PT1078054E - Mp52/gdf-5 monomérica com actividade morfogenética do osso e agente medicinal contendo a mesma para a prevenção e tratamento de doenças da cartilagem e do osso - Google Patents

Description

ΕΡ 1 078 054 /PT DESCRIÇÃO "MP52/GDF-5 monomérica com actividade morfogenética do osso e agente medicinal contendo a mesma para prevenção e tratamento de doenças da cartilagem e do osso"

ANTECEDENTES DO INVENTO (1) Campo do Invento 0 presente invento refere-se às proteínas monoméricas MP52 e GDF-5, nas quais a cisteína relacionada com a formação de dímeros da proteína foi substituída por outro aminoácido. Para além disso, o presente invento refere-se a um método para preparar as referidas proteínas monoméricas em grandes quantidades e com uma elevada pureza através da utilização de Escherichia coli transformada com um plasmídeo contendo uma sequência de ADN que pode expressar uma ou outra das referidas proteínas monoméricas. Para além disso, o presente invento refere-se a um agente contendo uma ou ambas as referidas proteínas monoméricas para prevenir e tratar uma doença que afecte o osso e/ou a cartilagem. (2) Descrição da Arte Relacionada

Actualmente, são conhecidos o estrogénio, a calcitonina, a vitamina D3, seus derivados e derivados do ácido bisfosfónico como agentes preventivos ou terapêuticos para doenças do osso. Recentemente, foi relatado que se verifica uma actividade morfogenética do osso numa série de proteínas morfogenéticas do osso (daqui em diante referidas como "BMP") pertencentes à superfamília do TGF-β, de BMP-2 a BMP-14.

Para além disso, foi relatado que uma proteína designada GDF-5 ou MP52 humana possui uma actividade morfogenética do osso (W0 93/16099, W0 95/04819, W0 94/15949 e Nature 368: 639-643, 1994). GDF-5 tal como descrita em WO 94/15949 é a proteína homóloga de ratinho da MP52 humana.

Considera-se que a MP52 humana madura é uma proteína possuindo 120 resíduos de aminoácido que começam com alanina 2

ΕΡ 1 078 054 /PT no terminal N e a sua sequência de aminoácidos foi descrita nestes pedidos de patente.

Estas proteínas existem como um homodímero possuindo uma única ligação dissulfureto na natureza. Pelo contrário, a produção da sua proteína recombinante é efectuada utilizando os seus homodímeros ou heterodímeros para produzir uma proteína que mostra a actividade. Por exemplo, a MP52 humana foi relatada na publicação de pedido não examinado, JP 031098/97.

Entretanto, há dois tipos designados receptor de tipo I e receptor de tipo II de receptores da superfamília do TGF-β. A transmissão de sinal intercelular através de receptores da superfamília do TGF-β contendo estas proteínas morfogenéticas do osso (dímeros) requer a combinação simultânea destas proteínas com os receptores de tipo I e tipo II e considera-se que se forma um polímero através da união de dois ou mais dímeros para efectuar a transmissão de sinal intercelular (Bone 19: 569-574, 1996). Considerou-se que para a formação do polímero é importante que a proteína seja um dímero. A actividade num monómero não foi ainda verificada. Para além disso, não foi ainda realizada a preparação destes monómeros recombinantes.

SUMÁRIO DO INVENTO

Os presentes inventores tentaram uma produção em massa de monómeros de MP52 humana através de uma tecnologia de engenharia genética utilizando Escherichia coli. Nomeadamente, os presentes inventores construíram um plasmídeo de sequência de ADN que codifica a sequência de aminoácidos possuindo os 119 resíduos descritos em SEQ ID NO:l, entre os quais o codão do resíduo de cisteína N° 83, que está relacionada com uma ligação dissulfureto entre moléculas de MP52 monoméricas, foi convertido no codão de alanina. Adicionalmente, os inventores tiveram sucesso a expressar uma grande quantidade de monómeros de MP52 humana utilizando Escherichia coli através da utilização do plasmídeo e redobragem para produzir monómeros da proteína descrita em SEQ ID NO:l da Listagem de Sequências com uma elevada pureza e um rendimento muito elevado. 3

