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Hintergrund
der Erfindung
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1.
Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft ein Protein mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID No.:1
des Sequenzprotokolls, welches von MP52 abgeleitet ist. Die Erfindung
betrifft auch ein homodimeres Protein dieses Proteins und eine pharmazeutische
Zusammensetzung zur Behandlung von Knorpel- und Knochenerkrankungen,
welche das dimere Protein als einen Wirkstoff enthält. Die
Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des oben beschriebenen
Proteins in großer
Menge und mit hoher Reinheit durch Kultivieren von E. coli, welche mit
einem Plasmid transformiert wurden, das eine DNA-Sequenz, die dazu
geeignet ist, das oben beschriebene Protein zu exprimieren, enthält. Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Behandlung von Knorpel-
und Knochenerkrankungen, welches die Verabreichung einer pharmazeutischen
Zusammensetzung, die als einen Wirkstoff eine effektive Menge des
homodimeren Proteins enthält,
bei einem Menschen umfasst.
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2. Beschreibung des Stands
der Technik
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen, welche Vitamin D3, Kalzitonin, Östrogen
oder deren Derivate sowie Biophosphonat-Derivate enthalten, sind
in der klinischen Praxis zur Vorbeugung und Behandlung von Knochenerkrankungen
verwendet worden. Von knochenmorphogenetischen Proteinen (im Folgenden
BMP) der TGF-β-Genfamilie, welche
BMP-2 bis BMP-9 und verwandte Proteine umfasst, ist vor kurzem berichtet worden,
dass sie knochenmorphogenetische Wirksamkeit aufweisen.
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Weiterhin
ist auch von der knochenmorphogenetischen Wirksamkeit eines dieser
Proteine, welches als BMP-52 bezeichnet wird, berichtet worden (WO
93/16099 und WO 95/04819). Als reife Region von MP52-Proteinen wird
ein Protein angesehen, welches aus 120 Aminosäureresten mit N-terminalem
Alanin besteht, und dessen Aminosäuresequenz ist in diesen Veröffentlichungen
beschrieben.
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Ein
mit GDF-5 bezeichnetes Protein, welches eine zu MP52 analoge Aminosäuresequenz
aufweist, ist außerdem
in Nature, Band 368, S. 639–643
(1994) und WO 94/15949 beschrieben.
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Diese
Proteine können
jedoch nicht auf einfache Weise in gereinigter Form in industriellem
Maßstab hergestellt
werden.
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Säugerzelllinien
wie beispielsweise L-Zellen wurden für die gentechnologische Herstellung
von MP52 ausprobiert. Man hat jedoch erkannt, dass es nicht einfach
ist, MP52 in gereinigter Form und mit hoher Ausbeute mit den Expressionssystemen
herzustellen.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben versucht, MP52 unter Verwendung
von E. coli mittels Gentechnologie in großem Maßstab herzustellen. Die Erfinder
haben versucht, MP52 unter Verwendung von E. coli herzustellen,
indem ein Kodon, welches Methionin kodiert, an die DNA, welche die
reife Region von MP52, die mit Alanin beginnt, kodiert, hinzugefügt wurde.
Bei dem resultierenden Produkt handelt es sich nicht nur um MP52,
sondern um ein Gemisch aus MP52, einem Protein mit 121 Aminosäureresten
mit einem N-terminalen Methionin und einem Protein mit 119 Aminosäureresten,
bei welchem das N-terminale Alanin abgespalten ist und welches mit
Prolin beginnt. Es war extrem schwierig, reines MP52 mit wenigstens
der reifen Region aus dem Gemisch zu isolieren.
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Die
Erfinder haben herausgefunden, dass ein Protein von SEQ ID No.:1
des Sequenzprotokolls, das mit Prolin am N-Terminus beginnt, auf
selektive Weise mit einer extrem hohen Ausbeute hergestellt werden kann,
indem ein Plasmid erzeugt wird, in welchem ein Kodon, das Methionin
kodiert, an die DNA-Sequenz angebunden wurde, welche die aus 119
Aminosäureresten
bestehende Aminosäuresequenz
von SEQ ID No.:1 des Sequenzprotokolls kodiert, wobei das N- terminale Alanin
von MP52 entfernt ist, und indem E. coli, in welche das erhaltene
Plasmid eingefügt
wurde, für
die Expression verwendet wurden. Außerdem wurde bestätigt, dass
das Homodimer des in SEQ ID No.:1 in dem Sequenzprotokoll beschriebenen
Proteins eine knorpel- und knochenmorphogenetische Wirksamkeit besitzt
und somit wurde die Erfindung abgeschlossen.
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Ein
Ziel der Erfindung ist es, ein Protein mit der in SEQ ID No.:1 des
Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz bereitzustellen.
Das Protein besteht aus 119 Aminosäureresten und entspricht einem
Protein, in welchem das N-terminale
Alanin von humanem MP52, das als reife Region die aus 120 Aminosäureresten besteht
angesehen wird, entfernt ist. Das erfindungsgemäße Protein ist in Wasser löslich. Ferner
ist das Protein selbst wenig toxisch, da es von humanem Protein
abgeleitet ist.
