CN108103147A - 缀合的聚合物颗粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及缀合的聚合物颗粒及其制备方法。使寡核苷酸与聚合物缀合的方法包括：用双NHS酯或二琥珀酰亚胺基碳酸酯处理包含胺官能团的聚合物，以形成官能化的聚合物；和用胺封端的寡核苷酸处理所述官能化的聚合物，以形成包括所述寡核苷酸的缀合的聚合物。寡核苷酸涂覆的颗粒用于核酸分离或核酸测序反应中。

Description

缀合的聚合物颗粒及其制备方法
本申请是国际申请日为2013年2月8日、申请号为201380013658.X、发明名称为“缀合的聚合物颗粒及其制备方法”的发明专利申请的分案申请。
本专利申请要求于2012年2月9日提交的美国临时申请号61/597,064的利益，所述美国临时申请以引用的方式全文并入本文。
技术领域
本公开内容总地涉及使底物缀合的方法和通过此类方法形成的底物。
背景技术
多核苷酸与底物的缀合已变成多种工业的关注点。包括缀合的多核苷酸的底物可用于分离技术、遗传标记物检测和测序中。
例如，与多核苷酸探针缀合的底物可用于捕获遗传标记物以便检测。示例性遗传标记物可与基因内的疾病变体、引起疾病的细菌或病毒、或可用于人体鉴定的等位基因有关。包括与遗传标记物互补的缀合探针的底物可捕获此类遗传标记物，且多种技术可用于检测捕获的遗传标记物的存在。
在另一个例子中，与多核苷酸缀合的底物可用于捕获并分离遗传材料。在一个例子中，在底物上的探针可与所需多核苷酸互补。探针可构造为捕获所需多核苷酸且之后释放多核苷酸，以允许多核苷酸的回收。在另一个例子中，与多核苷酸探针缀合的聚合物颗粒可用于从溶液中捕获并分离靶多核苷酸，所述多核苷酸探针与靶多核苷酸互补。随后，靶多核苷酸可在不同溶液中从缀合颗粒中释放。
在进一步例子中，与多核苷酸缀合的底物可用于多种测序技术中。例如，与多核苷酸或多核苷酸的多个拷贝缀合的聚合物颗粒可用于测序技术，例如基于荧光的测序技术或基于离子的测序技术中。
虽然缀合底物的上述用途各自对于多种工业是特别有利的，但多核苷酸与底物例如聚合物底物的可靠缀合通常是低效的。此类低效导致较低密度的缀合的多核苷酸或缺乏所需多核苷酸的随机区域。此类低效可导致弱分离、检测方法中的低精确度、以及测序技术中的低信号或高信噪比。
因此，改良的缀合方法将是希望的。
发明内容
在第一个方面，使底物缀合的方法包括使与生物分子结合的抗衡离子与亲脂抗衡离子交换，以形成生物分子复合物，将生物分子复合物分散在非水性溶剂中，并且在非水性溶剂的存在下使生物分子复合物与底物偶联。
在第二个方面，使聚合物颗粒缀合的方法包括使与多核苷酸结合的阳离子抗衡离子与亲脂阳离子抗衡离子交换，以形成多核苷酸复合物，该多核苷酸包括亲核或亲电反应基团。该方法还包括将多核苷酸复合物分散在非反应性、非水性溶剂中，并且通过亲核或亲电取代使多核苷酸与聚合物颗粒偶联，该聚合物颗粒包括亲电基团或亲核基团。
在第三个方面，聚合物颗粒包括使用上述方面或例子中的任一种的方法与多核苷酸缀合的聚合物。
在第四个方面，测序方法包括在寡核苷酸缀合的聚合物颗粒的存在下，扩增靶多核苷酸以形成多核苷酸缀合的聚合物颗粒。寡核苷酸至少部分与靶多核苷酸互补。寡核苷酸缀合的聚合物颗粒通过上述方面或例子中的任一种的方法形成。该方法还包括将多核苷酸缀合的聚合物颗粒应用于测序装置，将引物应用于多核苷酸缀合的聚合物颗粒，掺入核苷酸并检测掺入。
在第五个方面，分离靶多核苷酸的方法包括使含有靶多核苷酸的第一溶液与探针缀合的底物接触。探针缀合的底物的探针至少部分与靶多核苷酸互补。探针缀合的底物通过上述方面或例子中的任一种的方法形成。该方法还包括在靶多核苷酸与探针偶联的同时洗涤探针缀合的底物，并且在第二溶液中释放靶多核苷酸。
在另外一个方面，使寡核苷酸与聚合物缀合的方法包括用双NHS酯或二琥珀酰亚胺基碳酸酯处理包含胺官能团的聚合物，以形成官能化的聚合物，并且用胺封端的寡核苷酸处理官能化的聚合物，以形成包括寡核苷酸的缀合的聚合物。
本发明的方面例如如下。
1.一种使底物缀合的方法，所述方法包括：
使与生物分子结合的抗衡离子与亲脂抗衡离子交换，以形成生物分子复合物；
将所述生物分子复合物分散在非水性溶剂中；和
在所述非水性溶剂的存在下使所述生物分子复合物与底物偶联。
2.根据1所述的方法，其中所述生物分子是多核苷酸。
3.根据1或2所述的方法，其中所述亲脂抗衡离子是亲脂铵离子、亲脂磷鎓离子、亲脂砷离子、亲脂硫鎓离子，或其组合。
4.根据3所述的方法，其中所述亲脂铵离子是四烷基铵、四芳基铵、混合的烷基和芳基铵，或其组合。
5.根据4所述的方法，其中所述亲脂铵离子选自四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵、四丁基铵、四戊基铵、四己基铵、四庚基铵、四辛基铵、其烷基和芳基混合物，及其组合。
6.根据3所述的方法，其中所述亲脂磷鎓离子是四苯基磷鎓。
7.根据3所述的方法，其中所述亲脂砷离子是四烷基砷、四芳基砷、混合的烷基和芳基砷离子，或其组合。
8.根据7所述的方法，其中所述亲脂砷离子是四苯基砷。
9.根据3所述的方法，其中所述亲脂硫鎓离子是三烷基硫鎓离子。
10.根据1-9中任一项所述的方法，其中所述非水性溶剂是不与所述底物和所述生物分子上的偶联基团反应的。
11.根据1-10中任一项所述的方法，其中所述非水性溶剂是极性的。
12.根据1-11中任一项所述的方法，其中所述非水性溶剂是酰胺、脲、碳酸酯、醚、亚砜、砜、受阻醇，或其组合。
13.根据12所述的方法，其中所述酰胺或脲选自甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、乙酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、六甲基磷酰胺、吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮、N,N,N’,N’-四甲基脲、N,N’-二甲基-N,N’-三亚甲基脲，及其组合。
14.根据12所述的方法，其中所述碳酸酯选自碳酸二甲酯、碳酸亚丙基酯，及其组合。
15.根据12所述的方法，其中所述醚是四氢呋喃。
16.根据12所述的方法，其中所述亚砜或砜选自二甲基亚砜、二甲基砜，及其组合。
17.根据12所述的方法，其中所述受阻醇包括叔丁醇。
18.根据1-17中任一项所述的方法，其中所述底物包括聚合物颗粒。
19.根据1-18中任一项所述的方法，其中所述聚合物颗粒包括可与所述生物分子包括的反应基团反应的偶联基团。
