DE69533698T2

DE69533698T2 - Pantropische Neurotropische Faktoren

Info

Publication number: DE69533698T2
Application number: DE69533698T
Authority: DE
Inventors: Roman Urfer; G. Leonard PRESTA; W. John WINSLOW
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1994-06-03
Filing date: 1995-06-01
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2015-06-02
Also published as: US5981480A; EP0763107A1; PT763107E; WO1995033829A1; CA2191064A1; US5728803A; US7528233B2; DE69533698D1; US6333310B1; FI964833A0; US6503728B1; FI120237B; CN1153528A; AU2659295A; MX9605971A; CN1159439C; IL113983A0; US20100184656A1; BR9508019A; US20060270838A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Anmeldung betrifft Proteine, die am Wachstum, an der Regulation oder Erhaltung von Nervengewebe, insbesondere Neuronen, beteiligt sind. Insbesondere betrifft sie pantrope neurotrophe Faktoren, die mehrere neurotrophe Spezifitäten aufweisen (MNTS-Varianten).
Hintergrund der Erfindung
Das Überleben und die Erhaltung der differenzierten Funktion von Vertebratenneuronen wird von der Verfügbarkeit spezieller Proteine beeinflusst, die als Neurotrophine bezeichnet werden. Für das Überleben hängen die sich entwickelnden Neuronen von der Versorgung dieser Faktoren aus ihren Zielgebieten ab, und die eingeschränkte Produktion von Neurotrophinen resultiert im Tod überflüssiger Neuronen (für einen Überblick siehe (1); (2)). Die verschiedenen Neurotrophine unterscheiden sich funktionell hinsichtlich ihrer Fähigkeit, das Überleben einzelner Neuronenpopulationen im Zentral- und Periphernervensystem zu unterstützen (3), (4); (5), (80).
Die Neurotrophinfamilie ist eine höchst homologe Familie, die NT3 (6), (7); (8); (9); (10) Nervenwachstumsfaktor (NGF) (11); (12), aus Gehirn stammenden neurotrophen Wachstumsfaktor (BDNF) (13); (14)) und Neurotrophin 4/5 (NT4/5) ((15), (16), (17) umfasst.
Untersuchungen legen nahe, dass Neurotrophine die intrazelluläre Signalisierung zumindest teilweise über Liganden-abhängige Aktivierung einer Klasse von Tyrosinkinase enthaltenden Rezeptoren mit M_r = 140–145.000 transduzieren, die als trks bekannt sind (18); (19) (21); (20) (22); (23); (24); (25); (26). Folglich wird der Signaltransduktionsweg von Neurotrophinen durch diese Hochaffinitätsbindung an spezifische Tyrosinkinaserezeptoren sowie deren Aktivierung und die anschließende Rezeptor-Autophosphorylierung ausgelöst (19); (27). Obgleich ein gewisses Ausmaß an Rezeptor-Kreuzwechselwirkung zwischen den Neurotrophinen und den verschiedenen trks besteht, scheint die vorwiegende Spezifität NGF/trkA, BDNF/trkB und NT3/trkC zu sein; während NT4/5 in erster Linie mit TrkB genauso effizient wie BDNF zu interagieren scheint (27); (19) (21); (25); (22); (28); (18); (28a). Während trkC ausschließlich auf NT3 reagiert (25); (26), können trkA und trkB in vitro unter bestimmten Umständen auf mehrere Neurotrophine reagieren (6); (23). Jedoch beschränkt die neuronale Umgebung trkA und trkB hinsichtlich ihrer Fähigkeit, auf nicht-bevorzugte neurotrophe Liganden zu reagieren (29). Zusätzlich zur trk-Familie von Rezeptoren können die Neurotrophine auch an eine andere Rezeptorklasse binden, der niedrigaffiner p75-NGF-Rezeptor genannt wird (p75; (30); (31)), der einen unbekannten Mechanismus der Transmembransignalisierung besitzt, jedoch strukturell mit einer anderen Genfamilie verwandt ist, die den Tumornekrosefaktor-Rezeptor (TNFR), CD40, 0X40 und CD27 umfasst (32); (33); (34), (35); (36); (37)). Die Rolle des gp75 bei der Bildung hochaffiner Bindungsstellen und im Signaltransduktionsweg von Neurotrophinen ist bislang unklar (für einen Überblick siehe (38); (39)).
Eine Untersuchung der Primäraminosäuresequenz der Neurotrophine offenbart mehrere Regionen von je 7–10 Resten, die 85% der Sequenzdivergenz unter den Familienmitgliedern ausmachen.
Der Nervenwachstumsfaktor (NGF) ist ein homodimeres Protein von 120 Aminosäuren, das auffallende Wirkungen auf sich entwickelnde sensorische und sympathische Neuronen des Periphernervensystems aufweist. NGF wirkt über spezifische Zelloberflächenrezeptoren auf reaktive Neuronen, um das Überleben von Neuronen zu unterstützen, die Neuritenauswuchs zu fördern und die neurochemische Differenzierung zu verstärken. NGF-Wirkungen sind von Veränderungen in Neuronenmembranen (40), (41), des Phosphorylierungszustands neuronaler Proteine (42), (43) und der Häufigkeit bestimmter mRNAs und Proteine begleitet, die wahrscheinlich eine Rolle bei der Neuronendifferenzierung und Funktion spielen (siehe beispielsweise (44)).
Cholinerge Vorderhirn-Neuronen regieren ebenfalls auf NGF und erfordern möglicherweise NGF für trophische Unterstützung (45). In der Tat legt die Verteilung und Ontogenese von NGF und seinem Rezeptor im Zentralnervensystem (CNS) nahe, dass NGF als Ziel-hergeleiteter neurotropher Faktor für cholinerge Vorderhirn-Basalneuronen wirkt (46), (81).
Es ist wenig über die NGF-Aminosäurereste bekannt, die für die Wechselwirkung mit dem trkA-Tyrosinkinaserezeptor notwendig sind. Signifikante Verluste der biologischen Aktivität und Rezeptorbindung wurden mit gereinigten Homodimeren von menschlichem und Maus-NGF beobachtet, die homogene trunkierte, an den Amino- und Carboxytermini modifizierte Formen darstellen (47); (48); (49). Die Spezies (10-118)hNGF mit 109 Aminosäuren, die aus dem Verlust der ersten 9 Reste des N-Terminus und der letzten beiden Reste vom C-Terminus des gereinigten rekombinanten menschlichen NGF resultiert, ist beim Verdrängen von Maus-[¹²⁵I]NGF vom menschlichen trkA-Rezeptor im Vergleich zu (1-118)HNGF 300 Mal weniger effizient (49). Sie ist beim Überleben von Spinalganglien und sympathischen Ganglien im Vergleich zu (1-118)HNGF 50 bis 100 Mal weniger aktiv (48). (1-118)HNGF weist eine beträchtlich niedrigere trkA-Tyrosinkinase-Autophosphorylierungsaktivität auf (49).
NT3-Transkription ist in einer breiten Palette von Periphergeweben (z. B. Niere, Leber, Haut), sowie im Zentralnervensystem (z. B. Cerebellum, Hippokamp) nachgewiesen worden (5), (7), (82). Während der Entwicklung ist die NT3-mRNA-Transkription in denjenigen Regionen am markantesten, in denen Proliferation, Migration und Differenzierung von Neuronen vor sich geht (50). Unterstützende Beweise für eine Rolle bei der Neuronenentwicklung umfassen die fördernde Wirkung von NT3 auf Neuralleisten-Zellen (51) und die Stimulierung der Proliferation von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen in vivo (79). NT3 unterstützt außerdem das Überleben sensorischer Neuronen aus dem knotigen Ganglion (NG) (7); (5), (83) und einer Population von sensorischen Muskelneuronen aus dem Spinalganglion (DRG) (52). Zusätzlich zu diesen In-vitro-Untersuchungen zeigte eine neuere Untersuchung, dass NT3 den In-vivo-Abbau adulter zentraler noradrenergischer Neuronen des Locus coerulus in einem Modell verhindert, das dem bei der Alzheimer-Krankheit vorkommenden Zellverlustmuster gleicht. Gegenwärtig liegen keine publizierten Berichte vor, welche die zur trkC-Bindung notwendigen Aminosäurereste betreffen.
Es gab einige Bemühungen, chimäre oder pan-neurotrophe Faktoren mit mäßigem Erfolg zu erzeugen. (Siehe (53); (56); (54); (55).)
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist ein Ziel der Erfindung, pantrope Neurotrophine bereitzustellen und brauchbare Mengen dieser pantropen Neurotrophine unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken herzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, rekombinante Nucleinsäuren, die für pantrope Neurotrophine kodieren, und Expressionsvektoren und Wirtszellen bereitzustellen, welche die Nucleinsäuren enthalten, die für pantropische Neurotrophine kodieren.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zum Herstellen der pantropen Neurotrophine und zur Behandlung neuronaler Störungen eines Patienten.
Gemäß den vorangehenden Zielen stellt die vorliegende Erfindung rekombinante pantrope Neurotrophine und isolierte oder rekombinante Nucleinsäuren bereit, die für die Neurotrophine der vorliegenden Erfindung kodieren. Außerdem werden Expressionsvektoren, die DNA umfassen, die für ein pantropes Neurotrophin kodiert und operabel an transkriptions- und translationsregulatorische DNA gebunden ist, sowie Wirtszellen bereitgestellt, welche die Nucleinsäuren enthalten.
Ein zusätzlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt Verfahren zur Produktion pantroper Neurotrophine bereit, wobei das Verfahren das Kultivieren einer mit einem Expressionsvektor transformierten Wirtszelle und das Bewirken der Expression der für das pantrope Neurotrophin kodierenden Nucleinsäure umfasst, um ein rekombinantes Neurotrophin herzustellen.
Außerdem werden Verfahren der Behandlung einer neuronalen Störung bereitgestellt, die das Verabreichen eines pantropen Neurotrophins der vorliegenden Erfindung an einen Patienten umfassen.
Weitere Ziele und Merkmale der Erfindung werden dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und den angefügten Ansprüchen in Verbindung mit den Figuren offensichtlich.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1 stellt die hohe Homologie zwischen Maus-NGF (Seq.-ID Nr. 1) und menschlichem NT-3 (Seq.-ID Nr. 2) dar, was die Modellierung von NT-3 an der 3D-Struktur von NGF ermöglicht. Pfeile kennzeichnen β-Stränge. Bezeichnungen von β-Strängen wie in McDonald et al. (1991) (59). Aminosäuren, die sich zwischen NGF und NT-3 unterscheiden, sind in grauen Kästchen dargestellt. Abschnitte mit ungeordneter Struktur sind schraffiert.
Die 2A, 2B, 2C, 2D und 2E stellen die biologischen Wirkungen gewählter Mutanten auf das Überleben von Spinalganglion-Neuronen und die Neuriten-Extension an PC12/trkC-Zellen dar. E9-Hühner-DRG-Neuronen, kultiviert für 72 Stunden in Gegenwart von konditioniertem Medium von 293-Zellen, NT-3 oder mutierte Proteine enthaltend. Die durch Mutanten ausgelöste Reaktion ist als % der NT-3-Reaktion ausgedrückt. A) 5 ng/ml NT-3, R103A/D105A und R103A. B) 1 ng/ml NT-3, R103M, R103K, N1, Y51A. C) 0,2 ng/ml NT-3, Y11A, T22Q und K80A Q83A. Der Fehler ist die Standardabweichung (SD) von Dreifachbestimmungen. Die Reaktion von Medium aus Mock-transfizierten Zellen wurde von jedem Datenpunkt subtrahiert und betrug 23%, 23% und 29% für das Experiment mit 200 pg/ml, 1.000 pg/ml bzw. 5.000 pg/ml. (D) Reaktion von PC12/trkC-Zellen, die entweder durch NT-3 oder R68A-Mutante enthaltendes, konditioniertes Medium induziert wurden. Prozentueller Anteil an Zellen mit durch verschiedene Dosen von Neurotrophinen induzierten Neuriten. Die Summe der Zellen mit und ohne Neuriten war für NT-3 und R68A für alle Dosen konstant. (E) Überleben von Neuronen aus DRG. Die durch NT-3, R68A oder R114A/K115A induzierte Reaktion ist als Anzahl überlebender Zellen ausgedrückt. Die Ergebnisse sind die Mittelwerte von Dreifachbestimmungen +/–SD. Die durch Mock-transfiziertes, konditioniertes Medium induzierte Reaktion wurde von den Datenpunkten subtrahiert und betrug 20 +/– 4 überlebende Zellen.
Die 3A, 3B und 3C stellen die Bindungsepitope von NT-3 für seine Rezeptoren trkC und gp75 dar. Das NT3-Modell ist dargestellt, wobei die Bindungsdeterminanten aus Monomer A und B in Hell- bzw. Dunkelgrau dargestellt sind. (A) Epitop für den trkC-Rezeptor. (B) Seitenansicht des trkC-Epitops. Positionen von D15 und Y51 relativ zu trkC-Bindungsdeterminanten. (C) Epitop für den gp75-Rezeptor.
Die 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I und 4J stellen das Screening von NT3-Mutanten auf verbesserte BDNF- und NGF-artige Aktivitäten dar. P12-Zellen oder die trkB exprimierende PC12-Zelllinie wurden auf Kollagen-beschichtete Platten ausplattiert. Die PC12/trkB-Zelllinie wurde mit PC12-Medium behandelt, dass entweder mit BDNF (A), NT3 (B), mutiertem D15A (C) oder Überstand Mock-transfizierter 293-Zellen (E) ergänzt war. Die PC12-Zellen wurden mit PC12-Medium behandelt, das entweder mit NGF (F), NT3 (G), S1 (H), D15A (D), MNTS-1 (I) oder Überstand Mock-transfizierter 293-Zellen (J) ergänzt war. Repräsentative Felder wurden drei Tage nach der Behandlung fotografiert.
