CN105209638B - 基质阵列和其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种形成聚合物基质阵列的方法包括向孔阵列的孔中施加水溶液。所述水溶液包括聚合物前驱体。所述方法进一步包括在所述孔阵列上面施加不可混溶流体以分隔所述孔阵列的所述孔内的所述水溶液，并且使所述孔阵列的所述孔中分隔的所述聚合物前驱体聚合以形成所述聚合物基质阵列。一种设备包括感测器阵列、对应于所述感测器阵列的孔阵列以及安置于所述孔阵列中的聚合物基质阵列。

Description

基质阵列和其制备方法
技术领域
本公开内容总体上涉及限定反应体积的基质(matrix)阵列和形成这样的基质阵列的方法。
背景技术
小体积聚合物基质阵列日益受到例如分析化学和分子生物学领域研究人员的关注。这些小体积聚合物基质可用于捕捉分析物以及在稀释系统中进行分析，或可用于同时进行多种分析物的分析。特别地，这些聚合物基质阵列可用于基因测序技术。
已经证实例如桑格测序(Sanger sequencing)的早期基因测序技术昂贵并且耗时。最近，已针对基于荧光的测序技术研究了珠粒阵列。然而，这样的技术遭受与捕捉待测序的目标多核苷酸以及在测序期间将这样的目标多核苷酸保留在可分辨反应体积内有关的困难。此外，从业人员报导与制备珠粒和珠粒阵列有关的困难。
发明内容
在一实施方式中，可将聚合物基质前驱体施加至与一个或多个感测器关联(associate)的孔阵列。聚合物基质前驱体可聚合以形成聚合物基质阵列。这些聚合物基质可缀合(结合，conjugate)到寡核苷酸并且可用于多种分析技术，包括基因测序技术。
附图说明
通过参考附图，可以更好地理解本公开内容，并且使本领域技术人员清楚其众多特征和优势。
图1包括示范性测量系统的图示。
图2包括示范性测量组件的图示。
图3包括示范性测量组件阵列的图示。
图4包括示范性孔配置的图示。
图5包括示范性孔和感测器配置的图示。
图6、图7、图8以及图9包括工件在通过示范性方法处理期间的图示。
图10、图11以及图12包括工件在通过示范性方法处理期间的图示。
图13、图14以及图15包括工件在通过示范性方法处理期间的图示。
在不同附图中相同附图标记的使用指示相似或相同的项目。
具体实施方式
在一示范性实施方式中，测量系统包括分布于与感测器关联的孔中的亲水性聚合物基质阵列，所述感测器例如感测器阵列的感测器。在一实例中，亲水性基质为水凝胶基质。亲水性基质可与感测器阵列的感测器以一对一配置对应。在另一实例中，感测器阵列的感测器可包括场效应晶体管(FET)感测器，例如离子敏感场效应晶体管(ISFET)。特别地，基质材料被就地固化并且符合感测器件的各个孔的配置。孔之间的间隙区域可基本上不含聚合物基质。在一实例中，基质材料可键结(例如共价键结)于孔表面。在一实例中，孔的深度或厚度在100nm到10μm范围内。在另一实例中，孔可具有0.1μm到2μm范围内的特征直径。
在一示范性方法中，聚合物基质阵列可以通过向孔阵列的孔中施加包括聚合物前驱体的水溶液形成。可以使用安置在孔阵列上面的不可混溶流体分隔由孔阵列限定的水性材料的体积。可引发所分隔体积的溶液以促进基质前驱体聚合，导致分布于孔内的基质阵列。在一实例中，将包括基质前驱体的水溶液通过使所述水性前驱体流经(flow over)孔而分布至感测器件的孔。在另一实例中，水溶液作为分散相包括于乳液内。分散相可沉降或被推动到孔阵列的孔中。可使用安置于水相内或不可混溶流体内的引发剂引发基质前驱体的聚合。在另一实例中，可以用热方式引发聚合。
在另一示范性方法中，可以通过将引发剂分子锚定于孔阵列的孔内的表面而在感测器件的孔内形成基质阵列。可在孔阵列的孔上面提供包括基质前驱体的溶液。引发剂可引发基质前驱体的聚合，导致在孔阵列的孔内形成聚合物基质。在另一实例中，可组合上述方法的各方面以进一步提高基质阵列的形成。
在一具体实例中，测序系统包括安置有感测阵列的流槽，包括与感测阵列电子连通的通信电路，并且包括与流槽流体连通的容器和流体控制器。在一实例中，图1说明流槽100的放大的横截面图并且说明流室106的一部分。试剂流108流过孔阵列102的表面，其中试剂流108流经孔阵列102的孔的开口端。孔阵列102和感测器阵列105一起可形成整合单元，其形成流槽100的下壁(或底板)。参考电极104可流体地联接到流室106。另外，流槽罩130包封流室106以将试剂流108含于限定区域内。
图2说明如图1的110处所示的孔201和感测器214的放大图。孔的体积、形状、宽高比(纵横比，aspect ratio)(例如底部宽度对孔深度比率)以及其它维度特征可基于发生的反应性质，以及采用的试剂、副产物或标记技术(如果存在)来选择。感测器214可为具有浮动栅极(浮栅)218的化学场效应晶体管(chemFET)，更特别地离子敏感FET(ISFET)，所述浮动栅极具有任选地通过材料层216与孔内部隔开的感测器板220。另外，可在感测器板220上面安置导电层(未说明)。在一实例中，材料层216包括离子敏感材料层。材料层216可为陶瓷层，尤其例如锆、铪、钽、铝或钛的氧化物，或钛的氮化物。或者，金属层或材料层216可以由金属例如钛、钨、金、银、铂或其组合形成。在一实例中，材料层216的厚度可在5nm到100nm范围内，例如10nm到70nm范围内，15nm到65nm范围内或甚至20nm到50nm范围内。
尽管将材料层216说明成延伸超过所示FET组件的界限，但材料层216可沿孔201的底部延伸以及任选地沿孔201的壁延伸。感测器214可对与感测器板220相对的材料层216上存在的电荷224的量作出响应(并且产生与所述量相关的输出信号)。电荷224的改变可引起chemFET的源极221和漏极(汲极)222之间的电流改变。继而，chemFET可直接用于提供基于电流的输出信号或与额外电路一起间接用于提供基于电压的输出信号。反应物、洗涤溶液以及其它试剂可以通过扩散机理240移动进入和离开孔。
在一实施方式中，在孔201中进行的反应可为鉴别或测定所关注的分析物的特性或性质的分析反应。这样的反应可直接或间接产生影响感测器板220附近的电荷量的副产物。如果这样的副产物少量产生或快速衰变或与其它组分反应，那么可同时在孔201中分析相同分析物的多个拷贝以提高产生的输出信号。在一实施方式中，分析物的多个拷贝可在沉积到孔201中之前或之后附着(attach)于固相支撑物212。固相支撑物212可为聚合物基质，例如亲水性聚合物基质，例如水凝胶基质等。为简单和容易解释起见，固相支撑物212在本文中还称为聚合物基质。
孔201可以通过壁结构限定，所述壁结构可以由一个或多个材料层形成。在一实例中，壁结构可具有在0.01μm到10μm范围，例如0.05μm到10μm范围、0.1μm到10μm范围、0.3μm到10μm范围或0.5μm到6μm范围内的从孔的下表面延伸到上表面的厚度。特别地，厚度可在0.01μm到1μm范围，例如0.05μm到0.5μm范围或0.05μm到0.3μm范围内。孔201可具有不超过5μm，例如不超过3.5μm，不超过2.0μm，不超过1.6μm，不超过1.0μm，不超过0.8μm或甚至不超过0.6μm的特征直径，所述特征直径定义为4乘以横截面面积(A)除以π的平方根(例如sqrt(4*A/π))。在一实例中，孔201可具有至少0.01μm的特征直径。在另一实例中，孔201可限定0.05fL到10pL范围内的体积，例如0.05fL到1pL范围、0.05fL到100fL范围、0.05fL到10fL范围或甚至0.1fL到5fL范围内的体积。
尽管图2说明单层壁结构和单层材料层216，但系统可包括一个或多个壁结构层、一个或多个导电层或一个或多个材料层。举例来说，壁结构可以由一个或多个层形成，所述层包括硅氧化物或TEOS或包括硅的氮化物。