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Ein
weiteres Ziel der Erfindung ist es, eine pharmazeutische Zusammensetzung
zur Behandlung von Knorpel- und/oder Knochenerkrankungen bereitzustellen,
welche als einen Wirkstoff ein Homodimer des Proteins mit der in
SEQ ID No.:1 des Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz
umfasst. Genauer betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung
zur Vorbeugung und Behandlung von Osteoporose, Osteoarthritis wie
beispielsweise Gonarthritis deformans und Malum coxae deformans
oder Arthroosteitis, Knorpelläsion
wie beispielsweise artikuläre
Meniskusläsion,
Rekonstruktion in den beschädigten
Teilen von Knochen und Knorpel, hervorgerufen durch Verletzung und
Onkoektemie, Beschädigung
von Knochen und Knorpel, Knochenbruch, kongenitale Knorpel- und
Knochenerkrankungen wie beispielsweise Chondrodysplasie, Chondrohypoplasie,
Achondrogenesis, Palatoschisis und Osteodysplasie und außerdem radikuläre und anrekuläre Defekte,
da das erfindungsgemäße homodimere
Protein knorpel- und knochenmorphogenetische Wirksamkeit aufweist.
Außerdem
kann das homodimere Protein für
eine Knochentransplantationsbehandlung in der kosmetischen Chirurgie
eingesetzt werden. Diese Behandlungen beinhalten auch solche im
Bereich der Veterinärchirurgie.
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Ein
weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung
eines Proteins, welches aus 119 Aminosäureresten besteht und von humanem
MP52, welches in SEQ ID No.:1 des Sequenzprotokolls gezeigt ist,
abgeleitet ist, unter Verwendung von E. coli bereitzustellen.
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Insbesondere
betrifft die Erfindung die Erzeugung eines Plasmids, das eine DNA-Sequenz beinhaltet, die
die Aminosäuresequenz,
welche aus 119 Aminosäureresten
besteht und in SEQ ID No.:1 des Sequenzprotokolls gezeigt ist, kodiert,
mit einem zusätzlichen
Methionin am N-Terminus. Nur die reife Region von humaner MP52-cDNA wurde durch
Polymerasekettenreaktion (PCR-Verfahren) amplifiziert, indem als
eine Matritzen-DNA ein Plasmidvektor, der die in WO 93/16099 beschriebene
cDNA enthält,
verwendet wurde. Das PCR-Verfahren, auf welches hierin Bezug genommen
wird, bedeutet im Allgemeinen eine Vervielfältigung einer sehr kleinen
Menge an DNA-Fragmenten oder RNA-Fragmenten, nach dem in dem US-Patent
4,683,195 beschriebenen Verfahren.
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Für die Herstellung
des erfindungsgemäßen Proteins
ist es notwendig, geeignete Expressionsvektoren, welche DNA, die
das Protein kodiert, beinhalten zu erzeugen, und anschließend durch
Gentechnologie in gewünschte
E. coli-Wirtsstämme
einzufügen.
Die beiden folgenden verbesserten Verfahren wurden für eine Herstellung
des Proteins in großem
Maßstab
eingesetzt;
- 1) ein Verfahren zur Erhöhung der
Produktivität
von Zielproteinen durch Erhöhen
der Translationseffizienz, wie von M. Nobuhara et al. (Agric. Biol.
Chem., 52 (6), 1331–1338,
1988) beschrieben, nämlich
das Verfahren zur Erhöhung
des AT-Gehalts in der Umgebung des ATG-Startkodons und
- 2) ein Verfahren zur Erhöhung
einer durchschnittlichen Kopienanzahl an Plasmiden pro Zelle, nämlich das Verfahren,
in dem die Ori-Region für
den Replikationsursprung des PBR-Vektors durch denjenigen des pUC-Vektors
ersetzt wird.
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Weiterhin
wurde der erfindungsgemäße Expressionsvektor
(pKOT245) erzeugt, indem die Promotorregion direkt mit der DNA-Sequenz
verbunden wurde, welche die Aminosäuresequenz in SEQ ID No.:1
des Sequenzprotokolls mit einem zusätzlichen Methionin an dessen
N-Terminus kodiert. Die E. coli, welche diesen Vektor enthielten,
wurden am 14. April 1995 beim National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, welches
sich in 1-3, Higashi
1-chome, Yatake-cho, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan befindet,
hinterlegt (Accession-Nr. BIKOKEN-KI P-14895) und am 10. April 1996
gemäß dem Budapester
Abkommen über
die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen hinterlegt
(Accession-Nr. BIKOKEN-KI BP-5499).
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Diese
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monomerer Proteine
umfassend die Schritte:
Erzeugen eines Plasmids, das DNA enthält, welche
die Aminosäuresequenz
in SEQ ID No.:1 des Sequenzprotokolls mit einem Methionin am N-Terminus
kodiert,
Einbringen des Plasmids in E. coli für eine Transformation,
Kultivieren der E. coli, um Einschlusskörper zu erhalten, Solubilisieren
und Reinigen der Einschlusskörper,
um monomere Proteine zu erhalten, und
ein Verfahren zur Herstellung
homodimerer Proteine des Proteins von SEQ ID No.:1 des Sequenzprotokolls durch
Rückfalten
und Reinigen der oben erhaltenen monomeren Proteine. Die Proteine
der Erfindung wurden hergestellt durch Solubilisieren der E. coli-Einschlusskörper und
anschließendes
Auftragen auf eine SP-Sepharose FF-Säule und Sephacryl S-200-Säule, um
gereinigte, sulfonierte MP52-Monomere zu erhalten, die einer Rückfaltung
und isoelektronischer Präzipitation
unterzogen wurden, anschließend
erfolgte Auftragen auf eine RESOURCE RPC-Säule einer Reversphasen-HPLC,
um die gereinigten dimeren Fraktionen der Proteine zu erhalten.
Die physikochemischen Eigenschaften der Proteine wurden auf Grundlage
der N-terminalen Aminosäuresequenz
und der Aminosäurezusammensetzung
und durch Elektrophorese analysiert.
