JP2997549B2 - 新規なタンパク質およびその製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、MP52由来の配列表配列番号１のアミノ酸配
列を有するタンパク質に関する。また、本発明は前記タ
ンパク質の二量体およびこの二量体タンパク質からなる
軟骨、骨疾患治療剤に関する。また、本発明は上記タン
パク質を発現しうるDNA配列を含むプラスミドで形質転
換した大腸菌を用いて上記タンパク質を大量かつ高純度
で製造する方法に関する。さらに本発明は上記二量体タ
ンパク質を投与することからなる軟骨、骨疾患の治療方
法に関する。

背景技術 現在、骨疾患の予防ないしは治療剤としては、エスト
ロゲン、カルシトニン、ビタミンD3とその誘導体および
ビスホスホン酸誘導体などが知られている。また最近に
なってTGF−βジーンスーパーファミリーに属する骨誘
導因子（Bone morphogenetic protein:以降BMPと呼ぶ）
であるBMP−２からBMP−９等の一連のタンパク質に骨誘
導の作用のあることが報告されている。

さらにMP52と称されるタンパク質（WO 93/16099およ
びWO 95/04819）に骨誘導の作用があることが報告され
ている。成熟型MP52はＮ末端にアラニンを有する120残
基からなるタンパク質であると考えられており、そのア
ミノ酸配列はこれらの特許に記載されている。

またMP52とよく似たアミノ酸配列を有するGDF−５と
称されるマウス由来の蛋白質についてはNature,vol.36
8、p.639−643（1994年）およびWO 94/15949に記載され
ている。

しかしながら、これらのタンパク質を工業的な規模で
純粋な形で製造することは容易ではない。

MP52を遺伝子工学的に製造するに当たってＬ−細胞の
ような動物細胞を使うことが試みられた。しかし純粋な
MP52を収率よく製造することは容易ではない。

発明の開示 本発明者らは、MP52を大腸菌を使って遺伝子工学的手
法により大量に製造することを試みた。すなわちアラニ
ンから始まるMP52をコードするDNAの５プライム末端に
メチオニンをコードするコドンを付加して大腸菌によっ
てMP52を製造することを試みた。その結果生産されるも
のはMP52のみならずＮ末端にメチオニンを有する121残
基のタンパク質、およびＮ末端のアラニンが脱落してプ
ロリンから始まる119残基のタンパク質が生成しこの混
合物からMP52を純粋に分離することは極めて困難であっ
た。

本発明者は、MP52のＮ末端のアラニンを削除した119
残基よりなる配列表配列番号１のアミノ酸配列をコード
するDNA配列の５プライム末端にメチオニンをコードす
るコドンを結合させたプラスミドを構築し、このプラス
ミドを導入した大腸菌を用いて発現させたところ、Ｎ末
端がプロリンから始まる配列表配列番号１記載のタンパ
ク質を選択的に極めて収率よく生産することを見い出し
た。

しかも配列表配列番号１に記載したタンパク質の二量
体は軟骨・骨誘導活性を有することを確認し、本発明を
完成した。

本発明は、配列表配列番号１で示されるアミノ酸配列
を有するタンパク質に関する。このタンパク質は120残
基からなる成熟型部分と見なされているヒトMP52よりＮ
末端のアラニンを削除した119残基のアミノ酸からなる
タンパク質である。本発明により得られるタンパク質は
水溶液に可溶性である。さらに本発明のタンパク質はヒ
ト由来であることを特徴とするため、それ自身の毒性は
少ない。

また本発明は、配列表配列番号１で示されるアミノ酸
配列を有するタンパク質の二量体からなる軟骨および
（または）骨疾患の治療剤に関する。より詳細には、本
発明のタンパク質の二量体は軟骨・骨誘導活性を有する
ため、骨粗鬆症、先天性軟骨・骨疾患、変形性膝関節症
・変形性股関節症等の変形性関節症または、骨関節炎、
半月損傷等の軟骨損傷、外傷・腫瘍摘出等による骨・軟
骨欠損部の再生、骨・軟骨欠損、骨折、軟骨形成不全症
・軟骨発育不全症・軟骨無形成症・口蓋裂・骨形成不全
症等の先天性軟骨・骨疾患、さらには、歯根・歯槽の欠
損等の予防および治療剤に関する。さらに本発明のタン
パク質は軟骨・骨誘導活性を有するため美容外科の骨移
植の治療等に用いることが出来る。これらの治療には、
獣医外科領域のものも含まれる。