在图3中说明的一个具体实例中，系统300包括限定孔阵列304的孔壁结构302，所述孔阵列安置在感测器阵列的感测器垫上面或可操作地耦接到感测器阵列的感测器垫。孔壁结构302限定上表面306。与孔关联的下表面308安置在感测器阵列的感测器垫上面。孔壁结构302限定上表面306与下表面308之间的侧壁310。如上文所述，与感测器阵列的感测器垫接触的材料层可沿孔阵列304的孔的下表面308延伸或沿由孔壁结构302限定的壁310的至少一部分延伸。上表面306可不含材料层。特别地，聚合物基质可安置于孔阵列304的孔中。在一实例中，上表面306可基本上不含聚合物基质。举例来说，上表面306可包括不含聚合物基质的区域，例如至少70％总面积、至少80％总面积、至少90％总面积或约100％总面积。
尽管图2的壁表面被图示为基本上竖直地并且朝外地延伸，但壁表面可在各种方向中延伸并且具有各种形状。基本上竖直表示在具有与由感测器垫所限定的表面垂直的分量的方向中延伸。举例来说，如图4中所示，孔壁402可竖直延伸，与由感测器垫限定的表面的法向分量412平行。在另一实例中，壁表面404以远离感测器垫的向外方向基本上竖直延伸，提供比孔的下表面区域大的孔开口。如图4中所示，壁表面404在具有与表面414的法向分量412平行的竖直分量的方向中延伸。在一替代实例中，壁表面406在朝内方向中基本上竖直地延伸，提供比孔下表面的区域小的开口区域。壁表面406在具有与表面414的法向分量412平行的分量的方向中延伸。
尽管表面402、404或406通过直线示出，但一些半导体或CMOS制造方法可导致具有非线性形状的结构。特别地，壁表面(例如壁表面408)和上表面(例如上表面410)的形状可为弓形或采取各种非线性形式。尽管此处说明的结构和器件被描绘为具有线性层、表面或形状，但由半导体处理产生的实际层、表面或形状在一定程度上可不同，可能包括所说明实施方式的非线性和弓形变化。
图5包括包含离子敏感材料层的示范性孔的图示。举例来说，孔结构502可限定孔阵列，例如示范性孔504、506或508。孔(504、506或508)能够可操作地耦接到下伏感测器(未说明)或连接到这样的下伏感测器。示范性孔504包括离子敏感材料层510，其限定孔504的底部并且延伸进入结构502中。尽管图5中未说明，但离子敏感材料层510下面可存在导电层，例如离子敏感场效应晶体管的栅极(例如浮动栅极)。
在另一实例中，如孔506所示，离子敏感材料层512可限定孔506的底部而不延伸到结构502中。在另一实例中，孔508可包括沿孔508的侧壁516的至少一部分延伸的离子敏感层514，所述孔由结构502限定。如上所述，离子敏感材料层512或514可存在于下伏电子器件的栅极或导电层上面。
返回到图2，基质材料212与孔结构共形。特别地，基质材料可被就地固化以与孔的壁和底部表面共形。限定孔的上表面可包括基本上不含基质材料的区域。举例来说，至少70％总面积、至少80％总面积、至少90％总面积或约100％总面积可不含基质材料。视孔结构的性质而定，聚合物基质可以物理方式紧固到孔壁结构。在另一实例中，聚合物基质可以化学方式结合于孔壁结构。特别地，聚合物基质可共价结合于孔壁结构。在另一实例中，聚合物基质可通过氢键或离子键结合于孔壁结构。
聚合物基质可由基质前驱体例如能自由基聚合的单体例如基于乙烯基的单体形成。特别地，单体可包括亲水性单体，例如丙烯酰胺、乙酸乙烯酯、甲基丙烯酸羟基烷基酯，其变体或衍生物、其共聚物或其任何组合。在一个具体实例中，亲水性单体为丙烯酰胺，例如官能化以包括羟基、氨基、羧基、卤素基团或其组合的丙烯酰胺。在一实例中，亲水性单体为氨基烷基丙烯酰胺、用胺封端的聚烷基二醇官能化的丙烯酰胺(D，下文示出)、丙烯酰基哌嗪(acrylopiperazine)(C，下文示出)或其组合。在另一实例中，丙烯酰胺可为羟基烷基丙烯酰胺，例如羟基乙基丙烯酰胺。特别地，羟基烷基丙烯酰胺可包括N-三(羟基甲基)甲基)丙烯酰胺(A，下文示出)、N-(羟基甲基)丙烯酰胺(B，下文示出)或其组合。用胺封端的聚烷基二醇官能化的丙烯酰胺可包括1到20个烷基二醇单元，所述烷基二醇例如乙二醇、丙二醇或其组合。在另一实例中，共聚单体可包括卤素改性的丙烯酸酯或丙烯酰胺，例如N-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺(BRAPA，E，下文示出)。尽管BRAPA被显示为包括溴乙酰胺基，但可使用包括2到20个碳的烷基的溴烷基酰胺。另外，BRAPA的戊基可替换成碳长度在2到20范围内的另一烷基。在另一实例中，共聚单体可包括寡核苷酸改性的丙烯酸酯或丙烯酰胺单体。在另一实例中，可使用单体的混合物，例如羟基烷基丙烯酰胺与胺官能化丙烯酰胺的混合物或丙烯酰胺与胺官能化丙烯酰胺的混合物。在一实例中，可按在100:1到1:1范围，例如100:1到2:1范围、50:1到3:1范围、50:1到5:1范围或甚至50:1到10:1范围内的羟基烷基丙烯酰胺:胺官能化丙烯酰胺或丙烯酰胺:胺官能化丙烯酰胺的比率包括胺官能化丙烯酰胺。在另一实例中，可按在100:1到1:1范围，例如100:1到2:1范围、50:1到3:1范围、50:1到5:1范围或甚至50:1到10:1范围内的羟基烷基丙烯酰胺:溴官能化丙烯酰胺或丙烯酰胺:溴官能化丙烯酰胺的比率包括胺官能化丙烯酰胺。
在另一实例中，可包括寡核苷酸官能化丙烯酰胺或丙烯酸酯单体(例如AcryditeTM单体)以将寡核苷酸合并到聚合物基质中。
另一示范性基质前驱体包括交联剂。在一实例中，按在15:1到1:2范围，例如10:1到1:1范围、6:1到1:1范围或甚至4:1到1:1范围内的单体对交联剂质量比包括交联剂。特别地，交联剂可为二乙烯基交联剂。举例来说，二乙烯基交联剂可包括二丙烯酰胺，例如N,N'-(乙烷-1,2-二基)双(2-羟基乙基)丙烯酰胺、N,N'-(2-羟基丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺或其组合。在另一实例中，二乙烯基交联剂包括乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯、六亚甲基双丙烯酰胺、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、其经保护衍生物或其组合。
一方面，聚合物网络包含总单体百分比在1到20％(例如3到20％)范围内，并且更优选地在2到10％，例如5到10％范围内的聚丙烯酰胺凝胶。在一个实施方式中，单体的交联剂百分比在5到10％范围内。在一具体实施方式中，聚合物网络包含2到10％总丙烯酰胺,其10％为双丙烯酰胺交联剂。
可通过溶液内的引发剂引发聚合。举例来说，引发剂可为基于水的。在另一实例中，引发剂可为疏水性引发剂，其优选地存在于疏水相中。示范性引发剂包括过硫酸铵和TEMED(四甲基乙二胺)。TEMED可加速从过硫酸盐形成自由基，继而催化聚合的速率。过硫酸根自由基例如将丙烯酰胺单体转化成自由基，其与未活化单体反应以开始聚合链反应。伸长着的聚合物链可被随机交联，产生具有取决于聚合条件和单体浓度的特征孔隙率的凝胶。核黄素(或核黄素-5'-磷酸盐)也可以用作自由基来源，其通常与TEMED和过硫酸铵组合。在光和氧气存在下，核黄素转化成其隐色体形式，所述隐色体形式在引发聚合(一般称为光化聚合)方面是活性的。
在另一实例中，偶氮引发剂可用于引发聚合。示范性水溶性偶氮引发剂说明于表1中并且示范性油溶性偶氮引发剂说明于表2中。特别地，偶氮引发剂可为偶氮二异丁腈(AIBN)。
表I.
水溶性偶氮引发剂化合物
表II.
