KR20140130155A - 친수성 중합체성 입자 및 그의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

입자의 형성 방법은 수현탁액 내의 분산 상 중에서, 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체의 다수의 머(mer) 단위를 중합시켜, 다수의 소수성 보호기를 포함하는 중합체성 입자를 형성하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 중합체성 입자를 친수성 입자로 전환시키는 단계를 추가로 포함한다.

Description

친수성 중합체성 입자 및 그의 제조 방법 {HYDROPHILIC POLYMERIC PARTICLES AND METHODS FOR MAKING SAME}
본 출원은 2012년 2월 9일자로 출원된 미국 가출원 번호 61/597,053의 우선권을 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 출원은 2012년 10월 26일자로 출원된 미국 가출원 번호 61/719,045의 우선권을 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 출원은 2012년 11월 30일자로 출원된 미국 가출원 번호 61/731,873의 우선권을 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용은 일반적으로 친수성 중합체성 입자에 관한 것이며, 이러한 친수성 중합체성 입자의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다.
중합체성 입자는 분리 기술에서의 성분으로서 그리고 화학 시스템 및 생물 시스템 모두에서 분석물을 검출하는 것을 돕기 위해서 점점 더 빈번하게 사용되고 있다. 예를 들어, 중합체성 입자는 표적 분자를 용액으로부터 분리하기 위한 크로마토그래피 기술에서 사용되어 왔다. 또 다른 예에서, 자기 코팅을 갖는 중합체성 입자는 자기 분리 기술에서 사용된다. 보다 최근에는, 중합체성 입자는 ELISA-유형 기술을 증진시키기 위해서 사용되고 있으며, 폴리뉴클레오티드를 포획하는데 사용될 수 있다.
그럼에도 불구하고, 상기 분리 및 분석 기술은 입자 크기의 변동으로 인해서 불량해진다. 입자 크기의 큰 변동은 입자 중량의 변동, 뿐만 아니라 표적 분석물과 상호작용하는 것이 가능한 반응 부위의 수를 변동시킨다. 자기 분리 기술의 경우, 크기 변동은 낮은 효율의 분리를 유발할 수 있다. 크로마토그래피 기술 및 다양한 폴리뉴클레오티드 포획 기술의 경우, 크기 변동은 폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 것이 가능한 부위의 수를 변동시켜서, 포획 효율 또는 분리 효율을 변동시킨다.
이와 같이, 개선된 중합체성 입자 및 이러한 중합체성 입자의 제조 방법이 바람직할 것이다.
제1 측면에서, 입자의 형성 방법은 수현탁액 내의 분산 상 중에서, 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체의 다수의 머(mer) 단위를 중합시켜, 다수의 소수성 보호기를 포함하는 중합체성 입자를 형성하는 단계, 및 중합체성 입자를 히드로겔 입자로 전환시키는 단계를 포함한다.
제2 측면에서, 입자의 형성 방법은 수현탁액 내의 분산 상 중에서, 소수성 보호기를 갖는 아크릴아미드 단량체의 다수의 머 단위를 중합시켜, 다수의 소수성 보호기를 포함하는 중합체성 입자를 형성하는 단계, 및 중합체성 입자를 친수성 입자로 전환시키는 단계를 포함한다.
제3 측면에서, 입자의 형성 방법은 수현탁액 내의 분산 상 중에서, 라디칼 중합성 단량체의 다수의 머 단위와 소수성 보호기를 갖는 디아크릴아미드 가교제를 중합시켜, 다수의 소수성 보호기를 포함하는 중합체성 입자를 형성하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
제4 측면에서, 입자의 형성 방법은 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체의 다수의 머 단위를 중합시켜, 다수의 소수성 보호기를 포함하는 중합체성 입자를 형성하는 단계, 중합체성 입자로부터 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 제거하여 친수성 입자를 형성하는 단계, 및 올리고뉴클레오티드를 친수성 입자에 결합시키는 단계를 포함한다.
제5 측면에서, 다수의 입자는 적어도 100,000개의 입자를 포함한다. 다수의 입자의 적어도 하나의 입자는 히드로겔을 포함한다. 다수의 입자는 100 마이크로미터 이하의 평균 입자 크기 및 5％ 이하의 변동 계수(coefficient of variance)를 갖는다.
제6 측면에서, 시스템은 웰의 어레이를 포함한다. 웰의 어레이의 적어도 하나의 웰은 ISFET 센서와 작동가능하게 연결된다. 시스템은 5％ 이하의 변동 계수를 갖는 다수의 히드로겔 입자를 추가로 포함한다. 다수의 히드로겔 입자의 적어도 하나의 히드로겔 입자는 웰의 어레이의 웰 내에 배치된다.
제7 측면에서, 다수의 입자는, 수현탁액 내의 분산 상 중에서, 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체의 다수의 머 단위를 중합시켜, 다수의 소수성 보호기를 포함하는 중합체성 입자를 형성하는 단계를 포함하고, 중합체성 입자를 히드로겔 입자로 전환시키는 단계를 포함하는 방법에 의해서 형성된다.
제8 측면에서, 조성물은 아크릴아미드 단량체 및 가교제의 수성 혼합물을 포함하며, 아크릴아미드 단량체는 소수성 보호기를 포함하고, 단량체 및 가교제는 15:1 내지 1:2 범위의 단량체:가교제의 중량비로 포함된다.
제9 측면에서, 폴리뉴클레오티드의 서열분석 방법은 웰의 어레이를 포함하는 장치를 제공하는 단계를 포함한다. 적어도 하나의 웰은 ISFET에 작동가능하게 연결되고, 상기 측면의 방법에 의해서 형성된 입자를 포함한다. 입자를 폴리뉴클레오티드에 부착시킨다. 상기 방법은 소정의 유형의 뉴클레오티드를 포함하는 용액을 장치에 적용하는 단계 및 용액의 적용에 대한 이온성 반응을 관찰하는 단계를 추가로 포함한다.
제10 측면에서, 뉴클레오티드 도입 방법은 상기 측면의 방법에 의해서 형성된 입자를 제공하는 단계를 포함한다. 입자를 프라이머에 혼성화된 주형 핵산을 포함하는 핵산 듀플렉스(duplex)에 부착시킨다. 듀플렉스를 폴리머라제에 결합시킨다. 방법은 입자를 하나 이상의 뉴클레오티드와 접촉시키는 단계 및 폴리머라제를 사용하여 프라이머의 단부 상에 적어도 하나의 뉴클레오티드를 도입하는 단계를 추가로 포함한다.
제11 측면에서, 입자의 형성 방법은 시드(seed) 입자를 촉진시켜 수현탁액 중에서 분산 상을 형성하는 단계, 분산 상 중에서, 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체의 다수의 머 단위를 중합시켜, 다수의 소수성 보호기를 포함하는 중합체성 입자를 형성하는 단계, 및 중합체성 입자를 히드로겔 입자로 전환시키는 단계를 포함한다.
제12 측면에서, 입자의 형성 방법은 소수성 중합체를 포함하는 시드 입자를 수현탁액 중에 제공하는 단계를 포함하고, 시드 입자를 촉진시켜 수현탁액 중에서 분산 상을 형성하는 단계를 포함한다. 방법은 분산 상 중에서, 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체의 다수의 머 단위를 중합시켜, 다수의 소수성 보호기를 갖는 친수성 중합체를 포함하는 중합체성 입자를 형성하는 단계를 포함한다. 중합체성 입자는 소수성 중합체를 포함한다. 상기 방법은 또한 친수성 중합체로부터 다수의 소수성 보호기를 절단하는 단계 및 중합체성 입자로부터 소수성 중합체를 추출하여 히드로겔 입자를 형성하는 단계를 포함한다.
제13 측면에서, 입자는 히드록시알킬 아크릴아미드 및 디아크릴아미드의 중합으로부터 형성된 중합체를 포함한다. 디아크릴아미드는 히드록실 기를 포함한다. 입자는 물에 노출될 때 중합체의 중량을 기준으로 적어도 300 중량％의 물을 흡수한다.
첨부된 도면을 참조로 본 개시내용은 보다 쉽게 이해될 수 있으며, 그의 다수의 특징부 및 이점은 당업자에게 자명할 수 있다.
도 1은 예시적인 중합체성 입자를 제조하기 위한 예시적인 방법 흐름의 도시를 포함한다.
도 2는 중합체성 입자를 사용하는 예시적인 서열분석 방법의 도시를 포함한다.
상이한 도면에서 동일한 참조 부호의 사용은 유사하거나 또는 동일한 항목을 나타낸다.
예시적인 실시양태에서, 중합체성 입자의 형성 방법은 수현탁액 내의 분산 상 중에서, 소수성 보호기로 보호된 친수성 관능기를 갖는 단량체의 다수의 머 단위를 중합시키는 단계를 포함한다. 중합은 다수의 소수성 보호기를 포함하는 중합체성 입자를 형성한다. 방법은 중합체성 입자를 친수성 입자, 예컨대 히드로겔 입자로 전환시키는 단계를 추가로 포함한다. 한 예에서, 단량체는 친수성 라디칼 중합성 단량체, 예컨대 친수성 비닐계 단량체, 특히 아크릴아미드를 포함한다. 단량체는 소수성 보호기로 보호된 친수성 관능기를 포함하는 친수성 단량체이다. 예를 들어, 소수성 보호기는 실릴 관능기 또는 그의 유도체를 포함할 수 있다. 중합 단계는 또한 가교제, 예컨대 예시적인 디아크릴아미드 가교제를 비롯한 비닐 가교제의 존재 하에서의 중합을 포함할 수 있다. 가교제는 소수성 보호기를 갖는 보호된 가교제일 수 있다. 한 예에서, 중합체성 입자를 친수성 입자로 전환시키는 단계는 중합체성 입자로부터 소수성 보호기의 적어도 일부를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 특히, 소수성 보호기는 산-절단성 보호기일 수 있고, 소수성 보호기를 제거하는 것은 중합체성 입자로부터 소수성 보호기를 산 절단하는 것을 포함할 수 있다.
이러한 방법에 의해서 제조된 예시적인 중합체성 입자는 목적하는 크기 또는 변동 계수를 가질 수 있다. 특히, 중합체성 입자는 친수성일 수 있다. 예를 들어, 중합체성 입자는 히드로겔 입자를 포함할 수 있다. 추가로, 중합체성 입자는 100 μm 이하, 예컨대 30 μm 이하, 3 μm 이하, 또는 2 μm 이하의 평균 입자 크기를 가질 수 있다. 중합체성 입자는 15％ 이하, 예컨대 5％ 이하의 변동 계수를 가질 수 있다.
특히, 이러한 입자는 표적 분석물, 예컨대 폴리뉴클레오티드를 포획하는데 유용할 수 있다. 한 예에서, 중합체성 입자는 광 검출을 포함하는 서열분석 방법 또는 이온 검출을 포함하는 서열분석 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 서열분석하는데 유용할 수 있다.
특정 실시양태에서, 분산된 상을 수현탁액 내에서 형성한다. 분산된 상은 바람직하게는 소수성이다. 한 예에서, 분산된 상은 시드 입자, 예컨대 소수성 시드 입자를 촉진시켜서 분산된 상을 생성함으로써 형성된다. 촉진 단계는 시드 입자 중에서 소수성 성분의 흡수를 용이하게 한다.
제거가능한 소수성 보호기를 갖는 단량체는 분산된 상을 더 선호한다. 단량체는 분산된 상 내에서 중합된다. 임의로는, 가교제를 분산된 상 내에서 단량체와 중합시킨다. 분산된 상을 시드 입자, 예컨대 소수성 시드 입자로부터 형성하는 예에서, 시드 입자와 회합된 중합체를 제거할 수 있다. 예를 들어, 시드 입자의 중합체를 용매를 사용하여 용해시키고, 중합체성 입자로부터 추출할 수 있다.
예컨대, 중합체성 입자로부터 소수성 보호기의 적어도 일부를 절단함으로써 소수성 보호기를 제거할 수 있다. 그 결과, 친수성 입자, 예컨대 히드로겔 입자를 형성한다.
한 예에서, 생성된 친수성 입자를 활성화시켜서 표적 분석물, 예컨대 폴리뉴클레오티드와의 접합을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 소수성 보호기를 절단하여 친수성 입자 상에 친수성 관능기, 예컨대 히드록실 기, 아미노 기, 티올 기 또는 이들의 조합을 남길 수 있다. 특정 예에서, 히드록실 기를 술포네이트 에스테르 기 또는 염소로 전환시킴으로써, 히드록실 기를 활성화시킬 수 있다. 술포네이트 에스테르 관능기 또는 염소를 친핵성 치환을 사용하여 치환시키거나 또는 대체할 수 있다. 특히, 친핵체 말단 기, 예컨대 아민 또는 티올을 갖는 올리고뉴클레오티드를 술포네이트 기 또는 염소에 대한 친핵성 치환에 의해서 친수성 입자에 부착시킬 수 있다. 이러한 입자는 서열분석 기술에 사용하기 위해서 폴리뉴클레오티드를 포획하는데 특히 유용할 수 있다.
또 다른 예에서, 술포네이트화 입자를 일- 또는 다-관능성의 일- 또는 다-친핵성 시약과 추가로 반응시킬 수 있는데, 이것은 친전자성 기, 예컨대 말레이미드를 포함하는 올리고뉴클레오티드에 대한 친핵성 활성을 유지시키면서, 입자에 부착을 형성할 수 있다. 또한, 다-친전자성 기를 포함하는 시약에 부착시킴으로써, 잔류하는 친핵성 활성을 친전자성 활성으로 전환시키고, 이어서 이것을 친핵성 기를 포함하는 올리고뉴클레오티드에 부착시킬 수 있다.
다른 접합 기술은 입자 합성 동안 카르복실산 상에 소수성 보호기를 포함하는 단량체를 사용하는 것을 포함한다. 카르복실산 기의 탈보호는, 친핵성 기, 예컨대 아민을 갖는 친핵성 기를 갖는 올리고뉴클레오티드와 추가로 반응할 수 있는 카르복실산 기를 이용가능하게 하거나 올리고뉴클레오티드의 부착을 유발한다.
다른 접합 기술은 입자 합성 동안 아민 상에 소수성 보호기를 포함하는 단량체를 사용하는 것을 포함한다. 아민 기의 탈보호는, 중합체 입자에 부착된 후 일-관능성 친전자성 기를 생성하는 아민 반응성 이-관능성 비스-친전자성 시약으로 추가로 개질될 수 있는 친핵성 기를 이용가능하게 한다. 이러한 친전자성 기를 친핵성 기, 예컨대 아민 또는 티올을 갖는 올리고뉴클레오티드와 반응시켜서, 빈 친전자체(vacant electrophile)와의 반응에 의해서 올리고뉴클레오티드의 부착을 유발한다.
도 1에 도시된 바와 같이, 방법 (100)은 시드 입자 (102)를 제공하는 단계를 포함한다. 단량체를 현탁액에 제공하고, 바람직하게는 촉진된 시드 입자로부터 형성된 분산된 상 (104)으로 유지시킨다. 단량체 및 임의로는 가교제를 중합시켜서 중합체성 입자 (108)를 형성한다. 중합체성 입자 (108)를 시드 중합체로부터 제거하여 중합체성 입자 (110)를 형성한다. 중합체성 입자 (110) 상의 소수성 보호기를 제거하여 친수성 입자 (112)를 형성한다. 친수성 입자 (112)를 활성화시켜서 접합된 입자 (114)를 형성한다.
시드 입자 (102)는 시드 중합체를 포함할 수 있다. 한 예에서, 시드 중합체는 소수성이다. 특히, 시드 중합체는 스티렌 중합체, 아크릴 중합체, 아크릴아미드, 또 다른 소수성 비닐 중합체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 한 예에서, 시드 입자 (102)는 단분산성, 예를 들어 변동 계수가 20％ 이하이다. 변동 계수 (CV)는 표준 편차를 평균으로 나눈 값의 100배로서 정의되며, 여기서 "평균"은 평균 입자 직경이고, 표준 편차는 입자 크기의 표준 편차이다. 대안적으로, "평균"은 z-평균 또는 모드 입자 직경일 수 있다. 통상의 실시에 따라서, CV는 주 모드, 즉 주 피크 상에서 계산되기 때문에, 응집체와 관련된 부 피크를 제외한다. 따라서, 모드 크기보다 작거나 또는 큰 일부 입자는 계산에서 무시될 수 있으며, 이것은 예를 들어, 검출가능한 입자의 총 입자 수의 약 90％를 기준으로 할 수 있다. 이러한 CV의 측정은 CPS 디스크 원심분리기 상에서 수행할 수 있다. 특히, 시드 입자 (102)의 집단은 10％ 이하, 예컨대 5.0％ 이하, 3.5％ 이하, 3 이하％, 2.5％ 이하, 2％ 이하, 또는 심지어는 1.0％ 이하의 변동 계수를 가질 수 있다. 추가로, 시드 입자 (102)는 0.6 μm 이하의 초기 입자 크기를 가질 수 있다. 예를 들어, 초기 입자 크기는 0.45 μm 이하, 예컨대 0.35 μm 이하, 또는 심지어는 0.15 μm 이하일 수 있다. 대안적으로, 적어도 3 μm, 예컨대 적어도 5 μm, 적어도 10 μm, 적어도 20 μm, 또는 적어도 50 μm의 초기 입자 크기를 갖는 더 큰 시드 입자를 사용하여 더 큰 중합체 입자를 형성할 수 있다. 한 예에서, 초기 입자 크기는 100 μm 이하일 수 있다.
시드 입자 (102)를 수현탁액 내에서 촉진시켜서 촉진된 분산된 상 (104)을 형성할 수 있다. 특히, 시드 입자를 촉진시키는 단계는 용매 및 촉진제를 수현탁액 내에서 시드 입자와 혼합하여 분산된 상을 형성하는 단계를 포함한다. 촉진된 시드 입자는 소수성 성분을 보다 쉽게 흡수한다. 용매는 수-혼화성일 수 있다. 예를 들어, 용매는 알데히드 또는 케톤, 예컨대 포름알데히드, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 디이소프로필 케톤, 디메틸 포름아미드, 또는 이들의 조합; 에테르 용매, 예컨대 테트라히드로푸란, 디메틸 에테르, 또는 이들의 조합; 에스테르 용매; 헤테로시클릭 용매, 예컨대 피리딘, 디옥산, 테트라히드로푸르푸릴 알콜, N-메틸-2-피롤리돈, 또는 이들의 조합; 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 한 예에서, 용매는 케톤, 예컨대 아세톤을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 용매는 에테르 용매, 예컨대 테트라히드로푸란을 포함할 수 있다. 추가 예에서, 용매는 헤테로시클릭 용매, 예컨대 피리딘을 포함할 수 있다.
촉진제 또는 촉진 시약은 소수성이고, 낮은 수용해도, 예컨대 25℃에서 0.01 g/l 이하의 수용해도를 가질 수 있다. 예를 들어, 촉진제는 디옥타노일 퍼옥시드, 디옥틸아디페이트, n-부틸 프탈레이트, 도데칸올, 20 kD 미만의 분자량을 갖는 폴리스티렌 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 한 예에서, 디옥타노일 퍼옥시드는 또한 중합 반응을 위한 개시제로서 작용할 수 있다. 촉진제는 또한 저분자량 폴리스티렌, 예를 들어 낮은 단량체/개시제 비율을 사용하여 별도의 중합 단계로 제조되거나 또는 시드 중합 동안 사슬 전달제를 첨가하여 제조된 폴리스티렌일 수 있다. 촉진제를 전형적으로는 고압 균질화기에서 유화시킨다.
수현탁액은 또한 계면활성제를 포함할 수 있다. 계면활성제는 이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제, 또는 비-이온성 계면활성제일 수 있다. 이온성 계면활성제는 음이온성 계면활성제일 수 있다. 또 다른 예에서, 이온성 계면활성제는 양이온성 계면활성제일 수 있다. 예시적인 음이온성 계면활성제는 술페이트 계면활성제, 술포네이트 계면활성제, 포스페이트 계면활성제, 카르복실레이트 계면활성제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예시적인 술페이트 계면활성제는 알킬 술페이트, 예컨대 암모늄 라우릴 술페이트, 소듐 라우릴 술페이트 (소듐 도데실 술페이트, (SDS)), 또는 이들의 조합; 알킬 에테르 술페이트, 예컨대 소듐 라우레트 술페이트, 소듐 미레트 술페이트, 또는 이들의 임의의 조합; 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예시적인 술포네이트 계면활성제는 알킬 술포네이트, 예컨대 소듐 도데실 술포네이트; 도쿠세이트, 예컨대 디옥틸 소듐 술포숙시네이트; 알킬 벤질 술포네이트; 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예시적인 포스페이트 계면활성제는 알킬 아릴 에테르 포스페이트, 알킬 에테르 포스페이트, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예시적인 카르복실산 계면활성제는 알킬 카르복실레이트, 예컨대 지방산 염 또는 소듐 스테아레이트; 소듐 라우로일 사르코시네이트; 담즙산 염, 예컨대 소듐 데옥시콜레이트; 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
예시적인 양이온성 계면활성제는 1급, 2급 또는 3급 아민, 4급 암모늄 계면활성제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예시적인 4급 암모늄 계면활성제는 알킬트리메틸암모늄 염, 예컨대 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB) 또는 세틸 트리메틸암모늄 클로라이드 (CTAC); 세틸피리디늄 클로라이드 (CPC); 폴리에톡실화 탈로우 아민 (POEA); 벤즈알코늄 클로라이드 (BAC); 벤즈에토늄 클로라이드 (BZT); 5-브로모-5-니트로-1,3-디옥산; 디메틸디옥타데실암모늄 클로라이드; 디옥타데실디메틸암모늄 브로마이드 (DODAB); 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
예시적인 양쪽성 계면활성제는 1급, 2급, 또는 3급 아민 또는 술포네이트, 카르복실레이트, 또는 포스페이트 음이온을 갖는 4급 암모늄 양이온을 포함한다. 예시적인 술포네이트 양쪽성 계면활성제는 (3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트); 술타인, 예컨대 코카미도프로필 히드록시술타인; 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예시적인 카르복실산 양쪽성 계면활성제는 아미노산, 이미노산, 베타인, 예컨대 코카미도프로필 베타인, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예시적인 포스페이트 양쪽성 계면활성제는 레시틴을 포함한다. 추가 예에서, 계면활성제는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜계 계면활성제일 수 있다.
도 1로 돌아와서, 현탁액에 첨가된 단량체는 바람직하게는 본래 촉진된 시드 입자로부터 형성된 분산된 상 (104) 중에 존재한다. 가교제, 예컨대 소수성 가교제를 또한 수현탁액에 첨가하고, 이것은 분산된 상 중에 우세하게 존재할 수 있다. 한 예에서, 가교제는 10 g/l 이하의 수용해도를 갖는다. 추가로, 포로겐(porogen)을 수현탁액에 첨가할 수 있고, 이것은 분산된 상 내에 우세하게 존재할 수 있다. 추가 예에서, 분산된 상은 아크리디트 올리고뉴클레오티드, 예컨대 이온-교환된 아크리디트 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 단량체 및 임의로는, 가교제를 중합시켜서 중합체성 입자 (108)를 형성한다.
단량체는 라디칼 중합성 단량체, 예컨대 비닐계 단량체일 수 있다. 특히, 단량체는 소수성 보호기에 커플링된 친수성 단량체를 포함할 수 있다. 한 예에서, 친수성 단량체는 아크릴아미드, 비닐 아세테이트, 히드록시알킬메타크릴레이트, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 친수성 단량체는 아크릴아미드, 예컨대 히드록실 기, 아미노 기, 카르복실 기 또는 이들의 조합을 포함하는 아크릴아미드이다. 한 예에서, 친수성 단량체는 아미노알킬 아크릴아미드, 아민 종결 폴리프로필렌 글리콜로 관능화된 아크릴아미드 (C, 하기에 도시됨), 아크릴로피페라진 (D, 하기에 도시됨), 또는 이들의 조합이다. 또 다른 예에서, 아크릴아미드는 히드록시알킬 아크릴아미드, 예컨대 히드록시에틸 아크릴아미드일 수 있다. 특히, 히드록시알킬 아크릴아미드는 N-트리스(히드록시메틸)메틸)아크릴아미드 (A, 하기에 도시됨), N-(히드록시메틸)아크릴아미드 (B, 하기에 도시됨), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 추가 예에서, 단량체의 혼합물, 예컨대 히드록시알킬 아크릴아미드 및 아민 관능화된 아크릴아미드의 혼합물 또는 아크릴아미드 및 아민 관능화된 아크릴아미드의 혼합물을 사용할 수 있다. 한 예에서, 아민 관능화된 아크릴아미드는 100:1 내지 1:1 범위, 예컨대 100:1 내지 2:1 범위, 50:1 내지 3:1 범위, 50:1 내지 5:1 범위 또는 심지어는 50:1 내지 10:1 범위의 히드록시알킬 아크릴아미드:아민 관능화된 아크릴아미드 또는 아크릴아미드:아민 관능화된 아크릴아미드의 비율로 포함될 수 있다.
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특정 예에서, 친수성 단량체는 히드록실 기를 포함하거나 또는 아민을 포함한다. 소수성 보호기는 예를 들어, 히드록실 기 또는 아민 기에 결합함으로써 단량체의 친수성을 가린다. 히드록실 기에 결합하는 경우, 이러한 보호기를 본 발명에서 히드록실 또는 히드록시 보호기라 지칭한다. 특히, 소수성 보호기는 예컨대 절단, 예를 들어 산 절단을 통해서 제거가능하다. 소수성 기는 기본(underlying) 중합체 또는 그의 일부를 가수분해시키지 않는 산성 조건 하에서 절단되도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 6보다 작은 pH 값의 경우, 아크릴아미드 중합체가 존재할 때, 소수성 보호기를 아크릴아미드의 아미드 분획이 가수분해되는 pH보다 높은 pH에서 절단한다. 9보다 큰 pH 값의 경우, 소수성 보호기를 아크릴아미드의 아미드 분획이 가수분해되는 pH보다 낮은 pH에서 절단한다.
예시적인 소수성 보호기는 유기금속 모이어티(moiety)를 포함한다. 예를 들어, 유기금속 모이어티는 실릴 에테르 관능기를 형성할 수 있다. 실릴 에테르 관능기는 할로겐화 실릴 화합물, 예컨대 일반 화학식 R1Si(R2)(R3)(R4) (여기서, R1은 할로겐, 예컨대 염소이고, R2, R3, 및 R4는 수소, 알킬 기, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 아릴 기, 실릴 기, 이들의 에테르 유도체, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 독립적으로 선택됨)의 화합물로부터 유도될 수 있다. 예시적인 실릴 에테르 관능기는 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드, 트리메틸실릴 클로라이드, 트리에틸실릴 클로라이드, 트리프로필실릴 클로라이드, 트리부틸실릴 클로라이드, 디페닐 메틸 실릴 클로라이드, 클로로(디메틸)페닐 실란, 또는 이들의 조합으로부터 유도된다. 특정 예에서, 보호된 단량체는 N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드 또는 tBDMS-HEAM, N-(2-((트리에틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드 또는 TES-HEAM, 또는 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 예에서, 소수성 보호기는 유기 모이어티를 포함할 수 있다. 예시적인 유기 모이어티는 알킬옥시카르보닐 기 모이어티, 예컨대 t-부틸옥시카르보닐, 플루오레닐메틸옥시카르보닐, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 한 예에서, 이러한 유기 모이어티는 아민 관능기, 예컨대 아민 관능화된 아크릴아미드 또는 그의 공중합체의 아민 관능기에 결합된 소수성 보호기일 수 있다.
보호된 단량체는 100:1 내지 1:2 범위, 예컨대 50:1 내지 1:1 범위, 45:1 내지 2:1 범위, 30:1 내지 5:1 범위, 또는 심지어는 20:1 내지 8:1 범위의, (보호된 단량체:시드 중합체)의 중량비로서 표현되는 초기 시드 중합체에 대한 상대적인 양으로 포함될 수 있다. 대안적으로, 단량체는 10:1 내지 1:2 범위, 예컨대 5:1 내지 1:2 범위, 또는 심지어는 2:1 내지 1:2 범위의 양으로 포함될 수 있다.