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Verificou-se surpreendentemente que o monómero possui a actividade para induzir diferenciação em osteócitos nalgumas linhas celulares (MC3T3-E1 e ATDC5) apesar de, na compreensão convencional, apenas um dimero ter uma actividade morfogenética do osso. O presente invento foi terminado observando que a actividade para induzir diferenciação é duas vezes superior à do dimero com base na concentração do peso.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 é um mapa plasmídico do vector de expressão (pKOT279) obtido no Exemplo 1 (2). A Fig. 2 é uma figura comparativa da diferenciação de osteoblastos promovendo actividades entre o monómero do presente invento e o dimero da MP52 humana. (A) Mostra a actividade em células MC3T3-E1 e (B) mostra a mesma em células ATDC5. O circulo branco mostra a actividade do monómero e o circulo preto mostra a mesma do dimero da MP52 humana.

DESCRIÇÃO DA CONCRETIZAÇÃO PREFERIDA

Nomeadamente, o presente invento refere-se às proteínas monoméricas MP52 humanas e à sua homóloga GDF-5 de ratinho, nas quais a cisteína relacionada com a formação de dimeros da proteína foi substituída por outro aminoácido, um método para expressar a referida proteína monomérica e um agente para prevenir e tratar uma doença que afecte o osso e/ou a cartilagem contendo uma ou mais das referidas proteínas monoméricas. O presente invento refere-se às proteínas monoméricas MP52 e GDF-5 nas quais a cisteína relacionada com a formação de dimeros da proteína foi substituída por outro aminoácido. O outro aminoácido pode ser qualquer aminoácido seleccionado de entre um grupo que consiste em alanina, treonina, serina e valina tendo em consideração o tamanho de uma cadeia lateral do aminoácido. 0 aminoácido mais preferido é a alanina. 0 presente invento refere-se a uma proteína monomérica possuindo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID N0:1. Em detalhe, a proteína monomérica é uma proteína na qual 4

ΕΡ 1 078 054 /PT a cisteína é substituída por alanina e a cisteína acima mencionada contribui para a ligação dissulfureto intermolecular de um dímero de MP52 humana possuindo uma ligação dissulfureto intermolecular, e está presente na 83a posição da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:l. A proteína monomérica obtida através do presente invento mostra uma actividade duas vezes mais elevada na indução de diferenciação do que uma proteína dimérica produzida a partir da proteína monomérica.

Para além disso, o presente invento refere-se a um método para preparação da referida proteína monomérica para expressão através da utilização de Escherichia coli, levedura, células de insecto e células de mamífero que foram transformadas com um plasmídeo possuindo uma sequência de ADN capaz de expressão da referida proteína monomérica. Em detalhe, o presente invento refere-se a um método para preparação de uma proteína possuindo 119 resíduos de aminoácido derivados de MP52 humana representados por SEQ ID NO:2, através do emprego de Escherichia coli. Por outras palavras, o presente invento refere-se à construção de um plasmídeo possuindo uma sequência de ADN que codifica uma sequência de aminoácidos na qual é adicionada metionina ao terminal N da sequência de aminoácidos derivada da MP52 humana na qual alanina substituiu a cisteína da 83a posição dos 119 resíduos representados por SEQ ID NO:l. Para o ADNc da MP52 humana, uma porção madura foi amplificada unicamente através de reacção em cadeia da polimerase (método de PCR) através da utilização de um vector plasmídico como ADN molde contendo o ADNc descrito em W0 93/16099. O método de PCR utilizado no presente invento significa uma amplificação geral a partir de uma quantidade muito pequena de um fragmento de ADN ou ARN de um ácido nucleico através do método descrito em USP 4683195.

No presente invento, uma proteína monomérica mutante foi obtida através da construção de um plasmídeo possuindo uma sequência de ADN que codifica uma sequência de aminoácidos na qual é adicionada metionina ao terminal N da sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:l, através de transformação do plasmídeo em Escherichia coli, através da solubilização do corpo de inclusão obtido através da cultura da Escherichia coli e através de purificação. O presente 5

ΕΡ 1 078 054 /PT invento refere-se a um método para preparação da proteína através de redobragem para ter uma actividade, e purificação da referida proteína numa proteína monomérica descrita em SEQ ID NO:2.

