CN110637111A - 用于原位合成dna阵列的羟烷基化聚丙烯酰胺表面涂层 - Google Patents

用于原位合成dna阵列的羟烷基化聚丙烯酰胺表面涂层 Download PDF

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Abstract

本发明公开涉及通过在基底表面共价结合羟烷基化聚丙烯酰胺薄膜的方法衍生化该基底，并将该基底作为合成生物分子阵列的平台的一些过程和方法。这些方法也可以用于制备用于生物分子阵列原位固相合成的基底表面。

Description

用于原位合成DNA阵列的羟烷基化聚丙烯酰胺表面涂层
交叉引用
本发明主张对于在2017年3月17日申请的美国62/472,666号临时专利申请的权利，该文献全篇引入本文作为参考。
背景
随着DNA测序和基于DNA的诊断/检测技术的发展，以阵列的形式在固体支持物上原位合成寡核苷酸探针的方法显得愈发重要。为促进在固体支持物上的DNA阵列的制造，已开发了表面处理方法以修饰固体支持物。例如，未被处理的表面可能过于拥挤或者存在位阻效应，以至表面缺少可与探针分子接触或反应的适当的官能团。此外，当探针分子连接在固体支持物表面后，探针分子必须保持对生物样品中的标靶分子可接触性，以确保检测可以进行。有时空间位阻效应可能会阻碍在固体支持物表面标靶和探针的相互作用。
在制备探针阵列时表面处理的一种方式是通过表面初始的聚合制造聚合物涂层以形成表面聚合膜，其随后并入生物分子。例如，通过受控的自由基聚合的方法将聚合物共价连接至基底的表面，合成了聚合物刷(M.Husseman等人,Macromolecules(1999)32(5):1424-31.)。然而，如此形成的表面是疏水性的，且因此不适合DNA阵列制造以及后续的标靶分子检测。
概述
本发明的一个部分是提供一种固体支持物，其包含表面共价结合的聚合物所述聚合物包含式I所述的化合物：
其中R1可以从以下基团中独立选择：
假设至少一个R1是
T1可以是无基团，H，C1-C6烷基，或者第一引发剂残基；
T2可以是无基团，H，C1-C6烷基，或者第二引发剂残基；
R2独立地为H，-CH3，或者-CH2OCH3；
R3和R4在每次出现时，独立地为H或-CH3；
捕获探针(CaptureProbe)包含选自下组的至少一种分子：肽，蛋白质，糖基化蛋白质，糖缀合物，适体，糖类，多核苷酸，寡核苷酸和多肽；
x是1到20之间的独立整数；
y是1到20的独立整数；
z是2到200之间的独立整数；
p是0到20之间的独立整数；
q是0到20之间的独立整数；
a是1到5的整数；
b是0到10的整数；
c是1到5的整数；且
d是0到10的整数。
在本文所述的一些实施例中，所述的固体支持物进一步包括表面，所述表面包含共价连接至所述表面的多个氨基，从而允许式I所述的化合物与所述多个氨基中的至少一部分以酰胺键的方式共价连接。在本文所述的一些实施例中，p是从1到20的独立整数，q是从1到20的独立整数。
在本文所述的一些实施例中，R1可以从以下的基团中独立选择：
在本文所述的一些实施例中，捕获探针是寡核苷酸。在本文所述的一些实施例中，捕获探针是DNA分子。
在本文所述的一些实施例中，所述表面为玻璃或聚合物基底。在本文所述的一些实施例中，所述聚合物基底是选自下组的至少一种：丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、环烯烃聚合物、环烯烃共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟聚氨酯、聚甲醛、热可塑弹性体、聚酰亚胺、聚醚-酮、聚乳酸和聚甲基醚。
本发明的另一个部分是提供一种固体支持物，其包含表面共价结合的聚合物，所述聚合物包含式I的化合物：
其中R1从以下基团中独立选择：
T1可以是无基团，H，C1-C6烷基，或者第一引发剂残基；
T2可以是无基团，H，C1-C6烷基，或者第二引发剂残基；
R2独立地为H，-CH3，或者-CH2OCH3；
R3和R4每次出现时，独立地为H或-CH3；
x是1到20之间的独立整数；
y是1到20之间的独立整数；
z是2到200之间的独立整数；
p是0到20之间的独立整数；
q是0到20之间的独立整数；
a是1到5的整数；
b是0到10的整数；
c是1到5的整数；且
d是0到10的整数。
在本文所述的一些实施例中，所述的固体支持物进一步包括表面，所述表面包含与所述表面共价连接的多个氨基，从而允许式I所述的化合物与所述多个氨基中的至少一部分以酰胺键的方式共价连接。
在本文所述的一些实施例中，p是从1到20的独立整数，且q是从1到20的独立整数。
在本文所述的一些实施例中，R1可以从以下的基团中独立选择：
在本文所述的一些实施例中，R1是在本文所述的一些实施例中，R1可以从以下的基团中独立选择：