20.根据1-19中任一项所述的方法，其中所述偶联基团包括亲核体或亲电体之一，并且所述反应配偶体包括所述亲核体或所述亲电体中的另一个。
21.一种使聚合物颗粒缀合的方法，所述方法包括：
使与多核苷酸结合的阳离子抗衡离子与亲脂阳离子抗衡离子交换，以形成多核苷酸复合物，所述多核苷酸包括亲核或亲电反应基团；
将所述多核苷酸复合物分散在非反应性、非水性溶剂中；和
通过亲核或亲电取代使所述多核苷酸与所述聚合物颗粒偶联，所述聚合物颗粒包括亲电基团或亲核基团。
22.一种聚合物颗粒，所述聚合物颗粒包含使用根据1-21中任一项所述的方法与多核苷酸缀合的聚合物。
23.一种测序方法，所述方法包括：
在寡核苷酸缀合的聚合物颗粒的存在下，扩增靶多核苷酸以形成多核苷酸缀合的聚合物颗粒，所述寡核苷酸至少部分与所述靶多核苷酸互补，所述寡核苷酸缀合的聚合物颗粒通过根据1-21中任一项所述的方法形成；
将所述多核苷酸缀合的聚合物颗粒应用于测序装置；
将引物应用于所述多核苷酸缀合的聚合物颗粒；
掺入核苷酸；和
检测所述掺入。
24.根据23所述的方法，其中检测包括检测与核苷酸掺入相关的离子浓度的变化。
25.一种分离靶多核苷酸的方法，所述方法包括：
使含有所述靶多核苷酸的第一溶液与探针缀合的底物接触，所述探针缀合的底物的探针至少部分与所述靶多核苷酸互补，所述探针缀合的底物通过根据1-21中任一项所述的方法形成；
在所述靶多核苷酸与所述探针偶联的同时洗涤所述探针缀合的底物；和
在第二溶液中释放所述靶多核苷酸。
26.一种使寡核苷酸与聚合物缀合的方法，所述方法包括：
用双NHS酯或二琥珀酰亚胺基碳酸酯处理包含胺官能团的聚合物，以形成官能化的聚合物；和
用胺封端的寡核苷酸处理所述官能化的聚合物，以形成包括所述寡核苷酸的缀合的聚合物。
27.根据26所述的方法，所述方法还包括：
提供包括羟基官能团的起始聚合物；
处理所述起始聚合物以用卤素取代所述羟基官能团；和
进一步用受保护的胺封端的聚醚处理所述起始聚合物，以形成包含所述胺官能团的聚合物。
28.根据26或27所述的方法，其中所述聚合物为聚合物颗粒的形式。
附图说明
通过参考附图，本公开内容可得到更好理解，并且它的多个特征和优点对于本领域技术人员变得显而易见。
图1包括用于处理多核苷酸的示例性方法的举例说明。
图2包括示例性缀合方法的举例说明。
图3包括示例性测序方法的举例说明。
图4包括示例性直接缀合方法的举例说明。
图5包括示例性间接缀合方法的举例说明。
图6包括示例性缀合方法的举例说明。
在不同附图中的相同参考符号的使用指示相似或相同项。
具体实施方式
在一实施方式中，缀合方法包括使与生物分子结合的抗衡离子与亲脂抗衡离子交换，以形成生物分子复合物。在一个例子中，抗衡离子是阳离子的。生物分子复合物例如多核苷酸复合物可分散在非水性溶剂中，并且在非水性溶剂的存在下与底物缀合。示例性底物包括表面，例如陶瓷、金属或聚合物表面。在另一个例子中，底物包括可膨胀的聚合物颗粒。特别地，生物分子可在聚合物颗粒各处缀合至可膨胀聚合物的官能团。
在一个例子中，缀合的底物可用于捕获靶多核苷酸。在特定例子中，缀合的多核苷酸可基于捕获的靶多核苷酸延伸。在聚合物颗粒包括缀合的多核苷酸的多个拷贝的情况下，缀合的多核苷酸的拷贝可依照靶多核苷酸延伸，以提供靶多核苷酸的互补体的多个拷贝。此类颗粒可用于测序技术例如基于离子或pH的测序技术中。
特别地，本方法在非水性溶液内进行缀合。已发现水可与多种缀合化学品竞争或干扰多种缀合化学品，从而减少缀合效率。例如，水可干扰亲核或亲电取代。水可通过使亲电体水解为对于缀合无活性的部分，与亲核体竞争亲电体。通过在非水性溶液或溶剂中缀合，缀合方法例如亲核或亲电取代变得更有效。另外，新缀合化学可用于非水性环境中。
生物分子可包括核苷、核苷酸、核酸(寡核苷酸和多核苷酸)、多肽、糖、多糖、脂质及其衍生物或类似物。在特定例子中，生物分子是多肽或核酸，例如多核苷酸。例如，生物分子可以是多核苷酸或其类似物。
如图1中示出的，生物分子的抗衡离子可与亲脂抗衡离子交换，以提供更亲脂的生物分子复合物。举例说明的生物分子是多核苷酸102。如示出的，多核苷酸102由多个聚合核苷酸形成。核苷酸的碳水化合物部分(X)与相邻的核苷酸的磷酸基结合。每个磷酸基与阳离子抗衡离子(M)结合。在一个例子中，阳离子抗衡离子(M)可以是金属离子。在另一个例子中，阳离子抗衡离子(M)可以是铵或质子。另外，多核苷酸102可包括连接基团(L)，使反应基团(P)与核苷酸链连接。作为另外一种选择，生物分子可以是具有相似的连接基/反应基团结构的多核苷酸类似物，并且多核苷酸可具有从一个或多个碱基延伸出的反应基团(P)，除了从碳水化合物(X)延伸出的反应基团之外或代替从碳水化合物(X)延伸出的反应基团。
在一个例子中，连接基团(L)包括烃、醚或聚醚基团，或其组合。反应基团(P)可作用于与在底物例如聚合物底物上形成的官能团反应。在特定例子中，反应基团(P)可以是胺、硫醇、马来酰亚胺、乙炔、叠氮化物，或其组合。例如，反应基团(P)可以是胺或硫醇。特别地，反应基团(P)可以是胺。在一个例子中，反应基团(P)可以是马来酰亚胺。在进一步的例子中，反应基团(P)可以是乙炔。在进一步的例子中，反应基团(P)可以是叠氮化物。
使多核苷酸102暴露于亲脂抗衡离子104。亲脂抗衡离子104可包括与一个或多个烃基团(R1、R2、R3、R4)偶联并且与相反离子(Z)结合的带正电的成员(Y)。在一个例子中，带正电的成员(Y)可以是氮、磷、硫、砷或其任何组合。特别地，带正电的成员(Y)是氮、磷、硫，或其组合。例如，带正电的成员(Y)可以是氮或磷。特别地，带正电的成员(Y)是氮，从而与烃基团(R1、R2、R3或R4)形成胺。
带正电的成员(Y)包括一个或多个烃基团、例如至少两个烃基团、至少三个烃基团或至少四个烃基团。如所示的，带正电的成员(Y)包括四个烃基团(R1、R2、R3或R4)。烃基团(R1、R2、R3或R4)独立地可以是烷基、芳基、其醚衍生物，或其组合。在一个例子中，烷基烃基团可包括甲基、乙基、丙基或丁基、其醚衍生物，或其组合。例如，丙基可以是正丙基、异丙基，或其组合。在一个例子中，丁基可以是正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基或其任何组合。示例性芳基可包括苯基、甲苯基、二甲苯基或多芳基例如萘基、其醚衍生物，或其任何组合。