本発明は、配列表配列番号１で示されるヒトMP52由来
の119残基のアミノ酸からなるタンパク質を大腸菌を用
いて製造する方法に関する。

さらに、本発明は配列表配列番号１で示されるヒトMP
52由来の119残基のアミノ酸配列をコードするDNA配列の
５プライム末端にメチオニンをコードするDNAを含有す
るプラスミドの構築に関する。ヒトMP52cDNAは、WO 93/
16099記載のcDNAを含んだプラスミドベクターを鋳型DNA
として、成熟型部分のみをポリメラーゼ連鎖反応（PCR
法）用いて増幅した。ここで用いるPCR法とは通常核酸D
NAまたはRNAの微量断片を米国特許番号4,683,195に記載
されている方法で増幅することを意味する。

本発明のタンパク質を生産するために、このタンパク
質をコードしているDNAを含んだ適切な発現ベクターを
構築し、遺伝子工学の手法により好ましい大腸菌の宿主
に導入する事が必要である。本発明のタンパク質を大量
に生産するため以下の２つの改良方法を施した。１）目
的蛋白質の生産性を上げる方法:M.Nobuharaらが報告（A
gric.Biol.Chem.,52（６）,1331〜1338,1988）している
翻訳効率を上げる方法、即ち、開始コドンATG周辺のAT
含量を上げる方法、および２）プラスミドの複製数を上
げる方法、即ち複製オリジンをpBR系からpUC系に改変す
る方法。さらにプロモーター領域と配列表配列番号１の
アミノ酸配列をコードするDNA配列とを直接つなぐこと
により本発明の発現ベクター（pKOT245）を構築した。
このベクターは通商産業省、工業技術院国立生命科学・
人間技術研究所（NIBH）（茨城県筑波郡谷田部町東１丁
目１−３（日本）に1995年４月14日付で受託番号FERM P
−14895号として寄託され、1996年４月10日付でブタペ
スト条約に基づく寄託へ移管された（FERM BP−549
9）。

本発明は、配列表配列番号１で示されるアミノ酸配列
をコードするDNA配列の５プライム末端にメチオニンを
コードするコドンを付加したDNAを含有するプラスミド
を構築し、そのプラスミドで大腸菌を形質転換し、その
大腸菌を培養することによて得られるインクルージョン
ボディを可溶化し、精製することによって得られる単量
体のタンパク質、およびこれを再生、精製することによ
って得られる配列表配列番号１のタンパク質の二量体の
タンパク質の製造方法に関する。すなわち、本発明のタ
ンパク質は大腸菌インクルージョンボディを可溶化した
後、SP−Sepharose FFカラムおよびSephacryl S−200カ
ラムにより単一なスルホン化MP52単量体を得た。それか
らリフォールディングを行った後等電点沈殿し、逆相HP
LCのRESOURCE RPCカラムを通すことにより本タンパク質
の精製二量体画分を得た。得られた本タンパク質の物理
化学的性質はＮ末端アミノ酸配列、アミノ酸組成および
電気泳動による分析で解析した。

本発明は、さらに本発明の発現ベクターを組み込んだ
大腸菌の培養を培養液の温度28℃〜34℃、pH6〜８、溶
存酸素濃度20〜50％の条件下で行う製造方法に関する。

本発明のタンパク質の二量体の生物学的活性は異所性
軟骨・骨形成（エクトピックボーンフォーメーション）
の軟Ｘ線写真撮影解析、組織学的解析および経時的解析
により評価した。さらに、膜内骨化に対する作用、間接
軟骨の再生に対する効果および骨折・骨欠損に対する治
癒効果により、本発明のタンパク質が軟骨・骨再建に有
効であることを確認した。

全身投与方法としては静脈内、筋肉内および腹腔内投
与が可能であり、静脈内投与の場合は通常の静脈内注射
の他点滴静注が可能である。

注射用製剤としては、例えば注射用粉末製剤とするこ
とができる。その場合は適当な水溶性賦形剤、例えばマ
ンニトール、ショ糖、乳糖、マルトース、ブドウ糖、フ
ルクトース等の一種または２種以上を加えて水で溶解
し、バイアルまたはアンプルに分注した後、凍結乾燥し
密封して製剤とすることができる。

