CN106883334B - 亲水性聚合物颗粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

形成颗粒的方法包括在水性悬浮液内的分散相中，使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒。该方法还包括将聚合物颗粒转换为亲水性颗粒。

Description

亲水性聚合物颗粒及其制备方法
本申请是申请日为2013年02月08日、申请号为201380019099.3(PCT/US2013/025328)、题目为“亲水性聚合物颗粒及其制备方法”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2012年2月9日提交的美国临时申请号61/597,053的利益，所述美国临时申请以引用的方式全文并入本文。
本专利申请要求于2012年10月26日提交的美国临时申请号61/719,045的利益，所述美国临时申请以引用的方式全文并入本文。
本专利申请要求于2012年11月30日提交的美国临时申请号61/731,873的利益，所述美国临时申请以引用的方式全文并入本文。
技术领域
总的来说，本公开内容涉及亲水性聚合物颗粒，并且涉及用于制备并使用此类亲水性聚合物颗粒的方法。
背景技术
聚合物颗粒越来越多地用作分离技术中的组分，并且帮助检测化学和生物系统两者中的分析物。例如，聚合物颗粒已用于色谱技术中以从溶液中分离靶分子。在另一个例子中，具有磁性涂层的聚合物颗粒用于磁性分离技术中。最近以来，聚合物颗粒已用于增强ELISA型技术并且可用于捕获多核苷酸。
然而，此类分离和分析技术已具有由于颗粒大小中的变异的缺点。颗粒大小中的大变异导致颗粒重量中的变异，以及可用于与靶分析物相互作用的反应位点数目中的变异。对于磁性分离技术，大小中的变异可导致低效率分离。对于色谱技术和多种多核苷酸捕获技术，大小中的变异可导致可用于与多核苷酸相互作用的位点数目中的变异，导致捕获或分离效率中的变异。
像这样，改善的聚合物颗粒和用于制造此类聚合物颗粒的方法将是期望的。
发明内容
在第一个方面，形成颗粒的方法包括在水性悬浮液内的分散相中，使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒，并且将聚合物颗粒转换为水凝胶颗粒。
在第二个方面，形成颗粒的方法包括在水性悬浮液内的分散相中，使具有疏水性保护基团的丙烯酰胺单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒，并且将聚合物颗粒转换为亲水性颗粒。
在第三个方面，形成颗粒的方法包括在水性悬浮液内的分散相中，使可自由基聚合单体的多个聚体单元与具有疏水性保护基团的二丙烯酰胺交联剂聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒。该方法还包括去除至少一部分所述多个疏水性保护基团。
在第四个方面，形成颗粒的方法包括使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒；从聚合物颗粒中去除至少一部分所述多个疏水性保护基团，形成亲水性颗粒；并且使寡核苷酸与亲水性颗粒结合。
在第五个方面，多个颗粒包括至少100,000个颗粒。多个颗粒中的至少一个颗粒包括水凝胶。多个颗粒具有不超过100微米的平均粒度和不超过5％的变异系数。
在第六个方面，系统包括孔阵列。孔阵列的至少一个孔与ISFET传感器可操作地连接。该系统还包括具有不超过5％的变异系数的多个水凝胶颗粒。多个水凝胶颗粒中的至少一个水凝胶颗粒设置在孔阵列的孔中。
在第七个方面，多个颗粒通过包括下述的方法形成：在水性悬浮液内的分散相中，使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒，并且包括将聚合物颗粒转换为水凝胶颗粒。
在第八个方面，组合物包括丙烯酰胺单体和交联剂的水性混合物，该丙烯酰胺单体包括疏水性保护基团，单体和交联剂以在15:1至1:2范围内的单体:交联剂的质量比包括。
在第九个方面，测序多核苷酸的方法包括提供包括孔阵列的装置。至少一个孔与ISFET可操作地连接，并且包括通过上述方面的方法形成的颗粒。该颗粒附着至多核苷酸。该方法还包括将包括预定类型的核苷酸的溶液施加于装置，并且观测对施加溶液的离子应答。
在第十个方面，用于核苷酸掺入的方法包括提供通过上述方面的方法形成的颗粒。该颗粒附着至包括与引物杂交的模板核酸的核酸双链体。该双链体与聚合酶结合。该方法还包括使颗粒与一种或多种核苷酸接触，并且使用聚合酶将至少一种核苷酸掺入引物的末端上。
在第十一个方面，形成颗粒的方法包括促进种子颗粒在水性悬浮液中形成分散相，在分散相中使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒，并且将聚合物颗粒转换为水凝胶颗粒。
在第十二个方面，形成颗粒的方法包括提供在水性悬浮液中的种子颗粒，该种子颗粒包含疏水性聚合物，并且包括促进种子颗粒在水性悬浮液中形成分散相。该方法还包括在分散相中使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括具有多个疏水性保护基团的亲水性聚合物的聚合物颗粒。聚合物颗粒包括疏水性聚合物。该方法还包括从亲水性聚合物中切割多个疏水性保护基团，并且从聚合物颗粒中提取疏水性聚合物，形成水凝胶颗粒。
在第十三个方面，颗粒包括由羟烷基丙烯酰胺和二丙烯酰胺聚合形成的聚合物。二丙烯酰胺包括羟基。当暴露于水时，颗粒吸收基于聚合物重量至少300重量％的水。
具体地，本发明包括：
1.一种形成颗粒的方法，所述方法包括：
在水性悬浮液内的分散相中，使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒；和
将所述聚合物颗粒转换为亲水性颗粒。
2.根据项1所述的方法，其中所述亲水性颗粒是水凝胶颗粒。
3.根据项1或项2所述的方法，其中所述亲水性单体包括丙烯酰胺单体。
4.根据项1或项2所述的方法，其中所述亲水性单体是可自由基聚合的单体，并且所述分散相还包括具有疏水性保护基团的二丙烯酰胺交联剂。
5.根据项1-4中任一项所述的方法，其中转换所述聚合物颗粒包括从所述聚合物颗粒中去除至少一部分所述多个疏水性保护基团。
6.根据项5所述的方法，其中去除至少一部分所述多个疏水性保护基团包括从所述聚合物颗粒中酸切割至少一部分所述多个疏水性保护基团。
7.根据项1-6中任一项所述的方法，其中转换所述聚合物颗粒包括从所述聚合物颗粒中去除基本上全部的所述多个疏水性保护基团。
8.根据项1-7中任一项所述的方法，所述方法还包括促进所述水性悬浮液中的种子颗粒形成所述分散相。
9.根据项8所述的方法，其中受保护单体:种子颗粒的质量比在150:1至1:1的范围内。
10.根据项8所述的方法，其中所述种子颗粒包括种子聚合物。
11.根据项10所述的方法，所述方法还包括在转换所述聚合物颗粒后提取所述种子聚合物。
12.根据项10所述的方法，其中所述种子聚合物是疏水的。
13.根据项10所述的方法，其中所述种子聚合物包括苯乙烯类聚合物、丙烯酸类聚合物、丙烯酰胺、另一种乙烯基聚合物，或其组合。
14.根据项8所述的方法，其中所述种子颗粒具有不超过0.6微米的初始粒度。
15.根据项14所述的方法，其中所述初始粒度不超过0.45微米。
16.根据项15所述的方法，其中所述初始粒度不超过0.35微米。
17.根据项16所述的方法，其中所述初始粒度不超过0.15微米。
18.根据项8所述的方法，其中所述种子颗粒具有在1微米至7微米范围内的初始粒度。
19.根据项8所述的方法，其中促进所述种子颗粒包括使溶剂和促进试剂与所述种子颗粒混合。
20.根据项19所述的方法，其中所述促进试剂是疏水的，并且具有在25℃下小于0.01g/l的水溶性。
21.根据项19所述的方法，其中所述促进试剂包括二辛酰过氧化物或己二酸二辛酯或分子量低于20kD的聚苯乙烯。
22.根据项1-21中任一项所述的方法，其中所述亲水性单体包括丙烯酰胺。
23.根据项4-22中任一项所述的方法，其中所述可自由基聚合的单体是基于乙烯基的单体。
24.根据项23所述的方法，其中所述基于乙烯基的单体包括丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯醇、乙酸乙烯酯、丙烯酰胺-甲基-丙烷磺酸，或其组合。
25.根据项24所述的方法，其中所述基于乙烯基的单体是丙烯酰胺。
26.根据项1-25中任一项所述的方法，其中所述疏水性保护基团包括羟基保护基团。
27.根据项1-25中任一项所述的方法，其中所述疏水性保护基团包括胺保护基团。
28.根据项1-27中任一项所述的方法，其中所述疏水性保护基团包括有机金属部分。
29.根据项28所述的方法，其中所述有机金属部分形成甲硅烷基醚官能团。
30.根据项29所述的方法，其中所述甲硅烷基醚官能团源自叔丁基二甲基硅烷醚、三甲基甲硅烷基醚、三乙基甲硅烷基醚、二苯基甲基甲硅烷基醚，或其组合。
31.根据项1-30中任一项所述的方法，其中使所述多个聚体单元聚合还包括使交联剂与具有疏水性保护基团的所述亲水性单体混合。
32.根据项31所述的方法，其中混合所述交联剂包括以在15:1至1:2范围内的亲水性单体:交联剂的质量比混合所述交联剂。
33.根据项32所述的方法，其中所述范围是10:1至1:1。
34.根据项31所述的方法，其中所述交联剂是低水溶性交联剂，并且具有在25℃下小于10g/l的水溶性。
35.根据项31所述的方法，其中所述交联剂是二乙烯基交联剂。
36.根据项35所述的方法，其中所述二乙烯基交联剂包括二丙烯酰胺。
37.根据项4或项36所述的方法，其中所述二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羟丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、其受保护的衍生物，或其组合。
38.根据项4或项37所述的方法，其中所述二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、甲硅烷基-保护的N-[2-(丙烯酰氨基)-1,2-二羟乙基]丙烯酰胺例如N,N’(2,3-双((三乙基甲硅烷基)氧基)丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺，或其组合。
39.根据项35所述的方法，其中所述二乙烯基交联剂包括二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、六亚甲基双丙烯酰胺、三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯，或其组合。
40.根据项1-39中任一项所述的方法，其中使所述多个聚体单元聚合包括使致孔剂与具有疏水性保护基团的所述亲水性单体混合。
41.根据项40所述的方法，其中所述致孔剂是芳香族致孔剂。
42.根据项41所述的方法，其中所述芳香族致孔剂包括甲苯、二甲苯、均三甲苯、乙酸苯乙基酯(phenylenethyl acetate)或苯甲酸乙酯。
43.根据项1-42中任一项所述的方法，所述方法还包括活化所述亲水性颗粒或所述水凝胶颗粒。
44.根据项43所述的方法，其中所述转换包括在所述水凝胶颗粒上提供一个或多个羟基，并且其中活化包括将所述一个或多个羟基中的至少一个转换为烷基或芳基磺酸酯。
45.根据项43所述的方法，其中所述转换包括在所述水凝胶颗粒上提供一个或多个羟基，并且其中活化包括将所述一个或多个羟基中的至少一个替换为叠氮化物官能部分。
46.根据项43所述的方法，其中所述转换包括在所述水凝胶颗粒上提供一个或多个胺基，并且其中活化包括使所述一个或多个胺基中的至少一个与双琥珀酰亚胺C2-C12烷基酯反应。
47.根据项43所述的方法，所述方法还包括使寡核苷酸与所述活化的水凝胶聚合物结合。
48.根据项47所述的方法，其中所述结合包括亲核取代，并且所述寡核苷酸是亲核体封端的寡核苷酸。
49.根据项48所述的方法，其中所述亲核体封端的寡核苷酸的亲核体是胺基。
50.根据项48所述的方法，其中所述亲核体封端的寡核苷酸的亲核体是硫醇基。
51.根据项47所述的方法，所述方法还包括使多核苷酸与所述寡核苷酸杂交。
52.根据项51所述的方法，所述方法还包括将所述多核苷酸扩增成多个多核苷酸，并且使所述多个多核苷酸的至少一部分附着至所述水凝胶颗粒，由此生成包括多个附着的多核苷酸的水凝胶颗粒。
53.根据项51所述的方法，所述方法还包括通过延伸所述寡核苷酸将所述多核苷酸扩增成多个互补多核苷酸，由此生成包括多个附着的多核苷酸的水凝胶颗粒。
54.根据项1-53中任一项所述的方法，其中所述水凝胶颗粒是在水中具有不超过2微米的平均粒度的多个类似形成的水凝胶颗粒之一。
55.根据项54所述的方法，其中所述平均粒度不超过1微米。
56.根据项55所述的方法，其中所述平均粒度不超过0.8微米。
57.根据项56所述的方法，其中所述平均粒度不超过0.5微米。
58.根据项1-44中任一项所述的方法，其中所述水凝胶颗粒是在水中具有在5微米至100微米范围内的平均粒度的多个类似形成的水凝胶颗粒之一。
59.根据项1-58中任一项所述的方法，其中所述水凝胶颗粒是大小基本上均匀的多个类似形成的水凝胶颗粒之一。
60.根据项1-59中任一项所述的方法，其中所述水凝胶颗粒是具有不超过5.0％的变异系数的多个类似形成的水凝胶颗粒之一。
61.根据项60所述的方法，其中所述变异系数不超过3.5％。
62.一种形成颗粒的方法，所述方法包括：
使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒；
从所述聚合物颗粒中去除至少一部分所述多个疏水性保护基团，形成亲水性颗粒；和
使寡核苷酸与所述亲水性颗粒结合。
63.根据项62所述的方法，其中去除至少一部分所述多个疏水性保护基团包括从所述聚合物颗粒中酸切割至少一部分所述多个疏水性保护基团。
64.根据项62或项63所述的方法，其中所述亲水性单体包括丙烯酰胺。
65.根据项62-64中任一项所述的方法，其中所述疏水性保护基团包括羟基保护基团。
66.根据项62-65中任一项所述的方法，其中所述疏水性保护基团包括有机金属部分。
67.根据项66所述的方法，其中所述有机金属部分形成甲硅烷基醚官能团。
68.根据项62-67中任一项所述的方法，其中使所述多个聚体单元聚合还包括使交联剂与具有疏水性保护基团的所述亲水性单体混合。
69.根据项68所述的方法，其中所述交联剂是二乙烯基交联剂。
70.根据项69所述的方法，其中所述二乙烯基交联剂包括二丙烯酰胺。
71.根据项62-70中任一项所述的方法，所述方法还包括在结合所述寡核苷酸前活化所述水凝胶颗粒。
72.根据项71所述的方法，其中所述去除包括在所述亲水性颗粒上提供一个或多个羟基，并且其中活化包括将所述一个或多个羟基中的至少一个转换为磺酸酯基团。
73.根据项71所述的方法，其中所述去除包括在所述亲水性颗粒上提供一个或多个羟基，并且其中活化包括将所述一个或多个羟基中的至少一个替换为叠氮化物官能部分。
74.根据项71所述的方法，其中所述结合包括使所述寡核苷酸与所述活化的水凝胶聚合物结合。
75.根据项74所述的方法，其中所述结合包括亲核取代，并且所述寡核苷酸是亲核体封端的寡核苷酸。
76.根据项75所述的方法，其中所述亲核体封端的寡核苷酸的亲核体是胺基。
77.根据项75所述的方法，其中所述亲核体封端的寡核苷酸的亲核体是硫醇基。
78.根据项62-77中任一项所述的方法，所述方法还包括使多核苷酸与所述寡核苷酸杂交。
79.根据项78所述的方法，所述方法还包括将所述多核苷酸扩增成多个多核苷酸，并且使所述多个多核苷酸的至少一部分附着至所述水凝胶颗粒，由此生成包括多个附着的多核苷酸的水凝胶颗粒。
80.根据项78所述的方法，所述方法还包括通过延伸所述寡核苷酸将所述多核苷酸扩增成多个互补多核苷酸，由此生成包括多个附着的多核苷酸的水凝胶颗粒。
81.包含至少100,000个颗粒的多个颗粒，所述多个颗粒中的至少一个颗粒包含水凝胶，所述多个颗粒具有不超过100微米的平均粒度和不超过5％的变异系数。
82.根据项81所述的多个颗粒，其中所述至少100,000个颗粒各自包含所述水凝胶。
83.根据项81或82所述的多个颗粒，其中所述变异系数不超过4.5％。
84.根据项83所述的多个颗粒，其中所述变异系数不超过4.0％。
85.根据项84所述的多个颗粒，其中所述变异系数不超过3.5％。
86.根据项85所述的多个颗粒，其中所述变异系数不超过3.0％。
87.根据项81-86中任一项所述的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过30微米。
88.根据项87所述的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过1.5微米。
89.根据项88所述的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过1.1微米。
90.根据项89所述的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过0.6微米。
91.根据项90所述的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过0.5微米。
92.根据项81-91中任一项所述的多个颗粒，其中所述水凝胶包括丙烯酰胺聚合物。
93.根据项81-92中任一项所述的多个颗粒，其中所述多个颗粒的颗粒具有至少60％的平均孔隙率。
94.一种系统，所述系统包括：
孔阵列，所述孔阵列的至少一个孔与ISFET传感器可操作地连接；和
具有不超过5％的变异系数的多个水凝胶颗粒，所述多个水凝胶颗粒中的至少一个水凝胶颗粒设置在所述孔阵列的孔中。
95.通过包括下述步骤的方法形成的多个颗粒：
在水性悬浮液内的分散相中，使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒；和
将所述聚合物颗粒转换为水凝胶颗粒。
96.根据项95所述的多个颗粒，其中所述多个颗粒具有不超过5.0％的变异系数。
97.根据项96所述的多个颗粒，其中所述变异系数不超过4.0％。
98.根据项97所述的多个颗粒，其中所述变异系数不超过3.5％。
99.根据项98所述的多个颗粒，其中所述变异系数不超过3.0％。
100.根据项95-99中任一项所述的多个颗粒，其中所述多个颗粒具有不超过100微米的平均粒度。
101.根据项100所述的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过30微米。
102.根据项101所述的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过5微米。
103.根据项102所述的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过1.5微米。
104.根据项103所述的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过0.8微米。
105.根据项95-104中任一项所述的多个颗粒，其中所述亲水性单体包括丙烯酰胺单体。
106.根据项95-105中任一项所述的多个颗粒，其中所述多个颗粒的颗粒具有至少60％的平均孔隙率。
107.一种包含丙烯酰胺单体和交联剂的水性混合物的组合物，所述丙烯酰胺单体具有疏水性保护基团，所述单体和交联剂以在15:1至1:2范围内的单体:交联剂的质量比包括。
108.根据项107所述的组合物，其中所述交联剂是二乙烯基交联剂。
109.根据项108所述的组合物，其中所述二乙烯基交联剂包括二丙烯酰胺。
110.根据项109所述的组合物，其中所述二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羟丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、其受保护的衍生物，或其组合。
111.根据项110所述的组合物，其中所述二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、甲硅烷基-保护的N-[2-(丙烯酰氨基)-1,2-二羟乙基]丙烯酰胺例如N,N’(2,3-双((三乙基甲硅烷基)氧基)丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺，或其组合。
112.根据项108所述的组合物，其中所述二乙烯基交联剂包括二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、六亚甲基双丙烯酰胺、三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯，或其组合。
113.根据项107-112中任一项所述的组合物，其中所述比率在10:1至1:1的范围内。