油溶性偶氮引发剂化合物
在另一实例中，聚合物基质的前驱体可包括表面反应性添加剂以提高与表面的结合。示范性添加剂包括官能化丙烯酸类单体或官能化丙烯酰胺单体。举例来说，可将丙烯酸类单体官能化以与表面材料(例如形成孔底部或侧壁的陶瓷材料)结合。在一实例中，添加剂可包括丙烯酰基-膦酸酯，例如甲基丙烯酰基-膦酸酯。在另一实例中，添加剂可包括二甲基丙烯酰胺或聚二甲基丙烯酰胺。在另一实例中，添加剂可包括用可聚合基团(例如丙烯酸酯基团)改性的聚赖氨酸。
在另一实例中，可使用原子转移自由基聚合(ATRP)促进聚合。ATRP系统可包括链转移剂(CTA)、单体、过渡金属离子以及配体。示范性过渡金属离子络合物包括基于铜的络合物。示范性配体包括2,2'-联吡啶、4,4'-二-5-壬基-2,2'-联吡啶、4,4',4”-三(5-壬基)-2,2':6',2”-三联吡啶、N,N,N',N',N”-五甲基二亚乙基三胺、1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺、三(2-二甲基氨基乙基)胺、N,N-双(2-吡啶基甲基)十八烷基胺、N,N,N',N'-四[(2-吡啶基)甲基]乙二胺、三[(2-吡啶基)甲基]胺、三(2-氨基乙基)胺、三(2-双(3-丁氧基-3-氧代丙基)氨基乙基)胺、三(2-双(3-(2-乙基己氧基)-3-氧代丙基)氨基乙基)胺、三(2-双(3-十二烷氧基-3-氧代丙基)氨基乙基)胺、脂肪族、芳香族和杂环/杂芳香族胺、其变体和衍生物，或其组合。示范性CTA包括2-溴丙腈、2-溴异丁酸乙酯、2-溴丙酸乙酯、2-溴丙酸甲酯、1-苯基乙基溴、甲苯磺酰氯、二乙基二硫代氨基甲酸1-氰基-1-甲基乙基酯、2-(N,N-二乙基二硫代氨甲酰基)-异丁酸乙酯、2,6-二溴庚二酸二甲酯以及其它官能化烷基卤化物，其变体或衍生物，或其任何组合。任选地，BRAPA单体可在ATRP系统存在下充当支化剂。
在一实例中，在表面引发ATRP以将聚合物直接结合到表面。举例来说，可在过渡金属离子/配体络合物存在下将丙烯酸酯单体、丙烯酰胺单体、AcryditeTM单体、丁二酰亚胺基丙烯酸酯、双丙烯酸酯或双丙烯酰胺单体、其衍生物或其组合以溶液施加至引发表面。
在另一实例中，ATRP系统可用于使用改性的膦酸酯、磺酸酯、硅酸酯、钛酸酯或锆酸酯化合物将聚合物附着到孔的表面。特别地，可将胺或羟基封端的烷基膦酸酯或其烷氧基衍生物施加于表面并且使用引发剂引发。可施加催化剂络合物和单体，从而延长表面化合物。
在一示范性方法中，可将包括聚合物基质前驱体的水溶液施加到限定孔阵列的结构的孔中。可以通过如下将孔中的水溶液分隔开：在孔上面提供不可混溶流体，并且引发孔内的溶液中的聚合物前驱体聚合。
举例来说，图6说明限定孔604的示范性孔结构602。一个或多个感测器(未说明)可操作地耦接或连接到孔604。举例来说，一个或多个感测器可包括栅极结构，其与至少孔604的底部表面电连通。在孔上面提供包括聚合物前驱体连同其它组分的水溶液606，将该水溶液分布于孔604中。示范性聚合物前驱体尤其包括单体、交联剂、引发剂或表面反应性试剂，例如上文所述的。任选地，在沉积之前可使用亲水性溶液润湿孔604，所述亲水性溶液例如包括水、醇或其混合物的溶液，或包括水和表面活性剂的溶液。示范性醇包括异丙醇。在另一实例中，醇包括乙醇。尽管未说明，但孔的底部表面和任选地孔的侧壁可包括离子敏感材料。这样的离子敏感材料可覆盖在下伏电子器件(例如场效应晶体管)的导电结构上面。在施加包括聚合物前驱体的溶液之前，可用表面反应性添加剂处理孔的一个或多个表面。
将包括聚合物前驱体的水溶液分布到孔604中可以通过例如通过旋转或涡流来搅动结构而进一步强化。在另一实例中，振动例如声波或超声波振动可用于改善水溶液在孔604内的分布。在另一实例中，孔可使用真空脱气并且溶液在处于负表压下时施加。在一实例中，将水溶液在室温下分布到孔中。在另一实例中，将水溶液在低于室温的温度下分布，当使用基于水溶液的引发剂时尤其如此。或者，将水溶液在高温下分布。
如图7中所示，将不可混溶流体708施加在孔604上面，推动水溶液606离开孔顶部并且如图8中所示分隔孔604内的水溶液606。示范性不可混溶流体包括矿物油、硅油(例如聚(二甲基硅氧烷))、庚烷、碳酸酯油(例如碳酸二乙基己基酯(Tegosoft)或其组合。
引发剂可施加在水溶液606内。或者，引发剂可提供于不可混溶流体708内。可以通过改变衬底温度引发聚合。或者，聚合可在室温下发生。特别地，可将聚合物前驱体溶液在20℃到100℃范围，例如25℃到90℃范围、25℃到50℃范围或25℃到45℃范围内的温度下保持10分钟到5小时范围，例如10分钟到2小时范围或10分钟到1小时范围的时段。
由于聚合，在由孔结构602限定的孔604内形成聚合物基质阵列912，如图9中所示。任选地，阵列可用例如NaOH(例如1N NaOH)的碱洗涤以从孔之间的间隙区域去除聚合物。
在一替代实例中，可使用包括聚合物前驱体水溶液作为不可混溶流体内的分散相的乳液在孔内沉积水溶液液滴。举例来说，如图10中所示，孔结构1002限定孔1004。孔1004可操作地耦接或电连接到一个或多个感测器(未说明)。如上文所述，孔1004的底部表面和任选地壁侧表面可以由离子敏感材料层限定，所述材料层可覆盖在下伏电子器件的导电特征上面。
乳液1006可包括：连续不可混溶流体1010和包括聚合物前驱体的分散水溶液液滴1008。液滴1008可沉降至孔1004中。特别地，水溶液液滴1008的密度大于不可混溶流体1010。示范性不可混溶流体包括矿物油、硅油(例如聚(二甲基硅氧烷))、庚烷、碳酸酯油(例如碳酸二乙基己基酯(Tegosoft)或其组合。在另一实例中，可以通过旋转、涡流或超声波处理流体或结构而促进水溶液液滴分布到孔1004中。任选地，在沉积之前可使用亲水性溶液润湿孔1004，所述亲水性溶液例如包括水、醇或其混合物的溶液，或包括水和表面活性剂的溶液。将液滴分布到孔中的期间的温度可为室温。或者，可在升高的温度下进行分布。
如图11中所示，液滴在孔1004内聚结以提供包括聚合物前驱体的被分隔的溶液1112。任选地，可将乳液1006替换成不可混溶流体，例如不具有液滴1008的不可混溶流体1010或不同的不可混溶流体1116。示范性不可混溶流体包括矿物油、硅油(例如聚(二甲基硅氧烷))、庚烷、碳酸酯油(例如碳酸二乙基己基酯(Tegosoft)或其组合。或者，乳液1006在聚合期间可原地保持。因此，孔1004内的溶液1112与其它孔1004中的溶液分隔开。如图12所示，可引发聚合，在孔1004内产生聚合物基质1214。如上所述，可以用热方式引发聚合。在另一实例中，可使用油相引发剂引发聚合。或者，可使用水相引发剂引发聚合。特别地，可在孔1004上面施加第二乳液。第二乳液可包括包含水相引发剂的分散水相。
可以通过改变衬底温度引发聚合。或者，聚合可在室温下发生。特别地，可将聚合物前驱体溶液在20℃到100℃范围，例如25℃到90℃范围、25℃到50℃范围或25℃到45℃范围的温度下保持10分钟到5小时范围，例如10分钟到2小时范围或10分钟到1小时范围内的时段。任选地，阵列可用例如NaOH(例如1N NaOH)的碱洗涤以从孔之间的间隙区域去除聚合物。
在另一实例中，可使用紧固到孔阵列表面的引发剂在孔阵列的孔内形成基质材料阵列。举例来说，如图13中所示，结构1302可限定孔1304。材料层1306可限定孔1304的下表面。锚定化合物1308(例如在原子转移自由基聚合(ATRP)中有用的锚定化合物)可紧固到材料层1306，所述材料层限定孔1304的底部表面。或者，限定于孔内的侧壁材料、或者结构1302的暴露于孔1304内的层可锚定化合物，例如如上文所述的在ATRP中有用的化合物。