분산된 상은 또한 가교제를 포함할 수 있다. 한 예에서, 가교제는 15:1 내지 1:2 범위, 예컨대 10:1 내지 1:1 범위, 6:1 내지 1:1 범위, 또는 심지어는 4:1 내지 1:1 범위의 보호된 단량체 대 가교제의 질량비로 포함된다. 가교제는 낮은 수용해도 (예를 들어, 10 g/l 미만)를 가져서 분산된 상을 선호할 수 있다. 특히, 가교제는 디비닐 가교제일 수 있다. 예를 들어, 디비닐 가교제는 디아크릴아미드, 예컨대 N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(2-히드록실 에틸)아크릴아미드, N,N'-(2-히드록시프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 디비닐 가교제는 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트, 디비닐벤젠, 헥사메틸렌 비스아크릴아미드, 트리메틸올프로판 트리메타크릴레이트, 이들의 보호된 유도체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 추가 예에서, 가교제를 소수성 보호기, 예컨대 히드록실 보호기로 보호할 수 있다. 특히, 소수성 보호기는 유기금속 모이어티일 수 있다. 예를 들어, 유기금속 모이어티는 실릴 에테르 관능기를 형성할 수 있다. 예시적인 실릴 에테르 관능기는 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드, 트리메틸실릴 클로라이드, 트리에틸실릴 클로라이드, 트리프로필실릴 클로라이드, 트리부틸실릴 클로라이드, 디페닐 메틸 실릴 클로라이드, 클로로(디메틸)페닐실란, 또는 이들의 조합로부터 유도될 수 있다. 예시적인 보호된 디아크릴아미드 가교제는 N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-(2-((트리에틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(N-(2-((트리에틸실릴)옥시)프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, 실릴-보호된 N-[2-(아크릴로일아미노)-1,2-디히드록시에틸]아크릴아미드, 예컨대 N,N'(2,3-비스((트리에틸실릴)옥시)부탄-1,4-디일)디아크릴아미드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 예에서, 보호기는 알킬옥시카르보닐 기 모이어티, 예컨대 t-부틸옥시카르보닐, 플루오레닐메틸옥시카르보닐, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 특히, 히드록실 기를 포함하는 가교제를 보호기, 예컨대 보호된 단량체와 관련하여 상기에 기재된 것으로 보호할 수 있다.
또한, 소수성 보호를 갖는 친수성 단량체를 중합시키는 단계는 포로겐의 존재 하에서의 중합을 포함할 수 있다. 예시적인 포로겐은 방향족 포로겐을 포함한다. 한 예에서, 방향족 포로겐은 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 메시틸렌, 페네틸아세테이트, 디에틸아디페이트, 헥실아세테이트, 에틸벤조에이트, 페닐아세테이트, 부틸아세테이트, 또는 이들의 조합을 포함한다. 포로겐은 전형적으로는 15 내지 20의 용해도 파라미터를 갖는다. 또 다른 예에서, 포로겐은 알칸올 포로겐, 예컨대 도데칸올이다. 포로겐은 1 중량％ 내지 99 중량％ 범위, 예컨대 30 중량％ 내지 90 중량％ 범위, 또는 심지어는 50 중량％ 내지 85 중량％ 범위의 반응성 시스템 내의 유기 상의 상대적인 양으로 포함될 수 있다.
단량체는 그의 보호된 형태의 히드로겔을 생성하여 올리고뉴클레오티드 및 폴리머라제가 사용 동안 이들의 표적에 도달할 수 있도록 하는 단량체의 군으로부터 선택된다.
친수성 아크릴아미드, 특히 디아크릴아미드는 물과 혼화성이지 않고, 동시에 소수성 시드 중합체를 용해시키는 용매 중에서 용해되기가 어렵다. 단량체 및 가교제 모두에 대한 보호기는, 소수성 상 중의 단량체의 용해도가 중합을 수행하기에 충분히 큰 농도를 성취하기에 충분히 크도록 선택될 수 있다. 동시에, 보호기는 입체 장애(steric hindrance)로 인해서 중합이 수행될 수 없을 정도로 너무 클 수는 없다. 탈보호는 중합체를 가수분해시키지 않을 조건에서 수행할 수 있다.
임의로는, 중합 개시제가 포함될 수 있다. 예시적인 중합 개시제는 자유 라디칼 생성을 통해서 중합을 개시할 수 있다. 예시적인 중합 개시제는 아조 개시제, 예컨대 오일 용해성 아조 개시제를 포함한다. 또 다른 개시제는 암모늄 퍼술페이트를 포함할 수 있다. 추가의 예시적인 개시제는 테트라메틸에틸렌디아민을 포함할 수 있다. 한 예에서, 중합 개시제는 분산된 상의 중량을 기준으로 0.001 중량％ 내지 3 중량％의 양으로 포함될 수 있다.
중합 이후에, 중합체성 입자 (108)를 시드 중합체로부터 제거하여, 여전히 소수성 보호기를 갖는 중합체성 입자 (110)를 형성할 수 있다. 예를 들어, 시드 중합체를 용매, 예컨대 알데히드 또는 케톤, 예컨대 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 디이소프로필 케톤, 부틸아세테이트, 시클로헥산온, 디메틸 포름아미드, 또는 이들의 조합; 프탈레이트 용매, 예컨대, n-부틸 프탈레이트; 에테르 용매, 예컨대 테트라히드로푸란, 디이소프로필 에테르, 메틸 tert부틸 에테르, 디메틸 에테르, 디에틸 에테르, 또는 이들의 조합; 에스테르 용매, 예컨대 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 또는 이들의 조합; 헤테로시클릭 용매, 예컨대 피리딘, 디옥산, 테트라히드로푸르푸릴 알콜, 또는 이들의 조합; 할로겐화 용매, 예컨대 디클로로 메탄, 클로로포름 또는 이들의 조합을 사용하여 추출할 수 있다. 대안적으로, 중합체성 입자를 친수성 입자로 전환시킨 이후에, 시드 중합체를 추출할 수 있다. 예를 들어, 입자의 중합체를 탈보호시킨 이후에, 예컨대 보호된 단량체로부터 생성된 중합체 상의 실릴 기를 제거한 이후에, 시드 중합체를 추출할 수 있다.
도 1에 도시된 바와 같이, 시드 중합체를 추출한 후, 소수성 보호기의 적어도 일부를 제거함으로써 중합체성 입자 (110)를 친수성 중합체성 입자로 전환시킬 수 있다. 예를 들어, 소수성 보호기를 중합체성 입자로부터 산-절단할 수 있다. 특히, 이러한 제거는 중합체성 입자로부터 소수성 보호기의 실질적으로 전부, 예컨대 소수성 보호기의 적어도 80％, 또는 심지어는 소수성 보호기의 적어도 90％를 제거할 수 있다.
한 예에서, 소수성 보호기를 산, 예컨대 유기 산을 첨가하여 산-절단한다. 특히, 유기 산은 3.0 내지 5.5 범위의 pKa를 가질 수 있다. 예를 들어, 유기 산은 아세트산, 락트산, 시트르산, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 대안적으로, 무기 산을 사용할 수 있다.
소수성 보호기의 적어도 일부를 제거한 후, 친수성 입자 (112)가 형성된다. 친수성 입자 (112)는 히드로겔 입자일 수 있다. 히드로겔은 물 중에서 그의 중량의 적어도 20％, 예컨대 물 중에서 그의 중량의 적어도 45％, 적어도 65％, 적어도 85％, 적어도 100％, 적어도 300％, 적어도 1000％, 적어도 1500％ 또는 심지어는 적어도 2000％를 흡수할 수 있는 중합체이다.
친수성 중합체 (112)를 활성화시켜서 표적 분석물, 예컨대 폴리뉴클레오티드와의 접합을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 친수성 입자 (112) 상의 관능기를 표적 분석물 또는 분석물 수용체와의 결합을 허용하도록 증진시킬 수 있다. 특정 예에서, 친수성 중합체 관능기를 친핵성 치환 또는 친전자성 치환시킬 수 있는 반응성 모이어티로 전환시킬 수 있는 시약으로 친수성 중합체의 관능기를 개질할 수 있다. 예를 들어, 히드록실 기의 적어도 일부를 술포네이트 기 또는 염소로 대체함으로써 친수성 입자 (112) 상의 히드록실 기를 활성화시킬 수 있다. 예시적인 술포네이트 기는 트레실, 메실, 토실 또는 포실 클로라이드 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유도될 수 있다. 술포네이트는 친핵체가 술포네이트를 대체하게 할 수 있다. 술포네이트를 방출된 염소와 추가로 반응시켜서 입자를 접합시키기 위한 방법에서 사용될 수 있는 염소화 기를 제공할 수 있다. 또 다른 예에서, 친수성 중합체 (112) 상의 아민 기를 활성화시킬 수 있다.
예를 들어, 표적 분석물 또는 분석물 수용체를 술포네이트 기와의 친핵성 치환을 통해서 친수성 중합체에 결합시킬 수 있다. 특정 예에서, 친핵체, 예컨대 아민 또는 티올로 종결된 표적 분석물 수용체를 친핵성 치환시켜서 친수성 중합체 (112)의 표면 상의 술포네이트 기를 대체할 수 있다. 활성화로 인해서, 접합된 입자 (114)를 형성할 수 있다.
또 다른 예에서, 술포네이트화 입자를 일- 또는 다-관능성의 일- 또는 다-친핵성 시약과 추가로 반응시킬 수 있는데, 이것은 친전자성 기, 예컨대 말레이미드를 포함하는 올리고뉴클레오티드에 대한 친핵성 활성을 유지시키면서, 입자에 부착을 형성할 수 있다. 또한, 다-친전자성 기를 포함하는 시약에 부착시킴으로써, 잔류하는 친핵성 활성을 친전자성 활성으로 전환시키고, 이어서 이것을 친핵성 기를 포함하는 올리고뉴클레오티드에 부착시킬 수 있다.
또 다른 예에서, 관능기를 함유하는 단량체를 중합 동안 첨가할 수 있다. 단량체는 예를 들어, 카르복실산, 에스테르, 할로겐 또는 다른 아민 반응성 기를 함유하는 아크릴아미드를 포함할 수 있다. 아민 올리고와 반응시키기 전에 에스테르 기를 가수분해시킬 수 있다.
다른 접합 기술은 입자 합성 동안 아민 상에 소수성 보호기를 포함하는 단량체를 사용하는 것을 포함한다. 아민 기의 탈보호는, 중합체 입자에 부착된 후 일-관능성 친전자성 기를 생성하는 아민 반응성 이-관능성 비스-친전자성 시약으로 추가로 개질될 수 있는 친핵성 기를 이용가능하게 한다. 이러한 친전자성 기를 친핵성 기, 예컨대 아민 또는 티올을 갖는 올리고뉴클레오티드와 반응시켜서, 빈 친전자체와의 반응에 의해서 올리고뉴클레오티드의 부착을 유발한다.
입자 (112)를 아미노-아크릴아미드 및 히드록실-아크릴아미드의 조합물로부 제조하면, 히드로겔 입자의 탈보호는 친핵성 아미노 기 및 중성 히드록실 기의 조합물을 생성한다. 아미노 기를 이-관능성 비스-친전자성 모이어티, 예컨대 디-이소시아네이트 또는 비스-NHS 에스테르로 개질시켜서 친핵체와 반응성인 친수성 입자를 생성할 수 있다. 예시적인 비스-NHS 에스테르는 비스-숙신이미딜 C2-C12 알킬 에스테르, 예컨대 비스-숙신이미딜 수베레이트 또는 비스-숙신이미딜 글루타레이트를 포함한다.
다른 활성화 화학은 다수의 단계를 도입하여 명시된 관능기로 전환시켜서 바람직한 특정 연결을 제공하는 것을 포함한다. 예를 들어, 술포네이트 개질된 히드록실 기를 몇가지 방법을 통해서 친핵성 기로 전환시킬 수 있다. 한 예에서, 술포네이트와 아지드 음이온의 반응은 아지드 치환된 친수성 중합체를 생성한다. 아지드를 사용하여 구리 촉매반응과 함께 수행되거나 또는 이것 없이 수행될 수 있는 "클릭(CLICK)" 화학을 통해서 아세틸렌 치환된 생체분자에 직접 접합시킬 수 있다. 임의로는, 아지드를 예를 들어, 수소로의 촉매 환원 또는 유기 포스핀으로의 환원에 의해서 아민으로 전환시킬 수 있다. 이어서, 생성된 아민을 다양한 시약, 예컨대 디-이소시아네이트, 비스-NHS 에스테르, 시아누르산 클로라이드, 또는 이들의 조합을 사용하여 친전자성 기로 전환시킬 수 있다. 한 예에서, 디-이소시아네이트를 사용하여 중합체와 링커 간에 우레아 연결을 생성하며, 이것은 아미노 치환된 생체분자와 반응할 수 있는 잔류하는 이소시아네이트 기를 생성하여 링커와 생체분자 간에 우레아 연결을 생성한다. 또 다른 예에서, 비스-NHS 에스테르를 사용하여 중합체와 링커 간의 아미드 연결, 및 아미노 치환된 생체분자와 반응할 수 있는 잔류하는 NHS 에스테르 기를 생성하여 링커와 생체분자 간에 아미드 연결을 생성한다. 추가 예에서, 시아누르산 클로라이드를 사용하여 중합체와 링커 간의 아미노-트리아진 연결, 및 2개의 잔류하는 클로로-트리아진 기를 생성하며, 이들 중 하나는 아미노 치환된 생체분자와 반응하여 링커와 생체분자 간에 아미노-트리아진 연결을 생성할 수 있다. 술포네이트 활성을 통해서 다른 친핵성 기를 입자에 도입할 수 있다. 예를 들어, 술포네이트화 입자와 티오벤조산 음이온의 반응, 및 그로 인한 티오벤조에이트의 가수분해가 티올을 입자에 도입시키고, 이어서 이것을 말레이미드 치환된 생체분자와 반응시켜서 생체분자에 티오-숙신이미드 연결을 생성할 수 있다. 티올을 또한 브로모-아세틸 기와 반응시킬 수 있다.
대안적으로, 아크리디트 올리고뉴클레오티드를 중합 동안 사용하여 올리고뉴클레오티드를 도입할 수 있다. 예시적인 아크리디트 올리고뉴클레오티드는 이온-교환된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
내화성 또는 중합체성 기재에 대한 생체분자의 공유 연결은 생체분자 상의 친핵성 연결과 커플링된 기재 상의 친전자성 모이어티 또는 생체분자 상의 친전자성 연결과 커플링된 기재 상의 친핵성 연결을 사용하여 생성될 수 있다. 대부분의 일반적인 흥미로운 생체분자의 친수성 본성으로 인해서, 이들 커플링을 위해서 선택되는 용매는 기재 상에 생체분자를 분산시키기 위해서 물 또는 일부 수용성 유기 용매를 함유하는 물이다. 특히, 폴리뉴클레오티드는 그의 다가-음이온성(poly-anionic) 본성으로 인해서 일반적으로 수계 중에서 기재에 커플링시킨다. 물은 친전자체를 접합에 대한 비활성 모이어티로 가수분해시킴으로서 친전자체에 대한 친핵체와 경쟁하기 때문에, 수성계는 일반적으로 낮은 수율의 커플링된 생성물을 유발하고, 여기서 수율은 커플의 친전자성 분획을 기준으로 한다. 반응 커플의 친전차성 분획의 높은 수율이 바람직한 경우, 높은 농도의 친핵체가 반응을 유도하여 가수분해를 경감시키는 것이 필요하며, 이것은 친핵체의 비효율적인 사용을 유발한다. 폴리핵산의 경우, 극성의 비-반응성, 비-수성 용매 중에서 생체분자를 용해시키는 것을 돕기 위해서, 포스페이트의 금속 반대 이온을 친지성 반대 이온으로 대체할 수 있다. 이러한 용매는 아미드 또는 우레아, 예컨대 포름아미드, N,N-디메틸포름아미드, 아세트아미드, N,N-디메틸아세트아미드, 헥사메틸포스포르아미드, 피롤리돈, N-메틸피롤리돈, N,N,N',N'-테트라메틸우레아, N,N'-디메틸-N,N'-트리메틸렌우레아, 또는 이들의 조합; 카르보네이트, 예컨대 디메틸 카르보네이트, 프로필렌 카르보네이트, 또는 이들의 조합; 에테르, 예컨대 테트라히드로푸란; 술폭시드 및 술폰, 예컨대 디메틸술폭시드, 디메틸술폰, 또는 이들의 조합; 장애(hindered) 알콜, 예컨대 tert-부틸 알콜; 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 친지성 양이온은 테트라알킬암모늄 또는 테트라아릴암모늄 양이온, 예컨대 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 테트라프로필암모늄, 테트라부틸암모늄, 테트라펜틸암모늄, 테트라헥실암모늄, 테트라헵틸암모늄, 테트라옥틸암모늄, 및 이들의 알킬 및 아릴 혼합물, 테트라아릴포스포늄 양이온, 예컨대 테트라페닐포스포늄, 테트라알킬아르소늄 또는 테트라아릴아르소늄, 예컨대 테트라페닐아르소늄, 및 트리알킬술포늄 양이온, 예컨대 트리메틸술포늄, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 금속 양이온을 친지성 양이온으로 교환시킴으로써 폴리핵산을 유기 용매 가용성 물질로 전환시키는 것은 다양한 표준 양이온 교환 기술에 의해서 수행할 수 있다.
또 다른 예에서, 소수성 상이 친수성 상 내에서 분산된 상을 형성하는 유화 중합 기술을 사용하여 입자를 형성할 수 있다. 단량체, 가교제 및 소수성 상을 선호하는 상기에 기재된 다른 제제 및 화합물은 중합이 진행되는 소수성 상 중에 존재하려는 경향이 있다.
상기에 기재된 것과 같은 계면활성제를 친수성 상 중에 사용하여 에멀젼 형성을 지지할 수 있다. 시드 입자를 사용하는 경우, 계면활성제는 임계 미셀 농도 미만의 농도로 사용될 수 있다. 대안적으로, 계면활성제는 임계 미셀 온도보다 높은 농도로 사용될 수 있다. 유화 중합은 전형적으로는 수용성 개시제, 예컨대 칼륨 또는 암모늄 퍼술페이트를 사용하여 수행한다.
단량체의 가열된 에멀젼에 개시제를 첨가함으로써, 입자 핵형성(nucleation)이 수상 중에서 시작되고, 형성된 입자는 계면활성제에 의해서 안정화된다. 입자 대부분이 단기간 내에 생성되면, 단일 크기의(monosized) 시드 입자가 생성될 수 있다. 이후에 입자 크기의 증가가 발생하는데, 그 이유는 단량체가 큰 단량체 액적으로부터 훨씬 더 작은 시드 입자로 수상을 통해서 확산되기 때문이다.
특히, 상기 방법은 바람직한 입자 크기 및 변동 계수를 갖는 다수의 입자를 생성할 수 있다. 입자의 세트는 예를 들어, 100,000개의 입자, 예컨대 500,000개의 입자, 1 x 106개를 초과하는 입자, 10 x 106개를 초과하는 입자, 또는 심지어는 적어도 1 x 1010개를 초과하는 입자를 포함할 수 있다. 다수의 입자의 입자는 친수성 중합체성 입자, 예컨대 히드로겔 입자일 수 있다. 특정 예에서, 히드로겔 입자은 아크릴아미드입자, 예컨대 가교된 히드록시알킬 아크릴아미드 중합체 또는 히드로알킬 아크릴아미드 및 아민 관능화된 아크릴아미드의 가교된 공중합체를 포함하는 입자일 수 있다. 또 다른 예에서, 입자는 아크릴아미드 및 아민 관능화된 아크릴아미드의 가교된 공중합체일 수 있다.
다수의 입자는 바람직한 입자 크기, 예컨대 100 μm 이하, 30 μm 이하, 또는 3 μm 이하의 입자 크기를 가질 수 있다. 평균 입자 크기는 평균 입자 직경이다. 예를 들어, 평균 입자 크기는 2 μm 이하, 예컨대 1.5 μm 이하, 1.1 μm 이하, 0.8 μm 이하, 0.6 μm 이하, 0.5 μm 이하, 또는 심지어는 0.3 μm 이하일 수 있다. 특정 예에서, 평균 입자 크기는 0.1 μm 내지 100 μm 범위, 예컨대 0.1 μm 내지 50 μm 범위 또는 0.1 μm 내지 1.1 μm 범위일 수 있다. 일부 측면에서, 상기에 기재된 방법은 5 μm 내지 100 μm 범위, 예컨대 20 μm 내지 100 μm 범위, 또는 30 μm 내지 70 μm 범위의 입자 크기를 갖는 입자를 생성하는 기술적인 이점을 제공한다. 다른 측면에서, 상기에 기재된 방법은 1.1 μm 이하의 입자 크기를 갖는 입자를 생성하는 기술적인 이점을 제공한다. 시드 입자가 더 큰 경우, 더 큰 입자가 형성될 수 있다. 입자의 크기는 시드 입자의 크기를 기준으로 조정될 수 있다. 본 방법을 사용하면, 다른 방법을 사용하는 경우보다 중합체성 입자의 크기가 계면활성제 선택 및 및 농도에 덜 의존적이다.
추가로, 다수의 입자는 단분산성이며, 바람직하게 낮은 변동 계수, 예컨대 20％ 이하의 변동 계수를 가질 수 있다. 상기와 같이, 변동 계수(CV)는 표준 편차를 평균으로 나눈 값의 100배로서 정의되며, 여기서 "평균"은 평균 입자 직경이고, 표준 편차는 입자 크기의 표준 편차이다. 대안적으로, "평균"은 z-평균 또는 모드 입자 직경일 수 있다. 통상의 실시에 따라서, CV는 주 모드, 즉 주 피크 상에서 계산되기 때문에, 응집체와 관련된 부 피크를 제외한다. 따라서, 모드 크기보다 작거나 또는 큰 일부 입자는 계산에서 무시될 수 있으며, 이것은 예를 들어, 검출가능한 입자의 총 입자 수의 약 90％를 기준으로 할 수 있다. 이러한 CV의 측정은 CPS 디스크 원심분리기 또는 쿨터 계수기(coulter counter) 상에서 수행할 수 있다. 예를 들어, 다수의 입자의 변동 계수 (CV)는 15％ 이하, 예컨대 10％ 이하, 5％ 이하, 4.5％ 이하, 4.0％ 이하, 3.5％ 이하, 또는 심지어는 3.0％ 이하일 수 있다. 이러한 CV는 필터링 또는 다른 크기 배제 기술 없이 성취될 수 있다.
특히, 비드의 크기의 낮은 변동을 유지시키기 위해서, 중합 동안 액적의 유착(coalescence)이 회피되어야 한다. 이러한 회피는 유중수 에멀젼보다 수중유 에멀젼에서 성취되기가 더 쉬운데, 그 이유는 물이 연속상인 계를 안정화시키기가 더 쉽기 때문이다. 그러나, 친수성 단량체는 오일 상 중에 우세하게 존재하지 않는다.
추가 예에서, 물 중에서 친수성 중합체성 입자는 50 중량％ 이하의 중합체, 예컨대 30 중량％ 이하의 중합체, 20 중량％ 이하의 중합체, 10 중량％ 이하의 중합체, 5 중량％ 이하의 중합체, 또는 심지어는 2 중량％ 이하의 중합체일 수 있다.
추가 예에서, 중합체성 입자는 단백질 및 효소의 확산을 허용하는 다공도를 가질 수 있다. 한 예에서, 중합체성 입자는 적어도 50 킬로달톤, 예컨대 적어도 100 킬로달톤, 적어도 200 킬로달톤, 적어도 250 킬로달톤, 또는 심지어는 적어도 350 킬로달톤의 크기를 갖는 단백질의 확산을 허용하는 다공도를 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 접합되는 경우, 중합체성 입자는 적어도 7 x 104/μm3의 뉴클레오티드 밀도로 지칭되는 폴리뉴클레오티드의 밀도를 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 밀도는 적어도 105/μm3, 예컨대 적어도 106/μm3, 적어도 5 x 106/μm3, 적어도 8 x 106/μm3, 적어도 1 x 107/μm3, 또는 심지어는 적어도 3 x 107/μm3일 수 있다. 추가 예에서, 뉴클레오티드 밀도는 1015/μm3 이하일 수 있다.
이러한 중합체성 입자는 다양한 분리 기술 또는 분석 기술에서 사용될 수 있다. 특히, 중합체성 입자는 폴리뉴클레오티드를 결합시키는데 유용할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 결합은 용액으로부터 폴리뉴클레오티드를 분리하는데 유용할 수 있거나, 분석 기술, 예컨대 서열분석에서 사용될 수 있다. 도 2에 도시된 특정 예에서, 이러한 중합체성 입자를 서열분석 기술 동안 폴리뉴클레오티드를 위한 지지체로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 친수성 입자는 형광 서열분석 기술을 사용하는 서열분석을 위해서 폴리뉴클레오티드를 고정시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 친수성 입자는 이온-감수성 기술을 사용하는 서열분석을 위해서 폴리뉴클레오티드의 다수의 카피를 고정시킬 수 있다.
일반적으로, 중합체성 입자를 처리하여 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 핵산 (올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드), 폴리펩티드, 사카라이드, 폴리사카라이드, 지질, 또는 이들의 유도체 또는 유사체를 비롯한 생체분자를 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 중합체성 입자를 생체분자에 결합시키거나 부착시킬 수 있다. 생체분자의 말단 단부 또는 임의의 중간 부분을 중합체성 입자에 결합시키거나 부착시킬 수 있다. 중합체성 입자를 연결 화학을 사용하여 생체분자에 결합시키거나 부착시킬 수 있다. 연결 화학은 이온성 결합, 수소 결합, 친화도 결합, 쌍극자-쌍극자 결합, 반 데르 발스 결합(van der Waals bond) 및 소수성 결합을 비롯한 공유 결합 또는 비-공유 결합을 포함한다. 연결 화학은 결합 파트너들, 예를 들어 아비딘 모이어티와 비오틴 모이어티; 항원성 에피토프와 항체 또는 그의 면역학적으로 반응성인 단편; 항체와 합텐(hapten); 디옥시겐(digoxigen) 모이어티와 안티-디옥시겐 항체; 플루오레세인 모이어티와 안티-플루오레세인 항체; 오퍼레이터(operator)와 리프레서(repressor); 뉴클레아제(nuclease)와 뉴클레오티드; 렉틴과 폴리사카라이드; 스테로이드와 스테로이드-결합 단백질; 활성 화합물과 활성 화합물 수용체; 호르몬과 호르몬 수용체; 효소와 기질; 면역글로불린과 단백질 A; 또는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 그의 상응하는 상보체 간의 친화도를 포함한다.
한 예에서, 중합체성 입자를 표면을 갖는 시스템에서 사용할 수 있다. 시스템은 표면 상에 하나 이상의 중합체성 입자를 포함한다. 표면은 고체 표면일 수 있다. 표면은 평탄한 표면, 오목한 표면 또는 볼록한 표면, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 표면은 에칭(etching), 공동화(cavitation) 또는 범프(bump)를 비롯한 텍스쳐 또는 특징부를 포함할 수 있다. 표면은 임의의 텍스쳐 또는 특징부가 존재하지 않을 수 있다. 표면은 모세관, 채널, 홈, 웰 또는 저장소의 내벽을 포함할 수 있다. 표면은 메시일 수 있다. 표면은 다공성, 반-다공성 또는 비다공성일 수 있다. 표면은 필터 또는 겔일 수 있다. 표면은 핀(pin) (예를 들어, 핀 어레이)의 상부를 포함할 수 있다. 표면은 물질, 예컨대 유리, 보로실리케이트 유리, 실리카, 석영, 용융 석영(fused quartz), 운모, 폴리아크릴아미드, 가소성 폴리스티렌, 폴리카르보네이트, 폴리메타크릴레이트 (PMA), 폴리메틸 메타크릴레이트 (PMMA), 폴리디메틸실록산 (PDMS), 규소, 게르마늄, 흑연, 세라믹, 규소, 반도체, 고굴절률 유전체, 결정, 겔, 중합체 또는 필름 (예를 들어, 금, 은, 알루미늄 또는 다이아몬드 필름)으로부터 제조될 수 있다. 표면은 금속 필름 또는 금속 코트를 갖는 고체 기재를 포함할 수 있다. 표면은 임의로는 투명하고, 최소한으로 반사성이고, 최소한으로 흡수성일 수 있거나, 낮은 형광을 나타낼 수 있다.
표면은 96, 384, 1536, 3456 또는 9600 웰을 갖는 마이크로타이터(microtiter) 플레이트와 유사한 치수를 가질 수 있다. 표면은 임의의 한 치수가 약 1 내지 20 cm이거나, 임의의 한 치수가 약 1 내지 10 cm이거나, 임의의 한 치수가 약 0.10 내지 1 cm이거나, 또는 임의의 한 치수가 약 0.001 nm 내지 1 cm일 수 있다. 표면 (및 임의의 텍스쳐 또는 특징부)는 나노제조 기술에 의해서 제조될 수 있다.