114.一种测序多核苷酸的方法，所述方法包括：
提供包括孔阵列的装置，至少一个孔与ISFET可操作地连接，并且包括通过根据项1-80中任一项所述的方法形成的颗粒，所述颗粒附着至多核苷酸，
将包括预定类型的核苷酸的溶液施加于所述装置；和
观测对所述施加溶液的离子应答。
115.一种用于核苷酸掺入的方法，所述方法包括：
提供通过根据项1-80中任一项所述的方法形成的颗粒，所述颗粒附着至包括与引物杂交的模板核酸的核酸双链体，所述双链体与聚合酶结合；
使所述颗粒与一种或多种核苷酸接触；和
使用所述聚合酶将至少一种核苷酸掺入所述引物的末端上。
116.根据项115所述的方法，其中所述掺入还包括生成核苷酸掺入的副产物。
117.根据项115或116所述的方法，所述方法还包括通过使用场效应晶体管(FET)检测所述副产物来检测所述掺入。
118.一种形成颗粒的方法，所述方法包括：
促进种子颗粒在水性悬浮液中形成分散相；
在所述分散相中，使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒；和
将所述聚合物颗粒转换为水凝胶颗粒。
119.一种形成颗粒的方法，所述方法包括：
提供在水性悬浮液中的种子颗粒，所述种子颗粒包括疏水性聚合物；
促进所述种子颗粒在所述水性悬浮液中形成分散相；
在所述分散相中，使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括具有多个疏水性保护基团的亲水性聚合物的聚合物颗粒，所述聚合物颗粒包括所述疏水性聚合物；
从所述亲水性聚合物中切割所述多个疏水性保护基团；和
从所述聚合物颗粒中提取所述疏水性聚合物，形成水凝胶颗粒。
120.一种颗粒群体，所述颗粒群体具有不超过5％的变异系数并且包括由羟烷基丙烯酰胺和二丙烯酰胺聚合形成的聚合物，所述二丙烯酰胺包括羟基，其中当暴露于水时，所述颗粒吸收基于所述聚合物重量至少300重量％的水。
121.根据项120所述的颗粒，其中当暴露于水时，所述颗粒吸收基于所述聚合物重量至少1000重量％的水。
122.根据项120或121所述的颗粒，其中所述颗粒具有不超过100微米的粒度。
123.根据项122所述的颗粒，其中所述粒度不超过30微米。
124.根据项123所述的颗粒，其中所述粒度不超过1.5微米。
125.根据项120-124中任一项所述的颗粒，其中所述羟烷基丙烯酰胺包括羟乙基丙烯酰胺。
126.根据项120-125中任一项所述的颗粒，其中所述羟烷基丙烯酰胺包括N-[三(羟甲基)甲基)丙烯酰胺、N-(羟甲基)丙烯酰胺，或其组合。
127.根据项120-126中任一项所述的颗粒，其中所述二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(2-羟乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羟丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、其受保护的衍生物，或其组合。
附图说明
通过参考附图，本公开内容可得到更好理解，并且它的众多特征和优点对于本领域技术人员变得显而易见。
图1包括用于制造示例性聚合物颗粒的示例性流程的举例说明。
图2包括利用聚合物颗粒的示例性测序方法的举例说明。
在不同附图中的相同参考符号的使用指示相似或相同项。
具体实施方式
在示例性实施方式中，形成聚合物颗粒的方法包括在水性悬浮液内的分散相中，使具有由疏水性保护基团保护的亲水性官能团的单体的多个聚体单元聚合。聚合形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒。该方法还包括将聚合物颗粒转换为亲水性颗粒，例如水凝胶颗粒。在一个例子中，单体包括亲水性可自由基聚合单体，例如亲水性基于乙烯基的单体，特别是丙烯酰胺。单体是包括由疏水性保护基团保护的亲水性官能团的亲水性单体。例如，疏水性保护基团可包括甲硅烷基官能团或其衍生物。聚合还可包括在交联剂的存在下聚合，所述交联剂例如乙烯基交联剂，包括示例性二丙烯酰胺交联剂。交联剂可以是具有疏水性保护基团的受保护的交联剂。在一个例子中，将聚合物颗粒转换为亲水性颗粒可包括从聚合物颗粒中去除疏水性保护基团的至少一部分。特别地，疏水性保护基团可以是酸可切割的保护基团，并且去除疏水性保护基团可包括从聚合物颗粒中酸切割疏水性保护基团。
通过此类方法制备的示例性聚合物颗粒可具有期望的大小或变异系数。特别地，聚合物颗粒可以是亲水的。例如，聚合物颗粒可包括水凝胶颗粒。此外，聚合物颗粒可具有不超过100μm，例如不超过30μm、不超过3μm、或不超过2μm的平均粒度。聚合物颗粒可具有不超过15％，例如不超过5％的变异系数。
特别地，此类颗粒可用于捕获靶分析物例如多核苷酸。在一个例子中，聚合物颗粒可用于使用涉及光检测的测序方法或涉及离子检测的测序方法来测序多核苷酸。
在特定实施方式中，分散相在水性悬浮液内形成。分散相优选是疏水的。在一个例子中，分散相由于促进种子颗粒例如疏水性种子颗粒而形成，以获得分散相。促进有利于种子颗粒中疏水性组分的吸收。
具有可去除的疏水性保护基团的单体更喜欢分散相。单体在分散相内聚合。任选地，交联剂与在分散相内的单体聚合。在其中分散相由种子颗粒例如疏水性种子颗粒形成的一个例子中，可去除与种子颗粒结合的聚合物。例如，种子颗粒的聚合物可使用溶剂溶解，并且可从聚合物颗粒中提取。
疏水性保护基团可例如通过从聚合物颗粒中切割疏水性保护基团的至少一部分而去除。因此，形成亲水性颗粒例如水凝胶颗粒。
在一个例子中，可活化所得的亲水性颗粒，以有利于与靶分析物例如多核苷酸的缀合。例如，切割疏水性保护基团可在亲水性颗粒上留下亲水性官能团，例如羟基、氨基、硫醇基或其组合。在特定例子中，羟基可通过将羟基转换为磺酸酯基团或氯得到活化。磺酸酯官能团或氯可使用亲核取代进行取代或替换。特别地，具有亲核末端基团例如胺或硫醇基的寡核苷酸可通过磺酸酯基团或氯的亲核取代而附着至亲水性颗粒。此类颗粒可特别用于捕获在测序技术中使用的多核苷酸。
在另一个例子中，磺酸化颗粒还可与单官能或多官能单亲核试剂或多亲核试剂反应，所述亲核试剂可形成与颗粒的附着，同时维持关于包含亲电基团例如马来酰亚胺的寡核苷酸的亲核活性。另外，残留亲核活性可通过附着至包含多亲电基团的试剂而转换为亲电活性，所述多亲电基团随后附着至包含亲核基团的寡核苷酸。
其他缀合技术包括在颗粒合成过程中使用包含在羧酸上的疏水性保护基团的单体。羧酸基团的脱保护使得可获得羧酸基团，所述羧酸基团还可与具有亲核基团例如胺的寡核苷酸反应或促使寡核苷酸附着。
其他缀合技术包括在颗粒合成过程中使用包含在胺上的疏水性保护基团的单体。胺基的脱保护使得可获得亲核基团，所述亲核基团还可用胺反应性双官能双亲电试剂修饰，所述修饰获得在附着至聚合物颗粒后的单官能亲电基团。此类亲电基团可与具有亲核基团例如胺或硫醇的寡核苷酸反应，促使通过与空亲电体反应的寡核苷酸附着。
如图1中所示，方法100包括提供种子颗粒102。将单体加入悬浮液中，并且优选位于由促进的种子颗粒形成的分散相104中。使单体和任选的交联剂聚合，形成聚合物颗粒108。聚合物颗粒108可剥去种子聚合物，形成聚合物颗粒110。去除聚合物颗粒110上的疏水性保护基团，形成亲水性颗粒112。可活化亲水性颗粒112，形成缀合颗粒114。
种子颗粒102可包括种子聚合物。在一个例子中，种子聚合物是疏水的。特别地，种子聚合物可包括苯乙烯类聚合物、丙烯酸类聚合物、丙烯酰胺、另一种疏水的乙烯基聚合物，或其任何组合。在一个例子中，种子颗粒102是单分散的，例如具有不超过20％的变异系数。变异系数(CV)定义为标准偏差除以平均值乘以100，其中“平均值”是平均粒子直径，并且标准偏差是粒度的标准偏差。作为另外一种选择，“平均值”可以是z-平均值或模式粒径。依照通常实践，CV在主模式即主峰上进行计算，从而排除与聚集体相关的小峰。因此，低于或高于模式大小的一些颗粒可在计算中不计算，所述计算可例如基于可检测颗粒的总粒子数的约90％。此类CV测定可在CPS圆盘式离心机上执行。特别地，种子颗粒102群体可具有不超过10％，例如不超过5.0％、不超过3.5％、不超过3％、不超过2.5％、不超过2％、或甚至不超过1.0％的变异系数。此外，种子颗粒102可具有不超过0.6μm的初始粒度。例如，初始粒度可以是不超过0.45μm，例如不超过0.35μm、或甚至不超过0.15μm。作为另外一种选择，具有至少3μm，例如至少5μm、至少10μm、至少20μm、或至少50μm的初始粒度的更大种子颗粒可用于形成更大的聚合物颗粒。在一个例子中，初始粒度可以是不超过100μm。
种子颗粒102可在水性悬浮液内得到促进，形成促进的分散相104。特别地，促进种子颗粒包括使溶剂和促进剂与种子颗粒一起在水性悬浮液内混合，形成分散相。促进的种子颗粒更容易吸收疏水性组分。溶剂可以是与水混溶的。例如，溶剂可包括醛或酮，例如甲醛、丙酮、甲基乙基酮、二异丙基酮、二甲基甲酰胺或其组合；醚溶剂例如四氢呋喃、二甲醚或其组合；酯溶剂；杂环溶剂例如吡啶、二噁烷、四氢糠醇、N-甲基-2-吡咯烷酮或其组合；或其组合。在一个例子中，溶剂可包括酮例如丙酮。在另一个例子中，溶剂可包括醚溶剂例如四氢呋喃。在另外的例子中，溶剂可包括杂环溶剂例如吡啶。
促进剂或促进试剂可以是疏水的，并且具有低水溶性例如在25℃下不超过0.01g/l的水溶性。例如，促进剂可包括二辛酰过氧化物、己二酸二辛酯、邻苯二甲酸正丁酯、十二醇、分子量低于20kD的聚苯乙烯或其组合。在一个例子中，二辛酰过氧化物还可表现为聚合反应的引发剂。促进剂还可以是低分子量聚苯乙烯，其例如使用低单体/引发剂比率在分开的聚合步骤中，或在种子聚合过程中添加链转移试剂而制备。促进剂一般在高压匀化器中乳化。
水性悬浮液还可包括表面活性剂。表面活性剂可以是离子表面活性剂、两性表面活性剂、或非离子表面活性剂。离子表面活性剂可以是阴离子表面活性剂。在另一个例子中，离子表面活性剂可以是阳离子表面活性剂。示例性阴离子表面活性剂包括硫酸盐表面活性剂、磺酸盐表面活性剂、磷酸盐表面活性剂、羧酸盐表面活性剂或其任何组合。示例性硫酸盐表面活性剂包括烷基硫酸盐，例如月桂基硫酸铵、月桂基硫酸钠(十二烷基硫酸钠，(SDS))，或其组合；烷基醚硫酸盐，例如月桂基聚醚硫酸钠、肉豆蔻醇聚醚硫酸钠或其任何组合；或其任何组合。示例性磺酸盐表面活性剂包括烷基磺酸盐例如十二烷基磺酸钠；多库酯钠例如磺基琥珀酸钠二辛酯；烷基苄基磺酸盐；或其任何组合。示例性磷酸盐表面活性剂包括烷基芳基醚磷酸盐、烷基醚磷酸盐或其任何组合。示例性羧酸表面活性剂包括烷基羧酸盐，例如脂肪酸盐或硬脂酸钠；月桂酰肌氨酸钠；胆汁酸盐例如脱氧胆酸钠；或其任何组合。
示例性阳离子表面活性剂包括伯胺、仲胺或叔胺，季铵表面活性剂或其任何组合。示例性季铵表面活性剂包括烷基三甲铵盐例如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)或十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)；西吡氯铵(CPC)；聚乙氧基化牛油胺(POEA)；苯扎氯铵(BAC)；苄索氯铵(BZT)；5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷；双十八烷基二甲基氯化铵；双十八烷基二甲基溴化铵(DODAB)；或其任何组合。
示例性两性表面活性剂包括具有磺酸盐、羧酸盐或磷酸盐阴离子的伯胺、仲胺或叔胺，或季铵阳离子。示例性磺酸盐两性表面活性剂包括(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐)；磺基甜菜碱(sultaine)例如椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱；或其任何组合。示例性羧酸两性表面活性剂包括氨基酸、亚氨酸、甜菜碱例如椰油酰胺丙基甜菜碱或其任何组合。示例性磷酸盐两性表面活性剂包括卵磷脂。在进一步的例子中，表面活性剂可以是非离子表面活性剂例如基于聚乙二醇的表面活性剂。
回到图1，加入悬浮液中的单体优选天然位于由促进的种子颗粒形成的分散相104中。交联剂例如疏水性交联剂也可加入水性悬浮液中，并且可优先位于分散相中。在一个例子中，交联剂具有不超过10g/l的水溶性。此外，致孔剂(porogen)可加入水性悬浮液中，并且可优先位于分散相中。在进一步的例子中，分散相可包括丙烯酸亚磷酰胺(acrydite)寡核苷酸，例如离子交换的丙烯酸亚磷酰胺寡核苷酸。如图1中所示，使单体和任选的交联剂聚合以形成聚合物颗粒108。
单体可以是可自由基聚合的单体例如基于乙烯基的单体。特别地，单体可包括与疏水性保护基团偶联的亲水性单体。在一个例子中，亲水性单体可包括丙烯酰胺、乙酸乙烯酯、甲基丙烯酸羟烷基酯或其任何组合。在特定例子中，亲水性单体是丙烯酰胺，例如包括羟基、氨基、羧基或其组合的丙烯酰胺。在一个例子中，亲水性单体是氨基烷基丙烯酰胺、由胺封端的聚丙二醇官能化的丙烯酰胺(下文所示的C)、丙烯酰基哌嗪(下文所示的D)，或其组合。在另一个例子中，丙烯酰胺可以是羟烷基丙烯酰胺，例如羟乙基丙烯酰胺。特别地，羟烷基丙烯酰胺可包括N-三(羟甲基)甲基)丙烯酰胺(下文所示的A)、N-(羟甲基)丙烯酰胺(下文所示的B)，或其组合。在进一步的例子中，可使用单体的混合物，例如羟烷基丙烯酰胺和胺官能化的丙烯酰胺的混合物，或丙烯酰胺和胺官能化的丙烯酰胺的混合物。在一个例子中，胺官能化的丙烯酰胺可以在100:1至1:1的范围(例如100:1至2:1的范围、50:1至3:1的范围、50:1至5:1的范围、或甚至50:1至10:1的范围)内的羟烷基丙烯酰胺:胺官能化的丙烯酰胺或丙烯酰:胺官能化的丙烯酰胺的比率包括。
在特定例子中，亲水性单体包括羟基或包括胺。疏水性保护基团例如通过与羟基或胺基键合来屏蔽单体的亲水性。当与羟基键合时，此类保护基团在本文中被称为羟基保护基团或氢氧基保护基团。特别地，疏水性保护基团可例如通过切割例如酸切割去除。疏水性基团可选择为在酸性条件下切割，所述切割不导致潜在聚合物或其一部分的水解。例如，对于低于6的pH值，当丙烯酰胺聚合物存在时，疏水性保护基团在比丙烯酰胺的酰胺部分水解的pH高的pH下切割。对于高于9的pH值，疏水性保护基团在比丙烯酰胺的酰胺部分水解的pH低的pH下切割。
示例性疏水性保护基团包括有机金属部分。例如，有机金属部分可形成甲硅烷基醚官能团。甲硅烷基醚官能团可源自卤代甲硅烷基化合物，例如通式R1Si(R2)(R3)(R4)的化合物，其中R1是卤素，例如氯，并且R2、R3和R4独立地选自氢，烷基例如甲基、乙基、丙基、丁基、芳基、甲硅烷基、其醚衍生物或其任何组合。示例性甲硅烷基醚官能团源自叔丁基二甲基氯硅烷、三甲基氯硅烷、三乙基氯硅烷、三丙基氯硅烷、三丁基氯硅烷、二苯基甲基氯硅烷、氯(二甲基)苯基硅烷，或其组合。在特定例子中，受保护单体包括N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺或tBDMS-HEAM、N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺或TES-HEAM或其组合。在另一个例子中，疏水性保护基团可包括有机部分。示例性有机部分可包括烷氧羰基部分，例如叔丁氧羰基、芴基甲氧羰基或其组合。在一个例子中，此类有机部分可以是与胺官能团例如胺官能化的丙烯酰胺或其共聚物的胺官能团结合的疏水性保护基团。
受保护单体可以相对于初始种子聚合物作为在100:1至1:2的范围(例如50:1至1:1的范围、45:1至2:1的范围、30:1至5:1的范围、或甚至20:1至8:1的范围)内的重量比(受保护单体:种子聚合物)表示的量包括。作为另外一种选择，单体可以在10:1至1:2的范围，例如5:1至1:2的范围，或甚至在2:1至1:2的范围内的量包括。
分散相还可包括交联剂。在一个例子中，交联剂以在15:1至1:2的范围(例如10:1至1:1的范围、6:1至1:1的范围、或甚至4:1至1:1的范围)内的受保护单体与交联剂的质量比包括。交联剂可具有低水溶性(例如小于10g/l)，导致对于分散相的优先。特别地，交联剂可以是二乙烯基交联剂。例如，二乙烯基交联剂可包括二丙烯酰胺，例如N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(2-羟乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羟丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺或其组合。在另一个例子中，二乙烯基交联剂包括二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、六亚甲基双丙烯酰胺、三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯、其受保护的衍生物，或其组合。在进一步的例子中，交联剂可由疏水性保护基团例如羟基保护基团加以保护。特别地，疏水性保护基团可以是有机金属部分。例如，有机金属部分可形成甲硅烷基醚官能团。示例性甲硅烷基醚官能团可源自叔丁基二甲基氯硅烷、三甲基氯硅烷、三乙基氯硅烷、三丙基氯硅烷、三丁基氯硅烷、二苯基甲基氯硅烷、氯(二甲基)苯基硅烷，或其组合。示例性受保护的二丙烯酰胺交联剂包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、甲硅烷基保护的N-[2-(丙烯酰氨基)-1,2-二羟乙基]丙烯酰胺例如N,N’(2,3-双((三乙基甲硅烷基)氧基)丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺，或其组合。在另一个例子中，保护基团可包括烷氧羰基部分，例如叔丁氧羰基、芴基甲氧羰基或其组合。特别地，包括羟基的交联剂可由保护基团例如上文与受保护单体相关描述的保护基团加以保护。
另外，使具有疏水性保护基团的亲水性单体聚合可包括在致孔剂的存在下聚合。示例性致孔剂包括芳香族致孔剂。在一个例子中，芳香族致孔剂包括苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯、乙酸苯乙酯、己二酸二乙酯、乙酸己酯、苯甲酸乙酯、乙酸苯酯、乙酸丁酯，或其组合。致孔剂通常具有15-20的溶解度参数。在另一个例子中，致孔剂是烷醇致孔剂例如十二醇。致孔剂可以相对于在反应系统内的有机相在1重量％至99重量％的范围(例如30重量％至90重量％的范围或甚至50重量％至85重量％的范围)内的量包括。
单体选自以其无保护形式产生水凝胶的一组单体，使得寡核苷酸和聚合酶可在使用过程中到达其靶。
亲水性丙烯酰胺和尤其是二丙烯酰胺难以在这样的溶剂中溶解，所述溶剂与水不混溶并且同时溶解疏水性种子聚合物。关于单体和交联剂两者的保护基团可这样选择，使得单体在疏水相中的溶解度足够大，以实现足够大的浓度以进行聚合。同时，保护基团可以不大得使得聚合由于立体阻碍而无法进行。脱保护可在不水解聚合物的条件下进行。
任选地，可包括聚合引发剂。示例性聚合引发剂可通过自由基生成而引发聚合。示例性聚合引发剂包括偶氮引发剂例如油溶性偶氮引发剂。另一种引发剂可包括过硫酸铵。进一步的示例性引发剂可包括四甲基乙二胺。在一个例子中，聚合引发剂可以基于分散相重量0.001重量％至3重量％的量包括。
在聚合后，聚合物颗粒108可剥去种子聚合物，形成仍具有疏水性保护基团的聚合物颗粒110。例如，种子聚合物可使用溶剂提取，所述溶剂例如醛或酮例如丙酮、甲基乙基酮、二异丙基酮、乙酸丁酯、环己酮、二甲基甲酰胺或其组合；邻苯二甲酸酯溶剂例如邻苯二甲酸正丁酯；醚溶剂例如四氢呋喃、二异丙醚、甲基叔丁醚、二甲醚、二乙醚或其组合；酯溶剂例如乙酸乙酯、乙酸丁酯或其组合；杂环溶剂例如吡啶、二噁烷、四氢糠醇或其组合；卤代溶剂例如二氯甲烷、氯仿或其组合。作为另外一种选择，种子聚合物可在聚合物颗粒转换为亲水性颗粒后进行提取。例如，种子聚合物可在使颗粒聚合物脱保护，例如去除聚合物上起因于受保护单体的甲硅烷基后进行提取。
如图1中所示，一旦提取种子聚合物，聚合物颗粒110就可通过去除疏水性保护基团的至少一部分而转换为亲水性聚合物颗粒。例如，疏水性保护基团可从聚合物颗粒中酸切割。特别地，此类去除可从聚合物颗粒中去除基本上所有疏水性保护基团，例如去除至少80％的疏水性保护基团，或甚至至少90％的疏水性保护基团。
在一个例子中，疏水性保护基团通过添加酸例如有机酸进行酸切割。特别地，有机酸可具有在3.0至5.5的范围内的pKa。例如，有机酸可包括乙酸、乳酸、柠檬酸或其任何组合。作为另外一种选择，可使用无机酸。
一旦去除疏水性保护基团的至少一部分，就形成亲水性颗粒112。亲水性颗粒112可以是水凝胶颗粒。水凝胶是可吸收其重量至少20％的水，例如其重量至少45％、至少65％、至少85％、至少100％、至少300％、至少1000％、至少1500％或甚至至少2000％的水的聚合物。