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Diese
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Kultivierung von E.
coli, in welche die Expressionsvektoren der Erfindung eingebracht
wurden, unter den Bedingungen eines Kulturmediums bei 28–34 °C, pH 6–8 und einer
Konzentration an gelöstem
Sauerstoff von 20–25
%.
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Diese
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Behandlung von Knorpel-
und Knochenerkrankungen, welches die Verabreichung einer pharmazeutischen
Zusammensetzung, welche als einen Wirkstoff eine wirksame Menge
des homodimeren Proteins enthält,
bei einem Menschen umfasst.
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Biologische
Aktivitäten
des homodimeren Proteins wurden durch Radiographie- Analyse mit weichen Röntgenstrahlen,
Analyse durch Gewebeanfärben
und Analyse des Zeitverlaufs ektopischer Knorpel-/Knochenbildung
bestimmt. Weiter bestätigte
sich aus den Ergebnissen der Wirkung auf die intramembrane Verknöcherung,
der Wirkung auf die Regenerierung von Gelenkknorpel und der Wirkung
auf die Heilung von Knochenbruch und -defekten, dass das homodimere
Protein der Erfindung sich vorteilhaft auf Behandlungen der Knorpel-
und/oder Knochenregeneration auswirkt.
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Das
homodimere Protein der Erfindung kann systemisch verabreicht werden
durch intravenöse,
intramuskuläre
oder intraperitoneale Injektion. Im Fall von intravenöser Verabreichung
kann zusätzlich
zu herkömmlichen
intravenösen
Injektionen auch eine intravenöse
Tropfinfusion verwendet werden.
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Injizierbare
Präparationen
können
beispielsweise in Form injizierbarer Pulver formuliert werden. In
diesem Fall können
die Pulver durch Hinzufügen
eines oder mehrerer geeigneter wasserlöslicher Hilfsstoffe, wie beispielsweise
Mannitol, Saccharose, Laktose, Maltose, Glukose, Fruktose und dergleichen,
zu einem Wirkstoff, Auflösen
des Gemischs in Wasser, Aufteilen in Phiolen oder Ampullen und anschließendes Lyophilisieren und
hermetisches Verschließen
hergestellt werden.
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Im
Fall einer lokalen Verabreichung kann das homodimere Protein auf
die Oberfläche
von Knorpel, Knochen oder Zahn, welche behandelt werden sollen,
mit Kollegenpaste, Fibrinkleber oder anderen Haftmaterialien aufgetragen
werden. Im Fall einer Knochentransplantation kann sowohl natürlicher
Knochen als auch herkömmlicher
künstlicher
Knochen verwendet werden. Künstlicher
Knochen bedeutet Knochen der aus Metall, Keramik, Glas und anderen
natürlichen
oder künstlichen
anorganischen Substanzen hergestellt ist. Als bevorzugte künstliche
Substanz ist Hydroxyapatit zu nennen. Beispielsweise kann künstlicher
Knochen durch Stahl als dichtes Material im inneren Bereich und
Hydroxyapatit als poröses
Material im äußeren Bereich
aufgebaut werden. Außerdem
ist es nützlich,
das homodimere Protein auf den Teil des Knochens, von welchem Krebsgewebe
entfernt wurde, aufzutragen, um die Rekonstruktion von Knochen zu
beschleunigen. Es kann auch für
die Knorpeltransplantation eingesetzt werden.
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Die
Dosis kann abhängig
von verschiedenen Faktoren, welche die Wirksamkeit des Proteins
beeinflussen, wie beispielsweise dem Gewicht von Knochen und Knorpel, welche
rekonstruiert werden sollen, der verletzten Stelle von Knochen und
Knorpel und der Symptome, dem Alter und dem Geschlecht der Patienten, der
Schwere der Infektion, den Verabreichungsintervallen und anderen
klinischen Faktoren variiert werden. Die Dosis kann auch abhängig von
der Art der Träger,
die für
die Rekonstruktion mit dem dimeren Protein verwendet werden sollen,
variiert werden. Im Allgemeinen liegt die Dosis im Bereich von etwa
10–106 ng an homodimerem Protein pro Nassgewicht
an gewünschtem
Knochen und Knorpel, wenn sie als Zusammensetzung, welche einen
Träger
enthält,
verabreicht wird. Bei lokaler und systemischer Verabreichung durch
Injektion ist es bevorzugt, 0,1–104 μg
mit einer Frequenz von einmal wöchentlich
bis einmal täglich
zu verabreichen.
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Durch
die gleichzeitige Verabreichung des homodimeren Proteins mit bekannten
Wachstumsfaktoren wie beispielsweise insulinartigem Wachstumsfaktor-I
ist ein synergistischer Effekt für
die Regeneration von Knochen und Knorpel zu erwarten.
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Es
ist noch nie von einem Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Proteins
in industriellem Maßstab
und in gereinigter Form wie oben beschrieben berichtet worden und
das homodimere Protein ist als medizinische Zusammensetzung zur
Behandlung von Knorpel- und Knochenerkrankungen nützlich,
da es knorpel- und knochenmorphogenetische Aktivität besitzt.
Ferner kann das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Proteins
für die
Herstellung anderer Proteine der oben beschriebenen Mitglieder der TGF-β-Superfamilie
angewendet werden, die bislang alle nur unter Verwendung von Säugerzelllinien
erfolgreich hergestellt werden konnten.
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Diese
Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht.
Die Erfindung soll jedoch nicht dahingehend ausgelegt werden, dass
sie auf diese speziellen Beispiele begrenzt ist.
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Beispiele
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Beispiel 1 Konstruktion
eines Expressionsvektors
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(1) Isolierung einer reifen
Region von MP52
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Eine
reife Region von humaner MP52-cDNA wurde mittels PCR amplifiziert,
wobei der Plasmidvektor (pSK52s) verwendet wurde, welcher in WO
93/16099 beschriebene cDNA als Matritzen-DNA enthält.