다수의 중합체성 입자는 표면 상에 랜덤 배열 또는 정렬된 배열로, 또는 랜덤 배열 및 정렬된 배열의 조합으로 배열될 수 있다. 정렬된 배열은 직선형 및 육방정계 패턴을 포함한다. 표면은 랜덤 배열 또는 정렬된 배열, 또는 이들의 조합으로 배열된 다수의 부위를 포함할 수 있다. 하나 이상의 중합체성 입자를 하나의 부위, 일부 부위 또는 모든 부위에 위치시킬 수 있다. 일부 부위는 하나의 중합체성 입자를 가질 수 있고, 다른 부위는 다수의 중합체성 입자를 가질 수 있다. 적어도 하나의 부위는 중합체성 입자가 존재하지 않을 수 있다. 배열에서, 적어도 2개의 중합체성 입자가 서로 접촉할 수 있거나 또는 중합체성 입자들 간에는 접촉이 없을 수 있다.
도 2에 도시된 바와 같이, 다수의 중합체성 입자 (204)를 다수의 표적 폴리뉴클레오티드 (202)와 함께 용액 중에 넣을 수 있다. 다수의 입자 (204)를 활성화시키거나 또는 달리는 폴리뉴클레오티드 (202)와 결합하도록 할 수 있다. 예를 들어, 입자 (204)는 다수의 폴리뉴클레오티드 (202)의 폴리뉴클레오티드의 일부에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중합체성 입자 (204)를 비오틴-스트렙타비딘 결합과 같은 기술을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드 (204)로 개질시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 친수성 입자 및 폴리뉴클레오티드를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 적용한다. 예를 들어, 분산된 상 액적 (206) 또는 (208)이 에멀젼의 일부로서 형성되고, 친수성 입자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 한 예에서, 폴리뉴클레오티드 (202) 및 친수성 입자 (204)는 단일 폴리뉴클레오티드 (202)가 단일 친수성 입자 (204)와 동일한 분산된 상 액적 내에 존재하도록 서로에 대해서 낮은 농도 및 비율로 제공된다. 다른 액적, 예컨대 액적 (208)은 단일 친수성 입자를 포함할 수 있고, 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 각각의 액적 (206) 또는 (208)은 폴리뉴클레오티드의 복제를 용이하게 하기에 충분한 효소, 뉴클레오티드, 염 또는 다른 성분을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 효소, 예컨대 폴리머라제는 분산된 상 액적의 친수성 입자 또는 히드로겔 입자에 존재하거나, 결합되거나 또는 그 근처에 존재한다. 한 예에서, 폴리머라제는 분산된 상 액적 중에 존재하여 폴리뉴클레오티드의 복제를 용이하게 한다. 다양한 핵산 폴리머라제가 본 발명에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 폴리머라제는 효소, 그의 단편 또는 하위단위를 포함할 수 있으며, 이것은 폴리뉴클레오티드의 복제를 촉매화할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 폴리머라제는 자연-발생 폴리머라제, 재조합 폴리머라제, 돌연변이 폴리머라제, 변이 폴리머라제, 융합 또는 달리 가공된 폴리머라제, 화학적으로 개질된 폴리머라제, 합성 분자 또는 이들의 유사체, 유도체 또는 단편일 수 있다.
한 실시양태에서, 폴리머라제는 임의의 패밀리(Family) A DNA 폴리머라제 (또한 폴(pol) I 패밀리로 공지됨) 또는 임의의 패밀리 B DNA 폴리머라제일 수 있다. 실시양태에서, DNA 폴리머라제는 비-재조합 DNA 폴리머라제에 비해서 우수한 정확성 및 수율로 폴리뉴클레오티드를 복제할 수 있는 재조합 형태일 수 있다. 예를 들어, 폴리머라제는 높은 충실도(fidelity)의 폴리머라제 또는 열안정성 폴리머라제를 포함할 수 있다. 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드의 복제를 위한 조건은 '핫 스타트(Hot start)' 조건, 예를 들어 핫 스타트 폴리머라제, 예컨대 앰플리택 골드(Amplitaq Gold)® DNA 폴리머라제 (어플라이드 바이오사이언시스(Applied Biosciences)) 또는 KOD 핫 스타트 DNA 폴리머라제 (EMD 바이오사이언시스(EMD Biosciences))를 포함할 수 있다. 전형적으로, '핫 스타트' 폴리머라제는 열안정성 폴리머라제 및 주변 온도에서 DNA 폴리머라제 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 억제하는 하나 이상의 항체를 포함한다.
실시양태에서, 폴리머라제는 효소, 예컨대 Taq 폴리머라제 (써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)로부터), Tfi 폴리머라제 (써무스 필리포르미스(Thermus filiformis)로부터), Bst 폴리머라제 (바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus)로부터), Pfu 폴리머라제 (피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터), Tth 폴리머라제 (써무스 써모필루스(Thermus thermophilus)로부터), Pow 폴리머라제 (피로코쿠스 웨세이(Pyrococcus woesei)로부터), Tli 폴리머라제 (써모코쿠스 리토랄리스(Thermococcus litoralis)로부터), Ultima 폴리머라제 (써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)로부터), KOD 폴리머라제 (써모코쿠스 코다카라엔시스(Thermococcus kodakaraensis)로부터), Pol I 및 II 폴리머라제 (피로코쿠스 아비시(Pyrococcus abyssi)로부터) 및 Pab (피로코쿠스 아비시로부터)일 수 있다.
실시양태에서, 폴리머라제는 써모코쿠스 코다카라엔시스의 재조합 형태일 수 있다. 실시양태에서, 폴리머라제는 KOD 또는 KOD-유사 DNA 폴리머라제, 예컨대 KOD 폴리머라제 (EMD 바이오사이언시스), KOD "핫 스타트" 폴리머라제 (EMD 바이오사이언시스), KOD 엑스트림(Xtreme) 핫 스타트 DNA 폴리머라제 (EMD 바이오사이언시스), KOD XL DNA 폴리머라제 (EMD 바이오사이언시스), 플래티넘(Platinum)® Taq DNA 폴리머라제 (인비트로젠(Invitrogen)), 플래티넘® Taq DNA 폴리머라제 하이 피델리티(High Fidelity) (인비트로젠), 플래티넘® Pfx (인비트로젠), 아큐프림(Accuprime)™ Pfx (인비트로젠), 아큐프림™ Taq DNA 폴리머라제 하이 피델리티 (인비트로젠) 또는 앰플리택 골드® DNA 폴리머라제 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))일 수 있다. 실시양태에서, 폴리머라제는 본 발명에서 논의된 폴리머라제에 대한 유사한 돌연변이를 함유하는 DNA 폴리머라제일 수 있다.
실시양태에서, 폴리뉴클레오티드의 복제는 복제 조건을 조절하는 것을 포함할 수 있다. 조절은 임의로는 폴리머라제 농도를 증가시키거나 감소시키는 것; 뉴클레오티드 농도를 증가시키거나 감소시키는 것; 양이온 농도를 증가시키거나 감소시키는 것; 반응 온도, 시간 또는 pH 등을 증가시키거나 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 조절은 반응 속도를 증가시키거나 감소시키는 것, 반응 생성물의 수율 등을 증가시키거나 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 실시양태에서, 복제는 적절한 완충액 또는 뉴클레오티드 (뉴클레오티드 유사체 또는 비오티닐화 뉴클레오티드 포함)의 존재 하에서 수행할 수 있다.
특히, 증폭될 폴리뉴클레오티드를 중합체성 입자에 의해서 포획할 수 있다. 예시적인 핵산 포획 방법은 폴리뉴클레오티드를 중합체성 입자에 부착된 올리고뉴클레오티드에 혼성화시키는 것을 포함할 수 있다. 실시양태에서, 핵산의 포획 방법은 (a) 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 포획 올리고뉴클레오티드)에 부착된 중합체성 입자를 제공하는 단계; (b) 단일-가닥 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; 및 (c) 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 단일-가닥 폴리뉴클레오티드에 혼성화시켜서 단일-가닥 폴리뉴클레오티드를 중합체성 입자에 포획하는 단계를 포함한다. 실시양태에서, 중합체성 입자 각각을 다수의 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 포획 올리고뉴클레오티드)와 부착시킬 수 있다. 실시양태에서, 단계 (c)를 다수의 단일-가닥 폴리뉴클레오티드를 사용하여 수행할 수 있다. 실시양태에서, 단일-가닥 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부는 단일-가닥 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적인 (또는 부분적으로 상보적인) 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
한 예에서, 방법은 폴리뉴클레오티드를 다수의 폴리뉴클레오티드로 증폭시키는 단계, 및 다수의 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부를 친수성 입자에 부착시켜, 다수의 부착된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 친수성 입자를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 대안적으로, 방법은 올리고뉴클레오티드를 연장시킴으로써 폴리뉴클레오티드를 다수의 상보적 폴리뉴클레오티드 내로 증폭시켜, 다수의 부착된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 히드로겔 입자를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
실시양태에서, 뉴클레오티드의 도입 방법은 중합체성 입자에 부착된 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 폴리뉴클레오티드 상에서 뉴클레오티드 중합 반응을 수행하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 뉴클레오티드의 도입 방법은 (a) 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 프라이머 올리고뉴클레오티드)에 부착된 중합체성 입자를 제공하는 단계; (b) 단일-가닥 주형 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; (c) 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 단일-가닥 주형 폴리뉴클레오티드에 혼성화시키는 단계; 및 (d) 폴리머라제가 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 상에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 중합을 촉매화시키기에 적합한 조건 하에서 단일-가닥 주형 폴리뉴클레오티드를 폴리머라제 및 적어도 하나의 뉴클레오티드와 접촉시켜서 뉴클레오티드의 도입을 수행하는 단계를 포함한다. 실시양태에서, 중합체성 입자 각각을 다수의 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 포획 올리고뉴클레오티드)와 부착시킬 수 있다. 실시양태에서, 단계 (b), (c) 또는 (d)를 다수의 단일-가닥 폴리뉴클레오티드를 사용하여 수행할 수 있다. 실시양태에서, 단일-가닥 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부는 단일-가닥 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적인 (또는 부분적으로 상보적인) 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 실시양태에서, 시스템은 중합체성 입자에 부착된 단일-가닥 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 단일-가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 뉴클레오티드가 단일-가닥 올리고뉴클레오티드의 단부 상에 중합된다.
실시양태에서, 프라이머 연장 방법은 중합체성 입자에 부착된 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 폴리뉴클레오티드 상에서 프라이머 연장 반응을 수행하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 핵산 프라이머 연장 방법은 (a) 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 프라이머 올리고뉴클레오티드)에 부착된 중합체성 입자를 제공하는 단계; (b) 단일-가닥 주형 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; (c) 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 단일-가닥 주형 폴리뉴클레오티드에 혼성화시키는 단계; 및 (d) 폴리머라제가 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 상에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 중합을 촉매화시키기에 적합한 조건 하에서 단일-가닥 주형 폴리뉴클레오티드를 폴리머라제 및 적어도 하나의 뉴클레오티드와 접촉시켜서 프라이머를 연장시키는 단계를 포함한다. 실시양태에서, 중합체성 입자 각각을 다수의 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 포획 올리고뉴클레오티드)와 부착시킬 수 있다. 실시양태에서, 단계 (b), (c) 또는 (d)를 다수의 단일-가닥 폴리뉴클레오티드를 사용하여 수행할 수 있다. 실시양태에서, 단일-가닥 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부는 단일-가닥 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적인 (또는 부분적으로 상보적인) 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 실시양태에서, 시스템은 중합체성 입자에 부착된 단일-가닥 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 단일-가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 단일-가닥 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오티드와 연장된다.
실시양태에서, 핵산 증폭 방법은 중합체성 입자에 부착된 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 폴리뉴클레오티드 상에서 프라이머 연장 반응을 수행하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 핵산 증폭 방법은 (a) 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 프라이머 올리고뉴클레오티드)에 부착된 중합체성 입자를 제공하는 단계; (b) 단일-가닥 주형 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; (c) 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 단일-가닥 주형 폴리뉴클레오티드에 혼성화시키는 단계; 및 (d) 폴리머라제가 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 상에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 중합을 촉매화시켜서 연장된 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 생성하기에 적합한 조건 하에서 단일-가닥 주형 폴리뉴클레오티드를 폴리머라제 및 적어도 하나의 뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 실시양태에서, 방법은 (e) 연장된 단일-가닥 올리고뉴클레오티드로부터 단일-가닥 주형 폴리뉴클레오티드를 제거하여 (예를 들어, 변성) 단일-가닥 올리고뉴클레오티드가 중합체성 입자에 부착되어 있도록 하는 단계; (f) 남아있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 제2 단일-가닥 주형 폴리뉴클레오티드에 혼성화시키는 단계; 및 (g) 제2 폴리머라제가 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 상에서 적어도 하나의 제2 뉴클레오티드의 중합을 촉매화시켜서 후속의 연장된 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 생성하기에 적합한 조건 하에서 제2의 단일-가닥 주형 폴리뉴클레오티드를 제2 폴리머라제 및 적어도 하나의 제2 뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 단계 (e), (f) 및 (g)를 적어도 1회 반복할 수 있다. 실시양태에서, 폴리머라제 및 제2 폴리머라제는 열경화성 폴리머라제를 포함한다. 실시양태에서, 뉴클레오티드 중합에 적합한 조건은 승온에서 뉴클레오티드 중합 단계 (예를 들어, 단계 (d) 또는 (g))를 수행하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 뉴클레오티드 중합에 적합한 조건은 교호 온도 (예를 들어, 승온 및 비교적 저온)에서 뉴클레오티드 중합 단계 (예를 들어, 단계 (d) 또는 (g))를 수행하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 교호 온도는 60 내지 95℃ 범위이다. 실시양태에서, 온도 사이클은 약 10초 내지 약 5분, 또는 약 10분, 또는 약 15분이거나 또는 더 길 수 있다. 실시양태에서, 핵산 증폭 방법은 단일-가닥 주형 폴리뉴클레오티드 또는 제2 단일-가닥 주형 폴리뉴클레오티드에 상보적인 서열을 포함하는 다수의 주형 폴리뉴클레오티드에 각각 부착된 하나 이상의 중합체성 입자를 생성할 수 있다. 실시양태에서, 중합체성 입자 각각을 다수의 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 포획 올리고뉴클레오티드)와 부착시킬 수 있다. 실시양태에서, 단계 (b), (c), (d), (e), (f) 또는 (g)를 다수의 단일-가닥 폴리뉴클레오티드를 사용하여 수행할 수 있다. 실시양태에서, 단일-가닥 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부는 단일-가닥 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적인 (또는 부분적으로 상보적인) 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 실시양태에서, (상기에 기재된 바와 같은) 핵산 증폭 방법은 오일 상 중의 수상 용액 (예를 들어, 분산된 상 액적) 중에서 수행할 수 있다.
PCR 이후에, 친수성 입자 (212) 및 폴리뉴클레오티드의 다수의 카피 (214)를 포함할 수 있는 입자, 예컨대 입자 (210)가 형성된다. 폴리뉴클레오티드 (214)가 입자 (210)의 표면 상에 존재하는 것으로서 도시되어 있지만, 폴리뉴클레오티드는 입자 (210) 내에서 연장될 수 있다. 물에 비해서 저농도의 중합체를 갖는 친수성 입자 및 히드로겔은 입자 (210)의 내부에 그리고 전체에 폴리뉴클레오티드 절편을 포함할 수 있거나, 또는 폴리뉴클레오티드는 기공 및 다른 개구부에 존재할 수 있다. 특히, 입자 (210)는 효소, 뉴클레오티드, 프라이머 및 반응을 모니터링하는데 사용되는 반응 생성물의 확산을 허용할 수 있다. 입자 당 다수의 폴리뉴클레오티드가 양호한 신호를 생성한다.
실시양태에서, 에멀젼-브레이킹(emulsion-breaking) 절차로부터의 중합체성 입자를 수집하고, 서열분석을 위한 제제 중에서 세척할 수 있다. 수집은 (예를 들어, 중합체성 입자에 부착된 증폭된 폴리뉴클레오티드 주형에 연결된) 비오틴 모이어티를 아비딘 모이어티와 접촉시키고, 비오티닐화 주형이 존재하지 않은 중합체성 입자로부터 분리함으로써 수행할 수 있다. 이중-가닥 주형 폴리뉴클레오티드를 보유하는 수집된 중합체성 입자를 변성시켜서 서열분석을 위한 단일-가닥 주형 폴리뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 변성 단계는 염기 (예를 들어, NaOH), 포름아미드, 또는 피롤리돈으로 처리하는 것을 포함할 수 있다.
예시적인 실시양태에서, 입자 (210)는 서열분석 장치에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열분석 장치 (216)는 웰 (218)의 어레이를 포함할 수 있다. 입자 (210)는 웰 (218) 내에 놓일 수 있다.
예에서, 프라이머를 웰 (218)에 첨가할 수 있거나, 또는 웰 (218) 내에 놓기 전에 입자 (210)를 프라이머에 미리 노출시킬 수 있다. 특히, 입자 (210)는 결합된 프라이머를 포함할 수 있다. 프라이머 및 폴리뉴클레오티드는 프라이머에 혼성화된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 주형 핵산)을 포함하는 핵산 듀플렉스를 형성한다. 핵산 듀플렉스는 적어도 부분적인 이중-가닥 폴리뉴클레오티드이다. 효소 및 뉴클레오티드를 웰 (218)에 제공하여 검출가능한 반응, 예컨대 뉴클레오티드 도입을 용이하게 할 수 있다.
뉴클레오티드 첨가를 검출함으로써 서열분석을 수행할 수 있다. 뉴클레오티드 첨가는 형광 방출 방법 또는 이온 검출 방법과 같은 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 형광 표지된 뉴클레오티드의 세트를 시스템 (216)에 제공할 수 있고, 웰 (218)로 이동시킬 수 있다. 여기 에너지를 또한 웰 (218)에 제공할 수 있다. 뉴클레오티드가 폴리머라제에 의해서 포획되고, 연장 프라이머의 단부에 첨가될 때, 뉴클레오티드의 표지가 형광을 내어서, 어떤 유형의 뉴클레오티드가 첨가되는지를 나타낸다.
대안적인 예에서, 단일 유형의 뉴클레오티드를 포함하는 용액을 순차적으로 공급할 수 있다. 뉴클레오티드 첨가에 대한 반응으로, 웰 (218)의 국부 환경 내의 pH가 변화될 수 있다. 이러한 pH 변화는 이온 감수성 전계 효과 트랜지스터 (ISFET)에 의해서 검출될 수 있다. 이와 같이, pH 변화를 사용하여 입자 (210)의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드의 순서를 나타내는 신호를 생성할 수 있다.
특히, 서열분석 시스템은 이온 센서, 예컨대 전계 효과 트랜지스터 (FET)의 센서 패드 상에 배치된 웰 또는 다수의 웰을 포함할 수 있다. 실시양태에서, 시스템은 이온 센서 (예를 들어, FET)의 센서 패드 상에 배치된 웰 내에 적재된 하나 이상의 중합체성 입자, 또는 이온 센서 (예를 들어, FET)의 센서 패드 상에 배치된 다수의 웰 내에 적재된 하나 이상의 중합체성 입자를 포함한다. 실시양태에서, FET는 켐FET(chemFET) 또는 ISFET일 수 있다. "켐FET" 또는 화학 전계-효과 트랜지스터는 화학적 센서로서 작용하는 전계 효과 트랜지스터의 유형을 포함한다. 켐FET는 게이트 전극 상의 전하가 화학적 방법에 의해서 인가되는 MOSFET 트랜지스터의 구조적 유사체를 갖는다. "ISFET" 또는 이온-감수성 전계-효과 트랜지스터는 용액 중의 이온 농도를 측정하기 위해서 사용될 수 있으며, 이온 농도 (예컨대 H+)가 변할 때, 트랜지스터를 통과하는 전류가 이에 따라서 변한다.
실시양태에서, FET는 FET 어레이일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "어레이"는 부재, 예컨대 센서 또는 웰의 평탄한 배열이다. 어레이는 1차원 또는 2차원일 수 있다. 1차원 어레이는 제1 치수에서 부재의 하나의 칼럼 (또는 열) 및 제2 치수에서 다수의 칼럼 (또는 열)을 갖는 어레이일 수 있다. 제1 치수 및 제2 치수에서 칼럼 (또는 열)의 수는 동일하거나 동일하지 않을 수 있다. FET 또는 어레이는 102, 103, 104, 105, 106, 107개 이상의 FET를 포함할 수 있다.
실시양태에서, 하나 이상의 마이크로유체 구조체 FET 센서 어레이 위에 제조하여 생물 또는 화학 반응을 밀폐시키고 봉쇄한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 마이크로유체 구조체(들)는 어레이의 하나 이상의 센서 상에 배치된 하나 이상의 웰 (또는 미세웰, 또는 반응 챔버, 또는 반응 웰 (이 용어들은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용됨))로서 구성되어 주어진 웰 위의 하나 이상의 센서가 주어진 웰 내에서 분석물 존재, 수준 또는 농도를 검출하도록 배치된다. 실시양태에서, FET 센서 및 반응 웰의 대응치는 1:1일 수 있다.
도 2로 돌아와서, 또 다른 예에서, 웰의 어레이의 웰 (218)은 측정 장치에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 형광 방출 방법에서, 웰 (218)은 광 검출 장치에 작동가능하게 커플링될 수 있다. 이온 검출의 경우에, 웰 (218)의 하부 표면이 이온 센서, 예컨대 전계 효과 트랜지스터의 센서 패드 위에 배치될 수 있다.
뉴클레오티드 도입의 이온성 부산물의 검출을 통한 서열분석을 포함하는 예시적인 한 시스템은 이온 토렌트 PGM(Ion Torrent PGM)™ 서열분석기 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))이며, 이것은 뉴클레오티드 도입의 부산물로서 생성되는 수소 이온을 검출함으로써 핵산 주형을 서열분석하는 이온-기반 서열분석 시스템이다. 전형적으로, 수소 이온은 폴리머라제에 의한 주형-의존성 핵산 합성 동안 발생하는 뉴클레오티드 도입의 부산물로서 방출된다. 이온 토렌트 PGM™ 서열분석기는 뉴클레오티드 도입의 수소 이온 부산물을 검출함으로써 뉴클레오티드 도입을 검출한다. 이온 토렌트 PGM™ 서열분석기는 서열분석하고자 하는 다수의 주형 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 각각의 주형은 어레이에서 각각의 서열분석 반응 웰 내에 배치된다. 어레이의 웰은 뉴클레오티드 도입의 부산물로서 생성되는 H+ 이온의 방출 또는 용액 pH의 변화를 검출할 수 있는 적어도 하나의 이온 센서에 각각 커플링될 수 있다. 이온 센서는 H+ 이온의 존재 또는 용액 pH의 변화를 감지할 수 있는 이온-감수성 검출 층에 커플링된 전계 효과 트랜지스터 (FET)를 포함한다. 이온 센서는 뉴클레오티드 도입을 나타내는 출력 신호를 제공할 수 있으며, 이것은 강도가 각각의 웰 또는 반응 챔버 내의 H+ 이온 농도와 상관되는 것을 전압 변화로서 표현할 수 있다. 상이한 뉴클레오티드 유형이 반응 챔버로 직렬로(serially) 유동할 수 있고, 주형의 서열에 의해서 결정되는 순서로 폴리머라제에 의해서 연장 프라이머 (또는 중합 부위)에 도입될 수 있다. 각각의 뉴클레오티드 도입은 수반되는 국부적인 pH 변화와 함께, 반응 웰에서 H+ 이온의 방출을 동반할 수 있다. H+ 이온의 방출은 센서의 FET에 의해서 인지될 수 있으며, 이것은 뉴클레오티드 도입의 발생을 나타내는 신호를 생성한다. 특정 뉴클레오티드 유동 동안 도입되지 않은 뉴클레오티드는 신호를 생성하지 않을 수 있다. FET로부터의 신호의 진폭은 또한 연장 핵산 분자에 도입된 특정 유형의 뉴클레오티드의 수와 상관되어, 단독중합체 영역을 분석할 수 있도록 한다. 따라서, 서열분석기의 작동 동안, 도입과 함께 다수의 뉴클레오티드가 반응 챔버로 유동하고, 다수의 웰 또는 반응 챔버 전체의 모니터링은 장비가 동시에 많은 핵산 주형의 서열을 분석할 수 있도록 한다. 이온 토렌트 PGM™ 서열분석기의 조성, 설계 및 작동에 관한 추가의 상세 사항은 예를 들어, 미국 특허 출원 일련 번호 12/002781 (현재 미국 특허 공개 번호 2009/0026082로서 공개되고, 미국 특허 번호 8,262,900으로 공고됨); 미국 특허 출원 일련 번호 12/474897 (현재 미국 특허 공개 번호 2010/0137143으로서 공개됨); 및 미국 특허 출원 일련 번호 12/492844 (현재 미국 특허 공개 번호 2010/0282617로서 공개됨)에서 찾아볼 수 있으며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
중합체성 입자의 실시양태는 서열분석 기술, 특히 이온-기반 서열분석 기술에서 사용되는 경우에 기술적인 이점을 나타낸다. 특히, 중합체성 입자의 실시양태는 비-완충성(non-buffering)이거나, 또는 판독 길이(read length) 또는 정확성을 증진시킨다.
추가 예에서, 중합체성 입자는 (필터링을 하지 않고도) 다른 방법을 통해서 제조된 입자보다 더 균일하고, 더 낮은 CV를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 임의의 종류의 선택 방법, 예컨대 필터링을 적용하거나 또는 원심분리를 사용하지 않고 중합체 입자를 직접 형성할 수 있다. 특히, 유화 중합을 사용하여 시드 입자에 적합한 입자를 제조할 수 있다. 전형적으로, 시드 입자는 비가교성이어서 촉진제 분자를 흡착할 수 있다.
보통 스티렌을 사용하여 5％ 미만의 CV를 갖는 시드 입자를 생성하며, 다른 단량체의 정보는 제한적이다. 예상치 못하게 그리고 이롭게, tBDMS HEAM을 사용하여 상기에 기재된 방법, 예컨대 유화 중합 방법을 사용하여 2％의 CV를 갖는 시드를 제조할 수 있다.
추가로, 본 방법의 실시양태는 시드 입자의 크기를 기초로 크기 제어를 제공한다. 추가로, 상기 방법에 의해서 제조된 입자의 실시양태는 접합 증가, 예컨대 다른 방법에 비해서 예컨대 60％ 내지 80％의 접합 증가를 제공한다.
예를 들어, 이온 토렌트 314 PGM 상에서 측정하는 경우, 접합된 중합체성 입자의 실시양태는 적어도 200 bp, 예컨대 적어도 250 bp, 적어도 300 bp, 적어도 350 bp, 또는 심지어는 적어도 400 bp의 Q17 평균 판독 길이를 나타낸다. 특히, 접합된 중합체성 입자는 적어도 500 bp의 Q17 평균 판독 길이를 나타낼 수 있다. 또 다른 예에서, 접합된 중합체성 입자의 집단은 적어도 200K, 예컨대 적어도 300K, 적어도 350K, 또는 심지어는 적어도 400K의 200Q 17 런(run)을 나타낸다.
실시예
실시예 1
실릴 보호된 아크릴아미드 단량체, (N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드)를 히드록시알킬아크릴아미드 단량체 및 할로겐화 실릴 기로부터 형성하였다.
t-부틸디메틸실릴 클로라이드 (66.11 g, 439 mmol)를 불활성 분위기 (Ar) 하의 0℃에서 DMF (132 g) 중의 히드록시 에틸아크릴아미드 (50.01 g, 434 mmol) 및 이미다졸 (73.94 g, 1086 mmol)의 용액에 30분 간격으로 3번으로 나누어서 첨가하였다. 나머지 DMF (18.90 g)를 마지막 첨가 15분 후에 첨가하였다. 반응 혼합물을 서서히 실온으로 도달시키고, 대략 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물 (101 g)로 켄칭하고, 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 디에틸 에테르로 추출하고, 물 및 염수로 세척하였다. 유기상을 (MgSO4)로 밤새 건조하였다. 증발시켜서 93.59 g의 생성물을 제공하였다. 4-메톡시페놀 (MEHQ) (9 mg, 100 ppm)을 증발의 마지막에 첨가하였다. 생성물을 -20℃에서 저장하였다.
실시예 2
실릴 보호된 아크릴아미드 단량체, (N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드) (tBDMS-HEAM)를 분산된 상 중에서 중합시키고, 탈보호시켜서 히드로겔 입자를 형성하였다.
울트라투락스 유형 이스트랄(ultraturax type Ystral)™ XI 0/25 균질화기 ("울트라투락스")를 사용하여 소듐 도데실 술페이트 (SDS) 1.14 g, 물 190 g, 아세톤 9.50 g, 및 디옥타노일퍼옥시드 19.0 g을 2분 동안 혼합하고, 압력 균질화기를 사용하여 7분 동안 균질화시켜서 개시제 현탁액을 형성하였다.
0.5 L 플라스크에서, 7.2 중량％의 고체 함량을 갖는 0.53 마이크로미터의 단분산 폴리스티렌 시드 분산액 202.42 g을 개시제 현탁액 115.65 g과 혼합하였다. 혼합물을 26℃에서 20시간 동안 교반하여 촉진된 시드 용액을 제공하였다.