Concretamente, para a proteína monomérica do presente invento, a proteína monomérica mutante MP52 foi obtida aplicando os corpos de inclusão solubilizados de Escherichia coli numa coluna de SP-Sepharose FF (Amersham Pharmacia Biotech) e numa coluna de 200 pg Superdex (Amersham Pharmacia Biotech). Subsequentemente, a proteína monomérica purificada do presente invento é obtida através de redobragem e depois passagem através de uma coluna de HPLC RESOURCE RPC de fase inversa (Amersham Pharmacia Biotech). As propriedades físicas e químicas da presente proteína monomérica obtida são analisadas com base nos dados de uma sequência de aminoácidos N-terminal, numa composição de aminoácidos e em electroforese.

As propriedades biológicas da proteína monomérica do presente invento foram avaliadas através da actividade para induzir diferenciação de dois tipos de linhas celulares de osteoblastos nas quais a actividade promotora de fosfatase alcalina tinha já sido verificada num dímero de MP52 humana. Em comparação com a concentração do peso, a proteína monomérica do presente invento mostrou uma actividade duas vezes mais elevada que a da proteína dimérica convencional. O presente invento refere-se a um agente preventivo ou terapêutico para doenças da cartilagem e/ou do osso possuindo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 como ingrediente eficaz. Em detalhe, a proteína monomérica do presente invento possui uma actividade para induzir diferenciação, i.e., uma actividade morfogenética para cartilagem e osso e, portanto, refere-se a um agente preventivo ou terapêutico para osteoporose, doenças congénitas do osso e/ou da cartilagem, e osteoartrite tal como osteoartrite das articulações e osteoartrite das articulações da anca, ou artrosteíte, danos na cartilagem tais como danos no menisco, regeneração do défice de osso e cartilagem causado por ferimento e dissecção tumoral, défice de osso e cartilagem, fractura, doenças congénitas da cartilagem e/ou do osso tais como acondroplasia, discondrogénese, acondrogénese, 6

ΕΡ 1 078 054 /PT palatosquise e disosteogénese, e um défice de raiz dos dentes e de um alvéolo do dente.

Para além disso, a proteína do presente invento, possuindo actividade morfogenética do osso e da cartilagem, pode ser utilizada para terapia de enxerto ósseo no campo da cirurgia estética. A terapia inclui um campo de cirurgia veterinária.

Tal como no método de administração sistémica, são possíveis administrações intravenosa, intramuscular e intra-abdominal; numa administração intravenosa, pode ser aplicado um gotejamento intravenoso para além de uma injecção intravenosa geral.

Uma preparação de injecção pode ser, por exemplo, uma preparação em pó para injecção. No caso, é adicionado um ou mais tipos de excipientes solúveis em água apropriados tais como manitol, sacarose, lactose, maltose, glicose ou frutose para dissolver em água, dividir em frascos ou ampolas, serem liofilizados e selados hermeticamente para formar um produto final.

Para um método de administração local, existe um método para cobrir a superfície de uma cartilagem, osso ou dente do local com a presente proteína através da utilização de uma pasta de colagénio, cola de fibrina ou outros adesivos. Entre estes, um osso utilizado para enxerto ósseo pode também ser aplicado a um osso artificial convencionalmente utilizado bem como a um osso natural. Os ossos artificiais incluem ossos feitos de materiais naturais ou materiais inorgânicos artificiais tais como metais, cerâmica e vidro. Os materiais inorgânicos artificiais são de preferência exemplificados pela hidroxiapatite. Por exemplo, um metal é utilizado para material interno e a hidroxiapatite para material externo de um osso artificial. Para além disso, a presente proteína pode ser administrada a um tecido carcinomatoso para aumentar a reconstrução de um osso. É também possível utilizar-se para enxerto de cartilagem.

Uma dose administrável é determinada por um médico responsável tendo em consideração os vários factores seguintes 7 ΕΡ 1 078 054 /PT que afectam a acção da presente proteína: o peso do osso e da cartilagem a reconstruir, o local e a condição dos danos do osso e da cartilagem, o sexo e a idade do paciente, a gravidade da infecção, a duração da administração e outros factores clínicos. A dose pode variar de acordo com o tipo de transportador utilizado para a reconstrução que é realizada em combinação com a presente proteína. Em general, em relação à dose, são de preferência administrados cerca de 10-106 ng da presente proteína monomérica para um dado peso líquido de osso e cartilagem na utilização como composição contendo um transportador e cerca de 0,1-104 pg para um paciente como injecção para aplicação local e sistémica numa frequência que varia de uma vez por dia a uma vez por semana.