可活化亲水性聚合物112，以有利于与靶分析物例如多核苷酸的缀合。例如，可增强在亲水性颗粒112上的官能团，以允许与靶分析物或分析物受体的结合。在特定例子中，亲水性聚合物的官能团可用能够将亲水性聚合物官能团转换为反应部分的试剂进行修饰，所述反应部分可经历亲核或亲电取代。例如，亲水性颗粒112上的羟基可通过将羟基的至少一部分替换为磺酸酯基团或氯进行活化。示例性磺酸酯基团可源自三氟乙基磺酰氯、甲磺酰氯、对甲苯磺酰氯或4-氟苯磺酰氯(fosyl chloride)、或其任何组合。磺酸酯可作用于允许亲核体替换磺酸酯。磺酸酯还可与释放的氯反应，以提供可在过程中用于缀合颗粒的氯化基团。在另一个例子中，可活化在亲水性聚合物112上的胺基。
例如，靶分析物或分散物受体可通过由磺酸酯基团的亲核取代而与亲水性聚合物结合。在特定例子中，由亲核体例如胺或硫醇封端的靶分析物受体可经历亲核取代，以替换亲水性聚合物112的表面上的磺酸酯基团。由于活化，可形成缀合颗粒114。
在另一个例子中，磺酸化颗粒还可与单官能或多官能单亲核试剂或多亲核试剂反应，所述亲核试剂可形成与颗粒的附着，同时维持对包含亲电基团例如马来酰亚胺的寡核苷酸的亲核活性。另外，残留亲核活性可通过附着至包含多亲电基团的试剂而转换为亲电活性，所述多亲电基团随后附着至包含亲核基团的寡核苷酸。
在另一个例子中，含有官能团的单体可在聚合过程中添加。单体可包括例如含有羧酸、酯、卤素或其他胺反应基团的丙烯酰胺。酯基团可在与胺寡核苷酸反应前水解。
其他缀合技术包括在颗粒合成过程中使用包含在胺上的疏水性保护基团的单体。胺基的脱保护使得可获得亲核基团，所述亲核基团还可用胺反应性双官能双亲电试剂修饰，所述修饰获得在附着至聚合物颗粒后的单官能亲电基团。此类亲电基团可与具有亲核基团例如胺或硫醇的寡核苷酸反应，促使通过与空亲电体反应的寡核苷酸附着。
如果颗粒112由氨基和羟基丙烯酰胺的组合制备，则水凝胶颗粒的脱保护导致亲核氨基和中性羟基的组合。氨基可由二官能双亲电部分例如二异氰酸酯或双-NHS酯进行修饰，导致与亲核体反应的亲水性颗粒。示例性双-NHS酯包括双琥珀酰亚胺C2-C12烷基酯，例如双琥珀酰亚胺辛二酸酯或双琥珀酰亚胺戊二酸酯。
其他活化化学包括掺入多步以转化特定官能团，以容纳特定所需连接。例如，磺酸酯修饰的羟基可通过几种方法转化成亲核基团。在一个例子中，磺酸酯与叠氮化物阴离子的反应获得叠氮化物取代的亲水聚合物。叠氮化物可经由“CLICK”化学直接用于与乙炔取代的生物分子缀合，所述“CLICK”化学可伴随或不伴随铜催化进行。任选地，叠氮化物可通过例如与氢的催化还原或与有机膦的还原而转化为胺。所得的胺随后可用多种试剂转化为亲电基团，所述多种试剂例如二异氰酸酯、双NHS酯、三聚氯氰或其组合。在一个例子中，使用二异氰酸酯获得在聚合物和接头之间的脲连接，所述脲连接导致能够与氨基取代的生物分子反应的残留异氰酸酯基团，以获得在接头和生物分子之间的脲连接。在另一个例子中，使用双NHS酯获得在聚合物和接头之间的酰胺连接，和能够与氨基取代的生物分子反应的残留的NHS酯基团，以获得在接头和生物分子之间的酰胺连接。在进一步的例子中，使用三聚氯氰(cyanuric chloride)获得在聚合物和接头之间的氨基-三嗪连接，和两个残留的氯-三嗪基团，其中之一能够与氨基取代的生物分子反应，以获得在接头和生物分子之间的氨基-三嗪连接。其他亲核基团可经由磺酸酯活化掺入颗粒内。例如，磺酸化的颗粒与硫代苯甲酸阴离子的反应和后续硫代苯甲酸酯的水解将硫醇掺入颗粒内，所述颗粒可随后与马来酰亚胺取代的生物分子反应，以获得与生物分子的硫代-琥珀酰亚胺连接。硫醇还可与溴-乙酰基反应。
作为另外一种选择，丙烯酸亚磷酰胺寡核苷酸可在聚合过程中用于掺入寡核苷酸。示例性丙烯酸亚磷酰胺寡核苷酸可包括离子交换的寡核苷酸。
使用与在生物分子上的亲核部分偶联的在基底上的亲电部分、或与在生物分子上的亲电连接偶联的在基底上的亲核连接基团，可在难熔性(refractory)基底或聚合基底上产生生物分子的共价连接。由于大多数常见目的生物分子的亲水性性质，对于这些偶联选择的溶剂是水或含一些水溶性有机溶剂的水，以便将生物分子分散到基底上。特别地，由于其聚阴离子性质，多核苷酸一般在水系统中与基底偶联。因为水通过使亲电体水解为失活部分用于缀合而与亲核体竞争亲电体，所以水性系统一般导致偶联产物的低得率，其中得率基于该偶联对的亲电部分。当期望反应的对的亲电部分的高得率时，需要高浓度的亲核体以驱动反应并减轻水解，导致亲核体的无效使用。在多核酸的情况下，磷酸盐的金属抗衡离子可替换为亲脂抗衡离子，以便帮助生物分子溶解于极性、非反应性、非水性溶剂中。这些溶剂可包括酰胺或脲，例如甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、乙酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、六甲基磷酰胺、吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮、N,N,N’,N’-四甲基脲、N,N’-二甲基-N,N’-三亚甲基脲或其组合；碳酸酯；例如碳酸二甲基酯、碳酸亚丙基酯或其组合；醚例如四氢呋喃；亚砜和砜例如二甲基亚砜、二甲基砜或其组合；受阻醇例如叔丁醇；或其组合。亲脂阳离子可包括四烷基铵或四芳基铵阳离子例如四甲基铵、四乙基铵、四丙基胺、四丁基铵、四戊基铵、四己基铵、四庚基铵、四辛基胺、以及其烷基和芳基混合物，四芳基鏻阳离子例如四苯基鏻，四烷基鉮或四芳基鉮例如四苯基鉮，以及三烷基锍阳离子例如三甲基锍或其组合。通过用亲脂阳离子交换金属阳离子将多核酸转换成有机溶剂可溶性材料，可通过多种标准阳离子交换技术进行。
在另一个例子中，颗粒可使用乳状液聚合技术形成，其中疏水相在亲水相内形成分散相。上文描述的有利于疏水相的单体、交联剂以及其他试剂和化合物趋于位于在其中发生聚合的疏水相中。
表面活性剂例如上文描述的表面活性剂可用于亲水相中，以支持乳状液形成。当使用种子颗粒时，表面活性剂可以低于临界胶束浓度的浓度使用。作为另外一种选择，表面活性剂可以大于临界胶束浓度的浓度使用。乳状液聚合通常用水溶性引发剂如过硫酸钾或过硫酸铵进行。
通过将引发剂加入单体的加热乳状液中，颗粒成核在水相中开始，并且形成的颗粒通过表面活性剂得到稳定。如果大多数颗粒在短时间段内产生，则可产生单一尺寸的种子颗粒。因为单体通过水相从大单体小滴扩散到小得多的种子颗粒内，所以颗粒大小随后发生增加。
特别地，上述方法可产生具有期望粒度和变异系数的多个颗粒。颗粒组可包括100,000个颗粒，例如500,000个颗粒、大于1百万个颗粒、大于1千万个颗粒或甚至至少1x1010。多个颗粒的颗粒可以是亲水性聚合物颗粒，例如水凝胶颗粒。在特定例子中，水凝胶颗粒可以是丙烯酰胺颗粒，例如包括交联的羟烷基丙烯酰胺聚合物或羟烷基(hydroalkyl)丙烯酰胺和胺官能化的丙烯酰胺的交联共聚物的颗粒。在另一个例子中，颗粒可以是丙烯酰胺和胺官能化的丙烯酰胺的交联共聚物。
该多个颗粒可具有期望的粒度，例如不超过100μm、不超过30μm、或不超过3μm的粒度。平均粒度是平均粒子直径。例如，平均粒度可以是不超过2μm，例如不超过1.5μm、不超过1.1μm、不超过0.8μm、不超过0.6μm、不超过0.5μm、或甚至不超过0.3μm。在特定例子中，平均粒度可在0.1μm至100μm的范围内，例如0.1μm至50μm的范围或0.1μm至1.1μm的范围。在一些方面，上述方法提供了用于产生颗粒的技术优点，所述颗粒具有在5μm至100μm的范围，例如20μm至100μm的范围或30μm至70μm的范围内的粒度。在其他方面，上述方法提供了用于产生具有不超过1.1μm的粒度的颗粒的技术优点。当种子更大时，可形成更大的颗粒。颗粒的大小可基于种子颗粒的大小进行调整。使用本发明的方法，聚合物颗粒的大小比使用其他方法时更不依赖于表面活性剂选择和浓度。
此外，多个颗粒是单分散的，并且可具有期望的低变异系数，例如不超过20％的变异系数。如上，变异系数(CV)定义为标准偏差除以平均值乘以100，其中“平均值”是平均粒子直径，并且标准偏差是粒度中的标准偏差。作为另外一种选择，“平均值”可以是z-平均值或模式粒径。依照通常实践，CV在主模式即主峰上进行计算，从而排除与聚集体相关的小峰。因此，低于或高于模式大小的一些颗粒可在计算中不计算，所述计算可例如基于可检测颗粒的总粒子数的约90％。此类CV测定可在CPS圆盘式离心机或库尔特粒度仪上执行。例如，多个颗粒的变异系数(CV)可以是不超过15％，例如不超过10％、不超过5％、不超过4.5％、不超过4.0％、不超过3.5％、或甚至不超过3.0％。此类CV可无需过滤或其他尺寸排阻技术来实现。
特别地，为了维持珠大小的低变异，在聚合过程中应避免小滴的合并。该避免在水包油乳状液中比油包水乳状液中更容易实现，因为更容易使其中水是连续相的系统稳定。然而，亲水性单体不优先位于油相中。
在进一步的例子中，在水中的亲水性聚合物颗粒可以是不超过50重量％聚合物，例如不超过30重量％聚合物、不超过20重量％聚合物、不超过10重量％聚合物、不超过5重量％聚合物、或甚至不超过2重量％聚合物。
在另外的例子中，聚合物颗粒可具有允许蛋白质和酶扩散的孔隙率。在一个例子中，聚合物颗粒可具有允许具有下述大小的蛋白质扩散的孔隙率：至少50千道尔顿，例如至少100千道尔顿、至少200千道尔顿、至少250千道尔顿、或甚至至少350千道尔顿。
在另一个例子中，当缀合时，聚合物颗粒可包括至少7x 104/μm3的多核苷酸密度，称为核苷酸密度。例如，核苷酸密度可以是至少105/μm3，例如至少106/μm3、至少5x106/μm3、至少8x106/μm3、至少1x 107/μm3、或甚至至少3x107/μm3。在进一步的例子中，核苷酸密度可以是不超过1015/μm3。
此类聚合物颗粒可用于多种分离技术和分析技术中。特别地，聚合物颗粒可用于结合多核苷酸。此类结合多核苷酸可用于从溶液中分离多核苷酸或可用于分析技术例如测序。在图2中所示的具体例子中，此类聚合物颗粒可在测序技术过程中用作多核苷酸的载体。例如，此类亲水性颗粒可固定多核苷酸用于使用荧光测序技术的测序。在另一个例子中，亲水性颗粒可固定多核苷酸的多个拷贝用于使用离子感测技术的测序。
一般而言，聚合物颗粒可进行处理，以包括生物分子，所述生物分子包括核苷、核苷酸、核酸(寡核苷酸和多核苷酸)、多肽、糖、多糖、脂质或其衍生物或类似物。例如，聚合物颗粒可与生物分子结合或附着。生物分子的末端或任何中间部分都可与聚合物颗粒结合或附着。聚合物颗粒可使用连接化学与生物分子结合或附着。连接化学包括共价或非共价键，包括离子键、氢键、亲和键、偶极-偶极键、范德华键和疏水键。连接化学包括在结合配偶体之间，例如在下述物质之间的亲和力：抗生物素蛋白部分和生物素部分；抗原表位和抗体或其免疫反应片段；抗体和半抗原；地高辛配基(digoxigen)部分和抗地高辛配基抗体；荧光素部分和抗荧光素抗体；操纵子和阻遏子；核酸酶和核苷酸；凝集素和多糖；类固醇和类固醇结合蛋白；活性化合物和活性化合物受体；激素和激素受体；酶和底物；免疫球蛋白和蛋白A；或者寡核苷酸或多核苷酸及其相应互补体。
在一个例子中，聚合物颗粒可用于具有表面的系统中。该系统包括在表面上的一个或多个聚合物颗粒。表面可以是固体表面。表面可包括平面、凹或凸表面、或其任何组合。表面可包括纹理或特征，包括蚀刻、空穴化或隆起。表面可缺乏任何纹理或特点。表面可包括毛细管、通道、凹槽、孔或储库的内壁。表面可以是网。表面可以是多孔、半多孔或非多孔的。表面可以是滤器或凝胶。表面可包括针(例如针阵列)的顶端。表面可由例如下述材料制备：玻璃、硼硅玻璃、二氧化硅、石英、熔融石英、云母、聚丙烯酰胺、塑料聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯(PMA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、硅、锗、石墨、陶瓷、硅、半导体、高折射率电解质、晶体、凝胶、聚合物或薄膜(例如金、银、铝或钻石的薄膜)。表面可包括具有金属薄膜或金属涂层的固体基底。表面是光学透明、最低限度反射、最低限度吸收的或显示出低荧光。
表面可具有类似于含96、384、1536、3456或9600个孔的微量滴定板的尺度。表面可在任何一个尺度上是约1-20cm，在任何一个尺度上是约1-10cm，在任何一个尺度上是约0.10-1cm，或在任何一个尺度上是约0.001nm–1cm。表面(以及任何纹理或特点)可通过纳米构造技术产生。
多个聚合物颗粒可在表面上以随机或有序阵列排列，或以随机和有序阵列的组合排列。有序阵列包括直线和六角形模式。表面可包括以随机或有序阵列或两者的组合排列的多个位点。一个或多个聚合物颗粒可位于一个位点、一些位点或所有位点处。一些位点可具有一个聚合物颗粒，并且其他位点可具有多个聚合物颗粒。至少一个位点可缺乏聚合物颗粒。在阵列中，至少两个聚合物颗粒可彼此接触，或在聚合物颗粒之间不具有接触。
如图2中所示，多个聚合物颗粒204可连同多个多核苷酸202一起置于溶液中。多个颗粒204可被活化或以其他方式制备，以与多核苷酸202结合。例如，颗粒204可包括与多个多核苷酸202的多核苷酸一部分互补的寡核苷酸。在另一个例子中，聚合物颗粒204可使用诸如生物素-链霉抗生物素蛋白结合的技术由靶多核苷酸204进行修饰。
在特定实施方式中，对亲水性颗粒和多核苷酸实施聚合酶链反应(PCR)扩增。例如，分散相小滴206或208作为乳状液的一部分形成，并且可包括亲水性颗粒或多核苷酸。在一个例子中，多核苷酸202和亲水性颗粒204以低浓度和相对于彼此的低比率提供，使得单个多核苷酸202可能位于与单个亲水性颗粒204相同的分散相小滴内。其他小滴例如小滴208可包括单个亲水性颗粒且不包括多核苷酸。每个小滴206或208可包括酶、核苷酸、盐或足以促进多核苷酸复制的其他组分。
在特定实施方式中，酶例如聚合酶存在于分散相小滴的亲水性颗粒或水凝胶颗粒中，与分散相小滴的亲水性颗粒或水凝胶颗粒结合或紧密接近。在一个例子中，聚合酶存在于分散相小滴中，以有利于多核苷酸的复制。多种核酸聚合酶可用于本文描述的方法中。在示例性实施方式中，聚合酶可包括可催化多核苷酸复制的酶、其片段或子单元。在另一个实施方式中，聚合酶可以是天然存在的聚合酶、重组聚合酶、突变型聚合酶、变体聚合酶、融合物或以其他方式改造的聚合酶、化学修饰的聚合酶、合成分子、或其类似物、衍生物或片段。
在一个实施方式中，聚合酶可以是任何家族A DNA聚合酶(也称为pol I家族)或任何家族B DNA聚合酶。在实施方式中，DNA聚合酶可以是与非重组DNA聚合酶相比较，能够以优良的准确度和得率复制多核苷酸的重组形式。例如，聚合酶可包括高保真聚合酶或热稳定聚合酶。在实施方式中，用于多核苷酸复制的条件可包括‘热启动’条件，例如热启动聚合酶例如AmplitaqDNA聚合酶(Applied Biosciences)或KOD热启动DNA聚合酶(EMDBiosciences)。通常，‘热启动’聚合酶包括热稳定聚合酶和一种或多种抗体，所述抗体抑制在环境温度下的DNA聚合酶和3’-5’外切核酸酶活性。
在实施方式中，聚合酶可以是酶例如Taq聚合酶(来自水生栖热菌(Thermusaquaticus))、Tfi聚合酶(来自丝状栖热菌(Thermus filiformis))、Bst聚合酶(来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus))、Pfu聚合酶(来自强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus))、Tth聚合酶(来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus))、Pow聚合酶(来自沃氏热球菌(Pyrococcus woesei))、Tli聚合酶(来自栖热球菌(Thermococcuslitoralis))、Ultima聚合酶(来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima))、KOD聚合酶(来自超好热原始菌(Thermococcus kodakaraensis))、Pol I和II聚合酶(来自激烈火球菌(Pyrococcus abyssi))以及Pab(来自激烈火球菌)。
在实施方式中，聚合酶可以是重组形式的超好热原始菌。在实施方式中，聚合酶可以是KOD或KOD样DNA聚合酶，例如KOD聚合酶(EMD Biosciences)、KOD“热启动”聚合酶(EMDBiosciences)、KOD Xtreme热启动DNA聚合酶(EMD Biosciences)、KOD XL DNA聚合酶(EMDBiosciences)、Taq DNA聚合酶(Invitrogen)、Taq DNA聚合酶高保真度(Invitrogen)、Pfx(Invitrogen)、AccuprimeTM Pfx(Invitrogen)、AccuprimeTM Taq DNA聚合酶高保真度(Invitrogen)或AmplitaqDNA聚合酶(Applied Biosystems)。在实施方式中，聚合酶可以是含有与本文讨论的聚合酶相似的突变的DNA聚合酶。
在实施方式中，多核苷酸的复制可包括调节复制条件。调节可任选包括：增加或降低聚合酶浓度；增加或降低核苷酸浓度；增加或降低阳离子浓度；增加或降低反应温度、时间或pH等等。调节可包括增加或降低反应速率、增加或降低反应产物得率等等。在实施方式中，复制可在适当缓冲剂或核苷酸(包括核苷酸类似物或生物素化的核苷酸)的存在下进行。
特别地，待扩增的多核苷酸可通过聚合物颗粒捕获。用于捕获核酸的示例性方法可包括：使多核苷酸与寡核苷酸杂交，所述寡核苷酸附着至聚合物颗粒。在实施方式中，用于捕获核酸的方法包括：(a)提供附着至单链寡核苷酸(例如捕获寡核苷酸)的聚合物颗粒；(b)提供单链多核苷酸；和(c)使单链寡核苷酸与单链多核苷酸杂交，由此将单链多核苷酸捕获至聚合物颗粒。在实施方式中，聚合物颗粒各自可与多个单链寡核苷酸(例如捕获寡核苷酸)附着。在实施方式中，步骤(c)可用多个单链多核苷酸进行。在实施方式中，单链寡核苷酸的至少一部分包含与单链多核苷酸的至少一部分互补(或部分互补)的核苷酸序列。
在一个例子中，该方法还包括将多核苷酸扩增成多个多核苷酸，并且使多个多核苷酸的至少一部分附着至亲水性颗粒，由此生成包括多个附着的多核苷酸的亲水性颗粒。作为另外一种选择，该方法还可包括通过延伸寡核苷酸将多核苷酸扩增成多个互补多核苷酸，由此生成包括多个附着的多核苷酸的水凝胶颗粒。
在实施方式中，用于核苷酸掺入的方法包括：对多核苷酸进行核苷酸聚合反应，所述多核苷酸是与附着至聚合物颗粒的寡核苷酸杂交的。在实施方式中，用于核苷酸掺入的方法包括：(a)提供附着至单链寡核苷酸(例如引物寡核苷酸)的聚合物颗粒；(b)提供单链模板多核苷酸；(c)使单链寡核苷酸与单链模板多核苷酸杂交；和(d)在适合于聚合酶催化至少一个核苷酸聚合到单链寡核苷酸上的条件下，使单链模板多核苷酸与聚合酶和至少一个核苷酸接触，由此进行核苷酸掺入。在实施方式中，聚合物颗粒各自可与多个单链寡核苷酸(例如捕获寡核苷酸)附着。在实施方式中，步骤(b)、(c)或(d)可用多个单链多核苷酸进行。在实施方式中，单链寡核苷酸的至少一部分包含与单链多核苷酸的至少一部分互补(或部分互补)的核苷酸序列。在实施方式中，系统包含与单链寡核苷酸杂交的单链多核苷酸，所述单链寡核苷酸附着至聚合物颗粒，其中至少一个核苷酸聚合到单链寡核苷酸的末端上。
在实施方式中，用于引物延伸的方法包括：对多核苷酸进行引物延伸反应，所述多核苷酸是与附着至聚合物颗粒的寡核苷酸杂交的。在实施方式中，用于核酸引物延伸的方法包括：(a)提供附着至单链寡核苷酸(例如引物寡核苷酸)的聚合物颗粒；(b)提供单链模板多核苷酸；(c)使单链寡核苷酸与单链模板多核苷酸杂交；和(d)在适合于聚合酶催化至少一个核苷酸聚合到单链寡核苷酸上的条件下，使单链模板多核苷酸与聚合酶和至少一个核苷酸接触，由此延伸引物。在实施方式中，聚合物颗粒各自可与多个单链寡核苷酸(例如捕获寡核苷酸)附着。在实施方式中，步骤(b)、(c)或(d)可用多个单链多核苷酸进行。在实施方式中，单链寡核苷酸的至少一部分包含与单链多核苷酸的至少一部分互补(或部分互补)的核苷酸序列。在实施方式中，系统包含与单链寡核苷酸杂交的单链多核苷酸，所述单链寡核苷酸附着至聚合物颗粒，其中所述单链寡核苷酸由一个或多个核苷酸延伸。