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Gemäß dem Verfahren
zur Erhöhung
der Produktivität
der Zielproteine, welches von M. Nobuhara, et al. (Agric. Biol.
Chem., 52 (6), 1331–1338,
1988) beschreiben wurde, wurde ein Teil der DNA der reifen Region des
MP52-Gens ausgetauscht, um den AT-Gehalt in der Nähe des ATG-Startkodons
zu erhöhen.
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Die
Mutagenese wurde durch ein PCR-Verfahren unter Verwendung des konzipierten
Stromaufwärts-PCR-Primers,
der die Mutation von SEQ ID No.:2 des Sequenzprotokolls einschließt, eingefügt. Für die DNA-Sequenz
der PCR-Primer wurde die DNA von SEQ ID No.:2 als Stromaufwärts-Primer
und die DNA von SEQ ID No.:3 des Sequenzprotokolls als Stromabwärts-Primer
verwendet.
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Die
PCR wurde durchgeführt,
indem die Matritzen-DNA (10 ng), 50 pmol jedes der PCR-Primer in
Ablaufrichtung und in umgekehrter Richtung, dNTP (0,2 mmol) und
MgCl2 (1,5 mmol) zusammen mit Taq-DNA-Polymerase
(5 U) in dasselbe Testgefäß gegeben
wurde.
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Dreißig PCR-Zyklen
wurden durchgeführt;
die Bedingungen jedes Zyklus waren 94 °C für eine Minute zur Denaturierung,
55 °C für eine Minute
zum Primerannealing und 72 °C
für 2 Minuten
zur Primerverlängerung.
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Die
bei der PCR erhaltenen Produkte wurden durch Elektrophorese in 1,5
%-iger Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (bezogen von FMC) isoliert
und die Fragmente mit etwa 360 bp wurden isoliert (Fragment 1).
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(2) Konstruktion eines
E. coli-Expressionsvektors für
das erfindungsgemäße Protein
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Um
die Kopienanzahl des Plasmids pro Bakterium zu erhöhen, wurde
die Ori-Region für
den Replikationsursprung von derjenigen des pBR gegen diejenige
des pUC-Vektors
ausgetauscht. Der E. coli-Expressionsvektor pKK223-3 ist kommerziell
erhältlich
(bezogen von Pharmacia Biotech) und wurde verwendet, um die Tac-Promotor-Region durch
Verdau mit den Restriktionsendonukleasen SspI und EcoRI zu isolieren
und außerdem
um unter Verwendung von SalI und SspI die rrnBt1t2-Terminatorregion
zu isolieren. Ein DNA-Fragment der Tac-Promotorregion, welches mit
Mungobohnennuklease (Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt wurde, wurde
durch T4-DNA-Ligase mit dem oben erhaltenen Fragment 1 ligiert.
Das resultierende DNA-Fragment
wurde durch SalI verdaut und mit der rrnBt1t2-Region religiert. Das DNA-Fragment wurde in
die SmaI-Stelle des pUC18-Vektors ligiert, um den Expressionsvektor
(pKOT245 (Accession-Nr. BIKOKEN-KI P-14895)) (1) für die Herstellung
des Proteins zu erzeugen. Die Länge
der pKOT245-DNA beträgt
3,7 kb. Die Nukleotidsequenz des für das Protein erzeugten Expressionsvektors
wurde durch einen Pharmacia ALF-DNA-Sequenzierer analysiert.
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(3) Transformation
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Die
Transformation wurde gemäß dem Rubidiumchlorid-Transformationsverfahren
von Kushner et al. (Genetic Engineering, S. 17, Elsevier, 1978)
durchgeführt.
PKOT245 wurde verwendet, um den Wirtsstamm E. coli W3110M gemäß dem oben
beschriebenen Verfahren zu transformieren, um E. coli-Transformanten
für die
Herstellung des Proteins zu erzeugen.
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Beispiel 2 Kultivierung
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(1) Kultivierung
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Die
E. coli, welche das erfindungsgemäße Protein exprimieren, wurden
in dem modifizierten SOC-Medium (Bacto Trypton 20 g/l, Bacto Hefeextrakt
5 g/l, NaCl 0,5 g/l, MgCl2·6H2O 2,03 g/l, Glukose 3,6 g/l) vorkultiviert.
100 ml der Bakteriensuspension wurde verwendet, um 5 l des Produktionsmediums
(Bacto Trypton 5 g/l, Zitronensäure
4,3 g/l, K2HPO4 4,675
g/l, KH2PO4 1,275
g/l, NaCl 0,865 g/l, FeSO4·7H2O 100 mg/l, CuSO4·5H2O 1 mg/l, MnSO4·nH2O 0,5 mg/l, CaCl2·2H2O 2 mg/l, Na2B4O7·10H2O 0,225 mg/l, (NH4)6Mo7O24·4H2O 0,1 mg/l, ZnSO4·7H2O 2,25 mg/l, CoCl2·6H2O 6 mg/l, MgSO4·7H2O 2,2 g/l, Thiamin HCl 5,0 mg/l, Glukose
3 g/l), zu beimpfen, welches in einem 10-Liter-Fermentierer unter
Durchlüftungsrühren kultiviert wurde
und dann wurde bei Erreichen des frühen Stadiums der logarithmischen
Wachstumsphase (OD550 = 5,0) Isopropyl-β-D-thio-galaktopyranosid zu
einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt und die Kultivierung wurde fortgesetzt,
bis OD550 = 150 erreicht war. Während
der Kultivierung wurde die Temperatur bei 32 °C gehalten und der pH-Wert wurde
durch Hinzufügen
von Ammoniak bei 7,15 gehalten. Um eine Verringerung der Konzentration
an gelöstem
Sauerstoff zu verhindern, wurde das Rühren beschleunigt, so dass
die Konzentration an gelöstem
Sauerstoff bei einer Luftsättigung
von 50 % gehalten wurde. Bei Anzeichen eines plötzlichen Anstiegs der Konzentration
an gelöstem
Sauerstoff wurde die Kultivierung fortgesetzt, indem 50 %-ige Glukoselösung bei
einem Wert von 0,2 % hinzugefügt
wurde, um eine hohe Zelldichte zu erhalten.