特别地，亲脂基团[Y(R1)(R2)(R3)(R4)]可包括亲脂铵离子、亲脂磷鎓离子、亲脂砷离子、亲脂硫鎓离子，或其组合。示例性亲脂铵离子包括四烷基铵、四芳基铵、混合的烷基和芳基铵，或其组合。例如，示例性亲脂铵离子选自四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵、四丁基铵、四戊基铵、四己基铵、四庚基铵、四辛基铵、其烷基和芳基混合物，及其组合。示例性亲脂磷鎓离子包括四苯基磷鎓。示例性亲脂砷离子是四烷基砷、四芳基砷、混合的烷基和芳基砷离子，或其组合。例如，亲脂砷离子是四苯基砷。示例性亲脂硫鎓离子是三烷基硫鎓离子。离子(Z)可以是具有与亲脂基团[Y(R1)(R2)(R3)(R4)]的相反电荷的离子，例如氢氧化物、卤素、硝酸盐、碳酸盐、硫酸盐、高氯酸盐、酚盐、四烷基硼酸盐、四芳基硼酸盐、磷酸盐离子或其任何组合。
由于交换，多核苷酸复合物106显示出亲脂行为，并且可分散在非水性溶剂中。在一个例子中，非水性溶剂是极性的。在进一步的例子中，非水性溶剂不与底物上的偶联基团或聚合物的官能团反应，所述官能团例如多核苷酸复合物106的反应基团(P)。在一个例子中，溶剂包括酰胺、脲、碳酸酯、醚、亚砜、砜、受阻醇(hindered alcohol)，或其组合。示例性酰胺或脲包括甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、乙酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、六甲基磷酰胺、吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮、N,N,N’,N’-四甲基脲、N,N’-二甲基-N,N’-三亚甲基脲，或其组合。示例性碳酸酯包括碳酸二甲酯、碳酸亚丙基酯，或其组合。示例性醚包括四氢呋喃。示例性亚砜或砜包括二甲基亚砜、二甲基砜，或其组合。示例性受阻醇包括叔丁醇。
在交换后或作为交换的一部分，多核苷酸复合物106可分散在非水性溶剂中。分散的多核苷酸复合物106可用于底物的缀合中。
底物可以是固体表面、颗粒，或其组合。在一个例子中，底物可以是固体表面。底物可包括平面、凹或凸表面、或其任何组合。底物可包含纹理或特征，包括蚀刻、凹洞或隆起。作为另外一种选择，底物可缺乏任何纹理或特征。底物可包括毛细管结构、通道、凹槽、深孔或储池(reservoirs)。在一个例子中，底物可以是网。底物可以是多孔、半多孔或非多孔的。在进一步的例子中，底物可以是滤器或凝胶。底物可包括针(例如针阵列)的顶端。底物可由例如下述材料形成：玻璃、硼硅玻璃、二氧化硅、石英、熔融石英、云母、聚丙烯酰胺和N-取代聚丙烯酰胺、塑料聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯(PMA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、硅、锗、石墨、陶瓷、硅、半导体、高折光指数电解质、晶体、凝胶、聚合物或薄膜(例如，金、银、铝或钻石的薄膜)。特别地，底物可包括具有金属薄膜或金属涂层的固体底物。
在特定例子中，底物包括具有多孔性的聚合物颗粒，所述多孔性允许多核苷酸复合物106在聚合物颗粒内的扩散。特别地，聚合物颗粒可包括与多核苷酸复合物106的反应基团(P)反应的反应性官能团。在一个例子中，聚合物颗粒是亲水的。聚合物颗粒可以是可膨胀的。例如，聚合物颗粒可以是水凝胶。亲水聚合物颗粒可暴露官能团，例如羟基或胺基。此类基团可替换为其他官能团，以促进与多核苷酸复合物106的缀合。
在一个例子中，聚合物颗粒可由苯乙烯聚合物、丙烯酸酯聚合物、丙烯酰胺聚合物或其组合形成。例如，聚合物颗粒可由聚合单体形成。单体可以是可自由基聚合单体，例如基于乙烯基的单体。特别地，单体可包括亲水单体。在一个例子中，亲水单体可包括丙烯酰胺、乙酸乙烯酯、甲基丙烯酸羟烷基酯，或其任何组合。在特定例子中，亲水单体是丙烯酰胺，例如包括羟基、氨基或其组合的丙烯酰胺。在一个例子中，亲水单体是氨基烷基丙烯酰胺。在另一个例子中，丙烯酰胺可以是羟烷基丙烯酰胺，例如羟乙基丙烯酰胺。特别地，羟烷基丙烯酰胺可包括N-[三(羟甲基)甲基)丙烯酰胺、N-(羟甲基)丙烯酰胺，或其组合。在特定例子中，单体包括羟基。在进一步例子中，共聚单体可包括例如氨基丙烯酰胺，例如由胺封端的聚乙二醇官能化的丙烯酰胺或丙烯酰基哌嗪。
在一个例子中，聚合物颗粒的聚合物可由使单体和交联剂聚合形成。在一个例子中，以在15:1至1:2范围(例如10:1至1:1的范围、6:1至1:1的范围、或甚至4:1至1:1的范围)的单体与交联剂质量比包括交联剂。特别地，交联剂可以是二乙烯基交联剂。例如，二乙烯基交联剂可包括二丙烯酰胺例如N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(2-羟乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羟丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺，或其组合。在另一个例子中，二乙烯基交联剂包括乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯、六亚甲基双丙烯酰胺、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯，或其组合。
在一个例子中，聚合物颗粒可以是亲水性颗粒，例如水凝胶颗粒。水凝胶是可吸收其重量至少20％的水、例如其重量至少45％、至少65％、至少85％、至少100％、至少300％、至少1000％、至少1500％或甚至至少2000％的水的聚合物。
聚合物颗粒可具有期望的粒径，例如不超过100μm、不超过30μm、或不超过3μm的粒径。平均粒径是平均粒子直径。例如，平均粒径可以是不超过2μm，例如不超过1.5μm、不超过1.1μm、不超过0.8μm、不超过0.6μm、不超过0.5μm、或甚至不超过0.3μm。在特定例子中，平均粒径可在0.1μm至100μm的范围，例如0.1μm至50μm的范围或0.1μm至1.1μm的范围中。
在进一步的例子中，多个颗粒是单分散的，并且可具有期望的低变异系数，例如不超过20％的变异系数。变异系数(CV)定义为标准偏差除以平均值的100倍，其中“平均值”是平均粒子直径，并且标准偏差是粒径的标准偏差。作为另外一种选择，“平均值”可以是z-平均值或模式粒径(mode particle diameter)。依照通常实践，CV在主模式即主峰上进行计算，从而排除与聚集体相关的小峰。因此，低于或高于模式大小的一些颗粒可在计算中打折扣，所述计算可例如基于可检测颗粒的总粒子数的约90％。此类CV测定可在CPS圆盘式离心机或库尔特粒度仪上执行。例如，聚合物颗粒的变异系数(CV)可以是不超过15％，例如不超过10％、不超过5％、不超过4.5％、不超过4.0％、不超过3.5％、或甚至不超过3.0％。