在实施方式中，用于核酸扩增的方法包括：对多核苷酸进行引物延伸反应，所述多核苷酸与附着至聚合物颗粒的寡核苷酸杂交。在实施方式中，用于核酸扩增的方法包括：(a)提供附着至单链寡核苷酸(例如引物寡核苷酸)的聚合物颗粒；(b)提供单链模板多核苷酸；(c)使单链寡核苷酸与单链模板多核苷酸杂交；(d)在适合于聚合酶将至少一个核苷酸催化聚合到单链寡核苷酸上的条件下，使单链模板多核苷酸与聚合酶和至少一种核苷酸接触，以便生成延伸的单链寡核苷酸。在实施方式中，该方法还包括：(e)从延伸的单链寡核苷酸去除(例如使变性)单链模板多核苷酸，使得单链寡核苷酸保持附着至聚合物颗粒；(f)使剩余的单链寡核苷酸与第二单链模板多核苷酸杂交；和(g)在适合于第二聚合酶催化第二至少一个核苷酸聚合到单链寡核苷酸上的条件下，使第二单链模板多核苷酸与第二聚合酶和第二至少一个核苷酸接触，以便生成后续延伸的单链寡核苷酸。在实施方式中，步骤(e)、(f)和(g)可重复至少一次。在实施方式中，聚合酶和第二聚合酶包含热稳定的聚合酶。在实施方式中，适合于核苷酸聚合的条件包括在高温下进行核苷酸聚合步骤(例如步骤(d)或(g))。在实施方式中，适合于核苷酸聚合的条件包括在交替温度(例如高温和相对更低的温度)下进行核苷酸聚合步骤(例如步骤(d)或(g))。在实施方式中，交替温度范围为60-95℃。在实施方式中，温度循环可以是约10秒至约5分钟、或约10分钟、或约15分钟或更久。在实施方式中，用于核酸扩增的方法可生成各自附着至多个模板多核苷酸的一种或多种聚合物颗粒，所述多个模板多核苷酸包含与单链模板多核苷酸或第二单链模板多核苷酸互补的序列。在实施方式中，聚合物颗粒各自可与多个单链寡核苷酸(例如捕获寡核苷酸)附着。在实施方式中，步骤(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)可用多个单链多核苷酸进行。在实施方式中，单链寡核苷酸的至少一部分包含与单链多核苷酸的至少一部分互补(或部分互补)的核苷酸序列。在实施方式中，用于核酸扩增的方法(如上所述)可在油相(例如分散相小滴)中的水相溶液中进行。
在PCR后，形成颗粒例如颗粒210，其可包括亲水性颗粒212和多核苷酸的多个拷贝214。虽然多核苷酸214作为在颗粒210的表面上示出，但多核苷酸214可在颗粒210内延伸。具有相对于水的低浓度聚合物的水凝胶和亲水性颗粒可包括在颗粒210内部和各处的多核苷酸区段，或多核苷酸可位于孔及其他开口内。特别地，颗粒210可允许酶、核苷酸、引物和用于监控反应的反应产物的扩散。大量多核苷酸/颗粒产生更佳的信号。
在实施方式中，可收集来自破乳操作的聚合物颗粒并在用于测序的制剂中洗涤。收集可通过下述进行：使生物素部分(例如与附着至聚合物颗粒的扩增的多核苷酸模板连接)与抗生物素蛋白部分接触，并且与缺乏生物素化模板的聚合物颗粒分离。可使携带双链模板多核苷酸的收集的聚合物颗粒变性，以获得单链模板多核苷酸用于测序。变性步骤可包括用碱例如(NaOH)、甲酰胺或吡咯烷酮处理。
在示例性实施方式中，颗粒210可用于测序装置中。例如，测序装置216可包括孔218的阵列。颗粒210可置于孔218内。
在一个例子中，引物可加入孔218中，或颗粒210可在置于孔218内之前预暴露于引物。特别地，颗粒210可包括结合的引物。引物和多核苷酸形成包括与引物杂交的多核苷酸(例如模板核酸)的核酸双链体。核酸双链体是至少部分双链的多核苷酸。酶和核苷酸可提供给孔218，以促进可察觉的反应，例如核苷酸掺入。
测序可通过检测核苷酸添加进行。核苷酸添加可使用诸如荧光发射法或离子检测法的方法进行检测。例如，一组荧光标记的核苷酸可提供给系统216，并且可迁移至孔218。激发能也可提供给孔218。当核苷酸由聚合酶捕获并加入延伸引物的末端时，核苷酸的标记可发荧光，从而指示加入哪种类型的核苷酸。
在替代例子中，包括单一类型核苷酸的溶液可顺序进料。响应核苷酸添加，在孔218的局部环境内的pH可改变。此类pH变化可通过离子敏感场效应晶体管(ISFET)进行检测。像这样，pH变化可用于生成指示与颗粒210的多核苷酸互补的核苷酸次序的信号。
特别地，测序系统可包括设置在离子传感器例如场效应晶体管(FET)的传感器垫上的孔或多个孔。在实施方式中，系统包括装载到孔内的一个或多个聚合物颗粒，所述孔设置在离子传感器(例如FET)的传感器垫上，或包括装载到多个孔内的一个或多个聚合物颗粒，所述多个孔设置在离子传感器(例如FET)的传感器垫上。在实施方式中，FET可以是chemFET或ISFET。“chemFET”或化学场效应晶体管包括充当化学传感器的一类场效应晶体管。chemFET具有MOSFET晶体管的类似结构，其中在门电极上的电荷由化学过程施加。“ISFET”或离子敏感场效应晶体管可用于测量溶液中的离子浓度；当离子浓度(例如H+)改变时，通过晶体管的电流相应地改变。
在实施方式中，FET可以是FET阵列。如本文使用的，“阵列”是元件例如传感器或孔的平面排列。阵列可以是一维或二维的。一维阵列可以是具有在第一维度中的一列(或行)元件和在第二维度中的多个列(或行)的阵列。第一和第二维度中的列(或行)数目可相同或不同。FET或阵列可包含102、103、104、105、106、107或更多FET。
在实施方式中，一种或多种微流体结构可在FET传感器阵列上方制造，以提供生物学或化学反应的约束或限制。例如，在一个实现中，一种或多种微流体结构可构造为设置在阵列的一种或多种传感器上的一个或多个孔(或微孔、或反应室、或反应孔，因为这些术语在本文中可互换使用)，使得给定孔设置在其上的一种或多种传感器检测并测量给定孔中的分析物存在、水平或浓度。在实施方式中，可存在FET传感器和反应孔的1:1对应。
回到图2，在另一个例子中，孔阵列的孔218可以可操作地连接至测量装置。例如，对于荧光发射法，孔218可以可操作地偶联至光检测装置。在离子检测的情况下，孔218的下表面可设置在离子传感器例如场效应晶体管的传感器垫上。
涉及经由核苷酸掺入的离子副产物检测测序的一个示例性系统为Ion TorrentPGMTM测序仪(Life Technologies)，所述Ion Torrent PGMTM测序仪是基于离子的测序系统，其通过检测作为核苷酸掺入的副产物产生的氢离子来测序核酸模板。通常，氢离子作为在通过聚合酶的模板依赖性核酸合成过程中发生的核苷酸掺入的副产物释放。IonTorrent PGMTM测序仪通过检测核苷酸掺入的氢离子副产物来检测核苷酸掺入。IonTorrent PGMTM测序仪可包括待测序的多个模板多核苷酸，每个模板设置在阵列中的各自测序反应孔内。阵列的孔可各自与至少一种离子传感器偶联，所述离子传感器可检测作为核苷酸掺入的副产物产生的H+离子的释放或溶液pH变化。离子传感器包括与离子敏感的检测层偶联的场效应晶体管(FET)，所述离子敏感的检测层可感测H+离子的存在或溶液pH变化。离子传感器可提供指示核苷酸掺入的输出信号，所述输出信号可表示为其量级与各自孔或反应室中的H+离子浓度关联的电压变化。不同核苷酸类型可连续流动到反应室内，并且可以由模板序列决定的次序通过聚合酶掺入延伸引物(或聚合位点)内。每个核苷酸掺入可伴随反应孔中H+离子的释放，连同局限性pH的伴随变化。H+离子的释放可通过传感器的FET登记，所述传感器产生指示核苷酸掺入的发生的信号。在特定核苷酸流动过程中未掺入的核苷酸可能不产生信号。来自FET的信号幅度还可与掺入延伸核酸分子内的特定类型核苷酸的数目关联，由此允许分辨均聚物区域。因此，在测序仪的运行过程中，进入反应室内的多个核苷酸流连同跨越多个孔或反应室的掺入监控可允许仪器同时分辨多个核酸模板的序列。关于Ion Torrent PGMTM测序仪组成、设计和操作的更多细节可例如在下述专利申请中找到：美国专利申请序列号12/002781，目前作为美国专利公开号2009/0026082和授权的美国专利号8,262,900公开；美国专利申请序列号12/474897，目前作为美国专利公开号2010/0137143公开；和美国专利申请序列号12/492844，目前作为美国专利公开号2010/0282617公开，所有所述专利申请均以引用的方式全文并入本文。
当用于测序技术，特别是基于离子的测序技术中时，聚合物颗粒的实施方式显示出技术优点。特别地，聚合物颗粒的实施方式是非缓冲的或增强阅读长度或准确度。
在进一步的例子中，聚合物颗粒可显示出无需过滤而比其他方法制备的颗粒更大的均匀度和更低的CV。例如，上述方法可直接形成聚合物颗粒，而无需施加任何种类的选择过程例如过滤或使用离心机。特别地，乳状液聚合可用于产生适合于种子颗粒的颗粒。通常，种子颗粒是非交联的，以能够吸附促进剂分子。
通常，苯乙烯用于产生CV小于5％的种子颗粒，并且其他单体的报道是有限的。出乎意料和有利的是，使用方法例如上文描述的乳状液聚合法，tBDMS HEAM可用于产生CV2％的种子。
此外，本发明方法的实施方式提供了基于种子颗粒的大小的大小控制。另外，通过此类方法制备的颗粒的实施方式提供了超过其他方法的缀合增加，例如60％至80％的缀合增加。
例如，当在Ion Torrent 314PGM上测量时，缀合的聚合物颗粒的实施方式显示出至少200bp，例如至少250bp、至少300bp、至少350bp或甚至至少400bp的Q17平均阅读长度。特别地，缀合的聚合物颗粒可显示出至少500bp的Q17平均阅读长度。在另一个例子中，缀合的聚合物颗粒群体显示出至少200K，例如至少300K、至少350K或甚至至少400K的200Q17运行。
实施例
实施例1：
由羟烷基丙烯酰胺单体和卤代甲硅烷基形成甲硅烷基保护的丙烯酰胺单体，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)。
在0℃下在惰性气氛(Ar)下，将叔丁基二甲基氯硅烷(66.11g,439mmol)以三份以30分钟间隔加入在DMF(132g)中的羟乙基丙烯酰胺(50.01g,434mmol)和咪唑(73.94g,1086mmol)溶液中。在末次添加后15分钟加入额外的DMF(18.90g)。允许反应混合物逐渐达到室温，并且搅拌大约24小时。将反应混合物用水(101g)猝灭并搅拌一小时。随后用二乙醚提取混合物，并且用水和盐水洗涤。使有机相干燥(MgSO4过夜。蒸发获得93.59g产物。在蒸发结束时加入4-甲氧基苯酚(MEHQ)(9mg,100ppm)。将产物贮存于-20℃下。
实施例2
使甲硅烷基保护的丙烯酰胺单体，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，在分散相中聚合并脱保护，形成水凝胶颗粒。
通过用ultraturax型YstralTM X10/25匀化器(“ultraturax”)将1.14g十二烷基硫酸钠(SDS)、190g水、9.50g丙酮和19.0g二辛酰过氧化物混合2分钟形成引发剂乳状液，并且用压力匀化器匀化7分钟。
在0.5L烧瓶中，使具有7.2重量％固体含量的202.42g 0.53微米单分散的聚苯乙烯种子分散体与115.65g引发剂乳状液混合。将混合物在26℃下搅拌20小时，获得促进的种子溶液。
PVP溶液由16.02g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K-30形成。将K-30缓慢加入959g水中，并且搅拌30分钟，随后添加1.08g SDS。
由加入到912g水中的47.99g碳酸氢钠制备缓冲溶液。
由19.63g甲苯、11.49g tBDMS-HEAM、0.77g二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、187.42g水和186.4g PVP溶液制备单体乳状液，通过ultraturax混合2分钟，并且进一步匀化5分钟。
在0.5L反应器中，加入29.45g促进的种子颗粒和189.93g单体乳状液，随后为26.65g缓冲溶液。将混合物在25℃下搅拌2小时，并且随后加入53.33g水。将混合物加热至60℃。在60℃下1小时后，将温度升高至70℃并且在70℃下维持5小时。
将反应混合物转移至1升离心烧瓶，并且在Sorvall RC3CPlus离心机中以4500RPM离心60分钟。将奶油状漂浮产物转移至新的1升烧瓶，并且在四氢呋喃(THF)中离心两次。
将THF溶胀凝胶沉积物与冰乙酸和水混合至1:3:1的重量比，并且在室温下振荡过夜。通过在离心后去除上清液，并加入以THF:水1:1比率的THF和水的混合物两次以及水一次，随后为二甲基甲酰胺(DMF)三次和纯DMF三次，形成凝胶。
实施例3
使甲硅烷基保护的丙烯酰胺单体，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，在由聚苯乙烯颗粒形成的分散相中聚合并脱保护，形成水凝胶颗粒。
由加入800g水中的42.1g碳酸氢钠制备碳酸盐缓冲溶液，以获得0.5M缓冲溶液。用0.5M氢氧化钠将缓冲液的pH调整至10。
由0.96g SDS、160g水、8.00g丙酮和16.0g二辛酰过氧化物制备引发剂乳状液。用0.5M碳酸盐缓冲溶液将pH调整至9。将混合物用ultraturax型YstralTM X10/25匀化器(“ultraturax”)匀化2分钟，并且用压力匀化器匀化6分钟。
在0.5L烧瓶中，使具有15.91重量％固体含量的31.2g 0.31微米单分散的聚苯乙烯种子分散体与103.1g引发剂乳状液混合。将混合物在26℃下搅拌20小时，获得促进的种子溶液。
通过将80g 87-89％水解的聚乙烯醇(PVA)缓慢加入2000g水中，搅拌并加热至80℃1小时并冷却，来制备PVA溶液。使量为91g的PVA溶液与867g水、0.74g SDS和4.24g 0.5M碳酸钠缓冲液混合。
由29.2g甲苯、7.71g tBDMS-HEAM、0.76g EDMA和249g PVA溶液制备单体乳状液，通过ultraturax混合2分钟，并且进一步匀化5分钟。
在0.5L反应器中，加入13.3g促进的种子颗粒和287g单体乳状液。将混合物在25℃下搅拌2小时，并且加热至50℃。在50℃下1小时后，将温度升高至70℃。在2小时后，加入2.8ml 0.5M缓冲溶液，并且将该温度再维持一小时。
将反应混合物转移至1升离心烧瓶，并且在Sorvall RC3CPlus离心机中以4500RPM离心60分钟。将奶油状漂浮产物转移至新的1升烧瓶，并且在THF中离心两次。
向102g THF溶胀凝胶沉积物中，以1:3:1重量比加入冰乙酸和水，并且将分散体在室温下振荡过夜。通过在离心后去除上清液，并加入以THF:水1:1比率的THF和水两次，随后用DMF离心三次和用纯DMF离心三次，形成凝胶。
产物的固体含量测定为0.48g，并且在水中的珠直径通过显微镜检查测定为1.6微米。
实施例4
使用三氟乙基磺酰氯活化依照实施例3形成的水凝胶颗粒。
具体地，通过离心和去除上清液，用30ml无水DMF将来自上文实施例3的26g含有3.08％羟基凝胶的DMF分散体洗涤三次。在末次离心后，将DMF中的凝胶体积调整至26mL，并且用氩短暂冲洗管。加入量为0.241ml的无水吡啶，随后为0.318g三氟乙基磺酰氯。将管振荡过夜。用30ml冰冷的无水DMF将分散体离心四次，在每次离心后去除上清液，并且用冰冷的无水N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)离心两次。将颗粒重悬浮于50mL(2％干(2％dry))无水NMP中。
实施例5
使用4-氟苯磺酰氯(fosyl chloride)活化依照实施例3形成的水凝胶颗粒。
通过离心和去除上清液，用30ml无水DMF将含有来自实施例3的3.08％羟基凝胶的量为26g的DMF分散体洗涤三次。在末次离心后，将DMF中的凝胶体积调整至26mL，并且用氩短暂冲洗管。加入量为0.080ml的无水吡啶，随后为0.113g 4-氟苯磺酰氯。将管振荡过夜并离心，去除上清液，并加入30ml冰冷的无水DMF四次和冰冷的无水NMP两次。将颗粒重悬浮于50mL(2％干)无水NMP中。
实施例6
使用甲磺酰氯活化依照实施例3形成的水凝胶颗粒。
通过离心和去除上清液，用30ml无水DMF将含有来自实施例3的3.08％羟基凝胶的量为16g的DMF洗涤三次。在末次离心后，将DMF中的凝胶体积调整至16mL，并且用氩短暂冲洗管。加入量为0.049ml的无水吡啶，随后为0.121g甲磺酰氯。将管振荡过夜并离心，去除上清液，并加入30ml冰冷的无水DMF四次和冰冷的无水NMP两次。将颗粒重悬浮于50mL(2％干)无水NMP中。
实施例7
在由聚苯乙烯颗粒形成的分散相中，使甲硅烷基保护的丙烯酰胺单体，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，与二乙烯基苯交联剂聚合并脱保护，形成水凝胶颗粒。
由1.26g SDS、210g水、10.5g丙酮和21.0g二辛酰过氧化物制备引发剂乳状液，用ultraturax型YstralTM X10/25匀化器(“ultraturax”)混合2分钟，并且用压力匀化器匀化7分钟。
在0.5L烧瓶中，使具有15.9重量％固体含量的40.7g 0.31微米单分散的聚苯乙烯种子分散体与142.2g引发剂乳状液混合。将混合物在26℃下搅拌48小时，获得促进的种子分散体。
通过将80g聚乙烯醇(PVA)缓慢加入2000g水中，并且搅拌并加热至80℃1小时，来制备PVA溶液。随后使PVA溶液冷却。
向208g浓缩的PVA溶液中，加入1806g水、1.76g SDS和7.68g硼砂，形成PVA硼砂溶液。
将量为31.08g甲苯、9.79g tBDMS HEAM、0.37g 80％二乙烯基苯(DVB)(包含0.296g DVB和0.074g乙基乙烯基苯)、273.7g PVA硼砂溶液通过ultraturax混合2分钟，并且进一步匀化5分钟，形成单体乳状液。
在0.5L反应器中，使10.1g促进的种子颗粒与289.9g单体乳状液混合。将混合物在30℃下搅拌1小时，在50℃下搅拌1小时，并在75℃下搅拌2小时。
将反应混合物转移至1升离心烧瓶，并且在Sorvall RC3CPlus离心机中以4500RPM离心80分钟。收集奶油状漂浮产物，并在THF中离心六次。
向160g THF溶胀凝胶沉积物中，加入以1:3:1重量比的冰乙酸和水。将分散体在室温下振荡过夜。通过在离心后去除上清液，并加入THF:水为1:1比率的THF和水两次以及水一次，随后为DMF三次，形成凝胶。DMF的固体含量随后测定为1.01g。将珠分散体转移至水，并通过显微镜检查进行检查。珠是单一尺寸的并且珠直径为1.9微米。
实施例8
在由聚苯乙烯颗粒形成的分散相中，使甲硅烷基保护的丙烯酰胺单体，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，与受保护的交联剂聚合并脱保护，形成水凝胶颗粒。
由缓慢加入2000g水中的80g聚乙烯醇(PVA)制备浓缩的PVA溶液。将溶液搅拌并加热至80℃1小时并冷却。
向160.5g浓缩的PVA溶液中，加入1425g水、1.56g SDS和6.06g硼砂。用2M HCl将溶液的pH调整至8.2。
量为11.8g甲苯、11.80g 3-苯丙醇、0.15g 2,2’-偶氮双-(2-甲基丁腈)(AMBN)、7.78g tBDMS HEAM、1.44g N,N’-(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺(TES-PBAM)(82％纯度)和291.6g PVA硼砂溶液通过ultraturax混合2分钟，并且进一步匀化5分钟，形成单体乳状液。
在0.5L反应器中，将5.96g聚苯乙烯种子颗粒的水分散体(种子直径0.385μm，8.08重量％固体)与294.5g单体乳状液混合。使氩气(10-20ml/分钟)鼓泡通过混合物，同时在30℃下搅拌并加热1小时，并且在50℃下搅拌并加热1小时。停止氩流，并且加热和搅拌在80℃下继续3小时。
将反应混合物转移至1升离心烧瓶，并且在Sorvall RC3CPlus离心机中以4500RPM离心50分钟。收集奶油状漂浮产物，并在THF中离心四次。
向209g THF溶胀凝胶沉积物中，加入冰乙酸209g和水105g。将混合物在室温下振荡过夜。通过在离心后去除上清液，并加入以THF:水1:1比率的THF和水两次以及水一次，随后为DMF三次，形成凝胶。
分散体的固体含量测定为1.97g。水溶胀凝胶的直径可在具有相位差(phasecontrast)设备的显微镜中测量为1.9μm。CV不超过5.0％。
实施例9
在由聚苯乙烯颗粒形成的分散相中，使甲硅烷基保护的丙烯酰胺单体，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，与N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺(tBDMS EBHEAM)交联剂聚合并脱保护，形成水凝胶颗粒。
由缓慢加入2000g水中的80g聚乙烯醇(PVA)形成浓缩的PVA溶液，随后搅拌并加热至80℃1小时并冷却。
向88g浓缩的PVA溶液中，加入785g水、0.88g SDS和3.33g硼砂，形成PVA硼砂溶液。
由7.82g甲苯、0.040g 2,2’-偶氮双-(2-甲基丁腈)(AMBN)、2.06g tBDMS HEAM、0.51g tBDMS-EBHEAM(95纯度)和92.9g PVA硼砂溶液形成单体乳状液，通过ultraturax混合2分钟，并且进一步匀化5分钟。
在0.5L反应器中，将1.65g种子颗粒的水分散体(种子直径0.319μm，8.07重量％固体)与88.34g单体乳状液混合。使氩气(10-20ml/分钟)鼓泡通过混合物，同时在30℃下搅拌并加热1小时，并且在40℃下搅拌并加热2小时。停止氩流，并且加热和搅拌在80℃下继续3小时。
将反应混合物转移至1升离心烧瓶，并且在Sorvall RC3CPlus离心机中以4500RPM离心50分钟。收集奶油状漂浮产物，并在THF中离心两次。
向83.9g THF溶胀凝胶沉积物中，加入相同重量的冰乙酸和一半重量的水。将混合物在室温下振荡过夜。通过在离心后去除上清液，并加入以THF:水1:1比率的THF和水两次以及水一次，随后为DMF三次，形成凝胶。