폴리비닐피롤리돈 (PVP) K-30 16.02 g으로부터 PVP 용액을 형성하였다. K-30을 물 959 g에 천천히 첨가하고, 30분 동안 교반한 후 SDS 1.08 g을 첨가하였다.
물 912 g에 첨가된 중탄산나트륨 47.99 g로부터 완충 용액을 제조하였다.
울트라투락스로 2분 동안 혼합되고, 5분 동안 추가로 균질화된 톨루엔 19.63 g, tBDMS-HEAM 11.49 g, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 (EDMA) 0.77 g, 물 187.42 g 및 PVP 용액 186.4 g으로부터 단량체 에멀젼을 제조하였다.
0.5 L 반응기에서, 촉진된 시드 입자 29.45 g 및 단량체 에멀젼 189.93 g을 첨가한 후 완충 용액 26.65 g을 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 25℃에서 교반하고, 이어서 물 53.33 g을 첨가하였다. 혼합물을 60℃로 가열하였다. 60℃에서 1시간 후, 온도를 70℃로 상승시키고, 70℃에서 5시간 동안 유지시켰다.
반응 혼합물을 1 리터 원심분리 플라스크로 옮기고, 소르발 RC3C플러스(Sorvall RC3CPlus) 원심분리기에서 60분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 크림성 부유 생성물을 새로운 1 리터 플라스크로 옮기고, 테트라히드로푸란 (THF) 중에서 2회 원심분리하였다.
THF 팽윤된 겔 침전물을 1:3:1 중량비로 빙초산 및 물과 혼합하고, 실온에서 밤새 진탕하였다. 원심분리 후 상청액을 제거하고, THF:물 1:1 비율의 THF 및 물의 혼합물을 2회 그리고 물을 1회 첨가한 후, 디메틸포름아미드 (DMF)를 3회 첨가하고, 무수 DMF를 3회 첨가함으로써 겔을 처리하였다.
실시예 3
실릴 보호된 아크릴아미드 단량체, (N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드) (tBDMS-HEAM)를 폴리스티렌 입자로부터 형성된 분산된 상 중에서 중합시키고, 탈보호시켜서 히드로겔 입자를 형성하였다.
물 800 g에 첨가된 중탄산나트륨 42.1 g으로부터 카르보네이트 완충 용액을 제조하여 0.5 M 완충 용액을 제공하였다. 0.5 M 수산화나트륨을 사용하여 완충액의 pH를 10으로 조정하였다.
SDS 0.96 g, 물 160 g, 아세톤 8.00 g, 및 디옥타노일퍼옥시드 16.0 g으로부터 개시제 현탁액을 제조하였다. 0.5 M 카르보네이트 완충 용액을 사용하여 pH를 9로 조정하였다. 혼합물을 울트라투락스 유형 이스트랄™ XI 0/25 균질화기 ("울트라투락스")로 2분 동안 균질화시키고, 압력 균질화기로 6분 동안 균질화시켰다.
0.5 L 플라스크에서, 15.91 중량％의 고체 함량을 갖는 0.31 마이크로미터의 단분산 폴리스티렌 시드 분산액 31.2 g을 개시제 현탁액 103.1 g과 혼합하였다. 혼합물을 26℃에서 20시간 동안 혼합하여, 촉진된 시드 분산액을 제공하였다.
87 내지 89％ 가수분해된 폴리비닐알콜 (PVA) 80 g을 물 2000 g에 천천히 첨가하고, 1시간 동안 80℃로 가열하고, 냉각하여 PVA 용액을 제조하였다. PVA 용액의 양 91 g을 물 867 g, SDS 0.74 g 및 0.5 M 탄산나트륨 완충액 4.24 g과 혼합하였다.
울트라투락스로 2분 동안 혼합되고, 5분 동안 추가로 균질화된 톨루엔 29.2 g, tBDMS-HEAM 7.71 g, EDMA 0.76 g, 및 PVA 용액 249 g으로부터 단량체 에멀젼을 제조하였다.
0.5 L 반응기에, 촉진된 시드 입자 13.3 g 및 단량체 에멀젼 287 g을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 25℃에서 교반하고, 50℃로 가열하였다. 50℃에서 1시간 후, 온도를 70℃로 상승시켰다. 2시간 후, 0.5 M 완충 용액 2.8 ml를 첨가하고, 온도를 1시간 이상 동안 유지시켰다.
반응 혼합물을 1 리터 원심분리 플라스크로 옮기고, 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 60분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 크림성 부유 생성물을 새로운 1 리터 플라스크로 옮기고, THF 중에서 2회 원심분리하였다.
THF 팽윤된 겔 침전물 102 g에 1:3:1 중량비로 빙초산 및 물을 첨가하고, 분산액을 실온에서 밤새 진탕하였다. 원심분리 후 상청액을 제거하고, THF:물 1:1 비율의 THF 및 물을 2회 첨가한 후, DMF로 3회 원심분리하고, 무수 DMF로 3회 원심분리함으로써 겔을 처리하였다.
생성물의 고체 함량은 0.48 g으로 측정되었고, 물 중의 비드의 직경은 현미경검사에 의해서 1.6 마이크로미터로 측정되었다.
실시예 4
실시예 3에 따라서 형성된 히드로겔 입자를 트레실 클로라이드를 사용하여 활성화시켰다.
특히, 상기 실시예 3으로부터의 3.08 ％ 히드록실 겔을 함유하는 DMF 분산액 26 g을 원심분리에 의해서 무수 DMF 30 ml로 3회 세척하고, 상청액을 제거하였다. 마지막 원심분리 후, DMF 중의 겔의 부피를 26 mL로 조정하고, 튜브를 아르곤으로 짧게 플러싱(flushing)하였다. 무수 피리딘 0.241 ml의 양을 첨가한 후 트레실 클로라이드 0.318 g을 첨가하였다. 튜브를 밤새 진탕하였다. 분산액을 빙냉 무수 DMF 30 ml로 4회 원심분리하고, 각각의 원심분리 후에 상청액을 제거하고 빙냉 무수 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP)으로 2회 원심분리하였다. 입자를 무수 NMP 50 mL (2％ 무수) 중에 재현탁시켰다.
실시예 5
실시예 3에 따라서 형성된 히드로겔 입자를 포실 클로라이드를 사용하여 활성화시켰다.
실시예 3으로부터의 3.08％ 히드록실 겔을 함유하는 DMF 분산액 26 g의 양을 원심분리에 의해서 무수 DMF 30 ml로 3회 세척하고, 상청액을 제거하였다. 마지막 원심분리 후, DMF 중의 겔의 부피를 26 mL로 조정하고, 튜브를 아르곤으로 짧게 플러싱하였다. 무수 피리딘 0.080 ml의 양을 첨가한 후 포실 클로라이드 0.113 g을 첨가하였다. 튜브를 밤새 진탕하고, 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 빙냉 무수 DMF 30 ml를 4회 첨가하고, 빙냉 무수 NMP를 2회 첨가하였다. 입자를 무수 NMP 50 mL (2％ 무수) 중에 재현탁시켰다.
실시예 6
실시예 3에 따라서 형성된 히드로겔 입자를 메실 클로라이드를 사용하여 활성화시켰다.
실시예 3으로부터의 3.08％ 히드록실 겔을 함유하는 DMF 16 g의 양을 원심분리에 의해서 무수 DMF 30 ml로 3회 세척하고, 상청액을 제거하였다. 마지막 원심분리 후, DMF 중의 겔의 부피를 16 mL로 조정하고, 튜브를 아르곤으로 짧게 플러싱하였다. 무수 피리딘 0.049 ml의 양을 첨가한 후 메실 클로라이드 0.121 g을 첨가하였다. 튜브를 밤새 진탕하고, 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 빙냉 무수 DMF 30 ml를 4회 첨가하고, 빙냉 무수 NMP를 2회 첨가하였다. 입자를 무수 NMP 50 mL (2％ 무수) 중에 재현탁시켰다.
실시예 7
실릴 보호된 아크릴아미드 단량체, (N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드) (tBDMS-HEAM)를 폴리스티렌 입자로부터 형성된 분산된 상 중에서 디비닐 벤젠 가교제와 중합시키고, 탈보호시켜서 히드로겔 입자를 형성하였다.
울트라투락스 유형 이스트랄™ X10/25 균질화기 ("울트라투락스")로 2분 동안 혼합되고, 압력 균질화기로 7분 동안 균질화된 SDS 1.26 g, 물 210 g, 아세톤 10.5 g 및 디옥타노일퍼옥시드 21.0 g로부터 개시제 에멀젼을 제조하였다.
0.5 L 플라스크에서, 15.9 중량％의 고체 함량을 갖는 0.31 마이크로미터의 단분산 폴리스티렌 시드 분산액 40.7 g을 개시제 에멀젼 142.2 g과 혼합하였다. 혼합물을 26℃에서 48시간 동안 교반하여, 촉진된 시드 분산액을 제공하였다.
물 2000 g에 폴리비닐알콜 (PVA) 80 g을 천천히 첨가하고, 80℃로 1시간 동안 교반 및 가열하여 PVA 용액을 제조하였다. 이어서, PVA 용액을 냉각시켰다.
진한 PVA 용액 208 g에 물 1806 g, SDS 1.76 g 및 보락스(borax) 7.68 g을 첨가하여 PVA 보락스 용액을 형성하였다.
톨루엔 31.08 g, tBDMS HEAM 9.79 g, 80％ 디비닐벤젠 (DVB) (DVB 0.296 g 및 에틸비닐벤젠 0.074 g을 포함함) 0.37 g, PVA 보락스 용액 273.7 g의 양을 울트라투락스로 2분 동안 혼합하고, 5분 동안 추가로 균질화시켜서 단량체 에멀젼을 형성하였다.
0.5 L 반응기에서, 촉진된 시드 입자 10.1 g을 단량체 에멀젼 289.9 g과 혼합하였다. 혼합물을 1시간 동안 30℃에서, 1시간 동안 50℃에서, 2시간 동안 75℃에서 교반하였다.
반응 혼합물을 1 리터 원심분리 플라스크로 옮기고, 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 80분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 크림성 부유 생성물을 수집하고, THF 중에서 6회 원심분리하였다.
THF 팽윤된 겔 침전물 160 g에 1:3:1 중량비의 빙초산 및 물을 첨가하였다. 분산액을 실온에서 밤새 진탕하였다. 원심분리 후 상청액을 제거하고, THF:물 1:1 비율의 THF 및 물을 2회 그리고 물을 1회 첨가한 후 DMF를 3회 첨가하여 겔을 처리하였다. 이어서, DMF의 고체 함량은 1.01 g으로 측정되었다. 비드 분산액을 물로 옮기고, 현미경검사에 의해서 관찰하였다. 비드는 단일 크기였으며, 비드 직경은 1.9 마이크로미터였다.
실시예 8
실릴 보호된 아크릴아미드 단량체, (N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드) (tBDMS-HEAM)를 폴리스티렌 입자로부터 형성된 분산된 산 중에서 보호된 가교제와 중합시키고, 탈보호시켜서 히드로겔 입자를 형성하였다.
물 2000 g에 천천히 첨가된 폴리비닐알콜 (PVA) 80 g으로부터 진한 PVA 용액을 제조하였다. 용액을 80℃로 1시간 동안 교반 및 가열하고, 냉각하였다.
진한 PVA 용액 160.5 g, 물 1425 g, SDS 1.56 g 및 보락스 6.06 g을 첨가하였다. 용액의 pH를 2M HCl을 사용하여 8.2로 조정하였다.
톨루엔 11.8 g, 3-페닐프로판올 11.80 g, 2,2'-아조비스-(2-메틸부티로니트릴) (AMBN) 0.15 g, tBDMS HEAM 7.78 g, N,N'-(N-(2-((트리에틸실릴)옥시)프로판-1,3-디일)디아크릴아미드(TES-PBAM) (순도 82％) 1.44 g 및 PVA 보락스 용액 291.6 g의 양을 울트라투락스로 2분 동안 혼합하고, 추가로 5분 동안 균질화시켜서 단량체 에멀젼을 형성하였다.
0.5 L 반응기에서, 폴리스티렌 시드 입자의 수 분산액 (시드 직경 0.385 μm, 고체 8.08 중량％) 5.96 g을 단량체 에멀젼 294.5 g과 혼합하였다. 1시간 동안 30℃에서, 그리고 1시간 동안 50℃에서 가열 및 교반하면서, 아르곤 기체 (10 내지 20 ml/min)를 혼합물에 버블링하였다. 아르곤 유동을 중단하고, 가열 및 교반을 3시간 동안 80℃에서 계속하였다.
반응 혼합물을 1 리터 원심분리 플라스크로 옮기고, 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 50분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 크림성 부유 생성물을 수집하고, THF 중에서 4회 원심분리하였다.
THF 팽윤된 겔 침전물 209 g에 빙초산 209 g 및 물 105 g을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 진탕하였다. 원심분리 후 상청액을 제거하고, THF:물 1:1 비율의 THF 및 물을 2회 그리고 물을 1회 첨가한 후, DMF를 3회 첨가함으로써 겔을 처리하였다.
분산액의 고체 함량은 1.97 g으로 측정되었다. 수 팽윤된 겔의 직경을 위상 대조(phase contrast) 장비를 갖는 현미경으로 측정할 수 있고, 1.9 μm로 측정되었다. CV는 5.0％이하였다.
실시예 9
실릴 보호된 아크릴아미드 단량체, (N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드) (tBDMS-HEAM)를 폴리스티렌 입자로부터 형성된 분산된 상 중에서 N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드(tBDMS EBHEAM) 가교제와 중합시키고, 탈보호시켜서 히드로겔 입자를 형성하였다.
물 2000 g에 천천히 첨가된 폴리비닐알콜 (PVA) 80 g으로부터 진한 PVA 용액을 형성한 후 80℃로 1시간 동안 교반 및 가열하고, 냉각시켰다.
진한 PVA 용액 88 g에 물 785 g, SDS 0.88 g 및 보락스 3.33 g을 첨가하여 PVA 보락스 용액을 형성하였다.
울트라투락스로 2분 동안 혼합되고, 추가로 5분 동안 균질화된 톨루엔 7.82 g, 2,2'-아조비스-(2-메틸부티로니트릴) (AMBN) 0.040 g, tBDMS HEAM 2.06 g, tBDMS-EBHEAM (순도 95) 0.51 g 및 PVA 보락스 용액 92.9 g으로부터 단량체 에멀젼을 형성하였다.
0.5 L 반응기에서, 시드 입자의 수 분산액 (시드 직경 0.319 μm, 고체 8.07 중량％) 1.65 g을 단량체 에멀젼 88.34 g과 혼합하였다. 1시간 동안 30℃에서, 그리고 2시간 동안 40℃에서 가열 및 교반하면서, 아르곤 기체 (10 내지 20 ml/min)를 혼합물에 버블링하였다. 아르곤 유동을 중단하고, 가열 및 교반을 3시간 동안 80℃에서 계속하였다.
반응 혼합물을 1 리터 원심분리 플라스크로 옮기고, 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 50분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 크림성 부유 생성물을 수집하고, THF 중에서 2회 원심분리하였다.
THF 팽윤된 겔 침전물 83.9 g에 동일한 중량의 빙초산 및 1/2 중량의 물을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 진탕하였다. 원심분리 후 상청액을 제거하고, THF:물 1:1 비율의 THF 및 물을 2회 그리고 물을 1회 첨가한 후, DMF를 3회 첨가함으로써 겔을 처리하였다.
분산액의 고체 함량은 1.63 g으로 측정되었다. 수 팽윤된 겔의 직경을 위상 대조 장비를 갖는 현미경으로 측정할 수 있고, 평균 1.6 μm로 측정되었다. CV는 5.0％이하였다.
실시예 10
실릴 보호된 아크릴아미드 단량체, (N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드) (tBDMS-HEAM)를 폴리스티렌 입자로부터 형성된 분산된 상 중에서 디비닐 벤젠 (DVB) 가교제와 중합시키고, 탈보호시켜서 히드로겔 입자를 형성하였다.
울트라투락스 유형 이스트랄™ X10/25 균질화기 ("울트라투락스")로 2분 동안 혼합되고, 압력 균질화기로 7분 동안 균질화된 SDS 1.2 g, 물 200 g, 아세톤 10 g 및 디옥타노일퍼옥시드 20.0 g으로부터 개시제 에멀젼을 제조하였다.
0.5 L 플라스크에서, 4.55 중량％의 고체 함량을 갖는 0.13 마이크로미터의 단분산 폴리스티렌 시드 분산액 31.64 g을 개시제 에멀젼 15.84 g과 혼합하였다. 혼합물을 26℃에서 6일 동안 교반하여, 촉진된 시드 분산액을 제공하였다.
SDS 5.92 g 및 보락스 7.33 g과 혼합된 물 1922 g을 사용하여 보락스 용액을 제조하였다.
울트라투락스로 혼합되고, 17분 동안 추가로 균질화된 톨루엔 172.4 g, tBDMS HEAM 54.76 g, 80％ 디비닐벤젠 (DVB) (DVB 2.2 g 및 에틸비닐벤젠 0.55 g을 포함함) 2.75 g 및 보락스 용액 1468 g으로부터 단량체 에멀젼을 제조하였다.
0.5 L 반응기에서, 촉진된 시드 입자 22.6 g을 단량체 에멀젼 277.6 g과 혼합하였다. 혼합물을 1시간 동안 30℃에서, 1시간 동안 40℃에서, 2시간 동안 75℃에서 교반하였다.
반응 혼합물을 1 리터 원심분리 플라스크로 옮기고, 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 90분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 크림성 부유 생성물을 수집하고, THF 중에서 4회 원심분리하였다.
THF 팽윤된 겔 침전물 73.3 g에 동일한 중량의 빙초산 및 물 36.7 g을 첨가하고, 분산액을 실온에서 밤새 진탕하였다. 원심분리 후 상청액을 제거하고, THF:물 7:3 및 THF:물 6:4 비율의 THF 및 물을 첨가한 후 DMF로 3회 원심분리하여 겔을 처리하였다.
분산액의 고체 함량은 1.50 g으로 측정되었다.
실시예 11
실릴 보호된 아크릴아미드 단량체, (N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드) (tBDMS-HEAM)를 폴리스티렌 입자로부터 형성된 분산된 상 중에서 DVB 가교제와 중합시키고, 탈보호시켜서 친수성 입자를 형성하였다.
물 2000 g에 천천히 첨가된 폴리비닐알콜 (PVA) 80 g으로부터 진한 PVA 용액을 제조하였다. 분산액을 80℃로 1시간 동안 교반 및 가열하고, 냉각하였다.
진한 PVA 용액 208 g에, 물 1814 g, SDS 2.08 g 및 보락스 7.71 g을 첨가하여 PVA 보락스 용액을 형성하였다.
울트라투락스로 2분 동안 혼합되고, 추가로 5분 동안 균질화된 톨루엔 22.34 g, 2,2'-아조비스-(2-메틸부티로니트릴) (AMBN) 0.164 g, tBDMS HEAM 16.58 g, 80％ 디비닐벤젠 (DVB 2.77 g 및 에틸비닐벤젠 0.69 g을 포함함) 3.46 g 및 PVA 보락스 용액 275 g으로부터 단량체 에멀젼을 제조하였다.
0.5 L 반응기에서, 시드 입자의 수 분산액 (시드 직경 0.550 μm, 고체 7.20 중량％) 8.46 g을 단량체 에멀젼 292.15 g과 혼합하였다. 혼합물을 1시간 동안 30℃에서, 1시간 동안 50℃에서, 2시간 동안 75℃에서 교반 및 가열하였다.
반응 혼합물을 1 리터 원심분리 플라스크로 옮기고, 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 50분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 크림성 부유 생성물을 수집하고, THF 중에서 2회 원심분리하였다.
THF 팽윤된 겔 침전물 83.9 g에, 동일한 중량의 빙초산 및 1/2 중량의 물을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 진탕하였다. 원심분리 후 상청액을 제거하고, THF:물 1:1 비율의 THF 및 물을 2회 그리고 물을 1회 첨가한 후, DMF를 3회 첨가함으로써 겔을 처리하였다.
DMF의 고체 함량은 7.5 g이었다. 수 팽윤된 겔의 직경을 위상 대조 장비를 갖는 현미경으로 측정할 수 있고, 평균 1.8 μm로 측정되었다. CV는 5.0％이하였다.
실시예 12
실릴 보호된 아크릴아미드 단량체, (N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드) (tBDMS-HEAM)를 폴리스티렌 입자로부터 형성된 분산된 상 중에서 tBDMS-EBHEAM 가교제와 중합시키고, 탈보호시켜서 히드로겔 입자를 형성하였다.
물 2000 g에 천천히 첨가된 폴리비닐알콜 (PVA) 80 g으로부터 진한 PVA 용액을 형성한 후 80℃에서 1시간 동안 교반 및 가열하고, 냉각하였다.
진한 PVA 용액 88 g에, 물 785 g, SDS 0.88 g, 및 보락스 3.33 g을 첨가하여 PVA 보락스 용액을 형성하였다.
울트라투락스로 2분 동안 혼합되고, 추가로 5분 동안 균질화된 톨루엔 7.82 g, 2,2'-아조비스-(2-메틸부티로니트릴) (AMBN) 0.040 g, tBDMS HEAM 2.06 g, tBDMS-EBHEAM (순도 95) 0.96 g 및 PVA 보락스 용액 92.9 g으로부터 단량체 에멀젼을 형성하였다.
0.5 L 반응기에서, 시드 입자의 수 분산액 1.65 g (시드 직경 0.319 μm, 고체 8.07 중량％)을 단량체 에멀젼 88.34 g과 혼합하였다. 1시간 동안 30℃에서, 그리고 2시간 동안 40℃에서 가열 및 교반하면서, 아르곤 기체 (10 내지 20 ml/min)를 혼합물에 버블링하였다. 아르곤 유동을 중단하고, 가열 및 교반을 3시간 동안 80℃에서 계속하였다.
반응 혼합물을 1 리터 원심분리 플라스크로 옮기고, 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 50분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 크림성 부유 생성물을 수집하고, THF 중에서 2회 원심분리하였다.
THF 팽윤된 겔 침전물 83.9 g에, 동일한 중량의 빙초산 및 1/2 중량의 물을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 진탕하였다. 원심분리 후 상청액을 제거하고, THF:물 1:1 비율의 THF 및 물을 2회 그리고 물을 1회 첨가한 후, DMF를 3회 첨가함으로써 겔을 처리하였다.
분산액의 고체 함량은 1.63 g으로 측정되었다. 수 팽윤된 겔의 직경을 위상 대조 장비를 갖는 현미경으로 측정할 수 있고, 평균 1.6 μm로 측정되었다. CV는 5.0％이하였다.
실시예 13
실릴 보호된 아크릴아미드 단량체, (N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드) (tBDMS-HEAM)를 폴리스티렌 입자로부터 형성된 분산된 상 중에서 가교제로서의 N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드) (TBDMS EBHEAM)와 중합시키고, 탈보호시켜서 친수성 입자를 형성하였다.
교반하면서, 폴리비닐알콜 (PVA) 80 g을 물 2000 g에 천천히 첨가하여 진한 PVA 용액을 제조하였다. 혼합물을 80℃로 1시간 동안 교반 및 가열하고, 냉각하였다.
진한 PVA 용액 241.8 g에, 물 2129.6 g, SDS 2.32 g 및 보락스 9.97 g을 첨가하여 PVA 보락스 용액을 형성하였다.
울트라투락스로 2분 동안 혼합되고, 고압 가울린(Gauline) APV-100 균질화기에서 9분 동안 400 Bar로 추가로 균질화된 톨루엔 72.68 g, 2,2'-아조비스-(2-메틸부티로니트릴) (AMBN) 0.29 g, tBDMS HEAM 14.59 g, TBDMS EBHEAM 4.46 g 및 PVA 보락스 용액 835.8 g을 혼합하여 단량체 에멀젼을 제조하였다.
1 L 반응기에서, 시드 입자의 수 분산액 (시드 직경 0.319 μm, 고체 8.07 중량％) 16.86 g을 단량체 에멀젼 897 g과 혼합하였다. 처음 2시간 동안 0.05 l/min으로 그리고 1시간 동안 0.15 L/min으로 아르곤을 혼합물로 버블링하면서, 혼합물을 3시간 동안 40℃에서 교반 및 가열하였다. 이어서, 아르곤 유동을 중단하고, 에멀젼을 3시간 동안 80℃에서 가열하였다.
반응 혼합물을 1 리터 원심분리 플라스크로 옮기고, 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 60분 동안 4700 RPM으로 원심분리하였다. 크림성 부유 생성물을 새로운 500 mL 유리 플라스크로 옮기고, 물을 사용하여 370.74 g으로 재현탁시키고, 0.5 M 아세트산 21.09 g을 사용하여 pH를 3.86으로 조정하였다. 혼합물을 60℃에서 2시간 동안 교반하였다.
THF 9 부피를 탈보호된 겔에 첨가하고, 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 10분 동안 3500 RPM으로 원심분리한 후 DMF로 2회 원심분리하고, 무수 DMF로 2회 원심분리하여 겔을 처리하였으며, 이때 모든 원심분리 전에 7.5％ THF를 첨가하였다. DMF 중의 겔의 고체 함량은 6.37 g으로 측정되었다. 비드 분산액을 물로 옮기고, 현미경검사에 의해서 관찰하였고, 비드 직경은 물 중에서 1.7 마이크로미터였다.
실시예 14
실시예 13에 따라서 형성된 히드로겔 입자를 메탄술포닐 클로라이드를 사용하여 활성화시켰다.
DMF 중에 분산된 실시예 13으로부터의 히드록실 겔 1.51 g을 2개의 원심분리 병에 나누어 넣고, 200 ml의 무수 DMF 및 15 g의 무수 THF의 용매 혼합물을 사용하여 원심분리하고, 상청액을 제거함으로써 3회 세척하였다. 마지막 원심분리 후, 2개의 병의 내용물을 함께 모으고, 무수 DMF로 한번 더 세척하였다. 건조 함량은 2.32 중량％로 측정되었다.
상기로부터의 히드록실 겔 2.32 중량％를 함유하는 DMF 분산액 54.74 g을 기계적 교반기가 장치된 3구 둥근 바닥 가열 플라스크로 옮긴 후, DMF 8.76 g을 첨가하여 건조 함량을 2.00％로 조정하였다. 둥근 바닥 가열 플라스크를 아르곤으로 계속 플러싱하였다. 무수 피리딘 0.2077 g의 양을 첨가한 후 메탄술포닐 클로라이드 0.1692 g을 첨가하였다. 플라스크를 실온에서 밤새 교반하였다.
분산액을 무수 DMF 200 ml로 3회 원심분리하고, 각각의 원심분리 후 상청액을 제거하였고, 무수 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP) 중에 122.81 g 현탁액으로 재현탁시켰다. 건조 함량은 0.91％로 측정되었고, 활성화된 겔 입자 1.12 g을 제공하였다.
실시예 15
대략 280 x 106개의 히드로겔 입자를 실시예 11에 개시된 바와 같이 제조하고, 분산 상 액적 중에 존재하는 폴리뉴클레오티드의 복제를 용이하게 하기 위한 조건에 적용하였다.
히드로겔 입자를 DNA 라이브러리 (L499, 대략 70 x 106개의 분자) 및 앰플리택 골드® DNA 폴리머라제 (어플라이드 바이오시스템즈) 또는 KOD 핫 스타트 DNA 폴리머라제 (EMD 바이오사이언시스)의 존재 하에서 인큐베이션시켰다. 본질적으로 제조자의 설명서에 따라서, 샘플을 이온 원터치(Ion OneTouch)™ 시스템 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))에 적용하고, 주형화하고, 농축(enrichment)하였다. 농축 전 히드로겔 입자의 회수 백분율을 구아바 SYBR 골드 스테인 시스템(Guava SYBR Gold Stain system)을 사용하여 측정하였다. 본질적으로 제조자의 설명서 (라이프 테크놀로지스)에 따라서, 이온 원터치 ES™ 시스템 (라이프 테크놀로지스)을 사용하여 히드로겔 입자의 농축을 수행하였다. KOD 폴리머라제를 사용하는 경우, 히드로겔 입자에 대한 회수 후 백분율 (표 1)은 더 낮지만, 농축 후 총 회수 백분율은 KOD 폴리머라제를 사용하는 경우 (27.4％)가 앰플리택 골드® DNA 폴리머라제 (각각 9.5％ 및 18.2％)에 비해서 더 큰 것을 발견하였다.
Figure pct00002
실시예 14
중합체성 입자를 실시예 9에 따라서 제조하고, 술포네이트화시켜서 15％의 메실화를 제공하고, 아세테이트 및 진한 암모니아로 처리하였다. 접합 및 PCR 이후에, 중합체성 입자를 이온 토렌트 316 칩을 사용하는 서열분석 시험에 사용하였다.