在本文所述的一些实施例中，所述表面为玻璃或聚合物基底。在本文所述的一些实施例中，所述聚合物基底是选自下组的至少一种：丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、环烯烃聚合物、环烯烃共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟聚氨酯、聚甲醛、热可塑弹性体、聚酰亚胺、聚醚-酮、聚乳酸和聚甲基醚。
本发明的另一个部分是提供了一种衍生化基底表面的方法，包括：
(a)提供基底，所述基底具有含有多个第一氨基的表面；
(b)将第一试剂的第一组多个反应基团与一组所述多个第一氨基反应，从而形成表面共价结合的膜；以及
(c)将第一试剂的第二组多个反应基团与含有第二氨基和羟烷基官能团的第二试剂反应，从而形成羟烷基化的表面结合膜。
在本文所述的一些实施例中，(a)中的第一氨基是伯胺。在本文所述的一些实施例中，所述方法进一步包含，在(a)之前，用氨基烷基三烷氧基硅烷、氨等离子体，或者RF等离子体沉积处理所述基底的所述表面。在本文所述的一些实施例中，在(b)中的第一试剂是胺反应性丙烯酸酯聚合物或胺反应性丙烯酸酯-共丙烯酰胺共聚物。
在本文所述的一些实施例中，胺反应性丙烯酸酯聚合物是如式II的所述化合物：
其中X是从以下一组基团中独立选择的胺反应中心：
T1可以是无基团，H，C1-C6烷基，或者第一引发剂残基；
T2可以是无基团，H，C1-C6烷基，或者第二引发剂残基；以及
m是2到800的整数。
在本文所述的一些实施例中，所述丙烯酸酯-共丙烯酰胺共聚物是如式III所述的化合物：
其中X是胺反应中心，在每次出现时，X分别从以下基团中独立选择：
R3和R4在每次出现时，独立地为H或-CH3；
T1可以是无基团，H，C1-C6烷基，或者第一引发剂残基；
T2可以是无基团，H，C1-C6烷基，或者第二引发剂残基；
在每次出现时，m独立地是1到20的整数；
在每次出现时，n独立地是1到20的整数；以及
m是2到400的整数。
在本文所述的一些实施例中，所述反应基团是–C(O)X，且X从以下一组基团中独立选择：
在本文所述的一些实施例中，方法进一步包含了在(c)中将第三组多个反应基团与含有第三氨基而不是羟基的第三试剂反应。
在本文所述的一些实施例中，方法进一步包含了(d)用第四试剂与表面结合的羟烷基化膜反应，从而合成寡核苷酸阵列。在本文所述的一些实施例中，(d)中的合成包括喷墨合成或光刻合成。在本文所述的一些实施例中，(d)中的反应包括用寡核苷酸试剂对羟烷基进行烷基化反应。
在本文所述的一些实施例中，第一试剂的分子量为约5,000至约200,000。
本发明的其他特点和优势，对于本领域的技术人员来说，通过阅读本发明的实施例中详细的描述是显而易见的。本发明也可以、并且将被应用于其他不同的实施例，并且在不偏离本发明的情况下，发明披露中的一些细节可以在一些显而易见的方面被修改。因此，附图和描述应被认为在本质上是说明性的，而不是限制性的。
参考文献的并入
本发明中所有提及的出版物、专利和专利申请，在本文中以引用的方式并入，其程度与每一篇出版物、专利或专利申请被具体和单独地指明以引用的方式并入的程度相同。
附图概述
本发明中的创新特点，都在所附的权利要求中有具体阐述。通过参考以下详细描述中说明性的实施例，将更好的理解本发明的特征和优势。这些实例中应用了本发明的原理，并配有以下图示：
图1展示了本发明固体支持物的实例性实施例和及其制备方法；
图2A展示了棋盘状图案探针阵列的杂交图像，该阵列在室温下用1：1的乙二胺-水混合物在室温下处理了7小时；
图2B展示了图2A所示图像的灰度值-距离图；
图3A展示了棋盘状图案探针阵列的杂交图像，该阵列即图2A所展示的阵列，并且进一步用1：1氨-甲胺水溶液混合物在室温下处理2小时；
图3B展示了图3A所示图像的灰度值-距离图；
图4A展示了棋盘状图案探针阵列的杂交图像，该阵列即图3A所展示的阵列，并且进一步用1：1氨-甲胺水溶液混合物在65℃下处理1小时；
图4B展示了图4A所示图像的灰度值-距离图；
图5A展示了棋盘状图案探针阵列的杂交图像，该阵列即图4A所展示的阵列，并且进一步用1：1乙二胺水混合物在45℃下处理18小时；且
图5B展示了图5A所示图像的灰度值-距离图。
发明详述
因为需要一种控制支持物上的探针表面密度，并且使探针可与标靶生物分子接触并反应的方法，申请人试验并发明了本发明的主题。本发明提供了一种用于枝接的固体基底和/或探针阵列的原位固相合成，包括生物分子阵列，例如核酸阵列。本发明中披露的固体基底表面包含了一层通过共价键结合的羟烷基化聚丙烯酰胺薄膜，该薄膜位于表面和探针之间。本发明还提供了几种衍生化固体支持物的表面的方法，使其可以共价结合一层羟烷基化聚丙烯酰胺薄膜，以便在薄膜上进行探针阵列固相原位合成。羟烷基化聚丙烯酰胺薄膜为合成包括核酸阵列、多肽阵列或寡核苷酸阵列在内的生物分子阵列提供了一个平台。本发明中的羟烷基化聚丙烯酰胺涂层具有核酸合成起始/结合位点密度可控、与寡核苷酸合成化学和反应条件相容、减少与标靶核酸的非特异性结合以及操作中的水解稳定性高等优点。