分散体的固体含量测定为1.63g。水溶胀凝胶的直径可在具有相位差设备的显微镜中进行测量，并且平均为1.6μm。CV不超过5.0％。
实施例10
在由聚苯乙烯颗粒形成的分散相中，使甲硅烷基保护的丙烯酰胺单体，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，与二乙烯基苯(DVB)交联剂聚合并脱保护，形成水凝胶颗粒。
由1.2g SDS、200g水、10g丙酮和20.0g二辛酰过氧化物制备引发剂乳状液，用ultraturax型YstralTM X10/25匀化器(“ultraturax”)混合2分钟，并且用压力匀化器匀化7分钟。
在0.5L烧瓶中，使具有4.55重量％固体含量的31.64g 0.13微米单分散的聚苯乙烯种子分散体与15.84g引发剂乳状液混合。将混合物在26℃下搅拌6天，获得促进的种子分散体。
由与5.92g SDS和7.33g硼砂混合的1922g水制备硼砂溶液。
由172.4g甲苯、54.76g tBDMS HEAM、2.75g 80％二乙烯基苯(DVB)(包含2.2g DVB和0.55g乙基乙烯基苯)和1468g硼砂溶液制备单体乳状液，通过ultraturax混合，并且进一步匀化17分钟。
在0.5L反应器中，使22.6g促进的种子颗粒与277.6g单体乳状液混合。将混合物在30℃下搅拌1小时，在40℃下搅拌1小时，并在75℃下搅拌2小时。
将反应混合物转移至1升离心烧瓶，并且在Sorvall RC3CPlus离心机中以4500RPM离心90分钟。收集奶油状漂浮产物，并在THF中离心四次。
向73.3g THF溶胀凝胶沉积物中，加入相等重量的冰乙酸和36.7g水，并将分散体在室温下振荡过夜。通过在离心后去除上清液，并加入以THF:水7:3和THF:水6:4比率的THF和水，随后用DMF离心三次，形成凝胶。
分散体的固体含量测定为1.50g。
实施例11
在由聚苯乙烯颗粒形成的分散相中，使甲硅烷基保护的丙烯酰胺单体，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，与DVB交联剂聚合并脱保护，形成亲水性颗粒。
由缓慢加入2000g水中的80g聚乙烯醇(PVA)制备浓缩的PVA溶液。将分散体搅拌并加热至80℃1小时并冷却。
向208g浓缩的PVA溶液中，加入1814g水、2.08g SDS和7.71g硼砂，形成PVA硼砂溶液。
由22.34g甲苯、0.164g 2,2’-偶氮双-(2-甲基丁腈)(AMBN)、16.58g tBDMS HEAM、3.46g 80％二乙烯基苯(包含2.77g DVB和0.69g乙基乙烯基苯)和275g PVA硼砂溶液制备单体乳状液，通过ultraturax混合2分钟，并且进一步匀化5分钟。
在0.5L反应器中，将8.46g种子颗粒的水分散体(种子直径0.550μm，7.20重量％固体)与292.15g单体乳状液混合。将混合物在30℃下搅拌并加热1小时，在50℃下搅拌并加热1小时，并在75℃下搅拌并加热2小时。
将反应混合物转移至1升离心烧瓶，并且在Sorvall RC3CPlus离心机中以4500RPM离心50分钟。收集奶油状漂浮产物，并在THF中离心两次。
向83.9g THF溶胀凝胶沉积物中，加入相同重量的冰乙酸和一半重量的水。将混合物在室温下振荡过夜。通过在离心后去除上清液，并加入以THF:水1:1比率的THF和水两次以及水一次，随后为DMF三次，形成凝胶。
DMF的固体含量测定为7.5g。水溶胀凝胶的直径可在具有相位差设备的显微镜中进行测量，并且测定为平均1.8μm。CV不超过5.0％。
实施例12
在由聚苯乙烯颗粒形成的分散相中，使甲硅烷基保护的丙烯酰胺单体，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，与tBDMS-EBHEAM交联剂聚合并脱保护，形成水凝胶颗粒。
由缓慢加入2000g水中的80g聚乙烯醇(PVA)制备浓缩的PVA溶液，随后搅拌并加热至80℃1小时并冷却。
向88g浓缩的PVA溶液中，加入785g水、0.88g SDS和3.33g硼砂，形成PVA硼砂溶液。
由7.82g甲苯、0.040g 2,2’-偶氮双-(2-甲基丁腈)(AMBN)、2.06g tBDMS HEAM、0.96g tBDMS-EBHEAM(95纯度)和92.9g PVA硼砂溶液形成单体乳状液，通过ultraturax混合2分钟，并且进一步匀化5分钟。
在0.5L反应器中，将1.65g种子颗粒的水分散体(种子直径0.319μm，8.07重量％固体)与88.34g单体乳状液混合。使氩气(10-20ml/分钟)鼓泡通过混合物，同时在30℃下搅拌并加热1小时，并且在40℃下搅拌并加热2小时。停止氩流，并且加热和搅拌在80℃下继续3小时。
将反应混合物转移至1升离心烧瓶，并且在Sorvall RC3CPlus离心机中以4500RPM离心50分钟。收集奶油状漂浮产物，并在THF中离心两次。
向83.9g THF溶胀凝胶沉积物中，加入相同重量的冰乙酸和一半重量的水。将混合物在室温下振荡过夜。通过在离心后去除上清液，并加入以THF:水1:1比率的THF和水两次以及水一次，随后为DMF三次，形成凝胶。
分散体的固体含量测定为1.63g。水溶胀凝胶的直径可在具有相位差设备的显微镜中进行测量，并且平均为1.6μm。CV不超过5.0％。
实施例13
在由聚苯乙烯颗粒形成的分散相中，使甲硅烷基保护的丙烯酰胺单体，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，与作为交联剂的N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(TBDMS EBHEAM)聚合并脱保护，形成亲水性颗粒。
通过在搅拌的同时将80g聚乙烯醇(PVA)缓慢加入2000g水中，来制备浓缩的PVA溶液。将混合物搅拌并加热至80℃下1小时并冷却。
向241.8g浓缩的PVA溶液中，加入2129.6g水、2.32g SDS和9.97g硼砂，形成PVA硼砂溶液。
通过混合72.68g甲苯、0.29g 2,2’-偶氮双-(2-甲基丁腈)(AMBN)、14.59g tBDMSHEAM、4.46g TBDMS EBHEAM和835.8g PVA硼砂溶液制备单体乳状液，通过ultraturax混合2分钟，并在高压Gauline APV-100匀化器中以400巴进一步匀化9分钟。
在1L反应器中，将16.86g种子颗粒的水分散体(种子直径0.319μm，8.07重量％固体)与897g单体乳状液混合。使混合物在40℃下搅拌并加热3小时，同时使氩对于前2小时以0.05l/分钟和以0.15L/分钟1小时鼓泡通过混合物。随后停止氩流，并且使乳状液在80℃下加热3小时。
将反应混合物转移至1升离心烧瓶，并且在Sorvall RC3CPlus离心机中以4700RPM离心60分钟。将奶油状漂浮产物转移至新的500mL玻璃烧瓶，并用水重悬浮至370.74g，用21.09g 0.5M乙酸将pH调整至3.86。将混合物在60℃下搅拌2小时。
通过将9体积的THF加入脱保护的凝胶来形成凝胶，并且在Sorvall RC3CPlus离心机中以3500RPM离心10分钟，随后为用DMF的两次离心和用纯DMF两次离心，全部在离心前添加7.5％THF。DMF中的凝胶的固体含量测定为6.37g。将珠分散体转移至水，并通过显微镜进行检查，并且在水中的珠直径为1.7微米。
实施例14
使用甲磺酰氯活化依照实施例13形成的水凝胶颗粒。
将在DMF中分散的来自实施例13的1.51g羟基凝胶分到两个离心瓶内，并且使用200ml无水DMF和15g无水THF的溶剂混合物，通过离心和去除上清液洗涤三次。在末次离心后，将两个瓶的内容物合并在一起，并且用无水DMF再洗涤一次。干内容物测定为2.32重量％。
将含有来自上述的2.32重量％羟基凝胶的54.74g DMF分散体转移至具有机械搅拌的三颈圆底长颈烧瓶，之前加入8.76g DMF以将干内容物调整至2.00％。圆底长颈烧瓶用氩连续冲洗。加入量为0.2077g的无水吡啶，随后为0.1692g甲磺酰氯。使烧瓶在室温下搅拌过夜。
分散体用200ml无水DMF离心三次，在每次离心后去除上清液，并且在无水N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中重悬浮至122.81g悬浮液。干内容物测定为0.91％，获得1.12g活化的凝胶颗粒。
实施例15
如实施例11中公开的制备大约280,000,000个水凝胶颗粒，并且使其经受有利于分散相小滴中存在的多核苷酸复制的条件。
在DNA文库(L499，大约70,000,000种分子)和AmplitaqDNA聚合酶(Applied Biosystems)或KOD热启动DNA聚合酶(EMD Biosciences)的存在下，使水凝胶颗粒温育。基本上根据制造商的说明书，将样品应用于Ion OneTouchTM System(LifeTechnologies)，形成模板并富集。使用Guava SYBR Gold Stain系统测定在富集前水凝胶颗粒的回收百分比。基本上根据制造商的说明书(Life Technologies)，使用Ion OneTouchESTM System(Life Technologies)进行水凝胶颗粒的富集。当使用KOD聚合酶时，发现水凝胶颗粒的回收后百分比(表1)低；然而，与关于AmplitaqDNA聚合酶的9.5％和18.2％相比较，当使用KOD聚合酶(27.4％)时，总富集后回收百分比更大。
表1.
实施例14
依照实施例9制备聚合物颗粒，磺酸化以提供15％甲磺酰化，并且用乙酸酯和浓氨水处理。在缀合和PCR后，聚合物颗粒用于使用Ion Torrent 316芯片的测序测试中。
聚合物颗粒显示出1.2M例如至少1.4百万的200q17值。此外，聚合物颗粒显示出至少350M，例如至少400M的aq17基础测试。此外，颗粒显示出至少175，例如至少180的q17平均值。
实施例15
在由聚苯乙烯颗粒形成的分散相中，使甲硅烷基保护的丙烯酰胺单体，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，与tBDMS-EBHEAM交联剂聚合并脱保护，形成水凝胶颗粒。
通过首先将1.74g SDS溶解于290.00g水，并且随后加入14.50g丙酮和29.00g双(2-乙基己基)己二酸酯(DOA)，来制备乳状液。乳状液通过ultraturax混合2分钟，并在高压Gauline APV-100匀化器中以400巴进一步匀化5.6分钟。
将31.14g该乳状液加入烧瓶中的43.89g种子颗粒(种子直径0.140μm，4.85重量％固体)。使混合物在40℃下在振荡浴中振荡40小时用于活化。
通过将4.54g SDS和9.69g硼砂溶解至2369.8g水来制备SDS硼砂溶液。
由125.29g乙酸2-苯乙酯、0.468g 2,2’-偶氮双-(2-甲基丁腈)(AMBN)、19.51gtBDMS HEAM、5.99g tBDMS-EBHEAM和816.75g SDS硼砂溶液形成单体乳状液，通过ultraturax混合5分钟，并且进一步匀化9.68分钟。
在1L反应器中，使62.53g活化种子颗粒的水分散体与938.1g单体乳状液混合。将混合物在40℃下搅拌并加热2小时。将混合物进一步在40℃下搅拌并加热另一小时，同时使氩气(150-200ml/分钟)鼓泡通过混合物。在这点时乳状液中的O2量测量为0ppb。停止氩流，并且加热和搅拌在70℃下继续10小时。
将反应混合物转移至四个250mL离心烧瓶，并且在Beckman Coulter Avanti J-20XP离心机中以13000RPM离心60分钟。弃去上清液，并且通过加入水收集沉积物并转移到玻璃烧瓶内。
通过添加0.5M乙酸溶液将凝胶的水性分散体的pH调整至3.8。酸化的凝胶分散体在60℃下在振荡浴中振荡2小时并冷却。
将凝胶分散体转移到三个1L烧瓶内，将300g THF加入每个烧瓶中，使烧瓶在室温下在振荡台上振荡30分钟，并且在Thermo Scientific Thermo Scientific SorvallRC3CPlus离心机中以4500RPM离心25分钟。弃去所得的双相混合物的上相，将50g THF加入每个烧瓶中，使烧瓶在室温下在振荡台上振荡30分钟，并以4500RPM离心25分钟。弃去上清液。
将每个烧瓶的内容物分到两个250mL离心烧瓶内。将大约100g DMF加到每个烧瓶上，并且使烧瓶在室温下在振荡台上振荡过夜。通过加入20g THF和一定量的DMF使每个烧瓶的内容物总计200g。使烧瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP离心机中以13000RPM离心70分钟。弃去上清液。
将大约100g DMF加到每个烧瓶上，并且使烧瓶在室温下在振荡台上振荡40分钟。通过加入20g THF和一定量的DMF使每个烧瓶的内容物总计200g。使烧瓶在BeckmanCoulter Avanti J-20XP离心机中以13000RPM离心70分钟。弃去上清液，并且通过使用最低限度量的DMF，将所有沉积物合并到新烧瓶内。
分散体的固体含量测定为2.34g。水溶胀凝胶的直径在具有相位差设备的显微镜中进行测量，并且平均为0.80μm。
使用3和7重量％蔗糖溶液的梯度和15000RPM的旋转速度，在圆盘式离心机仪器(CPS Instruments,Inc，型号DC20000)中进一步分析水溶胀凝胶。使用1.032g/ml的颗粒密度，直径测量为0.4995μm。CV(数目)测量为3.6％。
实施例16
在由聚苯乙烯颗粒形成的分散相中，使甲硅烷基保护的丙烯酰胺单体，(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺)(tBDMS-HEAM)，与tBDMS-EBHEAM交联剂聚合并脱保护，形成水凝胶颗粒。
通过首先将1.98g SDS溶解于330.05g水，并且随后加入16.51g丙酮和33.00gDOA，来制备乳状液。乳状液通过ultraturax混合2分钟，并在高压Gauline APV-100匀化器中以400巴进一步匀化6.4分钟。
将37.71g该乳状液加入烧瓶中的68.57g种子颗粒(种子直径0.081μm，4.91重量％固体)。使混合物在40℃下在振荡浴中振荡20小时用于活化。
通过将3.77g SDS和7.59g硼砂溶解至1975.6g水来制备SDS硼砂溶液。
由33.89g乙酸2-苯乙酯、0.126g 2,2’-偶氮双-(2-甲基丁腈)(AMBN)、5.26gtBDMS HEAM、1.61g tBDMS-EBHEAM和223.32g SDS硼砂溶液形成单体乳状液，通过ultraturax混合5分钟，并且进一步匀化2.6分钟。
在250mL反应器中，使20.31g活化种子颗粒的水分散体与228.23g单体乳状液混合。将混合物在40℃下搅拌并加热2小时。将混合物进一步在40℃下搅拌并加热另一小时，同时使氩气(150-200ml/分钟)鼓泡通过混合物。在这点时乳状液中的O2量测量为230ppb。停止氩流，并且加热和搅拌在70℃下继续10小时。
将反应混合物转移至250mL离心烧瓶，并且在Beckman Coulter Avanti J-20XP离心机中以12500RPM离心90分钟。弃去上清液，并且通过加入水收集沉积物并转移到玻璃烧瓶内。
通过添加0.5M乙酸溶液将凝胶的水性分散体的pH调整至3.85。酸化的凝胶分散体在60℃下在振荡浴中振荡2.5小时并冷却。
将凝胶分散体转移到1L烧瓶内，加入170.06g THF，使烧瓶在室温下在振荡台上振荡10分钟，并且在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus离心机中以4500RPM离心30分钟。弃去所得的双相混合物的上相。加入86.81g THF，使烧瓶在室温下在振荡台上振荡15分钟，并以4500RPM离心30分钟。弃去上清液。
将200g DMF加到1L烧瓶中的凝胶沉积物上，并且将该悬浮液分到两个250mL离心烧瓶中。使烧瓶在室温下在振荡台上振荡153分钟，并且通过加入30g THF和一定量的DMF使每个烧瓶的内容物总计200g。使烧瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP离心机中以14000RPM离心90分钟。弃去上清液。
将100g DMF加入每个烧瓶中，并且使悬浮液在室温下在振荡台上振荡20分钟。通过加入30g THF和一定量的DMF使每个烧瓶的内容物总计200g，并且使烧瓶在BeckmanCoulter Avanti J-20XP离心机中以14000RPM离心90分钟。弃去上清液，并且通过使用最低限度量的DMF，将所有沉积物合并到新烧瓶内。分散体的固体含量测定为2.03g。
使用3和7重量％蔗糖溶液的梯度和20000RPM的旋转速度，在圆盘式离心机仪器(CPS Instruments,Inc，型号DC20000)中进一步分析水溶胀凝胶。使用1.032g/ml的颗粒密度，直径测量为0.2885μm。CV(数目)测量为5.56％。
实施例17
在由聚苯乙烯颗粒形成的分散相中，使受保护的氨基丙烯酰胺单体(N-叔丁氧羰基-N’-丙烯酰-哌嗪)与tBDMS-HEAM单体和tBDMS-EBHEAM交联剂聚合并脱保护，形成氨基水凝胶颗粒。
通过首先将1.74g SDS溶解于290.00g水，并且随后加入14.50g丙酮和29.00gDOA，来制备乳状液。乳状液通过ultraturax混合2分钟，并在高压Gauline APV-100匀化器中以400巴进一步匀化5.6分钟。
将41.33g该乳状液加入烧瓶中的62.93g种子颗粒(种子直径0.126μm，4.59重量％固体)。使混合物在40℃下在振荡浴中振荡40小时用于活化。
通过将4.54g SDS和9.69g硼砂溶解至2369.8g水来制备SDS硼砂溶液。
由34.22g乙酸2-苯乙酯、0.13g AMBN、4.98g tBDMS HEAM、1.61g tBDMS-EBHEAM、0.37g N-叔丁氧羰基-N’-丙烯酰-哌嗪和221.73g SDS硼砂溶液形成单体乳状液，通过ultraturax混合5分钟，并且进一步匀化4分钟。
在250mL反应器中，使17.09g活化种子颗粒的水分散体与233.1g单体乳状液混合。将混合物在40℃下搅拌并加热2小时。将混合物进一步在40℃下搅拌并加热另一小时，同时使氩气(150-200ml/分钟)鼓泡通过混合物。在这点时乳状液中的O2量测量为500ppb。停止氩流，并且加热和搅拌在70℃下继续10小时。
将反应混合物转移至250mL离心烧瓶，并且在Beckman Coulter Avanti J-20XP离心机中以12000RPM离心60分钟。弃去上清液，并且通过加入水收集沉积物并转移到玻璃烧瓶内。
通过添加0.5M乙酸溶液将凝胶的水性分散体的pH调整至3.8。酸化的凝胶分散体在60℃下在振荡浴中振荡2.5小时并冷却。
将凝胶分散体转移到1L烧瓶内，加入317.24g THF，使烧瓶在室温下在振荡台上振荡30分钟，并且在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus离心机中以4500RPM离心30分钟。弃去所得的双相混合物的上相，加入169.63g THF，使烧瓶在室温下在振荡台上振荡23分钟，并将烧瓶以4500RPM离心30分钟。弃去上清液。
将大约170g水加到凝胶沉积物上，并且使烧瓶在室温下在振荡台上振荡过夜。使烧瓶以4500RPM离心30分钟。弃去上清液。
将大约170g水加到凝胶沉积物上。
用33g水稀释32.2g水凝胶悬浮液(1.55重量％固体)。用3.2mL 2M HCl将pH调整至pH 1.0。将悬浮液连同54g水一起转移至250mL反应器。将悬浮液在60℃下加热18小时。随后将反应混合物转移至Beckman Coulter Avanti J-20XP中的250mL离心烧瓶。
在首先用水稀释并用10重量％NaOH将悬浮液滴定至大约pH 10后，通过离心形成凝胶，获得175g的总重量。在重复这点后，凝胶进一步用水形成三次。离心速度在该过程期间从14500rpm逐渐降低到6000rpm，持续5分钟。在弃去上清液后，随后将凝胶用DMF稀释至175g，并且将获得的悬浮液振荡过夜。在以6500rpm离心5分钟并弃去上清液后，再用DMF的三次相应洗涤继续形成。
将凝胶用NMP稀释至175g，并且以7000rpm离心5分钟。随后将干物质调整至0.29重量％固体，获得71g悬浮液。
实施例18
在由聚苯乙烯颗粒形成的分散相中，使受保护的氨基丙烯酰胺单体(N-芴基甲氧羰基-N’-丙烯酰-哌嗪)与tBDMS-HEAM单体和tBDMS-EBHEAM交联剂聚合并脱保护，形成氨基水凝胶颗粒。
通过首先将1.74g SDS溶解于290.00g水，并且随后加入14.50g丙酮和29.00gDOA，来制备乳状液。乳状液通过ultraturax混合2分钟，并在高压Gauline APV-100匀化器中以400巴进一步匀化5.6分钟。