局所投与方法としては、その部位の軟骨・骨あるいは
歯の表面をコラーゲンペースト、フィブリンのりまたは
他の接着剤を用いて本タンパク質で覆う方法がある。こ
れらのうち骨移植に用いる骨は天然骨の他、従来用いら
れる人工骨にも利用できる。人工骨とは金属、セラミッ
クス、ガラス等の天然素材または人工無機質素材で出来
た骨を意味する。人工無機質素材として好ましくはハイ
ドロキシアパタイトがあげられる。例えば、人工骨の内
部材料に金属そしてその外側の材料にハイドロキシアパ
タイトを使用する。さらに、本タンパク質は骨再構築を
促進するために癌性骨組織にも投与出来、また、軟骨移
植にも利用可能である。

投与量については、本タンパク質の作用に影響する様
々な要因、たとえば、形成が望まれる骨・軟骨の重量、
骨・軟骨損傷の部位およびその状態、患者の年齢、性
別、感染の重症度、投与時間および他の臨床要因を考慮
して担当医が決定する。また、用量は本タンパク質との
再構成に用いる担体の種類によって変動し得る。一般的
に、投与量は、支持体との組成物として使用するとき、
所望の骨・軟骨湿重量当たり、本タンパク質約10〜10⁶
ナノグラム、注射剤として局所および全身性に適用する
とき、患者１人当たり0.1〜10⁴マイクログラムを一週間
に一度から一日に一度の頻度で投与することが好まし
い。

骨・軟骨再生に対して既知の成長因子例えばinsulin
−like growth factor−Ｉ（IGF−Ｉ）等を同時適用す
ることにより相乗効果が期待できる。

このように本発明のタンパク質を工業的な規模でしか
も純粋な形で製造する方法は今まで報告されておらず、
軟骨・骨誘導活性を有する軟骨、骨疾患治療剤として有
効である。さらに本発明の製造方法は今まで動物細胞で
のみしか産生できなかったTGF−βジーンスーパーファ
ミリーに属する前述の骨誘導因子の製造にも応用でき
る。

図面の簡単な説明 図１は、実施例１（２）で得られた本発明のタンパク
質の発現ベクター（pKOT245）のプラスミドマップであ
る。

図２は、実施例４（１）で得られたマウス大腿筋内に
誘導された骨・軟骨石灰化組織の軟Ｘ線写真である。

図３は、実施例４（１）で得られたマウス大腿筋内に
誘導された骨・軟骨石灰化組織の非脱灰切片の組織染色
顕微鏡写真である。

図４は、実施例４（２）で得られたマウス大腿筋内に
おいて観察された軟骨・骨誘導の経時的変化を示す組織
染色顕微鏡写真である。

図５は、実施例４（３）で得られたラット頭頂骨の脱
灰切片の組織染色顕微鏡写真である。

図６は、実施例４（４）で得られた家兎の関節軟骨を
含む大腿骨頭部の脱灰組織切片の組織染色顕微鏡写真で
ある。

図７は、実施例４（５）で得られた大腿骨に骨欠損が
作成されたラットの大腿部の軟Ｘ線写真である。

発明を実施するための最良の形態 次に、実施例を示して本発明の効果を具体的に説明す
る。なお、本発明はこれらの実施例により限定されるも
のではない。

実施例１ ベクターの作製 （１） 変異型MP52成熟型部分の単離 ヒトMP52cDNAは、WO 93/16099に記載されたcDNAを含
んだプラスミドベクター（pSK52s）を鋳型DNAとして、
成熟型部分のみをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用い
て増幅した。

開始コドンATG周辺のAT含量を上げる事により、目的
タンパク質の生産性を上げる方法｛M.Nobuharaらの報告
（Agric.Biol.Chem.,52（６）,1331〜1338,1988）｝に
従い成熟型のMP52遺伝子の一部のDNAを置換した。

置換の方法は、配列番号２の順方向PCRプライマーを
用い、PCR法で行った。PCRプライマーのDNA配列は、順
方向プライマーとして配列番号２、および逆方向プライ
マーとして配列番号３記載のDNAを用いた。

PCRは、同じ試験管中で、鋳型DNA（10ナノグラム）、
順方向および逆方向PCRプライマー各々50ピコモル、dNT
P（0.2ミリモル）、およびMgCl₂（1.5ミリモル）をTaq
DNAポリメラーゼ（5U）と共に加えることにより行っ
た。