중합체성 입자는 1.2 M의 200ql7 값, 예컨대 적어도 1.4 x 106을 나타내었다. 추가로, 중합체성 입자는 적어도 350 M, 예컨대 적어도 400 M의 aql7 베이스 시험을 나타내었다. 또한, 입자는 적어도 175, 예컨대 적어도 180의 ql7 평균을 나타내었다.
실시예 15
실릴 보호된 아크릴아미드 단량체, (N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드) (tBDMS-HEAM)를 폴리스티렌 입자로부터 형성된 분산된 상 중에서 tBDMS-EBHEAM 가교제와 중합시키고, 탈보호시켜서 히드로겔 입자를 형성하였다.
먼저 물 290.00 g 중에 SDS 1.74 g을 용해시키고, 이어서 아세톤 14.50 g 및 비스(2-에틸헥실) 아디페이트 (DOA) 29.00 g을 첨가하여 에멀젼을 제조하였다. 에멀젼을 울트라투락스로 2분 동안 혼합하고, 고압 가울린 APV-100 균질화기로 400 Bar에서 5.6분 동안 추가로 균질화시켰다.
이 에멀젼 31.14 g을 플라스크 내의 시드 입자 (시드 직경 0.140 μm, 고체 4.85 중량％) 43.89 g에 첨가하였다. 활성화를 위해서 진탕조에서 혼합물을 40℃에서 40시간 동안 진탕하였다.
물 2369.8 g에 SDS 4.54 g 및 보락스 9.69 g를 용해시켜서 SDS 보락스 용액을 제조하였다.
울트라투락스로 5분 동안 혼합되고, 9.68분 동안 추가로 균질화된 2-페네틸 아세테이트 125.29 g, 2,2'-아조비스-(2-메틸부티로니트릴) (AMBN) 0.468 g, tBDMS HEAM 19.51 g, tBDMS-EBHEAM 5.99 g 및 SDS 보락스 용액 816.75 g으로부터 단량체 에멀젼을 형성하였다.
1 L 반응기에서, 활성화된 시드 입자의 수 분산액 62.53 g을 단량체 에멀젼 938.1 g과 혼합하였다. 혼합물을 40℃에서 2시간 동안 교반 및 가열하였다. 아르곤 기체 (150 내지 200 ml/min)를 혼합물로 버블링하면서, 혼합물을 추가로 40℃에서 1시간 더 교반 및 가열하였다. 이때, 에멀젼 중의 O2의 양은 0 ppb로 측정되었다. 아르곤 유동을 중지하고, 가열 및 교반을 10시간 동안 70℃에서 계속하였다.
반응 혼합물을 4개의 250 mL 원심분리 플라스크로 옮기고, 베크만 쿨터 아반티(Beckman Coulter Avanti) J-20 XP 원심분리기에서 60분 동안 13000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 침전물을 수집하고, 물을 첨가하여 유리 플라스크로 옮겼다.
0.5 M 아세트산 용액을 첨가하여 겔의 수성 분산액의 pH를 3.8로 조정하였다. 산성화된 겔 분산액을 진탕조에서 60℃에서 2시간 동안 진탕하고, 냉각하였다.
겔 분산액을 3개의 1L 플라스크로 옮기고, THF 300 g을 각각에 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 30분 동안 실온에서 진탕하고, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific) 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 25분 동안 4500 RPM으로 심분리하였다. 생성된 2상 혼합물의 상부 상을 폐기하고, THF 50 g을 각각의 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 30분 동안 진탕하고, 25분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
각각의 플라스크의 내용물을 2개의 250 mL 원심분리기 플라스크에 나누어 넣었다. DMF 대략 100 g을 각각의 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 밤새 진탕하였다. THF 20 g 및 임의의 양의 DMF를 첨가하여 각각의 플라스크의 내용물을 총 200 g으로 만들었다. 플라스크를 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 70분 동안 13000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
DMF 대략 100 g을 각각의 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 40분 동안 실온에서 밤새 진탕하였다. THF 20 g 및 임의의 양의 DMF를 첨가하여 각각의 플라스크의 내용물을 총 200 g으로 만들었다. 플라스크를 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 70분 동안 13000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 최소량의 DMF를 사용하여 침전물 모두를 새로운 플라스크에 합쳤다.
분산액의 고체 함량은 2.34 g으로 측정되었다. 수 팽윤된 겔의 직경을 위상 대조 장비를 갖는 현미경으로 측정하였고, 평균 0.80 μm였다.
수 팽윤된 겔을 3 및 7 중량％의 수크로스 용액의 구배 및 15000 RPM의 회전 속도를 사용하여 디스크 원심분리 장비 (CPS 인스트루먼츠, 인크(CPS Instruments, Inc), 모델 DC20000)에서 추가로 분석하였다. 1,032 g/ml의 입자 밀도를 사용하여 직경은 0.4995 μm로서 측정되었다. CV (수)는 3.6％로 측정되었다.
실시예 16
실릴 보호된 아크릴아미드 단량체, (N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드) (tBDMS-HEAM)를 폴리스티렌 입자로부터 형성된 분산된 상 중에서 tBDMS-EBHEAM 가교제와 중합시키고, 탈보호시켜서 히드로겔 입자를 형성하였다.
먼저 물 330.05 g 중에 SDS 1.98 g을 용해시키고, 이어서 아세톤 16.51 g 및 DOA 33.00 g을 첨가하여 에멀젼을 제조하였다. 에멀젼을 울트라투락스로 2분 동안 혼합하고, 고압 가울린 APV-100 균질화기에서 400 Bar로 6.4분 동안 추가로 균질화시켰다.
이 에멀젼 37.71 g을 플라스크 내의 시드 입자 (시드 직경 0.081 μm, 고체 4.91 중량％) 68.57 g에 첨가하였다. 활성화를 위해서 혼합물을 40℃에서 20시간 동안 진탕하였다.
SDS 3.77 g 및 보락스 7.59 g을 물 1975.6 g 중에 용해시켜서 SDS 보락스 용액을 제조하였다.
울트라투락스로 5분 동안 혼합되고, 2.6분 동안 추가로 균질화된 2-페네틸 아세테이트 33.89 g, 2,2'-아조비스-(2-메틸부티로니트릴) (AMBN) 0.126 g, tBDMS HEAM 5.26 g, tBDMS-EBHEAM 1.61 g 및 SDS 보락스 용액 223.32 g으로부터 단량체 에멀젼을 형성하였다.
250 mL 반응기에서, 활성화된 시드 입자의 수 분산액 20.31 g을 단량체 에멀젼 228.23 g과 혼합하였다. 혼합물을 40℃에서 2시간 동안 교반 및 가열하였다. 아르곤 기체 (150 내지 200 ml/min)를 혼합물에 버블링하면서, 혼합물을 1시간 더 40℃에서 추가로 교반 및 가열하였다. 이때, 에멀젼 중의 O2의 양은 230 ppb로 측정되었다. 아르곤 유동을 중단하고, 10시간 동안 70℃에서 가열 및 교반을 계속하였다.
반응 혼합물을 250 mL 원심분리 플라스크로 옮기고, 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 90분 동안 12500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 침전물을 수집하고, 물을 첨가하여 유리 플라스크로 옮겼다.
0.5 M 아세트산 용액을 첨가하여 겔의 수성 분산액의 pH를 3.85로 조정하였다. 산성화된 겔 분산액을 60℃에서 진탕조 내에서 2.5시간 동안 진탕하고, 냉각하였다.
겔 분산액을 1L 플라스크로 옮기고, THF 170.06 g을 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 10분 동안 진탕하고, 써모 사이언티픽 써모 사이언티픽 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 30분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 생성된 2상 혼합물의 상부 상을 폐기하였다. THF 86.81 g을 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 15분 동안 진탕하고, 30분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
DMF 200 g을 1L 플라스크 내의 겔 침전물 상에 첨가하고, 이 현탁액을 2개의 250 mL 원심분리기 플라스크에 나누어 넣었다. 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 153분 동안 진탕하고, THF 30 g 및 임의의 양의 DMF를 첨가함으로써 각각의 플라스크의 내용물을 총 200 g으로 만들었다. 플라스크를 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 90분 동안 14000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
DMF 100 g을 각각의 플라스크에 첨가하고, 현탁액을 진탕 테이블 상에서 실온에서 20분 동안 진탕하였다. THF 30 g 및 임의의 양의 DMF를 첨가함으로써 각각의 플라스크의 내용물을 총 200 g으로 만들고, 플라스크를 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 90분 동안 14000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 최소량의 DMF를 사용하여, 모든 침전물을 새로운 플라스크에 합하였다. 분산액의 고체 함량은 2.03 g으로 측정되었다.
수 팽윤된 겔을 3 및 7 중량％의 수크로스 용액의 구배 및 20000 RPM의 회전 속도를 사용하여 디스크 원심분리 장비 (CPS 인스트루먼츠, 인크, 모델 DC20000)에서 추가로 분석하였다. 1.032 g/ml의 입자 밀도를 사용하여 직경은 0.2885 μm로서 측정되었다. CV (수)는 5.56 ％로 측정되었다.
실시예 17
보호된 아미노 아크릴아미드 단량체 (N-tert-부톡시카르보닐-N'-아크릴로일-피페라진)를 폴리스티렌 입자로부터 형성된 분산된 상 중에서 tBDMS-HEAM 단량체 및 tBDMS-EBHEAM 가교제와 중합시키고, 탈보호시켜서 아미노 히드로겔 입자를 형성하였다.
먼저 물 290.00 g 중에 SDS 1.74 g을 용해시키고, 이어서 아세톤 14.50 g 및 DOA 29.00 g을 첨가하여 에멀젼을 제조하였다. 에멀젼을 울트라투락스로 2분 동안 혼합하고, 고압 가울린 APV-100 균질화기에서 400 Bar로 5.6분 동안 추가로 균질화시켰다.
이 에멀젼 41.33 g을 플라스크 내의 시드 입자 (시드 직경 0.126 μm, 고체 4.59 중량％) 62.93 g에 첨가하였다. 혼합물을 활성화를 위해서 진탕조에서 40℃에서 40시간 동안 진탕하였다.
SDS 4.54 g 및 보락스 9.69 g을 물 2369.8 g에 용해시켜서 SDS 보락스 용액을 제조하였다.
울트라투락스로 5분 동안 혼합되고, 4분 동안 추가로 균질화된 2-페네틸 아세테이트 34.22 g, AMBN 0.13 g, tBDMS HEAM 4.98 g, tBDMS-EBHEAM 1.61 g, N-tert-부톡시카르보닐-N'-아크릴로일-피페라진 0.37 g 및 SDS 보락스 용액 221.73 g으로부터 단량체 에멀젼을 형성하였다.
250 mL 반응기에서, 활성화된 시드 입자의 수 분산액 17.09 g을 단량체 에멀젼 233.1 g과 혼합하였다. 혼합물을 40℃에서 2시간 동안 교반 및 가열하였다. 아르곤 기체 (150 내지 200 ml/min)를 혼합물로 버블링하면서, 혼합물을 1시간 더 40℃에서 추가로 교반 및 가열하였다. 이때, 에멀젼 중의 O2의 양은 500 ppb로 측정되었다. 아르곤 유동을 중단하고, 10시간 동안 70℃에서 가열 및 냉각을 계속하였다.
반응 혼합물을 250 mL 원심분리 플라스크로 옮기고, 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 60분 동안 12000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 침전물을 수집하고, 물을 첨가하여 유리 플라스크로 옮겼다.
0.5 M 아세트산 용액을 첨가하여 겔의 수성 분산액의 pH를 3.8로 조정하였다. 산성화된 겔 분산액을 진탕조에서 60℃로 2.5시간 동안 진탕하고, 냉각하였다.
겔 분산액을 1L 플라스크로 옮기고, THF 317.24 g을 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 30분 동안 진탕하고, 써모 사이언티픽 써모 사이언티픽 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 30분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 생성된 2상 혼합물의 상부 상을 폐기하였다. THF 169.63 g을 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 23분 동안 진탕하고, 플라스크를 30분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
물 대략 170 g을 겔 침전물 상에 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 밤새 진탕하였다. 플라스크를 30분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
물 대략 170 g을 겔 침전물 상에 첨가하였다.
히드로겔의 현탁액 32.2 g (고체 1.55 중량％)을 물 33 g으로 희석하였다. 2 M HCl 3.2 mL로 pH를 pH 1.0으로 조정하였다. 현탁액을 물 54 g과 함께 250 mL 반응기로 옮겼다. 현탁액을 60℃에서 18시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응 혼합물을 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP의 250mL 원심분리기 플라스크로 옮겼다.
현탁액을 먼저 물로 희석하고, 10 중량％ NaOH를 사용하여 약 pH 10으로 적정한 후, 원심분리함으로써 겔을 처리하여 총 중량 175 g을 제공하였다. 이것을 반복한 후, 물로 추가로 3회 겔을 후처리하였다. 이 방법 동안 원심분리 속도를 5분 동안 14500 rpm에서 6000 rpm으로 서서히 늦추었다. 상청액을 폐기한 후, 이어서 겔을 DMF로 175 g으로 희석하고, 수득된 현탁액을 밤새 진탕하였다. 6500 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기한 후, 상응하는 DMF로의 세척을 3회 이상 수행하여 후처리를 계속하였다.
겔을 NMP로 175 g으로 희석하고, 7000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 이어서, 건조 물질을 고체 0.29 중량％로 조정하여 현탁액 71 g을 생성하였다.
실시예 18
보호된 아미노 아크릴아미드 단량체 (N-플루오레닐메틸옥시카르보닐-N'-아크릴로일-피페라진)을 폴리스티렌 입자로부터 형성된 분산된 상 중에서 tBDMS-HEAM 단량체 및 tBDMS-EBHEAM 가교제와 중합시키고, 탈보호시켜서 아미노 히드로겔 입자를 형성하였다.
먼저 SDS 1.74 g을 물 290.00 g 중에 용해시키고, 이어서 아세톤 14.50 g 및 DOA 29.00 g을 첨가함으로써 에멀젼을 제조하였다. 에멀젼을 울트라투락스로 2분 동안 혼합하고, 5.6분 동안 고압 가울린 APV-100 균질화기에서 400 Bar로 추가로 균질화시켰다.
이 에멀젼 41.33 g을 플라스크 내의 시드 입자 (시드 직경 0.126 μm, 고체 4.59 중량％) 62.93 g에 첨가하였다. 혼합물을 활성화를 위해서 진탕조에서 40℃에서 40시간 동안 진탕하였다.
SDS 4.54 g 및 보락스 9.69 g을 물 2369.8 g에 용해시켜서 SDS 보락스 용액을 제조하였다.
울트라투락스로 5분 동안 혼합되고, 4분 동안 추가로 균질화된 2-페네틸 아세테이트 34.22 g, AMBN 0.13 g, tBDMS HEAM 4.98 g, tBDMS-EBHEAM 1.61 g, N-플루오레닐메틸옥시카르보닐-N'-아크릴로일-피페라진 0.59 g 및 SDS 보락스 용액 221.71 g으로부터 단량체 에멀젼을 형성하였다.
250 mL 반응기에서, 활성화된 시드 입자의 수 분산액 17.09 g을 단량체 에멀젼 233.23 g과 혼합하였다. 혼합물을 40℃에서 2시간 동안 교반 및 가열하였다. 아르곤 기체 (150 내지 200 ml/min)를 혼합물로 버블링하면서 혼합물을 1시간 더 40℃에서 추가로 교반 및 가열하였다. 이때, 에멀젼 중의 O2의 양은 62 ppb로 측정되었다. 아르곤 유동을 중단하고, 가열 및 냉각을 10시간 동안 70℃에서 계속하였다.
반응 혼합물을 250 mL 원심분리 플라스크로 옮기고, 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 60분 동안 12000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 침전물을 수집하고, 물을 첨가하여 유리 플라스크로 옮겼다.
0.5 M 아세트산 용액을 첨가하여 겔의 수성 분산액의 pH를 3.8로 조정하였다. 산성화된 겔 분산액을 진탕조에서 60℃로 2.5시간 동안 진탕하고, 냉각하였다.
겔 분산액을 1L 플라스크로 옮기고, THF 287.06 g을 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 30분 동안 진탕하고, 써모 사이언티픽 써모 사이언티픽 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 30분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 생성된 2상 혼합물의 상부 상을 폐기하였다. THF 111.41 g을 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 23분 동안 진탕하고, 플라스크를 30분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다. DMF를 겔 상에 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 밤새 실온에서 진탕하였다.
DMF 중의 비드의 현탁액 120 g에, 피페리딘 10 mL를 첨가하고, 진탕 테이블 상에서 실온에서 60분 동안 진탕하였다. THF 45 g을 첨가하고, 플라스크를 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 90분 동안 14000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
현탁액이 112 g이 될 때까지 DMF를 첨가하고, 겔을 진탕 테이블 상에서 4시간 동안 진탕하였다. THF 37 g을 첨가하고, 플라스크를 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 60분 동안 14000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
현탁액이 130 g이 될 때까지 DMF를 첨가하고, 겔을 진탕 테이블 상에서 90분 동안 진탕하였다. THF 40 g을 첨가하고, 플라스크를 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 60분 동안 14000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
무수 1-메틸-2-피롤리디논 (NMP) 105 g을 배치 상에 첨가하고, 3일 동안 진탕하였다. 수 팽윤된 겔을 3 및 7 중량％의 수크로스 용액의 구배 및 15000 RPM의 회전 속도를 사용하여 디스크 원심분리 장비 (CPS 인스트루먼츠, 인크, 모델 DC20000)에서 분석하였다. 직경은 0.3694 μm로서 측정되었고, CV (수)는 4.8 ％로 측정되었다.
실시예 19
보호된 아미노 아크릴아미드 단량체 ((9H-플루오렌-9-일)메틸(2-(2-(2-아크릴아미도에톡시)에톡시)에틸)카르바메이트)를 폴리스티렌 입자로부터 형성된 분산된 상 중에서 tBDMS-HEAM 단량체 및 tBDMS-EBHEAM 가교제와 중합시키고, 탈보호시켜서 아미노 히드로겔 입자를 형성하였다.
먼저 SDS 1.68 g을 물 280.00 g에 용해시키고, 이어서 아세톤 14.00 g 및 DOA 28.00 g을 첨가하여 에멀젼을 제조하였다. 에멀젼을 울트라투락스로 2분 동안 혼합하고, 5.4분 동안 고압 가울린 APV-100 균질화기에서 400 Bar로 추가로 균질화시켰다.
이 에멀젼 26.58 g을 플라스크 내의 시드 입자 (시드 직경 0.126 μm, 고체 4.59 중량％) 52.61 g에 첨가하였다. 혼합물을을 활성화를 위해서 진탕조 내에서 40℃로 16시간 동안 진탕하였다.
SDS 3.21 g 및 보락스 8.07 g을 물 1823.6 g 중에 용해시켜서 SDS 보락스 용액을 제조하였다.
울트라투락스로 5분 동안 혼합되고, 2.6분 동안 추가로 균질화된 2-페네틸 아세테이트 33.68 g, AMBN 0.13 g, tBDMS HEAM 4.89 g, tBDMS-EBHEAM 1.61 g, (9H-플루오렌-9-일)메틸 (2-(2-(2-아크릴아미도에톡시)에톡시)에틸)카르바메이트 0.64 g 및 SDS 보락스 용액 218.95 g으로부터 단량체 에멀젼을 형성하였다.
250 mL 반응기에서, 활성화된 시드 입자의 수 분산액 15.53 g을 단량체 에멀젼 234.9 g과 혼합하였다. 혼합물을 40℃에서 2시간 동안 교반 및 가열하였다. 아르곤 기체 (150 내지 200 ml/min)를 혼합물로 버블링하면서, 혼합물을 1시간 더 40℃에서 추가로 교반 및 가열하였다. 이때, 에멀젼 중의 O2의 양은 75 ppb로 측정되었다. 아르곤 유동을 중단하고, 가열 및 냉각을 10시간 동안 70℃에서 계속하였다.
반응 혼합물을 250 mL 원심분리 플라스크로 옮기고, 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 60분 동안 13000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 침전물을 수집하고, 물을 첨가하여 유리 플라스크로 옮겼다.
0.5 M 아세트산 용액을 첨가하여 겔의 수성 분산액의 pH를 3.7로 조정하였다. 산성화된 겔 분산액을 진탕조에서 60℃로 2.5시간 동안 진탕하고, 냉각하였다.
겔 분산액을 1L 플라스크로 옮기고, THF 180 g을 첨가하고, 써모 사이언티픽 써모 사이언티픽 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 30분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 생성된 2상 혼합물의 상부 상을 폐기하고, 혼합물을 진탕 테이블 상에서 실온에서 15분 동안 진탕하였다. THF 160 g을 첨가하고, 플라스크를 30분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
겔을 DMF를 사용하여 유리 플라스크로 옮겼다. 이러한 비드의 DMF 현탁액 50 g 상에, 피페리딘 5 mL를 첨가하고, 혼합물을 진탕 테이블 상에서 실온에서 60분 동안 진탕하였다.
이 현탁액 50 g을 250 mL 원심분리기 플라스크로 옮기고, THF 23 g을 첨가하였다. 플라스크를 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 10분 동안 10000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, DMF를 첨가하고, 혼합물을 진탕 테이블 상에서 16시간 동안 실온에서 진탕하였다.
수 팽윤된 겔을 3 및 7 중량％의 수크로스 용액의 구배 및 15000 RPM의 회전 속도를 사용하여 디스크 원심분리 장비 (CPS 인스트루먼츠, 인크, 모델 DC20000)에서 분석하였다. 1.032 g/ml의 입자 밀도를 사용하여 직경은 0.4517 μm로서 측정되었다. CV (수)는 3.7％로 측정되었다.
실시예 20
보호된 아미노 아크릴아미드 단량체, N-Boc N-아크릴로일-4,7,10-트리옥사트리데칸-1,13-디아민을 폴리스티렌 입자로부터 형성된 분산된 상 중에서 tBDMS-HEAM 단량체 및 tBDMS-EBHEAM 가교제와 중합시키고, 탈보호시켜서 아미노 히드로겔 입자를 형성하였다.
87 내지 89％ 가수분해된 폴리비닐알콜 (PVA) 80 g을 물 2000 g에 천천히 첨가하고, 80℃에서 1시간 동안 교반 및 가열하고, 냉각시켜서 PVA 용액을 제조하였다. PVA 용액 67.66 g의 양을 물 582.70 g, SDS 0.62 g 및 보락스 2.74 g과 혼합하였다.
울트라투락스로 수분 동안 혼합되고, 2분 동안 추가로 균질화된 2-페네틸 아세테이트 26.39 g, AMBN 0.098 g, tBDMS HEAM 3.97 g, tBDMS-EBHEAM 1.26 g, N-Boc N-아크릴로일-4,7,10-트리옥사트리데칸-1,13-디아민 0.21 g 및 PVA-보락스 용액 176.12 g으로부터 단량체 에멀젼을 형성하였다.
250 mL 반응기에서, 시드 입자의 수 분산액 (시드 직경 0.319 μm, 고체 8.07 중량％) 7.15 g을 단량체 에멀젼 193.02 g과 혼합하였다. 혼합물을 40℃에서 2시간 동안 교반 및 가열하였다. 아르곤 기체 (150 내지 200 ml/min)를 혼합물로 버블링하면서, 혼합물을 1시간 더 40℃에서 추가로 교반 및 가열하였다. 이때, 에멀젼 중의 O2의 양은 40 ppb로 측정되었다. 아르곤 유동을 중단하고, 가열 및 냉각을 10시간 동안 70℃에서 계속하였다.
반응 혼합물을 250 mL 원심분리 플라스크로 옮기고, 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 40분 동안 12500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 침전물을 수집하고, 물을 첨가하여 유리 플라스크로 옮겼다.
1 M H2SO4 용액을 겔 현탁액 상에 9:1 부피비로 첨가하여 0.1 M H2SO4 농도가 되게 하였다. 현탁액을 60℃에서 3시간 동안 진탕하고, 실온으로 냉각하였다.
pH가 12가 될때까지, 진한 NaOH 용액을 적가하였다. THF 500 g을 현탁액에 첨가하고, 2개의 250 mL 병에 나누어 넣고, 혼합물을 진탕 테이블 상에서 실온에서 60분 동안 진탕하였다. 플라스크를 써모 사이언티픽 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 30분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 생성된 2상 혼합물의 상부 상을 폐기하고, 물을 각각의 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 실온에서 진탕 테이블 상에서 밤새 진탕하였다. 진한 NaOH 용액을 첨가하여 혼합물의 pH를 12.3으로 조정하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 25분 동안 진탕하고, 플라스크를 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 30분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
물을 각각의 플라스크에 첨가하고, 진한 NaOH 용액을 첨가하여 혼합물의 pH를 12.2로 조정하였다. 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 밤새 진탕하고, 플라스크를 써모 사이언티픽 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 30분 동안 4000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
물을 각각의 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 4시간 동안 진탕하고, 플라스크를 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 30분 동안 6500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
NMP를 각각의 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 밤새 진탕하고, 플라스크를 써모 사이언티픽 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 30분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액의 대략 1/2를 폐기하였다.
겔 침전물을 하나의 병에 합치고, NMP를 첨가하고, 플라스크를 써모 사이언티픽 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 60분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
NMP를 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 3시간 동안 진탕하고, 플라스크를 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 50분 동안 6500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
일부 추가의 NMP를 첨가하였고, 분산액의 고체 함량은 0.108％로 측정되었다. 수 팽윤된 겔의 직경을 위상 대조 장비를 갖는 현미경으로 측정하였고, 평균 1.79 μm였다.
수 팽윤된 겔을 3 및 7 중량％의 수크로스 용액의 구배 및 10050 RPM의 회전 속도를 사용하여 디스크 원심분리 장비 (CPS 인스트루먼츠, 인크, 모델 DC20000)에서 추가로 분석하였다. 1.032 g/ml의 입자 밀도를 사용하여 직경은 0.934 μm로 측정되었다.
실시예 21
보호된 아미노 아크릴아미드 단량체, N-Boc N-아크릴로일-4,7,10-트리옥사트리데칸-1,13-디아민을 폴리스티렌 입자로부터 형성된 분산된 상 중에서 tBDMS-HEAM 단량체 및 tBDMS-EBHEAM 가교제와 중합시키고, 탈보호시켜서 아미노 히드로겔 입자를 형성하였다
먼저 SDS 1.74 g을 물 290.00 g 중에 용해시키고, 이어서 아세톤 14.50 g 및 비스(2-에틸헥실) 아디페이트 (DOA) 29.00 g을 첨가하여 에멀젼을 제조하였다. 에멀젼을 울트라투락스로 2분 동안 혼합하고, 5.6분 동안 고압 가울린 APV-100 균질화기에서 400 Bar로 추가로 균질화시켰다.
이 에멀젼 26.58 g을 플라스크 내의 시드 입자 (시드 직경 0.126 μm, 고체 4.59 중량％) 52.27 g에 첨가하였다. 혼합물을 활성화를 위해서 진탕조에서 40℃에서 40시간 동안 진탕하였다.
SDS 1.87 g 및 보락스 4.04 g을 물 987.5 g에 용해시켜서 SDS 보락스 용액을 제조하였다.
울트라투락스로 수분 동안 혼합되고, 추가로 4.8분 동안 균질화된 2-페네틸 아세테이트 62.81 g, AMBN 0.238 g, tBDMS HEAM 9.13 g, tBDMS-EBHEAM 3.00 g, N-Boc N-아크릴로일-4,7,10-트리옥사트리데칸-1,13-디아민 1.05 g 및 SDS-보락스 용액 408.39 g으로부터 단량체 에멀젼을 형성하였다.
500 mL 반응기에서, 활성화된 시드 입자의 수 분산액 31.06 g을 단량체 에멀젼 469.6 g과 혼합하였다. 혼합물을 40℃에서 2시간 동안 교반 및 가열하였다. 아르곤 기체 (200 ml/min)를 혼합물로 버블링하면서, 혼합물을 1시간 더 40℃에서 추가로 교반 및 가열하였다. 아르곤 유동을 중단하고, 가열 및 냉각을 10시간 동안 70℃에서 계속하였다.
반응 혼합물을 4개의 250 mL 원심분리 플라스크로 옮기고, 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 60분 동안 13000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 침전물을 수집하고, 물을 첨가하여 유리 플라스크로 옮겼다.