此处使用的术语“寡核苷酸”是指核苷酸链。在某些情况下，寡核苷酸的长度小于200个残基，例如，在15到100个核苷酸之间。寡核苷酸可以包含至少或大约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45或50个碱基。寡核苷酸的碱基数可以是约3至约5个碱基，约1至约50个碱基，约8至约12个碱基，约15至约25个碱基，约25至约35个碱基，约35至约45个碱基，或约45至约55个碱基。寡核苷酸可以是任何类型的寡核苷酸(例如引物)。寡核苷酸可以包含天然核苷酸、非天然核苷酸，或其组合。
本文中的引发剂是指用于引发聚合反应的分子。引发剂是用于制备聚合物的分子，这在本领域中属于常识。代表性的引发物包括但不限于：原子转移自由基聚合引发剂、活性聚合引发剂、AIBN系列引发剂和二苯甲酮引发剂。引发剂残基，是引发物分子中可以通过自由基或者其他机理和聚合物发生连接的部分。在一些实施例中，引发物残基连接在发明披露的聚合物的末端。在本发明中，当描述留在聚合物分子上的引发剂分子时，“引发剂”和“引发剂残基”两词是可以互换使用的。此处使用的术语“重均分子量”是指一种聚合物的平均分子量，该聚合物由具有不同聚合物链长或大小的聚合物分子组成，重均分子量根据不同大小分子的重量分数计算。如下是一个通过不同分子量的聚合物分子组分各自的比例来计算重均分子量的方法。重均分子量的Mw的计算方式如下：
Mw＝{总和[(Wi)×(MW)i]}/{总和Wi}
其中Wi是各个组分的重量比例，(MW)i是各个组分的平均分子量。
芯片实验室(lab-on-chip)的概念，涉及在一个微型平台整合多种分析操作，比如微全分析系统((μTAS)(D.J.Harrison等人,Anal.Chem.(1992)64(17):1926-32)。这些芯片系统包括了如微流体系统、传感器、阵列或生物芯片，以及芯片上化学合成等。在多种分析领域和新型材料上开发芯片实验室的研究已有报道(D.R.Reyes等人,Anal.Chem.(2002)74(12):2623-36；P.A.Auroux等人,Anal.Chem.(2002)74(12):2637-52)。
这些微系统芯片，微流体芯片、微芯片或生物芯片的固态基底，由如玻璃、硅、二氧化硅、熔融石英基底材料、氧化钛、氧化铝、氧化铟锡(ITO)和多种聚合物材料、钛、金、其他金属、或其他合适的材料制备。使用的聚合物材料包括如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚对苯二甲酸(PETG)、聚氯乙烯(PVC)、聚酰亚胺(PI)、聚烯烃如聚甲基戊烯(PMP)和ZeonorTM，以及环烯烃共聚物如TopasTM等，因为这些材料具有低价、生物分子可兼容性、光学透明、复制策略多样以及可处置性等优点。(Becker等人,Talanta(2002)56(2):267-87)。
本文所用的术语“基底”是指具有刚性，半刚性或凝胶状表面的材料。典型的实例包括上述固体基底，包括玻璃或合适的聚合物材料。在本发明的一些实施例中，基底的至少一个表面会大致上是平的，但在一些实施例中，对于不同的聚合物，可能需要物理分离的合成区域，例如，孔、凸起区域、蚀刻沟槽等。在一些实施例中，基底本身含有孔、沟槽、流过区域等结构，其可以形成部分或全部的合成区域。根据其他实施例，可在表面上提供小珠子，且在其上合成的化合物任选可在合成完成时释放。表面的实例包括流动池，测序流动池，流动通道，微流体通道，毛细管，压电表面，孔，微孔，微孔阵列，微阵列，芯片，晶片，非磁珠，磁珠，铁磁珠，顺磁珠，超顺磁珠和聚合物凝胶。基底是本领域中公所周知的，并可以从USPG,PPG工业,AFG工业等供应商处购得。在某些实施例中，本发明中使用的基底是易于硅烷化的基底，例如玻璃，石英，熔融石英和硅晶片。(D.Cuschin等人,Anal.Biochem.(1997)250(2):203-11)。
如本文所用，单数形式“一”，“一种”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。例如，术语“一种试剂”也包括多种试剂，包括其混合物。
如本文所用的术语“约”是指+/-所指数量的15％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％或1％。
如本文所用的术语“膜”是指具有一种或多种成分的层或涂层，其以如旋涂等大致均匀的方法被涂在基底的整个表面上。例如，按照本发明中所指，膜可以是所选聚合物的溶液，悬浮液，分散液，乳液或其他可接受形式。膜可以包括与成膜聚合物组合的其他化学试剂。成膜聚合物是指经过熔融，或者溶解于相容的溶剂后可在基底上形成均匀的膜的聚合物。聚合物膜可以通过化学键，例如酰胺键，酯键，烷基氨基键和烷氧基键共价结合到基底表面。
本文所用的术语“反应性基团”是指对另一种靶标官能团具有反应性的官能团，此种反应性使得反应性基团优先与目标官能团反应。例如，一个胺反应性基团可以指如包括酯和酰胺在内的活性羰基化合物的官能团，这些化合物可以优先与胺基反应。