各サイクルが、変性（94℃、１分間）、プライマーア
ニーリング（55℃、１分間）、およびプライマー伸長
（72℃、２分間）からなる30サイクルのPCRを行った
（以下のPCRはすべてこの条件で行った）。

PCR反応からの生成物を1.5％低融点アガロース（FMC
社）中で電気泳動により分離し、配列番号１のアミノ酸
配列に相当する約360bpからなるDNAを切り出した（これ
をフラグメント１とする）。

（２） 本タンパク質の大腸菌発現ベクターの構築 プラスミドの複製数を上げるためには、複製オリジン
をpBR系からpUC系に改変した。市販の大腸菌発現ベクタ
ーpKK223−３（ファルマシア・バイオテク株式会社より
購入）のtacプロモーター領域を制限酵素SspIとEcoRIで
消化後、Mung Bean Nuclease（宝酒造株式会社，カタロ
グ番号2420A）で処理し、フラグメント１の開始コドン
側にT4DNA Ligase（宝酒造株式会社，カタログ番号2011
A）で結合させ、pKK223−３のrrnBT₁T₂ターミネーター
領域を制限酵素SalIとSspIで消化し、SalIで消化したフ
ラグメント１の終止コドン側に結合させ、pUC18のSmaI
部位に組み込むことにより、本タンパク質の生産のため
の発現ベクター｛pKOT245（受託番号微工研寄第Ｐ−148
95号）｝（図１）を構築した。pKOT245のDNAの長さは3.
7kbである。作製した本発明のタンパク質発現ベクター
は、Pharmacia ALF DNAシークエンサーによりその塩基
配列の決定を行った。

（３） 形質転換 形質転換は、Kushnerらの塩化ルビジウム法（Genetic
Engineering,p.17,Elsevier（1978））に従った。即
ち、pKOT245を宿主大腸菌W3110Mへの上記の手法に従い
移入し、本発明のタンパク質生産大腸菌とした。

実施例２ 培養 （１） 培養 本発明のタンパク質発現大腸菌を改変SOC培地（Bacto
tryptone 20g/,Bacto yeast extract 5g/,NaCl 0.
5g/,MgCl₂・6H₂O 2.03g/,Glucose 3.6g/）で前培
養し、生産用培地（Bacto tryptone 5g/,Citric acid
4.3g/,K₂HPO₄ 4.675g/,KH₂PO₄ 1.275g/,NaCl 0.
865g/,FeSO₄・7H₂O 100mg/,CuSO₄・5H₂O 1mg/,Mn
SO₄・nH₂O 0.5mg/,CaCl₂・2H₂O 2mg/,Na₂B₄O₇・10H
₂O 0.225mg/，（NH₄）₆Mo₇O₂₄・4H₂O 0.1mg/,ZnSO₄
・7H₂O 2.25mg/,CoCl₂・6H₂O 6mg/,MgSO₄・7H₂O 2.
2g/,Thiamine HCl 5.0mg/,Glucose 3g/）5Lに対
し菌体懸濁液を100ml添加し、10Lの培養槽で通気攪拌し
ながら培養し、対数増殖前期（OD550＝5.0）に達した段
階で1mMの濃度でイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト
ピラノシドを添加し、さらにOD550が150に達するまで培
養した。培養中、温度は32℃、pHはアンモニアを添加す
ることにより7.15に制御し、溶存酸素濃度の低下を防ぐ
ために攪拌速度をあげることにより空気飽和の50％に溶
存酸素濃度を制御した。また、高菌体濃度とするために
溶存酸素濃度の急激な上昇を指標として、50％グルコー
ス溶液を0.2％濃度で添加しながら培養した。

（２） 大腸菌インクルージョンボディの調製 上記方法により得られた培養液を遠心して菌体を回収
し、10mMエチレンヂアミン四酢酸を含む25mM Tris−HCl
緩衝液を（pH7.3）に懸濁し菌体破砕装置（ゴーリン社
製）を用いて最近を破砕し、再度遠心してインクルージ
ョンボディを含む沈殿を回収した。

実施例３ 精製 （１） 大腸菌インクルージョンボディの可溶化 大腸菌インクルージョンボディを１％Triton X−100
で３回洗浄後、3000×ｇで30分間、４℃で遠心し、得ら
れた沈殿を20mM Tris−HCl緩衝液、pH8.3、8M尿素、10m
M DTT、1mM EDTAで超音波をかけながら可溶化した。