将41.33g该乳状液加入烧瓶中的62.93g种子颗粒(种子直径0.126μm，4.59重量％固体)。使混合物在40℃下在振荡浴中振荡40小时用于活化。
通过将4.54g SDS和9.69g硼砂溶解至2369.8g水来制备SDS硼砂溶液。
由34.22g乙酸2-苯乙酯、0.13g AMBN、4.98g tBDMS HEAM、1.61g tBDMS-EBHEAM、0.59g N-芴基甲氧羰基-N’-丙烯酰-哌嗪和221.71g SDS硼砂溶液形成单体乳状液，通过ultraturax混合5分钟，并且进一步匀化4分钟。
在250mL反应器中，使17.09g活化种子颗粒的水分散体与233.23g单体乳状液混合。将混合物在40℃下搅拌并加热2小时。将混合物进一步在40℃下搅拌并加热另一小时，同时使氩气(150-200ml/分钟)鼓泡通过混合物。在这点时乳状液中的O2量测量为62ppb。停止氩流，并且加热和搅拌在70℃下继续10小时。
将反应混合物转移至250mL离心烧瓶，并且在Beckman Coulter Avanti J-20XP离心机中以12000RPM离心60分钟。弃去上清液，并且通过加入水收集沉积物并转移到玻璃烧瓶内。
通过添加0.5M乙酸溶液将凝胶的水性分散体的pH调整至3.8。酸化的凝胶分散体在60℃下在振荡浴中振荡2.5小时并冷却。
将凝胶分散体转移到1L烧瓶内，加入287.06g THF，使烧瓶在室温下在振荡台上振荡30分钟，并且在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus离心机中以4500RPM离心30分钟。弃去所得的双相混合物的上相。加入111.41g THF，使烧瓶在室温下在振荡台上振荡23分钟，并将烧瓶以4500RPM离心30分钟。弃去上清液。将DMF加到凝胶上，并且使烧瓶在室温下在振荡台上振荡过夜。
向称重120g的在DMF中的珠悬浮液中，加入10mL哌啶，并且在室温下在振荡台上振荡60分钟。加入45g THF，并且使烧瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP离心机中以14000RPM离心90分钟。弃去上清液。
加入DMF直至悬浮液称重112g，并且使凝胶在振荡台上振荡4小时。加入37g THF，并且使烧瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP离心机中以14000RPM离心60分钟。弃去上清液。
加入DMF直至悬浮液称重130g，并且使凝胶在振荡台上振荡90分钟。加入40g THF，并且使烧瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP离心机中以14000RPM离心60分钟。弃去上清液。
将105g无水1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)加到该批料上，并且振荡3天。使用3和7重量％蔗糖溶液的梯度和15000RPM的旋转速度，在圆盘式离心机仪器(CPS Instruments,Inc，型号DC20000)中分析该水溶胀凝胶。直径测量为0.3694μm，并且CV(数目)测量为4.8％。
实施例19
在由聚苯乙烯颗粒形成的分散相中，使受保护的氨基丙烯酰胺单体(9H-芴-9-基)甲基(2-(2-(2-丙烯酰胺乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯与tBDMS-HEAM单体和tBDMS-EBHEAM交联剂聚合并脱保护，形成氨基水凝胶颗粒。
通过首先将1.68g SDS溶解于280.00g水，并且随后加入14.00g丙酮和28.00gDOA，来制备乳状液。乳状液通过ultraturax混合2分钟，并在高压Gauline APV-100匀化器中以400巴进一步匀化5.4分钟。
将26.58g该乳状液加入烧瓶中的52.61g种子颗粒(种子直径0.126μm，4.59重量％固体)。使混合物在40℃下在振荡浴中振荡16小时用于活化。
通过将3.21g SDS和8.07g硼砂溶解至1823.6g水来制备SDS硼砂溶液。
由33.68g乙酸2-苯乙酯、0.13g AMBN、4.89g tBDMS HEAM、1.61g tBDMS-EBHEAM、0.64g(9H-芴-9-基)甲基(2-(2-(2-丙烯酰胺乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯和218.95gSDS硼砂溶液形成单体乳状液，通过ultraturax混合5分钟，并且进一步匀化2.6分钟。
在250mL反应器中，使15.53g活化种子颗粒的水分散体与234.9g单体乳状液混合。将混合物在40℃下搅拌并加热2小时。将混合物进一步在40℃下搅拌并加热另一小时，同时使氩气(150-200ml/分钟)鼓泡通过混合物。在这点时乳状液中的O2量测量为75ppb。停止氩流，并且加热和搅拌在70℃下继续10小时。
将反应混合物转移至250mL离心烧瓶，并且在Beckman Coulter Avanti J-20XP离心机中以13000RPM离心60分钟。弃去上清液，并且通过加入水收集沉积物并转移到玻璃烧瓶内。
通过添加0.5M乙酸溶液将凝胶的水性分散体的pH调整至3.7。酸化的凝胶分散体在60℃下在振荡浴中振荡2.5小时并冷却。
将凝胶分散体转移到1L烧瓶内，加入180g THF，并且在Thermo ScientificThermo Scientific Sorvall RC3CPlus离心机中以4500RPM离心30分钟。弃去所得的双相混合物的上相，并且使混合物在室温下在振荡台上振荡15分钟。加入160g THF，并将烧瓶以4500RPM离心30分钟。弃去上清液。
将凝胶转移到具有DMF的玻璃烧瓶内。在50g该珠的DMF悬浮液上，加入5mL哌啶，并且使烧瓶在室温下在振荡台上振荡60分钟。
将50g该悬浮液转移至250mL离心烧瓶，并且加入23g THF。使烧瓶在BeckmanCoulter Avanti J-20XP离心机中以10000RPM离心10分钟。弃去上清液。加入DMF，并且使混合物在振荡台上在室温下振荡16小时。
使用3和7重量％蔗糖溶液的梯度和15000RPM的旋转速度，在圆盘式离心机仪器(CPS Instruments,Inc，型号DC20000)中分析水溶胀凝胶。使用1.032g/ml的颗粒密度，直径测量为0.4517μm。CV(数目)测量为3.7％。
实施例20
在由聚苯乙烯颗粒形成的分散相中，使受保护的氨基丙烯酰胺单体，N-Boc N-丙烯酰-4,7,10-三氧杂十三烷-1,13-二胺，与tBDMS-HEAM单体和tBDMS-EBHEAM交联剂聚合并脱保护，形成氨基水凝胶颗粒。
通过将80g 87-89％水解的聚乙烯醇(PVA)缓慢加入2000g水中，搅拌并加热至80℃，持续1小时并冷却，来制备PVA溶液。使量为67.66g的PVA溶液与582.70g水、0.62g SDS和2.74g硼砂混合。
由26.39g乙酸2-苯乙酯、0.098g AMBN、3.97g tBDMS HEAM、1.26g tBDMS-EBHEAM、0.21g N-Boc N-丙烯酰-4,7,10-三氧杂十三烷-1,13-二胺和176.12g PVA-硼砂溶液形成单体乳状液，通过ultraturax混合几分钟，并且进一步匀化2分钟。
在250mL反应器中，将7.15g种子颗粒的水分散体(种子直径0.319μm，8.07重量％固体)与193.02g单体乳状液混合。使混合物在40℃下搅拌并加热2小时。使混合物进一步在40℃下搅拌并加热另一小时，同时使氩气(150-200ml/分钟)鼓泡通过混合物。在这点时乳状液中的O2量测量为40ppb。停止氩流，并且加热和搅拌在70℃下继续10小时。
将反应混合物转移至250mL离心烧瓶，并且在Beckman Coulter Avanti J-20XP离心机中以12500RPM离心40分钟。弃去上清液，并且通过加入水收集沉积物并转移到玻璃烧瓶内。
将1M H2SO4溶液以9:1体积比加到凝胶悬浮液上，以0.1M H2SO4浓度终止。使悬浮液在60℃下振荡3小时，并且冷却至室温。
逐滴加入浓缩的NaOH溶液，直至pH达到12。将500g THF加入悬浮液中，分到两个250mL瓶内，并且使混合物在室温下在振荡台上振荡60分钟。使烧瓶在Thermo ScientificThermo Scientific Sorvall RC3CPlus离心机中以4500RPM离心30分钟。弃去所得的双相混合物的上相，将水加入每个烧瓶中，并且使烧瓶在室温下在振荡台上振荡过夜。通过添加浓缩的NaOH溶液将混合物的pH调整至12.3，使烧瓶在室温下在振荡台上振荡25分钟，并且使烧瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP离心机中以4500RPM离心30分钟。弃去上清液。
将水加入每个烧瓶中，并且通过添加浓缩的NaOH溶液将混合物的pH调整至12.2。使烧瓶在室温下在振荡台上振荡过夜，并且使烧瓶在Thermo Scientific ThermoScientific Sorvall RC3CPlus离心机中以4000RPM离心30分钟。弃去上清液。
将水加入每个烧瓶中，使烧瓶在室温下在振荡台上振荡4小时，并且使烧瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP离心机中以6500RPM离心30分钟。弃去上清液。
将NMP加入每个烧瓶中，使烧瓶在室温下在振荡台上振荡过夜，并且使烧瓶在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus离心机中以4500RPM离心30分钟。弃去大约一半上清液。
将凝胶沉积物合并到一个瓶内，加入NMP并且使烧瓶在Thermo ScientificThermo Scientific Sorvall RC3CPlus离心机中以4500RPM离心60分钟。弃去上清液。
将NMP加入烧瓶中，使烧瓶在室温下在振荡台上振荡3小时，并且使烧瓶在BeckmanCoulter Avanti J-20XP离心机中以6500RPM离心50分钟。弃去上清液。
加入更多的NMP，并且分散体的固体含量测定为0.108％。水溶胀凝胶的直径在具有相位差设备的显微镜中进行测量，并且平均为1.79μm。
使用3和7重量％蔗糖溶液的梯度和10050RPM的旋转速度，在圆盘式离心机仪器(CPS Instruments,Inc，型号DC20000)中进一步分析水溶胀凝胶。使用1.032g/ml的颗粒密度，直径测量为0.934μm。
实施例21
在由聚苯乙烯颗粒形成的分散相中，使受保护的氨基丙烯酰胺单体，N-Boc N-丙烯酰-4,7,10-三氧杂十三烷-1,13-二胺，与tBDMS-HEAM单体和tBDMS-EBHEAM交联剂聚合并脱保护，形成氨基水凝胶颗粒。
通过首先将1.74g SDS溶解于290.00g水，并且随后加入14.50g丙酮和29.00g双(2-乙基己基)己二酸酯(DOA)，来制备乳状液。乳状液通过ultraturax混合2分钟，并在高压Gauline APV-100匀化器中以400巴进一步匀化5.6分钟。
将26.58g该乳状液加入烧瓶中的52.27g种子颗粒(种子直径0.126μm，4.59重量％固体)。使混合物在40℃下在振荡浴中振荡40小时用于活化。
通过将1.87g SDS和4.04g硼砂溶解至987.5g水来制备SDS硼砂溶液。
由62.81g乙酸2-苯乙酯、0.238g AMBN、9.13g tBDMS HEAM、3.00g tBDMS-EBHEAM、1.05g N-Boc N-丙烯酰-4,7,10-三氧杂十三烷-1,13-二胺和408.39g SDS-硼砂溶液形成单体乳状液，通过ultraturax混合几分钟，并且进一步匀化4.8分钟。
在500mL反应器中，使31.06g活化种子颗粒的水分散体与469.6g单体乳状液混合。将混合物在40℃下搅拌并加热2小时。将混合物进一步在40℃下搅拌并加热另一小时，同时使氩气(200ml/分钟)鼓泡通过混合物。停止氩流，并且加热和搅拌在70℃下继续10小时。
将反应混合物转移至四个250mL离心烧瓶，并且在Beckman Coulter Avanti J-20XP离心机中以13000RPM离心60分钟。弃去上清液，并且通过加入水收集沉积物并转移到玻璃烧瓶内。
通过添加0.5M乙酸溶液将凝胶的水性分散体的pH调整至3.8。酸化的凝胶分散体在60℃下在振荡浴中振荡2小时并冷却。
将1M H2SO4溶液以9:1体积比加到凝胶悬浮液上，以0.1M H2SO4浓度终止。使悬浮液在60℃下振荡3小时，并且冷却至室温。
逐滴加入浓缩的NaOH溶液，直至pH达到12。将悬浮液分到两个1L离心烧瓶内。将380g THF加入每个烧瓶中，并且使混合物在室温下在振荡台上振荡145分钟。使烧瓶在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus离心机中以4500RPM离心30分钟。弃去上清液，将水加入每个烧瓶中，并且使烧瓶在室温下在振荡台上振荡2小时。加入更多的水，并且使烧瓶在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus离心机中以4500RPM离心60分钟。弃去上清液。
将凝胶转移到四个250mL离心烧瓶内，并且使烧瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP离心机中以14500RPM离心45分钟。弃去上清液。
将水加入每个烧瓶中，使烧瓶在室温下在振荡台上振荡60分钟，并且使烧瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP离心机中以14500RPM离心45分钟。弃去上清液。
将水加入每个烧瓶中，并且通过添加浓缩的NaOH溶液将混合物的pH调整至12。使烧瓶在室温下在振荡台上振荡25分钟，并且使烧瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP离心机中以6500RPM离心30分钟。弃去上清液。
将水加入每个烧瓶中，并且通过添加浓缩的NaOH溶液将混合物的pH调整至12.3。使烧瓶在室温下在振荡台上振荡过夜，并且使烧瓶在Thermo Scientific ThermoScientific Sorvall RC3CPlus离心机中以4000RPM离心30分钟。弃去上清液。
将水加入每个烧瓶中，使烧瓶在室温下在振荡台上振荡4小时，并且使烧瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP离心机中以6500RPM离心30分钟。弃去上清液。
将NMP加入每个烧瓶中，使烧瓶在室温下在振荡台上振荡过夜，并且使烧瓶在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus离心机中以4500RPM离心30分钟。弃去上清液。
将NMP加入烧瓶中，使烧瓶在室温下在振荡台上振荡5小时，并且使烧瓶在BeckmanCoulter Avanti J-20XP离心机中以6500RPM离心50分钟。弃去上清液。
加入更多的NMP，并且分散体的固体含量测定为0.408％。水溶胀凝胶的直径在具有相位差设备的显微镜中进行测量，并且平均为0.86μm。还使用3和7重量％蔗糖溶液的梯度和15000RPM的旋转速度，在圆盘式离心机仪器(CPS Instruments,Inc，型号DC20000)中测量水溶胀凝胶的直径。使用1.032g/ml的颗粒密度，直径测量为0.511μm。CV(数目)测量为4.82％。
实施例22
在由聚苯乙烯颗粒形成的分散相中，使tBDMS-HEAM与tBDMS-EBHEAM交联剂聚合并脱保护，形成水凝胶颗粒。
通过首先将1.14g SDS溶解于190.00g水，并且随后加入28.50g丙酮和19.00gDOA，来制备乳状液。乳状液通过ultraturax混合5分钟，并在高压Gauline APV-100匀化器中以400巴进一步匀化4分钟。
将30.55g该乳状液加入烧瓶中的7.39g种子颗粒(种子直径4.96μm，9.54重量％固体)。使混合物在40℃下在振荡浴中振荡22小时用于活化。
将300g H2O加热直至80℃，并且将4.2g Methocel K-100溶解于其中。加入332gH2O，以获得Methocel K-100溶液。
将2.41g硼砂加到94.8g Methocel溶液上。通过加入水使该溶液的重量合计为420.2g，以获得通过混合制备的硼砂溶液。
由35.72g乙酸2-苯乙酯、0.138g AMBN、5.56g tBDMS HEAM、1.71g tBDMS-EBHEAM和165.89g硼砂溶液形成单体乳状液，通过ultraturax混合几分钟，并且进一步匀化2.1分钟。
在250mL反应器中，使9.25g活化种子颗粒的水分散体与177.0g单体乳状液和63.26g Methocel K-100溶液混合。将混合物在40℃下搅拌并加热2.5小时。将混合物进一步在40℃下搅拌并加热另外30分钟，同时使氩气(200ml/分钟)鼓泡通过混合物。停止氩流，并且加热和搅拌在70℃下继续10小时。
将反应混合物的一部分转移至250mL离心烧瓶，并且在Beckman Coulter AvantiJ-20XP离心机中以13000RPM离心60分钟。弃去上清液，并且通过加入水收集沉积物并转移到玻璃烧瓶内。
通过添加0.5M乙酸溶液将凝胶的水性分散体的pH调整至3.8。酸化的凝胶分散体在60℃下在振荡浴中振荡150分钟并冷却。
将凝胶分散体转移到1L烧瓶内，加入300g THF，并且使烧瓶在室温下在振荡台上振荡30分钟，并且在Thermo Scientific Thermo Scientific Sorvall RC3CPlus离心机中以4500RPM离心25分钟。弃去所得的双相混合物的上相，将50g THF加入烧瓶中。使烧瓶在室温下在振荡台上振荡30分钟，并以4500RPM离心25分钟。弃去上清液。
将烧瓶的内容物分到两个250mL离心烧瓶内。将大约100g DMF加到每个烧瓶上，并且使烧瓶在室温下在振荡台上振荡过夜。通过加入20g THF和一定量的DMF使每个烧瓶的内容物总计200g。使烧瓶在Beckman Coulter Avanti J-20XP离心机中以13000RPM离心70分钟。弃去上清液。
将大约100g DMF加到每个烧瓶上，并且使烧瓶在室温下在振荡台上振荡40分钟。通过加入20g THF和一定量的DMF使每个烧瓶的内容物总计200g。使烧瓶在BeckmanCoulter Avanti J-20XP离心机中以13000RPM离心70分钟。弃去上清液，并且通过使用最低限度量的DMF，将所有沉积物合并到新烧瓶内。
分散体的固体含量测定为2.34g。水溶胀凝胶的直径在具有相位差设备的显微镜中进行测量，并且平均为47.5μm。
实施例23
使tBDMS-HEAM单体在水性乳状液中聚合，形成单一尺寸的种子颗粒。
使250mL水在250mL锥形瓶中煮沸10分钟，并且用冰水浴冷却，同时将Ar气吹扫到其内。
在50mL锥形瓶中，通过使用磁力搅拌棒，使0.04g SDS溶解于10.1g该沸水中。
在另一个50mL锥形瓶中，通过使用磁力搅拌棒，使0.059g过硫酸钾溶解于10g沸水中。
向100mL加套两片反应器内加入先前煮沸至少30分钟的0.20g硼砂和80g沸水，所述反应器配备机械搅拌器、温度探头、运行水的冷凝器和Ar源，并且通过使用加热浴将反应器加热至80℃，同时将配备聚(四氟乙烯)叶片的顶置式搅拌器设为以150±5RPM搅拌。溶液用Ar吹扫20分钟。
当溶液的温度达到80℃时，使Ar管道提升离开溶液，而Ar压仍打开，并且将正好在之前超声处理5分钟的SDS溶液加入反应器内。
在添加SDS溶液后8分钟，将机械搅拌器设为以250±5RPM搅拌。
将9.22g tBDMS-HEAM用Ar吹扫5分钟，并且随后加入反应器内。在添加tBDMS-HEAM后1分钟，将机械搅拌器设为以350±5RPM搅拌。
在添加tBDMS-HEAM后5分钟，将正好在之前用Ar吹扫5分钟的过硫酸钾溶液快速加入反应器内，并且在Ar流仍在乳状液上方运行的同时密封反应器。
在添加过硫酸钾后270分钟，将机械搅拌器设为以250±5RPM搅拌，并且停止Ar流。使乳状液进一步聚合18小时。
使该批料冷却至室温，并且将整个批料转移到塑料瓶内。直径通过动态光散射(Malvern,Nano ZS)进行测量，并且发现为0.398μm。PDI测量为0.015。通过使用凝胶渗透化色谱仪器(配备Waters 2414折射率检测器和Polymer Laboratories 5μm混合C 300mm x7.5mm柱的Waters 717plus)，重量平均分子量和数量平均分子量分别测量为707kDa和102kDa。
使用3和7重量％蔗糖溶液的梯度和20 000RPM的旋转速度，在圆盘式离心机仪器(CPS Instruments,Inc，型号DC20000)中测量颗粒的CV，并且发现为2.0％。
实施例24.