Die 5A, 5B, 5C und 5D stellen dar, dass MNTS-1 mit hoher Affinität an menschliches trkA, trkB und trkC bindet. Verdrängungskurven unter Verwendung von Rezeptor-Immunoadhäsinen wurden ermittelt, und zwar in Gegenwart einer konstanten Menge von markiertem Neurotrophin (50 pM für trkA, trkB und trkC; 100 pM für gp75) und ansteigenden Mengen von unmarkiertem Kompetitor, (O) HNGF, (Δ) hBDNF, (⎕) NT3, (
) MNTS-1, (X) S1, (+) D15A. (A) Verdrängung von ¹²⁵I-NGF von menschlichem trkA. (B) Verdrängung von ¹²⁵I-BDNF von menschlichem trkB. (C) Verdrängung von ¹²⁵I-NT-3 von menschlichem trkC. (D) Verdrängung von ¹²⁵I-NT-3 von menschlichem gp75.
Die 6A, 6B und 6C stellen die durch MNTS-1 induzierte Autophosphorylierung von trkA, trkB und trkC dar. Die PC12-Variantenzellen wurden neurotrophen Faktoren und Mutanten bei 25 ng/ml für 5 Minuten bei 37°C exponiert und wie in „Experimentelle Verfahren" beschrieben getestet. (A) Reaktion von PC12-Zellen bei Zugabe von keinem Faktor, NGF, NT-3, S1, D15A, MNTS-1 und Überstand Mock-transfizierter 293-Zellen. (B) Reaktion von PC12/trkB-Zellen bei Zugabe von keinem Faktor, NGF, BDNF, NT-3 gereinigt, NT-3 exprimiert, D15A und Überstand Mock-transfizierter 293-Zellen. (C) Reaktion von PC12/trkC-Zellen bei Zugabe von keinem Faktor, NGF, NT-3, D15A, S1, MNTS-1 und Überstand Mock-transfizierter 293-Zellen. Die Zahlen unter den neurotrophen Faktoren kennzeichnen den zur Immunpräzipitation verwendeten Antiserumtyp, 443 ist ein pan-trk-Antiserum, 656 ist ein trkC-spezifisches Antiserum.
7 stellt dar, dass MNTS-1 für das Überleben von DRG-Neuronen genauso potent wie der Cocktail aus NT-3/BDNF/NGF ist. Dosisabhängigkeit des Überlebens von Neuronen aus DRG. Anzahl an Zellen, die vom Cocktail aus NT-3/BDNF/NGF (1 : 1 : 1) (•) und MNTS (
) unterstützt werden. Die Ergebnisse sind als Mittelwert von Dreifachbestimmungen +/–SD ausgedrückt. Die Daten wurden an eine Vierparametergleichung für MNTS-1 (strichlierte Linie) und Cocktail (durchgezogene Linie) angepasst. Die berechneten EC-50-Werte für MNTS-1 und Cocktail betrugen 36 pg/ml bzw. 44 pg/ml.
8 stellt die Homologie, variable Regionen und konstante Regionen der verschiedenen Neurotrophine dar. NGF (Seq.-ID Nr. 3), BDNF (Seq.-ID Nr. 4), NT3 (Seq.-ID Nr. 5) und NT4/5 (Seq.-ID Nr. 6) sind dargestellt, wobei die variablen Regionen eingerahmt sind.
9A, 9B und 9C stellen die Konkurrenzverdrängung von [¹²⁵I]hNGF von entweder trkA-, p75- oder trkA + p75-Rezeptoren durch Erhöhen der Konzentration gereinigter, N-terminal modifizierter Formen von hNGF dar. Die oberen (12A), mittleren (12B) und unteren (12C) Tafeln stellen die Verdrängung von MH3T3-, A875-Melanom- bzw. PC12-Pheochromozytom-Zellen dar, die trkA-, p75- bzw. trkA + p75-Rezeptoren exprimieren. Die konkurrierenden Liganden sind folgendermaßen bezeichnet: (•-•) 111/111 = Homodimere von (10-118)hNGF; (O-O) 118-118 = Homodimere von (1-118)hNGF; (
-
) 115-115 = Homodimere (6-118)hNGF; (
-
) Maus-NGF = Homodimere von (1-118)mNGF. Die Rezeptorbindung wurde bei 4°C durchgeführt und wie in den Beispielen beschrieben analysiert. Die dargestellten Daten repräsentieren die Gesamtbindung (spezifisch und unspezifisch) und vertreten zumindest drei gesonderte Bindungsexperimente für jede Zelllinie. Die IC₅₀ für dieses Experiment ist in Tabelle 5 angegeben.
Die 10A und 10B stellen die durch N-terminal trunkierte Formen von hNGF induzierte Autophosphorylierung dar. Die obere Tafel (10A) zeigt die Intensität der Autophosphorylierung der p140^trkA-Bande als Funktion der molaren Konzentration der hNGF-Variante, während die untere Tafel (10B) die Quantifizierung der mittels Reflexionsdensitometrie bestimmten optischen Dichte jeder Bande darstellt. Die autophosphorylierte p140^trkA-Bande wurde durch Anti-trkA-Immunoblotting an Nitrozellulose, gefolgt von Immunpräzipitation mit Antiphosphotyrosin identifiziert. Die dargestellten Daten repräsentieren zwei unabhängige Experimente.
Die 11A und 11B stellen die Expression und Proteinanalyse von hNGF-Mutanten dar. Tafel A stellt eine Autoradiografie metabolisch markierter Mutanten 1–8 dar (siehe Tabelle 1 für die Beschreibung), die mittels SDS-PAGE getrennt wurden. Die Mutanten wurden vorübergehend in menschlichen 293-Zellen exprimiert und mit ³⁵S-Methionin und Cystein markiert. Konditionierte Medien wurden mit einem gereinigten polyklonalen Kaninchen-Anti-hNGF-Antikörper immunpräzipitiert und die Präzipitate mittels SDS-PAGE wie in den Beispielen beschrieben analysiert. Die mit wt oder B markierten Lanes stellen die Transfektion von Zellen mit Wildform-(1-120)hNGF-Expressionsvektor bzw. AdVA-Vektor alleine dar. Tafel B stellt die Western-Immunoblotanalyse von ungefähr 0,1 μg nicht-markierter hNGF-Mutante oder NGF der Wildform dar. Diese Proben werden aus konditionierten Medien nach Transfektion parallel zu den oben beschriebenen metabolisch markierten Zellen entnommen. Das Immunoblotten wurde mit demselben polyklonalen Anti-hNGF-Antikörper durchgeführt, der in Tafel A beschrieben ist. Die Ergebnisse können der variablen Detektion der Mutanten gegenüber gestellt werden, die parallel dazu im selben Experiment immunogeblottet und mit einem spezifischen monoklonalen hNGF-Antikörper wie in 18 dargestellt zur Reaktion gebracht wurden. Die mit NGF markierte Lane stellt das Signal von 0,1 μg gereinigtem (1-120)hNGF dar. Die linke Achse beider Tafeln bezeichnet die relative Mobilität der Molmassenmarker in kD.
Die 12A, 12B, 12C, 12D, 12E und 12F stellen die Konkurrenzverdrängung von [¹²⁵I]hNGF von trkA (obere Tafeln, 12A und B), p75 (mittlere Tafeln, 12C und 12D) und p75 + trkA (untere Tafeln, 12E und 12F) exprimierenden Zellen durch Erhöhen der Konzentrationen von hNGF-Mutanten dar. Der Übersichtlichkeit halber sind die Daten in zwei Tafeln für jede Zelllinie unterteilt. Für Vergleiche der relativen Bindungsaffinität wurden vier Mutanten und die hNGF-Kontrolle der Wildform in jeder Zelllinie in einem Experiment getestet. Jede der zwei Tafeln stellt zumindest zwei gesonderte Bindungsexperimente aus einem Transfektions- und einem Bindungsexperiment aus einer zusätzlichen Transfektion dar. Die Bindungsexperimente wurden bei 4°C wie in den Beispielen beschrieben durchgeführt. Die Gesamtbindung ist wie in 12 dargestellt. Die IC₅₀ relativ zum hNGF der Wildform ist in Tabelle 5 dargestellt.
Die 13A und 13B stellen die Autophosphorylierung des durch hNGF-Mutanten hervorgebrachten trkA dar. Die obere Tafel (13A) stellt eine Autoradiografie von p140^trkA nach Stimulation trkA-exprimierender Zellen durch die angegebenen Konzentrationen von mutiertem hNGF oder hNGF der Wildform. dar. Die Ausmaße an trkA-Autophosphorylierung wurden wie in 10 bestimmt. Die untere Tafel (13A) ist die densitometrische Quantifizierung der obigen Autoradiografie. Die dargestellten Daten stellen zumindest zwei Experimente dar, welche die von allen Mutanten in einem Experiment hervorgerufene trkA-Autophosphorylierung vergleichen, und stehen mit Daten aus anderen Experimenten im Einklang, die 3–4 Mutanten pro Experiment mit hNGF vergleichen.
14 stellt die durch PC12-Zellen-Neuritenauswuchs ermittelte biologische Aktivität von hNGF-Mutanten dar. PC12-Zellen wurden in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen von hNGF oder hNGF der Wildform für 48 Stunden gezüchtet. Der prozentuelle Anteil aller Zellen mit extendierenden Neuriten in einem vorgegebenen Mikroskopfeld ist wie in den Beispielen beschrieben gegen die maximale durch (1-118)hNGF hervorgerufene Reaktion normalisiert. Die dargestellten Werte sind die Mittelwerte von zumindest zwei Bestimmungen pro Mutante.
Die 15A, 15B, 15C, 15D und 15E stellen die Charakterisierung gereinigter Mutanten der N-terminalen Region dar. A. Silberfärbung der SDS-PAGE (15% Acrylamid) von 1 μg gereinigter H4D-Mutante 2 (Lane 1), gereinigter N-terminaler chimärer hNT3/hNGF-Mutante 6 (Lane 2), teilweise gereinigtem (1-120)hNGF (Lane 3-N) und Molekularmassenmarkern in kD (Lane 4-M). Einzelheiten der Reinigung und Analyse sind im Abschnitt „Material und Verfahren" dargestellt. B. Konkurrenzverdrängung von [¹²⁵I]hNGF durch die gereinigte H4D-Mutante 2, N-terminale chimäre hNT3/hNGF-Mutante 6 und gereinigtes (1-120)hNGF. Die obere Tafel (15B) stellt die Bindung an trkA-exprimierende NIH3T3-Zellen dar, die untere Tafel (15D) zeigt die Bindung an A875-Zellen (p75). C. Die obere Tafel (15C) stellt die Konzentrationsabhängigkeit (M) der durch den Antiphosphotyrosin-Immunoblot wie in 10 und 13 detektierten p140^trkA-Autophosphorylierung dar. Die untere Tafel (18E) stellt die densitometrische Quantifizierung der Immunoblot-Daten dar.
Die 16A und B stellen die Wechselwirkung des monoklonalen Antikörpers mit der N-terminalen Region von hNGF dar. A. Immunoblot von 0,1 μg der Mutanten 1–6 und 8 (Mutante 7 wurde aufgrund niedriger Konzentration weggelassen), hNGF (wt) und des kontroll-transfizierten konditionierten Mediums (B). Konditioniertes Medium wurde einer SDS-PAGE unterzogen, auf Nitrozellulose immungeblottet und mit dem monoklonalen Anti-hNGF-Antikörper 14.14 zur Reaktion gebracht. Die relative Mobilität der Mutanten betrug 14 kD. B. Konkurrenzverdrängung von 25 pM [¹²⁵1]hNGF von entweder trkA exprimierenden oder p75 exprimierenden Zellen durch Erhöhen der Konzentrationen desselben monoklonalen Antikörpers, der in Tafel A verwendet wurde.
17 beschreibt eine schematische Darstellung eines hNGF-Monomers auf Basis der Röntgenstrahlenkristallstruktur von Maus-NGF, welche die Primäraminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 3), die grundlegenden Merkmale der Sekundärstruktur und der mittels Mutagenese modifizierten Reste erkennen lässt. Die gelb schattierten Reste bezeichnen jene, die sich zwischen hNGF und hNT3 unterscheiden und durch die entsprechenden hNT3-Reste in hNGF als Domänenaustausch ersetzt wurden. Die großen schwarzen Zahlen, die sich nahe den Blöcken von 5–8 gelben Resten befinden, nummerieren die spezielle variable Neurotrophin-Region. Diese variablen Regionen umfassen außerdem die Amino- und Carboxytermini. Die rot schattierten Reste bezeichnen jene, die einzeln oder in Paaren mutiert wurden und stellen Aminosäuren dar, die größtenteils dem Lösungsmittel ausgesetzt sind.
Die 18A, 18B und 18C zeigen den hNGF-Aufbau. 18A stellt die Position variabler Domänen in der Primärsequenz von hNGF dar. 18B stellt die chimären Mutanten der variablen Domäne von hNGF dar, die eine einzige variable Domäne von hNT3 enthalten. Die Liste, 18C, enthält die speziellen Reste von hNGF, die durch hNT3 in einer gegebenen Mutante ersetzt wurden.
Die 19A und 19B stellen die Charakterisierung eines neuen Rezeptorbindungsverfahrens dar, das zur Analyse von hNGF-Strukturvarianten verwendet wurde. A) Vergleich der Bindungseigenschaften von trkA-IgG-Immunoadhäsions-basierten Tests mit jenen von in NIH3T3-Zelllinien exprimierten Holo-trkA-Rezeptoren. Die trkA-IgG-Konkurrenzbindungsprofile sind jenen von Holo-trkA-Zelllinien (20A) sehr ähnlich, obwohl trkA-IgG dieselbe Neurotrophin-Selektivität zeigt (20B; NGF >> NT3 > BDNF). Die nunmehr dargestellten Bindungsdaten setzen einzelne trk-A-, -B-, -C- oder p75-IgG-Immunoadhäsionstests ein. Die Rezeptorbindungseigenschaften für mehrere Varianten wurden in Holo-trkA-Zellbindungstests verifiziert.