本文所用的术语“分析物”或“分析物分子”是指作为分析对象的化合物或分子。例如，分析物分子可以具有未知结构，并且分析包括对结构的识别。分析物分子包括任何数量的常见分子，包括DNA，蛋白质，肽和碳水化合物，有机和无机分子，金属(包括放射性同位素)等。分析物包括病毒，细菌，疟原虫，真菌，以及金属和生物武器、生物危害和化学武器材料。
本文所用的术语“探针”是指用于间接识别分析物分子的分子。例如，探针可以带有可特异性识别分析物分子的序列信息。探针的例子包括碳水化合物，寡核苷酸和多肽等，可以带有或不带有接头。
本文所用的术语“捕获探针”是指能够与分析物分子相互作用的分子，例如通过氢键(例如DNA杂交)，螯合，共价键合，离子相互作用等。捕获探针的例子包括可以和寡核苷酸探针或侧翼序列特异性结合(杂交)的寡核苷酸，低聚糖(如凝集素)，以及蛋白质。在一些实施例中，捕获探针包含荧光基团标记。例如，捕获探针可以包含荧光基团标记，并且分析物分子可以包含猝灭基团，分析物分子的存在可以通过来自捕获探针的荧光信号不存在检测到(因为荧光在与猝灭基团相互作用时被猝灭)。在相关实施例中，捕获探针包含猝灭基团。在这些实施例中，带有荧光标记的分析物分子的荧光在被捕获探针捕获时被猝灭。探针的例子包括肽，蛋白质，糖基化蛋白质，糖缀合物，适体，碳水化合物，多核苷酸，寡核苷酸和多肽。
除非有另外指明，本发明中涉及到的有机化学，聚合物技术，分子生物学(包括重组核酸技术)，细胞生物学，生物化学技术和免疫学技术，对于相关领域拥有普通技能的人员来说是可以理解的。这些技术包括杂交、连接和使用标记物检测杂交。对合适的技术的具体描述，可以在下文中披露的实施例中找到。但是，也可以使用其他等效的传统方法。这些传统技术和描述可以在标准实验室手册中找到，例如：Genome Analysis:A LaboratoryManual Series(Vols.I-IV),Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cells:ALaboratory Manual,PCR Primer:A Laboratory Manual,and Molecular Cloning:ALaboratory Manual(all from Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Stryer,L.(1995)Biochemistry(4th Ed.)Freeman,New York；Gait,“Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach”1984,IRL Press,London；Nelson and Cox(2000),Lehninger,Principles of Biochemistry 3rd Ed.,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.；Brinker andScherer(1990),Sol-Gel Science,Academic Press,San Diego,CA；and Berg等人(2002)Biochemistry,5th Ed.,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.。以上所有文献都通过引用整体并入本文。
此处开始解释图1，其展示了根据本发明的固体支持物及其制备的示例性实施例。在步骤1中，在适当的条件下用试剂对基底进行处理，使基底表面具有共价键结合的氨基。例如，玻璃基板基底可以涂有氨基烷基三烷氧基硅烷(P.H.Maddox等人,J.Clin.Pathol.(1987)40(10):1256-7)。此外，各种高分子材料，例如环烯烃共聚物(COC)，可以通过氨等离子体处理实现表面胺化(K.S.Siow等人,Plasma Process.Polym.(2006)3:392-418)。氨基烷基三烷氧基硅烷可以是氨基烷基三甲氧基硅烷或氨基烷基三甲氧基硅烷。氨基烷基三烷氧基硅烷的氨基烷基部分的亚烷基可以是未被取代的，或用选自下组的1-5个基团取代的C2-C10亚烷基：C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、卤化物和氰化物。亚烷基中的一些碳可以用-0-或-N(R20)-取代，其中R20是C1-C5烷基。
此外，玻璃或聚合物材料可以用射频(RF)等离子体沉积方法涂覆一层交联聚烯丙胺薄膜，以在基板表面提供氨基(T.M.Ko等人,J.Colloid Interface Sci.(1993),156:207-17；D.A.Puleo等人,Biomaterials(2002)23(9):2079-87；M.Taloulian等人PlasmaProcesses and Polymers(2005)2(1):38-44)。为产生共价键结合的氨基而对基底进行表面处理的方法不仅限于上文或下文所述例子。其他方法也可用于在底物表面引入氨基。