在这样的实例中，包括聚合物前驱体例如单体、交联剂和任选地表面反应性添加剂的溶液1310可施加在结构1302上面和孔1304内。可引发锚定化合物1308以促进：聚合从锚定化合物延长，分隔孔1304内的聚合以及将聚合物紧固到孔1304。在一实例中，锚定化合物具有表面反应性基团和末端自由基形成基团。表面反应性基团可包括膦酸酯、硅酸酯、磺酸酯、锆酸酯、钛酸酯或其组合。末端自由基形成基团可包括胺或羟基，其可例如用卤化(例如溴化)化合物而进行转移并且随后形成用于聚合聚合物前驱体并且将所得聚合物锚定到孔表面的自由基。在另一实例中，锚定化合物1308可包括用表面反应性基团改性的溴乙酸烷基酯。举例来说，锚定化合物1308可包括烷基膦酰基溴乙酸酯化合物。烷基可包括3到16个碳，例如6到16个碳或9到13个碳。烷基可以是直链的或支化的。特别地，烷基为直链的。在另一实例中，溴乙酰基可经改性以包括烷基改性的溴乙酰基，例如乙基或甲基改性的溴乙酰基，其与表面官能性烷基形成酯。在一具体实例中，锚定化合物包括以下化合物：
可选择ATRP系统以在单体加成的统计平均长度或数目之后终止聚合。以这样的方式，可控制孔1304内的聚合量。在另一实例中，可施加影响链伸长或终止的其它试剂并且将其添加到水溶液1310中。
在一替代实例中，可将锚定化合物(例如上文所述的)包括于聚合物前驱体溶液(例如相对于图6或图10所述的)中。在固化之后，锚定化合物可辅助聚合物结合到孔的内表面。
在图14中说明的另一实例中，结构1402可限定孔1404。孔1404可包括沿着结构1402和孔1404的侧壁1410延伸的材料层1406。可将引发剂1408沿孔1404的底部并且沿侧壁1410紧固到材料层1406。可将包括聚合物前驱体、交联剂和其它试剂的溶液1412施加在结构1402和孔1404上面。
如图15中所示，由于引发的聚合从孔1304内的表面(例如由材料层1306限定的表面)延长而形成聚合物基质1512。
可以通过改变衬底温度引发聚合。或者，聚合可在室温下发生。特别地，可将聚合物前驱体溶液在20℃到100℃范围，例如25℃到90℃范围、25℃到50℃范围或25℃到45℃范围内的温度下保持10分钟到5小时范围，例如10分钟到2小时范围或10分钟到1小时范围内的时段。
一旦形成，可活化聚合物基质以促进与目标分析物(例如多核苷酸)的缀合。举例来说，可增强聚合物基质上的官能团以允许与目标分析物或分析物受体(例如寡核苷酸引物)结合。在一具体实例中，可将亲水性聚合物基质的官能团使用能够将所述亲水性聚合物官能团转化成可进行亲核或亲电子取代的反应性部分的试剂改性。举例来说，聚合物基质上的羟基可以通过用磺酸酯基或氯替代羟基的至少一部分来活化。示范性磺酸酯基可衍生自三氟乙烷磺酰氯、甲磺酰氯、甲苯磺酰氯或氟代苯磺酰氯(fosylchloride)，或其任何组合。磺酸酯可用于允许亲核试剂置换磺酸酯基。磺酸酯可进一步与释放的氯反应以提供氯化的官能团，其可用于与基质缀合的过程中。在另一实例中，可将聚合物基质上的胺基活化。
举例来说，目标分析物或分析物受体可通过与磺酸酯基的亲核取代而结合到亲水性聚合物。在具体实例中，用亲核试剂例如胺或硫醇封端的目标分析物受体可进行亲核取代以置换聚合物基质中的磺酸酯基。因为活化，所以可形成缀合的聚合物基质。
在另一实例中，磺化的聚合物基质可与可形成对基质的附着并且同时维持针对包含亲电子基团的寡核苷酸的亲核活性的单官能或多官能的单亲核或多亲核试剂(例如顺丁烯二酰亚胺)进一步反应。另外，残余亲核活性可通过附着到包含多亲电子基团的试剂转化成亲电子活性，所述多亲电子基团随后附着到包含亲核性基团的寡核苷酸。
在另一实例中，在所述聚合期间可添加含有所述官能团的单体。所述单体可包括，例如，含有羧酸、酯、卤素或其它胺反应性基团的丙烯酰胺。可将酯基在与胺寡聚物反应之前水解。
其它缀合技术包括使用包含胺的单体。胺基为可用在附着到聚合物基质之后产生单官能亲电子基团的胺反应性双官能双亲电子试剂进一步改性的亲核性基团。可使这样的亲电子基团与具有亲核性基团(例如胺或硫醇)的寡核苷酸反应，导致寡核苷酸通过与空缺亲电子试剂(vacant electrophile)反应而附着。
如果聚合物基质由氨基-和羟基-丙烯酰胺的组合制备，那么聚合物基质包括亲核性氨基和中性羟基的组合。所述氨基可用二官能双亲电子部分(例如二-异氰酸酯或双-NHS酯)改性，产生对亲核试剂具有反应性的亲水性聚合物基质。示范性双-NHS酯包括双丁二酰亚胺基C2-C12烷基酯，例如双-丁二酰亚胺基辛二酸酯或双丁二酰亚胺基戊二酸酯。
其它活化化学反应包括并入转化指定官能团以容纳特定所需键的多个步骤。举例来说，磺酸酯改性的羟基可通过若干方法转化成亲核性基团。在一实例中，磺酸酯与叠氮化物阴离子反应产生叠氮化物取代的亲水性聚合物。叠氮化物可直接用于通过“CLICK”化学方法缀合至乙炔取代的生物分子，所述化学方法可在使用或不使用铜催化的情况下进行。任选地，叠氮化物可通过例如用氢催化还原或用有机膦还原而转化成胺。所得胺可然后用各种各样的试剂(例如二异氰酸酯、双-NHS酯、三聚氯化氰或其组合)转化成亲电子基团。在一实例中，使用二异氰酸酯在聚合物与连接体(linker)之间产生脲键，这导致残余异氰酸酯基，所述残余异氰酸酯基能够与氨基取代的生物分子反应以在连接体与生物分子之间产生脲键。在另一实例中，使用双-NHS酯在聚合物与连接体之间产生酰胺键以及残余NHS酯基，残余NHS酯基能够与氨基取代的生物分子反应以在连接体与生物分子之间产生酰胺键。在另一实例中，使用三聚氯化氰在聚合物与连接体之间产生氨基-三嗪键以及两个残余氯-三嗪基团，其中一个能够与氨基取代的生物分子反应以在连接体与生物分子之间产生氨基-三嗪键。可通过磺酸酯活化将其它亲核性基团并入到基质中。举例来说，磺化基质与硫代苯甲酸(巯基苯甲酸、硫基苯甲酸，thiobenzoic acid)阴离子的反应以及随后硫代苯甲酸酯(巯基苯甲酸酯、硫基苯甲酸酯，thiobenzoate)的水解将硫醇并入基质中，其可随后与顺丁烯二酰亚胺取代的生物分子反应以产生与生物分子的硫基-丁二酰亚胺键。
硫醇也可以与溴-乙酰基或溴-酰胺基反应。在一具体实例中，当包括正-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺(BRAPA)作为共聚单体时，可以通过形成例如如下文所述的硫代苯甲酰胺-寡核苷酸(巯基苯甲酰胺-寡核苷酸)化合物用于与聚合物上的溴-乙酰基反应而并入寡核苷酸。
硫代苯甲酰胺-寡核苷酸化合物可以通过如下形成：使以下二硫代苯甲酸酯-NHS化合物与胺封端的寡核苷酸反应并且活化二硫代苯甲酰胺-寡核苷酸化合物以形成上述硫代苯甲酰胺-寡核苷酸化合物。
或者，为了并入寡核苷酸，可在聚合期间使用Acrydite寡核苷酸。示范性Acrydite寡核苷酸可包括经离子交换的寡核苷酸。
生物分子到耐火或聚合物衬底上的共价键可使用衬底上与生物分子上的亲核部分偶合的亲电子部分或衬底上与生物分子上的亲电子键偶合的亲核键形成。因为所关注的最常见生物分子的亲水性性质，所以选择用于这些偶合的溶剂为水或含有一些水溶性有机溶剂的水以将生物分子分散到衬底上。特别地，多核苷酸一般因为其聚阴离子性质而在水系统中偶合到衬底。因为水通过将亲电子试剂水解成对于缀合而言不活泼的部分而与亲核试剂竞争亲电子试剂，所以水性系统可导致偶合产物的产率低，其中产率基于偶合的亲电子部分。当期望反应偶合的亲电子部分高的产率时，高浓度亲核试剂驱动反应并且降低水解，导致亲核试剂使用效率低。在多核酸的情况下，可将磷酸根的金属抗衡离子置换成亲脂性抗衡离子，以帮助将生物分子溶解于极性非反应性非水性溶剂中。这些溶剂可包括酰胺或脲，例如甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、乙酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、六甲基磷酰胺、吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮、N,N,N',N'-四甲基脲、N,N'-二甲基-N,N'-三亚甲基脲、或其组合；碳酸酯，例如碳酸二甲酯、碳酸亚丙酯、或其组合；醚，例如四氢呋喃；亚砜和砜，例如二甲亚砜、二甲砜、或其组合；位阻醇，例如叔丁醇；或其组合。亲脂性阳离子可包括四烷基铵或四芳基铵阳离子，例如四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵、四丁基铵、四戊基铵、四己基铵、四庚基铵、四辛基铵以及其烷基和芳基混合物；四芳基阳离子，例如四苯基四烷基砷或四芳基例如四苯基以及三烷基锍阳离子，例如三甲基锍；或其组合。可以通过各种各样的标准阳离子交换技术进行将金属阳离子用亲脂性阳离子交换而将多核酸转化成可溶于有机溶剂的材料。