Die 20A und 20B. stellen die Bindung von chimären hNGF/hNT3-Mutanten an trkA-IgG und gp75-Rezeptoren dar. Die relativen Affinitäten der Mutanten sind als das Verhältnis der IC₅₀ der Mutante zu jener von hNGF aufgetragen, die aus den Konkurrenzbindungskurven entnommenen wurde. Es ist das durchschnittliche Verhältnis aus drei unabhängigen Bindungsexperimenten dargestellt. Die N-terminale NGF/NT3-Domänen-Austauschmutante (Mutante 6) resultiert in einem signifikanten Verlust der trkA-Bindung, während die gp75-Bindung unbeeinflusst bleibt. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit den Daten, die aus der Holo-trkA-Bindung in Zellen bei 4°C erhalten wurden (18B, C). Chimäre Mutanten, welche die ersten Beta-Wende von NT3 enthalten (Mutanten 10 und 19), weisen einen 4fachen Verlust der Potenz der Bindung an gp75 auf. Der Alanin-Ersatz basischer Reste in der ersten Beta-Wende (Mutante 21) oder im C-Terminus (Mutante 24) resultiert in einem signifikanten Verlust der gp75-Bindung.
Die 21A und 21B stellen die Fähigkeit der chimären hNGF/hNT3-Mutanten dar, eine trkA-Tyrosinkinase-Autophosphorylierung bzw. P12-Zellen-Neuritenauswuchs hervorzurufen. TrkA-exprimierende CHO-Zellen wurden mit hNGF, hNT3 oder hNGF/hNT3-Domänen-ausgetauschten chimären Mutanten stimuliert und die Autophosphorylierung durch einen Phosphotyrosin-ELISA-Test (OD_450/650) bestimmt. Im Einklang mit der trkA-Bindung wird die trkA-Autophosphorylierung durch die N- terminale chimäre hNGF/hNT3-Mutante wenig stimuliert. Ein 2- bis 3facher Verlust an Aktivität resultiert aus dem Domänenaustausch in der Prä-Beta-Wende-Region 1 (V18, V20, G23), was eine mögliche Rolle dieser Reste bei der Festlegung der NGF-trkA-Spezifität anzeigt. Für die PC12-Zellen-Differenzierung wurde die EC₅₀ für die Neuritenauswuchs für alle Mutanten bestimmt und als Verhältnis zur EC₅₀ für hNGF ausgedrückt. Wiederum wird die größte Wirkung mit der N-terminalen hNGF/hNT3-Domänen-Austauschmutante beobachtet, jedoch wird ein Verlust der Bioaktivität auch mit der Prä-Beta-Wende-Region 1 beobachtet, was mit der trkA-Bindung und Autophosphorylierung im Einklang steht.
Die 22A und 22B stellen die neurotrophische Gesamtaktivität von hNGF/hNT3-Domänen-Austauschmutanten dar. Die Aktivität wird durch trkC-IgG-Konkurrenzbindung und Neuritenauswuchs in trkC-transfizierten P12-Zellen gemessen. Die Konkurrenzverdrängung von [¹²⁵I]hNT3 wird nur für hNT3 (IC₅₀ = 45 pM) und die hNGF/hNT3-Domänen-Austauschmutante der variablen Region 4 (Mutante 16; IC₅₀ = 80 nM) beobachtet. Gleichermaßen resultiert der hNGF/hNT3-Domänen-Austausch in der variablen Region 4 in einer signifikanten Neuritenauswuchs in trkC-transfizierten PC12-Zellen, die nicht auf hNGF reagieren. Der Vergleich der trkA-abhängigen Bindung, Autophosphorylierung und PC12-Zellaktivitäten für Mutante 16 (19, 20) offenbart einen geringen Verlust an endogener hNGF-artiger Aktivität. Die N-terminale Domänen-Austauschmutante (Mutante 6), die den N-Terminus von NT3 enthält, zeigt keine Wechselwirkung mit trkC.
23 stellt die beiden N-terminalen Domänen-Austauschmutanten dar: hNT3-NH2/hNGF ist Mutante 6 und enthält die hNT3-Reste 1–6 (YAEHKS-), welche die hNGF-Reste 1–7 ersetzen, auf einem verbleibenden hNGF-Gerüst. hNGF-NH2/NT3 ist P2 (S1) und enthält die hNGF-Reste 1–7 (SSSHPIF-), welche die hNT3-Reste 1–6 ersetzten, auf einem verbleibenden hNT3-Gerüst.
Die 24A, 24B und 24C stellen die Gesamt-Neurotrophin-Rezeptorbindungsaktivität von P2 (S1) mit trkA, trkC bzw. gp75 dar. Es wurden Konkurrenzver drängungstests durch Verdrängung von [¹²⁵I]hNGF oder [¹²⁵I]hNT3 von den Rezeptor-IgG-Immunoadhäsionen durch den bezeichneten Faktor durchgeführt. P2 (NGF-NH₂/NT3), die den hNGF-N-Terminus enthaltende N-terminate Domänen-Austauschmutante von hNT3, zeigt eine hNGF-artige trkA-Bindungsaktivität, während die trkC-Aktivität erhalten bleibt. NT3-NH₂/NGF (Mutante 6), die den hNT3-N-Terminus enthaltende umgekehrte N-terminale Domänen-Austauschmutante von hNGF, zeigt eine verminderte trkA-Bindung und keine Bindung an trkC.
Die 25A und 25B stellen die Gesamt-Neurotrophin-Bioaktivität von P2 (S1) in normalen, trkA exprimierenden PC12-Zellen bzw. trkC-transfizierten PC12-Zellen mit verminderter hNGF-Reaktion dar. Der prozentuelle Anteil an Neuriten tragenden PC12-Zellen bei einer gegebenen Konzentration von Neurotrophin oder Variante wurde gegen die maximale vom natürlichen Neurotrophin hervorgerufene Reaktion normalisiert. Die EC₅₀ für P2 (NGF-NH₂/NT3) in den trkA-PC12-Zellen beträgt 0,4 ng/ml (15 pM) und 0,2 ng/ml (7 pM) in den trkC-transfizierten PC12-Zellen, ähnlich zu den EC₅₀ für hNGF bzw. hNT3.
Die 26A und 26B stellen die Bindung von hNGF-Punktmutanten an trkA- und gp75-Rezeptoren dar. Die Affinitäten der Mutanten wurden durch Konkurrenzbindung bestimmt und sind als das Verhältnis der Mutanten-IC₅₀ zu jener des natürlichen hNGF dargestellt. Die IC₅₀ wurde mittels Konkurrenzbindungskurven bestimmt, die zumindest zweimal aus den beiden unabhängigen Transfektionen jedes mutierten hNGF durchgeführt wurden. Die SD der IC₅₀-Verhältnisse für 4–6 unabhängige Messungen für jede Mutante sind dargestellt. Die auf Wirkungen auf die Bindung getesteten hNGF-Reste waren, wie aus der Maus-NGF-Kristallstruktur vorhergesagt wurde, größtenteils oberflächenexponiert.
27 stellt die durch einen trkA-Autophosphorylierungs-ELISA-Test gemessene biochemische Aktivität von hNGF-Mutanten dar. Es ist die EC₅₀ für jede Mutante relativ zu jener von hNGF (EC₅₀ = 120 pM) dargestellt. Mutierte Reste, welche die stärksten Wirkungen auf die Potenz aufwiesen, sind durch die Restenummer gekennzeichnet. Mutierte Reste, die zusätzliche Wirkungen auf das Ausmaß an Autophosphorylierung (Effizienz) aufwiesen, sind durch Restenummer und Stern (*) gekennzeichnet.
28 stellt die Bioaktivität ausgewählter hNGF-Mutanten im trkA-PC12-Zellen-Neuritenauswuchsstest dar. Es ist das Verhältnis der EC₅₀ für die Neuritenauswuchs jeder Mutante im Vergleich zur Reaktion von hNGF aufgetragen. Mutierte Reste mit den stärksten Wirkungen sind gekennzeichnet. Alle anderen Mutanten werden zurzeit untersucht.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Einzelbuchstabencodes für die Aminosäuren werden hierin wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt gemäß folgender Tabelle verwendet:
Tabelle 1
Folglich ist die Kennzeichnung einer Aminosäure der Einzelbuchstaben-Aminosäurecode, gefolgt von der Positionszahl des Rests. Es versteht sich, dass die Positionszahl dem speziellen Neurotrophingerüst entspricht, daher bedeutet D15A-NT3, dass die Asparaginsäureposition 15 von NT3 gegen ein Alanin ausgetauscht ist. Diese Asparaginsäure, die sich in einer unten definierten „konstanten Region" findet, entspricht der Position 16 von NGF, da NGF eine zusätzliche Aminosäure an seinem N-Terminus aufweist, wie in 8 dargestellt ist.
Die vorliegende Erfindung stellt pantrope Neurotrophine bereit. Im Allgemeinen ist ein Neurotrophin ein Protein, das an der Entwicklung, Regulation und Erhaltung des Nervensystems und insbesondere von Neuronen beteiligt ist. Gegenwärtig gibt es zumindest fünf bekannte, wichtige neurotrophe Faktoren: Nervenwachstumsfaktor (NGF), Neurotrophin-3 (NT3), Neurotrophin-4 (NT4, manchmal auch Neurotrophin-5 (NT5) oder NT4/5 genannt), vom Gehirn stammender neurotropher Faktor (BDNF) und Ziliar-neurotropher-Faktor (CNTF).
Unter dem Ausdruck „pantrope Neurotrophine" oder „pantrope neurotrophe Faktoren" oder grammatikalischen Entsprechungen wird hierin ein Neurotrophin verstanden, das im Gegensatz zu natürlich auftretenden Neurotrophinen mehrere Neurotrophin-Spezifitäten aufweist. Das heißt, es enthält Domänen, die verschiedene Neurotrophin-Spezifitäten verleihen. In einer der Ausführungsformen bedeutet dies, dass die pantropen Neurotrophine der vorliegenden Erfindung an eine Vielzahl von neurotrophen Rezeptoren binden werden. Folglich bindet beispielsweise natürlich vorkommendes NGF, das der natürliche oder native Ligand für den trkA-Rezeptor ist, mit keiner nennenswerten Affinität an den trkB- sowie trkC-Rezeptor; beispielsweise bindet NGF an diese Rezeptoren mit einer 500–1.000 Mal niedrigeren K_D als BDNF bzw. NT3. Jedoch kann ein pantropes NGF, d. h. ein pantropes Neurotrophin, dessen Aminosäuregerüst auf NGF basiert, zumindest an den trkA-, trkB- und p75-Rezeptor binden. Alternativ dazu wird ein pantropes NGF an den trkA-, trkC- und p75-Rezeptor binden. Eine bevorzugte Ausführungsform ermöglicht die Bindung des trkA-, trkB-, trkC- und p75-Rezeptors. Gleichermaßen binden natürlich vorkommendes BDNF und NT4/5, welche die natürlichen Liganden für den trkB-Rezeptor sind, wie oben nicht nennenswert an den trkA- sowie trkC-Rezeptor.
In alternativen Ausführungsformen wird das natürlich vorkommende Neurotrophin mit geringer Affinität an mehrere Neurotrophin-Rezeptoren binden. In dieser Ausführungsform bindet pantropes Neurotrophin an diese Rezeptoren mit höheren als die normalerweise vorkommenden Affinitäten, ähnlich zu den Affinitäten, die für den natürlichen Liganden beobachtet werden. Beispielsweise bindet NT3 stark an trkC und schwach an trkA und trkB. Folglich bindet ein pantropes NT3 mit seiner normalen Bindungsaffinität an trkC und an trkB mit einer Affinität ähnlich den natürlichen trkB-Liganden BDNF oder NT4/5 oder beiden.
In der bevorzugten Ausführungsform beträgt die Bindungsaffinität des pantropen Neurotrophins für Neurotrophin-Rezeptoren zumindest ungefähr 50–60%, vorzugsweise ungefähr 75–80% und insbesondere bevorzugt ungefähr 90% der Bindungsaffinität des natürlichen Liganden. Folglich wird ein pantropes NGF an den trkB- oder trkC-Rezeptor mit zumindest 50% der Bindung von BDNF oder NT4/5, bzw. NT3 binden. Diese Affinität wird auf zahlreiche Weisen gemessen, wie der Fachkundige auf dem Gebiet der Erfindung anerkennen wird. Das bevorzugte Verfahren ist die Verwendung von Konkurrenztests, wie sie in (84) und im Beispiel 2 dargelegt sind. Im Allgemeinen werden Bindungsaffinitäten als IC₅₀ angegeben, welche diejenige Konzentration des unmarkierten Kompetitors ist, die 50% der Bindung des markierten Liganden an den Rezeptor hemmt.
In alternativen Ausführungsformen wird die Pantropie des Neurotrophins nicht durch die Bindungsaffinität an Neurotrophin-Rezeptoren gemessen, sondern durch das Überleben von Neuronen oder durch Neuritenauswuchsstests. Folglich unterstützen alle Neurotrophine das Überleben embryonaler sensorischer Neuralleisten-Neuronen (77), (78), (7), (17). Das Überleben embryonaler sympathischer Neuronen wird nur durch NGF unterstützt, während das Überleben sensorischer, von Plakode abgeleiteter Neuronen durch NT3 und BDNF unterstützt wird (85). Das Überleben sensorischer Neuronen des Spinalganglions wird von NGF sowie BDNF unterstützt (13). NT3 ruft eine Neuritenauswuchs sensorischer Neuronen aus dem Spinalganglion, aus Sympathikusanglienketten und knotigen Ganglion hervor und unterstützt das Überleben von Neuronen des knotigen Ganglions und Spinalganglion-Neuronen. Folglich können Neuronenüberlebenstests oder Neuritenauswuchsstests durchgeführt werden, um die Panthrophie der pantropen Neurotrophine zu bestimmen.
Folglich wird die Neurotrophin-Spezifität durch die Neurotrophinrezeptorbindung, und die Neuronenüberlebenstests und/oder Neuritenauswuchsstests bestimmt. Folglich wird unter einem pantropen Neurotrophin mit NGF-Spezifität ein Neurotrophin verstanden, das zumindest die Bindungseigenschaften, Neuronenüberlebenstestspezifität oder die Neuritenauswuchsstestspezifität von NGF aufweist.