在进一步的例子中，在水中的亲水聚合物颗粒可以是不超过50重量％聚合物，例如不超过30重量％聚合物、不超过20重量％聚合物、不超过10重量％聚合物、不超过5重量％聚合物、或甚至不超过2重量％聚合物。
在另外的例子中，聚合物颗粒可具有允许多核苷酸、蛋白质或酶扩散的多孔性。在一个例子中，聚合物颗粒可具有允许具有下述大小的蛋白质扩散的多孔性：至少50千道尔顿，例如至少100千道尔顿、至少200千道尔顿、至少250千道尔顿、或甚至至少350千道尔顿。
无论是固体表面还是聚合物颗粒，例如上文描述的聚合物颗粒，图1中所示的多核苷酸复合物106均可在非水性溶剂的存在下与底物缀合。例如，底物的聚合物可包括羟基。羟基的一部分可替换为替代的官能团，以促进与多核苷酸复合物例如图1中所示的多核苷酸复合物106的缀合。
底物可经历直接缀合或间接缀合。在特定例子中，聚合物的官能团例如羟基可经历亲核或亲电取代，以使聚合物与多核苷酸缀合。例如，底物的偶联基团可包括亲核体或亲电体之一，并且多核苷酸的末端反应基团可包括亲核体或亲电体中的另一个。多核苷酸可通过亲核或亲电取代与聚合物颗粒偶联。在一个例子中，包括羟基的聚合物的直接缀合可包括用磺酸酯替换羟基，所述磺酸酯随后与包括胺或硫醇反应基团的寡核苷酸或多核苷酸缀合。例如，聚合物颗粒上的羟基可通过用磺酸酯基团替换羟基的至少一部分得到活化。示例性磺酸酯基团可源自三氟乙基磺酰氯、甲磺酰氯、对甲苯磺酰氯或4-氟苯磺酰氯(fosylchloride)、或其任何组合，以提供磺酸酯官能团代替羟基的至少一部分。磺酸酯可作用于允许亲核体替换磺酸酯。磺酸酯还可与释放的氯反应，以提供可在过程中用于缀合颗粒的氯化基团。作为另外一种选择，羟基可替换为卤素基团，所述卤素基团与多核苷酸复合物的反应基团反应。在进一步的例子中，聚合物的共聚单体的胺基可与多核苷酸复合物的反应基团反应。
作为另外一种选择，缀合可以是间接的，其中聚合物官能团例如羟基通过一系列取代被替换，导致可与多核苷酸复合物的反应基团反应的官能团(偶联基团)。例如，图2示出了包括羟基的聚合物202，其可通过一系列一种或多种取代由官能团取代。
例如，在204处，羟基的至少一部分可替换为官能团(A)，例如磺酸酯、除氟之外的卤素，或其组合。如在206处示出的，此类官能团(A)还可替换为官能团(B)，例如叠氮化物、邻苯二甲酰亚胺、硫酯、N-受保护的二胺、N-受保护的氨基硫醚、氨基(寡核苷酸)，或其组合。任选地，如在208处示出的，此类官能团(B)还可由官能团(C)例如胺、硫醇或其组合活化。此外，在208处示出的此类官能团(C)可替换为如在210处示出的官能团(D)，例如单酰胺-单(NHS酯)二羧酸、琥珀酰亚胺硫醚(寡核苷酸)，或其组合。再进一步地，在210处示出的此类官能团(D)可替换为在212处示出的官能团(E)，例如单酰胺-(氨基-寡核苷酸)-单酰胺二羧酸。如此，初始聚合物的官能团可经历一系列取代中的一种或多种，从而提供适合于与多核苷酸复合物反应的反应位点。
作为另外一种选择，具有胺官能团的丙烯酰胺聚合物可用于代替包括羟基的聚合物。例如，示出的羟基可替换为胺封端的聚醚(例如胺封端的PEG)基团。对于胺官能团，示出的方法可例如在(C)处开始。
在特定例子中，在204处的官能团(A)可以是磺酸酯、卤素，或其组合。特别地，卤素是除氟外的卤素，例如氯。官能团(A)可与多核苷酸复合物106反应，其中连接基团(L)是烃或聚醚，并且反应基团(P)是非水性溶剂中的胺，以获得在206处的官能团(B)，例如氨基(寡核苷酸)。在其中在204处的官能团(A)替换为在206处的官能团(B)的另一个例子中，官能团(A)可以是磺酸酯、卤素，或其组合，并且官能团(B)可以是叠氮化物、邻苯二甲酰亚胺、单(N-受保护的)二胺或N-受保护的氨基硫醚。官能团(B)还可活化为官能团(C)，例如胺。胺官能团(C)还可由官能团(D)例如(单-酰胺)-(单-NHS酯)二羧酸活化。官能团(D)还可通过在非水性溶剂中与多核苷酸复合物106反应，由官能团(E)例如(氨基(寡核苷酸))-二羧酸取代，所述多核苷酸复合物106包括烃或聚醚的连接基团(L)和胺的反应性官能团(P)。作为另外一种选择，聚合物颗粒可以是包括共聚单体的共聚物，所述共聚单体包括胺官能团。此类胺官能团可以与其反应。
在进一步的例子中，官能团(A)是磺酸酯、卤素，或其组合。官能团(B)是叠氮化物。在此类情况下，官能团(B)可由官能团(C)例如(寡核苷酸)三唑取代。多核苷酸复合物包括烃或聚醚的连接基团(L)和乙炔的反应性官能团(P)。
在另外的例子中，官能团(A)可以是磺酸酯、卤素，或其组合。官能团(A)由官能团(B)例如硫酯取代。硫酯官能团(B)可由官能团(C)例如硫醇取代，所述官能团(C)进一步由官能团(D)例如琥珀酰亚胺硫醚(寡核苷酸)取代。在此类例子中，多核苷酸复合物可包括连接基(L)例如烃或聚醚，和反应基团(P)例如马来酰亚胺。
其他活化化学包括掺入多步以转化特定官能团，从而纳入特定所需的连接。例如，磺酸酯修饰的羟基可通过几种方法转化成亲核基团。在一个例子中，磺酸酯与叠氮化物阴离子的反应获得叠氮化物取代的亲水聚合物。叠氮化物可经由“CLICK”化学直接用于与乙炔取代的生物分子缀合，所述“CLICK”化学可伴随或不伴随铜催化进行。任选地，叠氮化物可通过例如与氢的催化还原或与有机膦的还原而转化为胺。所得的胺随后可用多种试剂转化为亲电基团，所述多种试剂例如二异氰酸酯、双NHS酯、三聚氯氰，或其组合。在一个例子中，使用二异氰酸酯获得在聚合物和连接基之间的脲连接，所述脲连接导致能够与氨基取代的生物分子反应的残留异氰酸酯基团，从而获得在连接基和生物分子之间的脲连接。在另一个例子中，使用双NHS酯获得在聚合物和连接基之间的酰胺连接，和能够与氨基取代的生物分子反应的残留的NHS酯基团，从而获得在连接基和生物分子之间的酰胺连接。示例性双NHS酯包括双琥珀酰亚胺基C2-C12烷基酯，例如双琥珀酰亚胺基辛二酸酯或双琥珀酰亚胺基戊二酸酯。在进一步的例子中，使用三聚氯氰获得在聚合物和连接基之间的氨基-三嗪连接，和两个残留的氯-三嗪基团，其中之一能够与氨基取代的生物分子反应，以获得在连接基和生物分子之间的氨基-三嗪连接。其他亲核基团可经由磺酸酯活化掺入颗粒内。例如，磺酸化的颗粒与硫代苯甲酸阴离子的反应和后续硫代苯甲酸酯的水解将硫醇掺入颗粒内，所述颗粒可随后与马来酰亚胺取代的生物分子反应，以获得与生物分子的硫代-琥珀酰亚胺连接。硫醇还可与溴-乙酰基反应。