Pode esperar-se um efeito multiplicador da aplicação simultânea de um factor de crescimento conhecido tal como o factor de crescimento I semelhante à insulina para regeneração de osso e cartilagem. Assim, não foi relatado um monómero produzido através da substituição da cisteína da proteína MP52 nem o fabrico industrial deste monómero. O monómero possui uma actividade morfogenética para cartilagem e osso e é útil como agente terapêutico para doenças da cartilagem e/ou do osso. Para além disso, a proteína MP52 monomérica do presente invento mostra uma actividade por peso duas vezes mais elevada do que a de um dímero da proteína e permite a redução para metade de uma dose eficaz de um agente terapêutico para doenças da cartilagem e/ou do osso. Este facto pode ser aplicado ao fabrico dos factores morfogenéticos do osso anteriormente mencionados pertencentes à superfamília do TGF-β. A proteína monomérica derivada da MP52 humana e possuindo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 2 possui uma actividade duas vezes mais elevada a induzir diferenciação numa linha celular de osteoblastos que a do dímero e é útil como agente preventivo ou terapêutico para doenças da cartilagem e/ou do osso. Para além disso, uma mudança de um aminoácido da proteína monomérica do presente invento reduz as cisteínas e torna assim fácil e possível a preparação de uma proteína monomérica pura em massa através da utilização de Escherichia coli. 8

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EXEMPLOS

Este invento será explicado de forma mais ilustrativa por meio dos seguintes Exemplos. Os seguintes Exemplos devem ser considerados em todos os aspectos como ilustrativos e não como restritivos.

Exemplo 1 - Preparação de um vector de expressão do monómero da MP52 humana (1) Isolamento de uma região madura de um mutante da MP52 humana O monómero da MP52 humana foi preparado através da substituição do resíduo de cisteína, que é considerado como formando um dímero com outro resíduo de aminoácido, a fim de impedir a formação de um dímero com o monómero da MP52 humana. No presente invento, o codão da cisteína (TGC) da 83a posição da MP52 humana madura que começa com prolina descrita em SEQ ID NO:l da Listagem de Sequências de WO 96/33215 foi convertido no codão de alanina (GCC). A substituição de um resíduo de aminoácido foi realizada através da utilização um iniciador de PCR (sentido directo) no qual foi introduzida uma mutação objectiva com referência ao método de mutação (Secção 8.5) através de reacção em cadeia da polimerase (PCR) descrita em "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons, Inc.). A sequência do iniciador de PCR utilizado foi descrita em SEQ ID NO:3 como iniciador de sentido directo e em SEQ ID NO:4 como iniciador inverso. A PCR foi executada através da utilização de um vector de expressão da MP52 humana (pKOT245) descrito em WO 96/33215 como ADN molde (10 ng) , 10 pM de cada iniciador de sentido directo e de iniciador inverso, dNTP a 0,4 mM, MgCl2 a 2,5 mM e ADN-polimerase Taq LA (5U, Takara Shuzo Co., Ltd; n° de catálogo RR013A) no mesmo tubo de ensaio. Foram efectuados 30 ciclos de reacção dos quais um ciclo incluiu desnaturação (94°C, 1 min), ligação do iniciador (55°C, 1 min) e extensão do iniciador (72°C, 2 min) . O produto de PCR foi digerido

pelas enzimas de restrição NcoI e HindIII, separado por electroforese com agarose de baixo ponto de fusão a 1,5% (FMC 9

