JP6333737B2 - コンジュゲートされたポリマー粒子およびその製造方法 - Google Patents
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Description
本開示は、概して、基質をコンジュゲートする方法およびそのような方法によって形成された基質に関する。
基質へのポリヌクレオチドのコンジュゲーションは様々な産業にとって興味の対象となっている。コンジュゲートされたポリヌクレオチドを含む基質は、分離技術、遺伝子マーカーの検出、および配列決定において有用である。
第一の局面において、基質をコンジュゲートする方法は、生体分子と会合した対イオンを親油性対イオンと交換して生体分子複合体を形成する工程、生体分子複合体を非水溶媒中に分散させる工程、および非水溶媒の存在下で生体分子複合体を基質にカップリングする工程を含む。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
[1]
生体分子と会合した対イオンを親油性対イオンと交換して生体分子複合体を形成する工程、
該生体分子複合体を非水溶媒中に分散させる工程、および
該非水溶媒の存在下で該生体分子複合体を基質にカップリングする工程
を含む、基質をコンジュゲートする方法。
[2]
生体分子がポリヌクレオチドである、[1]記載の方法。
[3]
親油性対イオンが、親油性アンモニウムイオン、親油性ホスホニウムイオン、親油性アルソニウムイオン、親油性スルホニウムイオン、またはそれらの組み合わせである、[1]または[2]記載の方法。
[4]
親油性アンモニウムイオンが、テトラアルキルアンモニウム、テトラアリールアンモニウム、混合アルキルおよびアリールアンモニウム、またはそれらの組み合わせである、[3]記載の方法。
[5]
親油性アンモニウムイオンが、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、テトラペンチルアンモニウム、テトラヘキシルアンモニウム、テトラへプチルアンモニウム、テトラオクチルアンモニウム、それらのアルキルおよびアリール混合物、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、[4]記載の方法。
[6]
親油性ホスホニウムイオンがテトラフェニルホスホニウムである、[3]記載の方法。
[7]
親油性アルソニウムイオンが、テトラアルキルアルソニウム、テトラアリールアルソニウム、混合アルキルおよびアリールアルソニウムイオン、またはそれらの組み合わせである、[3]記載の方法。
[8]
親油性アルソニウムイオンがテトラフェニルアルソニウムである、[7]記載の方法。
[9]
親油性スルホニウムイオンがトリアルキルスルホニウムイオンである、[3]記載の方法。
[10]
非水溶媒が、基質および生体分子上のカップリング基と非反応性である、[1]〜[9]のいずれか一項記載の方法。
[11]
非水溶媒が極性である、[1]〜[10]のいずれか一項記載の方法。
[12]
非水溶媒が、アミド、尿素、カーボネート、エーテル、スルホキシド、スルホン、ヒンダードアルコール、またはそれらの組み合わせである、[1]〜[11]のいずれか一項記載の方法。
[13]
アミドまたは尿素が、ホルムアミド、N,N-ジメチルホルムアミド、アセトアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホラミド、ピロリドン、N-メチルピロリドン、N,N,N',N'-テトラメチル尿素、N,N'-ジメチル-N,N'-トリメチレン尿素、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、[12]記載の方法。
[14]
カーボネートが、炭酸ジメチル、炭酸プロピレン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、[12]記載の方法。
[15]
エーテルがテトラヒドロフランである、[12]記載の方法。
[16]
スルホキシドまたはスルホンが、ジメチルスルホキシド、ジメチルスルホン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、[12]記載の方法。
[17]
ヒンダードアルコールがtert-ブチルアルコールを含む、[12]記載の方法。
[18]
基質がポリマー粒子を含む、[1]〜[17]のいずれか一項記載の方法。
[19]
ポリマー粒子が、生体分子を含む反応性基と反応性のカップリング基を含む、[1]〜[18]のいずれか一項記載の方法。