如图1所示，共价键合的氨基为下一步提供了活性中心。氨基优选为伯胺，虽然反应性的仲胺基也可以起作用。如图1所示，例如氨基等反应中心的表面密度，可以通过选择引入例如氨基等反应中心的试剂来控制。例如，当用氨基烷基三烷氧基硅烷修饰玻璃表面时，一个新的表面氨基可以封闭(或失活)至多三个原本在玻璃表面的羟基，从而降低了可用反应中心的表面密度(羟基/氨基总数)。
在步骤2中，具有式II的胺反应的丙烯酸酯聚合物，或者具有式III的胺反应的丙烯酸酯-共丙烯酰胺共聚物，被施加到在步骤1中获得的具有表面氨基的基底上。这些胺反应的聚合物与表面氨基反应形成酰胺键，使得一层丙烯酸酯聚合物薄膜结合在表面上。薄膜的厚度可以变化。
胺反应的丙烯酸酯聚合物是如式II所述的化合物：
其中X是从以下一组基团中独立选择的胺反应中心：
T1可以是无基团，H，C1-C6烷基，或者第二引发剂残基；
T2可以是无基团，H，C1-C6烷基，或者第三引发剂残基；以及
m是2到800的整数。
胺反应的丙烯酸酯-共丙烯酰胺共聚物是如式III所述的一种化合物：
其中X是胺反应中心，在每次出现时，X分别从以下基团中独立选择：
R3和R4在每次出现时，独立地为H或-CH3；
T1可以是无基团，H，C1-C6烷基，或者第二引发剂残基；
T2可以是无基团，H，C1-C6烷基，或者第三引发剂残基；
在每次出现时，m独立地是1到20的整数；
在每次出现时，n独立地是1到20的整数；以及
m是2到400的整数。
胺活性的丙烯酸酯聚合物涂层可以包含特定长度或长度范围的聚合物分子。聚合物分子的重均分子量可以从大约5000到大约200000，从大约10000到大约180000，从大约15000到大约160000，从大约20000到大约140000，从大约40000到大约100000，或从大约60000到大约80000。聚合物分子的重均分子量约为5000，约为10000，约为15000，约为20000，约为25000，约为30000，约为35000，约为40000，约为45000，约为55000，约为60000，约为65000，约为70000，约为75000,大约8万，大约8万5千，大约9万5千，大约9万5千，大约10万5千，大约10万5千，大约11万，大约11万5千，大约12万5千，大约13万5千，大约13万5千大约140,000，大约145,000，大约150,000，大约155,000，大约160,000，大约165,000，大约170,000，大约175,000，大约180,000，大约190,000，大约195,000，大约200,000。聚合物分子的长度至少有2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800个原子或分子(例如碳)。聚合物分子的长度至少有2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750单体单元(例如，丙烯酸酯和/或丙烯酰胺分子)。
胺反应基团X与表面氨基反应，在聚合物和基底表面之间形成酰胺键。在一个实施例中，表面氨基的表面密度小于聚合物内部胺反应的X基团的表面密度，以致在与表面氨基反应之后，只消耗X基团的第一部分形成酰胺键，而第二部分的X基团完整地留在表面键合的共聚物上。如图1所示，X基团的第一部分和第二部分之间的比值可以是x:y。第一部分和第二部分之间的比例可以是大约1:20，大约1:19，大约1:18，大约1:17，大约1:16，大约1:15，大约1:14，大约1:13，大约1:12大约1:11，大约1:10，大约1:9，大约1:8，大约1:7，大约1:6，大约1:5，大约1:4，大约1:3，大约1:2，大约1:1，大约2:1，大约3:1，大约4:1，大约5:1，大约6:1，大约7:1；大约8:1，大约9:1，大约10:1，大约11:1，大约12:1，大约13:1，大约14:1，大约15:1，大约16:1，大约17:1，大约18:1，大约19:1，大约20:1。剩下的胺反应的X基团(X基团的第二部分)可以在步骤3中被进一步处理。应该注意的是，虽然图1中的表面氨基显示为酰化的(与聚合物形成酰胺键)，但由于胺反应聚合物的大小、空间位阻或反应性差别等原因，一些表面氨基可能没有形成如步骤2中所示的酰胺键。一个如式III所述的胺反应性的丙烯酸酯-共丙烯酰胺共聚物可形成与步骤2类似的酰胺键。
在步骤3中，具有剩余胺反应性X基团的表面结合的聚合物薄膜进一步暴露在大量过量的羟烷基官能化胺中，出于反应性考虑，优选使用伯胺。羟烷基可以作为引入各种捕获探针的锚点。羟烷基官能化胺的氨基与第二组分的胺反应性X基团反应，在底物表面形成羟烷基化聚丙烯酰胺薄膜。例如，羟烷基官能化的胺可以如式IV所述：
其中a是1至5的整数；和
b是0到10之间的整数。