在进一步的例子中，聚合物颗粒可进行处理，以形成可通过使用双NHS酯或二琥珀酰亚胺基碳酸酯缀合的胺官能团。示例性双NHS酯包括双琥珀酰亚胺基C2-C12烷基酯，例如双琥珀酰亚胺基辛二酸酯或双琥珀酰亚胺基戊二酸酯。例如，聚合物颗粒例如包括暴露的羟基的颗粒可进行处理，以用卤素例如氯替换羟基。颗粒还可在酸条件下用tBOC(N-叔丁氧羰基)保护的胺封端的聚醚例如聚乙二醇(PEG)进行处理，从而提供还可用于缀合聚合物颗粒的胺官能团。作为另外一种选择，聚合物颗粒可使用提供胺官能团的单体进行聚合。包括胺基的聚合物颗粒还可使用双NHS酯或二琥珀酰亚胺基碳酸酯进行处理，所述聚合物颗粒进一步暴露于胺封端的寡核苷酸，从而产生与寡核苷酸缀合的聚合物颗粒。
在缀合后，聚合物颗粒可包括至少7x 104/μm3的多核苷酸密度，称为核苷酸密度。例如，核苷酸密度可以是至少105/μm3，例如至少106/μm3、至少2x106/μm3、至少5x106/μm3、至少8x106/μm3、至少1x 107/μm3、或甚至至少3x107/μm3。
在特定例子中，缀合的颗粒可用于分离技术或测序技术中。例如，缀合的颗粒可用于捕获靶多核苷酸。在一个例子中，与聚合物缀合的多核苷酸可基于捕获的靶多核苷酸进行延伸。此类缀合的颗粒可用于测序技术例如基于离子或基于pH的测序技术中。如图3中所示，多个缀合的聚合物颗粒304可连同多个靶多核苷酸302一起置于溶液中。多个颗粒304可与探针多核苷酸缀合，以与靶多核苷酸302结合。例如，缀合的颗粒304可包括与靶多核苷酸302的一部分互补的寡核苷酸。
在特定实施方式中，对颗粒304和多核苷酸302实施聚合酶链反应(PCR)扩增。例如，分散相小滴306或308作为乳状液的一部分形成，并且可包括亲水性颗粒或多核苷酸。在一个例子中，靶多核苷酸302和亲水性颗粒304以低浓度和相对于彼此的低比率提供，使得单个多核苷酸302可能位于与单个亲水性颗粒304相同的分散相小滴内。其他小滴例如小滴308可包括单个亲水性颗粒且不包括多核苷酸。每个小滴306或308可包括酶、核苷酸、盐或足以促进多核苷酸复制的其他组分。
靶多核苷酸的复制可包括调节复制条件。调节可任选包括：增加或降低聚合酶浓度；增加或降低核苷酸浓度；增加或降低阳离子浓度；增加或降低反应温度、时间或pH等等。调节可包括增加或降低反应速率、增加或降低反应产物收率等等。复制可在适当缓冲剂或核苷酸(包括核苷酸类似物或生物素化的核苷酸)的存在下进行。
特别地，待扩增的多核苷酸可通过聚合物颗粒捕获。用于捕获核酸的示例性方法可包括：使多核苷酸水解为寡核苷酸，所述寡核苷酸附着至聚合物颗粒。用于捕获核酸的方法可包括：(a)提供附着至单链寡核苷酸(例如捕获寡核苷酸)的聚合物颗粒；(b)提供单链多核苷酸；和(c)使单链寡核苷酸水解为单链多核苷酸，由此将单链多核苷酸捕获至聚合物颗粒。聚合物颗粒各自可与多个单链寡核苷酸(例如捕获寡核苷酸)附着。在一些实施方式中，步骤(c)可用多个单链多核苷酸进行。在一些实施方式中，单链寡核苷酸的至少一部分包括与单链多核苷酸的至少一部分互补(或部分互补)的核苷酸序列。
在一个例子中，该方法还可包括将多核苷酸扩增成多个多核苷酸，并且使多个多核苷酸的至少一部分附着至亲水性颗粒，由此生成包括多个附着的多核苷酸的亲水性颗粒。作为另外一种选择，该方法可包括通过延伸缀合的寡核苷酸将多核苷酸扩增成多个互补多核苷酸，由此生成包括多个附着的多核苷酸的水凝胶颗粒。
在进一步的例子中，用于核苷酸掺入的方法可包括：对多核苷酸进行核苷酸聚合反应，所述多核苷酸水解为附着至聚合物颗粒的寡核苷酸。在一些实施方式中，用于核苷酸掺入的方法包括：(a)提供附着至单链寡核苷酸(例如引物寡核苷酸)的聚合物颗粒；(b)提供单链模板多核苷酸；(c)使单链寡核苷酸与单链模板多核苷酸杂交；和(d)在适合于聚合酶催化至少一个核苷酸聚合到单链寡核苷酸上的条件下，使单链模板多核苷酸与聚合酶和至少一个核苷酸接触，由此进行核苷酸掺入。在一些实施方式中，聚合物颗粒各自可与多个单链寡核苷酸(例如捕获寡核苷酸)附着。在一些实施方式中，步骤(b)、(c)或(d)可用多个单链多核苷酸进行。在一些实施方式中，单链寡核苷酸的至少一部分包含与单链多核苷酸的至少一部分互补(或部分互补)的核苷酸序列。在一些实施方式中，系统包含与单链寡核苷酸杂交的单链多核苷酸，所述单链寡核苷酸附着至聚合物颗粒，其中至少一个核苷酸聚合到单链寡核苷酸的末端上。
在另一个例子中，用于引物延伸的方法可包括：对多核苷酸进行引物延伸反应，所述多核苷酸与附着至聚合物颗粒的寡核苷酸杂交。在一些实施方式中，用于核酸引物延伸的方法包括：(a)提供附着至单链寡核苷酸(例如引物寡核苷酸)的聚合物颗粒；(b)提供单链模板多核苷酸；(c)使单链寡核苷酸与单链模板多核苷酸杂交；和(d)在适合于聚合酶催化至少一个核苷酸聚合到单链寡核苷酸上的条件下，使单链模板多核苷酸与聚合酶和至少一个核苷酸接触，由此延伸引物。在一些实施方式中，聚合物颗粒各自可与多个单链寡核苷酸(例如捕获寡核苷酸)附着。在一些实施方式中，步骤(b)、(c)或(d)可用多个单链多核苷酸进行。在一些实施方式中，单链寡核苷酸的至少一部分包含与单链多核苷酸的至少一部分互补(或部分互补)的核苷酸序列。在一些实施方式中，系统包含与单链寡核苷酸杂交的单链多核苷酸，所述单链寡核苷酸附着至聚合物颗粒，其中所述单链寡核苷酸由一个或多个核苷酸延伸。
在另外的例子中，用于核酸扩增的方法包括：对多核苷酸进行引物延伸反应，所述多核苷酸与附着至聚合物颗粒的寡核苷酸杂交。在一些实施方式中，用于核酸扩增的方法包括：(a)提供附着至单链寡核苷酸(例如引物寡核苷酸)的聚合物颗粒；(b)提供单链模板多核苷酸；(c)使单链寡核苷酸与单链模板多核苷酸杂交；(d)在适合于聚合酶催化至少一个核苷酸聚合到单链寡核苷酸上的条件下，使单链模板多核苷酸与聚合酶和至少一种核苷酸接触，以便生成延伸的单链寡核苷酸。在一些实施方式中，该方法还包括：(e)从延伸的单链寡核苷酸去除(例如使变性)单链模板多核苷酸，使得单链寡核苷酸保持附着至聚合物颗粒；(f)使剩余的单链寡核苷酸与第二单链模板多核苷酸杂交；和(g)在适合于第二聚合酶催化第二至少一个核苷酸聚合到单链寡核苷酸上的条件下，使第二单链模板多核苷酸与第二聚合酶和第二至少一个核苷酸接触，以便生成后续延伸的单链寡核苷酸。在一些实施方式中，步骤(e)、(f)和(g)可重复至少一次。在一些实施方式中，聚合酶和第二聚合酶包含热稳定的聚合酶。在一些实施方式中，适合于核苷酸聚合的条件包括在高温下进行核苷酸聚合步骤(例如步骤(d)或(g))。在一些实施方式中，适合于核苷酸聚合的条件包括在交替温度(例如高温和相对更低的温度)下进行核苷酸聚合步骤(例如步骤(d)或(g))。在一些实施方式中，交替温度范围为60-95℃。在一些实施方式中，温度循环可以是约10秒至约5分钟、或约10分钟、或约15分钟或更久。在一些实施方式中，用于核酸扩增的方法可生成各自附着至多个模板多核苷酸的一种或多种聚合物颗粒，所述多个模板多核苷酸包含与单链模板多核苷酸或第二单链模板多核苷酸互补的序列。在一些实施方式中，聚合物颗粒各自可与多个单链寡核苷酸(例如捕获寡核苷酸)附着。在一些实施方式中，步骤(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)可用多个单链多核苷酸进行。在一些实施方式中，单链寡核苷酸的至少一部分包含与单链多核苷酸的至少一部分互补(或部分互补)的核苷酸序列。在一些实施方式中，用于核酸扩增的方法(如上所述)可在油相(例如分散相小滴)中的水相溶液中进行。