0.5 M 아세트산 용액을 첨가하여 겔의 수성 분산액의 pH를 3.8로 조정하였다. 산성화된 겔 분산액을 진탕조에서 60℃로 2시간 동안 진탕하고, 냉각하였다.
1 M H2S04 용액을 겔 현탁액에 9:1의 부피비로 첨가하여 0.1 M H2SO4 농도가 되게 하였다. 현탁액을 60℃에서 3시간 동안 진탕하고, 실온으로 냉각하였다.
진한 NaOH 용액을 pH가 12가 될 때까지 적가하였다. 현탁액을 2개의 1 L 원심분리기 플라스크에 나누어 넣었다. THF 380 g을 각각의 플라스크에 첨가하고, 혼합물을 진탕 테이블 상에서 실온에서 145분 동안 진탕하였다. 플라스크를 써모 사이언티픽 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 30분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 물을 각각의 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 2시간 동안 진탕하였다. 추가의 물을 첨가하고, 플라스크를 써모 사이언티픽 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 60분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
겔을 4개의 250 mL 원심분리기 플라스크로 옮기고, 플라스크를 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 45분 동안 14500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
물을 각각의 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 60분 동안 진탕하고, 플라스크를 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 45분 동안 14500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
물을 각각의 플라스크에 첨가하고, 진한 NaOH 용액을 첨가하여 혼합물의 pH를 12로 조정하였다. 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 25분 동안 진탕하고, 플라스크를 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 30분 동안 6500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
물을 각각의 플라스크에 첨가하고, 진한 NaOH 용액을 첨가하여 혼합물의 pH를 12.3으로 조정하였다. 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 밤새 진탕하고, 플라스크를 써모 사이언티픽 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 30분 동안 4000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
물을 각각의 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 4시간 동안 진탕하고, 플라스크를 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 30분 동안 6500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
NMP를 각각의 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 밤새 진탕하고, 플라스크를 써모 사이언티픽 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 30분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
NMP를 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 5시간 동안 진탕하고, 플라스크를 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 50분 동안 6500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
일부 추가의 NMP를 첨가하였고, 분산액의 고체 함량은 0.408％로 측정되었다. 수 팽윤된 겔의 직경을 위상 대조 장비를 갖는 현미경으로 측정하였고, 평균 0.86 μm였다. 수 팽윤된 겔의 직경을 또한 3 및 7 중량％의 수크로스 용액의 구배 및 15000 RPM의 회전 속도를 사용하여 디스크 원심분리 장비 (CPS 인스트루먼츠, 인크, 모델 DC20000)에서 분석하였다. 1.032 g/ml의 입자 밀도를 사용하여 직경은 0.511 μm로서 측정되었다. CV (수)는 4.82％로서 측정되었다.
실시예 22
tBDMS-HEAM을 폴리스티렌 입자로부터 형성된 분산된 상 중에서 tBDMS-EBHEAM 가교제와 중합시키고, 탈보호시켜서 히드로겔 입자를 형성하였다.
먼저 SDS 1.14 g을 물 190.00 g 중에 용해시키고, 이어서 아세톤 28.50 g 및 DOA 19.00 g을 첨가하여 에멀젼을 제조하였다. 에멀젼을 울트라투락스로 5분 동안 혼합하고, 고압 가울린 APV-100 균질화기에서 400 Bar로 4분 동안 추가로 균질화시켰다.
이 에멀젼 30.55 g을 플라스크 내의 시드 입자 (시드 직경 4.96 μm, 고체 9.54 중량％) 7.39 g에 첨가하였다. 혼합물을 활성화를 위해서 진탕조에서 40℃에서 22시간 동안 진탕하였다.
H2O 300 g을 80℃ 이하로 가열하고, 메토셀(Methocel) K-100 4.2 g을 용해시켰다. H2O 332 g을 첨가하여 메토셀 K-100 용액을 수득하였다.
보락스 2.41 g을 메토셀 용액 94.8 g 상에 첨가하였다. 물을 첨가하여 이 용액의 중량을 총 420.2 g으로 만들어서, 혼합에 의해서 제조된 보락스 용액을 수득하였다.
울트라투락스로 수분 동안 혼합되고, 2.1분 동안 추가로 균질화된 2-페네틸 아세테이트 35.72 g, AMBN 0.138 g, tBDMS HEAM 5.56 g, tBDMS-EBHEAM 1.71 g 및 보락스 용액 165.89 g으로부터 단량체 에멀젼을 형성하였다.
250 mL 반응기에서, 활성화된 시드 입자의 수 분산액 9.25 g을 단량체 에멀젼 177.0 g 및 메토셀 K-100 용액 63.26 g과 혼합하였다. 혼합물을 40℃에서 2.5시간 동안 교반 및 가열하였다. 아르곤 기체 (200 ml/min)을 혼합물로 버블링하면서, 혼합물을 추가로 40℃에서 30분 더 교반 및 가열하였다. 아르곤 유동을 중단하고, 가열 및 냉각을 10시간 동안 70℃에서 계속하였다.
반응 혼합물의 일부를 250 mL 원심분리 플라스크로 옮기고, 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 60분 동안 13000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 침전물을 수집하고, 물을 첨가하여 유리 플라스크로 옮겼다.
0.5 M 아세트산 용액을 첨가하여 겔의 수성 분산액의 pH를 3.8로 조정하였다. 산성화된 겔 분산액을 진탕조에서 60℃로 150분 동안 진탕하고, 냉각하였다.
겔 분산액을 1L 플라스크로 옮기고, THF 300 g을 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 30분 동안 진탕하고, 써모 사이언티픽 소르발 RC3C플러스 원심분리기에서 25분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 생성된 2상 혼합물의 상부 상을 폐기하고, THF 50 g을 플라스크에 첨가하였다. 플라스크를 진탕 테이블 상에서 실온에서 30분 동안 진탕하고, 25분 동안 4500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
플라스크의 내용물을 2개의 250 mL 원심분리기 플라스크에 나누어 넣었다. DMF 대략 100 g을 각각의 플라스크 상에 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 밤새 실온에서 진탕하였다. THF 20 g 및 임의의 양의 DMF를 첨가하여 각각의 플라스크의 내용물을 총 200 g이 되게 하였다. 플라스크를 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 70분 동안 13000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
DMF 대략 100 g을 각각의 플라스크 상에 첨가하고, 플라스크를 진탕 테이블 상에서 40분 동안 실온에서 진탕하였다. THF 20 g 및 임의의 양의 DMF를 첨가하여 각각의 플라스크의 내용물을 총 200 g이 되게 하였다. 플라스크를 베크만 쿨터 아반티 J-20 XP 원심분리기에서 70분 동안 13000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 최소량의 DMF를 사용하여 모든 침전물을 새로운 플라스크로 합쳤다.
분산액의 고체 함량은 2.34 g으로 측정되었다. 수 팽윤된 겔의 직경을 위상 대조 장비를 갖는 현미경으로 측정하였고, 평균 47.5 μm였다.
실시예 23
tBDMS-HEAM 단량체를 수성 에멀젼 중에서 중합시켜서 단일 크기의 시드 입자를 형성하였다.
물 250 mL를 250 mL 원뿔형 플라스크에서 10분 동안 끓이고, Ar 기체를 퍼징하면서, 빙수조로 냉각시켰다.
50 mL 원뿔형 플라스크에서, 자석 교반막대를 사용하여 SDS 0.04 g을 상기 끓는 물 10.1 g 중에 용해시켰다.
또 다른 50 mL 원뿔형 플라스크에서, 자석 교반막대를 사용하여 과황산칼륨 0.059 g을 끓는 물 10 g 중에 용해시켰다.
자석 교반기, 온도 프로브, 물 유동 응축기 및 Ar 공급원이 장치된 100 mL 재킷 2-부분(jacketed two-piece) 반응기에, 적어도 30분 동안 미리 끓인 끓는 물 80 g 및 보락스 0.20 g을 첨가하고, 폴리(테트라플루오로에틸렌) 날개가 장치된 오버헤드 교반기를 설정하여 150 ± 5 RPM으로 교반하면서, 가열조를 사용하여 반응기를 80℃로 가열하였다. 용액을 Ar으로 20분 동안 퍼징하였다.
용액의 온도가 80℃에 도달하면, Ar 튜빙을 용액 외부로 상승시키고, Ar 압력을 유지시키고, 직전에 5분 동안 초음파처리된 SDS 용액을 반응기에 첨가하였다.
SDS 용액을 첨가하고 8분 후, 기계 교반기를 설정하여 250 ± 5 RPM으로 교반하였다.
tBDMS-HEAM 9.22 g을 5분 동안 Ar으로 퍼징하고, 이어서 반응기에 첨가하였다. tBDMS-HEAM 첨가하고 1분 후, 기계 교반기를 설정하여 350 ± 5 RPM으로 교반하였다.
tBDMS-HEAM를 첨가하고 5분 후, 직전에 Ar로 5분 동안 퍼징된 과황산칼륨 용액을 반응기에 신속히 첨가하고, Ar을 여전히 에멀젼 상부에 유동시키면서, 반응기를 실링하였다.
과황산칼륨을 첨가하고 270분 후, 기계 교반기를 설정하여 250 ± 5 RPM으로 교반하고, Ar 유동을 중단하였다. 에멀젼을 18시간 동안 추가로 중합시켰다.
배치를 실온으로 냉각하고, 전체 배치를 플라스틱 병으로 옮겼다. 동적 광산란 (맬버른(Malvern), 나노(Nano) ZS)에 의해서 직경을 측정하고, 0.398 μm인 것을 발견하였다. PDI는 0.015로 측정되었다. 겔 투과 크로마토그래피 장비 (워터스(Waters) 2414 반사율 검출기 및 폴리머 래보러토리즈(Polymer Laboratories) 5μm 믹스트(Mixed)-C 300 mm x 7.5 mm 칼럼이 장치된 워터스 717플러스(Waters 717plus))를 사용하여, 중량 평균 분자량 및 수 평균 분자량은 각각 707 kDa 및 102 kDa으로 측정되었다.
3 및 7 중량％의 수크로스 용액의 구배 및 20,000 RPM의 회전 속도를 사용하여 디스크 원심분리 장비 (CPS 인스트루먼츠, 인크, 모델 DC20000)에서 입자의 CV를 측정하였고, 2.0％인 것을 발견하였다.
실시예 24
아미노-히드로겔의 활성화 및 히드로겔과 아민 말단 DNA 프로브의 접합
무수 아민-무함유 N-메틸피롤리돈 (NMP) (600 μL) 중의 아미노-히드로겔 (직경 = 0.55 마이크로미터, 23 x 106 아민/마이크로미터3) 100 x 109개의 용액에 고체 비스-숙신이미딜 수베레이트 (22.1 mg, 60 μmmol)를 첨가하고, 이어서 트리부틸아민 (14 μL, 60 μmol)을 첨가하였다. 60℃에서 1시간 동안 교반한 후, 히드로겔을 원심분리 (21300 rcf에서 30분)에 의해서 단리하였다. 히드로겔 펠릿을 아민-무함유 무수 NMP (1 ml)로 희석하고, 원심분리에 의해서 단리하고; 이 세척 방법을 2회 반복하고, 최종 펠릿을 NMP (600 μL) 중에 재현탁시켰다. 이 히드로겔 현탁액을 아세트산 무수물 (30 μL, 317 μmol) 및 트리부틸아민 (30 μL, 126 μmol)으로 처리하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 히드로겔을 원심분리 (21300 rcf에서 30분)에 의해서 단리하고, 펠릿을 아민-무함유 무수 NMP (1 ml)로 희석하고, 원심분리에 의해서 단리하고, 이 세척 방법을 2회 반복하고, 최종 활성화된 캡핑 펠릿을 3 μmol의 테트라부틸암모늄 5'-아미노-올리고뉴클레오티드의 NMP 용액 1 μmol, 트리부틸아민 (1 μmol), 및 아민-무함유 NMP로 최종 부피 600 μL로 희석하였다. 70℃에서 16시간 동안 교반한 후, DNA 접합된 히드로겔을 원심분리 (21300 rcf에서 30분)에 의해서 단리하였다. 펠릿을 NMP (1 ml)로 세척하고, 이어서 탈이온수 (1 ml)로 세척하고, 원심분리를 사용하여 펠릿을 단리하였다. 최종 히드로겔 펠릿을 1XTE 완충액 (1.6 ml)으로 희석하고, 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. 히드로겔을 원심분리 (21300 rcf에서 30분)에 의해서 단리하고, 탈이온수 (1 ml)로 2회 세척하였다 (펠릿 단리를 위해서 원심분리를 사용함). 최종 펠릿에 30％의 수성 암모니아를 첨가하고, 실온에서 15분 후, 히드로겔을 원심분리에 의해서 단리하고 (21300 rcf에서 20분), 단리용 원심분리를 사용하여 탈이온수 (1 mL)로 3X 세척하였다. 최종 펠릿을 표적 증폭을 수행하기에 바람직한 완충액 중에서 재분산시켰다.
실시예 25
올리고뉴클레오티드를 메실 활성화된 입자에 직접 접합시켰다. 시딩 유화 중합을 통해서 메실 클로라이드 활성화된 마이크로겔을 제조하였다. 이온 교환된 단일 가닥 DNA와의 접합을 위한 준비로, 이렇게 형성된 입자를 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP) 중에서 세척하였다.
5'-NH2-C6-30-머 올리고뉴클레오티드의 나트륨 염을 0.1 M 테트라부틸암모늄 아세테이트 중에 용해시키고, 역상 HPLC 칼럼 상에 주입하였다. 0.1 M 테트라부틸암모늄 아세테이트 이동상을 사용하여 용리를 수행하였다. 핵산을 함유하는 분획을 수집하고, 건조 분말로 동결건조하고, 무수 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP) 중에 재현탁시켰다.
5백만 (5.0 x 106)개의 입자를 무수 NMP 350 uL 중에 분산시키고, 볼텍스(vortex) 혼합하여 분산시켰다. NMP (4.10 mM) 중의 Bu4NAc-DNA (5'-NH2-C6-30-머 올리고뉴클레오티드) 124 uL를 입자 혼합물에 직접 첨가하였다. 이어서, 테트라에틸암모늄 보레이트 (26.14 mM) 19.5 uL를 약 500 uL의 최종 부피를 위해서 반응 혼합물에 첨가하였다.
반응 혼합물을 신속하게 볼텍스 혼합하고, 70℃에서 16시간 동안 약하게 혼합하였다. 혼합물을 원심분리하고, 상청액을 따라내고, 입자를 NMP 1 mL 중에 재현탁시켰다. 볼텍스 혼합 후, 재현탁된 마이크로겔 입자를 NMP 중에서의 침전/분산의 2회 사이클로 펠릿화하였다. 두번째 NMP 세척 후, 펠릿을 2xSSPE/0.1％ 소듐 도데실 술페이트 (SDS) 1 mL 중에서 성장시키고, 혼합하고, 펠릿으로 원심분리하였다. 마지막으로, 입자를 1xPBS/0.1％ 트리톤(Triton) X-100 1 mL 중에서 성장시키고, 혼합하고, 단단한 펠릿으로 원심분리하고, 이 방법을 3회 반복하였다. 최종 사이클 후, 접합된 마이크로겔을 1xPBS/0.1％ 트리톤 X-100 500 uL 중에 재현탁시켰다.
제1 측면에서, 입자의 형성 방법은 수현탁액 내의 분산 상 중에서, 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체의 다수의 머 단위를 중합시켜, 다수의 소수성 보호기를 포함하는 중합체성 입자를 형성하는 단계, 및 중합체성 입자를 히드로겔 입자로 전환시키는 단계를 포함한다.
제1 측면의 예에서, 중합체성 입자를 전환시키는 단계는 중합체성 입자로부터 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 제거하는 것을 포함한다. 예를 들어, 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 제거하는 것은 중합체성 입자로부터 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 산 절단하는 것을 포함한다.
제1 측면 및 상기 예의 또 다른 예에서, 중합체성 입자를 전환시키는 단계는 중합체성 입자로부터 다수의 소수성 보호기의 실질적으로 전부를 제거하는 것을 포함한다.
제1 측면 및 상기 예의 추가 예에서, 방법은 수현탁액 중에서 시드 입자를 촉진시켜서 분산된 상을 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 한 예에서, 보호된 단량체:시드 입자의 질량비는 150:1 내지 1:1 범위, 예컨대 50:1 내지 1:1 범위이다. 또 다른 예에서, 시드 입자는 시드 중합체를 포함한다. 방법은 중합체성 입자를 전환시키는 단계 이후에 시드 중합체를 추출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 한 예에서, 시드 중합체는 소수성일 수 있다. 또 다른 예에서, 시드 중합체는 스티렌 중합체, 아크릴 중합체, 또 다른 비닐 중합체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 예의 특정 예에서, 시드 입자는 0.6 마이크로미터 이하, 예컨대 0.45 마이크로미터 이하, 0.35 마이크로미터 이하, 또는 0.15 마이크로미터 이하의 초기 입자 크기를 갖는다. 상기 예의 또 다른 예에서, 시드 입자를 촉진시키는 단계는 용매 및 촉진제를 시드 입자와 혼합하는 것을 포함한다. 예를 들어, 촉진제는 소수성이다. 또 다른 예에서, 촉진제는 디옥타노일 퍼옥시드를 포함한다.
제1 측면 및 상기 예의 추가 예에서, 친수성 단량체는 아크릴아미드를 포함한다.
제1 측면 및 상기 예의 또 다른 예에서, 소수성 보호기는 히드록실 보호기를 포함한다.
제1 측면 또는 상기 예의 추가 예에서, 소수성 보호기는 유기금속 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 유기금속 모이어티는 실릴 에테르 관능기를 형성한다. 한 예에서, 실릴 에테르 관능기는 tert-부틸디메틸실란 에테르, 트리메틸실릴 에테르, 트리에틸실릴 에테르, 디페닐 메틸 실릴 에테르, 또는 이들의 조합으로부터 유도된다.
제1 측면 및 상기 예의 예에서, 다수의 머를 중합시키는 단계는 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체와 가교제를 혼합하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 가교제를 혼합하는 것은 15:1 내지 1:2 범위의 친수성 단량체:가교제의 질량비로 가교제를 혼합하는 것을 포함할 수 있다. 범위는 10:1 내지 1:1일 수 있다. 또 다른 예에서, 가교제는 낮은 수용해도의 가교제이다. 상기 예의 예에서, 가교제는 디비닐 가교제이다. 예를 들어, 디비닐 가교제는 디아크릴아미드를 포함한다. 상기 예의 특정 예에서, 디아크릴아미드는 N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(2-히드록시프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, 이들의 보호된 유도체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 디아크릴아미드는 예를 들어, N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-(2-((트리에틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(N-(2-((트리에틸실릴)옥시)프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, 실릴-보호된 N-[2-(아크릴로일아미노)-1,2-디히드록시에틸]아크릴아미드, 예컨대 N,N'(2,3-비스((트리에틸실릴)옥시)부탄-1,4-디일)디아크릴아미드, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 예의 또 다른 예에서, 디비닐 가교제는 에틸렌글리콜디메타크릴레이트, 디비닐벤젠, 헥사메틸렌 비스아크릴아미드, 트리메틸올프로판 트리메타크릴레이트, 또는 이들의 조합을 포함한다.
제1 측면 및 상기 예의 또 다른 예에서, 다수의 머 단위를 중합시키는 단계는 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체와 포로겐을 혼합하는 것을 포함한다. 예를 들어, 포로겐은 방향족 포로겐일 수 있다. 한 예에서, 방향족 포로겐은 톨루엔을 포함한다.
제1 측면 및 상기 예의 추가 예에서, 방법은 히드로겔 입자를 활성화시키는 단계를 추가로 포함한다. 한 예에서, 전환 단계는 히드로겔 입자 상에 하나 이상의 히드록실 기를 제공하는 것을 포함하며, 활성화 단계는 하나 이상의 히드록실 기의 적어도 하나를 술포네이트 에스테르 기로 전환시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 전환 단계는 히드로겔 입자 상에 하나 이상의 히드록실 기를 제공하는 것을 포함할 수 있고, 활성화 단계는 하나 이상의 히드록실 기의 적어도 하나를 아지드 관능성 모이어티로 대체하는 것을 포함한다. 또 다른 예에서, 방법은 올리고뉴클레오티드를 활성화된 히드로겔 중합체에 결합시키는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 결합 단계는 친핵성 치환을 포함하고, 올리고뉴클레오티드는 친핵성-말단 올리고뉴클레오티드이다. 친핵체-종결 올리고뉴클레오티드의 친핵체는 아민 기일 수 있다. 친핵체-종결 올리고뉴클레오티드의 친핵체는 티올 기일 수 있다. 상기 예의 예에서, 방법은 폴리뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드에 혼성화시키는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 방법은 폴리뉴클레오티드를 다수의 폴리뉴클레오티드로 증폭시키는 단계, 및 다수의 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부를 히드로겔 입자에 부착시켜, 다수의 부착된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 히드로겔 입자를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 방법은 올리고뉴클레오티드를 연장시킴으로써 폴리뉴클레오티드를 다수의 상보적 폴리뉴클레오티드 내로 증폭시켜, 다수의 부착된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 히드로겔 입자를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
제1 측면 및 상기 예의 또 다른 예에서, 히드로겔 입자는 2 마이크로미터 이하의 평균 입자 크기를 갖는 다수의 유사하게 형성된 히드로겔 입자 중 하나이다. 예를 들어, 평균 입자 크기는 1 마이크로미터 이하, 예컨대 0.8 마이크로미터 이하, 또는 0.5 마이크로미터 이하일 수 있다.
제1 측면 및 상기 예의 추가 예에서, 히드로겔 입자는 크기가 실질적으로 균일한 다수의 유사하게 형성된 히드로겔 입자 중 하나이다.
제1 측면 또는 상기 예의 추가 예에서, 히드로겔 입자는 5.0％ 이하의 변동 계수를 갖는 다수의 유사하게 형성된 히드로겔 입자 중 하나이다. 예를 들어, 변동 계수는 3.5％ 이하이다.
제2 측면에서, 입자의 형성 방법은 수현탁액 내의 분산 상 중에서, 소수성 보호기를 갖는 아크릴아미드 단량체의 다수의 머 단위를 중합시켜, 다수의 소수성 보호기를 포함하는 중합체성 입자를 형성하는 단계, 및 중합체성 입자를 친수성 입자로 전환시키는 단계를 포함한다.
제2 측면의 예에서, 중합체성 입자를 전환시키는 단계는 중합체성 입자로부터 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 제거하는 것을 포함한다. 예를 들어, 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 제거하는 것은 중합체성 입자로부터 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 산 절단하는 것을 포함한다.
제2 측면 또는 상기 예의 또 다른 예에서, 중합체성 입자를 전환시키는 단계는 중합체성 입자로부터 다수의 소수성 보호기의 실질적으로 전부를 제거하는 것을 포함한다.
제2 측면 또는 상기 예의 추가 예에서, 방법은 수현탁액 중에서 시드 입자를 촉진시켜서 분산된 상을 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 보호된 단량체:시드 입자의 질량비는 50:1 내지 1:1 범위이다. 또 다른 예에서, 시드 입자는 시드 중합체를 포함한다. 상기 예의 예에서, 방법은 중합체성 입자를 전환시키는 단계 이후에 시드 중합체를 추출하는 단계를 추가로 포함한다. 시드 중합체는 소수성일 수 있다. 또 다른 예에서, 시드 중합체는 스티렌 중합체, 아크릴 중합체, 또 다른 비닐 중합체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 예의 예에서, 시드 입자는 0.6 마이크로미터 이하의 초기 입자 크기를 갖는다. 상기 예의 추가 예에서, 시드 입자를 촉진시키는 단계는 용매 및 촉진제를 시드 입자와 혼합하는 것을 포함한다. 예를 들어, 촉진제는 소수성일 수 있다.
제2 측면 또는 상기 예의 또 다른 예에서, 소수성 보호기는 히드록실 보호기를 포함한다. 제2 측면 및 상기 예의 추가 예에서, 소수성 보호기는 유기금속 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 유기금속 모이어티는 실릴 에테르 관능기를 형성할 수 있다. 한 예에서, 실릴 에테르 관능기는 tert-부틸디메틸실란 에테르, 트리메틸실릴 에테르, 트리에틸실릴 에테르, 디페닐 메틸 실릴 에테르, 또는 이들의 조합으로부터 유도될 수 있다.
제2 측면 및 상기 예의 추가 예에서, 다수의 머 단위를 중합시키는 단계는 소수성 보호기를 갖는 아크릴아미드 단량체와 가교제를 혼합하는 것을 추가로 포함한다. 가교제를 혼합하는 것은 가교제를 15:1 내지 1:2 범위의 친수성 단량체:가교제의 질량비로 혼합하는 것을 포함할 수 있다. 한 예에서, 가교제는 낮은 수용해도의 가교제이다. 또 다른 예에서, 가교제는 디비닐 가교제이다.
제2 측면 및 상기 예의 추가 예에서, 다수의 머 단위를 중합시키는 단계는 포로겐을 소수성 보호기를 갖는 아크릴아미드 단량체와 혼합하는 것을 포함한다. 예를 들어, 포로겐은 방향족 포로겐을 포함할 수 있다.
제2 측면 및 상기 예의 또 다른 예에서, 방법은 친수성 입자를 활성화시키는 단계를 추가로 포함한다. 한 예에서, 전환 단계는 히드로겔 입자 상에 하나 이상의 히드록실 기를 제공하는 것을 포함하며, 활성화 단계는 하나 이상의 히드록실 기의 적어도 하나를 술포네이트 에스테르 기로 전환시키는 것을 포함한다. 또 다른 예에서, 전환 단계는 히드로겔 입자 상에 하나 이상의 히드록실 기를 제공하는 것을 포함하며, 활성화 단계는 하나 이상의 히드록실 기의 적어도 하나를 아지드 관능성 모이어티로 대체하는 것을 포함한다. 추가 예에서, 방법은 올리고뉴클레오티드를 활성화된 히드로겔 중합체에 결합시키는 단계를 추가로 포함한다. 결합 단계는 친핵성 치환을 포함할 수 있고, 올리고뉴클레오티드는 친핵체-종결 올리고뉴클레오티드이다. 친핵체-종결 올리고뉴클레오티드의 친핵체는 아민 기일 수 있다. 또 다른 예에서, 친핵체-종결 올리고뉴클레오티드의 친핵체는 티올 기를 포함할 수 있다. 추가 예에서, 방법은 폴리뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드에 혼성화시키는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 예에서, 방법은 폴리뉴클레오티드를 다수의 폴리뉴클레오티드로 증폭시키는 단계, 및 다수의 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부를 친수성 입자에 부착시켜, 다수의 부착된 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 대안적으로, 방법은 올리고뉴클레오티드를 연장시킴으로써 폴리뉴클레오티드를 다수의 상보적 폴리뉴클레오티드 내로 증폭시켜, 다수의 부착된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 히드로겔 입자를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
제2 측면 및 상기 예의 추가 예에서, 친수성 입자는 2 마이크로미터 이하의 평균 입자 크기를 갖는 다수의 유사하게 형성된 친수성 입자 중 하나이다.
제2 측면 및 상기 예의 추가 예에서, 친수성 입자는 크기가 실질적으로 균일한 다수의 유사하게 형성된 친수성 입자 중 하나이다.
제2 측면 및 상기 예의 또 다른 예에서에서, 친수성 입자는 5.0％ 이하의 변동 계수를 갖는 다수의 유사하게 형성된 친수성 입자 중 하나이다.
제3 측면에서, 입자의 형성 방법은 수현탁액 내의 분산 상 중에서, 라디칼 중합성 단량체의 다수의 머 단위와 소수성 보호기를 갖는 디아크릴아미드 가교제를 중합시켜, 다수의 소수성 보호기를 포함하는 중합체성 입자를 형성하는 단계를 포함한다. 방법은 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
제3 측면의 예에서, 디아크릴아미드는 N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(2-히드록시프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, 이들의 보호된 유도체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 디아크릴아미드는 예를 들어, N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-(2-((트리에틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(N-(2-((트리에틸실릴)옥시)프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, 실릴-보호된 N-[2-(아크릴로일아미노)-1,2-디히드록시에틸]아크릴아미드, 예컨대 N,N'(2,3-비스((트리에틸실릴)옥시)부탄-1,4-디일)디아크릴아미드, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
제3 측면 또는 상기 예의 또 다른 예에서, 중합 단계는 15:1 내지 1:2 범위의 라디칼 중합성:가교제의 질량비로 디아크릴아미드 가교제를 혼합하는 것을 포함한다.
제3 측면 또는 상기 예의 추가 예에서, 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 제거하는 단계는 중합체성 입자로부터 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 산 절단하는 것을 포함한다.
제3 측면 또는 상기 예의 추가 예에서, 라디칼 중합성 단량체는 비닐계 단량체이다. 한 예에서, 비닐계 단량체는 아크릴레이트, 아크릴아미드, 비닐 알콜, 비닐 아세테이트, 아크릴아미도-메틸-프로판술폰산, 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 비닐계 단량체는 아크릴아미드이다.