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(2) Herstellung von E.
coli-Einschlusskörpern
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Die
durch das oben beschriebene Verfahren erhaltene Kulturbrühe wurde
zentrifugiert, um die Zellne zu ernten, welche dann in 25 mM Tris-HCl
Puffer, der 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (pH 7,3) enthielt, suspendiert
wurde. Die Zellen wurden zerstört,
indem sie durch einen Homogenisierer geleitet wurden (hergestellt
von APV Gaulin Inc.) und sie wurden erneut zentrifugiert, um das
Präzipitat,
welches die Einschlusskörper enthielt,
zu ernten.
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Beispiel 3 Reinigung
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(1) Solubilisierung von
E. coli-Einschlusskörpern
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Nach
dreimaligem Waschen mit 1 % Triton X-100 wurden die E. coli-Einschlusskörper bei
3 000 × g für 30 Minuten
bei 4 °C
zentrifugiert und anschließend
wurde das resultierende Präzipitat
durch Sonikation in 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,3, 8 M Harnstoff, 10 mM
DTT und 1 mM EDTA solubilisiert.
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(2) Herstellung von Monomeren
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Die
solubilisierte Lösung
wurde bei 20 000 × g
für 30
Minuten bei 4 °C
zentrifugiert und der resultierende Überstand wurde gesammelt. Der
erhaltene Überstand
wurde SP-Sepharose FF (Pharmacia AB), eingestellt mit 20 mM Tris-HCl-Puffer
pH 8,3, 6 M Harnstoff und 1 mM EDTA, unterzogen und anschließend wurde er
nach Waschen mit derselben Lösung
mit derselben Lösung,
welche 0,5 M NaCl enthält,
eluiert. Das Protein in dem Eluat wurde sulfoniert durch Hinzufügen von
Na2SO3 und Na2SO4O6 bis
zu einer Endkonzentration von 111 mM bzw. 13 mM und es wurde für 15 Stunden
bei 4 °C
inkubiert. Die sulfonierte Lösung
wurde gelfiltriert an Sephacryl S-200 HR (Pharmacia AB), welche
mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,3, 6 M Harnstoff, 0,2 M NaCl und
1 mM EDTA eingestellt war, um gereinigte sulfonierte Monomere der
erfindungsgemäßen Proteine
zu erhalten.
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(3) Rückfalten
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Die
Lösung
der sulfonierten Monomere wurde unter Rühren in ein neunfaches Volumen
an 50 mM Na-Glyzin-Puffer, pH 9,8, 0,2 M NaCl, 16 mM CHAPS, 5 mM
EDTA, 2 mM GSH (Glutathion im reduzierten Zustand) und 1 mM GSSG
(Glutathion im oxidierten Zustand) hinzugefügt und anschließend für 24 Stunden
bei 4 °C
inkubiert, um das erfindungsgemäße Protein
zu oxidieren und rückzufalten.
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(4) Herstellung von Homodimeren
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Die
Rückfaltungslösung wurde
mit demselben Volumen an gereinigtem Wasser verdünnt und anschließend wurde
der pH-Wert durch Hinzufügen
von 6 N NaCl auf etwa 7,4 eingestellt, und die Lösung wurde einer isoelektrischen
Präzipitation
unterzogen. Die durch 20-minütige
Zentrifugation bei 3 000 × g
gesammelten Präzipitate
wurden in einer Lösung
mit 30 % Acetonitril, welche 0,1 % TFA enthielt, solubilisiert.
Die Lösung
wurde mit demselben Volumen an gereinigtem Wasser verdünnt und
auf eine RESOURCE RPC-Säule
(Pharmacia AB) einer Reversphasen-HPLC, die mit 25 % Acetonitril,
welches 0,05 % TFA enthielt, voreingestellt war, aufgetragen und
dann mit einem linearen Gradienten von 25–45 Acetonitril, welches 0,05
% TFA enthielt, eluiert. Das Eluat wurde bei einer Absorption von
280 nm beobachtet. Die gereinigten homodimeren Proteinfraktionen wurden
gesammelt und mittels SpeedVac-Konzentrierer (Servant Co.) lyophilisiert.
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(5) Bestimmung der physikochemischen
Eigenschaften des gereinigten erfindungsgemäßen Proteins
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a) Analyse der N-terminalen
Aminosäuresequenz
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Die
Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
für die
gereinigten Proteine wurde unter Verwendung eines Aminosäuresequenzierers
Modell 476A (Applied Biosystems Inc.) durchgeführt, um die Aminosäuresequenz
von dem N-Terminus zu der 30. Aminosäure wie in SEQ ID No.:1 des
Sequenzprotokolls gezeigt, zu bestätigen.
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b) Analyse der Aminosäurezusammensetzung
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Die
Analyse der Aminosäurezusammensetzung
der oben erhaltenen gereinigten Proteine wurde mit einem Aminosäuresequenzierer
(PICO TAG Systems, Waters) durchgeführt. Das Ergebnis ist in Tabelle
1 gezeigt. Die in Tabelle 1 beschriebene Zahl gibt die Anzahl an
Aminosäureresten
pro monomerem Protein an.