（２） 単量体精製 その可溶化液を20000×ｇで30分間、４℃で遠心し、
その上清を回収した。得られた上清を20mM Tris・HCl緩
衝液pH8.3、6M尿素、1mM EDTAで平衡化したSP−Sepharo
se FF（ファルマシア社）に通し、同溶液で洗浄後、0.5
M食塩を含む同溶液で溶出させた。溶出液にNa₂SO₃とNa₂
S₄O₆をそれぞれ最終濃度が111mM、13mMになるように加
え４℃、15時間スルホン化を行った。スルホン化溶液を
20mM Tris−HCl緩衝液、pH8.3、6M尿素、0.2M食塩、1mM
EDTAで平衡化したSephacryl S−200HR（ファルマシア
社）でゲル濾過を行い、単一なスルホン化された本発明
のタンパク質単量体を得た。

（３） リフォールディング スルホン化された本発明のタンパク質単量体の溶液に
９倍量の50mM Na−Glycine緩衝液pH9.8、0.2M塩化ナト
リウム、16mM CHAPS、5mM EDTA、2mM GSH（還元型グル
タチオン）、1mM GSSG（酸化型グルタチオン）を加えた
後、１日間、４℃で撹拌しリフォールディングを行っ
た。

（４） 二量体精製 リフォールディングされた試料を純水で２倍希釈し、
6N塩酸を加えpHを約7.4に合わせて等電点沈殿を行っ
た。沈殿を3000×g 20分の遠心で集めた後、30％アセト
ニトリル、0.1％TFAに溶解した。その溶液を純水で２倍
希釈し、0.05％TFA、25％アセトニトリルで平衡化して
おいた逆相HPLCのRESOURCE RPCカラム（ファルマシア
社）に通し、0.05％TFA、25〜45％アセトニトリルグラ
ジェントにより溶出した。溶出液は吸光度光度計を用い
280nmの吸光度によりモニターし、精製された本発明の
タンパク質二量体画分を得た。これを、スピードバック
コンセントレーター（サーバント社）により凍結乾燥し
た。

（５） 精製された本発明のタンパク質の物理化学的性
質の測定 （ア） Ｎ末端アミノ酸配列分析 上記で得られた精製された本発明のタンパク質につ
き、Ｎ末端アミノ酸配列をアミノ酸シークエンサー、モ
デル476A（アプライドバイオシステムズ社）により分析
したところ、配列表配列番号１で示すＮ末端から30番目
までのアミノ酸配列が確認された。

（イ） アミノ酸組成分析 上記で得られた精製された本発明のタンパク質のアミ
ノ酸組成をアミノ酸分析機〔PICO TAGシステム（ウォー
ターズ社）〕により調べた。その結果を表１に示す。表
に示された数は１モノマー当りのアミノ酸残基数を示
す。

（ウ） 電気泳動による分析 上記で得られた精製された本発明のタンパク質の分子
量を非還元条件下のSDS−PAGEにより確認したところ、
約28KDaの分子量を示した。

上記（ア）、（イ）および（ウ）に示された結果よ
り、本発明のタンパク質はＮ末端が単一にProから始ま
る119残基からなるタンパク質であることが解った。

実施例４ 生物学的活性の測定 （１） 異所性軟骨・骨組織の誘導作用 実施例３により得られたタンパク質約500μｇを10mM
塩酸50μに溶解、同溶媒で希釈し、１μｇ、/10μ
、10μg/10μ、および100μg/10μの濃度の溶液
を調製し、その10μを豚腱由来type−Ｉコラーゲン溶
液150μ（高研、0.5％、pH3、Ｉ−AC）と混和し、中
和した後、凍結乾燥し、得られた混和物を８週令の雄性
ICRマウスの大腿筋内に埋め込み、21日後に大腿部を摘
出し、皮膚を剥離した後、軟Ｘ線写真撮影により、骨・
軟骨石灰化組織の発現率を検討した。表２にその結果を
示す。１μg/部位以上の用量においてその発現を認め、
10μg/部位以上の用量において用いられたマウス全例に
その発現を認めた。

また、図２に各用量における典型的な骨・軟骨石灰化
組織の軟Ｘ線写真像を示す。図２において、ＡはMP52タ
ンパク質１μg/部位、ＢはMP52タンパク質10μg/部位、
ＣはMPタンパク質100μg/部位の用量でそれぞれMP52タ
ンパク質をマウス大腿筋肉に埋め込んだ例の結果を示
す。この結果より、用量依存的な骨・軟骨石灰化組織の
増加が認められた。さらにこれらマウスの大腿部を、固
定後、非脱灰切片を作成し、フォンコッサ（von Koss
a）染色、アルシアンブルー（Alcian blue）染色、およ
びヘマトキシリン−エオシン（Hematoxylin−eosin）染
色をそれぞれ実施した。