제3 측면 또는 상기 예의 또 다른 예에서, 방법은 시드 입자를 수현탁액 중에 촉진시켜 분산된 상을 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 보호된 단량체:시드 입자의 질량비는 50:1 내지 1:1 범위이다. 또 다른 예에서, 시드 입자는 시드 중합체를 포함한다. 추가 예에서, 방법은 중합체성 입자를 전환시키는 단계 이후에 시드 중합체를 추출하는 단계를 추가로 포함한다. 한 예에서, 시드 중합체는 소수성이다. 또 다른 예에서, 시드 중합체는 스티렌 중합체, 아크릴 중합체, 또 다른 비닐 중합체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 추가 예에서, 시드 입자는 0.6 마이크로미터 이하의 초기 입자 크기를 갖는다. 또 다른 예에서, 시드 입자를 촉진시키는 단계는 용매 및 촉진제를 시드 입자와 혼합하는 것을 포함한다.
제3 측면 또는 상기 예의 추가 예에서, 소수성 보호기는 히드록실 보호기를 포함한다.
제3 측면 또는 상기 예의 추가 예에서, 소수성 보호기는 유기금속 모이어티를 포함한다. 한 예에서, 유기금속 모이어티는 실릴 에테르 관능기를 형성한다. 또 다른 예에서, 실릴 에테르 관능기는 tert-부틸디메틸실란 에테르, 트리메틸실릴 에테르, 트리에틸실릴 에테르, 디페닐 메틸 실릴 에테르, 또는 이들의 조합으로부터 유도된다.
제3 측면 또는 상기 예의 또 다른 예에서, 다수의 머 단위를 중합시키는 단계는 포로겐을 라디칼 중합성 단량체 및 디아크릴아미드 가교제와 혼합하는 것을 포함한다. 예를 들어, 포로겐은 방향족 포로겐일 수 있다.
제3 측면 또는 상기 예의 추가 예에서, 방법은 입자를 활성화시키는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 방법은 올리고뉴클레오티드를 활성화된 히드로겔 중합체에 결합시키는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 예에서, 결합 단계는 친핵성 치환을 포함하고, 올리고뉴클레오티드는 친핵체-종결 올리고뉴클레오티드이다. 예를 들어, 친핵체-종결 올리고뉴클레오티드의 친핵체는 아민 기이다. 추가 예에서, 친핵체-종결 올리고뉴클레오티드의 친핵체는 티올 기이다. 또 다른 예에서, 방법은 폴리뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드에 혼성화시키는 단계를 추가로 포함한다. 추가 예에서, 방법은 폴리뉴클레오티드를 다수의 폴리뉴클레오티드로 증폭시키는 단계, 및 다수의 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부를 친수성 입자에 부착시켜, 다수의 부착된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 친수성 입자를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 대안적으로, 방법은 올리고뉴클레오티드를 연장시킴으로써 폴리뉴클레오티드를 다수의 상보적 폴리뉴클레오티드 내로 증폭시켜, 다수의 부착된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 히드로겔 입자를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
제3 측면 또는 상기 예의 추가 예에서, 친수성 입자는 2 마이크로미터 이하의 평균 입자 크기를 갖는 다수의 유사하게 형성된 친수성 입자 중 하나이다.
제3 측면 또는 상기 예의 또 다른 예에서, 친수성 입자는 5.0％ 이하의 변동 계수를 갖는 다수의 유사하게 형성된 친수성 입자 중 하나이다.
제4 측면에서, 입자의 형성 방법은 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체의 다수의 머 단위를 중합시켜, 다수의 소수성 보호기를 포함하는 중합체성 입자를 형성하는 단계, 중합체성 입자로부터 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 제거하여 친수성 입자를 형성하는 단계, 및 올리고뉴클레오티드를 친수성 입자에 결합시키는 단계를 포함한다.
제4 측면 또는 상기 예의 예에서, 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 제거하는 단계는 중합체성 입자로부터 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 산 절단하는 것을 포함한다.
제4 측면 또는 상기 예의 또 다른 예에서, 친수성 단량체는 아크릴아미드를 포함한다.
제4 측면 또는 상기 예의 추가 예에서, 소수성 보호기는 히드록실 보호기를 포함한다.
제4 측면 또는 상기 예의 추가 예에서, 소수성 보호기는 유기금속 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 유기금속 모이어티는 실릴 에테르 관능기를 형성할 수 있다.
제4 측면 또는 상기 예의 예에서, 다수의 머 단위를 중합시키는 단계는 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체와 가교제를 혼합하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 가교제는 디비닐 가교제일 수 있다. 또 다른 예에서, 디비닐 가교제는 디아크릴아미드를 포함한다.
제4 측면 또는 상기 예의 또 다른 예에서, 방법은 올리고뉴클레오티드를 결합시키는 단계 전에, 히드로겔 입자를 활성화시키는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 제거 단계는 친수성 입자 상에 하나 이상의 히드록실 기를 제공하는 것을 추가로 포함하고, 활성화 단계는 하나 이상의 히드록실 기의 적어도 하나를 술포네이트 에스테르 기로 전환시키는 것을 포함한다. 또 다른 예에서, 제거 단계는 친수성 입자 상에 하나 이상의 히드록실 기를 제공하는 것을 포함하고, 활성화 단계는 하나 이상의 히드록실 기의 적어도 하나를 아지드 관능성 모이어티로 대체하는 것을 포함한다. 추가 예에서, 결합 단계는 올리고뉴클레오티드를 활성화된 히드로겔 중합체에 결합시키는 것을 포함한다. 추가 예에서, 결합 단계는 친핵성 치환을 포함하고, 올리고뉴클레오티드는 친핵체-종결 올리고뉴클레오티드이다. 예를 들어, 친핵체-종결 올리고뉴클레오티드의 친핵체는 아민 기일 수 있다. 또 다른 예에서, 친핵체-종결 올리고뉴클레오티드의 친핵체는 티올 기를 포함할 수 있다.
제4 측면 또는 상기 예의 추가 예에서, 방법은 폴리뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드에 혼성화시키는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 방법은 폴리뉴클레오티드를 다수의 폴리뉴클레오티드로 증폭시키는 단계, 및 다수의 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부를 히드로겔 입자에 부착시켜, 다수의 부착된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 히드로겔 입자를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 대안적으로, 방법은 올리고뉴클레오티드를 연장시킴으로써 폴리뉴클레오티드를 다수의 상보적 폴리뉴클레오티드 내로 증폭시켜, 다수의 부착된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 히드로겔 입자를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
제5 측면에서, 다수의 입자는 적어도 100,000개의 입자를 포함한다. 다수의 입자의 적어도 하나의 입자는 히드로겔을 포함한다. 다수의 입자는 100 마이크로미터 이하의 평균 입자 크기 및 5％ 이하의 변동 계수를 갖는다. 예를 들어, 변동 계수는 4.5％ 이하, 예컨대 4.0％ 이하, 3.5％ 이하, 또는 3.0％ 이하이다.
제5 측면 또는 상기 예의 예에서, 평균 크기는 30 마이크로미터 이하, 예컨대 1.5 마이크로미터 이하, 1.1 마이크로미터 이하, 0.6 마이크로미터 이하, 또는 0.5 마이크로미터 이하이다.
제5 측면 또는 상기 예의 또 다른 예에서, 히드로겔은 아크릴아미드 중합체를 포함한다.
제5 측면 또는 상기 예의 추가 예에서, 다수의 입자의 입자는 적어도 60％의 평균 다공도를 갖는다.
제6 측면에서, 시스템은 웰의 어레이를 포함한다. 웰의 어레이의 적어도 하나의 웰은 ISFET 센서와 작동가능하게 연결된다. 시스템은 5％ 이하의 변동 계수를 갖는 다수의 히드로겔 입자를 추가로 포함한다. 다수의 히드로겔 입자의 적어도 하나의 히드로겔 입자는 웰의 어레이의 웰 내에 배치된다.
제7 측면에서, 다수의 입자는, 수현탁액 내의 분산 상 중에서, 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체의 다수의 머 단위를 중합시켜, 다수의 소수성 보호기를 포함하는 중합체성 입자를 형성하는 단계를 포함하고, 중합체성 입자를 히드로겔 입자로 전환시키는 단계를 포함하는 방법에 의해서 형성된다.
제7 측면의 예에서, 다수의 입자는 5.0％ 이하, 예컨대 4.0％ 이하, 3.5％ 이하, 또는 3.0％ 이하의 변동 계수를 갖는다.
제7 측면 또는 상기 예의 또 다른 예에서, 다수의 입자는 100 마이크로미터 이하의 평균 크기를 갖는다. 예를 들어, 평균 크기는 30 마이크로미터 이하, 예컨대 1.5 마이크로미터 이하, 또는 0.8 마이크로미터 이하일 수 있다.
제7 측면 또는 상기 예의 추가 예에서, 친수성 단량체는 아크릴아미드 단량체를 포함한다.
제7 측면 또는 상기 예의 추가 예에서, 다수의 입자의 입자는 적어도 60％의 평균 다공도를 갖는다.
제8 측면에서, 조성물은 아크릴아미드 단량체 및 가교제의 수성 혼합물을 포함하며, 아크릴아미드 단량체는 소수성 보호기를 포함하고, 단량체 및 가교제는 15:1 내지 1:2 범위의 단량체:가교제의 중량비로 포함된다.
제8 측면의 예에서, 가교제는 디비닐 가교제이다. 예를 들어, 디비닐 가교제는 디아크릴아미드를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 디아크릴아미드는 N.N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(2-히드록시프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, 이들의 보호된 유도체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 디아크릴아미드는 예를 들어, N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-(2-((트리에틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(N-(2-((트리에틸실릴)옥시)프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, 실릴-보호된 N-[2-(아크릴로일아미노)-1,2-디히드록시에틸]아크릴아미드, 예컨대 N,N'(2,3-비스((트리에틸실릴)옥시)부탄-1,4-디일)디아크릴아미드, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 추가 예에서, 디비닐 가교제는 에틸렌글리콜디메타크릴레이트, 디비닐벤젠, 헥사메틸렌 비스아크릴아미드, 트리메틸올프로판 트리메타크릴레이트, 또는 이들의 조합을 포함한다.
제8 측면 또는 상기 예의 또 다른 예에서, 비율은 10:1 내지 1:1 범위이다.
제9 측면에서, 폴리뉴클레오티드의 서열분석 방법은 웰의 어레이를 포함하는 장치를 제공하는 단계를 포함한다. 적어도 하나의 웰은 ISFET에 작동가능하게 연결되고, 상기 측면의 방법에 의해서 형성된 입자를 포함한다. 입자를 폴리뉴클레오티드에 부착시킨다. 방법은 소정의 유형의 뉴클레오티드를 포함하는 용액을 장치에 적용하는 단계 및 용액의 적용에 대한 이온성 반응을 관찰하는 단계를 추가로 포함한다.
제10 측면에서, 뉴클레오티드 도입 방법은 상기 측면의 방법에 의해서 형성된 입자를 제공하는 단계를 포함한다. 입자를 프라이머에 혼성화된 주형 핵산을 포함하는 핵산 듀플렉스에 부착시킨다. 듀플렉스를 폴리머라제에 결합시킨다. 방법은 입자를 하나 이상의 뉴클레오티드와 접촉시키는 단계 및 폴리머라제를 사용하여 프라이머의 단부 상에 적어도 하나의 뉴클레오티드를 도입하는 단계를 추가로 포함한다.
제10 측면의 예에서, 도입 단계는 뉴클레오티드 도입의 부산물을 생성하는 것을 추가로 포함한다.
제10 측면 및 상기 예의 또 다른 예에서, 방법은 추가로 전계 효과 트랜지스터 (FET)를 사용하여 부산물을 검출함으로써 도입을 검출하는 단계를 포함한다.
제11 측면에서, 입자의 형성 방법은 시드 입자를 촉진시켜 수현탁액 중에서 분산 상을 형성하는 단계, 분산 상 중에서, 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체의 다수의 머 단위를 중합시켜, 다수의 소수성 보호기를 포함하는 중합체성 입자를 형성하는 단계, 및 중합체성 입자를 히드로겔 입자로 전환시키는 단계를 포함한다.
제12 측면에서, 입자의 형성 방법은 소수성 중합체를 포함하는 시드 입자를 수현탁액 중에 제공하는 단계를 포함하고, 시드 입자를 촉진시켜 수현탁액 중에서 분산 상을 형성하는 단계를 포함한다. 방법은 분산 상 중에서, 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체의 다수의 머 단위를 중합시켜, 다수의 소수성 보호기를 갖는 친수성 중합체를 포함하는 중합체성 입자를 형성하는 단계를 포함한다. 중합체성 입자는 소수성 중합체를 포함한다. 방법은 또한 친수성 중합체로부터 다수의 소수성 보호기를 절단하는 단계 및 중합체성 입자로부터 소수성 중합체를 추출하여 히드로겔 입자를 형성하는 단계를 포함한다.
제13 측면에서, 입자는 히드록시알킬 아크릴아미드 및 디아크릴아미드의 중합으로부터 형성된 중합체를 포함한다. 디아크릴아미드는 히드록실 기를 포함한다. 입자는 물에 노출될 때 중합체의 중량을 기준으로 적어도 300 중량％의 물을 흡수한다.
제13 측면의 예에서, 입자는 물에 노출될 때 중합체의 중량을 기준으로 적어도 1000 중량％의 물을 흡수한다.
제13 측면 및 상기 예의 또 다른 예에서, 입자는 100 마이크로미터 이하의 입자 크기를 갖는다. 예를 들어, 입자 크기는 30 마이크로미터 이하, 예컨대 1.5 마이크로미터 이하일 수 있다.
제13 측면 및 상기 예의 추가 예에서, 히드록시알킬 아크릴아미드는 히드록시에틸 아크릴아미드를 포함한다.
제13 측면 및 상기 예의 추가 예에서, 히드록시알킬 아크릴아미드는 N-[트리스(히드록시메틸)메틸)아크릴아미드 (A, 하기에 도시됨), N-(히드록시메틸)아크릴아미드 (B, 하기에 도시됨), 또는 이들의 조합을 포함한다.
제13 측면 및 상기 예의 또 다른 예에서, 디아크릴아미드는 N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(2-히드록실 에틸)아크릴아미드, N,N'-(2-히드록시프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, 이들의 보호된 유도체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 디아크릴아미드는 예를 들어, N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-(2-((트리에틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(N-(2-((트리에틸실릴)옥시)프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, 실릴-보호된 N-[2-(아크릴로일아미노)-1,2-디히드록시에틸]아크릴아미드, 예컨대 N,N'(2,3-비스((트리에틸실릴)옥시)부탄-1,4-디일)디아크릴아미드, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
실시양태는 하기 번호의 조항 중 임의의 하나에 따를 수 있다.
1. 수현탁액 내의 분산 상 중에서, 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체의 다수의 머 단위를 중합시켜, 다수의 소수성 보호기를 포함하는 중합체성 입자를 형성하는 단계, 및 중합체성 입자를 친수성 입자로 전환시키는 단계를 포함하는, 입자의 형성 방법.
2. 제1항에 있어서, 친수성 입자가 히드로겔 입자인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 친수성 단량체가 아크릴아미드 단량체를 포함하는 것인 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 친수성 단량체가 라디칼 중합성 단량체이고, 분산된 상이 소수성 보호기를 갖는 디아크릴아미드 가교제를 추가로 포함하는 것인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체성 입자를 전환시키는 단계가 중합체성 입자로부터 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 제거하는 것을 포함하는 것인 방법.
6. 제5항에 있어서, 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 제거하는 것이 중합체성 입자로부터 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 산 절단하는 것을 포함하는 것인 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체성 입자를 전환시키는 단계가 중합체성 입자로부터 다수의 소수성 보호기의 실질적으로 전부를 제거하는 것을 포함하는 것인 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 시드 입자를 수현탁액 중에 촉진시켜 분산된 상을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 보호된 단량체:시드 입자의 질량비가 150:1 내지 1:1 범위인 방법.
10. 제8항에 있어서, 시드 입자가 시드 중합체를 포함하는 것인 방법.
11. 제10항에 있어서, 중합체성 입자를 전환시키는 단계 이후에 시드 중합체를 추출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
12. 제10항에 있어서, 시드 중합체가 소수성인 방법.
13. 제10항에 있어서, 시드 중합체가 스티렌 중합체, 아크릴 중합체, 아크릴아미드, 또 다른 비닐 중합체, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
14. 제8항에 있어서, 시드 입자가 0.6 마이크로미터 이하의 초기 입자 크기를 갖는 것인 방법.
15. 제14항에 있어서, 초기 입자 크기가 0.45 마이크로미터 이하인 방법.
16. 제15항에 있어서, 초기 입자 크기가 0.35 마이크로미터 이하인 방법.
17. 제16항에 있어서, 초기 입자 크기가 0.15 마이크로미터 이하인 방법.
18. 제8항에 있어서, 시드 입자가 1 마이크로미터 내지 7 마이크로미터 범위의 초기 입자 크기를 갖는 것인 방법.
19. 제8항에 있어서, 시드 입자를 촉진시키는 단계가 용매 및 촉진제를 시드 입자와 혼합하는 것을 포함하는 것인 방법.
20. 제19항에 있어서, 촉진제가 소수성이고, 25℃에서 0.01 g/l 미만의 수용해도를 갖는 것인 방법.
21. 제19항에 있어서, 촉진제가 디옥타노일 퍼옥시드 또는 디옥틸아디페이트 또는 20 kD 미만의 분자량을 갖는 폴리스티렌을 포함하는 것인 방법.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 친수성 단량체가 아크릴아미드를 포함하는 것인 방법.
23. 제4항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 라디칼 중합성 단량체가 비닐계 단량체인 방법.
24. 제23항에 있어서, 비닐계 단량체가 아크릴레이트, 아크릴아미드, 비닐 알콜, 비닐 아세테이트, 아크릴아미도-메틸-프로판술폰산, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
25. 제24항에 있어서, 비닐계 단량체가 아크릴아미드인 방법.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 보호기가 히드록실 보호기를 포함하는 것인 방법.
27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 보호기가 아민 보호기를 포함하는 것인 방법.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 보호기가 유기금속 모이어티를 포함하는 것인 방법.
29. 제28항에 있어서, 유기금속 모이어티가 실릴 에테르 관능기를 형성하는 것인 방법.
30. 제29항에 있어서, 실릴 에테르 관능기가 tert-부틸디메틸실란 에테르, 트리메틸실릴 에테르, 트리에틸실릴 에테르, 디페닐 메틸 실릴 에테르, 또는 이들의 조합으로부터 유도되는 것인 방법.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 머 단위를 중합시키는 단계가 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체와 가교제를 혼합하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
32. 제31항에 있어서, 가교제를 혼합하는 것이 15:1 내지 1:2 범위의 친수성 단량체:가교제의 질량비로 가교제를 혼합하는 것을 포함하는 것인 방법.
33. 제32항에 있어서, 범위가 10:1 내지 1:1인 방법.
34. 제31항에 있어서, 가교제가 낮은 수용해도의 가교제이고, 25℃에서 10 g/l 미만의 수용해도를 갖는 것인 방법.
35. 제31항에 있어서, 가교제가 디비닐 가교제인 방법.
36. 제35항에 있어서, 디비닐 가교제가 디아크릴아미드를 포함하는 것인 방법.
37. 제4항 또는 제36항에 있어서, 디아크릴아미드가 N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(2-히드록시프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, 이들의 보호된 유도체, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
38. 제4항 또는 제37항에 있어서, 디아크릴아미드가 N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-(2-((트리에틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(N-(2-((트리에틸실릴)옥시)프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, 실릴-보호된 N-[2-(아크릴로일아미노)-1,2-디히드록시에틸]아크릴아미드, 예컨대 N,N'(2,3-비스((트리에틸실릴)옥시)부탄-1,4-디일)디아크릴아미드, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
39. 제35항에 있어서, 디비닐 가교제가 에틸렌글리콜디메타크릴레이트, 디비닐벤젠, 헥사메틸렌 비스아크릴아미드, 트리메틸올프로판 트리메타크릴레이트, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 머 단위를 중합시키는 단계가 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체와 포로겐을 혼합하는 것을 포함하는 것인 방법.
41. 제40항에 있어서, 포로겐이 방향족 포로겐인 방법.
42. 제41항에 있어서, 방향족 포로겐이 톨루엔, 크실렌, 메시틸렌, 페닐렌에틸 아세테이트 또는 에틸벤조에이트를 포함하는 것인 방법.
43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 친수성 입자 또는 히드로겔 입자를 활성화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
44. 제43항에 있어서, 전환 단계가 히드로겔 입자 상에 하나 이상의 히드록실 기를 제공하는 것을 포함하며, 활성화 단계가 하나 이상의 히드록실 기의 적어도 하나를 알킬 또는 아릴 술폰 에스테르로 전환시키는 것을 포함하는 것인 방법.
45. 제43항에 있어서, 전환 단계가 히드로겔 입자 상에 하나 이상의 히드록실 기를 제공하는 것을 포함하며, 활성화 단계가 하나 이상의 히드록실 기의 적어도 하나를 아지드 관능성 모이어티로 대체하는 것을 포함하는 것인 방법.
46. 제43항에 있어서, 전환 단계가 히드로겔 입자 상에 하나 이상의 아민 기를 제공하는 것을 포함하며, 활성화 단계가 하나 이상의 아민 기의 적어도 하나를 비스-숙신이미딜 C2-C12 알킬 에스테르와 반응시키는 것을 포함하는 것인 방법.
47. 제43항에 있어서, 올리고뉴클레오티드를 활성화된 히드로겔 중합체에 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
48. 제47항에 있어서, 결합 단계가 친핵성 치환을 포함하고, 올리고뉴클레오티드가 친핵체-종결 올리고뉴클레오티드인 방법.
49. 제48항에 있어서, 친핵체-종결 올리고뉴클레오티드의 친핵체가 아민 기인 방법.
50. 제48항에 있어서, 친핵체-종결 올리고뉴클레오티드의 친핵체가 티올 기인 방법.
51. 제47항에 있어서, 폴리뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드에 혼성화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
52. 제51항에 있어서, 폴리뉴클레오티드를 다수의 폴리뉴클레오티드로 증폭시키는 단계, 및 다수의 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부를 히드로겔 입자에 부착시켜, 다수의 부착된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 히드로겔 입자를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
53. 제51항에 있어서, 올리고뉴클레오티드를 연장시킴으로써 폴리뉴클레오티드를 다수의 상보적 폴리뉴클레오티드 내로 증폭시켜, 다수의 부착된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 히드로겔 입자를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 히드로겔 입자가 물에서 2 마이크로미터 이하의 평균 입자 크기를 갖는 다수의 유사하게 형성된 히드로겔 입자 중 하나인 방법.
55. 제54항에 있어서, 평균 입자 크기가 1 마이크로미터 이하인 방법.
56. 제55항에 있어서, 평균 입자 크기가 0.8 마이크로미터 이하인 방법.
57. 제56항에 있어서, 평균 입자 크기가 0.5 마이크로미터 이하인 방법.
58. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 히드로겔 입자가 물 중에서 5 마이크로미터 내지 100 마이크로미터 범위의 평균 입자 크기를 갖는 다수의 유사하게 형성된 히드로겔 입자 중 하나인 방법.
59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 히드로겔 입자가 실질적으로 균일한 크기의 다수의 유사하게 형성된 히드로겔 입자 중 하나인 방법.
60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 히드로겔 입자가 5.0％ 이하의 변동 계수를 갖는 다수의 유사하게 형성된 히드로겔 입자 중 하나인 방법.
61. 제60항에 있어서, 변동 계수가 3.5％ 이하인 방법.
62. 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체의 다수의 머 단위를 중합시켜, 다수의 소수성 보호기를 포함하는 중합체성 입자를 형성하는 단계, 중합체성 입자로부터 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 제거하여 친수성 입자를 형성하는 단계, 및 올리고뉴클레오티드를 친수성 입자에 결합시키는 단계를 포함하는, 입자의 형성 방법.
63. 제62항에 있어서, 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 제거하는 단계가 중합체성 입자로부터 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 산 절단하는 것을 포함하는 것인 방법.
64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 친수성 단량체가 아크릴아미드를 포함하는 것인 방법.
65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 보호기가 히드록실 보호기를 포함하는 것인 방법.
66. 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 보호기가 유기금속 모이어티를 포함하는 것인 방법.
67. 제66항에 있어서, 유기금속 모이어티가 실릴 에테르 관능기를 형성하는 것인 방법.
68. 제62항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 머 단위를 중합시키는 단계가 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체와 가교제를 혼합하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
69. 제68항에 있어서, 가교제가 디비닐 가교제인 방법.
70. 제69항에 있어서, 디비닐 가교제가 디아크릴아미드를 포함하는 것인 방법.
71. 제62항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드를 결합시키는 단계 전에, 히드로겔 입자를 활성화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
72. 제71항에 있어서, 제거 단계가 친수성 입자 상에 하나 이상의 히드록실 기를 제공하는 것을 포함하고, 활성화 단계가 하나 이상의 히드록실 기의 적어도 하나를 술포네이트 에스테르 기로 전환시키는 것을 포함하는 것인 방법.
73. 제71항에 있어서, 제거 단계가 친수성 입자 상에 하나 이상의 히드록실 기를 제공하는 것을 포함하고, 활성화 단계가 하나 이상의 히드록실 기의 적어도 하나를 아지드 관능성 모이어티로 대체하는 것을 포함하는 것인 방법.
74. 제71항에 있어서, 결합 단계가 올리고뉴클레오티드를 활성화된 히드로겔 중합체에 결합시키는 것을 포함하는 것인 방법.
75. 제74항에 있어서, 결합 단계가 친핵성 치환을 포함하고, 올리고뉴클레오티드가 친핵체-종결 올리고뉴클레오티드인 방법.
76. 제75항에 있어서, 친핵체-종결 올리고뉴클레오티드의 친핵체가 아민 기인 방법.
77. 제75항에 있어서, 친핵체-종결 올리고뉴클레오티드의 친핵체가 티올 기인 방법.
78. 제62항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드에 혼성화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
79. 제78항에 있어서, 폴리뉴클레오티드를 다수의 폴리뉴클레오티드로 증폭시키는 단계, 및 다수의 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부를 히드로겔 입자에 부착시켜, 다수의 부착된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 히드로겔 입자를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
80. 제78항에 있어서, 올리고뉴클레오티드를 연장시킴으로써 폴리뉴클레오티드를 다수의 상보적 폴리뉴클레오티드 내로 증폭시켜, 다수의 부착된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 히드로겔 입자를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
81. 적어도 100,000개의 입자를 포함하는 다수의 입자이며, 다수의 입자의 적어도 하나의 입자는 히드로겔을 포함하고, 100 마이크로미터 이하의 평균 입자 크기 및 5％ 이하의 변동 계수를 갖는 다수의 입자.
82. 제81항에 있어서, 적어도 100,000개의 입자 각각이 히드로겔을 포함하는 것인 다수의 입자.
83. 제81항 또는 제82항에 있어서, 변동 계수가 4.5％ 이하인 다수의 입자.
84. 제83항에 있어서, 변동 계수가 4.0％ 이하인 다수의 입자.
85. 제84항에 있어서, 변동 계수가 3.5％ 이하인 다수의 입자.
86. 제85항에 있어서, 변동 계수가 3.0％ 이하인 다수의 입자.
87. 제81항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 평균 크기가 30 마이크로미터 이하인 다수의 입자.
88. 제87항에 있어서, 평균 크기가 1.5 마이크로미터 이하인 다수의 입자.
89. 제88항에 있어서, 평균 크기가 1.1 마이크로미터 이하인 다수의 입자.
90. 제89항에 있어서, 평균 크기가 0.6 마이크로미터 이하인 다수의 입자.
91. 제90항에 있어서, 평균 크기가 0.5 마이크로미터 이하인 다수의 입자.
92. 제81항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 히드로겔이 아크릴아미드 중합체를 포함하는 것인 다수의 입자.
93. 제81항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 입자의 입자가 적어도 60％의 평균 다공도를 갖는 것인 다수의 입자.
94. 적어도 하나의 웰이 ISFET 센서와 작동가능하게 연결된 웰의 어레이; 및 5％ 이하의 변동 계수를 가지며 적어도 하나의 히드로겔 입자가 웰의 어레이의 웰 내에 배치된 다수의 히드로겔 입자를 포함하는 시스템.
95. 수현탁액 내의 분산 상 중에서, 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체의 다수의 머 단위를 중합시켜, 다수의 소수성 보호기를 포함하는 중합체성 입자를 형성하는 단계, 및 중합체성 입자를 히드로겔 입자로 전환시키는 단계를 포함하는 방법에 의해서 형성된 다수의 입자.
96. 제95항에 있어서, 5.0％ 이하의 변동 계수를 갖는 다수의 입자.
97. 제96항에 있어서, 변동 계수가 4.0％ 이하인 다수의 입자.