In einer weiteren Ausführungsform werden pantrope Neurotrophine durch Konstruieren kovalenter Heterodimere hergestellt. Normalerweise sind Neurotrophine Homodimere, die zwei identische Monomere umfassen, die nicht-kovalent verbunden sind. In dieser Ausführungsform wird Pantropie wie unten dargelegt durch jedes Monomer verliehen, das Domänen enthält, die unterschiedliche neurotrophe Spezifitäten verleihen. Alternativ dazu kann Pantropie erzeugt werden, indem zwei verschiedene Neurotrophine mit verschiedenen Spezifitäten kovalent verbunden werden, um ein kovalentes Heterodimer zu erzeugen. Folglich kann beispielsweise ein NGF-Monomer kovalent an ein NT3-Monomer gebunden werden, was in einem pantropen Neurotrophin mit NGF- sowie NT3-Spezifität resultiert. Außerdem kann dieses Verfahren mit Monomeren durchgeführt werden, die selbst pantrop sind, was kovalente Dimere beliebiger Kombinationen pantroper und monospezifischer Monomere liefert. Folglich kann ein pantropes kovalentes Dimer ein Homodimer zweier pantroper Monomere sein. Um jedoch in der Definition der vorliegenden Erfindung umfasst zu sein, muss das pantrope kovalente Dimer zumindest zwei, vorzugsweise drei Neurotrophin-Spezifitäten aufweisen.
Die kovalente Bindung wird vorzugsweise als direkte Fusion der Nucleinsäure vorgenommen, so dass bei der Expression des Proteins der C-Terminus des ersten Monomers direkt an den N-Terminus des zweiten Monomers gebunden wird, wodurch eine einzige, für das Dimer kodierende Nucleinsäure erzeugt wird. In alternativen Ausführungsformen kann ein Linker, wie z. B. kurze Wiederholungen von Glycin und Serin verwendet werden, beispielsweise kann ein Linker, wie z. B. Gly-Gly oder Gly-Gly-Ser-Gly-Gly verwendet werden. Dies wird mittels Verfahren durchgeführt, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind. Andere Techniken für die kovalente Bindung von Proteinen sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt.
Pantrope Neurotrophine erzielen eine pantrope Bindung oder, wie oben erörtert, ein pantropes Neuronenüberleben, indem sie Domänen enthalten, die Neurotrophinrezeptorspezifität oder Bindung verleihen. Eine Domäne kann auf eine von zwei Weisen definiert werden. In der ersten Ausführungsform ist eine Domäne ein Abschnitt des Neurotrophins, das eine gewisse neurotrophe Spezifität verleiht. In dieser Ausführungsform enthält ein einzelnes Monomer des pantropen Neurotrophins eine oder mehrere Domänen, die unterschiedliche Spezifitäten verleihen. Die Domänen können im Größenbereich von einer einzigen Aminosäure bis ungefähr 10–15 Aminosäuren liegen. Die Domäne kann aus einer Kombination von Aminosäuren aus einem anderen Neurotrophin als das Wirts-Neurotrophin bestehen, d. h. dass eine Domäne aus einem Neurotrophin in ein zweites Neurotrophin substituiert werden kann, wodurch dem zweiten Neurotrophin eine Pantropie verliehen wird. Alternativ dazu kann die Domäne aus Aminosäuresubstitutionen resultieren, die nicht auf Homologie zu bestehenden Neurotrophinen beruhen, wie unten dargelegt wird. In der bevorzugten Ausführungsform umfasst die Domäne eine kontinuierliche Sequenz von Aminosäuren; dass heißt, dass ein einzelner Abschnitt von Aminosäuren ersetzt wird. In anderen Ausführungsformen kann die Domäne aus diskontinuierlichen Aminosäuren bestehen; beispielsweise können mehrere Regionen im Neurotrophin Spezifität verleihen und folglich sind für eine Pantropie Ersetzungen an mehreren Positionen im Neurotrophin notwendig.
In manchen Ausführungsformen liegt mehr als eine Domäne in einem Neurotrophin vor, die neurotrophe Spezifität verleihen können, was vom jeweiligen Neurotrophin abhängt. Beispielsweise weist BNDF eine Reihe von Domänen auf, die anscheinend BDNF-Spezifität verleihen. Die vorliegende Erfindung zeigt, dass eine einzige Aminosäureänderung in NT3 von Asparaginsäure an Position 15 zu einem Alanin dem NT3 BDNF-Spezifität verleiht. Diese Domäne kann auch in die NGF-Sequenz an derjenigen Position importiert werden, die Position 15 in NT3 entspricht; d. h. Position 16 in NGF. Es versteht sich, dass die entsprechenden Aminosäuren durch eine Untersuchung der Angleichung der Sequenzen wie in 8 gezeigt ermittelt werden. Zusätzlich zu dieser Domäne liegen andere Domänen in BDNF vor, die BDNF-Spezifität verleihen. Beispielsweise kann die Substitution der BDNF-Sequenz von Position 78 bis Position 88 (QCRTTQSYVR) oder von Position 93 bis Position 99 (SKKRIG) BDNF-Spezifität verleihen (55).
Gleichermaßen weist NT3 eine Reihe von Domänen auf, die NT3-Spezifität verleihen könnten, wenn sie in ein anderes Neurotrophin substituiert werden. Eine Reihe von NT3-Resten hat sich als bedeutsam bei der NT3-trkC-Rezeptorbindung sowie bei Bioaktivitätstests erwiesen. Im Speziellen tragen Mutationen an den Positionen R103, D105, K80, Q83, E54, R56, T22, Y51, V97, Y11, E7, R8, E10 und R68 alle zur NT3-Spezifität bei, da Mutationen an diesen Positionen in NT3 Verminderungen der NT3-Aktivität verursachen. Von diesen befinden sich K80, QA83, T22 und V97 in variablen Regionen, wie in 8 gezeigt ist, und der Rest befindet sich in konstanten Regionen. Außerdem können Reste in Nachbarschaft der Reste ebenfalls NT3-Spezifität liefern. In manchen Ausführungsformen können Änderungen in den konstanten Regionen ebenfalls NT3-Spezifität bewirken. Alternativ dazu verursachten Mutationen an den Positionen R31 und E92 Erhöhungen der NT3-Bindung; im Speziellen zeigten R31A- und E92A-NT3 eine erhöhte trkC-Bindung. Diese Mutationen können neben NT3 direkt in Neurotrophine importiert werden, und zwar unter Verwendung der unten beschriebenen Verfahren. Die Aminosäuren an beliebigen dieser Positionen können wie unten dargestellt geändert werden.
NGF weist eine Reihe von Domänen auf, die NGF-Spezifität verleihen könnten, wenn sie in ein anderes Neurotrophin substituiert werden. Die N-terminalen Aminosäuren von NGF verleihen NGF-Spezifität, wenn die N-terminalen Reste von NT3 mit diesen substituiert werden. Im Speziellen können die 6 N-terminalen Aminosäuren von NT3 (YAEHKS) durch die 7 N-terminalen Aminosäuren (SSSHPIF) von NGF substituiert werden, was in einem pantropen NT3 mit NGF-Spezifität resultiert. Die exakte Anzahl von N-terminalen NGF-Resten ist nicht entscheidend; wie in den Beispielen und insbesondere im Beispiel 3 gezeigt wird, scheint das Histidin an der Aminosäureposition 4 für NGF-Spezifität ziemlich wichtig zu sein; folglich können ungefähr 4 bis ungefähr 10 N-terminale Reste ausgetauscht werden, obgleich in manchen Ausführungsformen eine einzige Aminosäureänderung ausreicht. Gleichermaßen ist gezeigt worden, dass eine Reihe anderer NGF-Reste bei der NGF-trkA-Rezeptorbindung sowie in Bioaktivitätstests von Bedeutung sind. Beispielsweise gibt es eine Reihe von Resten, die bei Mutation NGF-Aktivität verlieren. Dies belegt die Bedeutung dieser Reste für die NGF-Spezifität. Diese Reste umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf H4, P5, V18, V20, G23, D30, Y52, R69, H75, Y79, T81 und R103. Von diesen befinden sich D30, R59, Y79 und T81 in „variablen Regionen", d. h. in Regionen, die unter verschiedenen Neurotrophinen variieren, wie in 8 dargestellt ist, wobei sich die verbleibenden in konstanten Regionen befinden. In manchen Ausführungsformen bewirken die Reste variabler Regionen mit höherer Wahrscheinlichkeit NGF-Spezifität, da Reste konstanter Regionen für die allgemeine Struktur und allgemeine Eigenschaften von Bedeutung sein könnten und keine Spezifität verleihen dürften. Jedoch können, wie oben für die D15A-Mutation gezeigt wurde, Mutationen in den konstanten Regionen ebenfalls Spezifität verleihen. Außerdem gibt es eine Reihe von Aminosäuresubstitutionen in NGF, welche die NGF-Bindung und/oder Bioaktivität erhöhen. Demgemäß können diese Substitutionen in andere Neurotrophin-Gerüste importiert werden, um NGF-Spezifität zu verleihen. Diese Reste umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf E11, F12, D24, E41, N46, S47, K57, D72, N77, H84, D105 und K115.

Wenn sie einmal identifiziert sind, können für die Neurotrophin-Spezifität wichtige Reste durch beliebige der anderen Aminosäurereste ersetzt werden, und zwar unter Verwendung von in den Beispielen beschriebenen Techniken und wohlbekannten Techniken für ortsgerichtete Mutagenese. Im Allgemeinen werden die zu substituierenden Aminosäuren auf Basis von Eigenschaften gewählt, die vom Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung wohlverstanden werden. Wenn beispielsweise geringfügige Veränderungen der Eigenschaften erwünscht sind, werden Substitutionen im Allgemeinen gemäß folgender Tabelle vorgenommen: Tabelle 2

Ursprünglicher Rest	Beispielhafte Substitutionen
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gln, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn, Gln
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg
Met	Leu, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

Wesentliche Änderungen der Funktion oder immunologischen Identität werden vorgenommen, indem Substitutionen gewählt werden, die weniger konservativ als die in der Tabelle dargestellten sind. Beispielweise können Substitutionen vorgenommen werden, die in einem signifikanteren Ausmaß folgende Eigenschaften beeinflussen: die Struktur des Polypeptidgerüsts im Bereich der Änderung, beispiels weise die Alpha-Helix- oder Beta-Faltblatt-Struktur; die Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Zielstelle; oder die Sperrigkeit der Seitenkette. Die Substitutionen, von denen im Allgemeinen erwartet wird, dass sie die stärksten Veränderungen der Eigenschaften des Polypeptids hervorrufen, sind jene, bei denen (a) ein hydrophiler Rest, z. B., Seryl oder Threonyl durch einen hydrophilen Rest, z. B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl substituiert wird oder umgekehrt; (b) ein Cystein oder Prolin durch einen beliebigen anderen Rest substituiert wird oder umgekehrt; (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z. B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl durch einen elektronegativen Rest, z. B. Glutamyl oder Aspartyl substituiert wird oder umgekehrt; oder (d) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette, z. B. Phenylalanin, durch einen substituiert wird, der wie z. B. Glycin keine Seitenkette aufweist oder umgekehrt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Reste zu Alaninresten geändert.
Andere Domänen in jedem Neurotrophin können unter Verwendung der hierin offenbarten Techniken aufgefunden werden. Im Speziellen ermöglichen die Modellierungstechniken des Beispiels 1 die Identifizierung mutmaßlicher Spezifitätsstellen. Außerdem können Homolog-Scanningmutagense, Zufallsmutagenese, Kassettenmutagenese alle verwendet werden, um mutmaßliche pantrope Neurotrophine zu erzeugen, die dann unter Verwendung der in den Beispielen beschriebenen und auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannten Techniken auf Rezeptorbindung gescreent werden können.
Im Zusammenhang mit einem kovalenten Heterodimer kann sich eine Domäne auch auf das gesamte Neurotrophin-Monomer beziehen. Folglich kann ein pantropes kovalentes Heterodimer eine Domäne, die NT3-Spezifität verleiht, d. h. das NT3-Monomer umfassen, die kovalent an eine Domäne, die BDNF-Spezifität verleiht, d. h. an das BDNF-Monomer gebunden ist. Gleichermaßen kann ein NT3-Monomer mit einem NGF-Monomer gepaart sein. In diesen Ausführungsformen ist die Domäne groß und umfasst im Allgemeinen den Großteil oder die gesamte Neurotrophin-Aminosäuresequenz der Wildform.
In der umfassendsten Ausführungsform bindet ein pantropisches Neurotrophin an zumindest drei verschiedene Neurotrophin-Rezeptoren. In der bevorzugten Ausführungsform bindet das pantrope Neurotrophin an zumindest vier verschiedene Neurotrophin-Rezeptoren.