図３に、本タンパク質10μg/部位の用量においてtype
−Ｉコラーゲンとともに埋め込まれた標本の組織染色の
顕微鏡写真を示す。図３において、Ａはフォンコッサ染
色、Ｂはアルシアンブルー染色、Ｃはヘマトキシリン−
エオシン染色をそれぞれ示す。

図３（Ａ）において、矢印ctの部分は石灰化組織を示
し、矢印ccの部分は石灰化軟骨細胞を示す。図３（Ｂ）
において、矢印rcの部分は残存軟骨組織を示す。図３
（Ｃ）において、矢印ad部分は脂肪細胞、矢印bm部分は
骨髄細胞、矢印1b部分は層板骨、矢印ob部分は骨芽細
胞、矢印wb部分は線維性骨をそれぞれ示す。図３から、
MP52タンパク質の投与により、骨芽細胞、骨髄細胞、石
灰化軟骨細胞が生成し、骨・軟骨石灰化組織が形成され
ることが明らかである。

実施例４の結果から、本発明のタンパク質の二量体
は、軟骨・骨誘導作用を有することが明らかとなった。

（２） 異所性骨化作用の経時的解析 実施例３により得られたタンパク質約３μｇを含有す
る実施例４（１）に記載された方法で同様に調製した凍
結乾燥物をICRマウスの大腿筋中に埋め込み、３、７、1
0、14、21および28日後に組織を摘出、10％ホルマリン
で固定後、それらの組織切片にヘマトキシリン−エオシ
ン染色（HE）およびフォンコッサ染色（von Kossa）を
施した。図４にその染色切片の光学顕微鏡写真像を示
す。

３日目（図4A、HE）において、埋め込まれたコラーゲ
ン線維（co）と周囲の筋組織（ｍ）との間に、形態学的
には結合織性細胞を含む未分化間葉系細胞（mc）の出現
が認められた。７日目（図4B、HE）から10日目（図4C、
HE）にかけて、この部位には未分化間葉系細胞（mc）が
集積・増殖し、未分化間葉系細胞の肥大化および前軟骨
様組織への変化が認められた。14日目（図4D、HE;図4
E、von Kossa）において、石灰軟骨組織（矢印cc）およ
び骨組織（矢印ｂ）の形成を認めた。21日目（図4F、H
E;図4G、von Kossa）において、骨髄細胞（矢印bm）の
形成が見られる一方、14日目に観察された石灰化軟骨組
織はほとんど認められず、石灰化軟骨組織が骨組織（矢
印ｂ）に変換されたものと考えられた。28日目（図4H、
HE）において、広範囲に骨髄細胞（bm）が認められ、形
成された骨組織（ｂ）は、吸収過程にあるようであっ
た。

このように、rMP52は、従来BMPsについて明らかにさ
れているように異所性に軟骨組織を誘導し、引き続き、
軟骨内骨形成を引き起こすことができるタンパク質であ
ることが明らかであった。

（３） 膜内骨化に対する作用 実施例３により得られたタンパク質を0.01％ヒト血清
アルブミンを含む生理的リン酸緩衝液（pH3.4）に溶解
し、0.01μg/20μ、0.1μg/20μおよび１μg/20μ
溶液を調製し、その20μをスプラグドーレー系ラッ
トの左右の頭頂骨のうちその一方の骨膜に生後１日目か
ら、マイクロシリンジを用いて一日一回、12日間連日同
一部位に注射した。他方の頭頂骨骨膜内には同量のその
溶媒を注射した。また、両方の頂骨骨膜にその溶媒を注
射し、比較対照とした。最終投与一日後に、左右頭頂骨
を摘出・固定後、投与部位を横断する脱灰ヘマトキシリ
ン−エオシン染色標本を作成し、左右頭頂骨投与部位の
厚さを顕微鏡写真上にて測定し、同一固体における溶媒
投与部位の厚さに対する本発明の蛋白質投与部位の厚さ
の比を算出した。表３にその結果を示す。また、図５に
本発明の蛋白質0.1μg/20μを連続注射した場合の組
織切片の光学顕微鏡写真像の一例（図5B）を反対側溶媒
投与群のそれ（図5A）とともに示す。本発明の蛋白質投
与により、骨膜細胞（ｐ）の活性化および増殖が認めら
れるとともに、活性化された骨芽細胞（矢印ob）が頭頂
骨内および骨膜（ｐ）との協会領域に数多く出現し、用
量依存的に頭頂骨（ｂ）の厚さが投与部位において増す
事が明らかである。このことは、本発明の蛋白質が、少
なくとも局所注入した場合、膜骨化を亢進し、骨粗鬆
症、骨折ならびに歯槽、歯根欠損の治療に有用であるこ
とが示された。