或者，作为一种控制膜中表面可用羟烷基的浓度或密度的手段，可以相对于羟烷基官能化胺的数量加入不同比例的非官能化胺，例如氨、烷基胺或烷氧基烷基胺，作为酰胺形成反应中的竞争分子。例如，非官能化胺可以式式V的化合物：
其中R2独立地为H，-CH3或-CH2OCH3；
c为1至5的整数；和
d是0到10之间的整数。
应指出的是，羟烷基官能化胺和非官能化胺的选择不限于以上或下文所示的实例。也可以使用其他胺。因此，本文所用的术语“羟烷基官能化胺”是指一种一端包含反应性胺，而另一端包含羟基，并且在胺基和羟基之间具有亚烷基接头的化合物。亚烷基接头可以是可以是未被取代的，或用选自下组的1-5个基团取代的C2-C10亚烷基：C1-C5烷基，C1-C5烷氧基，卤化物和氰化物。亚烷基接头中的一些碳原子可被–O–或–N(R20–取代，其中R20为C1-C5烷基。
在步骤4中，羟烷基化聚丙烯酰胺涂覆的基底可借助其游离羟基直接用于基于喷墨或光刻印刷技术的寡核苷酸阵列原位合成。其结果是寡核苷酸共价连接于聚丙烯酰胺的主链上。例如，可以在羟烷基化聚丙烯酰胺的游离羟基上进行标准寡核苷酸探针的合成，以合成寡核苷酸序列。
此外，可以将其他生物分子偶联至本公开中描述的聚合物涂层以生产生物分子阵列。生物分子可包含抗体。生物分子可以包含蛋白质。生物分子可包含肽。生物分子可包含酶。生物分子可包含适体。生物分子可包含寡核苷酸。
寡核苷酸可以偶联至本公开中描述的聚合物涂层。寡核苷酸可包含引物。寡核苷酸可包含可切割的连接结构。可切割的连接结构可以被酶切开。寡核苷酸可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60个碱基。寡核苷酸的长度可以变化，例如3至5个碱基，1至50个碱基，6至12个碱基，8至12个碱基，15至25个碱基，25至35个碱基，35至45个碱基，或45至55个碱基。偶联至涂层的各个寡核苷酸的长度或组成可以彼此不同。
生物分子(例如，寡核苷酸)可以以受控的方式掺入聚合物涂层中，使特定的生物分子位于聚合物涂层的特定区域。生物分子可以随机掺入聚合物涂层中，使特定的生物分子随机分布在整个聚合物涂层中。
在某些情况下，本发明的组合物包含一个表面，与所述表面共价结合的聚丙烯酰胺涂层，和至少一个与所述聚丙烯酰胺涂层偶联的寡核苷酸。在其他情况下，该表面包括偶联至聚丙烯酰胺涂层的至少1、10、100、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000或1,000,000,000个寡核苷酸。
在本公开中描述的聚合物涂层可以是稳健的。聚合物涂层的稳健性可以体现在一定条件下的耐久性，耐降解性或涂层的附着程度。聚合物涂层的稳定性可以体现在与聚合物涂层偶联的生物分子(例如，寡核苷酸)在经历特定条件后仍与聚合物涂层偶联的分子数量或百分比。条件可以包括但不限于持续时间，单一温度或一组温度，化学物质(例如酸，碱，还原剂，氧化剂)的存在，机械力(例如应力，应变，振动，高压，真空)，上述条件的组合，上述条件或条件组合的重复循环(例如，包括温度和化学药品使用的反应循环)。时间长度可以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50分钟，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时，至少1，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13天，或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、50或60周。温度可包括至少0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100℃。温度可包括最多0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100℃。化学物质可包括强酸，弱酸，强碱，弱碱，强氧化剂，弱氧化剂，强还原剂，弱还原剂，酶，单体，聚合物，缓冲剂，溶剂或其他试剂。条件循环可以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000个循环。在一些实施例中，本文的聚合物涂层用于实施至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个循环的条件，并且其中至少50％，60％，70％，80％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或99.9％的聚合物链在循环后保持完全完整，并且结合于所述的表面。
例1：胺化基底的制备
将熔融石英基底(ESCO)在Nanostrip(Cyantek，Fremont，CA)中浸泡/搅拌4小时以清洁。然后将基底用去离子水彻底洗涤，并在35℃的氮气流中旋转干燥5分钟。将刚刚清洁的基底在氮气下保存，并在24小时内硅烷化。用5％(3-氨基丙基)-三甲氧基硅烷(APTMS，Gelest，2％溶解于95∶5乙醇-水中)硅烷化基底。用乙醇和水彻底洗涤，然后用旋转清洗干燥，以保获得APTMS胺化的二氧化硅基质。