在一具体实施方式中，将聚合物基质暴露于具有与缀合至聚合物基质的寡核苷酸互补的链段的目标多核苷酸。例如通过聚合酶链反应(PCR)或重组酶聚合酶扩增(RPA)对多核苷酸进行扩增。举例来说，目标多核苷酸是以低浓度提供的，使得单个多核苷酸可能存在于聚合物基质阵列的单个聚合物基质内。可将聚合物基质暴露于酶、核苷酸、盐或足以促进目标多核苷酸复制的其它组分。
在一具体实施方式中，例如聚合酶的酶存在、结合于或紧密靠近于聚合物基质。本文所述的方法中可使用各种各样的核酸聚合酶。在一示范性实施方式中，聚合酶可包括可催化多核苷酸复制的酶、其片段或子单元。在另一实施方式中，聚合酶可为天然存在的聚合酶、重组聚合酶、突变聚合酶、变异聚合酶、融合或以其它方式人工改造(基因工程，engineer)的聚合酶、化学改性聚合酶、合成分子或类似物、其衍生物或片段。
在一实施方式中，聚合酶可为任何家族A DNA聚合酶(也称为pol I家族)或任何家族B DNA聚合酶。在实施方式中，DNA聚合酶可为相较于非重组DNA聚合酶能够以优良精确度和产率复制多核苷酸的重组形式。举例来说，聚合酶可包括高保真度聚合酶或热稳定聚合酶。在实施方式中，用于复制多核苷酸的条件可包括‘热启动’条件，例如热启动聚合酶，例如AmplitaqDNA聚合酶(应用生物科学(Applied Biosciences))或KOD热启动DNA聚合酶(EMD生物科学(EMD Biosciences))。典型地，‘热启动’聚合酶包括热稳定聚合酶和一个或多个在环境温度下抑制DNA聚合酶和3'-5'核酸外切酶活性的抗体。
在实施方式中，聚合酶可为例如以下的酶：Taq聚合酶(来自水生栖热菌(Thermusaquaticus))、Tfi聚合酶(来自丝状栖热菌(Thermus filiformis))、Bst聚合酶(来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus))、Pfu聚合酶(来自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus))、Tth聚合酶(来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus))、Pow聚合酶(来自深海火球菌(Pyrococcus woesei))、Tli聚合酶(来自海滨嗜热球菌(Thermococcus litoralis))、Ultima聚合酶(来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima))、KOD聚合酶(来自极端耐热古生菌(Thermococcus kodakaraensis))、Pol I和II聚合酶(来自深海热球菌(Pyrococcus abyssi))和Pab(来自深海热球菌)。
在实施方式中，聚合酶可为极端耐热古生菌的重组形式。在实施方式中，聚合酶可为KOD或KOD样DNA聚合酶，例如KOD聚合酶(EMD生物科学)、KOD“热启动”聚合酶(EMD生物科学)、KOD Xtreme热启动DNA聚合酶(EMD生物科学)、KOD XL DNA聚合酶(EMD生物科学)、Taq DNA聚合酶(英杰(Invitrogen))、Taq DNA聚合酶高保真度(英杰)、Pfx(英杰)、AccuprimeTMPfx(英杰)、AccuprimeTMTaq DNA聚合酶高保真度(英杰)或AmplitaqDNA聚合酶(应用生物系统公司(Applied Biosystems))。在实施方式中，聚合酶可为含有与本文所讨论的那些聚合酶类似的突变的DNA聚合酶。
特别地，待扩增的多核苷酸可以被聚合物基质捕捉。用于捕捉核酸的示范性方法可包括：使多核苷酸与附着到聚合物基质的寡核苷酸杂交。在实施方式中，捕捉核酸的方法包含：(a)提供附着到单链寡核苷酸(例如捕捉寡核苷酸)的聚合物基质；(b)提供单链多核苷酸；以及(c)使单链寡核苷酸与单链多核苷酸杂交，由此将单链多核苷酸捕捉到聚合物基质。聚合物基质的每一个可附着有多个单链寡核苷酸(例如捕捉寡核苷酸)。步骤(c)可使用多个单链多核苷酸进行。在实施方式中，单链寡核苷酸的至少一部分包含与单链多核苷酸的至少一部分互补(或部分互补)的核苷酸序列。
在一实例中，所述方法进一步包括将多核苷酸扩增成多个多核苷酸并且将多个多核苷酸的至少一部分附着到聚合物基质，由此产生包括多个附着的多核苷酸的聚合物基质。或者，所述方法可进一步包括通过延长寡核苷酸将多核苷酸扩增成多个互补多核苷酸，由此产生包括多个附着的多核苷酸的聚合物基质。
在实施方式中，核苷酸并入方法包含：对与附着到聚合物基质的寡核苷酸杂交的多核苷酸进行核苷酸聚合反应。在实施方式中，核苷酸并入方法包含：(a)提供附着到单链寡核苷酸(例如引物寡核苷酸)的聚合物基质；(b)提供单链模板多核苷酸；(c)使单链寡核苷酸与单链模板多核苷酸杂交；以及(d)使单链模板多核苷酸与聚合酶以及至少一种核苷酸在适于聚合酶催化至少一种核苷酸聚合到单链寡核苷酸上的条件下接触，由此进行核苷酸并入。在实施方式中，聚合物基质的每一个可附着有多个单链寡核苷酸(例如捕捉寡核苷酸)。可使用多个单链多核苷酸进行步骤(b)、(c)或(d)。在实施方式中，单链寡核苷酸的至少一部分包含与单链多核苷酸的至少一部分互补(或部分互补)的核苷酸序列。在实施方式中，系统包含与附着到聚合物基质的单链寡核苷酸杂交的单链多核苷酸，其中至少一个核苷酸聚合到单链寡核苷酸的末端上。
在实施方式中，引物延长方法包含：对与附着到聚合物基质的寡核苷酸杂交的多核苷酸进行引物延长反应。在实施方式中，核酸引物延长方法包含：(a)提供附着到单链寡核苷酸(例如引物寡核苷酸)的聚合物基质；(b)提供单链模板多核苷酸；(c)使单链寡核苷酸与单链模板多核苷酸杂交；以及(d)使单链模板多核苷酸与聚合酶以及至少一种核苷酸在适于聚合酶催化至少一种核苷酸聚合到单链寡核苷酸上的条件下接触，由此延长引物。在实施方式中，聚合物基质的每一个可附着有多个单链寡核苷酸(例如捕捉寡核苷酸)。在实施方式中，步骤(b)、(c)或(d)可使用多个单链多核苷酸进行。在实施方式中，单链寡核苷酸的至少一部分包含与单链多核苷酸的至少一部分互补(或部分互补)的核苷酸序列。在实施方式中，系统包含与附着到聚合物基质的单链寡核苷酸杂交的单链多核苷酸，其中单链寡核苷酸用一个或多个核苷酸延长。
在实施方式中，核酸扩增的方法包含：对与附着到聚合物基质的寡核苷酸杂交的多核苷酸进行引物延长反应。在实施方式中，核酸扩增的方法包含：(a)提供附着到单链寡核苷酸(例如引物寡核苷酸)的聚合物基质；(b)提供单链模板多核苷酸；(c)使单链寡核苷酸与单链模板多核苷酸杂交；(d)使单链模板多核苷酸与聚合酶以及至少一种核苷酸在适于聚合酶催化至少一种核苷酸聚合到单链寡核苷酸上的条件下接触，以产生延长的单链寡核苷酸。在实施方式中，所述方法进一步包含：(e)从延长的单链寡核苷酸去除(例如变性)单链模板多核苷酸使得单链寡核苷酸仍附着到聚合物基质；(f)使剩余的单链寡核苷酸与第二单链模板多核苷酸杂交；以及(g)使第二单链模板多核苷酸与第二聚合酶以及第二至少一种核苷酸在适于第二聚合酶催化第二至少一种核苷酸聚合到单链寡核苷酸上的条件下接触，以产生随后的延长的单链寡核苷酸。在实施方式中，步骤(e)、(f)和(g)可重复至少一次。在实施方式中，聚合酶和第二聚合酶包含热稳定聚合酶。在实施方式中，适于核苷酸聚合的条件包括在升高的温度下进行核苷酸聚合步骤(例如步骤(d)或(g))。在实施方式中，适于核苷酸聚合的条件包括在交替温度(例如升高的温度和相对较低的温度)下进行核苷酸聚合步骤(例如步骤(d)或(g))。在实施方式中，所述交替温度在60-95℃范围内。在实施方式中，温度周期可为约10秒到约5分钟，或约10分钟，或约15分钟，或更长。在实施方式中，核酸扩增的方法可产生一个或多个各自附着到多个模板多核苷酸的聚合物基质，所述模板多核苷酸包含与单链模板多核苷酸或第二单链模板多核苷酸互补的序列。在实施方式中，聚合物基质的每一个可附着有多个单链寡核苷酸(例如捕捉寡核苷酸)。在实施方式中，步骤(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)可使用多个单链多核苷酸进行。在实施方式中，单链寡核苷酸的至少一部分包含与单链多核苷酸的至少一部分互补(或部分互补)的核苷酸序列。在实施方式中，核酸扩增的方法(如上文所述)可在油相中的水相溶液(例如分散相液滴)中进行。