（４） 関節軟骨の再生に対する効果 ６匹の12週令の雄性家兎（ニュージーランドホワイ
ト）の右側膝部の皮膚および関節包を切開の後、腱を損
傷しないように大腿骨の膝蓋骨溝を露出し、その部位に
歯科用ドリルを用いて直径5mmの骨髄腔まで貫通した関
節軟骨・骨欠損を作成し、その欠損部位に実施例３によ
り得られたタンパク質約10μｇ含有または非含有タイプ
−Ｉコラーゲン凍結乾燥物を実施例４（１）に記載され
た方法と同様に調製し、３例ずつ埋め込み、関節包おび
皮膚を縫合し、３週間後に、大腿骨頭を摘出・固定後、
全例の脱灰組織切片を作成し、アルシアンブルー染色を
行った。図６にそれぞれの典型的一例の光学顕微鏡写真
像を示す。タイプ−Ｉコラーゲン凍結乾燥物のみを埋め
込んだ場合（図6Aおよび6B）、欠損部位（矢印ｄ）には
線維性の組織（ｆ）を認めるのみであったが、実施例３
により得られた本発明のタンパク質約10μｇ含有タイプ
−Ｉコラーゲンを埋め込んだ場合（図6Cおよび6D）、欠
損部位に細胞外にアルシアンブルー染色陽性の基質の沈
着を伴った、軟骨細胞（ch）の形成を認めた。また、そ
の形成された組織は、正常関節軟骨組織において観察さ
れる静止細胞層、増殖細胞層、肥大細胞層といった層状
構造に類似の細胞構成構造を欠損部位の外側から内側へ
と構築していた。これらの所見は、用いられた家兎のい
ずれにおいても認められ、本発明のタンパク質が、軟骨
の再生、特に、変形性関節症または骨関節炎等により引
き起こされた関節軟骨変性組織の正常組織への回復に有
効であることを示している。

（５） 骨折・骨欠損に対する治癒効果 30匹のスプラグドーレー系雄性ラット（約15週令）を
用い、大腿部の皮膚組織を切開、周囲筋肉組織から大腿
骨を露出させ、大腿骨骨幹部中央に歯科用ドリルにて5m
mの円柱状の骨欠損部を作成、残存大腿骨両端をステン
レス製ネジを用いてポリエチレン製のプレートで固定し
た。実施例３により得られたタンパク質０、約１、10ま
たは100μｇ含有タイプ−Ｉコラーゲン凍結乾燥物をそ
の骨欠損部位に埋め込み、皮膚組織を縫合した。埋め込
み直後および12週目においてそれらの軟Ｘ線写真撮影を
行った結果を図７に示す。図7Aは骨欠損作成時の写真で
ある。図7B〜Ｅに示されている如く、タイプ−Ｉコラー
ゲン単独（図7B）および本研究のタンパク質１μｇ含有
タイプ−Ｉコラーゲン（図7C）の埋め込みでは12週目に
おいて欠損部両端からの若干の仮骨（矢印cs）の形成を
認めたのみであり、骨癒合には至らなかった。一方、10
または100μｇ含有タイプ−Ｉコラーゲン（図Ｄおよび
図Ｅ）の埋め込みではその骨欠損部位全体に亙って仮骨
（矢印cs）の形成を認め、Ｘ線上で骨癒合を認めた。12
週目において大腿骨を摘出、ポリエチレン製プレートを
はずし、二重Ｘ線吸収法（Aloka,DCS−600）により1mm
間隔のスキャンニングモードで骨欠損作成部を含む大腿
骨長軸方向15mmを連続的にその方向に対して垂直に走査
し、作成骨欠損中央部3mm相当部位における骨塩量を積
算するとともに料骨端を樹脂で固定し、骨強度測定装置
（マルトー製作所、MZ−500D）に装着し、180゜／分の
スピードで下部樹脂で回転させ、大腿骨を破壊するのに
必要な最大ねじり力を測定した（表４）。本発明のタン
パク質のラット大腿骨欠損部位への埋め込みはこのよう
に、用量依存的にその部位での骨塩量を増加させるとと
もに、その部位の骨強度（ねじり力）を上昇させること
が示され、本発明のタンパク質が、骨折の治癒おび骨欠
損部における骨再建に有効であることを示している。