98. 제97항에 있어서, 변동 계수가 3.5％ 이하인 다수의 입자.
99. 제98항에 있어서, 변동 계수가 3.0％ 이하인 다수의 입자.
100. 제95항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 100 마이크로미터 이하의 평균 크기를 갖는 다수의 입자.
101. 제100항에 있어서, 평균 크기가 30 마이크로미터 이하인 다수의 입자.
102. 제101항에 있어서, 평균 크기가 5 마이크로미터 이하인 다수의 입자.
103. 제102항에 있어서, 평균 크기가 1.5 마이크로미터 이하인 다수의 입자.
104. 제103항에 있어서, 평균 크기가 0.8 마이크로미터 이하인 다수의 입자.
105. 제95항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 친수성 단량체가 아크릴아미드 단량체를 포함하는 것인 다수의 입자.
106. 제95항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 입자가 적어도 60％의 평균 다공도를 갖는 것인 다수의 입자.
107. 아크릴아미드 단량체 및 가교제의 수성 혼합물을 포함하고, 아크릴아미드 단량체는 소수성 보호기를 포함하며, 단량체 및 가교제는 15:1 내지 1:2 범위의 단량체:가교제의 질량비로 포함되는 것인 조성물.
108. 제107항에 있어서, 가교제가 디비닐 가교제인 조성물.
109. 제108항에 있어서, 디비닐 가교제가 디아크릴아미드를 포함하는 것인 조성물.
110. 제109항에 있어서, 디아크릴아미드가 N.N'-(에탄-1,2-디일)비스( -(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(2-히드록시프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, 이들의 보호된 유도체, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 조성물.
111. 제110항에 있어서, 디아크릴아미드가 N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-(2-((트리에틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(N-(2-((트리에틸실릴)옥시)프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, 실릴-보호된 N-[2-(아크릴로일아미노)-1,2-디히드록시에틸]아크릴아미드, 예컨대 N,N'(2,3-비스((트리에틸실릴)옥시)부탄-1,4-디일)디아크릴아미드, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 조성물.
112. 제108항에 있어서, 디비닐 가교제가 에틸렌글리콜디메타크릴레이트, 디비닐벤젠, 헥사메틸렌 비스아크릴아미드, 트리메틸올프로판 트리메타크릴레이트, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 조성물.
113. 제107항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 비율이 10:1 내지 1:1 범위인 조성물.
114. 웰의 어레이 및 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 형성된 입자를 포함하는 장치를 제공하는 단계이며, 적어도 하나의 웰은 ISFET에 작동가능하게 연결되고, 입자는 폴리뉴클레오티드에 부착된 것인 단계; 소정의 유형의 뉴클레오티드를 포함하는 용액을 장치에 적용하는 단계; 및 용액의 적용에 대한 이온성 반응을 관찰하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오티드의 서열분석 방법.
115. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 형성된 입자를 제공하는 단계이며, 입자는 프라이머에 혼성화된 주형 핵산을 포함하는 핵산 듀플렉스에 부착되고, 듀플렉스는 폴리머라제에 결합된 것인 단계; 입자를 하나 이상의 뉴클레오티드와 접촉시키는 단계; 및 폴리머라제를 사용하여 프라이머의 단부 상에 적어도 하나의 뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하는 뉴클레오티드의 도입 방법.
116. 제115항에 있어서, 뉴클레오티드 도입의 부산물을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
117. 제115항 또는 제116항에 있어서, 전계 효과 트랜지스터 (FET)를 사용하여 부산물을 검출함으로써 도입을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
118. 시드 입자를 촉진시켜 수현탁액 중에서 분산 상을 형성하는 단계; 분산 상 중에서, 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체의 다수의 머 단위를 중합시켜, 다수의 소수성 보호기를 포함하는 중합체성 입자를 형성하는 단계; 및 중합체성 입자를 히드로겔 입자로 전환시키는 단계를 포함하는, 입자의 형성 방법.
119. 소수성 중합체를 포함하는 시드 입자를 수현탁액 중에 제공하는 단계; 시드 입자를 촉진시켜 수현탁액 중에서 분산 상을 형성하는 단계; 분산 상 중에서, 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체의 다수의 머 단위를 중합시켜, 다수의 소수성 보호기를 갖는 친수성 중합체를 포함하는 중합체성 입자를 형성하는 단계이며, 중합체성 입자는 소수성 중합체를 포함하는 것인 단계; 친수성 중합체로부터 다수의 소수성 보호기를 절단하는 단계; 및 중합체성 입자로부터 소수성 중합체를 추출하여 히드로겔 입자를 형성하는 단계를 포함하는, 입자의 형성 방법.
120. 5％ 이하의 변동 계수를 갖고, 히드록시알킬 아크릴아미드 및 디아크릴아미드의 중합으로부터 형성된 중합체를 포함하는 입자의 집단이며, 디아크릴아미드는 히드록실 기를 포함하고, 여기서 입자는 물에 노출될 때 중합체의 중량을 기준으로 적어도 300 중량％의 물을 흡수하는 것인, 입자의 집단.
121. 제120항에 있어서, 물에 노출될 때 중합체의 중량을 기준으로 적어도 1000 중량％의 물을 흡수하는 입자.
122. 제120항 또는 제121항에 있어서, 입자 크기가 100 마이크로미터 이하인 입자.
123. 제122항에 있어서, 입자 크기가 30 마이크로미터 이하인 입자.
124. 제123항에 있어서, 입자 크기가 1.5 마이크로미터 이하인 입자.
125. 제120항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 히드록시알킬 아크릴아미드가 히드록시에틸 아크릴아미드를 포함하는 것인 입자.
126. 제120항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 히드록시알킬 아크릴아미드가 N-[트리스(히드록시메틸)메틸)아크릴아미드, N-(히드록시메틸)아크릴아미드, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 입자.
127. 제120항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 디아크릴아미드가 N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(2-히드록실 에틸)아크릴아미드, N,N'-(2-히드록시프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, 이들의 보호된 유도체, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 입자.
일반적인 설명 또는 예에서 상기에 기재된 행위 모두가 필요한 것은 아니며, 구체적인 행위 중 일부는 필요하지 않을 수 있고, 상기에 기재된 것 이외에 하나 이상의 추가 행위가 수행될 수 있음을 인지해야 한다. 또한 추가로, 행위가 열거된 순서는 반드시 그들이 수행되는 순서로 열거된 것은 아니다.
상기 명세서에서, 개념을 구체적인 실시양태를 참조로 설명하였다. 그러나, 당업자는 하기 특허청구범위에서 언급된 바와 같은 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변형 및 변경을 행할 수 있음을 인식한다. 따라서, 명세서 및 도면은 제한 개념이 아니라 예시로서 간주되어야 하며, 이러한 모든 변형은 본 발명의 범주 내에 포함되려는 의도이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함한다", "포함하는", "포함하고 있다", "비롯한", "갖는다", "갖는" 또는 이들의 임의의 변형은 비배타적인 포함을 망라하려는 의도이다. 예를 들어, 특징부의 목록을 포함하는 공정, 방법, 물품 또는 장치는 단지 그러한 특징부로 반드시 제한되는 것은 아니며, 명확하게 열거되지 않거나 또는 그러한 공정, 방법, 물품 또는 장치에 내재하는 다른 특징부를 포함할 수 있다. 또한, 명확하게 반대로 언급되지 않는 한, "또는"은 배타적인-또는이 아니라 포괄적인-또는을 지칭한다. 예를 들어, 조건 A 또는 B는 하기 중 임의의 하나를 충족한다: A가 참이고 (또는 존재하고), B가 거짓임 (또는 존재하지 않음), A가 거짓이고 (또는 존재하지 않고) B가 참임 (또는 존재함), 및 A와 B 모두 참임 (또는 존재함).
또한 부정관사 ("a" 또는 "an")의 사용은 본 발명에 기재된 부재 및 성분을 기재하는데 사용된다. 이것은 단지 편의를 위해서 사용되며, 본 발명의 범주의 일반적인 의미를 제공한다. 이러한 기재는 하나 또는 적어도 하나를 포함하는 것으로 읽혀져야 하며, 달리 의미하는 것이 명백하지 않는 한, 단수형은 복수형을 또한 포함한다.
이익, 다른 이점, 및 문제점에 대한 해결책을 구체적인 실시양태와 관련하여 상기에 기재하였다. 그러나, 이익, 이점 또는 문제점에 대한 해결책, 및 임의의 이익, 이점 또는 해결책을 유발하거나 또는 보다 명확하게 할 수 있는 임의의 특징부(들)는 임의의 또는 모든 특허청구범위의 중요하거나, 필요하거나 또는 본질적인 특징부로서 해석되어서는 안된다.
본 명세서를 읽은 후, 당업자는 명확성을 위해서 별개의 실시양태의 내용으로 본 명세서에 기재된 특정 특징부가 또한 단한 실시양태와 조합되어 제공될 수 있음을 인식할 것이다. 반대로, 간략화를 위해서 단한 실시양태의 내용에 기재된 다양한 특징부가 또한 별개로 또는 임의의 하위조합으로 제공될 수 있다. 추가로, 범위로 언급된 수치의 참고는 그 범위 내의 각각의 수치 및 모든 수치를 포함한다.

Claims (34)

  1. 수현탁액 내의 분산 상 중에서, 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체의 다수의 머(mer) 단위를 중합시켜, 다수의 소수성 보호기를 포함하는 중합체성 입자를 형성하는 단계, 및
    중합체성 입자를 친수성 입자로 전환시키는 단계
    를 포함하는, 입자의 형성 방법.
  2. 제1항에 있어서, 친수성 입자가 히드로겔 입자인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 친수성 단량체가 아크릴아미드 단량체를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 친수성 단량체가 라디칼 중합성 단량체이고, 분산된 상이 소수성 보호기를 갖는 디아크릴아미드 가교제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체성 입자를 전환시키는 단계가 중합체성 입자로부터 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 제거하는 것을 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 제거하는 것이 중합체성 입자로부터 다수의 소수성 보호기의 적어도 일부를 산 절단하는 것을 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체성 입자를 전환시키는 단계가 중합체성 입자로부터 다수의 소수성 보호기의 실질적으로 전부를 제거하는 것을 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 시드 입자를 수현탁액 중에 촉진시켜 분산된 상을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 시드 입자가 시드 중합체를 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 중합체성 입자를 전환시키는 단계 이후에 시드 중합체를 추출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 시드 중합체가 소수성인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 시드 중합체가 스티렌 중합체, 아크릴 중합체, 아크릴아미드, 또 다른 비닐 중합체, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  13. 제8항에 있어서, 시드 입자가 0.6 마이크로미터 이하의 초기 입자 크기를 갖는 것인 방법.
  14. 제8항에 있어서, 시드 입자를 촉진시키는 단계가 용매 및 촉진제를 시드 입자와 혼합하는 것을 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 촉진제가 소수성이고, 25℃에서 0.01 g/l 미만의 수용해도를 갖는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 촉진제가 디옥타노일 퍼옥시드 또는 디옥틸아디페이트 또는 20 kD 미만의 분자량을 갖는 폴리스티렌을 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 친수성 단량체가 아크릴아미드를 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 보호기가 유기금속 모이어티를 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 유기금속 모이어티가 실릴 에테르 관능기를 형성하는 것인 방법.
  20. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 머 단위를 중합시키는 단계가 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체와 가교제를 혼합하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 가교제를 혼합하는 것이 15:1 내지 1:2 범위의 친수성 단량체:가교제의 질량비로 가교제를 혼합하는 것을 포함하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 가교제가 낮은 수용해도의 가교제이고, 25℃에서 10 g/l 미만의 수용해도를 갖는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 가교제가 디비닐 가교제인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 디비닐 가교제가 디아크릴아미드를 포함하는 것인 방법.
  25. 제4항 또는 제24항에 있어서, 디아크릴아미드가 N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(2-히드록시프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, 이들의 보호된 유도체, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  26. 제4항 또는 제24항에 있어서, 디아크릴아미드가 N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(N-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, N,N'-(에탄-1,2-디일)비스(N-(2-((트리에틸실릴)옥시)에틸)아크릴아미드, N,N'-(N-(2-((트리에틸실릴)옥시)프로판-1,3-디일)디아크릴아미드, 실릴-보호된 N-[2-(아크릴로일아미노)-1,2-디히드록시에틸]아크릴아미드, 예컨대 N,N'(2,3-비스((트리에틸실릴)옥시)부탄-1,4-디일)디아크릴아미드, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  27. 제23항에 있어서, 디비닐 가교제가 에틸렌글리콜디메타크릴레이트, 디비닐벤젠, 헥사메틸렌 비스아크릴아미드, 트리메틸올프로판 트리메타크릴레이트, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  28. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 머 단위를 중합시키는 단계가 소수성 보호기를 갖는 친수성 단량체와 포로겐(porogen)을 혼합하는 것을 포함하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 포로겐이 방향족 포로겐인 방법.
  30. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 친수성 입자 또는 히드로겔 입자를 활성화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 올리고뉴클레오티드를 활성화된 히드로겔 중합체에 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 폴리뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드에 혼성화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 올리고뉴클레오티드를 연장시킴으로써 폴리뉴클레오티드를 다수의 상보적 폴리뉴클레오티드 내로 증폭시켜, 다수의 부착된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 히드로겔 입자를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  34. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 히드로겔 입자가 물에서 2 마이크로미터 이하의 평균 입자 크기를 갖는 다수의 유사하게 형성된 히드로겔 입자 중 하나인 방법.
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Families Citing this family (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2625189B1 (en) 2010-10-01 2018-06-27 ModernaTX, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
JP2014511687A (ja) 2011-03-31 2014-05-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッド 工学操作された核酸の送達および製剤
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
HUE057725T2 (hu) 2011-10-03 2022-06-28 Modernatx Inc Módosított nukleozidok, nukleotidok és nukleinsavak és ezek felhasználása
HRP20220717T1 (hr) 2011-12-16 2022-07-22 Modernatx, Inc. Modificirani pripravci mrna
WO2013119956A1 (en) 2012-02-09 2013-08-15 Life Technologies Corporation Conjugated polymeric particle and method of making same
CN106883334B (zh) 2012-02-09 2019-06-18 生命技术公司 亲水性聚合物颗粒及其制备方法
AU2013243947A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US10400280B2 (en) 2012-08-14 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
IN2015DN01126A (ko) 2012-08-14 2015-06-26 10X Genomics Inc
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
ES2921623T3 (es) 2012-11-26 2022-08-30 Modernatx Inc ARN modificado terminalmente
CA2894694C (en) 2012-12-14 2023-04-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
DK2954065T3 (da) 2013-02-08 2021-09-06 10X Genomics Inc Opdeling og bearbejdning af analytter og andre arter
EP2971010B1 (en) 2013-03-14 2020-06-10 ModernaTX, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
WO2015034928A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
JP6439307B2 (ja) * 2013-09-19 2018-12-19 株式会社リコー 流体デバイス、転写材、および流体デバイスの製造方法
EP3052106A4 (en) 2013-09-30 2017-07-19 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EP3052521A1 (en) 2013-10-03 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
CN114534806B (zh) 2014-04-10 2024-03-29 10X基因组学有限公司 用于封装和分割试剂的流体装置、系统和方法及其应用
KR20230070325A (ko) 2014-06-26 2023-05-22 10엑스 제노믹스, 인크. 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 핵산을 분석하는 방법
US20170204152A1 (en) 2014-07-16 2017-07-20 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
US20170210788A1 (en) 2014-07-23 2017-07-27 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
CN107002128A (zh) 2014-10-29 2017-08-01 10X 基因组学有限公司 用于靶核酸测序的方法和组合物
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
BR112017014902A2 (pt) 2015-01-12 2018-03-13 10X Genomics Inc processos e sistemas para a preparação de bibliotecas de sequenciamento de ácido nucleico e bibliotecas preparadas usando os mesmos
WO2016138148A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 10X Genomics, Inc. Methods for targeted nucleic acid sequence coverage
WO2016137973A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 10X Genomics Inc Partition processing methods and systems
KR20180008493A (ko) * 2015-05-18 2018-01-24 10엑스 제노믹스, 인크. 생화학 반응 및 분석에 사용하기 위한 이동성 고체상 조성물
US10144968B2 (en) 2015-07-02 2018-12-04 Life Technologies Corporation Conjugation of carboxyl functional hydrophilic beads
EP3702383B1 (en) * 2015-07-02 2023-12-27 Life Technologies Corporation Polymer substrates formed from carboxy functional acrylamide
CN108350490B (zh) 2015-07-06 2022-06-21 生命技术公司 用于测序的底物和方法
WO2017007838A1 (en) 2015-07-07 2017-01-12 Life Technologies Corporation Method of distributing discrete polymer networks
GB201512725D0 (en) 2015-07-20 2015-08-26 Life Technologies As Polymeric particles
CN105131163B (zh) * 2015-09-11 2017-08-11 福州大学 一种voc吸收剂及其制备方法
ES2910425T3 (es) 2015-09-17 2022-05-12 Modernatx Inc Compuestos y composiciones para la administración intracelular de agentes terapéuticos
DK3718565T3 (da) 2015-10-22 2022-06-20 Modernatx Inc Vacciner mod respiratorisk virus
SG11201804086VA (en) 2015-12-04 2018-06-28 10X Genomics Inc Methods and compositions for nucleic acid analysis
SI3386484T1 (sl) 2015-12-10 2022-06-30 Modernatx, Inc. Sestave in metode za dovajanje terapevtskih sredstev
RS63051B1 (sr) 2015-12-22 2022-04-29 Modernatx Inc Jedinjenja i kompozicije za intracelularnu isporuku agenasa
SI3394093T1 (sl) 2015-12-23 2022-05-31 Modernatx, Inc. Metode uporabe liganda OX40, ki kodira polinukleotid
US20190241658A1 (en) 2016-01-10 2019-08-08 Modernatx, Inc. Therapeutic mRNAs encoding anti CTLA-4 antibodies
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
GB201609983D0 (en) 2016-06-08 2016-07-20 Thermo Fisher Scient Geneart Gmbh And Life Technologies As Solid support
US11583504B2 (en) 2016-11-08 2023-02-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
US10414899B2 (en) 2016-11-30 2019-09-17 Dow Global Technologies Llc Markers for aqueous compositions
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
GB201700983D0 (en) 2017-01-20 2017-03-08 Life Tech As Polymeric particles
EP3545089B1 (en) 2017-01-30 2022-03-09 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
AU2018234814B2 (en) 2017-03-15 2022-06-30 Modernatx, Inc. Crystal forms of amino lipids
WO2018170336A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle formulation
KR20190132405A (ko) 2017-03-15 2019-11-27 모더나티엑스, 인크. 치료제의 세포내 전달을 위한 화합물 및 조성물
CN106952705A (zh) * 2017-03-30 2017-07-14 中国人民解放军装甲兵工程学院 一种再分散性优越的磁流变液及其湿式制备方法
US20180340169A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
CN116064732A (zh) 2017-05-26 2023-05-05 10X基因组学有限公司 转座酶可接近性染色质的单细胞分析
CN111051523B (zh) 2017-11-15 2024-03-19 10X基因组学有限公司 功能化凝胶珠
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
EP3495040A1 (en) 2017-12-08 2019-06-12 ETH Zurich Porous materials, method for producing same and uses thereof
CN112262218A (zh) 2018-04-06 2021-01-22 10X基因组学有限公司 用于单细胞处理中的质量控制的系统和方法
US20210108013A1 (en) * 2018-07-04 2021-04-15 Wacker Chemie Ag Water-soluble copolymers
WO2020037284A1 (en) 2018-08-16 2020-02-20 Life Technologies Corporation System and method for preparing a sequencing device
CN112585695A (zh) 2018-08-16 2021-03-30 生命技术公司 用于自动化试剂验证的系统和方法
US11512356B2 (en) 2018-11-08 2022-11-29 Tokitae Llc Systems and methods for particle multiplexing in droplets
WO2020193368A1 (en) * 2019-03-22 2020-10-01 Qiagen Gmbh Method for improving the amplification efficiency of bead-based emulsion pcr (empcr)
WO2021034709A1 (en) 2019-08-21 2021-02-25 Life Technologies Corporation Systems and methods for providing fluidic access to a flow cell
US11905558B2 (en) 2019-08-21 2024-02-20 Life Technologies Corporation System and method for sequencing
CA3154618A1 (en) 2019-09-19 2021-03-25 Modernatx, Inc. Branched tail lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
TWI758797B (zh) * 2020-07-28 2022-03-21 長庚大學 應用於生物表面檢測之裝置及方法
EP4244388A1 (en) 2020-11-14 2023-09-20 Life Technologies Corporation System and method for automated repeat sequencing
EP4243986A1 (en) 2020-11-16 2023-09-20 Life Technologies Corporation System and method for sequencing
US20220205033A1 (en) 2020-12-31 2022-06-30 Life Technologies Corporation System and Method for Control of Sequencing Process
WO2022146745A1 (en) 2020-12-31 2022-07-07 Life Technologies Corporation Rehydration buffer solutions and methods
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
CN113385306B (zh) * 2021-06-24 2023-02-28 江苏建筑职业技术学院 一种用于低阶煤浮选的纳米粒子捕收剂及制备方法
WO2023161350A1 (en) 2022-02-24 2023-08-31 Io Biotech Aps Nucleotide delivery of cancer therapy
WO2024058579A1 (ko) * 2022-09-16 2024-03-21 주식회사 엘지화학 다공성 고분자 입자, 및 이를 이용한 단백질 정제용 컬럼

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02166102A (ja) * 1988-12-19 1990-06-26 Kao Corp 親水性架橋重合体粒子の製造方法
JP2008504410A (ja) * 2004-06-29 2008-02-14 テヒニーシェ ウニヴェルジテート ウィーン ビス（メタ）アクリルアミド糖を基材としたポリマー担体材料の製造方法

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US278107A (en) 1883-05-22 dowson
CH578592A5 (ko) * 1972-10-27 1976-08-13 Ciba Geigy Ag
US4134916A (en) 1978-02-06 1979-01-16 Texaco Development Corp. N-polyalkoxyalkyl acrylamides or methacrylamides
US4507382A (en) 1983-03-03 1985-03-26 Minnesota Mining And Manufacturing Company Water developable positive acting lithographic printing plate
US4507497A (en) 1983-03-03 1985-03-26 Minnesota Mining And Manufacturing Company Water soluble michlers ketone analogs
US4451613A (en) 1983-03-03 1984-05-29 Minnesota Mining And Manufacturing Company Ethylenically-unsaturated dextrin oligomers
US4511646A (en) 1983-03-03 1985-04-16 Minnesota Mining And Manufacturing Company Ethylenically-unsaturated dextrin composition for preparing a durable hydrophilic photopolymer
JPS6081229A (ja) * 1983-10-11 1985-05-09 Mitsui Petrochem Ind Ltd 水膨潤性架橋重合体の製法
DE3344912A1 (de) * 1983-12-13 1985-06-20 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Vernetzte polymerisate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre anwendung
US4982258A (en) * 1988-05-02 1991-01-01 General Electric Company Metal oxide semiconductor gated turn-off thyristor including a low lifetime region
GB9115372D0 (en) 1991-07-16 1991-08-28 Sinvent As Polymerisation process
US5216096A (en) * 1991-09-24 1993-06-01 Japan Synthetic Rubber Co., Ltd. Process for the preparation of cross-linked polymer particles
US5455143A (en) 1991-10-25 1995-10-03 Minnesota Mining And Manufacturing Company Aminoketone sensitizers for aqueous soluble photopolymer compositions
RU2054009C1 (ru) 1993-05-17 1996-02-10 Прокопов Николай Иванович Способ получения монодисперсного латекса
JPH07179504A (ja) * 1993-12-22 1995-07-18 Fujimori Kogyo Kk 微粒子ポリマーおよびその製造方法
GB9425138D0 (en) 1994-12-12 1995-02-08 Dynal As Isolation of nucleic acid
FR2755693B1 (fr) * 1996-11-14 1998-12-18 Atochem Elf Sa Procede pour l'obtention de polymeres hydrophiles a grande vitesse de dissolution ou de gonflement dans l'eau
JPH10219191A (ja) * 1997-02-03 1998-08-18 Toyo Ink Mfg Co Ltd 高親水性塗料および該塗料を用いてなるアルミニウムフィン材
US7217762B1 (en) 1999-04-09 2007-05-15 Invitrogen Corporation Process for the preparation of monodisperse polymer particles
JP4771029B2 (ja) * 2000-12-28 2011-09-14 Ｊｓｒ株式会社 ポリオルガノシロキサン／有機ポリマー複合粒子の水系分散体およびその製造方法
RU2206575C2 (ru) * 2001-07-25 2003-06-20 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Композиция для иммобилизации биологических макромолекул в гидрогелях, способ приготовления композиции, биочип, способ проведения пцр на биочипе
KR20030096077A (ko) 2002-06-15 2003-12-24 박상규 식품의 신선도 표시기
GB0228914D0 (en) 2002-12-11 2003-01-15 Dynal Biotech Asa Particles
CN1849512B (zh) 2003-07-17 2012-08-22 英维特罗根戴内尔公司 包覆的磁性颗粒的制备方法
GB0406015D0 (en) 2004-03-17 2004-04-21 Dynal Biotech Asa Improvements in magnetic polymer particles
US20060188905A1 (en) 2005-01-17 2006-08-24 Dynal Biotech Asa Process
ATE476505T1 (de) 2005-02-11 2010-08-15 Invitrogen Dynal As Verfahren zur isolierung von nukleinsäuren mit verwendung von ethylenglykol-multimeren
JP2006249389A (ja) * 2005-03-14 2006-09-21 Fuji Xerox Co Ltd 水酸基含有ポリマーの製造方法
JP2007217447A (ja) 2006-02-14 2007-08-30 Tokuyama Corp 水酸基含有重合性化合物及びその製造方法
RU2309959C1 (ru) 2006-02-22 2007-11-10 Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук Применение немодифицированных полимерных материалов для изготовления подложки биочипов, биочип на их основе и способ его изготовления, способ иммобилизации гидрогелей на немодифицированных полимерных материалах
TWI422597B (zh) * 2006-03-29 2014-01-11 Kawamura Inst Chem Res 中空聚合物粒子、著色中空聚合物粒子及彼等之製法
CN101511892B (zh) 2006-06-29 2012-02-29 英维特罗根戴内尔公司 含有多嵌段聚合物的颗粒
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
EP2677308B1 (en) * 2006-12-14 2017-04-26 Life Technologies Corporation Method for fabricating large scale FET arrays
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
ATE553144T1 (de) 2006-12-21 2012-04-15 Invitrogen Dynal As Partikel und ihre verwendung in einem verfahren zur nukleinsäureisolierung oder einem verfahren zur phosphorproteinisolierung
WO2009134414A2 (en) 2008-04-30 2009-11-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Devices for the treatment of wounds and methods and kits thereof
EP2179751A1 (en) * 2008-10-21 2010-04-28 Stichting Dutch Polymer Institute Macroporous polymeric crosslinked materials, method for manufacture thereof and use
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
GB0907372D0 (en) 2009-04-29 2009-06-10 Invitrogen Dynal As Particles
US8574835B2 (en) * 2009-05-29 2013-11-05 Life Technologies Corporation Scaffolded nucleic acid polymer particles and methods of making and using
WO2011106542A2 (en) * 2010-02-24 2011-09-01 Relypsa, Inc. Crosslinked polyvrnylamine, poly all ylamine, and polyethyleneimine for use as bile acid sequestrants
JP5780507B2 (ja) * 2010-06-29 2015-09-16 国立大学法人 岡山大学 生分解性中空微粒子およびその製造方法
CN106883334B (zh) 2012-02-09 2019-06-18 生命技术公司 亲水性聚合物颗粒及其制备方法
WO2013119956A1 (en) 2012-02-09 2013-08-15 Life Technologies Corporation Conjugated polymeric particle and method of making same
US9062079B2 (en) 2012-02-09 2015-06-23 Life Technologies Corporation Hydrophobic diacrylamide compound
US8959987B2 (en) 2012-11-12 2015-02-24 Kerdea Technologies, Inc. Oxygen sensing method and apparatus
EP3702383B1 (en) * 2015-07-02 2023-12-27 Life Technologies Corporation Polymer substrates formed from carboxy functional acrylamide
CA2992096A1 (en) 2015-07-13 2017-01-19 Life Technologies Corporation System and method for improved transient protein expression in cho cells

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02166102A (ja) * 1988-12-19 1990-06-26 Kao Corp 親水性架橋重合体粒子の製造方法
JP2008504410A (ja) * 2004-06-29 2008-02-14 テヒニーシェ ウニヴェルジテート ウィーン ビス（メタ）アクリルアミド糖を基材としたポリマー担体材料の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
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US11572427B2 (en) 2023-02-07
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US20130210991A1 (en) 2013-08-15
RU2014136081A (ru) 2016-03-27

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