在PCR或RPA之后，形成了扩增的聚合物基质。聚合物基质阵列的聚合物基质可为单克隆的，包括单个物种的目标多核苷酸的拷贝。多核苷酸可在聚合物基质内延长。相对于水具有低浓度聚合物的亲水性聚合物基质和水凝胶可在聚合物基质的内部和其整体上包括多核苷酸链段。特别地，聚合物基质可允许用于监测反应的酶、核苷酸、引物和反应产物的扩散。每个基质高的多核苷酸数量产生更好的信号。
在一实例中，水中的聚合物基质可为不超过50重量％聚合物，例如不超过30重量％聚合物、不超过20重量％聚合物、不超过10重量％聚合物、不超过5重量％聚合物或甚至不超过2重量％聚合物。在一实例中，聚合物基质可包括至少0.01重量％聚合物。
在其它实例中，聚合物基质可具有允许蛋白质和酶扩散的孔隙率。在一实例中，聚合物基质可具有允许尺寸为至少50千道尔顿，例如至少100千道尔顿、至少200千道尔顿、至少250千道尔顿或甚至至少350千道尔顿的蛋白质扩散的孔隙率。在一实例中，尺寸为106千道尔顿的蛋白质受到限制。
在另一实例中，当缀合时，聚合物基质可包括至少7×104/μm3的多核苷酸密度，称为核苷酸密度。举例来说，核苷酸密度可为至少105/m3，例如至少106/m3、至少5×106/m3、至少8×106/m3、至少1×107/m3或甚至至少3×107/m3。在另一实例中，核苷酸密度可不超过1015/m3。
在一示范性实施方式中，聚合物基质阵列可用于测序器件中。举例来说，测序器件可包括其内部形成有聚合物基质的孔阵列。可向孔提供酶和核苷酸以促进可检测(可察觉，detectible)反应，例如核苷酸并入。
可以通过检测核苷酸添加进行测序。可使用例如荧光发射法或离子检测法的方法检测核苷酸添加。举例来说，可向系统提供一组经荧光标记的核苷酸并且其可迁移到孔。还可向孔提供激发能量。当核苷酸被聚合酶捕捉并且被添加到延长引物的末端时，核苷酸的标记可发荧光，指示添加了何种类型的核苷酸。
在一替代实例中，可顺序馈入包括单个类型的核苷酸的溶液。回应于核苷酸添加，孔的局部环境内的pH可改变。这样的pH改变可以通过离子敏感场效应晶体管(ISFET)检测。因此，pH改变可用于产生指示与聚合物基质的多核苷酸互补的核苷酸的顺序的信号。
特别地，测序系统可包括一个孔或多个孔，其安置于离子性感测器(例如场效应晶体管(FET))的感测器垫上。在实施方式中，系统包括在安置在离子性感测器(例如FET)的感测器垫上的一个孔中的聚合物基质，或在安置在离子性感测器(例如FET)的感测器垫上的多个孔中的聚合物基质。在实施方式中，FET可为chemFET或ISFET。“chemFET”或化学场效应晶体管包括充当化学感测器的类型的场效应晶体管。chemFET具有MOSFET晶体管的结构类似物，其中栅电极上的电荷是通过化学方法施加的。“ISFET”或离子敏感场效应晶体管可用于测量溶液中的离子浓度；当离子浓度(例如H+)改变时，通过该晶体管的电流相应地改变。
在实施方式中，FET可为FET阵列。如本文所用，“阵列”为例如感测器或孔的元件的平面布置。阵列可为一维或二维的。一维阵列可为在第一维度具有一列(或行)元件并且在第二维度具有多个列(或行)的阵列。第一和第二维度中的列(或行)的数目可相同或不同。FET或阵列可包含102、103、104、105、106、107个或更多FET。在一实例中，FET阵列可包括不超过1015个FET。
在实施方式中，可在FET感测器阵列上方制造一个或多个微流体结构以提供生物学或化学反应的容纳或约束。举例来说，在一种实施中，所述微流体结构可配置成一个或多个安置在阵列的一个或多个感测器上的孔(或微孔，或反应室，或反应孔，因为所述术语在本文中可互换地使用)，使得上面安置有指定孔的一个或多个感测器检测和测量该指定孔中分析物的存在、水平或浓度。在实施方式中，FET感测器和反应孔可存在1:1对应。
在另一实例中，孔阵列的孔能够可操作地连接到测量器件。举例来说，对于荧光发射法，孔能够可操作地耦接到光检测器件。在离子性检测的情况下，孔的下表面可安置在离子性感测器(例如场效应晶体管)的感测器垫上面。
一种涉及通过检测核苷酸并入的离子性副产物而测序的示范性系统为离子激流PGMTM(Ion Torrent PGMTM)或ProtonTM测序器(生命技术(Life Technologies))，其为通过检测作为核苷酸并入的副产品产生的氢离子来对核酸模板进行测序的基于离子的测序系统。典型地，氢离子作为通过聚合酶的模板依赖性核酸合成期间发生的核苷酸并入的副产物释放。离子激流PGMTM或ProtonTM测序器通过检测核苷酸并入的氢离子副产物来检测核苷酸并入。离子激流PGMTM或ProtonTM测序器可包括多个待测序的模板多核苷酸，各模板安置在阵列中的各自测序反应孔内。阵列的孔可各自耦接到至少一个离子感测器，所述感测器可检测作为核苷酸并入的副产品产生的H+离子的释放或溶液pH的改变。离子感测器包含耦接到离子敏感检测层的场效应晶体管(FET)，其可感测由核苷酸并入导致的溶液pH改变或H+离子的存在。离子感测器可提供指示核苷酸并入的输出信号，其可表示为量值与各自孔或反应室中的H+离子浓度关联的电压改变。不同核苷酸类型可连续(顺序地，serially)流入反应室，并且可通过聚合酶以由模板的序列决定的顺序并入到延长引物(或聚合位点)中。各核苷酸并入可伴随着反应孔中H+离子的释放，以及局部pH中的相伴改变。可以由感测器的FET记录H+离子的释放，所述FET产生指示发生核苷酸并入的信号。具体核苷酸流动期间未并入的核苷酸不产生信号。来自FET的信号的幅值(振幅)也可以与并入到延长核酸分子中的具体类型的核苷酸数目关联，由此允许解析均聚物区域。因此，在测序器运行期间，多个核苷酸流入反应室中以及跨越多个孔或反应室的并入监测可允许仪器同时解析许多核酸模板的序列。关于离子激流PGMTM或ProtonTM测序器的组成、设计和操作的更多细节可见于例如美国专利申请案第12/002781号，现作为美国专利公开案第2009/0026082号公布并且作为美国专利第8,262,900号颁予；美国专利申请案第12/474897号，现作为美国专利公开案第2010/0137143号公布；以及美国专利申请案第12/492844号，现作为美国专利公开案第2010/0282617号公布，所述申请案的全部内容全部以引用的方式并入本文中。
实施例
将离子质子芯片(ION Proton Chip)用165μL 1N NaOH溶液预处理3分钟，并且用1毫升去离子水洗涤两次并且用甲醇洗涤两次。通过抽吸去除剩余甲醇。在干燥器中在真空下干燥芯片20分钟。
在15mL试管中，通过如下制备聚合物混合物：混合160mg丙烯酰胺和5mL水。将溶液用N2鼓泡20分钟。向溶液中添加165mg 10wt/v％正-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺(BRAPA)溶液。另外，添加11.5mg四甲基乙二胺(TMEDA)和100μL 5wt/v％过硫酸铵(APS)溶液。溶液进行短暂涡旋。