在PCR后，形成颗粒例如颗粒310，其可包括亲水性颗粒312和靶多核苷酸或其互补体的多个拷贝314。虽然多核苷酸314作为在颗粒310的表面上示出，但多核苷酸314可在颗粒310内延伸。水凝胶和具有相对于水的低浓度聚合物的亲水性颗粒可包括在颗粒310内部和各处的多核苷酸区段，或多核苷酸可位于孔及其他开口内。特别地，颗粒310可允许酶、核苷酸、引物和用于监控反应的反应产物的扩散。大量多核苷酸/颗粒在特定测序技术中产生更佳的信号。
在示例性实施方式中，颗粒310可用于测序装置中。例如，测序装置316可包括孔138的阵列。颗粒310可置于孔318内。
在一个例子中，引物可加入孔318中，或颗粒310可在置于孔318内之前预暴露于引物。引物和多核苷酸形成包括与引物杂交的多核苷酸(例如模板核酸)的核酸双链体。核酸双链体是至少部分双链的多核苷酸。酶和核苷酸可提供给孔318，以促进可察觉的反应，例如核苷酸掺入。
测序可通过检测核苷酸添加进行。核苷酸添加可使用诸如荧光发射法或离子检测法的方法进行检测。例如，一组荧光标记的核苷酸可提供给系统316，并且可迁移至孔318。激发能也可提供给孔318。当核苷酸由聚合酶捕获并加入延伸引物的末端时，核苷酸的标记可发荧光，从而指示加入哪种类型的核苷酸。
在替代例子中，包括单一类型核苷酸的溶液可序贯进料。响应核苷酸添加，在孔318的局部环境内的pH可改变。此类pH变化可通过离子敏感场效应晶体管(ISFET)进行检测。像这样，pH变化可用于生成指示与颗粒310的多核苷酸314互补的核苷酸次序的信号。
特别地，测序系统可包括设置在离子传感器例如场效应晶体管(FET)的传感器垫上的孔或多个孔。在一些实施方式中，系统包括装载到孔内的一个或多个聚合物颗粒，所述孔设置在离子传感器(例如FET)的传感器垫上，或包括装载到多个孔内的一个或多个聚合物颗粒，所述多个孔设置在离子传感器(例如FET)的传感器垫上。在一些实施方式中，FET可以是chemFET或ISFET。“chemFET”或化学场效应晶体管包括充当化学传感器的一类场效应晶体管。它是MOSFET晶体管的结构类似物，其中在门电极上的电荷由化学过程施加。“ISFET”或离子敏感场效应晶体管可用于测量溶液中的离子浓度；当离子浓度(例如H+)改变时，通过晶体管的电流相应地改变。
FET可以是FET阵列。如本文使用的，“阵列”是元件例如传感器或孔的平面排列。阵列可以是一维或二维的。一维阵列可以是具有在第一维度中的一列(或行)元件和在第二维度中的多个行(或列)的阵列。第一和第二维度中的列(或行)数目可相同或不同。
一种或多种微流体结构可在FET传感器阵列上方制造，以提供生物学或化学反应的约束或限制。例如，在一种实施中，一种或多种微流体结构可构造为设置在阵列的一种或多种传感器上的一个或多个孔(或微孔、或反应室、或反应孔，因为这些术语在本文中可互换使用)，使得给定孔设置在其上的一种或多种传感器检测并测量给定孔中的分析物存在、水平或浓度。在一些实施方式中，可存在FET传感器和反应孔的1:1对应。
回到图3，在另一个例子中，孔阵列的孔318可以可操作地连接至测量装置。例如，对于荧光发射法，孔318可以可操作地偶联至光检测装置。在离子检测的情况下，孔318的下表面可设置在离子传感器例如场效应晶体管的传感器垫上。
涉及经由核苷酸掺入的离子副产物检测测序的一个示例性系统为Ion TorrentPGMTM测序仪(Life Technologies)，所述Ion Torrent PGMTM测序仪是基于离子的测序系统，其通过检测作为核苷酸掺入的副产物产生的氢离子来测序核酸模板。通常，氢离子作为在通过聚合酶的模板依赖性核酸合成过程中发生的核苷酸掺入的副产物释放。IonTorrent PGMTM测序仪通过检测核苷酸掺入的氢离子副产物来检测核苷酸掺入。IonTorrent PGMTM测序仪可包括待测序的多个模板多核苷酸，每个模板设置在阵列中的各自测序反应孔内。阵列的孔可各自与至少一种离子传感器偶联，所述离子传感器可检测作为核苷酸掺入的副产物产生的H+离子的释放或溶液pH变化。离子传感器包括与离子敏感的检测层偶联的场效应晶体管(FET)，所述离子敏感的检测层可感测H+离子的存在或溶液pH变化。离子传感器可提供指示核苷酸掺入的输出信号，所述输出信号可表示为其量级与各自孔或反应室中的H+离子浓度关联的电压变化。不同核苷酸类型可连续流动到反应室内，并且可以由模板序列决定的次序通过聚合酶掺入延伸引物(或聚合位点)内。每个核苷酸掺入可伴随反应孔中H+离子的释放，连同局部化pH的伴随变化。H+离子的释放可通过传感器的FET登记，所述传感器产生指示核苷酸掺入的发生的信号。在特定核苷酸流动过程中未掺入的核苷酸可能不产生信号。来自FET的信号幅度还可与掺入延伸核酸分子内的特定类型核苷酸的数目关联，由此允许分辨均聚物区域。因此，在测序仪的运行过程中，进入反应室内的多个核苷酸流连同跨越多个孔或反应室的掺入监控可允许仪器同时分辨多个核酸模板的序列。关于Ion Torrent PGMTM测序仪组成、设计和操作的更多细节可例如在下述专利申请中找到：美国专利申请序列号12/002781，目前作为美国专利公开号2009/0026082公开；美国专利申请序列号12/474897，目前作为美国专利公开号2010/0137143公开；和美国专利申请序列号12/492844，目前作为美国专利公开号2010/0282617公开，所有所述专利申请均以引用的方式全文并入本文。
实施例
实施例1
如图4中所示，使寡核苷酸直接缀合至甲磺酰活化的Dynal颗粒。虽然官能团作为在颗粒的表面上示出，但官能团可存在于颗粒各处。甲磺酰氯活化的微凝胶体经由Ugelstad过程——一种种子乳液聚合进行制备。因此形成的颗粒在制剂中在N-甲基-2吡咯烷酮(NMP)中进行洗涤，用于与离子交换的单链DNA的缀合。
将5’-NH2-C6-30-聚体寡核苷酸的钠盐溶解于0.1M四丁基乙酸铵，并且注射到反相HPLC柱上。洗脱用0.1M四丁基乙酸铵流动相进行。收集含有核酸的级分，冻干为干粉，并且重悬浮于纯N-甲基-2吡咯烷酮(NMP)中。