Unter dem Ausdruck „Neurotrophin-Rezeptor" oder grammatikalischen Entsprechungen davon wird ein Rezeptor verstanden, der einen Neurotrophin-Liganden bindet. In manchen Ausführungsformen ist der Neurotrophin-Rezeptor ein Element der Tyrosinkinasefamilie von Rezeptoren, die im Allgemeinen als „trk"-Rezeptoren bezeichnet und an der Oberfläche unterschiedlicher Neuronenpopulationen exprimiert werden. Die trk-Familie umfasst, ist jedoch nicht eingeschränkt auf trkA (auch als p140^trk bekannt); trkB (auch als p145^trkB bekannt); und trkC (auch als p145^trkC bekannt). In anderen Ausführungsformen ist der Neurotrophin-Rezeptor p75^NGFR, der auch p75 oder niedrigaffiner Nervenwachstumsfaktor-Rezeptor (LNGFR) genannt wird. Es versteht sich außerdem, dass andere bisher nicht entdeckte Neurotrophin-Rezeptoren ebenfalls an die pantropen Neurotrophine der vorliegenden Erfindung binden können, wie vom Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung leicht festgestellt werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das pantrope Neurotrophin ein pantropisches NT3. In diesem Zusammenhang ist ein pantropes NT3 ein pantropes Neurotrophin, das eine zur Aminosäuresequenz von NT3 homologe Aminosäuresequenz mit Domänen aufweist, die andere Neurotrophin-Spezifitäten verleihen. In der bevorzugten Ausführungsform werden NT3-Reste durch die Domänen substituiert, d. h. dass eine gewisse Anzahl von Aminosäuren aus der NT3-Sequenz deletiert und eine identische oder ähnliche Anzahl von Aminosäuren substituiert wird, was eine zusätzliche Spezifität verleiht. Beispielsweise umfasst das pantrope MNTS-1-(„mehrere neurotrophe Spezifitäten"-1-)NT3 die ersten 7 Aminosäuren von NGF, welche die 6 N-terminalen NT3-Reste ersetzten, zuzüglich der D15A-Substitution. Das pantrope MNTS-1-NT3 weist NT3-, NGF- und BDNF-Spezifitäten auf und bindet außerdem an den p75-Rezeptor. Andere pantrope NT3 werden unter Verwendung minimaler Änderungen im N-Terminus hergestellt. Da beispielsweise H4 und P5 unter NGFs konserviert sind und 2 hydrophobe Resten an Positionen 6 und 7 konserviert sind, werden die folgenden Varianten hergestellt: 1) YASHPIF-hNT3; 2) YAHPIF-hNT3; 3) YASHPIS-hNT3; 4) YAEHPIF-hNT3; 5) YAQHPIF-hNT3. Wenn die D15A-Substitution angefügt wird, zeigen die resultierenden Neurotrophine NGF-, NT3- und BDNF-Spezifität. Alternativ dazu liefert das Ersetzen der variablen Region 2 oder 3 oder 4, oder Kombinationen davon, von NT3 durch die entsprechende Region aus NGF ein pantropes Neurotrophin mit NT3- sowie NGF-Spezifität.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das pantrope Neurotrophin pantropes NGF. In diesem Zusammenhang ist ein pantropes NGF ein pantropes Neurotrophin, das eine zur Aminosäuresequenz von NGF homologe Aminosäuresequenz mit Domänen aufweist, die andere Neurotrophin-Spezifitäten verleihen. In der bevorzugten Ausführungsform werden NGF-Reste durch die Domänen substituiert, d. h. dass eine gewisse Anzahl von Aminosäuren aus der NGF-Sequenz deletiert und eine identische oder ähnliche Anzahl von Aminosäuren substituiert wird, was eine zusätzliche Spezifität verleiht. Beispielsweise wird ein pantropes NGF mit einer D16A-Substitution hergestellt, die BDNF-Spezifität verleiht, zuzüglich Substitutionen in der prävariablen Region 1 (V18E + V20L + G23T) und in der variablen Region 4 (Y79Q + T81K + H84Q + F86Y + K88R). Alternativ dazu können die Substitutionen in der prä-variablen Region 1 mit nur einzelnen Aminosäuresubstitutionen in der variablen Region 4 hergestellt werden; beispielsweise kann V18E + V20L + G23T und eine von Y79Q, T81K, H84Q, F86Y oder K88R vorgenommen werden.
Zusätzlich zu den oben kurz dargestellten Aminosäureänderungen wird vom Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung verstanden, dass eine gewisse Variabilität der Aminosäuresequenz toleriert wird, ohne die Spezifität und Eigenschaften des Neurotrophin zu verändern. Folglich können pantrope Neurotrophine Aminosäuresubstitutionen, Insertionen oder Deletionen im Vergleich zu den Sequenzen der Wildform aufweisen, welche die Pantropie nicht beeinträchtigen, sondern lediglich Variationen der Sequenz sind. In manchen Ausführungsformen werden sich diese Mutationen an denselben Positionen finden, die als für die Spezifität bedeutsam identifiziert wurden; d. h. dass in manchen Fällen neutrale Mutationen vorgenommen werden können, ohne die Neurotrophin-Spezifität zu verändern.
Die pantropen Neurotrophine der vorliegenden Erfindung können auf zahlreiche Weisen unter Verwendung rekombinanter Technologien hergestellt werden. Unter dem Ausdruck „rekombinante Nucleinsäure" wird hierin eine Nucleinsäure in einer Form verstanden, die in der Natur normalerweise nicht vorkommt. Das heißt, dass eine rekombinante Nucleinsäure von einer Nucleotidsequenz flankiert wird, welche die natürliche Nucleinsäure nicht flankiert oder eine Sequenz aufweist, die in der Natur normalerweise nicht vorkommt. Rekombinante Nucleinsäuren können zuerst in vitro durch Manipulation von Nucleinsäure durch Restriktionsendonucleasen gebildet werden, oder alternativ dazu unter Verwendung von Techniken, wie z. B. der Polymerasekettenreaktion. Es versteht sich, dass eine rekombinante Nucleinsäure, sobald sie hergestellt und wieder in eine Wirtszelle oder in einem Wirtsorganismus eingeführt ist, nicht-rekombinant replizieren wird, d. h. unter Verwendung der In-vivo-Zellmaschinerie der Wirtszelle und nicht der In-vitro-Manipulationen; jedoch werden derartige Nucleinsäuren, wenn sie einmal rekombinant produziert werden, trotz anschließender nicht-rekombinanter Produktion für die Zwecke der Erfindung nach wie vor als rekombinant betrachtet.
Gleichermaßen ist ein „rekombinantes Protein" ein Protein, das durch rekombinante Techniken, d. h. über die Expression einer oben dargelegten rekombinanten Nucleinsäure hergestellt wird. Ein rekombinantes Protein unterscheidet sich vom natürlich vorkommenden Protein durch zumindest eine oder mehrere Eigenschaften. Beispielsweise kann das Protein von einigen oder allen Proteinen oder Verbindungen abgetrennt und isoliert werden, mit denen es normalerweise in seinem Wirt der Wildform assoziiert ist. Die Definition umfasst die Produktion pantroper Neurotrophine aus einem Organismus im selben Organismus oder in einem anderen Organismus oder einer anderen Wirtszelle. Beispielsweise kann das Protein im selben Organismus hergestellt werden, aus dem es stammt, jedoch in einer höheren Konzentration, als sie normalerweise beobachtet wird, z. B. durch die Verwendung eines induzierbaren oder stark exprimierenden Promotors, so dass erhöhte Mengen des Proteins hergestellt werden. Alternativ dazu kann das Protein in einer Form hergestellt werden, die in der Natur normalerweise nicht vorkommt, wie bei der Addition eines Epitop-Markers oder bei Aminosäuresubstitutionen, Insertionen und Deletionen.
Unter Verwendung der Nucleinsäuren der Erfindung, die für pantrope Neurotrophine kodieren, werden eine Reihe von Expressionsvektoren hergestellt. Die Expressionsvektoren können entweder selbst-replizierende extrachromosomale Vektoren oder Vektoren sein, die sich in das Wirtsgenom integrieren. Im Allgemeinen umfassen Expressionsvektoren eine die Transkription und Translation regulierende Nucleinsäure, die operabel an die für das pantrope Neurotrophin kodierende Nucleinsäure gebunden ist. „Operabel gebunden" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die die Transkription und Translation regulierende DNA auf eine solche Weise bezüglich der kodierenden Sequenz des pantropen Neurotrophins positioniert ist, dass die Transkription initiiert wird. Im Allgemeinen bedeutet dies, dass die Promotor- und Transkriptionsinitiations- oder Startsequenzen 5' zur für pantropes Neurotrophin kodierenden Region positioniert werden. Die transkriptions- und translationsregulatorische Nucleinsäure ist im Allgemeinen für die Wirtszelle geeignet, die zur Expression des pantropen Neurotrophins verwendet wird; beispielsweise werden Transkriptions- und Translationsregulations-Nucleinsäuresequenzen aus Säugetierzellen verwendet, um das pantrope Neurotrophin in Säugetierzellen zu exprimieren. Zahlreiche Typen geeigneter Expressionsvektoren und geeignete Regulationssequenzen sind auf dem Gebiet der Erfindung für eine Vielzahl von Wirtszellen bekannt.
Im Allgemeinen können die Transkriptions- und Translationsregulationssequenzen Promotorsequenzen, Transkriptionsstart- und Transkriptionsstopsequenzen, Translationsstart- und Translationstopsequenzen, Terminations- und Poly-A-Signalsequenzen, und Enhancer- oder Aktivatorsequenzen umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Regulationssequenzen einen Promotor und Transkriptionsstart- und Stopsequenzen.
Promotorsequenzen kodieren entweder für konstitutive oder für induzierbare Promotoren. Hybridpromotoren, die Elemente von mehr als einem Promotor kombinieren, sind auf dem Gebiet der Erfindung ebenfalls bekannt und in der Erfindung zweckdienlich.
Außerdem kann der Expressionsvektor zusätzliche Elemente umfassen. Beispielsweise kann der Expressionsvektor zwei Replikationssysteme aufweisen, wodurch seine Erhaltung in zwei Organismen, zum Beispiel in Säugetierzellen zur Expression und in einem prokaryotischen Wirt zur Klonierung und Amplifikation ermöglicht wird. Darüber hinaus enthält der Expressionsvektor für integrierende Expressionsvektoren zumindest eine zum Wirtszellgenom homologe Sequenz und vorzugsweise zwei homologe Sequenzen, die das Expressionskonstrukt flankieren. Der integrierende Vektor kann zu einem speziellen Locus in der Wirtszelle geleitet werden, indem die geeignete homologe Sequenz zur Aufnahme in den Vektor gewählt wird. Konstrukte für integrierende Vektoren sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt.
Außerdem enthält der Expressionsvektor in einer bevorzugen Ausführungsform ein selektierbares Markergen, um die Selektion transformierter Wirtszellen zu ermöglichen. Selektionsgene sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt und variieren mit der verwendeten Wirtszelle.
Die pantropen Neurotrophine der Erfindung werden produziert, indem eine mit einem die für ein pantropes Neurotrophin kodierende Nucleinsäure enthaltenden Expressionsvektor transformierte Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird, um die Expression des pantropen Neurotrophins zu induzieren oder zu bewirken. Die zur Expression des pantropen Neurotrophins geeigneten Bedingungen variieren mit der Wahl des Expressionsvektors und der Wirtszelle, und können von einem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung leicht ermittelt werden. Beispiels weise erfordert die Verwendung konstitutiver Promotoren im Expressionsvektor die Optimierung des Wachstums und der Proliferation der Wirtszelle, wogegen die Verwendung eines induzierbaren oder reprimierbaren Promotors die geeigneten Wachstumsbedingungen für Induktion oder Repression erfordert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das pantrope Neurotrophin nach der Expression gereinigt oder isoliert. Die pantropen Neurotrophine können auf zahlreiche Weisen isoliert oder gereinigt werden, die dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind und davon abhängen, welche anderen Verbindungen sich in der Probe befinden. Standardreinigungsverfahren umfassen elektrophoretische, molekulare, immunologische und chromatographische Techniken, einschließlich Ionenaustauschhydrophobe, Affinitäts- und Umkehrphasen-HPLC-Chromatographie, und Chromatofokussierung. Ultrafiltrations- und Diafiltrationstechniken in Verbindung mit Proteinkonzentration sind ebenfalls zweckdienlich. Für allgemeine Anleitungen zu geeigneten Reinigungstechniken siehe (57). Das notwendige Ausmaß der Reinigung variiert üblicherweise in Abhängigkeit von der Verwendung des pantropen Neurotrophins. In manchen Fällen wird keine Reinigung notwendig sein.
Geeignete Wirtszellen umfassen Hefe, Bakterien, Archaebakterien, Pilze, wie z. B. filamentöse Pilze, sowie Pflanzen- und Tierzellen, einschließlich Säugetierzellen. Von besonderem Interesse sind Saccharomyces cerevisiae und andere Hefen, E. coli, Bacillus subtilis, Pichia pastoris, SF9-Zellen, C129-Zellen, 293-Zellen, Neurospora sowie CHO-, COS-, HeLa-Zellen, immortalisierte Säugetier-Knochenmark- und Lymphoid-Zelllinien. Eine bevorzugte Wirtszelle ist eine Säugetierzelle und die insbesondere bevorzugten Wirtzellen umfassen CHO-Zellen, COS-7-Zellen und die menschliche Urnierenzelllinie 293.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die pantropen Neurotrophine der Erfindung in Säugetierzellen exprimiert. Säugetier-Expressionssysteme sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Manche Gene können effizienter exprimiert werden, wenn Introns vorhanden sind. Mehrere cDNAs sind jedoch effizient aus Vektoren exprimiert worden, denen Spleißsignale fehlen. Folglich umfasst die für das pantrope Neurotrophin kodierende Nucleinsäure in manchen Ausführungsformen Introns.
Die Verfahren zur Einführung exogener Nucleinsäure in Säugetierwirte sowie in andere Wirte sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt und variieren mit der verwendeten Wirtszelle und umfassen Dextran-vermittelte Transfektion, Calciumphosphatpräzipitation, Polybren-vermittelte Transfektion, Protoplastenfusion, Elektroporation, Verkapselung des/der Polynucleotids/e in Liposomen und direkte DNA-Mikroinjektion in Kerne.
In einer der Ausführungsformen werden pantrope Neurotrophine in Hefezellen produziert. Hefeexpressionssysteme sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt und umfassen Expressionsvektoren für Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans und C. maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis und K. lactis, Pichia guillerimondii und P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe und Yarrowia lipolytica. Die Verfahren zur Einführung exogener Nucleinsäure in Hefewirte sowie in andere Wirte sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt und variieren mit der verwendeten Wirtszelle.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden pantrope Neurotrophine in bakteriellen Systemen exprimiert. Expressionsvektoren für Bakterien sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt und umfassen Vektoren unter anderem für Bacillus subtilis, E. coli, Streptococcus cremoris und Streptococcus lividans. Die bakteriellen Expressionsvektoren werden unter Verwendung von Techniken in Bakterienwirte transformiert, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind, wie z. B. Calciumchloridbehandlung, Elektroporation und andere.
In einer der Ausführungsformen werden pantrope Neurotrophine in Insektenzellen produziert. Expressionsvektoren zur Transformation von Insektenzellen und insbe sondere auf Baculovirus basierende Expressionsvektoren sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Materialien und Verfahren für Baculovirus/Insektenzellen-Expressionssysteme sind im Handel in Form von Sets erhältlich; beispielsweise das „MaxBac"-Set von Invitrogen in San Diego.
Es sind rekombinante Baculovirus-Expressionsysteme zur Infektion in mehrere Insektenzellen entwickelt worden. Beispielsweise sind rekombinante Baculoviren für Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda und Trichoplusia ni entwickelt worden.
Wenn sie einmal exprimiert sind, werden pantrope Neurotrophine als neurotrophe Faktoren verwendet. Diese pantropen Neurotrophine können bei verschiedenen diagnostischen und therapeutischen Anwendungen eingesetzt werden.