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c) Analyse durch Elektrophorese
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Es
wurde mittels SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen bestätigt, dass
das Molekulargewicht der oben erhaltenen gereinigten Proteine etwa
28 KDa beträgt.
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Aus
den oben unter a), b) und c) gezeigten Ergebnissen ergibt sich,
dass das Protein der Erfindung ausgehend von dem N-terminalen Pro
ausschließlich
119 Aminosäurereste
umfasst.
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Beispiel 4 Bestimmung
der biologischen Aktivitäten
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(1) Aktivität bei ektopischer
Knochenbildung in Mäusen.
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Etwa
500 μg an
in Beispiel 3 erhaltenem homodimerem Protein wurden gelöst und in
50 μl 10
mM Chlorwasserstoffsäure
verdünnt
und es wurden Konzentrationen von 1 μg/10 μl, 10 μg/10 μl und 100 μg/10 μl der Lösung hergestellt. 10 μl jeder Lösung wurden
mit 150 μl
Porzintendon Typ-I Kollagenlösung
(Koken, 0,5 %, pH 3, I-AC) gemischt, neutralisiert, lyophilisiert
und die resultierende Mischung wurde in Taschen implantiert, die
in den Oberschenkelmuskeln von 8 Wochen alten männlichen ICR-Mäusen erzeugt worden waren. Am
Tag 21 nach der Implantation wurden die Tiere getötet und
die Oberschenkel wurden herausgeschnitten. Nach dem Abtrennen der
Haut wurde das Auftreten von kalzifizierten Geweben durch weiche
Röntgenstrahlenradiographie
bewertet. Wie in Tabelle 2 gezeigt, rief die Implantation von 1 μg/Stelle
oder mehr des dimeren Proteins in einem Teil der Gruppe von Mäusen kalzifiziertes
Gewebe hervor und 10 und mehr Dosen riefen in allen verwendeten
Mäusen
kalzifiziertes Gewebe hervor.
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2 zeigt
typische Beispiele von weichen Röntgenstrahlenradiographien
von kalzifiziertem Gewebe, welches durch unterschiedliche Dosierungen
an MP52-Protein
hervorgerufen wurde. Die 2A, 2B und 2C zeigen
Beispiele von weichen Röntgenstrahlenradiographien
von 1 μg
des homodimeren Proteins pro Stelle, 10 μg pro Stelle und 100 μg pro Stelle,
die jeweils in Mäuseoberschenkel
implantiert wurden. Diese Radiographien zeigen, dass das homodimere
Protein in dem Mäuseoberschenkel
kalzifiziertes Gewebe hervorrief und dieses auf eine dosisabhängige Art
und Weise vermehrte. Um zu bestätigen,
ob es sich bei den gebildeten kalzifizierten Geweben um Knorpel
oder Knochen handelte, wurden die Sektionen der fixierten Mäuseoberschenkel,
in welche 10 μg/Stelle
des homodimeren Proteins implantiert wurden, mit von Kossa Alcian
blue oder Hematoxylin-Eosin angefärbt.
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3 zeigt
lichtmikroskopische Aufnahmen der mit den jeweiligen Anfärbeverfahren
angefärbten
Abschnitte. In 3A (von Kossa-Anfärben) zeigen
die mit ct und cc bezeichneten Bereiche kalzifiziertes Gewebe bzw.
kalzifizierte Chondrozyten. In 3B (Alcian
blue-Anfärben)
zeigt ein mit rc bezeichneter Bereich verbleibendes Knorpelgewebe.
In 3C (Anfärben mit Hematoxylin-Eosin) handelt es
sich bei den mit ad, bm, lb, ob und wb bezeichneten Elementen jeweils
um Adipozyt, Knochenmarkszellen, Lamellenknochen, Osteoblasten und
Geflechtknochen. Somit ist es offensichtlich, dass die Implantation
des homodimeren Proteins mit Typ-I Kollagen in Mäuseoberschenkel an den Stellen
kalzifizierte Chondrozyten, Osteoblasten und Knochenmarkszellen
induzierte.
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Somit
wurde gezeigt, dass das homodimere Protein eine Aktivität bei der
ektopischen Knorpel- und Knochenbildung besitzt.
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(2) Analyse des Zeitverlaufs
der ektopischen Knochenbildung in Mäusen
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Das
in Beispiel 3 erhaltene dimere Protein (3 μg) wurde mit einer Typ-I- Kollagenlösung gemischt
und wie in Beispiel 4 (1) beschrieben neutralisiert und die lyophilisierten
Materialien wurden in die männlichen ICR-Mäuseoberschenkel
implantiert. An den Tagen 3, 7, 10, 14, 21 und 28 nach der Implantation
wurden die Oberschenkel herausgeschnitten und in 10 % Formalin fixiert
und anschließend
wurden Sektionen mit Hematoxylin-Eosin oder von Kossa angefärbt. 4 zeigt
die lichtmikroskopischen Aufnahmen der angefärbten Sektionen.
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Am
Tag 3 (4A, Hematoxylin-Eosin-Anfärben) traten
nicht-differenzierte Mesenchymalzellen (mc) einschließlich morphologischer
fasriger Bindezellen in dem Raum zwischen implantierten Kollagenfasern
(co) und Muskelzellen (m) auf. Zwischen den Tagen 7 und 10 (4B bzw. 4C,
Anfärben
mit Hematoxylin-Eosin) war
der Raum mit nicht-differenzierten Mesenchymalzellen (mc) gefüllt und
diese Zellen wurden hypertrophiert und differenziert zu Vorknorpelgewebe.