産業上の利用可能性 配列表配列番号１記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質の二量体からなるタンパク質は軟骨・骨誘導活性を
有し、軟骨、骨疾患の治癒剤として有用である。さらに
本発明のタンパク質の発現ベクターを改変することによ
り大腸菌を用いた遺伝子工学の手法により工業的な規模
で純粋な形で該タンパク質を製造することが可能であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 三木 秀夫 埼玉県川越市南台１丁目３番地２ 日本 ヘキスト・マリオン・ルセル株式会社創 薬研究所内 (72)発明者 河合 伸治 埼玉県川越市南台１丁目３番地２ 日本 ヘキスト・マリオン・ルセル株式会社創 薬研究所内 (72)発明者 木村 道夫 埼玉県川越市南台１丁目３番地２ 日本 ヘキスト・マリオン・ルセル株式会社創 薬研究所内 (72)発明者 松本 智明 埼玉県川越市南台１丁目３番地２ 日本 ヘキスト・マリオン・ルセル株式会社創 薬研究所内 (72)発明者 勝浦 美枝子 埼玉県川越市南台１丁目３番地２ 日本 ヘキスト・マリオン・ルセル株式会社創 薬研究所内 (72)発明者 榎本 耕一 埼玉県川越市南台１丁目３番地２ 日本 ヘキスト・マリオン・ルセル株式会社創 薬研究所内 (72)発明者 佐藤 右典 埼玉県川越市南台１丁目３番地２ 日本 ヘキスト・マリオン・ルセル株式会社創 薬研究所内 (56)参考文献 特表 平５−508075（ＪＰ，Ａ) 特表 平９−506261（ＪＰ，Ａ) 英国公開2073245（ＧＢ，Ａ) 国際公開95／4819（ＷＯ，Ａ１) 国際公開93／16099（ＷＯ，Ａ１) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．204, Ｎｏ．２（1994）ｐ．646−52 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 269，Ｎｏ．45（1994）ｐ．28227−34 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/51 C12P 21/02 C12N 15/12 ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列表配列番号１記載のアミノ酸配列を有
   するタンパク質。
2. 【請求項２】請求項１記載のタンパク質の二量体からな
   るタンパク質。
3. 【請求項３】請求項２記載のタンパク質を有効成分とす
   る軟骨、骨疾患治療剤。
4. 【請求項４】軟骨、骨疾患が骨粗鬆症である請求項３記
   載の軟骨、骨疾患治療剤。
5. 【請求項５】軟骨、骨疾患が変形性関節症または、骨関
   節炎である請求項３記載の軟骨、骨疾患治療剤。
6. 【請求項６】軟骨、骨疾患が骨折、骨欠損である請求項
   ３記載の軟骨、骨疾患治療剤。
7. 【請求項７】軟骨、骨疾患が歯根・歯槽の欠損である請
   求項３記載の軟骨、骨疾患治療剤。
8. 【請求項８】請求項１のタンパク質を発現しうるDNA配
   列を含むプラスミドで形質転換した大腸菌を用いて請求
   項１のタンパク質を製造する方法。
9. 【請求項９】配列表配列番号１記載のアミノ酸配列をコ
   ードするDNA配列の５プライム末端にメチオニンをコー
   ドするコドンを付加したDNAを含有するプラスミドを構
   築することを特徴とする請求項８の製造方法。
10. 【請求項１０】配列表配列番号１記載のアミノ酸配列を
    コードするDNA配列の５プライム末端にメチオニンをコ
    ードするコドンを付加したDNAを含有するプラスミドを
    構築し、そのプラスミドで大腸菌を形質転換し、その大
    腸菌を培養することによって得られるインクルージョン
    ボディを可溶化し、精製することによって得られる単量
    体のタンパク質を二量体に再生し、これを精製すること
    を特徴とする請求項２のタンパク質の製造方法。