[20]
カップリング基が求核体または求電子体の一方を含み、反応性パートナーが該求核体または該求電子体の他方を含む、[1]〜[19]のいずれか一項記載の方法。
[21]
ポリヌクレオチドと会合したカチオン対イオンを親油性カチオン対イオンと交換してポリヌクレオチド複合体を形成する工程であって、該ポリヌクレオチドが求核性または求電子性の反応性基を含む、工程、
該ポリヌクレオチド複合体を非反応性の非水溶媒中に分散させる工程、および
求核置換または求電子置換によって該ポリヌクレオチドを該ポリマー粒子にカップリングする工程であって、該ポリマー粒子が求電子性基または求核性基を含む、工程
を含む、ポリマー粒子をコンジュゲートする方法。
[22]
[1]〜[21]のいずれか一項記載の方法を使用してポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマーを含むポリマー粒子。
[23]
オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子の存在下で標的ポリヌクレオチドを増幅して、ポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子を形成する工程であって、該オリゴヌクレオチドが該標的ポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり、該オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子が[1]〜[21]のいずれか一項記載の方法によって形成される、工程、
該ポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子を配列決定装置に適用する工程、
該ポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子にプライマーを適用する工程、
ヌクレオチドを取り込む工程、および
該取り込みを検出する工程
を含む、配列を決定する方法。
[24]
検出する工程が、ヌクレオチドの取り込みに伴ったイオン濃度の変化を検出することを含む、[23]記載の方法。
[25]
標的ポリヌクレオチドを含む第一の溶液を、プローブにコンジュゲートされた基質と接触させる工程であって、該プローブにコンジュゲートされた基質のプローブが該標的ポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり、該プローブにコンジュゲートされた基質が[1]〜[21]のいずれか一項記載の方法によって形成される、工程、
該標的ポリヌクレオチドが該プローブにカップリングしている間に、該プローブにコンジュゲートされた基質を洗浄する工程、および
該標的ポリヌクレオチドを第二の溶液中に放出する工程
を含む、標的ポリヌクレオチドを単離する方法。
[26]
オリゴヌクレオチドをポリマーにコンジュゲートする方法であって、
アミン官能性を含むポリマーをビス−NHSエステルまたはジスクシンイミジルカーボネートで処理して官能化ポリマーを形成する工程、および
該官能化ポリマーをアミン終結オリゴヌクレオチドで処理して、該オリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートされたポリマーを形成する工程
を含む、方法。
[27]
ヒドロキシル官能性を含む初期ポリマーを提供する工程、
該ヒドロキシル官能性をハロゲンで置換するよう該初期ポリマーを処理する工程、および
アミン官能性を含むポリマーを形成するよう、保護アミン終結ポリエーテルで該初期ポリマーをさらに処理する工程
をさらに含む、[26]記載の方法。
[28]
ポリマーがポリマー粒子の形態にある、[26]または[27]記載の方法。
一つの態様において、コンジュゲーション方法は、生体分子と会合した対イオンを親油性対イオンと交換して生体分子複合体を形成する工程を含む。一例において、対イオンはカチオンである。生体分子複合体、たとえばポリヌクレオチド複合体は、非水溶媒中に分散させ、非水溶媒の存在下で基質にコンジュゲートさせることができる。例示的な基質は、表面、たとえばセラミック表面、金属表面、またはポリマー表面を含む。もう一つの例において、基質は膨潤性ポリマー粒子を含む。特に、生体分子は、ポリマー粒子の至る所で膨潤性ポリマーの官能基にコンジュゲートさせることができる。