通过进口端添加165μL聚合物混合物直到覆盖出口储槽来进一步处理芯片。用聚合物混合物的剩余部分覆盖进口储槽。两个储槽都用胶布覆盖。在室温下培育芯片90分钟。任选地，可在贴胶布之后立即离心芯片1分钟。90分钟后，从入口储槽抽吸超出的聚合物溶液。芯片用1mL水经20分钟洗涤五次。任选地，芯片用1N NaOH洗涤1分钟到10分钟的时段持续1到5次。芯片用水填充并且贴胶布。
为了使芯片官能化，通过从干燥等分试样或1mM水溶液等分试样配制benzthio B引物TEA盐于DMSO中的1mM溶液来制备溶液。如果从水溶液等分试样配制，那么向水溶液等分试样中添加比水溶液等分试样大50％的DMSO等分试样，并且在Speedvac上蒸发直到体积减小到初始水溶液等分试样体积。(约45分钟)。添加4当量新鲜制成的100mM DTT/DMSO溶液。(约100μl 1mM寡聚溶液用4μL 100mM DTT/DMSO溶液处理。)DTT为二硫苏糖醇。
10分钟后，将该经DTT处理的寡聚/DMSO溶液用作为1000份DMSO/50份用碘化钠饱和的DMSO/50份二异丙基乙基胺的DMSO溶液稀释到200μM。溶液短暂涡旋。这一方法通常对于1体积的DTT/寡聚DMSO溶液提供4体积稀释剂。所述溶液立即使用。
芯片抽吸成干燥芯片，直到芯片中不再观察到表面水。通过进口端添加135μL的量的官能化溶液直到覆盖出口储槽。剩余溶液用于覆盖进口储槽。用胶布覆盖进口端和出口端。芯片在室温下培育至少一小时，一般2到3小时。去除胶布，并且用1mL水洗涤芯片四次。芯片储存在水下并且用胶布覆盖储槽。
特别地，上述系统和方法的实施方式提供包括沉积到限定约0.05fL到1pL体积的小孔中在内的技术优势。这样的沉积技术对于向限定约0.05fL到10fL体积的孔中沉积聚合物基质尤其有利。
在第一方面中，一种形成聚合物基质阵列的方法包括：向孔阵列的孔中施加水溶液，所述水溶液包含聚合物前驱体；在孔阵列上面施加不可混溶流体以分隔孔阵列的孔内的水溶液；并且使孔阵列的孔中分隔的聚合物前驱体聚合以形成聚合物基质阵列。
在第一方面的一个实例中，孔具有0.1μm到2μm范围内的特征直径。在第一方面的另一实例和上述实例中，孔的厚度在0.01μm到10μm范围内。
在第一方面的另一实例和上述实例中，孔阵列的孔覆盖在感测器阵列的感测器上面，孔与感测器阵列的感测器的离子敏感材料对应。
在第一方面的另一实例和上述实例中，聚合物基质阵列的聚合物基质与孔阵列的孔壁共形。
在第一方面的另一实例和上述实例中，聚合物前驱体包括能自由基聚合的单体。举例来说，能自由基聚合的单体包括基于乙烯基的单体。在一实例中，基于乙烯基的单体包括丙烯酰胺、乙酸乙烯酯、甲基丙烯酸羟烷基酯、其变体或衍生物或其任何组合。
在第一方面的另一实例和上述实例中，聚合物前驱体包括交联剂。举例来说，交联剂为双-丙烯酰胺。
在第一方面的另一实例和上述实例中，聚合物前驱体包括表面活性添加剂。
在第一方面的另一实例和上述实例中，聚合物前驱体包括寡核苷酸官能化的丙烯酰胺。在第一方面的另一实例和上述实例中，聚合物前驱体包括N-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺。
在第一方面的另一实例和上述实例中，施加水溶液包括施加包括作为分散相的水溶液的乳液。
在第一方面的另一实例和上述实例中，不可混溶流体包括矿物油、硅油、庚烷、碳酸酯油或其组合。
在第一方面的另一实例和上述实例中，所述方法进一步包括在施加水溶液之后旋转孔阵列。
在第一方面的另一实例和上述实例中，所述方法进一步包括在施加水溶液之后超声波处理孔阵列。
在第一方面的另一实例和上述实例中，所述方法进一步包括在施加水溶液期间使孔阵列脱气。
在第一方面的另一实例和上述实例中，所述方法进一步包括在施加水溶液之前用亲水性流体润湿孔阵列。
在第一方面的另一实例和上述实例中，聚合物前驱体包括引发剂。
在第一方面的另一实例和上述实例中，不可混溶流体包括引发剂。
在第一方面的另一实例和上述实例中，所述方法进一步包括在施加水溶液之前用表面活性剂处理孔内的表面。
在第二方面中，一种形成聚合物基质阵列的方法包括在孔阵列的孔上面施加乳液。乳液包括在不可混溶连续相中的水性分散相。水性分散相包括聚合物前驱体。分散相在孔阵列的孔中聚结。所述方法进一步包括在孔阵列的孔上面施加第二不可混溶流体来代替乳液并且使孔阵列的孔中的聚合物前驱体聚合以形成聚合物基质阵列。
在第二方面的一个实例中，孔具有0.1μm到2μm范围内的特征直径。在第二方面的另一实例和上述实例中，孔的厚度在0.01μm到10μm范围内。
在第二方面的另一实例和上述实例中，孔阵列的孔覆盖在感测器阵列的感测器上面，孔与感测器阵列的感测器的离子敏感材料对应。
在第二方面的另一实例和上述实例中，聚合物基质阵列的聚合物基质与孔阵列的孔壁共形。
在第二方面的另一实例和上述实例中，聚合物前驱体包括能自由基聚合的单体。举例来说，能自由基聚合的单体包括基于乙烯基的单体。在一实例中，基于乙烯基的单体包括丙烯酰胺、乙酸乙烯酯、甲基丙烯酸羟烷基酯、其变体或衍生物或其任何组合。
在第二方面的另一实例和上述实例中，聚合物前驱体包括交联剂。在一实例中，交联剂为双-丙烯酰胺。
在第二方面的另一实例和上述实例中，聚合物前驱体包括表面活性添加剂。
在第二方面的另一实例和上述实例中，聚合物前驱体包括寡核苷酸官能化的丙烯酰胺。
在第二方面的另一实例和上述实例中，聚合物前驱体包括N-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺。
在第二方面的另一实例和上述实例中，不可混溶流体包括矿物油、硅油、庚烷、碳酸酯油或其组合。
在第二方面的另一实例和上述实例中，所述方法进一步包括在施加水溶液之后旋转孔阵列。
在第二方面的另一实例和上述实例中，所述方法进一步包括在施加水溶液之后超声波处理孔阵列。
在第二方面的另一实例和上述实例中，所述方法进一步包括在施加水溶液期间使孔阵列脱气。
在第二方面的另一实例和上述实例中，所述方法进一步包括在施加水溶液之前用亲水性流体润湿孔阵列。
在第二方面的另一实例和上述实例中，聚合物前驱体包括引发剂。
在第二方面的另一实例和上述实例中，不可混溶流体包括引发剂。
在第二方面的另一实例和上述实例中，所述方法进一步包括在施加水溶液之前用表面活性剂处理孔内的表面。
在第三方面中，一种形成聚合物基质阵列的方法包括用包括表面反应性官能团和自由基形成末端基团的表面化合物处理孔阵列的孔内的表面，向孔阵列的孔施加包括聚合物前驱体的水溶液，并且用引发剂和原子转移自由基聚合(ATRP)催化剂活化表面偶合化合物的自由基形成末端基团来引发孔阵列的孔内的聚合物前驱体的自由基聚合，以形成聚合物基质阵列。
在第三方面的一个实例中，表面反应性官能团包括膦酸根。
在第三方面的另一实例和上述实例中，自由基形成末端基团包括胺或羟基。
在第三方面的另一实例和上述实例中，孔具有0.1μm到2μm范围内的特征直径。在第三方面的另一实例和上述实例中，孔的厚度在0.01μm到10μm范围内。
在第三方面的另一实例和上述实例中，孔阵列的孔覆盖在感测器阵列的感测器上面，孔与感测器阵列的感测器的离子敏感材料对应。
在第三方面的另一实例和上述实例中，聚合物前驱体包括能自由基聚合的单体。举例来说，能自由基聚合的单体包括基于乙烯基的单体。在一实例中，基于乙烯基的单体包括丙烯酰胺、乙酸乙烯酯、甲基丙烯酸羟烷基酯、其变体或衍生物或其任何组合。
在第三方面的另一实例和上述实例中，聚合物前驱体包括寡核苷酸官能化的丙烯酰胺。
在第三方面的另一实例和上述实例中，聚合物前驱体包括N-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺。
在第三方面的另一实例和上述实例中，聚合物前驱体包括交联剂。举例来说，交联剂为双-丙烯酰胺。
在第四方面中，一种方法包括固化孔阵列的孔内的聚合物基质。聚合物基质由包括丙烯酸酯或丙烯酰胺以及溴官能化的丙烯酸酯或丙烯酰胺的前驱体形成。所述方法进一步包括向固化的聚合物施加硫代苯甲酸酯寡核苷酸复合物。硫代苯甲酰胺寡核苷酸复合物与聚合物基质反应以形成寡核苷酸缀合的聚合物基质。