Am Tag 14 (4D, Anfärben mit Hematoxylin-Eosin
und 4E, Anfärben mit von Kossa) wurde kalzifiziertes
Knorpelgewebe (cc) und Knochengewebe (b) beobachtet. Am Tag 21 (4D, Anfärben mit Hematoxylin-Eosin
und 4E, Anfärben mit von Kossa) wurde keinerlei
kalzifiziertes Knorpelgewebe beobachtet und das am Tag 14 beobachtete
Gewebe schien durch Knochen (b) mit Knochenmark (bm) ersetzt worden
zu sein. Am Tag 28 (4H, Anfärben mit
Hematoxylin-Eosin) lag eine große Menge
an Knochenmarkszellen vor und gebildeter Knochen schien sich in
einem Resorptionsvorgang zu befinden.
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Es
ist somit offensichtlich, dass das homodimere Protein eine endochondrale
Verknöcherung
durch Knorpelbildung an ektopischen Stellen induziert, wie es bei
der Verwendung anderer BMPs berichtet wurde.
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(3) Auswirkung auf die
intramembrane Verknöcherung
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Das
in Beispiel 3 erhaltene homodimere Protein wurde in phosphatgepufferter
Saline (pH 3,4), welche 0,01 % humanes Serumalbumin enthielt, gelöst und Lösungen mit
Konzentrationen von 0,01 μg/20 μl, 0,01 μg/20 μl und 1 μg/20 μl wurden
hergestellt. Eine 20 μl-Portion
jeder Lösung
wurde 12-mal einmal täglich
unter Verwendung einer Mikrospritze in die Knochenhaut des Scheitelbeins
neugeborener Ratten injiziert, beginnend am Tag 1 nach der Geburt.
Dasselbe Volumen des Vehikels wurde auf die Gegenseite des Scheitelknochens
jeder Ratte injiziert. Dasselbe Volumen des Vehikels wurde auch
auf beiden Seiten des Scheitelknochens von Kontrollratten injiziert.
Am Tag 1 nach der letzten Injektion wurden die Ratten getötet und
beide Seiten der Scheitelbeine wurden herausgeschnitten und fixiert,
und anschließend
wurden die mit Hematoxylin-Eosin angefärbten dekalzifizierten Sektionen
präpariert,
um die Dicke der Scheitelbeine an den Injektionsstellen auf Mikroskopaufnahmen
zu messen. Das Verhältnis
homodimeres Protein-Injektionsstelle zu Vehikel-Injektionsstelle bezüglich der Dicke des Scheitelbeins
jeder Ratte wurde berechnet. Wie in Tabelle 3 gezeigt, erhöhte das
homodimere Protein auf eine dosisabhängige Art und Weise die Dicke
des Scheitelbeins. Ein typisches Beispiel der mikroskopischen Aufnahmen
der Sektion bei einem Verhältnis
homodimeres Protein/injizierte Stelle von 0,1 μg/Stelle ist in 5B im
Vergleich zu der gegenüberliegenden
Vehikelinjektionsstelle gezeigt (5A).
Die Injektion des homodimeren Proteins rief die Aktivierung und
Proliferation von Periostalzellen (p) hervor und aktivierte Osteoblasten
(ob) wurden in und auf dem Scheitelbein (b) beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen,
dass die intramembrane Verknöcherung
durch das homodimere Protein stimuliert wurde, wenn es lokal injiziert
wurde, und dass das homodimere Protein für die Therapie von Osteoporose,
Knochenbruch und alveolärer
Krista und peridontalen Defekten nützlich ist.
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- Werte bedeuten Mittelwerte ± SD (n = 4), *p < 0,05, **p < 0,01 im Vergleich
zum Verhältnis
der Gruppe, in welche Vehikel in beide Stellen injiziert wurde (Williams'-Test).
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(4) Auswirkung auf die
Regeneration von artikulärem
Knorpel
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Für diese
Studie wurden sechs 12-Wochen-alte männliche Weiße Neuseeland Kaninchen verwendet. Die
Haut des rechten Knies und die artikuläre Kapsel wurden geschnitten
und in der Patellarinne wurde unter Verwendung eines dentalen Schnittgeräts ein osteochrondraler
Defekt mit einer Dicke von 5 × 5
mm erzeugt, um umgebende Sehnen nicht zu beschädigen. Die Defekte wurden entweder
mit lyophilisiertem Typ-I Kollagenschwamm oder mit lyophilisiertem
Typ-I Kollagenschwamm, welcher 10 μg homodimeres Protein, das wie in
Beispiel 4 (1) beschrieben hergestellt wurde, enthielt, aufgefüllt und
anschließend
wurden die geschnittene artikuläre
Kapsel und die Haut genäht.
Drei Wochen nach der Operation wurden die Kaninchen getötet und
die Oberschenkelköpfe
wurden herausgeschnitten und in 10 %-igem Formalin fixiert und anschließend wurden
dekalzifizierte Sektionen mit Alcian blue angefärbt. Typische Beispiele mikroskopischer
Aufnahmen der Sektionen sind in 6 gezeigt.