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BioProducts Co., n° de catálogo 5170B) e purificado para obter um fragmento de ADN possuindo cerca de 170 bases como produto final. O vector de expressão da MP52 monomérica humana (pKOT279) foi preparado substituindo um fragmento de ADN NcoI-HindIII no qual foi introduzida uma mutação através do método acima mencionado por uma região NcoI-HindIII de um vector de expressão da MP52 monomérica humana (pKOT277) produzido através da modificação de um vector de expressão da MP52 monomérica humana (pKOT245) descrito em W0 96/33215. Concretamente, através da preparação do vector de expressão da MP52 monomérica humana (pKOT277) a partir do promotor lacZ, que é transcrito no sentido inverso a uma MP52 existente a jusante do terminador do vector de expressão da MP52 monomérica humana (pKOT245) descrito em W0 96/33215, através da digestão do referido vector de expressão de MP52 (pKOT277) pelas enzimas de restrição IVcol e HindlII, através da separação por electroforese em agarose de baixo ponto de fusão a 1,5% (FMC BioProducts Co., n° de catálogo 5170B) e através de purificação, obteve-se um fragmento de ADN possuindo 2717 pares de bases como produto final. O fragmento de ADN e o fragmento do ADN de cerca de 170 pares de bases no qual foi introduzida uma mutação, foram ligados utilizando o "DNA Ligation Kit" (Takara Shuzo Co., Ltd., n° de catálogo 6021) para preparar um vector de expressão da MP52 monomérica humana (pKOT279, 2,9 kb). O vector foi depositado no Nacional Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305-8566 Japão, a 5 de Fevereiro de 1998 (n° do Depósito n° Bikoukenki FERM P-16625) e transferido para a International Depository Authority sob o Tratado de Budapeste a 3 de Fevereiro de 1999 (N° de Depósito FERM BP-6637) . Para a sequência de bases do vector de expressão da MP52 monomérica humana do presente invento, a introdução da mutação objectiva e a exactidão da sequência de bases (outra sequência diferente da do local no qual foi introduzida uma mutação) da MP52 humana produzida foram confirmadas através da utilização de um sequenciador de ADN (Amersham Pharmacia Biotech, ALF). 10 ΕΡ 1 078 054 /PT (2) Transformação A transformação foi efectuada de acordo com o método de cloreto de rubídio de Kushner et al. ("Genetic Engineering" pág. 17, Elsevier, 1978). Nomeadamente, pKOT279 foi introduzido em Escherichia coli W3110M de acordo com o método acima para fazer com que a Escherichia coli expressasse uma proteina no presente invento.

Exemplo 2 - Cultura (1) Cultura A Escherichia coli para expressar uma proteína do presente invento foi pré-cultivada num meio de cultura SOC modificado (20 g/1 de triptona Bacto, 5 g/1 de extracto de levedura Bacto, 0,5 g/1 de NaCl, 0,95 g/1 de MgCl2 e 3,6 g/1 de glicose), foram adicionados 100 ml de suspensão celular (20 g/1 de triptona Bacto, 4,3 g/1 de ácido cítrico, 4,675 g/1 de K2HP04, 1,275 g/1 de KH2P04, 0,865 g/1 de NaCl, 100 mg/1 de

FeS04.7H20, 1 mg/1 de CuS04.5H20, 0,5 mg/1 de MnS04.nH20, 2 mg/1 de CaCl2.2H20, 0,225 mg/1 de Na2B407.10H2O, 0,1 mg/1 de (NH4) 6M07024, 2,25 mg/1 de ZnS04.7H20, 6 mg/1 de CoCl2.6H20, 2,2 g/1 de MgS04.7H20, 5,0 mg/1 de tiamina-HCl, 2 g/1 de metionina e 3 g/1 de glicose) a 5 litros de um meio de cultura para produção para cultivar num vaso de cultura de 10 litros ventilado com agitação, foi adicionado à cultura a uma DO550 superior a 150 isopropil-B-D-tiogalactopiranósido a uma concentração de 1 mM num estádio que alcançou uma profase logarítmica de multiplicação (D055o= 50) . Na cultura, a temperatura foi regulada a 31°C e o pH foi regulado para 7,2 através da adição de amónia. A concentração de oxigénio dissolvido foi regulada para 50% de saturação do ar aumentando a velocidade de agitação a fim impedir uma diminuição na concentração de oxigénio dissolvido. Foi adicionada uma solução de glicose a 50% contendo fosfato 0,1 M para tornar a concentração de glicose 0,2% em relação ao rápido aumento da concentração de oxigénio dissolvido como indicação para tornar uma concentração celular mais elevada na cultura. 11

ΕΡ 1 078 054 /PT (2) Preparação dos corpos de inclusão de Escherichia coli A solução de cultura obtida através do referido método foi passada três vezes através de um homogeneizador de alta pressão (LAB40-10RBF1, APV, Gohrin Co.) sob uma pressão de 560 bar para destruir as células e centrifugada para recolher um precipitado contendo os corpos de inclusão.