将五百万颗粒(5.0x109)分散在350uL无水NMP中，并且涡旋混合以分散。将124uL在NMP(4.10mM)中的Bu4NAc-DNA(5’-NH2-C6-30-聚体寡核苷酸)直接加入颗粒混合物中。随后将19.5uL四乙基硼酸铵(26.14mM)加入反应混合物中，共～500uL的最终体积。
将反应混合物快速涡旋混合，并且在70℃下轻轻混合16小时。将混合物离心，将上清液倾析，并且将颗粒重悬浮于1mL NMP中。在涡旋混合后，使用在NMP中的两轮沉淀/分散，使重悬浮的微凝胶体颗粒形成团块。在第二次NMP洗涤后，将团块放(brought up)在1mL2xSSPE/0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)中，混合并离心成团块。最后，将颗粒放在1mL 1x PBS/0.1％Triton X-100中，混合并离心成牢固团块，将该过程重复三次。在末次循环后，使缀合的微凝胶体重悬浮于500uL 1xPBS/0.1％Triton X-100中。
随后在用SYBR-金染剂标记后，用流式细胞仪计数缀合的材料。该材料已经可以用于制剂中的DNA模板的PCR扩增以备用于测序。
实施例2
如图5中所示，颗粒通过一系列取代进行缀合。虽然官能团作为在颗粒的表面上示出，但官能团可存在于颗粒各处。
向在2ml离心管中的在NMP中的甲磺酰氯活化的水凝胶溶液(20亿，1ml)中，加入在NMP(800uL)中的饱和四甲基叠氮化铵溶液，并且将反应混合物在60℃下搅拌过夜。将反应混合物以21300rcf离心10分钟，并且去除上清液。将所得的团块重悬浮于NMP中，并且离心以去除上清液。将该过程重复两次。
将所得的团块重悬浮于去离子(DI)水(1ml)中。将反应混合物以21300rcf离心10分钟，并且去除上清液。将该过程再重复2次。
向团块中加入1ml TCEP溶液(DI水，1M)，并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物以21300rcf离心10分钟，以去除上清液。再两次将所得的团块重悬浮于DI水中，并且以21300rcf离心10分钟，以去除上清液。将反应混合物重悬浮于无水NMP(1ml)中，并且以21300rcf离心10分钟。去除上清液，并且将该过程再重复3次。
将所得的团块重悬浮于无水NMP(500ul)中，并且将在无水NMP中的双NHS辛二酸酯溶液(200uL,20mg)加入反应混合物中。将反应混合物在70℃下搅拌过夜。将反应混合物以21300rcf离心10分钟，以去除上清液。将反应混合物重悬浮于无水NMP(1ml)中，并且以21300rcf离心10分钟，以去除上清液。将该过程再重复五次，并且将所得的团块重悬浮于无水NMP(200uL)中。
向反应混合物中，加入寡核苷酸溶液(在NMP中的Bu4NAc-DNA(5’-NH2-C6-30-聚体寡核苷酸))(0.6微摩尔，200uL)和在无水NMP中的四丁基硼酸铵溶液(60uL，在200uL中的1mg)，并且将反应混合物在70℃下搅拌过夜。
将反应混合物以21300rcf离心10分钟，以去除上清液，并且将所得的团块重悬浮于NMP(1ml)中。将反应混合物以21300rcf离心10分钟，并且将所得的团块重悬浮于NMP中。将该过程再重复三次，并且将团块重悬浮于2x SSPE+0.2％SDS溶液(1ml)中，并且以21300rcf离心10分钟。将所得的团块重悬浮于具有0.1％Triton X100的1xTE缓冲液(1ml)中。将反应混合物以21300rcf离心10分钟。将团块重悬浮于1xTE缓冲液中，并且在80℃下搅拌1小时。将混合物以21300rcf离心10分钟，以去除上清液。将团块重悬浮于具有0.1％Triton X100的1xTE缓冲液(1ml)中，并且以21300rcf离心10分钟，以去除上清液。将该过程重复一次。将团块重悬浮于30％氨溶液(1ml)，并且在室温下搅拌15分钟。将反应混合物以21300rcf离心10分钟，以去除上清液，并且将团块重悬浮于DI水(1ml)中。将反应混合物以21300rcf离心10分钟，以去除上清液，并且将该过程再重复两次。将团块重悬浮于具有0.1％Triton X100的1xTE缓冲液(1ml)中。将反应混合物以21300rcf离心10分钟，以去除上清液，并且将该过程再重复一次。将团块重悬浮于具有0.1％Triton X100的1xTE缓冲液中，并且将反应混合物以21300rcf离心10分钟，以去除上清液。将该过程再重复一次，并且将团块重悬浮于具有0.1％Triton X100的1xTE缓冲液(500uL)中。
实施例3氨基-水凝胶的活化以及水凝胶与胺末端DNA探针的缀合。
向在无水、不含胺的N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的1000亿氨基-水凝胶(直径＝0.55微米，2300万胺/微米3)溶液(600μL)中加入固体双琥珀酰亚胺基辛二酸酯(22.1mg,60μmol)，随后加入三丁胺(14μL,60μmol)。在60℃下搅拌1小时，通过离心(在21300rcf下30分钟)分离水凝胶。用不含胺的无水NMP(1ml)稀释水凝胶团块，并且通过离心分离；将该洗涤过程重复2次，并且将最终团块重悬浮于NMP(600μL)中。将该水凝胶悬浮液用乙酸酐(30μL,317μmol)和三丁胺(30μL,126μmol)进行处理，并且在室温下搅拌2小时。所得的水凝胶通过离心(在21300rcf下30分钟)进行分离，并且团块用不含胺的无水NMP(1ml)进行稀释，并且通过离心进行分离；将该洗涤过程重复2次，并且将最终活化的、封端(capped)团块用1μmol的四丁基铵5’-氨基-寡核苷酸、三丁胺(1μmol)和不含胺的NMP的3μmol NMP溶液稀释至600μL的最终体积。在70℃下搅拌16小时后，通过离心(在21300rcf下30分钟)分离DNA缀合的水凝胶。将团块用NMP(1ml)洗涤，随后用去离子水(1ml)洗涤，使用离心以分离团块。将最终的水凝胶团块用1X TE缓冲液(1.6ml)稀释，并且在80℃下搅拌1小时。将水凝胶通过离心(在21300rcf下30分钟)进行分离，并且用DI水(1ml)洗涤两次(使用离心以用于团块分离)。向最终团块中，加入30％氨水；在室温下15分钟后，将水凝胶离心(在21300rcf下20分钟)分离，并且用DI水(1ml)洗涤3X，使用离心用于分离。将最终团块重悬浮于对于进行靶扩增所需的缓冲液中。
实施例4.