図4に示すように、オリゴヌクレオチドをメシル活性化Dynal粒子に直接コンジュゲートする。官能基は粒子の表面にあるように示されているが、官能基は粒子の至る所に存在することができる。播種乳化重合であるUgelstad法により、塩化メシル活性化マイクロゲルを調製する。このようにして形成した粒子を、イオン交換された一本鎖DNAとのコンジュゲーションに備え、N-メチル-2-ピロリドン(NMP)中で洗浄する。
図5に示すような一連の置換によって粒子をコンジュゲートさせる。官能基は粒子の表面にあるように示されているが、官能基は粒子の至る所に存在することができる。
アミノヒドロゲルの活性化およびヒドロゲルとアミン末端DNAプローブとのコンジュゲーション
アミンフリーの無水N-メチルピロリドン(NMP)(600μL)中アミノヒドロゲル1000億個(直径0.55ミクロン、アミン2300万個/micron3)の溶液に、固体ビス−スクシンイミジルスベレート(22.1mg、60μモル)を加え、次いでトリブチルアミン(14μL、60μモル)を加える。60℃で1時間撹拌したのち、遠心分離(21300rcfで30分間)によってヒドロゲルを単離する。ヒドロゲルペレットをアミンフリーの無水NMP(1ml)で希釈し、遠心分離によって単離する。この洗浄工程を二回繰り返し、最終的なペレットをNMP(600μL)中に再懸濁させる。このヒドロゲル懸濁液を酢酸無水物(30μL、317μモル)およびトリブチルアミン(30μL、126μモル)で処理し、室温で2時間撹拌する。得られたヒドロゲルを遠心分離(21300rcfで30分間)によって単離し、ペレットをアミンフリーの無水NMP(1ml)で希釈し、遠心分離によって単離する。この洗浄工程を二回繰り返し、活性化されキャップされた最終的なペレットを、テトラブチルアンモニウム5'-アミノ-オリゴヌクレオチド、トリブチルアミン(1μモル)およびアミンフリーのNMPの3μモルNMP溶液1μモルで600μLの最終量まで希釈する。70℃で16時間撹拌したのち、DNAがコンジュゲートしたヒドロゲルを遠心分離(21300rcfで30分間)によって単離する。ペレットをNMP(1ml)で洗浄したのち、遠心分離を使用して脱イオン水洗浄(1ml)してペレットを単離する。最終的なヒドロゲルペレットを1×TEバッファ(1.6ml)で希釈し、80℃で1時間撹拌する。遠心分離(21300rcfで30分間)によってヒドロゲルを単離し、DI水(1ml)で二回洗浄する(ペレット単離のために遠心分離を使用)。最終的なペレットに30%水性アンモニアを加える。室温で15分後、ヒドロゲルを遠心分離単離し(21300rcfで20分間)、単離のために遠心分離を使用してDI水(1mL)で三回洗浄する。最終的なペレットを、標的増幅を実施するために望ましいバッファ中に再分散させる。
モノ保護ジアミンによるメシル化ヒドロゲルの官能化、その後の脱保護、活性化、および有機可溶性DNAプローブとのコンジュゲーションを図6に示す。
Claims (15)
- (a)オリゴヌクレオチドと会合した対イオンを親油性対イオンと交換して生体分子複合体を形成する工程であって、該オリゴヌクレオチドがアミン反応性基を含み、該親油性対イオンが親油性アンモニウムイオンである、該工程、
(b)該生体分子複合体を非水溶媒中に分散させる工程であって、該非水溶媒がアミドまたは尿素である、該工程、
(c)該工程(b)とは別に、アミノヒドロゲルビーズ基質を、工程(b)で使用した非水溶媒と同じ種類の非水溶媒中に分散させる工程、
(d)該アミノヒドロゲルビーズ基質をビス−NHSエステルまたはジスクシンイミジルカーボネートで処理する工程、および
(e)該非水溶媒の存在下で該生体分子複合体のオリゴヌクレオチドを該アミノヒドロゲルビーズ基質にカップリングする工程
を含む、アミノヒドロゲルビーズ基質をコンジュゲートする方法。 - 親油性アンモニウムイオンが、テトラアルキルアンモニウム、テトラアリールアンモニウム、混合アルキルおよびアリールアンモニウム、またはそれらの組み合わせである、請求項1記載の方法。
- 親油性アンモニウムイオンが、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、テトラペンチルアンモニウム、テトラヘキシルアンモニウム、テトラへプチルアンモニウム、テトラオクチルアンモニウム、それらのアルキルおよびアリール混合物、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項2記載の方法。