Exemplo 3 - Purificação (1) Solubilização dos corpos de inclusão de Escherichia coli

Os corpos de inclusão recolhidos foram lavados duas vezes com solução tampão de Tris-HCl 20 mM (pH 8,3) contendo ureia 1 M e EDTA 5 mM e centrifugados a 4°C e 3000 xg durante 30 min; o precipitado obtido foi solubilizado através de ultra-sons em solução tampão de Tris-HCl 20 mM (pH 8,3) contendo ureia 8 M, NaCl 50 mM, DTT 64 mM e EDTA 5 mM. (2) Purificação da proteína monomérica desnaturada A solução solubilizada foi centrifugada a 4°C e 20000 xg durante 30 min e o sobrenadante foi recolhido. O sobrenadante recolhido foi aplicado na coluna de SP-Sepharose FF (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada com solução tampão de Tris-HCl 20 mM (pH 8,3), ureia 6 M, DTT 10 mM DTT e EDTA 1 mM, lavada com a solução e eluída com a solução contendo NaCl 0,4 Μ. O eluato foi sujeito a filtração em gel com uma coluna Superdex de 200 pg (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada com solução tampão de Tris-HCl 20 mM (pH 8,3), ureia 6 M, NaCl 0,5 M, DTT 10 mM e EDTA 1 mM para obter uma única proteína monomérica desnaturada. (3) Redobragem

Foram adicionadas à solução da proteína monomérica desnaturada obtida através do tratamento de cima, solução tampão de Na-Glicina 50 mM (pH 9,8), NaCl 0,5 M, CHAPS 20 mM e GSSG 3 mM (glutationa oxidada) nove vezes a quantidade, seguido de agitação para redobragem a 4°C durante 20 h. 12

ΕΡ 1 078 054 /PT (4) Purificação de uma proteína monomérica possuindo uma actividade A amostra redobrada foi diluída 2,8 vezes com NaH2P04 14 mM e sujeita a precipitação isoeléctrica. O precipitado foi recolhido através de centrifugação a 3000 xg durante 20 min e dissolvido em TFA a 0,05%. A solução foi aplicada a uma coluna RESOURSE RPC (Amersham Pharmacia Biotech) de HPLC de fase reversa previamente equilibrada com TFA a 0,05% e eluída com TFA a 0,05% e um gradiente de acetonitrilo 0-50%. O eluato foi monitorizado através de um espectrofotómetro a uma absorvância de 280 nm para obter uma fracção de proteína monomérica purificada do presente invento. À fracção proteica, foi adicionado NaOH 5 N para colocar o pH no intervalo entre pH 6,5 e 7,5 para precipitação no ponto isoeléctrico. O precipitado foi recolhido através de centrifugação a 10000 xg durante 10 h e dissolvido em HC1 10 mM para o tornar a cerca de 3 mg/ml para obter uma proteína monomérica possuindo uma actividade do presente invento. (i) Análise da sequência N-terminal A análise N-terminal da composição de aminoácidos da proteína monomérica purificada do presente invento obtida acima foi realizada utilizando um sequenciador (Applied Biosystem, Modelo 476A). (ii) Análise da composição de aminoácidos A composição de aminoácidos da proteína monomérica purificada do presente invento obtida acima foi examinada através de um analisador de aminoácidos (Waters, PICO. TAG. WORK STATION). (iii) Análise electroforética 0 peso molecular da proteína monomérica purificada do presente invento obtida acima foi determinado através de SDS-PAGE sob condições não redutoras como sendo um peso molecular de cerca de 1,4 kDa. 13

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Tal como os resultados dados por (i), (ii) e (iii), verificou-se que a proteína monomérica do presente invento é uma proteína monomérica possuindo 119 resíduos de aminoácido cujo terminal N começa com Pro mostrado em SEQ ID NO: 2 da Listagem de Sequências.