图6中示出了甲磺酰化水凝胶由单保护的二胺的官能化，伴随后续脱保护、活化以及与有机可溶性DNA探针的缀合。
向2000亿甲磺酰化水凝胶(直径＝0.6微米)(通过在无水、不含胺的N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的离心浓缩)团块中加入1mL作为50mM溶液的单-t-Boc保护的二胺：O-(2-氨乙基)-O′-[2-(Boc-氨基)乙基]六甘醇。在70℃下搅动12小时后，水凝胶通过离心进行分离，用去离子水洗涤一次，并且在室温下在1mL 30％HCl水溶液中脱保护；在1小时后，水凝胶通过离心进行分离，并且用5mL份的去离子水洗涤5次。水凝胶通过水性悬浮液的离心进行脱水，并且用1mL无水、不含胺的NMP稀释；将该过程再重复3次。在末次离心后，将团块用0.6mL125mM二琥珀酰亚胺基碳酸酯的NMP溶液活化，向所述NMP溶液中加入30μL三丁胺；在室温下2小时后，通过离心分离活化的水凝胶，并且将团块用1mL份的无水、不含胺的NMP洗涤5次。向所得的团块中加入0.5mL四丁基铵5’-氨基-寡核苷酸和三丁胺(30μL)的3μmol NMP溶液；在70℃下搅动12小时后，缀合的水凝胶通过离心进行浓缩，并且用1mL份的NMP洗涤3次。缀合的水凝胶团块用1X TE缓冲液(1.6ml)进行稀释，并且在80℃下搅拌1小时，并且随后通过离心进行分离。在用去离子水洗涤两次后，将最终团块重悬浮于对于进行靶扩增所需的缓冲液中。
在第一个方面，使底物缀合的方法包括使与生物分子结合的抗衡离子与亲脂抗衡离子交换，以形成生物分子复合物，将生物分子复合物分散在非水性溶剂中，并且在非水性溶剂的存在下使生物分子复合物与底物偶联。
在第一个方面的例子中，生物分子是多核苷酸。
在第一个方面的另一个例子和上述例子中，亲脂抗衡离子是亲脂铵离子、亲脂磷鎓离子、亲脂砷离子、亲脂硫鎓离子，或其组合。例如，亲脂铵离子是四烷基铵、四芳基铵、混合的烷基和芳基铵，或其组合。在一个例子中，亲脂铵离子选自四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵、四丁基铵、四戊基铵、四己基铵、四庚基铵、四辛基铵、其烷基和芳基混合物，及其组合。在进一步的例子中，亲脂磷鎓离子是四苯基磷鎓。在另外的例子中，亲脂砷离子是四烷基砷、四芳基砷、混合的烷基和芳基砷离子，或其组合。在另一个例子中，亲脂砷离子是四苯基砷。在一个例子中，亲脂硫鎓离子是三烷基硫鎓离子。
在第一个方面的进一步例子和上述例子中，非水性溶剂不与底物和生物分子上的偶联基团反应。
在第一个方面的另外例子和上述例子中，非水性溶剂是极性的。
在第一个方面的另一个例子和上述例子中，非水性溶剂是酰胺、脲、碳酸酯、醚、亚砜、砜、受阻醇，或其组合。例如，酰胺或脲选自甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、乙酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、六甲基磷酰胺、吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮、N,N,N’,N’-四甲基脲、N,N’-二甲基-N,N’-三亚甲基脲，及其组合。在另一个例子中，碳酸酯选自碳酸二甲酯、碳酸亚丙基酯，及其组合。在另外的例子中，醚是四氢呋喃。在进一步的例子中，亚砜或砜选自二甲基亚砜、二甲基砜，及其组合。在另一个例子中，受阻醇包括叔丁醇。
在第一个方面的进一步例子和上述例子中，底物包括聚合物颗粒。
在第一个方面的另外例子和上述例子中，聚合物颗粒包括与生物分子的反应基团反应的偶联基团。
在第一个方面的一个例子和上述例子中，偶联基团包括亲核体或亲电体之一，并且反应基团包括亲核体或亲电体中的另一个。
在第二个方面，使聚合物颗粒缀合的方法包括使与多核苷酸结合的阳离子抗衡离子与亲脂阳离子抗衡离子交换，以形成多核苷酸复合物，该多核苷酸包括亲核或亲电反应基团。该方法还包括将多核苷酸复合物分散在非反应性、非水性溶剂中，并且通过亲核或亲电取代使多核苷酸与聚合物颗粒偶联，该聚合物颗粒包括亲电基团或亲核基团。
在第三个方面，聚合物颗粒包括使用上述方面或例子中的任一种的方法与多核苷酸缀合的聚合物。
在第四个方面，测序方法包括在寡核苷酸缀合的聚合物颗粒的存在下，扩增靶多核苷酸以形成多核苷酸缀合的聚合物颗粒。寡核苷酸至少部分与靶多核苷酸互补。寡核苷酸缀合的聚合物颗粒通过上述方面或例子中的任一种的方法形成。该方法还包括将多核苷酸缀合的聚合物颗粒应用于测序装置，将引物应用于该多核苷酸缀合的聚合物颗粒，掺入核苷酸并检测掺入。
在第四个方面的一个例子中，检测包括检测与核苷酸掺入相关的离子浓度的变化。
在第五个方面，分离靶多核苷酸的方法包括使包括靶多核苷酸的第一溶液与探针缀合的底物接触。探针缀合的底物的探针至少部分与靶多核苷酸互补。探针缀合的底物通过上述方面或例子中的任一种的方法形成。该方法还包括在靶多核苷酸与探针偶联的同时洗涤探针缀合的底物，并且在第二溶液中释放靶多核苷酸。
在另外一个方面，使寡核苷酸与聚合物缀合的方法包括用双NHS酯或二琥珀酰亚胺基碳酸酯处理包含胺官能团的聚合物，以形成官能化的聚合物，并且用胺封端的寡核苷酸处理官能化的聚合物，以形成包括寡核苷酸的缀合的聚合物。
在另外方面的一个例子中，该方法还包括提供包括羟基官能团的起始聚合物，处理起始聚合物以用卤素取代羟基官能团，并且进一步用受保护的胺封端的聚醚处理起始聚合物，以形成包含胺官能团的聚合物。
在另外方面的另一个例子和上述例子中，聚合物为聚合物颗粒的形式。
在进一步的例子中，寡核苷酸经历上述方面及其例子的方法的处理。
虽然上文描述了与聚合物颗粒的缀合，但此类缀合方法可应用于多种形式的类似官能化的聚合物，所述形式例如珠、底物、片层、杆、各种形状的聚合物形式，或其任何组合。
应当指出，并非需要在上文一般描述或例子中所述的活性的全部，特异活性的一部分可能是不需要的，除了所述的那些活性，可以实施且一种或多种其他的活性。再进一步地，其中活性列出的次序不需要是实施它们的次序。
在前述说明书中，已关于具体实施方式描述了本发明的概念。然而，本领域普通技术人员应当理解可作出多种修饰和变化，而不背离如下文权利要求中所示的本发明的范围。因此，说明书和附图应以举例说明而不是限制性含义加以考虑，并且所有此类修饰预期包括在本发明的范围内。
如本文使用的，术语“包含”、“包括”、“具有”或其任何其它变型预期覆盖非排他性包括。例如，包括一系列特征的过程、方法、物品或仪器不必须仅限于这些特征，而是可包括对此类过程、方法、物品和或仪器未明确列出或固有的其他特征。此外，除非另有明确相反描述，“或”指包括性-或而非排他性-或。例如，条件A或B满足下述中的任何一种：A是真的(或存在的)并且B是假的(或不存在的)，A是假的(或不存在的)并且B是真的(或存在的)，以及A和B均为真的(或存在的)。
另外，“一个”或“一种”的使用用于描述本文描述的元件和组分。这样做仅为了方便，并且给出本发明范围的一般含义。该描述应视为包括一个/种或至少一个/种，并且单数还包括复数，除非很明显另有所指。
益处、其他优点和问题的解决方案已在上文就具体实施方式而言进行描述。然而，益处、优点、问题的解决方案以及可引起任何益处、优点或解决方案发生或变得更明显的任何一个或多个特征不应解释为任何或所有权利要求的关键、所需或基本特征。
在阅读说明书后，技术人员应当理解为了清楚起见，本文在分开实施方式的上下文中描述的某些特征还可在单个实施方式中组合提供。相反，为了简要起见，在单个实施方式的上下文中描述的多个特征还可分开或在任何子组合中提供。此外，对范围中所述的值的提及包括在该范围内的每个值。

Claims (8)

1.一种使寡核苷酸与聚合物缀合的方法，所述方法包括：
用双NHS酯或二琥珀酰亚胺基碳酸酯处理包含胺官能团的聚合物，以形成官能化的聚合物；和
用胺封端的寡核苷酸处理所述官能化的聚合物，以形成包括所述寡核苷酸的缀合的聚合物。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：
提供包括羟基官能团的起始聚合物；
处理所述起始聚合物以用卤素取代所述羟基官能团；和
进一步用受保护的胺封端的聚醚处理所述起始聚合物，以形成包含所述胺官能团的聚合物。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述聚合物为聚合物颗粒的形式。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述卤素为氯。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述聚合物颗粒是使用提供胺官能团的单体进行聚合的。
6.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：
提供包括羟基官能团的起始聚合物；
将所述羟基官能团的至少一部分替换为选自如下的第一官能团：磺酸酯、卤素，或其组合；
将所述第一官能团替换为选自如下的第二官能团：叠氮化物、邻苯二甲酰亚胺、单(N-受保护的)二胺、或N-受保护的氨基硫醚；以及
将所述第二官能团活化为胺官能团，以形成包含所述胺官能团的聚合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一官能团为磺酸酯官能团。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述第二官能团为叠氮化物官能团。
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