- 非水溶媒が、基質および生体分子上のカップリング基と非反応性である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 非水溶媒が極性である、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- アミドまたは尿素が、ホルムアミド、N,N-ジメチルホルムアミド、アセトアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホラミド、ピロリドン、N-メチルピロリドン、N,N,N',N'-テトラメチル尿素、N,N'-ジメチル-N,N'-トリメチレン尿素、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 処理工程が、ビス−NHSエステルで処理することを含む、請求項1記載の方法。
- ビス−NHSエステルが、ビス−スクシンイミジルC2〜C12アルキルエステルを含む、請求項7記載の方法。
- ビス−スクシンイミジルC2〜C12アルキルエステルが、ビス−スクシンイミジルスベレートまたはビス−スクシンイミジルグルタレートを含む、請求項8記載の方法。
- 処理工程が、ジスクシンイミジルカーボネートで処理することを含む、請求項1記載の方法。
- (a)ポリヌクレオチドと会合したカチオン対イオンを親油性対イオンと交換してポリヌクレオチド複合体を形成する工程であって、該ポリヌクレオチドがアミン反応性基を含み、該親油性対イオンが親油性アンモニウムイオンである、工程、
(b)該ポリヌクレオチド複合体を非反応性の非水溶媒中に分散させる工程であって、該非反応性の非水溶媒が、ホルムアミド、N,N-ジメチルホルムアミド、アセトアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホラミド、ピロリドン、N-メチルピロリドン、N,N,N',N'-テトラメチル尿素、N,N'-ジメチル-N,N'-トリメチレン尿素、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるアミドまたは尿素である、該工程、
(c)該工程(b)とは別に、アミノヒドロゲルポリマー粒子を、工程(b)で使用した非水溶媒と同じ種類の非水溶媒中に分散させる工程、
(d)該アミノヒドロゲルポリマー粒子を、ビス−スクシンイミジルC2〜C12アルキルエステルから選択されるビス−NHSエステルで処理する工程、および
(e)該非水溶媒の存在下で、該アミン反応性基を有する該ポリヌクレオチドを該アミノヒドロゲルポリマー粒子にカップリングする工程
を含む、アミノヒドロゲルポリマー粒子をコンジュゲートする方法。 - ビス−スクシンイミジルC2〜C12アルキルエステルが、ビス−スクシンイミジルスベレートまたはビス−スクシンイミジルグルタレートを含む、請求項11記載の方法。
- オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子の存在下で標的ポリヌクレオチドを増幅して、ポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子を形成する工程であって、該オリゴヌクレオチドが該標的ポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり、該オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子が請求項1〜11のいずれか1項記載の方法によって形成される、工程、
該ポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子を配列決定装置に適用する工程、
該ポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子にプライマーを適用する工程、
ヌクレオチドを取り込む工程、および
該取り込みを検出する工程
を含む、配列を決定する方法。 - 検出する工程が、ヌクレオチドの取り込みに伴ったイオン濃度の変化を検出することを含む、請求項13記載の方法。
- 標的ポリヌクレオチドを含む第一の溶液を、プローブにコンジュゲートされた基質と接触させる工程であって、該プローブにコンジュゲートされた基質のプローブが該標的ポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり、該プローブにコンジュゲートされた基質が請求項1〜11のいずれか1項記載の方法によって形成される、工程、
該標的ポリヌクレオチドが該プローブにカップリングしている間に、該プローブにコンジュゲートされた基質を洗浄する工程、および
該標的ポリヌクレオチドを第二の溶液中に放出する工程
を含む、標的ポリヌクレオチドを単離する方法。
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