Exemplo 4 - Medição da actividade biológica A actividade indutora de diferenciação foi avaliada através do emprego de duas linhas celulares em cultura; ATDC5 (Riken Gene Bank, RCB 0565) para se diferenciar como uma célula de cartilagem derivada de uma célula embrionária de ratinho e MC3T3-E1 (Riken Gene Bank, RCB 1126) possuindo propriedades como as de um osteoblasto derivado de um ratinho, com base na referência à actividade promotora de fosfatase alcalina da referida proteína. O resultado é mostrado na Fig. 2. ATDC5 e MC3T3-E1 na concentração de 10000 células por ml foram suspensas em meio de cultura DF (Gibco Ltd.) contendo soro fetal bovino a 5% e em meio MEM-oT (Gibco Ltd.) contendo soro fetal bovino a 10%, respectivamente, e inoculadas em 24 placas em 1 ml por poço para cultivar a 37°C durante 3 dias sob CO2 a 5%.

Subsequentemente, as células foram lavadas com o meio MEM-oT sem soro e foram adicionados a 0,5 ml por poço um dímero natural ou uma proteína monomérica diluídos gradualmente com o meio MEM-oT contendo albumina bovina a 0,3% para iniciar a indução da diferenciação. A cultura foi efectuada durante 3 dias, as células foram lavadas com PBS (solução de tampão fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) duas vezes e foram adicionados 250 μΐ de solução citolítica (NP-40 a 0,2%, MgCl2 1 mM) e manteve-se a repousar a 37°C durante 2 horas. Depois deste passo, o volume total da solução citolítica contendo as células rompidas foi transferido para um microtubo e centrifugado (10000 xg, 5 min) para utilizar o seu sobrenadante para ensaio.

Foi medida uma actividade enzimática através da observação do aumento da absorvância de p-nitrofenol (pNp) que é o produto dissociado derivado de fosfato de p-nitrofenilo 14

ΕΡ 1 078 054 /PT como substrato da concentração final de 10 mM através de dissolução em tampão glicina 0,1 M, pH 10,4, ZuCl2 1 mM e MgCl2 1 mM, a 405 nm. O aumento da absorvância foi observado de 2 em 2 min durante 40 minutos e a actividade promotora de fosfatase alcalina (μΜ pNp/min) foi calculada com base nos dados da variação que mostra linearidade.

Adicionalmente, a concentração proteica do mesmo sobrenadante foi conhecida através da utilização de um BCA Protein Assay Kit (Amersham Pharmacia Biotech) e a actividade de fosfatase alcalina por proteína foi representada por nmol pNp/min/mg de proteína.

Texto Livre da Listagem de Sequências <210> 1 <223> Resíduos de aminoácido relevantes em SEQ ID NO:l de 1 a 82 e de 84 a 119 em WO 95/04819.

Nota: o resíduo de aminoácido 83 é alanina em vez de cisteína. <210> 3 <223> Iniciador de PCR de sentido directo para introdução de mutação. <210> 4 <223> Iniciador de PCR de sentido inverso para introdução de mutação.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Hoechst Marion Roussel <120> Nova proteína monomérica com actividade morfogenética do osso e agente medicinal contendo a mesma para prevenção e tratamento de doenças da cartilagem e do osso.

<130> SEQUÊNCIAS DE PCT JH98K008 EM INGLÊS 15 ΕΡ 1 078 054 /PT <140> <141> <150> 10-141379 <151> 1998-05-22 <160> 4 <170> Patentln Ver. 2.1

<210 > 1 <211> 357 <212> ADN <213> HUMANA <2 2 0 > <221> <222> CDS (D · · (357) <223> Resíduos de de 84 a 119 aminoácido em WO 95/0 relevantes 4819 . em SEQ ID NO:1 de 1 a 82 e Nota: o re ci steína. síduo de aminoácido 83 é alanina em vez de <3 0 0 > <301> ΗΟΤΤΕΝ, Gertrud NEIDHARDT, Helge PAULISTA, Michael <302> Novo factor de crescimento/diferenciação da família do TGF-β <310> WO 95/04819 <311> 1995-02-16 16 ΕΡ 1 078 054 /PT <400> 1 cca cta gca act cgt Pro Leu Ala Thr Arg 1 5 cgc tgc agt cgg aag Arg Cys Ser Arg Lys 20 gac gac cgg acc ate Asp Asp Trp Ile Ile 35 ggg ctg tgc gag ttc Gly Leu Cys Glu Phe 50 gca gtc ate cag acc Ala Vai Ile Gin Thr 65 ccc acc gee tgt gtg Pro Thr Ala Cys Vai 85 att gac tet gee aac Ile Asp Ser Ala Asn 100 gtg gag teg tgt ggc . Vai Glu Ser Cys Gly 115