Die mit dimerem Protein behandelten Defekte (6C und 6D) zeigten die Regeneration von Chondrozyten
(ch) mit extrazellulären
Matritzen, welche intensiv mit Alcian blue angefärbt waren, im Vergleich zu
Kontrolldefekten, in welche Typ-I Kollagenschwamm implantiert worden
war (6A und 6B), welche
mit fasrigem Gewebe gefüllt
waren (f). Das durch das dimere Protein hervorgerufene Knorpelgewebe zeigte
eine zonenartige Struktur mit ruhenden Chondrozyten, wachsenden
Chondrozyten und hypertrophierten Chondrozyten, wie denjenigen von
normalem artikulärem
Knorpel. Die Chondroinduktion durch das MP52-Protein wurde in den
Defekten aller verwendeten Kaninchen (n = 3) beobachtet. Diese Ergebnisse
zeigen, dass das dimere Protein zur Reparatur von beschädigtem Knorpelgewebe
von Patienten nützlich
ist, wie beispielsweise bei Osteoarthritis.
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(5) Auswirkung auf die
Heilung von Knochenbruch und -defekten
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30
männliche
Sprague-Dawley-Ratten (etwa 15 Wochen alt) wurden für diese
Studie verwendet. Unter Verwendung einer seitlichen Annäherung an
den Oberschenkelknochen wurde sämtliches
Muskel- und Periostelgewebe von der Diaphyse abgestreift. Ein 5
mm-Segment Knochendefekt wurde im mittleren Bereich des rechten
Oberschenkelknochenschafts erzeugt, wobei ein dentales Schnittwerkzeug
verwendet wurde und anschließend
wurde eine speziell hergestellte Polyethylenplatte mit rostfreien
Schrauben entlang des Kortex des Oberschenkelknochens fixiert. Typ-I-Kollagenschwämme, welche
0, 1, 10 und 100 μg
des homodimeren Proteins enthielten, wurden wie in Beispiel 4 (1)
beschrieben hergestellt und in die Segmentknochendefekte implantiert
und anschließend
wurde die Wunde genäht.
Unmittelbar nach der Operation und 12 Wochen nach der Operation
wurden die Defekte durch Radiographie mit weichen Röntgenstrahlen
bewertet. Wie in 7 gezeigt, regte 10 und 100 μg/Stelle
des homodimeren Proteins die Callus (cs)-Bildung in den Defekten
und den gebildeten knochenartigen Einheiten an, aber die Wirkung
bei 1 μg/Stelle
war im Vergleich zu dem Defekt, in welchen Kollagenkontrolle implantiert
worden war, bei welchem nur marginale Endostealknochenbildung beobachtet
wurde, nicht deutlich. 12 Wochen nach der Operation wurden die Ratten
getötet
und der Oberschenkelknochen mit einem Defekt wurde herausgeschnitten
und der Knochenmineralgehalt (Summe der Mittelwerte dreier Scans
pro Defekt) wurde durch Dualenergie-Röntgenstrahlabsorptiometrie
(Aloka, Modell DCS-600) in einem Modus mit 1 mm Scanbreite nach
Entfernen der Polyethylenplatte gemessen. Beide Enden des Oberschenkelknochens
mit dem Harz wurden fixiert, anschließend wurde die maximale Torsionsfestigkeit,
um die Einheit der Proben zu brechen, mittels Knochenstrainersystem
(Malto, Modell MZ-500D) bei einer Arbeitsgeschwindigkeit von 180°/Min (Tabelle
4) gemessen. Es zeigte sich, dass das homodimere Protein sowohl
den Knochenmineralgehalt als auch die Knochenfestigkeit bei dem
Rattenoberschenkelknochendefekt, in welchen das Protein implantiert
worden war erhöht
und dies spiegelt die Wirksamkeit des vorliegenden Proteins zur Bruchheilung
und Knochenrekonstruktion des Defekts wider.
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- Werte bedeuten Mittelwerte ± SE, *p < 0,05 im Vergleich zur Gruppe mit Kollagen
allein (Studenten-T-Test).
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Aus
den Ergebnissen in Beispiel 4 ergibt sich, dass das homodimere Protein
der Erfindung Knorpel- und knochenmorphogenetische Wirksamkeit besitzt.
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Das
Protein, welches aus einem Homodimer des Proteins mit einer Aminosäuresequenz
in SEQ ID No.:1 des Sequenzprotokolls zusammengesetzt ist, besitzt
eine Knorpel- und knochenmorphogenetische Wirksamkeit und ist als
pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Knorpel und Knochenerkrankungen
nützlich.
Weiter kann das erfindungsgemäße Protein
in industriellem Maßstab
und in reiner Form durch ein gentechnologisches Verfahren durch
Kultivieren von E. coli, welche mit einem Expressionsvektor für das Protein
mit höherer
Kopienanzahl transformiert sind, hergestellt werden.
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Kurze Erläuterung
der Zeichnungen
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1 zeigt
eine Plasmidkarte des Expressionsvektors (pKOT245) für das Protein
der Erfindung, welches in Beispiel 1 (2) erhalten wurde.
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2 zeigt
eine weiche Röntgenstrahlenradiographie
des kalzifizierten Gewebes, welches in Mäuseoberschenkel in Beispiel
4 (1) induziert wurde.
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3 zeigt
eine lichtmikroskopische Aufnahme des angefärbten kalzifizierten Gewebes
in Mäuseoberschenkel
in Beispiel 4 (1).
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4 zeigt
eine lichtmikroskopische Aufnahme der zeitlichen Entwicklung des
angefärbten
kalzifizierten Gewebes in Beispiel 4 (2).
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5 zeigt
eine lichtmikroskopische Aufnahme von angefärbtem Rattenscheitelbein in
Beispiel 4 (3).
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6 zeigt
eine lichtmikroskopische Aufnahme von angefärbten artikulären Knorpeldefekten
in dem Rattenoberschenkelknochenkopf in Beispiel 4 (4).
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7 zeigt
eine weiche Röntgenstrahlenradiographie
der Knochenbildung in den Knochendefekten der Rattenoberschenkelknochen
in Beispiel 4 (5).