例2：胺反应性丙烯酸酯聚合物薄膜的应用
将实验1中获得的APTMS胺化的二氧化硅基质浸入如前所述制备的聚五氟苯基丙烯酸酯(PFPA)溶液中(可参阅R.M.Arnold等人,Chem.Commun.(2014)50(40):5307-9；L.Q.Xu等人,Polym.Chem.(2012)3:920-7)报道)。溶液在密闭的聚丙烯容器中，溶解在含有二异丙基乙胺(10mg/ml)的干燥THF中，浓度为10mg/ml。将该容器在定轨振荡器上搅拌18-24小时。然后将基底用丙酮和异丙醇彻底洗涤，然后吹干并储存在干燥器中，以获得涂覆有活化丙烯酸酯聚合物薄膜的基质。
实验3：丙烯酰胺聚合物薄膜的羟烷基化
将涂有活化丙烯酸酯聚合物的基底浸入装有含有乙醇胺的乙醇溶液(10％w/v)的密闭聚丙烯容器中，然后在定轨振荡器上搅拌8-16小时，以在基底上产生羟烷基化丙烯酰胺聚合物薄膜。可选地，为淬灭残留在基底膜上的任何未反应的丙烯酸酯，可将基底转移至溶解有2.0M氨的乙醇溶液中，并在定轨振荡器上再搅拌2-4小时，用乙醇和水彻底洗涤，然后吹干。这种处理用非官能化的胺或氨淬灭了未反应的活化丙烯酸酯。
实验4：原位寡核苷酸探针阵列合成
使用5'带有光敏保护基团的核苷亚磷酰胺单体进行光刻合成，用棋盘格掩模图案在羟烷基化丙烯酰胺底物上合成了测试寡核苷酸探针序列(参见G.H.McGall等人,MethodsMolec.Biol.(2001)170:71-101；G.H.McGall等人,J Am.Chem.Soc.(1997)119(22):5081-90)。测试探针的序列为5'-GGCTGAGTATGTGGTCTAT-3'-(HEG)，其3'端连接有六甘醇(HEG)间隔区结构(spacer)，其通过磷酸二酯键连接至羟烷基化表面。合成后，将阵列置于1：1乙二胺-水的混合物中于室温孵育7小时，用水洗涤，然后吹干。
杂交实验1
为了进行杂交测量，将阵列与浓度为100nM的5'带有Cy3标记的互补20碱基靶寡核苷酸于4×SSC缓冲液中在50℃孵育30分钟，然后在室温下用4×SSC缓冲液洗涤。荧光图像由Keyence荧光显微镜上拍摄(Cy3滤光片套装，放大40倍，采集时间为4秒)。所获取的图像如图2所示。
杂交实验2
然后将阵列用水洗涤，在室温下于1：1氨-甲胺水溶液中孵育2小时，水洗涤并干燥，与Cy3标记的靶标再次杂交，并在与上述相同的条件下再次成像。所获取的图像如图3所示。
杂交实验3
然后将阵列用水洗涤，在65℃的1：1氨-甲胺水溶液中孵育1小时，水洗并干燥，与Cy3标记的靶标再次杂交，并在与上述相同的条件下再次成像。所获取的图像如图4所示。
杂交实验4
然后将阵列用水洗涤，在45℃的1：1乙二胺水溶液中孵育18小时，水洗并干燥，与Cy3标记的靶标再次杂交，并在与上述相同的条件下再次成像。所获取的图像如图5所示。
本发明的优势
比较图2-5中的图像证明本发明的聚合物膜表现出以下特征：
·均匀，高度可润湿的表面
·均匀、荧光杂交低背景的图像；
·升温下在碱水溶液中具有很高的稳定性；
·与寡核苷酸探针阵列合成工艺兼容；
·与标准羟烷基硅烷化基底相当的杂交信号密度；
·与“芯片上”连接和聚合酶延伸兼容；以及
·出色的批次间一致性。
尽管在本文中已经示展示和描述了本发明的优选实施例，对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施例仅以示例的方式提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员可以发展出许多的变化，改变和替代。应当理解，各种与本文所述的本发明的实施例不完全相同的替代方案也可以用于实施本发明。本文中如下权利要求的意图是定义本发明的范围，以及这些权利要求范围内所包含的方法和结构，及其等同物。

Claims (28)

1.一种固体支持物，其包含表面共价结合的聚合物，所述聚合物包含式I的化合物：
其中R1可以从以下基团中独立选择：
假设至少有一个R1是
T1可以是无基团，H，C1-C6烷基，或者第一引发剂残基；
T2可以是无基团，H，C1-C6烷基，或者第二引发剂残基；
R2独立地为H，-CH3，或者-CH2OCH3；
R3和R4在每次出现时，独立地为H或-CH3；
捕获探针(Capture Probe)包含选自下组的至少一种分子：肽，蛋白质，糖基化蛋白质，糖缀合物，适体，糖类，多核苷酸，寡核苷酸和多肽；
x是1到20之间的独立整数；
y是1到20的独立整数；
z是2到200之间的独立整数；
p是0到20之间的独立整数；
q是0到20之间的独立整数；
a是1到5的整数；
b是0到10的整数；
c是1到5的整数；且
d是0到10的整数。
2.权利要求1所述的固体支持物，其进一步包括表面，所述表面包含共价连接至所述表面的多个氨基，从而允许式I所述的化合物与所述多个氨基中的至少一部分以酰胺键的方式共价连接。