<210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> HUMANA cag ggc aag cga ccc age

Gin Gly Lys Arg Pro Ser 10 gca ctg cac gtc aac ttc Ala Leu His Vai Asn Phe 25 gca ccc ccc gag tac gag Ala Pro Leu Glu Tyr Glu 40 cca ttg cgc ccc cac ctg Pro Leu Arg ser His Leu 5 S ctg acg aac tcc atg gac Leu Met Asn Ser Met Asp 70 75 ccc acg cga ctg agt ccc Pro Thr Arg Leu Ser Pro 90 aac gtg gtg tat aag cag Asn Vai Vai Tyr. Lys Gin 105 tgt agg Cys Arg aag aac ctt aag gct 48 Lys Asn Leu Lys Ala 15 aag gac ata ggc tog 96 Lys Asp Met Gly Trp 30 gct ttc cac tgc gag 144 Ala Phe His Cys Glu 45 gag ccc acg aat cat 192 Glu Pro Thr Asn His 60 ccc gag tcc aca cca 240 Pro Glu Ser Thr Pro 80 ate age ate etc ttc 288 Ile Ser Ile Leu Phe 95 tae gag gac atg gtc 336 Tyr Glu Asp Met Vai 110 357 17 ΕΡ 1 078 054 /PT <400> 2

Pro Leu Ala Thr Arg Gin Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala 15 10 15

Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Vai Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp 20 25 30

Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu 35 40 45

Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His 50 55 60

Ala Vai Ile Gin Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro 65 70 75 80

Pro Thr Ala Cys Vai Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe 85 90 95

Ile Asp Ser Ala Asn Asn Vai Vai Tyr Lys Gin Tyr Glu Asp Met Vai 100 105 110

Vai Glu Ser Cys Gly Cys Arg 115

<210> 3 <211> 39 <212> ADN <213> HUMANA <220> <221> "misc_feature" <222> (1)..(39) <223> Iniciador de PCR de sentido directo para introdução de mutação. <400> 3 catgccatgg accccgagtc cacaccaccc accgcctgt 39

<210> 4 <211> 37 <212> ADN <213> HUMANA 18

ΕΡ 1 078 054 /PT <2 2 0 > <221> "misc_feature" <222> Complemento ((1)..(37)) <223> Iniciador de PCR de sentido inverso para introdução de mutação. <400> 4 cccaagcttg catgcctgcc ggtcgactac ctacagc 37

Lisboa,

Claims (10)

1. ΕΡ 1 078 054 /PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína MP52 ou GDF-5 monomérica da qual a cisteína relacionada com a formação de dímeros da proteína foi substituída por outro aminoácido.
2. 2. Proteína monomérica de acordo com a reivindicação 1, em que o referido outro aminoácido é um aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste em serina, treonina, alanina e valina.
3. 3. Proteína monomérica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o referido outro aminoácido é alanina.
4. 4. Proteína monomérica compreendendo a sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO:2.
5. 5. Método para expressão através da utilização de Escherichia coli, uma levedura, uma célula de insecto ou uma célula de mamífero transformada com um plasmídeo compreendendo uma sequência de ADN que pode expressar uma proteína monomérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
6. 6. Agente compreendendo a proteína monomérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 contendo uma quantidade eficaz da proteína monomérica para prevenir e tratar uma doença que afecte o osso e/ou a cartilagem.
7. 7. Agente para prevenir e tratar uma doença que afecte o osso e/ou a cartilagem de acordo com a reivindicação 6, em que a doença é osteoporose.
8. 8. Agente para prevenir e tratar uma doença que afecte o osso e/ou a cartilagem de acordo com a reivindicação 6, em que a doença é osteoartrite ou artrosteíte.
9. 9. Agente para prevenir e tratar uma doença que afecte o osso e/ou a cartilagem de acordo com a reivindicação 6, em que a doença é uma fractura óssea. ΕΡ 1 078 054 /PT 2/2
10. 10. Agente para prevenir e tratar uma doença que afecte o osso e/ou a cartilagem de acordo com a reivindicação 6, em que a doença é uma falta de raiz dos dentes e de um alvéolo do dente. Lisboa,