在第四方面的一个实例中，溴官能化的丙烯酸酯或丙烯酰胺包括N-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺。
在第四方面的另一实例和上述实例中，丙烯酸酯或丙烯酰胺包括羟基烷基丙烯酰胺。
在第四方面的另一实例和上述实例中，所述方法进一步包括在扩增条件下向寡核苷酸缀合的聚合物基质施加目标多核苷酸，其中寡核苷酸包含与目标多核苷酸的一部分互补的序列。在一实例中，寡核苷酸至少部分地基于目标多核苷酸延长。在另一实例中，所述方法进一步包括使用可操作地耦接到孔的感测器对延长的寡核苷酸进行测序。在另一实例中，测序包括向聚合物基质顺序施加包括核苷酸的溶液以及用感测器测量响应。
在第五方面中，一种设备包括包含多个感测器的感测器阵列，各感测器包括离子敏感材料层。所述设备进一步包括安置在所述感测器阵列上面并且限定与多个感测器的感测器对应的孔的孔阵列。感测器的离子敏感材料层形成对应孔的底部表面。所述方法进一步包括安置在孔内的共形聚合物基质。
在第五方面的一个实例中，所述共形聚合物基质包括聚丙烯酰胺基质。
在第五方面的另一实例和上述实例中，聚合物基质为就地固化的聚合物基质。
在第五方面的另一实例和上述实例中，共形聚合物基质缀合至寡核苷酸。
在第五方面的另一实例和上述实例中，孔具有在0.1μm到2μm范围内的特征直径。在第五方面的另一实例和上述实例中，孔的厚度在0.01μm到10μm范围内。
在第五方面的另一实例和上述实例中，多个感测器为离子敏感场效应晶体管。
注意，并非所有以上在一般描述或实例中所述的行为都是需要的，一部分具体行为可能是不需要的，并且除了所描述的那些之外，还可以进行一种或多种其它行为。再者，列行为的顺序不一定是执行它们的顺序。
在前文说明书中，已经参考具体实施方式来描述构思。然而，本领域普通技术人员了解，可以在不脱离如所附权利要求书中所阐述的本发明范围的情况下进行各种修改和变化。因此，所述说明书和附图应该以说明性而不是限制性意义来看待，并且所有这样的修改意图被包括在本发明范围内。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”、“含”、“具有”、“拥有”或其任何其它变体意图涵盖非排它性的包涵物。举例来说，包含一列特征的工艺、方法、制品或设备不一定仅限于那些特征，而是可以包括没有明确列出的其它特征或所述工艺、方法、制品或设备所固有的其它特征。另外，除非明确相反说明，否则“或”是指包括性的或而不是排它性的或。举例来说，条件A或B是通过以下中的任一者来满足：A是真的(或存在的)并且B是假的(或不存在的)；A是假的(或不存在的)并且B是真的(或存在的)；以及A和B都是真的(或存在的)。
此外，“一(a或an)”的使用是用来描述本文中所述的要素和组件(组分)。这样做只是为了方便起见并且给出本发明范围的一般性意义。除非明显的是其指的是其它情况，否则该描述应该被解读为包括一个或至少一个并且该单数也包括复数。
上文已关于具体实施方式描述了益处、其它优势和对问题的解决方案。然而，所述益处、优势、对问题的解决方案以及可能引起任何益处、优势或解决方案出现或变得更明显的任何特征不应被解释为任何或所有权利要求的至关重要、所需或必要的特征。
阅读本说明书之后，熟练的技术人员将了解，某些特征是为了清楚起见在此在独立实施方式的情况下描述的并且也可以在单个实施方式中以组合形式提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方式的情况下所描述的各种特征也可以单独地或以任何子组合提供。另外，提及范围中所述的值包括在那个范围内的每一个值。

Claims (22)

1.一种形成聚合物基质阵列的方法，所述方法包含：
将水溶液流入流槽的流室中，所述流槽包括孔阵列，所述水溶液流入所述孔阵列的孔中，所述水溶液包含聚合物前驱体；
将不可混溶流体流入所述流室中并在所述孔阵列上面以分隔所述孔阵列的所述孔内的所述水溶液；以及
使所述孔阵列的所述孔中分隔的所述聚合物前驱体聚合以形成所述聚合物基质阵列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述孔具有0.1μm到2μm范围内的特征直径。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述孔具有在0.01μm到10μm范围内的厚度。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述孔阵列的所述孔覆盖在感测器阵列的感测器上面，所述孔与所述感测器阵列的所述感测器的离子敏感材料对应。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物基质阵列的聚合物基质与所述孔阵列的孔壁共形。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物前驱体包括能自由基聚合的单体。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述能自由基聚合的单体包括基于乙烯基的单体。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述基于乙烯基的单体包括丙烯酰胺、乙酸乙烯酯、甲基丙烯酸羟基烷基酯、或其变体或衍生物、或其任何组合。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物前驱体包括交联剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述交联剂为双-丙烯酰胺。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物前驱体包括表面活性添加剂。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物前驱体包括寡核苷酸官能化的丙烯酰胺。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物前驱体包括N-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺。
14.根据权利要求1所述的方法，其中将所述水溶液流入包括将乳液流入，所述乳液包括作为分散相的所述水溶液。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述不可混溶流体包括矿物油、硅油、庚烷、碳酸酯油、或其组合。
16.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含在将所述水溶液流入之后旋转所述孔阵列。
17.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含在将所述水溶液流入之后对所述孔阵列进行超声波处理。
18.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含在将所述水溶液流入期间将所述孔阵列脱气。
19.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含在将所述水溶液流入之前用亲水性流体润湿所述孔阵列。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物前驱体包括引发剂。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述不可混溶流体包括引发剂。
22.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含在将所述水溶液流入之前用表面活性剂处理所述孔内的表面。
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