3.权利要求1所述的固体支持物，其中p是从1到20的独立整数，且q是从1到20的独立整数。
4.权利要求1所述的固体支持物，其中R1可以从以下的基团中独立选择：
5.权利要求4所述的固体支持物，其中所述捕获探针是寡核苷酸。
6.权利要求4所述的固体支持物，其中所述捕获探针是DNA分子。
7.权利要求2所述的固体支持物，其中所述表面为玻璃或聚合物基底。
8.权利要求7所述的固体支持物，其中所述聚合物基底是选自下组的至少一种：丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、环烯烃聚合物、环烯烃共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟聚氨酯、聚甲醛、热可塑弹性体、聚酰亚胺、聚醚-酮、聚乳酸和聚甲基醚。
9.一种固体支持物，其包含表面共价结合的聚合物，所述聚合物包含式I的化合物：
其中R1从以下基团中独立选择：
T1可以是无基团，H，C1-C6烷基，或者第一引发剂残基；
T2可以是无基团，H，C1-C6烷基，或者第二引发剂残基；
R2独立地为H，-CH3，或者-CH2OCH3；
R3和R4在每次出现时，独立地为H或-CH3；
x是1到20之间的独立整数；
y是1到20之间的独立整数；
z是2到200之间的独立整数；
p是0到20之间的独立整数；
q是0到20之间的独立整数；
a是1到5的整数；
b是0到10的整数；
c是1到5的整数；且
d是0到10的整数。
10.权利要求9所述的固体支持物，其进一步包括表面，所述表面包含共价连接至所述表面的多个氨基，从而允许式I所述的化合物与所述多个氨基中的至少一部分以酰胺键的方式共价连接。
11.权利要求9所述的固体支持物，其中p是从1到20的独立整数，且q是从1到20的独立整数。
12.权利要求9所述的固体支持物，其中R1可以从以下的基团中独立选择：
13.权利要求9所述的固体支持物，其中R1是
14.权利要求9所述的固体支持物，其中R1可以从以下的基团中独立选择：
15.权利要求10所述的固体支持物，其中所述表面为玻璃或聚合物基底。
16.权利要求15所述的固体支持物，其中所述聚合物基底是选自下组的至少一种：丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、环烯烃聚合物、环烯烃共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟聚氨酯、聚甲醛、热可塑弹性体、聚酰亚胺、聚醚-酮、聚乳酸和聚甲基醚。
17.一种衍生化基底表面的方法，包括：
(a)提供基底，所述基底具有含有多个第一氨基的表面；
(b)将第一试剂的第一组多个反应基团与一组所述多个第一氨基反应，从而形成表面共价结合的膜；以及
(c)将所述第一试剂的第二组多个反应基团与含有第二氨基和羟烷基官能团的第二试剂反应，从而形成羟烷基化的表面结合膜。
18.权利要求17所述的方法，其中(a)中的第一氨基是伯胺。
19.权利要求17所述的方法，其进一步包含，在(a)之前，用氨基烷基三烷氧基硅烷、氨等离子体，或者RF等离子体沉积处理所述基底的所述表面。
20.权利要求17所述的方法，其中在(b)中的第一试剂是胺反应性丙烯酸酯聚合物或胺反应性丙烯酸酯-共丙烯酰胺共聚物。
21.权利要求20所述的方法，其中胺反应性丙烯酸酯聚合物是如式II所述的化合物：
其中X是从以下一组基团中独立选择的胺反应中心：
T1可以是无基团，H，C1-C6烷基，或者第一引发剂残基；
T2可以是无基团，H，C1-C6烷基，或者第二引发剂残基；以及
m是2到800的整数。
22.权利要求20所述的方法，其中所述丙烯酸酯-共丙烯酰胺共聚物是如式III所述的化合物：
其中X是胺反应中心，在每次出现时，X分别从以下基团中独立选择：
R3和R4在每次出现时，独立地为H或-CH3；
T1可以是无基团，H，C1-C6烷基，或者第一引发剂残基；
T2可以是无基团，H，C1-C6烷基，或者第二引发剂残基；
在每次出现时，m独立地是1到20的整数；
在每次出现时，n独立地是1到20的整数；以及
m是2到400的整数。
23.权利要求17所述的方法，其中所述反应基团是–C(O)X，且X从以下一组基团中独立选择：
24.权利要求17所述的方法，进一步包含在(c)中将第三组多个反应基团与含有第三氨基而不是羟基的第三试剂反应。
25.权利要求17所述的方法，进一步包含(d)用第四试剂与表面结合的羟烷基化膜反应，从而合成寡核苷酸阵列。
26.权利要求25所述的方法，其中(d)中的合成包括喷墨合成或光刻合成。
27.权利要求25所述的方法，其中(d)中的反应包括用寡核苷酸试剂对所述羟烷基进行烷基化反应。
28.权利要求17所述的方法，其中所述第一试剂的分子量为约5,000至约200,000。
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