Die pantropen Neurotrophine der vorliegenden Erfindung sind in Diagnoseverfahren des Nachweises von Neurotrophinrezeptoren zweckdienlich. Beispielweise können die pantropen Neurotrophine der vorliegenden Erfindung markiert werden. Unter einem „markierten pantropen Neurotrophin" wird hierin ein pantropes Neurotrophin verstanden, an das zumindest ein Element, Isotop oder eine chemische Verbindung gebunden ist, um den Nachweis des pantropen Neurotrophins oder des an einen Neurotrophinrezeptor gebundenen pantropen Neurotrophins zu ermöglichen. Im Allgemeinen fallen Marker in drei Klassen: a) Isotopmarker, die radioaktive oder schwere Isotope sein können; b) Immunomarker, die Antikörper oder Antigene sein können; und c) gefärbte oder fluoreszierende Farbstoffe. Die Marker können an einer beliebigen Position in das pantrope Neurotrophin inkorporiert werden. Wenn sie einmal markiert sind, werden die pantropen Neurotrophine verwendet, um Neurotrophin-Rezeptoren entweder in vitro oder in vivo nachzuweisen. Beispielsweise kann die Gegenwart von Neurotrophin-Rezeptoren ein Hinweis auf die Gegenwart bestimmter Zelltypen sein, die zur Diagnose zweckdienlich sind. Das heißt, dass eine Subpopulation bestimmter Zelltypen durch die Bindung des markierten pantropen Neurotrophins and die Zellen über die Rezeptoren dargestellt werden kann.
Außerdem sind die pantropen Neurotrophine der vorliegenden Erfindung als Standards in Neurotrophin-Tests zweckdienlich. Beispielsweise kann die Aktivität eines pantropen Neurotrophins in irgendeinem bestimmten Test unter Verwendung bekannter Neurotrophin-Standards gemessen und das pantrope Neurotrophin dann in der Diagnose und Quantifizierung von Neurotrophinen verwendet werden.
Darüber hinaus sind die pantropen Neurotrophine der vorliegenden Erfindung als Komponenten von Kulturmedien zur Verwendung bei der Kultivierung von Nervenzellen in vivo zweckdienlich, da viele Nervenzellkulturen Wachstumsfaktoren erfordern. Wie dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, können die pantropen Neurotrophine der vorliegenden Erfindung andere neurotrophe Faktoren ersetzen, die häufig als Mediumskomponenten verwendet werden. Die Menge der zuzugebenden pantropen Neurotrophine kann leicht unter Verwendung von Standardtechniken bestimmt werden.
Die pantropen Neurotrophine der vorliegenden Erfindung sind auch zur Erzeugung von Antikörpern zweckdienlich, die bei der Diagnose, Identifizierung und Lokalisierung von Neurotrophinen oder Neurotrophin-Antikörpern in einem Organismus oder Patienten verwendet werden können. Beispielsweise können die pantropen Neurotrophine verwendet werden, um polyklonale und monoklonale Antikörper herzustellen, wie auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt ist. Die Antikörper können dann markiert und verwendet werden, um die Gegenwart oder Abwesenheit der Neurotrophine nachzuweisen. Folglich kann die Diagnose von Neuronenstörungen, die mit Neurotrophinen zusammenhängen, nachgewiesen werden. Alternativ dazu werden die Antikörper unter Verwendung eines zweiten Antikörpers indirekt nachgewiesen. Beispielsweise können Primärantikörper in Mäusen oder Kaninchen hergestellt werden, wobei anschließend markierte Anti-Maus- oder Anti-Kaninchen-Antikörper verwendet werden, um die Primärantikörper nachzuweisen. Jedes dieser Verfahren sowie ähnliche, auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannte Verfahren ermöglichen den Nachweis von Neurotrophinen in einer Vielzahl von Geweben.
Außerdem sind die gegen die pantropen Neurotrophine der vorliegenden Erfindung erzeugten Antikörper auch für die Reinigung von Neurotrophinen und pantropen Neurotrophinen zweckdienlich. Da die Aminosäuresubstitutionen der pantropen Neurotrophine im Allgemeinen gering sind, haben die Neurotrophine und pantropen Neurotrophine zahlreiche Immunoepitope gemeinsam. Folglich werden die gegen die pantropen Neurotrophine erzeugten Antikörper natürlich vorkommende Neurotrophine binden und sind daher bei der Reinigung zweckdienlich. Beispielsweise können auf Affinitätschromatographietechniken basierende Reinigungssysteme verwendet werden, wie sie auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind.
In der bevorzugten Ausführungsform werden die pantropen Neurotrophine der vorliegenden Erfindung an einen Patienten verabreicht, um Neuronenstörungen zu behandeln. Unter „Neuronenstörungen" werden hierin Störungen des Zentral- und/oder Periphernervensystems verstanden, die mit Neuronendegeneration oder Schädigung zusammenhängen. Spezielle Beispiele von Neuronenstörungen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Huntington-Chorea, Schlaganfall, ALS, periphere Neuropathie und andere Leiden, die durch Nekrose oder Neuronenverlust gekennzeichnet sind, ob es sich um zentrale, periphere Neuronen oder Motoneuronen handelt, zusätzlich zur Behandlung aufgrund von Trauma, Verbrennung, Nierenversagen oder Verletzung geschädigter Nerven. Beispielsweise können periphere Neuropathien, die mit bestimmten Leiden zusammenhängen, wie zum Beispiel mit Diabetes, AIDS oder Chemotherapie zusammenhängende Neuropathien unter Verwendung der pantropen Neurotrophine der vorliegenden Erfindung behandelt werden. Außerdem verhindert die Verabreichung von NT3 die In-vivo-Degeneration adulter zentraler noradrenergischer Neuronen des Locus coerulus in einem Modell, welches dem Muster des bei Alzheimer-Krankheit auftretenden Zellverlusts gleicht (86). Außerdem ist von der Zugabe von NT3 gezeigt worden, dass sie die Sprossung des Tractus corticospinalus während der Entwicklung sowie nach adulten Rückenmarkläsionen verstärkt (58). In der Tat wurde eine Regeneration über weite Strecken beobachtet, wenn NT3 mit Antikörpern verabreicht wurde, welche die Myelin-assoziierten wachstumshemmenden Proteine hemmen. Folglich können die pantropen Neurotrophine der vorliegenden Erfindung bei dieser Anwendung anstelle von NT3 verwendet werden.
In dieser Ausführungsform wird eine therapeutisch wirksame Dosis eines pantropen Neurotrophins an einen Patienten verabreicht. Unter einer „therapeutisch wirksamen Dosis" wird hierin eine Dosis verstanden, welche die Wirkungen hervorruft, für die sie verabreicht wurde. Die exakte Dosis wird von der zu behandelnden Störung abhängen und kann vom Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung unter Verwendung bekannter Techniken ermittelt werden. Im Allgemeinen werden die pantropen Neurotrophine der vorliegenden Erfindung mit ungefähr 1 μg/kg bis ungefähr 100 mg/kg pro Tag verabreicht. Außerdem können, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, Anpassungen bezüglich Alter sowie Körpergewicht, allgemeiner Gesundheit, Geschlecht, Ernährung, Verabreichungszeit, Medikamentenwechselwirkung und der Schwere der Krankheit notwendig sein, die vom Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung durch routinemäßige Experimente ermittelt werden können.
Ein „Patient" umfasst für die Zwecke der Erfindung Menschen sowie andere Tiere und Organismen. Folglich sind die Verfahren auf Humantherapie sowie veterinäre Anwendungen anwendbar.
Die Verabreichung der pantropen Neurotrophine der vorliegenden Erfindung kann auf zahlreiche Weisen durchgeführt werden, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf orale, subkutane, intravenöse, intrazerebrale, intranasale, transdermale, intraperitoneale, intramuskuläre, intrapulmonale, vaginale, rektale oder intraokuläre Verabreichung. Die pantropen Neurotrophine können kontinuierlich durch Infusion in die Flüssigkeitsreservoire des CNS verabreicht werden, obgleich die Bolusinjektion annehmbar ist, wobei auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannte Techniken, wie z. B. Pumpen oder Implantation verwendet werden. In manchen Fällen, beispielsweise bei der Wundbehandlung, können die pantropen Neurotrophine direkt als Lösung oder Spray angewendet werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen ein pantropes Neurotrophin in einer zur Verabreichung an einen Patienten geeigneten Form. In der bevorzugten Ausführungsform liegen die pharmazeutischen Zusammensetzungen in wasserlöslicher Form vor und können Träger, Exzipienten, Stabilisatoren, Puffer, Salze, Antioxidantien, hydrophile Polymere, Aminosäuren, Kohlenhydrate, ionische oder nicht-ionische Tenside und Polyethylen- oder Polypropylenglykol umfassen. Die pantropen Neurotrophine können in Form einer nachhaltig freisetzenden Form zur. Implantation. vorliegen oder können in Mikrokapseln eingeschlossen werden, wobei auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannte Techniken verwendet werden.
Die folgenden Beispiele dienen der ausführlicheren Beschreibung der Art und Weise der Verwendung der oben beschriebenen Erfindung sowie der Darlegung der besten vorgesehenen Formen zur Umsetzung verschiedener Aspekte der Erfindung. Es versteht sich, dass diese Beispiele in keiner Weise der Einschränkung des wahren Schutzumfangs dieser Erfindung dienen, sondern zu illustrativen Zwecken dargelegt werden.
Beispiele
Beispiel 1
Molekulare Modellierung von NZ-3 und Identifizierung von Zielen zur Mutationsanalyse
Die Koordinaten der dreidimensionalen Struktur von Maus-NGF wurden von N. Q. McDonald und T. L. Blundell erhalten. Die molekulare Modellierung für menschliches NT-3 wurde an einer Silicon Graphics Iris Workstation unter Verwendung des interaktiven Programms InsightII durchgeführt. Die Darstellungen von NT-3-Strukturen wurden unter Verwendung des Programms MidasPlus (University of California in San Francisco) erzeugt.
Als die dreidimensionale Struktur von Maus-NGF (mNGF) verfügbar wurde (59), war ein rationaler Zugang zur strukturellen Basis der neurotrophen Funktion unter Verwendung von Proteinkonstruktionstechniken möglich. Die Struktur von mNGF besteht aus einem eng assoziierten Dimer aus zwei identischen Aminosäurepolypeptidketten. Die Faltung beider Monomere wird durch ausgestreckte Segmente verdrillter antiparalleler β-Faltblätter gebildet, die durch Wenden verbunden sind. Das Molekül weist eine gedehnte Form auf und stellt eine flache hydrophobe Oberfläche bereit, welche die Schnittstelle der assoziierten Monomere bilden (59). Eine auffallende Eigenschaft der Struktur ist die Anordnung der Disulfidbindungen, die nunmehr als das Cysteinknoten-Motiv bekannt ist (60). Dieses Motiv findet sich auch im ansonsten nicht verwandten TGF-β (61); (60) und PDGF-BB (87). Mehrere Regionen der mNGF-Struktur, einschließlich die Amino- und Carboxytermini und die Schleife zwischen den Resten 43 und 48 waren nicht genau bestimmbar, was auf höchst flexible Strukturelemente hinweist.
Die Sequenz von menschlichem NT-3 (hNT-3) weist eine Identität von 56% und eine Ähnlichkeit von 70% bezüglich mNGF auf (1). Sequenzunterschiede sind im strukturell undefinierten N-Terminus und in der Schleifenregion zwischen den Resten 43 und 48 gebündelt. Die relative Position der Cysteinreste ist wie in allen Mitgliedern der Neurotrophinfamilie konserviert, was die Existenz eines ähnlichen Cysteinknoten-Motivs in hNT-3 nahe legt. Die Sequenzähnlichkeit von hNT-3 und Maus-NGF legt nahe, dass beide dieselbe grundlegende dreidimensionale Faltung gemeinsam haben, und daher wurde mNGF als Gerüst für das hNT-3-Modell verwendet. Im zweiten Schritt der Modellbildung wurden Seitenketten, die sich zwischen mNGF und hNT-3 unterschieden, unter Verwendung des InsightII-Programms (Biosym Technology, San Diego, CA) durch die hNT-3-Aminosäuren ersetzt. Wenn möglich, wurden die Konformationen der hNT-3-Seitenketten ähnlich jenen von mNGF gehalten und basierten ansonsten auf Rotamer-Bibliotheken (62), Packungs- und Wasserstoffbrückenbindungserwägungen. Schließlich wurden die Insertion von Asn93 und die anschließende Anpassung der Schleife 93–95 einer Suche von Kristallstrukturen in der „Protein Data Bank" (63) entnommen. Das endgültige Modell besteht aus 104 Aminosäuren und umfasst nicht die sechs N-terminalen (Tyr1-Ser6), die vier C-terminalen (Ile116-Thr119) und fünf Schleifenreste (G44-V48). Dieses Modell ermöglichte die Identifizierung von Resten, die voraussichtlich an wichtigen strukturellen Zusammenhängen beteiligt sind, was zu ihrem Ausschluss von der Mutationsanalyse führte. Diese Reste waren entweder an der Schnittstelle (W20, F52, Y53, W99, W101), an strukturell wichtigen Wasserstoffbindungen oder hydrophoben Kontaktstellen (S12, I30, Q50, P62, S83, R100, T106, S107), an Disulfidbindungen (C15, C57, C67, C79, C108, C110) beteiligt oder waren im Inneren des Protein verborgen (V13, S16, S18, V21, D29, I30, V35, V37, 1102, 1104). Jedoch wird es in manchen Fällen wünschenswert sein, diese Reste zu ändern. Außerdem wurden Glycin- und Alaninreste mit Ausnahme von Gly 44 nicht geändert. Im Gegensatz zu ähnlichen Untersuchungen der mNGF/trkA-Wechselwirkung wurden nicht mehrere Reste ausgetauscht (53) (56) (55) oder Reste deletiert (49), sondern hauptsächlich einzelne Reste oder Paare von Aminosäuren substituiert. Reste wurden meistens zu Alanin geändert (64). In manchen Fällen war es möglich, größere Aminosäuren als Substitutionen in die Struktur zu modellieren, um eine mögliche sterische Behinderung für die Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung zu erzeugen.