氨基-水凝胶的活化和水凝胶与胺封端DNA探针的缀合。
向在无水、无胺N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的1000亿氨基-水凝胶(直径＝0.55微米，23,000,000胺/微米3)溶液(600μL)中，加入固体双琥珀酰亚胺辛二酸酯(22.1mg,60μmol)，随后为三丁胺(14μL,60μmol)。在60℃下搅拌1小时后，通过离心(以21300rcf 30分钟)分离水凝胶。将水凝胶团块用无胺无水NMP(1ml)稀释，并且通过离心分离；将该洗涤过程重复2次，并且将最终团块重悬浮于NMP(600μL)中。将该水凝胶悬浮液用乙酸酐(30μL,317μmol)和三丁胺(30μL,126μmol)处理，并且在室温下搅拌2小时。所得的水凝胶通过离心(以21300rcf 30分钟)分离，并且将团块用无胺无水NMP(1ml)稀释，并且通过离心分离；将该洗涤过程重复2次，并且将最终活化的封端的团块用1μmol四丁基铵5’-氨基-寡核苷酸、三丁胺(1μmol)和无胺NMP的3μmolar NMP溶液稀释至600μL的最终体积。在70℃下搅拌16小时后，通过离心(以21300rcf 30分钟)分离DNA缀合的水凝胶。将团块用NMP(1ml)洗涤，随后为去离子水洗涤(1ml)，使用离心以分离团块。将最终的水凝胶团块用1X TE缓冲液(1.6ml)稀释，并且在80℃下搅拌1小时。通过离心(以21300rcf 30分钟)分离水凝胶，并且用DI水(1ml)洗涤两次(使用离心用于团块分离)。向最终团块中加入30％氨水；在室温下15分钟后，将水凝胶离心(以21300rcf 20分钟)分离，并且用DI水(1mL)洗涤3次，使用离心用于分离。将最终团块再分散在对于进行靶扩散所需的缓冲液中。
实施例25
实施例1
使寡核苷酸直接缀合至甲磺酰活化的颗粒。经由种子乳状液聚合制备甲磺酰氯活化的微凝胶体。因此形成的颗粒在N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中进行洗涤，以备用于与离子交换的单链DNA的缀合。
将5’-NH2-C6-30聚体寡核苷酸的钠盐溶解于0.1M四丁基乙酸铵中，并且注射到反相HPLC柱上。洗脱用0.1M四丁基乙酸铵流动相进行。收集含有核酸的级分，冻干为干粉，并且重悬浮于干N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中。
将五百万个颗粒(5.0x109)分散在350uL无水NMP中，并且涡旋混合以分散。将124uL在NMP(4.10mM)中的Bu4NAc-DNA(5’-NH2-C6-30聚体寡核苷酸)直接加入颗粒混合物中。随后将19.5uL四乙基硼酸铵(26.14mM)加入反应混合物中，至～500uL的最终体积。
将反应混合物快速涡旋混合，并且在70℃下轻轻混合16小时。将混合物离心，将上清液倾析，并且将颗粒重悬浮于1mL NMP中。在涡旋混合后，使用在NMP中的两轮沉淀/分散，使重悬浮的微凝胶体颗粒形成团块。在第二次NMP洗涤后，使团块放(brought up)在1mL2xSSPE/0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)中，混合并离心成团块。最后，使颗粒放在1mL 1x PBS/0.1％Triton X-100中，混合并离心成牢固团块，将该过程重复三次。在末次循环后，使缀合的微凝胶体重悬浮于500uL 1xPBS/0.1％Triton X-100中。
在第一个方面，形成颗粒的方法包括在水性悬浮液内的分散相中，使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒，并且将聚合物颗粒转换为水凝胶颗粒。
在第一个方面的一个例子中，转换聚合物颗粒包括从聚合物颗粒中去除至少一部分所述多个疏水性保护基团。例如，去除至少一部分所述多个疏水性保护基团包括从聚合物颗粒中酸切割至少一部分所述多个疏水性保护基团。
在第一个方面的另一个例子和上述例子中，转换聚合物颗粒包括从聚合物颗粒中去除基本上全部的多个疏水性保护基团。
在第一个方面的进一步例子和上述例子中，该方法还包括促进水性悬浮液中的种子颗粒形成分散相。在一个例子中，受保护单体:种子颗粒的质量比在150:1至1:1的范围，例如50:1至1:1的范围内。在另一个例子中，种子颗粒包括种子聚合物。该方法还可包括在转换聚合物颗粒后提取种子聚合物。在一个例子中，种子聚合物可以是疏水的。在另一个例子中，种子聚合物包括苯乙烯类聚合物、丙烯酸类聚合物、另一种乙烯基聚合物或其组合。在上述例子的具体例子中，种子颗粒具有不超过0.6微米，例如不超过0.45微米、不超过0.35微米、或不超过0.15微米的初始粒度。在上述例子的另一个例子中，促进种子颗粒包括使溶剂和促进试剂与种子颗粒混合。例如，促进试剂是疏水的。在另一个例子中，促进试剂包括二辛酰过氧化物。
在第一个方面的另外例子和上述例子中，亲水性单体包括丙烯酰胺。
在第一个方面的另一个例子和上述例子中，疏水性保护基团包括羟基保护基团。
在第一个方面的进一步例子或上述例子中，疏水性保护基团包括有机金属部分。例如，有机金属部分形成甲硅烷基醚官能团。在一个例子中，甲硅烷基醚官能团源自叔丁基二甲基硅烷醚、三甲基甲硅烷基醚、三乙基甲硅烷基醚、二苯基甲基甲硅烷基醚或其组合。
在第一个方面的一个例子和上述例子中，使多个聚体单元聚合还包括使交联剂与具有疏水性保护基团的亲水性单体混合。例如，混合交联剂可包括以在15:1至1:2范围内的亲水性单体:交联剂的质量比混合交联剂。该范围可以是10:1至1:1。在另一个例子中，交联剂是低水溶性交联剂。在上述例子的一个例子中，交联剂是二乙烯基交联剂。例如，二乙烯基交联剂包括二丙烯酰胺。在上述例子的具体例子中，二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羟丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、其受保护的衍生物或其组合。二丙烯酰胺可例如包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、甲硅烷基-保护的N-[2-(丙烯酰氨基)-1,2-二羟乙基]丙烯酰胺例如N,N’(2,3-双((三乙基甲硅烷基)氧基)丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺或其组合。在上述例子的另一个例子中，二乙烯基交联剂包括二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、六亚甲基双丙烯酰胺、三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯或其组合。
在第一个方面的另一个例子和上述例子中，使多个聚体单元聚合包括使致孔剂与具有疏水性保护基团的亲水性单体混合。例如，致孔剂可以是芳香族致孔剂。在一个例子中，芳香族致孔剂包括甲苯。
在第一个方面的另外例子和上述例子中，该方法还包括活化水凝胶颗粒。在一个例子中，转换包括在水凝胶颗粒上提供一个或多个羟基，并且其中活化包括将一个或多个羟基中的至少一个转换为磺酸酯基团。例如，转换可包括在水凝胶颗粒上提供一个或多个羟基，并且其中活化包括将一个或多个羟基中的至少一个替换为叠氮化物官能部分。在另一个例子中，该方法还包括使寡核苷酸与活化的水凝胶聚合物结合。例如，结合包括亲核取代，并且寡核苷酸是亲核体封端的寡核苷酸。亲核体封端的寡核苷酸的亲核体可以是胺基。亲核体封端的寡核苷酸的亲核体可以是硫醇基。在上述例子的一个例子中，该方法还可包括使多核苷酸与寡核苷酸杂交。例如，该方法还可包括将多核苷酸扩增成多个多核苷酸，并且使多个多核苷酸的至少一部分附着至水凝胶颗粒，由此生成包括多个附着的多核苷酸的水凝胶颗粒。作为另外一种选择，该方法还可包括通过延伸寡核苷酸将多核苷酸扩增成多个互补多核苷酸，由此生成包括多个附着的多核苷酸的水凝胶颗粒。
在第一个方面的另一个例子和上述例子中，水凝胶颗粒是具有不超过2微米的平均粒度的多个类似形成的水凝胶颗粒之一。例如，平均粒度可以是不超过1微米，例如不超过0.8微米、或不超过0.5微米。
在第一个方面的进一步例子和上述例子中，水凝胶颗粒是大小基本上均匀的多个类似形成的水凝胶颗粒之一。
在第一个方面的另外例子或上述例子中，水凝胶颗粒是具有不超过5.0％的变异系数的多个类似形成的水凝胶颗粒之一。例如，变异系数不超过3.5％。
在第二个方面，形成颗粒的方法包括在水性悬浮液内的分散相中，使具有疏水性保护基团的丙烯酰胺单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒，并且将聚合物颗粒转换为亲水性颗粒。
在第二个方面的一个例子中，转换聚合物颗粒包括从聚合物颗粒中去除至少一部分所述多个疏水性保护基团。例如，去除至少一部分所述多个疏水性保护基团包括从聚合物颗粒中酸切割至少一部分所述多个疏水性保护基团。
在第二个方面的另一个例子或上述例子中，转换聚合物颗粒包括从聚合物颗粒中去除多个疏水性保护基团的基本上全部。
在第二个方面的另外例子或上述例子中，该方法还包括促进水性悬浮液中的种子颗粒形成分散相。例如，受保护单体:种子颗粒的质量比在50:1至1:1的范围内。在另一个例子中，种子颗粒包括种子聚合物。在上述例子的一个例子中，该方法还包括在转换聚合物颗粒后提取种子聚合物。种子聚合物可以是疏水的。在另一个例子中，种子聚合物包括苯乙烯类聚合物、丙烯酸类聚合物、另一种乙烯基聚合物或其组合。在上述例子的一个例子中，种子颗粒具有不超过0.6微米的初始粒度。在上述例子的另外例子中，促进种子颗粒包括使溶剂和促进试剂与种子颗粒混合。例如，促进试剂是疏水的。
在第二个方面的另一个例子或上述例子中，疏水性保护基团包括羟基保护基团。在第二个方面的另外例子和上述例子中，疏水性保护基团包括有机金属部分。例如，有机金属部分可形成甲硅烷基醚官能团。在一个例子中，甲硅烷基醚官能团可源自叔丁基二甲基硅烷醚、三甲基甲硅烷基醚、三乙基甲硅烷基醚、二苯基甲基甲硅烷基醚或其组合。
在第二个方面的进一步例子和上述例子中，使多个聚体单元聚合还包括使交联剂与具有疏水性保护基团的丙烯酰胺单体混合。混合交联剂可包括以在15:1至1:2范围内的亲水性单体:交联剂的质量比混合交联剂。在一个例子中，交联剂是低水溶性交联剂。在另一个例子中，交联剂是二乙烯基交联剂。
在第二个方面的另外例子和上述例子中，使多个聚体单元聚合包括使致孔剂与具有疏水性保护基团的丙烯酰胺单体混合。例如，致孔剂可包括芳香族致孔剂。
在第二个方面的另一个例子和上述例子中，该方法还包括活化亲水性颗粒。在一个例子中，转换包括提供在水凝胶颗粒上的一个或多个羟基，并且其中活化包括将一个或多个羟基中的至少一个转换为磺酸酯基团。在另一个例子中，转换包括提供在水凝胶颗粒上的一个或多个羟基，并且其中活化包括将一个或多个羟基中的至少一个替换为叠氮化物官能部分。在另外的例子中，该方法还包括使寡核苷酸与活化的水凝胶聚合物结合。结合可包括亲核取代，并且寡核苷酸是亲核体封端的寡核苷酸。亲核体封端的寡核苷酸的亲核体可以是胺基。在另一个例子中，亲核体封端的寡核苷酸的亲核体可包括硫醇基。在另外的例子中，该方法还包括使多核苷酸与寡核苷酸杂交。在另一个例子中，该方法还包括将多核苷酸扩增成多个多核苷酸，并且使多个多核苷酸的至少一部分附着至亲水性颗粒，由此生成包括多个附着的多核苷酸的亲水性颗粒。作为另外一种选择，该方法还可包括通过延伸寡核苷酸将多核苷酸扩增成多个互补多核苷酸，由此生成包括多个附着的多核苷酸的水凝胶颗粒。
在第二个方面的进一步例子和上述例子中，亲水性颗粒是具有不超过2微米的平均粒度的多个类似形成的亲水性颗粒之一。
在第二个方面的另外例子和上述例子中，亲水性颗粒是大小基本上均匀的多个类似形成的亲水性颗粒之一。
在第二个方面的另一个例子和上述例子中，亲水性颗粒是具有不超过5.0％的变异系数的多个类似形成的亲水性颗粒之一。
在第三个方面，形成颗粒的方法包括在水性悬浮液内的分散相中，使可自由基聚合单体的多个聚体单元与具有疏水性保护基团的二丙烯酰胺交联剂聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒。该方法还包括去除至少一部分所述多个疏水性保护基团。
在第三个方面的一个例子中，二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羟丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、其受保护的衍生物或其组合。二丙烯酰胺可例如包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、甲硅烷基-保护的N-[2-(丙烯酰氨基)-1,2-二羟乙基]丙烯酰胺例如N,N’(2,3-双((三乙基甲硅烷基)氧基)丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺或其组合。
在第三个方面的另一个例子或上述例子中，聚合包括以在15:1至1:2范围内的可自由基聚合单体:交联剂的质量比混合二丙烯酰胺交联剂。
在第三个方面的另外例子或上述例子中，去除至少一部分所述多个疏水性保护基团包括从聚合物颗粒中酸切割至少一部分所述多个疏水性保护基团。
在第三个方面的进一步例子或上述例子中，可自由基聚合的单体是基于乙烯基的单体。在一个例子中，基于乙烯基的单体包括丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯醇、乙酸乙烯酯、丙烯酰胺-甲基-丙烷磺酸或其组合。例如，基于乙烯基的单体是丙烯酰胺。
在第三个方面的另一个例子或上述例子中，该方法还包括促进水性悬浮液中的种子颗粒形成分散相。例如，受保护单体:种子颗粒的质量比在50:1至1:1的范围内。在另一个例子中，种子颗粒包括种子聚合物。在进一步例子中，该方法还包括在转换聚合物颗粒后提取种子聚合物。例如，种子聚合物是疏水的。在另一个例子中，种子聚合物包括苯乙烯类聚合物、丙烯酸类聚合物、另一种乙烯基聚合物或其组合。在另外的例子中，种子颗粒具有不超过0.6微米的初始粒度。在另一个例子中，促进种子颗粒包括使溶剂和促进试剂与种子颗粒混合。
在第三个方面的进一步例子或上述例子中，疏水性保护基团包括羟基保护基团。
在第三个方面的另外例子或上述例子中，疏水性保护基团包括有机金属部分。在一个例子中，有机金属部分形成甲硅烷基醚官能团。在另一个例子中，甲硅烷基醚官能团源自叔丁基二甲基硅烷醚、三甲基甲硅烷基醚、三乙基甲硅烷基醚、二苯基甲基甲硅烷基醚或其组合。
在第三个方面的另一个例子或上述例子中，使多个聚体单元聚合包括使致孔剂与可自由基聚合的单体和二丙烯酰胺交联剂混合。例如，致孔剂可以是芳香族致孔剂。
在第三个方面的进一步例子或上述例子中，该方法还包括活化亲水性颗粒。例如，该方法还包括使寡核苷酸与活化的水凝胶聚合物结合。在另一个例子中，结合包括亲核取代，并且寡核苷酸是亲核体封端的寡核苷酸。例如，亲核体封端的寡核苷酸的亲核体是胺基。在进一步例子中，亲核体封端的寡核苷酸的亲核体是硫醇基。在另一个例子中，该方法还包括使多核苷酸与寡核苷酸杂交。在另外的例子中，该方法还包括将多核苷酸扩增成多个多核苷酸，并且使多个多核苷酸的至少一部分附着至亲水性颗粒，由此生成包括多个附着的多核苷酸的亲水性颗粒。作为另外一种选择，该方法还可包括通过延伸寡核苷酸将多核苷酸扩增成多个互补多核苷酸，由此生成包括多个附着的多核苷酸的水凝胶颗粒。
在第三个方面的另外例子或上述例子中，亲水性颗粒是具有不超过2微米的平均粒度的多个类似形成的亲水性颗粒之一。
在第三个方面的另一个例子或上述例子中，亲水性颗粒是具有不超过5.0％的变异系数的多个类似形成的亲水性颗粒之一。
在第四个方面，形成颗粒的方法包括使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒；从聚合物颗粒中去除至少一部分所述多个疏水性保护基团，形成亲水性颗粒；并且使寡核苷酸与亲水性颗粒结合。
在第四个方面的一个例子或上述例子中，去除至少一部分所述多个疏水性保护基团包括从聚合物颗粒中酸切割至少一部分所述多个疏水性保护基团。
在第四个方面的另一个例子或上述例子中，亲水性单体包括丙烯酰胺。
在第四个方面的另外例子或上述例子中，疏水性保护基团包括羟基保护基团。
在第四个方面的进一步例子或上述例子中，疏水性保护基团包括有机金属部分。例如，有机金属部分可形成甲硅烷基醚官能团。
在第四个方面的一个例子或上述例子中，使多个聚体单元聚合还包括使交联剂与具有疏水性保护基团的亲水性单体混合。例如，交联剂可以是二乙烯基交联剂。在另一个例子中，二乙烯基交联剂包括二丙烯酰胺。
在第四个方面的另一个例子或上述例子中，该方法还包括在结合寡核苷酸前活化水凝胶颗粒。例如，去除可包括在亲水性颗粒上提供一个或多个羟基，并且其中活化包括将一个或多个羟基中的至少一个转换为磺酸酯基团。在另一个例子中，去除包括在亲水性颗粒上提供一个或多个羟基，并且其中活化包括将一个或多个羟基中的至少一个替换为叠氮化物官能部分。在另外的例子中，结合包括使寡核苷酸与活化的水凝胶聚合物结合。在另外的例子中，结合包括亲核取代，并且寡核苷酸是亲核体封端的寡核苷酸。例如，亲核体封端的寡核苷酸的亲核体可以是胺基。在另一个例子中，亲核体封端的寡核苷酸可包括硫醇基。
在第四个方面的进一步例子或上述例子中，该方法还包括使多核苷酸与寡核苷酸杂交。例如，该方法还包括将多核苷酸扩增成多个多核苷酸，并且使多个多核苷酸的至少一部分附着至水凝胶颗粒，由此生成包括多个附着的多核苷酸的水凝胶颗粒。作为另外一种选择，该方法还可包括通过延伸寡核苷酸将多核苷酸扩增成多个互补多核苷酸，由此生成包括多个附着的多核苷酸的水凝胶颗粒。
在第五个方面，多个颗粒包括至少100,000个颗粒。多个颗粒中的至少一个颗粒包括水凝胶。多个颗粒具有不超过100微米的平均粒度和不超过5％的变异系数。例如变异系数不超过4.5％，例如不超过4.0％、不超过3.5％、或不超过3.0％。
在第五个方面的一个例子或上述例子中，平均粒度不超过30微米，例如不超过1.5微米、不超过1.1微米、不超过0.6微米、或不超过0.5微米。
在第五个方面的另一个例子或上述例子中，水凝胶包括丙烯酰胺聚合物。
在第五个方面的进一步例子或上述例子中，多个颗粒的颗粒具有至少60％的平均孔隙率。
在第六个方面，系统包括孔阵列。孔阵列的至少一个孔与ISFET传感器可操作地连接。该系统还包括具有不超过5％的变异系数的多个水凝胶颗粒。多个水凝胶颗粒中的至少一个水凝胶颗粒设置在孔阵列的孔中。
在第七个方面，多个颗粒通过包括下述的方法形成：在水性悬浮液内的分散相中，使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒，并且包括将聚合物颗粒转换为水凝胶颗粒。
在第七个方面的一个例子中，多个颗粒具有不超过5.0％，例如不超过4.0％、不超过3.5％、或不超过3.0％的变异系数。
在第七个方面的另一个例子或上述例子中，多个颗粒具有不超过100微米的平均粒度。例如，平均粒度可以是不超过30微米，例如不超过1.5微米、或不超过0.8微米。
在第七个方面的另外例子或上述例子中，亲水性单体包括丙烯酰胺单体。
在第七个方面的进一步例子或上述例子中，多个颗粒的颗粒具有至少60％的平均孔隙率。
在第八个方面，组合物包括丙烯酰胺单体和交联剂的水性混合物，该丙烯酰胺单体包括疏水性保护基团，单体和交联剂以在15:1至1:2范围内的单体:交联剂的质量比包括。
在第八个方面的一个例子，交联剂是二乙烯基交联剂。例如，二乙烯基交联剂可包括二丙烯酰胺。在另一个例子中，二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羟丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、其受保护的衍生物或其组合。二丙烯酰胺可例如包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、甲硅烷基-保护的N-[2-(丙烯酰氨基)-1,2-二羟乙基]丙烯酰胺例如N,N’(2,3-双((三乙基甲硅烷基)氧基)丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺或其组合。在另外的例子中，二乙烯基交联剂包括二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、六亚甲基双丙烯酰胺、三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯或其组合。
在第八个方面的另一个例子或上述例子中，该比率在10:1至1:1的范围内。
在第九个方面，测序多核苷酸的方法包括提供包括孔阵列的装置。至少一个孔与ISFET可操作地连接，并且包括通过上述方面的方法形成的颗粒。该颗粒附着至多核苷酸。该方法还包括将包括预定类型的核苷酸的溶液施加于装置，并且观测对施加溶液的离子应答。
在第十个方面，用于核苷酸掺入的方法包括提供通过上述方面的方法形成的颗粒。该颗粒附着至包括与引物杂交的模板核酸的核酸双链体。该双链体与聚合酶结合。该方法还包括使颗粒与一种或多种核苷酸接触，并且使用聚合酶将至少一种核苷酸掺入引物的末端上。
在第十个方面的一个例子中，掺入还包括生成核苷酸掺入的副产物。
在第十个方面的另一个例子和上述例子中，该方法还包括通过使用场效应晶体管(FET)检测副产物来检测掺入。
在第十一个方面，形成颗粒的方法包括促进种子颗粒在水性悬浮液中形成分散相，在分散相中使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒，并且将聚合物颗粒转换为水凝胶颗粒。
在第十二个方面，形成颗粒的方法包括提供在水性悬浮液中的种子颗粒，该种子颗粒包含疏水性聚合物，并且包括促进种子颗粒在水性悬浮液中形成分散相。该方法还包括在分散相中使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括具有多个疏水性保护基团的亲水性聚合物的聚合物颗粒。聚合物颗粒包括疏水性聚合物。该方法还包括从亲水性聚合物中切割多个疏水性保护基团，并且从聚合物颗粒中提取疏水性聚合物，形成水凝胶颗粒。
在第十三个方面，颗粒包括由羟烷基丙烯酰胺和二丙烯酰胺聚合形成的聚合物。二丙烯酰胺包括羟基。当暴露于水时，颗粒吸收基于聚合物重量至少300重量％的水。
在第十三个方面的一个例子中，当暴露于水时，颗粒吸收基于聚合物重量至少1000重量％的水。
在第十三个方面的另一个例子和上述例子中，颗粒具有不超过100微米的粒度。例如，粒度可以是不超过30微米，例如不超过1.5微米。
在第十三个方面的进一步例子和上述例子中，羟烷基丙烯酰胺包括羟乙基丙烯酰胺。
在第十三个方面的另外例子和上述例子中，羟烷基丙烯酰胺包括N-[三(羟甲基)甲基)丙烯酰胺(下文所示的A)、N-(羟甲基)丙烯酰胺(下文所示的B)或其组合。
在第十三个方面的另一个例子和上述例子中，二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(2-羟乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羟丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、其受保护的衍生物，或其组合。二丙烯酰胺可例如包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、甲硅烷基-保护的N-[2-(丙烯酰氨基)-1,2-二羟乙基]丙烯酰胺例如N,N’(2,3-双((三乙基甲硅烷基)氧基)丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺，或其组合。
实施方式可为依照下述编号的项中的任一项。
1.一种形成颗粒的方法，所述方法包括：在水性悬浮液内的分散相中，使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒；和将所述聚合物颗粒转换为亲水性颗粒。
2.项1的方法，其中所述亲水性颗粒是水凝胶颗粒。
3.项1或项2的方法，其中所述亲水性单体包括丙烯酰胺单体。
4.项1或项2的方法，其中所述亲水性单体是可自由基聚合的单体，并且所述分散相还包括具有疏水性保护基团的二丙烯酰胺交联剂。
5.项1-4中任一项的方法，其中转换所述聚合物颗粒包括从所述聚合物颗粒中去除至少一部分所述多个疏水性保护基团。
6.项5的方法，其中去除至少一部分所述多个疏水性保护基团包括从所述聚合物颗粒中酸切割至少一部分所述多个疏水性保护基团。
7.项1-6中任一项的方法，其中转换所述聚合物颗粒包括从所述聚合物颗粒中去除所述多个疏水性保护基团的基本上全部。
8.项1-7中任一项的方法，所述方法还包括促进所述水性悬浮液中的种子颗粒形成所述分散相。
9.项8的方法，其中受保护单体:种子颗粒的质量比在150:1至1:1的范围内。
10.项8的方法，其中所述种子颗粒包括种子聚合物。
11.项10的方法，所述方法还包括在转换所述聚合物颗粒后提取所述种子聚合物。
12.项10的方法，其中所述种子聚合物是疏水的。
13.项10的方法，其中所述种子聚合物包括苯乙烯类聚合物、丙烯酸类聚合物、丙烯酰胺、另一种乙烯基聚合物，或其组合。
14.项8的方法，其中所述种子颗粒具有不超过0.6微米的初始粒度。
15.项14的方法，其中所述初始粒度不超过0.45微米。
16.项15的方法，其中所述初始粒度不超过0.35微米。
17.项16的方法，其中所述初始粒度不超过0.15微米。
18.项8的方法，其中所述种子颗粒具有在1微米至7微米范围内的初始粒度。
19.项8的方法，其中促进所述种子颗粒包括使溶剂和促进试剂与所述种子颗粒混合。
20.项19的方法，其中所述促进试剂是疏水的，并且具有在25℃下小于0.01g/l的水溶性。
21.项19的方法，其中所述促进试剂包括二辛酰过氧化物或己二酸二辛酯或分子量低于20kD的聚苯乙烯。
22.项1-21中任一项的方法，其中所述亲水性单体包括丙烯酰胺。
23.项4-22中任一项的方法，其中所述可自由基聚合的单体是基于乙烯基的单体。
24.项23的方法，其中所述基于乙烯基的单体包括丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯醇、乙酸乙烯酯、丙烯酰胺-甲基-丙烷磺酸，或其组合。
25.项24的方法，其中所述基于乙烯基的单体是丙烯酰胺。
26.项1-25中任一项的方法，其中所述疏水性保护基团包括羟基保护基团。
27.项1-25中任一项的方法，其中所述疏水性保护基团包括胺保护基团。
28.项1-27中任一项的方法，其中所述疏水性保护基团包括有机金属部分。
29.项28的方法，其中所述有机金属部分形成甲硅烷基醚官能团。
30.项29的方法，其中所述甲硅烷基醚官能团源自叔丁基二甲基硅烷醚、三甲基甲硅烷基醚、三乙基甲硅烷基醚、二苯基甲基甲硅烷基醚，或其组合。
31.项1-30中任一项的方法，其中使所述多个聚体单元聚合还包括使交联剂与具有疏水性保护基团的所述亲水性单体混合。
32.项31的方法，其中混合所述交联剂包括以在15:1至1:2范围内的亲水性单体:交联剂的质量比混合所述交联剂。
33.项32的方法，其中所述范围是10:1至1:1。
34.项31的方法，其中所述交联剂是低水溶性交联剂，并且具有在25℃下小于10g/l的水溶性。
35.项31的方法，其中所述交联剂是二乙烯基交联剂。
36.项35的方法，其中所述二乙烯基交联剂包括二丙烯酰胺。
37.项4或项36的方法，其中所述二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羟丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、其受保护的衍生物，或其组合。
38.项4或项37的方法，其中所述二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、甲硅烷基-保护的N-[2-(丙烯酰氨基)-1,2-二羟乙基]丙烯酰胺例如N,N’(2,3-双((三乙基甲硅烷基)氧基)丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺，或其组合。
39.项35的方法，其中所述二乙烯基交联剂包括二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、六亚甲基双丙烯酰胺、三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯，或其组合。
40.项1-39中任一项的方法，其中使所述多个聚体单元聚合包括使致孔剂与具有疏水性保护基团的所述亲水性单体混合。
41.项40的方法，其中所述致孔剂是芳香族致孔剂。
42.项41的方法，其中所述芳香族致孔剂包括甲苯、二甲苯、均三甲苯、乙酸苯乙基酯(phenylenethyl acetate)或苯甲酸乙酯。
43.项1-42中任一项的方法，所述方法还包括活化所述亲水性颗粒或所述水凝胶颗粒。
44.项43的方法，其中所述转换包括在所述水凝胶颗粒上提供一个或多个羟基，并且其中活化包括将所述一个或多个羟基中的至少一个转换为烷基或芳基磺酸酯。
45.项43的方法，其中所述转换包括在所述水凝胶颗粒上提供一个或多个羟基，并且其中活化包括将所述一个或多个羟基中的至少一个替换为叠氮化物官能部分。
46.项43的方法，其中所述转换包括在所述水凝胶颗粒上提供一个或多个胺基，并且其中活化包括使所述一个或多个胺基中的至少一个与双琥珀酰亚胺C2-C12烷基酯反应。
47.项43的方法，所述方法还包括使寡核苷酸与所述活化的水凝胶聚合物结合。
48.项47的方法，其中所述结合包括亲核取代，并且所述寡核苷酸是亲核体封端的寡核苷酸。
49.项48的方法，其中所述亲核体封端的寡核苷酸的亲核体是胺基。
50.项48的方法，其中所述亲核体封端的寡核苷酸的亲核体是硫醇基。
51.项47的方法，所述方法还包括使多核苷酸与所述寡核苷酸杂交。
52.项51的方法，所述方法还包括将所述多核苷酸扩增成多个多核苷酸，并且使所述多个多核苷酸的至少一部分附着至所述水凝胶颗粒，由此生成包括多个附着的多核苷酸的水凝胶颗粒。
53.项51的方法，所述方法还包括通过延伸所述寡核苷酸将所述多核苷酸扩增成多个互补多核苷酸，由此生成包括多个附着的多核苷酸的水凝胶颗粒。
54.项1-53中任一项的方法，其中所述水凝胶颗粒是在水中具有不超过2微米的平均粒度的多个类似形成的水凝胶颗粒之一。
55.项54的方法，其中所述平均粒度不超过1微米。
56.项55的方法，其中所述平均粒度不超过0.8微米。
57.项56的方法，其中所述平均粒度不超过0.5微米。
58.项1-44中任一项的方法，其中所述水凝胶颗粒是在水中具有在5微米至100微米范围内的平均粒度的多个类似形成的水凝胶颗粒之一。
59.项1-58中任一项的方法，其中所述水凝胶颗粒是大小基本上均匀的多个类似形成的水凝胶颗粒之一。
60.项1-59中任一项的方法，其中所述水凝胶颗粒是具有不超过5.0％的变异系数的多个类似形成的水凝胶颗粒之一。
61.项60的方法，其中所述变异系数不超过3.5％。
62.一种形成颗粒的方法，所述方法包括：使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒；从所述聚合物颗粒中去除至少一部分所述多个疏水性保护基团，形成亲水性颗粒；和使寡核苷酸与所述亲水性颗粒结合。
63.项62的方法，其中去除至少一部分所述多个疏水性保护基团包括从所述聚合物颗粒中酸切割至少一部分所述多个疏水性保护基团。
64.项62或项63的方法，其中所述亲水性单体包括丙烯酰胺。
65.项62-64中任一项的方法，其中所述疏水性保护基团包括羟基保护基团。
66.项62-65中任一项的方法，其中所述疏水性保护基团包括有机金属部分。
67.项66的方法，其中所述有机金属部分形成甲硅烷基醚官能团。
68.项62-67中任一项的方法，其中使所述多个聚体单元聚合还包括使交联剂与具有疏水性保护基团的所述亲水性单体混合。
69.项68的方法，其中所述交联剂是二乙烯基交联剂。
70.项69的方法，其中所述二乙烯基交联剂包括二丙烯酰胺。
71.项62-70中任一项的方法，所述方法还包括在结合所述寡核苷酸前活化所述水凝胶颗粒。
72.项71的方法，其中所述去除包括在所述亲水性颗粒上提供一个或多个羟基，并且其中活化包括将所述一个或多个羟基中的至少一个转换为磺酸酯基团。
73.项71的方法，其中所述去除包括在所述亲水性颗粒上提供一个或多个羟基，并且其中活化包括将所述一个或多个羟基中的至少一个替换为叠氮化物官能部分。
74.项71的方法，其中所述结合包括使所述寡核苷酸与所述活化的水凝胶聚合物结合。
75.项74的方法，其中所述结合包括亲核取代，并且所述寡核苷酸是亲核体封端的寡核苷酸。
76.项75的方法，其中所述亲核体封端的寡核苷酸的亲核体是胺基。
77.项75的方法，其中所述亲核体封端的寡核苷酸的亲核体是硫醇基。
78.项62-77中任一项的方法，所述方法还包括使多核苷酸与所述寡核苷酸杂交。
79.项78的方法，所述方法还包括将所述多核苷酸扩增成多个多核苷酸，并且使所述多个多核苷酸的至少一部分附着至所述水凝胶颗粒，由此生成包括多个附着的多核苷酸的水凝胶颗粒。
80.项78的方法，所述方法还包括通过延伸所述寡核苷酸将所述多核苷酸扩增成多个互补多核苷酸，由此生成包括多个附着的多核苷酸的水凝胶颗粒。
81.包含至少100,000个颗粒的多个颗粒，所述多个颗粒中的至少一个颗粒包含水凝胶，所述多个颗粒具有不超过100微米的平均粒度和不超过5％的变异系数。
82.项81的多个颗粒，其中所述至少100,000个颗粒各自包含所述水凝胶。
83.项81或82的多个颗粒，其中所述变异系数不超过4.5％。
84.项83的多个颗粒，其中所述变异系数不超过4.0％。
85.项84的多个颗粒，其中所述变异系数不超过3.5％。
86.项85的多个颗粒，其中所述变异系数不超过3.0％。
87.项81-86中任一项的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过30微米。
88.项87的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过1.5微米。
89.项88的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过1.1微米。
90.项89的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过0.6微米。
91.项90的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过0.5微米。
92.项81-91中任一项的多个颗粒，其中所述水凝胶包括丙烯酰胺聚合物。
93.项81-92中任一项的多个颗粒，其中所述多个颗粒的颗粒具有至少60％的平均孔隙率。
94.一种系统，所述系统包括：孔阵列，所述孔阵列的至少一个孔与ISFET传感器可操作地连接；和具有不超过5％的变异系数的多个水凝胶颗粒，所述多个水凝胶颗粒中的至少一个水凝胶颗粒设置在所述孔阵列的孔中。
95.通过包括下述的方法形成的多个颗粒：在水性悬浮液内的分散相中，使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒；和将所述聚合物颗粒转换为水凝胶颗粒。
96.项95的多个颗粒，其中所述多个颗粒具有不超过5.0％的变异系数。
97.项96的多个颗粒，其中所述变异系数不超过4.0％。
98.项97的多个颗粒，其中所述变异系数不超过3.5％。
99.项98的多个颗粒，其中所述变异系数不超过3.0％。
100.项95-99中任一项的多个颗粒，其中所述多个颗粒具有不超过100微米的平均粒度。
101.项100的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过30微米。
102.项101的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过5微米。
103.项102的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过1.5微米。
104.项103的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过0.8微米。
105.项95-104中任一项的多个颗粒，其中所述亲水性单体包括丙烯酰胺单体。
106.项95-105中任一项的多个颗粒，其中所述多个颗粒的颗粒具有至少60％的平均孔隙率。
107.一种包含丙烯酰胺单体和交联剂的水性混合物的组合物，所述丙烯酰胺单体具有疏水性保护基团，所述单体和交联剂以在15:1至1:2范围内的单体:交联剂的质量比包括。
108.项107的组合物，其中所述交联剂是二乙烯基交联剂。
109.项108的组合物，其中所述二乙烯基交联剂包括二丙烯酰胺。
110.项109的组合物，其中所述二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羟丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、其受保护的衍生物，或其组合。
111.项110的组合物，其中所述二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、甲硅烷基-保护的N-[2-(丙烯酰氨基)-1,2-二羟乙基]丙烯酰胺例如N,N’(2,3-双((三乙基甲硅烷基)氧基)丁烷-1,4-二基)二丙烯酰胺，或其组合。
112.项108的组合物，其中所述二乙烯基交联剂包括二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、六亚甲基双丙烯酰胺、三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯，或其组合。
113.项107-112中任一项的组合物，其中所述比率在10:1至1:1的范围内。
114.一种测序多核苷酸的方法，所述方法包括提供：包括孔阵列的装置，至少一个孔与ISFET可操作地连接，并且包括通过项1-80中任一项的方法形成的颗粒，所述颗粒附着至多核苷酸，将包括预定类型的核苷酸的溶液施加于所述装置，和观测对所述施加溶液的离子应答。
115.一种用于核苷酸掺入的方法，所述方法包括：提供通过项1-80中任一项的方法形成的颗粒，所述颗粒附着至包括与引物杂交的模板核酸的核酸双链体，所述双链体与聚合酶结合；使所述颗粒与一种或多种核苷酸接触；和使用所述聚合酶将至少一种核苷酸掺入所述引物的末端上。
116.项115的方法，其中所述掺入还包括生成核苷酸掺入的副产物。
117.项115或116的方法，所述方法还包括通过使用场效应晶体管(FET)检测所述副产物来检测所述掺入。
118.一种形成颗粒的方法，所述方法包括：促进种子颗粒在水性悬浮液中形成分散相；在所述分散相中，使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒；和将所述聚合物颗粒转换为水凝胶颗粒。
119.一种形成颗粒的方法，所述方法包括：提供在水性悬浮液中的种子颗粒，所述种子颗粒包括疏水性聚合物；促进所述种子颗粒在所述水性悬浮液中形成分散相；在所述分散相中，使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括具有多个疏水性保护基团的亲水性聚合物的聚合物颗粒，所述聚合物颗粒包括所述疏水性聚合物；从所述亲水性聚合物中切割所述多个疏水性保护基团；和从所述聚合物颗粒中提取所述疏水性聚合物，形成水凝胶颗粒。
120.一种颗粒群体，所述颗粒群体具有不超过5％的变异系数并且包括由羟烷基丙烯酰胺和二丙烯酰胺聚合形成的聚合物，所述二丙烯酰胺包括羟基，其中当暴露于水时，所述颗粒吸收基于所述聚合物重量至少300重量％的水。
121.项120的颗粒，其中当暴露于水时，所述颗粒吸收基于所述聚合物重量至少1000重量％的水。
122.项120或121的颗粒，其中所述颗粒具有不超过100微米的粒度。
123.项122的颗粒，其中所述粒度不超过30微米。
124.项123的颗粒，其中所述粒度不超过1.5微米。
125.项120-124中任一项的颗粒，其中所述羟烷基丙烯酰胺包括羟乙基丙烯酰胺。
126.项120-125中任一项的颗粒，其中所述羟烷基丙烯酰胺包括N-[三(羟甲基)甲基)丙烯酰胺、N-(羟甲基)丙烯酰胺，或其组合。
127.项120-126中任一项的颗粒，其中所述二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(2-羟乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羟丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、其受保护的衍生物，或其组合。
应当指出并非需要在上文一般描述或例子中所述的活动的全部，特定活动的一部分可能是不需要的，并且一种或多种进一步活动可加上所述活动进行。再进一步地，其中活动列出的次序不一定是其中它们进行的次序。
在前述说明书中，已就具体实施方式而言描述概念。然而，本领域普通技术人员应当理解可作出多种修饰和变化，而不背离如下文权利要求中所示的本发明范围。相应地，说明书和附图应以举例说明而不是限制性含义加以考虑，并且所有此类修饰预期包括在本发明的范围内。
如本文使用的，术语“包含”、“包括”、“具有”或其任何其他变型预期覆盖非排他性包括。例如，包括一系列特征的过程、方法、物品或仪器不一定仅限于这些特征，而是可包括对此类过程、方法、物品和或仪器未明确列出或固有的其他特征。此外，除非另有明确相反描述，“或”指包括性或而不是排他性或。例如，条件A或B由下述中的任何一种满足：A是真实的(或存在的)并且B是假的(或不存在的)，A是假的(或不存在的)并且B是真实的(或存在的)，以及A和B均为真实的(或存在的)。
另外，“一个”或“一种”的使用用于描述本文描述的元件和组分。这仅为了方便而完成，并且给出本发明范围的一般含义。该描述应视为包括一个/种或至少一个/种，并且单数还包括复数，除非很明显它以其他方式指出。
益处、其他优点和问题的解决方案已在上文就具体实施方式而言进行描述。然而，益处、优点、问题的解决方案以及可引起任何益处、优点或解决方案发生或变得更明显的任何一个或多个特征不应解释为任何或所有权利要求的关键、所需或基本特征。
在阅读说明书后，技术人员应当理解为了清楚起见，本文在分开实施方式的上下文中描述的某些特征还可在单个实施方式中组合提供。相反，为了简要起见，在单个实施方式的上下文中描述的多个特征还可分开或在任何子组合中提供。此外，对范围中所述的值的提及包括在该范围内的每个和每一个值。

Claims (22)

1.包含至少100,000个颗粒的多个颗粒，所述多个颗粒中的至少一个颗粒包含水凝胶，所述多个颗粒具有不超过100微米的平均粒度和不超过5％的变异系数。
2.根据权利要求1所述的多个颗粒，其中所述至少100,000个颗粒各自包含所述水凝胶。
3.根据权利要求1或2所述的多个颗粒，其中所述变异系数不超过4.5％。
4.根据权利要求3所述的多个颗粒，其中所述变异系数不超过4.0％。
5.根据权利要求4所述的多个颗粒，其中所述变异系数不超过3.5％。
6.根据权利要求5所述的多个颗粒，其中所述变异系数不超过3.0％。
7.根据权利要求1或2所述的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过30微米。
8.根据权利要求7所述的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过1.5微米。
9.根据权利要求8所述的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过1.1微米。
10.根据权利要求9所述的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过0.6微米。
11.根据权利要求10所述的多个颗粒，其中所述平均粒度不超过0.5微米。
12.根据权利要求1或2所述的多个颗粒，其中所述水凝胶包括丙烯酰胺聚合物。
13.根据权利要求1或2所述的多个颗粒，其中所述多个颗粒具有至少60％的平均孔隙率。
14.一种产品系统，所述系统包括：
孔阵列，所述孔阵列的至少一个孔与离子敏感场效应晶体管传感器可操作地连接；和
具有不超过5％的变异系数的多个水凝胶颗粒，所述多个水凝胶颗粒中的至少一个水凝胶颗粒设置在所述孔阵列的孔中。
15.一种颗粒群体，所述颗粒群体具有不超过5％的变异系数并且包括由羟烷基丙烯酰胺和二丙烯酰胺聚合形成的聚合物，所述二丙烯酰胺包括羟基，其中当暴露于水时，所述颗粒吸收基于所述聚合物重量至少300重量％的水。
16.根据权利要求15所述的颗粒群体，其中当暴露于水时，所述颗粒吸收基于所述聚合物重量至少1000重量％的水。
17.根据权利要求15或16所述的颗粒群体，其中所述颗粒具有不超过100微米的粒度。
18.根据权利要求17所述的颗粒群体，其中所述粒度不超过30微米。
19.根据权利要求18所述的颗粒群体，其中所述粒度不超过1.5微米。
20.根据权利要求15或16所述的颗粒群体，其中所述羟烷基丙烯酰胺包括羟乙基丙烯酰胺。
21.根据权利要求15或16所述的颗粒群体，其中所述羟烷基丙烯酰胺包括N-(三(羟甲基)甲基)丙烯酰胺、N-(羟甲基)丙烯酰胺，或其组合。
22.根据权利要求15或16所述的颗粒群体，其中所述二丙烯酰胺包括N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(2-羟乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羟丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)乙基)丙烯酰胺、N,N’-(N-(2-((三乙基甲硅烷基)氧基)丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺、甲硅烷基-保护的N-[2-(丙烯酰氨基)-1,2-二羟乙基]丙烯酰胺，或其组合。
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