Der erste Satz von Mutationen sondierte sowohl konservierte, als auch nicht-konservierte Reste, die sich hauptsächlich in β-Strängen befinden, die oberflächenexponiert sind und daher möglicherweise an der Bindung an die trkC- und gp75-Rezeptoren beteiligt sind. Die aktuelle für die NGF-Funktion vorgeschlagene Hypothese ist es, dass divergente Reste, die sich in Schleifen befinden und β- Stränge sowie Termini verbinden, Hauptdeterminanten für die Rezeptorbindung und Spezifität sind. Ein zweiter Satz von hNT-3-Mutationen beurteilte die Bedeutung dieser Reste für die Wechselwirkung von hNT-3 und seinen Rezeptoren. Der gesamte Satz an Mutanten umfasste im Wesentlichen die gesamte Oberfläche des NT-3-Moleküls.
Beispiel 2
Erzeugung spezifischer Aminosäuresubstitutionen von NT3 und pantropen NT3s
Menschliches NT-3 wurde vorher kloniert, sequenziert und in einen Vektor des pRK-Typs subkloniert, der die Produktion doppel- und einzelsträngiger DNA in E. coli sowie die Expression des reifen NT-3 in einem Säugetiersystem unter der Kontrolle des Cytomegalovirus-Promotors ermöglicht (65). Die Mutagenese dieses Vektors wurde nach dem Verfahren von Kunkel (66) (67) durchgeführt. Nach Transformation in den E. coli-Stamm XK1-Blue wurden Kolonien auf die Gegenwart der gewünschten Mutation gescreent, und zwar durch Sequenzierung einzelsträngiger DNA unter Verwendung des Sequenase-Sets Version 2.0 (U.S. Biochemical Corp.). Die gesamte für reifes NT-3 kodierende Sequenz wurde für alle positiven Klone verifiziert. Doppelsträngige DNA wurde aus XL-1 Blue mit dem QIAGEN-DNA-Reinigungsset isoliert (Qiagen Inc., Chatsworth CA). Diese DNA wurde anschließend zur Transfektion der fötalen menschlichen Nierenzelllinie 293 verwendet (68). Alle anderen rekombinanten DNA-Manipulationen wurden wie beschrieben durchgeführt (69). Es werden wohlbekannte Techniken verwendet, um die Primer für alle der Mutationen zu erzeugen. Der Primer für die D15A-Mutation war 5'-GGTCACCCACAAGCTTTCACTGGCACATACCGAG-3' (Seq.-ID Nr. 7), und der Primer für die S1-Mutante (der N-terminate Austausch der 6 N-terminalen Aminosäuren von NT3 gegen die 7 N-terminalen Aminosäuren von NGF) war 5'-GTACTCCCCTCGGTGGAAGATGGGATGGCTCGAGGACCGTTTCCGCCGTG-3' (Seq.-ID Nr. 8).
Expression von Neurotrophinen der Wildform und mutierten Neurotrophinen Plasmid-DNA, die entweder die für hNT-3 oder die für mutiertes hNT-3 kodierenden Sequenzen enthielt, wurde in die menschliche fötale Nierenzelllinie 293 mittels Calciumphosphatpräzipitation eingeführt (70). Die zu 75% konfluenten Zellen wurden mit 10 μg Plasmid-DNA pro 15 mm-Zellkulturplatte transfiziert und für 15 Stunden in serumhaltigem Medium inkubiert. Danach wurde das Medium entfernt und gegen serumfreies Medium (PSO4) ausgetauscht, das mit 10 m/l rekombinantem Rinderinsulin, 1 m/l Transferrin und Spurenelementen ergänzt war. Der Überstand wurde nach 48 und 96 Stunden abgezogen, mit Centriprep-10-Filtrationseinheiten (Amicon, Beverly MA) ungefähr 20fach konzentriert und sterilfiltriert.
Quantifizierung von Neurotrophin-Mutanten
Der spezifische hNT-3-ELISA basierte auf einem Protein-A-gereinigten polyklonalen Antiserum aus Meerschweinchen (Genentech). Alle Näpfe einer 96-Napf-Platte (MaxiSorp; Nunc, Kamstrup, Dänemark) wurden über Nacht bei 4°C mit 100 μl Antiserum (4 μg/ml) in 0,05 M Natriumcarbonatpuffer (pH 9,6) beschichtet. Nach einem einstündigen Blockschritt mit Blockpuffer (PBS + 0,5% BSA + 0,01% Thimerosal, pH 7,4) wurden die Näpfe sechs Mal mit ELISA-Puffer (PBS + 0,5% BSA + 0,05% Tween-20 + 0,01% Thimerosal, pH 7,4) gewaschen. Gereinigtes rekombinantes hNT-3 oder Proben von hNT-3-Mutanten unbekannter Konzentrationen wurden in ELISA-Puffer auf ein Volumen von 100 μl verdünnt und den Näpfen zugegeben. Die Platten wurden für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter dauerndem Schütteln inkubiert. Nach einem Waschschritt mit ELISA-Puffer wurden die Näpfe mit 100 μl biotinyliertem Anti-hNT3-Antikörper (Genentech) für 2 Stunden inkubiert und wiederum mit ELISA-Puffer gewaschen. 100 μl einer 1 : 50.000-Verdünnung von Streptavidin/Meerrettichperoxidase (Zymed, 43-4323) wurden den Näpfen zugegeben und für 30 Minuten inkubiert, gefolgt von einem Waschschritt mit ELISA-Puffer. Schließlich wurde die Farbentwicklung für 10–20 Minuten unter Verwendung von 100 μl einer PBS-Lösung durchgeführt, die 0,012% H₂O₂ und 0,04 o-Phenylendiamin enthielt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl 4,5 N H₂SO₄ gestoppt. Die Absorption wurde bei 490 nm und 405 nm an einem V_max-Kinetik-Mikroplattenleser (Molecular Devices, Palo Alto CA) gemessen. Die Standardkurve wurde unter Verwendung von gereinigtem rekombinantem hNT-3 (Genentech) der Konzentrationen 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56 und 0,78 ng/ml ermittelt. Die Proben mit unbekannter NT-3-Konzentration wurden 1 : 10, 1 : 30, 1 : 90, 1 : 270, 1 : 810, 1 : 2.430, 1 : 7.290 und 1 : 21.870 reihenverdünnt, um mehrere Datenpunkte je Probe zu erlangen. Die Standardkurve wurde unter Verwendung einer Vierparameter-Anpassung der aus dem Test des Standardproteins erhaltenen Datenpunkte ermittelt.
Die Mengen an NT-3-Mutanten nach der Konzentrierung variierten zwischen 120 ng/ml und 36 μg/ml. Der ELISA-Test detektierte keinerlei NT-3 in Überständen Mock-transfizierter Zellen und kreuzreagierte nicht mit rekombinantem menschlichem NGF aus Überständen NGF-transfizierter Zellen (Daten nicht dargelegt). Für jeden Satz an Expressionen von NT-3-Mutanten wurde parallel dazu eine native hNT-3-Expression durchgeführt und mittels ELISA quantifiziert, um eine Vergleichs-Wildform-Konzentration für Rezeptorbindungsuntersuchungen zu erhalten. Alle Mutanten wurden zumindest zwei Mal exprimiert, quantifiziert und getestet.
Iodierung
Gereinigtes rekombinantes hNT-3, hBDNF und hNGF (Genentech) wurden mittels Lactoperoxidase-Behandlung unter Verwendung einer Modifizierung des Enzymobead-Radioiodierungsreagens-(Bio-Rad)Verfahrens markiert (71). 2 μg der Neurotrophine wurden auf spezifische Aktivitäten im Bereich von 3.000 bis 3.500 cpm/fmol iodiert. Das markierte Material wurde bei 4°C gelagert und innerhalb von 2 Wochen der Herstellung verwendet.
Bindungstests
Auf Zellen basierende Bindungstests verwendeten Membranpräparate aus Ratten-trkC exprimierenden stabilen Zelllinien (NIH3T3/trkC, (26)). Kompetitive Verdrängungstests wurden wie früher beschrieben durchgeführt (26). Mutanten wurden auf Bindungsaffinität für den trkC-Rezeptor zweimal für jede der mehrfachen Expressionen mit einem doppelten Satz von Datenpunkten getestet. Dieses Verfahren ermöglichte die Abschätzung des Fehlers der Affinitätsbestimmung für jede der Mutanten. Ungereinigtes rekombinantes NT-3 aus vorübergehend exprimierenden Zellen wurde mit gereinigtem NT-3 auf seine Fähigkeit zur Verdrängung von 125-I-markiertem NT-3 von an NIH/3T3-Zellen exprimierten trkC-Rezeptoren verglichen. Beide verdrängten markiertes NT-3 mit einer ähnlichen IC-50: 7 pM und 9 pM für ungereinigtes NT-3 und gereinigtes NT-3. Dies zeigte an, dass ungereinigtes NT-3 aus Überständen exprimierender 293-Zellen präzise quantifiziert und anschließend für Rezeptorbindungsuntersuchungen verwendet werden konnte. Die Spezifität der Bindungstests wurde durch die Fähigkeit von NGF, BDNF und Überstand Mock-transfizierter Zellen nachgewiesen werden, gebundenes markiertes NT-3 von trkC zu verdrängen (Daten nicht dargelegt).
Rezeptor-Immunoadhäsin-Proteine wurden unter Verwendung extrazellulärer menschlicher trkA-, trkB-, trkC- und gp75-Domänen, die an konstante Immunglobulindomänen fusioniert waren, konstruiert (Genentech, unveröffentlichte Ergebnisse). Eine 96-Napf-Platte (Corning, ELISA-Napf-Streifen) wurde mit 100 μl Ziege-F(ab')₂-Anti-Human-Fc-IgG (Organon Technika, West Chester, PA) einer Konzentration von 5 μg/ml in Beschichtungspuffer für 15 Stunden bei 4–8°C beschichtet. Die Näpfe wurden abgesaugt, 3 Mal mit PBS gewaschen und für 2 Stunden mit 100 μl einer Lösung des Rezeptor-Immunoadhäsin-Proteins (40 ng/ml) in Bindungspuffer (Leibovitz's L-15-Medium, ergänzt mit 5 mg/ml BSA (Intergen, Purchase, PA), 0,1 mg/ml Pferdeherz-Cytochrom C (Sigma) und 20 mM HEPES, pH 7,2) inkubiert. Nach einem Waschschritt mit PBS wurde den Näpfen sofort 50 μl Bindungspuffer zugegeben, um Austrocknung zu verhindern. Jede der Stammlösungen des nativen und mutierten Proteins wurde unter Verwendung von Bindungspuffer reihenverdünnt, um einen Konzentrationsbereich von 4.096–2 pM zu liefern. 25 μl der Reihenverdünnung wurden je Napf zugegeben, gefolgt von 25 μl der markierten Neurotrophine. Die Endkonzentration der markierten Neurotrophine in jedem Napf betrug ungefähr 50 pM für trkA-, trkB- und trkC-Tests, und 100 pM für gp75-Bindungstests. Nach 3-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Näpfe mit PBS +0,5% Tween-20 gewaschen und die gebundene Radioaktivität gezählt. Alle Verdrängungsexperimente wurden durch Anwendung eines Vierparameter-Anpassungsverfahrens auf den Datensatz mit dem Kaleidagraph-Softwarepaket analysiert. Alle Bindungsergebnisse in den Balkengrafiken sind als IC-50mut/IC-50wt ausgedrückt.
Stimulierung der Autophosphorylierung von trk-Rezeptoren an PC12-Zelllinien durch neurotrophe Faktoren
Ungefähr 1 × 10⁷ Zellen wurden bei 37°C für 5 Minuten mit 25 ng/ml Neurotrophin behandelt. NP-40-Platten-Lyse und Immunopräzipitation mit dem Antiserum 443 (pan-trk) oder 656 (trkC-spezifisch) wurden wie früher beschrieben durchgeführt (26). Der Phosphotyrosingehalt wurde mittels Western-Transfer unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 4G10 wie früher beschrieben analysiert (23). 4G10 wurde wie früher beschrieben nachgewiesen (26).
Differenzierungstests an PC12 und trkB sowie trkC exprimierenden PC12-Zellen
Ungefähr 10³ PC12-Zellen, welche die verschiedenen trk-Familienmitglieder exprimierten (trkC; (26) trkB; Soppet, unveröffentlichte Beobachtungen), wurden in Kollagen-beschichtete, insgesamt 2 ml Medium enthaltenden 35 mm-Gewebekulturplatten ausplattiert. trkC exprimierende PC12-Zellen wurden bei drei verschiedenen Konzentrationen (10 ng/ml, 1 ng/ml, 100 pg/ml) getestet, und die ausschließlich trkA exprimierenden elterlichen PC12-Zellen oder trkB exprimierenden PC-12-Zellen wurden mit 10 ng/ml der NT-3-Mutanten-Überstände behandelt. Für jede Behandlung wurden zumindest 200 Zellen gezählt. Der Anteil an Neuriten-tragenden Zellen wurde durch Zählen der Anzahl an Zellen ermittelt, die nach 3–4 Tagen Fortsätze enthielten, die zumindest die zweifache Länge des Zellkörpers aufwiesen.
Sezieren von Embryonalgeweben und Neuronenkulturen
Hühner-Embryos verschiedener Entwicklungsstadien wurden durch Inkubieren weißer Leghorn-Hühnereier (SPAFAS, Reinholds, PA) bei 38°C in einem Eierinkubator für die erforderliche Zeit erhalten. Spinalganglien, Knotenganglien des Embryonaltags 8 (E8) und sympathische Ganglien des Embryonaltags 11 (E11) wurden in 1 × Penicillin/Streptomycin enthaltendem Leibowitz-15-(L-15-)Medium unter Verwendung von Uhrmacherpinzetten und elektrolytisch geschärften Wolframnadeln seziert. Embryonale Hühnerganglien wurden bei 37°C für 20 Minuten trypsinisiert und dann in Kulturmedium (F14 mit 10% hitzeinaktiviertem Pferdeserum und 5% hitzeinaktiviertem Fötalkälberserum) gewaschen und dann mit einer feuerpolierten Pipette sanft zerrieben, um eine Einzelzellensuspension zu liefern. Die Hühnerembryozellen wurden auf 35 mm-Platten ausplattiert, die mit Polyorthinin (0,5 mg/ml in 0,15 M Boratpuffer bei pH 8,6 über Nacht) und Laminin (20 ml/ml für 4–6 Stunden bei 37°C) in 2 ml Kulturmedium in Gegenwart von 2 ng/ml Neurotrophin oder mit den im Text erwähnten Konzentrationen beschichtet waren. Alle Zellen mit einer Neuronen-Morphologie innerhalb eines 5 × 5 mm-Gitters in der Mitte jeder Platte wurden 72 Stunden später gezählt.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 und 4 dargestellt.
Tabelle 4
Beispiel 3
Erzeugung, Reinigung und Charakterisierung von N-terminalen NGF-Varianten
Mehrere geladene und ungeladene Reste sind unter NGF-Proteinen aus anderen Spezies konserviert. Insbesondere sind His4, Pro5 und His8 in 7 von 8 bekannten NGF-Sequenzen konserviert; Arg8 existiert nur in menschlichem NGF und in Hühner-NGF, während an dieser Position in NGF anderer Spezies Met überwiegt. Es wurden zehn Mutanten durch Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese erzeugt, wobei die Mutation entweder 1) einige der geladenen Reste des N-Terminus von hNGF einzeln oder zusammen durch Alanin ersetzte, 2) His4 durch negativ geladene Asparaginsäure ersetzte, die sich an Position 3 der N-terminalen hBDNF-Sequenz befindet (65) oder 3) chimäre hNGF-Moleküle erzeugte, welche die ersten 5 oder 6 Reste von hBDNF bzw. hNT3 oder andere variable hNT3-Regionen enthielten. Die resultierenden Mutantenkonstrukte wurden in Vektoren erzeugt, die einen menschlichen CMV-Promotor enthielten (70), und wurden vorübergehend in menschlichen 293-Zellen wie unten beschrieben exprimiert.
Gereinigtes rekombinantes (1-118), (6-118) und (10-118) wurden aus konditioniertem Medium der transfizierten CHO-Zelllinie unter Einsatz von Umkehrphasen-HPLC und Hochleistungsionentauscherchromatographie wie von Burton et al. (1992) (48) und Kahle et al. (1992) (49) beschrieben gereinigt und mittels N-terminaler Sequenzanalyse, SDS-PAGE und Aminosäureanalyse charakterisiert (Daten nicht dargelegt). Diese prozessierten Varianten resultieren aus der In-situ-Proteolyse während der Konditionierung des CHO-Zellmediums durch bisher nicht charakterisierte proteolytische Enzyme oder Prozessierungswege. Die Reinheit aller Formen betrug 99% auf Basis der SDS-PAGE und die Konzentration wurde durch quantitative Aminosäureanalyse bestimmt. Die Reinigung und Analyse der H4D-Mutante 2 (20 μg aus 300 ml Medium) und der N-terminalen hNT3/hNGF-Mutante 6 (5 μg aus 300 ml Medium) wurde aus serumfreiem Medium durchgeführt, das durch transfizierte 293-Zellen konditioniert war (siehe unten), wie gerade für die N-terminalen trunkierten Varianten beschrieben wurde.
Die Mutagenese wurde mit dem Oligonucleotid-gerichteten Verfahren (72) mit Modifizierungen durchgeführt, die im Muta-Gene-Set von BioRad beschrieben sind (66); BioRad, Richmond CA. Die Mutationen wurden mittels DNA-Sequenzierung einzelsträngiger Phagemid-Klone mittels Kettenterminationsverfahren verifiziert (73). Die hNGF-Mutanten wurden in konditioniertem Medium nach vorübergehender Transfektion menschlicher 293-Zellen exprimiert (69) (70). Das zur Gewinnung verwendete Medium war N2-Ergänzung enthaltendes, serumfreies 50 : 50 F12/DMEM-Medium und wurde nach 48 Stunden im serumfreien Medium gewonnen. Das konditionierte Medium wurde unter Verwendung von Amicon-Konzentratoren 10fach konzentriert. Die Konzentration der hNGF-Mutanten wurde mit einem Enzyme-Linked-Immunoassay (ELISA) unter Einsatz gereinigter polyklonaler Kaninchen-Anti-hNGF-Antikörper ermittelt. Die Konzentration aller Mutanten variierte von 3 bis 8 μg/ml. Alle Mutanten wurden zumindest drei Mal exprimiert und die Konzentration mittels ELISA 2 bis 3 unabhängige Male bestimmt.
Die Mutanten wurden außerdem durch metabolische Markierung transfizierter 293-Zellen (60 mm-Platten, 1,2 ml Medium) durch Zugabe von je 200 μCi ³⁵S-Methionin und Cystein (Amersham) analysiert. Nach 18 Stunden wird das Medium gewonnen und entweder mit polyklonalem Kaninchen-Anti-hNGF-Antikörper oder mit monoklonalem Maus-Antikörper für 3–4 Stunden bei 4°C zur Reaktion gebracht, mittels Präzipitation mit Protein-A-Perlen (Pharmacia) gewonnen und auf 15%ige SDS-PAGE-Gele (Novex) aufgegeben. Nach der Elektrophorese wurden die Gele getrocknet und neben einen Röntgenfilm gegeben. Nicht-radiomarkierte Mutanten wurden wie oben beschrieben hergestellt und es wurden Aliquote von 0,1 μg lyophilisiert, wieder in SDS-PAGE-Probenpuffer aufgelöst, an denselben Gelen der Elektrophorese unterzogen und nach Standardprotokollen (BioRad) auf Nitrozellulose übertragen. Der Blot wurde mit polyklonalem Kaninchen-Anti-hNGF-Antikörper oder monoklonalem Maus-Anti-hNGF-Antikörper über Nacht bei 4°C behandelt, gewaschen und die Mutanten mit Alkalische Phosphatase-gekoppelten Ziege-Anti-Maus-IgG-Antikörpern detektiert.
Rezeptorbindungs-, trkA-Autophosphorylierungs- und PC12-Neuritenauswuchsstests
[¹²⁵I]hNGF wurde unter Verwendung des Enzymobead-Verfahrens (BioRad) nach dem Verfahren von Escandon (71) hergestellt. Die spezifische Radioaktivität, die mittels TCA-Präzipitation von Aliquoten des Anfangsreaktionsgemischs und gelchromatographiertem [¹²⁵I]hNGF bestimmt wurde, betrug im Mittel 60–90 μCi/μg. Rezeptorbindungstests wurden über Nacht bei 4°C an rekombinant trkA-exprimierenden NIH3T3-Ze11en (freundlicherweise von Dr. Luis Parada bereitgestellt), p75-exprimierenden menschlichen A875-Melanomzellen (ATCC) und Ratten-PC12-Zellen (freundlicherweise von Dr. Louis Reichardt bereitgestellt) durchgeführt, wie sie für trkB-exprimierende NIH3T3-Zellen beschrieben wurden (23). Die verwendete Konzentration an NIH3T3-trkA- und A875-p75-Zellen betrug 1 × 10⁶ Zellen pro ml; 5 × 10⁵ Zellen pro ml für PC12-Zellen. Die Endkonzentration von [¹²⁵I]hNGF betrug 50 pM in einem Volumen von 0,2 ml. Die unspezifische Bindung, definiert als das in Gegenwart von 1 × 10^–6 M unmarkiertem hNGF gebundene [¹²⁵I]hNGF, variierte zwischen 15–25% in den meisten Fällen für die NIN3T3-trkA-Zellen, 20–35% für die p75-A875-Myelomzellen und 20–30% für die trkA + p75-PC12-Zellen unter Verwendung des Filterbindungstests. Die Daten wurden an eine Verdrängungsisotherme angepasst und es wurde eine IC₅₀ unter Einsatz einer 4-Parametergleichung im Kaleidagraph-Programm berechnet. In manchen Fällen wurde die Rezeptorbindung mit Zellen bei 25°C für 90 Minuten durchgeführt und gebundenes [¹²⁵I]hNGF vom freien durch Sachharasekissen-Zentrifugation getrennt.
Die Autophosphorylierung von trkA wurde bei 37°C für 5 Minuten durchgeführt und das Phosphorylierungsausmaß durch eine Variation des von Kaplan (19) beschriebenen Verfahrens bestimmt. Mit Triton X-100 lysierte trkA-Zellen wurden mit dem Agaroseperlen-immobilisierten monoklonalen Antikörper 4G10 (UBI) immunopräzipitiert, einer SDS-PAGE (8% Acrylamid-Novex) unterzogen, immunogeblottet und mit polyklonalem Kaninchen-Anti-trkA-Antikörper (freundlicherweise von Dr. David Kaplan bereitgestellt) sondiert. Der Nachweis von trkA erfolgte durch Alkalische-Phosphatase-(AP-)gekoppelten Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (TAGO). PC12-Zellen wurden auf polykationischen Primaria-24-Napf-Platten auf 20–30% Konfluenz gezüchtet und das Medium gegen N2 enthaltendes serumfreies High-Glucose-DEMEM ausgetauscht, das hNGF der Wildform oder mutierte hNGF-Varianten enthielt. Nach 48 Stunden wurde die Anzahl jener Zellen, deren vorstehende Neuriten länger als zwei Zellkörper waren, in einem repräsentativen Sichtfeld gezählt und als prozentueller Anteil der Gesamtzellzahl im Feld, üblicherweise 100–140 Zellen, ausgedrückt. Die Aktivität jeder Mutante und NGF-Kontrolle wurde zumindest zweimal in gesonderten Experimenten bestimmt. Der prozentuelle Anteil an reaktiven Zellen bei maximalen hNGF-Konzentrationen variierte von 55 bis 75% unter Experimenten mit einem aus 13 Bestimmungen berechneten Mittelwert von 63%. Um die Variation der maximalen Reaktion unter den Experimenten zu berücksichtigen, wurde dieser Wert verwendet, um alle Daten zu normalisieren.
Hemmung der [¹²⁵I]hNGF-Bindung an trkA- und p75-Zellen durch einen monoklonalen Antikörper gegen hNGF
Unter denselben Bedingungen wie für die oben beschriebenen Filterbindungstests wurden ansteigende Konzentrationen eines monoklonalen Anti-hNGF-Antikörpers zu 25 pM [¹²⁵I]hNGF zugegeben und für 30 Minuten bei 25°C inkubiert. Anschließend wurden 1 × 10⁶ Zellen pro ml von entweder NIH3T3-trkA- oder A875-p75-Zellen zugegeben (0,2 ml Endvolumen) und bei 4°C über Nacht unter kräftigem Vermischen inkubiert. Die Proben wurden dann verdünnt und auf Whatman GF/C-Filter filtriert und gezählt.
Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 5 und 6 dargestellt.
Um die Charakterisierung der für volle hNGF-Aktivität notwendigen N-terminalen Aminosäurereste zu beginnen, wurde die (6-118)-trunkierte Form von hNGF aus konditioniertem Medium von rekombinant hNGF exprimierenden CHO-Zellen isoliert. Die um neun Aminosäuren trunkierte Form (10-118)hNGF wurde durch begrenzte Proteolyse wie beschrieben erzeugt (48). (6-118)hNGF und (10-118)hNGF wurden mittels Hochleistungsionentauscherchromatographie (HPIEC) gereinigt und mittels Umkehrphasen-HPLC, N-terminate Sequenzanalyse, SDS-PAGE und Aminosäureanalyse charakterisiert (Daten nicht dargelegt).
Die relative Potenz von gereinigtem (6-118)hNGF zur Verdrängung von [¹²⁵I]hNGF aus trkA, p75 und trkA + p75 exprimierenden Zelllinien wurde mit jener von (10-118)hNGF, (1-118)hNGF oder (1-120)hNGF, und (1-118)mNGF verglichen (9). Wie ihre Äquivalenz der Bioaktivität (74) nahe legt, zeigten anfängliche Experimente keinen Unterschied der Bindungseigenschaften von (1-118)hNGF gegenüber (1-120)hNGF (nicht dargelegt). Die relativen IC₅₀-Werte für hNGF und trkA (80–100 pM), p75 (2–300 pM) und PC12-Zellen (50 pM) liegen innerhalb eines Faktors von 2–3 bezüglich der von anderen Forschern berichteten IC₅₀- und K_d-Werte. Im Einklang mit Vroegop et al. beobachten die Erfinder eine etwas höhere Affinität von hNGF für p75 als sie üblicherweise berichtet wird (IC₅₀ = 0,3 nM gegenüber 1–2 nM).
Die Deletion der ersten fünf Aminosäuren resultiert in einem 9fachen Verlust der Bindung an rekombinant trkA exprimierende NIH3T3-Zellen, während kaum ein Unterschied der Bindung mit p75 exprimierenden menschlichen A875-Myelomzellen (keine Veränderung) oder mit trkA + p75 exprimierenden PC12-Zellen (3fach) auftritt. Im Gegensatz dazu wurde ein 265- und 82facher Verlust der Bindung an trkA- bzw. PC12-Zellen für (10-118)hNGF im Vergleich zu (1-118)hNGF beobachtet, während ein 10facher Verlust der Bindung an p75 auftritt. Die dazwischen liegende, mit BC12-Zellen relativ zu den trkA- und p75-Zellen beobachtete Verdrängungspotenz legt nahe, dass beide Rezeptoren zum Profil der Verdrängungsisotherme beitragen (9C). Zellen, die Ratten-trkA rekombinant exprimieren, und radioiodiertes menschliches NGF wurden in der vorliegenden Untersuchung eingesetzt, während eine frühere Untersuchung von (10-118)hNGF durch Kahle et al. (1992) menschliches trkA exprimierende Zellen und radioiodiertes Maus-NGF einsetzte. Folglich werden ähnliche Unterschiede zwischen der (1-118)hNGF- und (10-118)hNGF-Bindung unabhängig davon beobachtet, ob menschliches oder Nager-trkA oder radioaktiv markiertes NGF während der Analyse eingesetzt werden. Darüber hinaus weist (1-118)hNGF eine 2–3 Mal höhere Affinität für entweder menschliches oder Ratten-trkA auf als (1-188)mNGF, ob radioiodiertes Maus- oder menschliches NGF den verdrängbaren Tracer darstellt. Die Autophosphorylierung von trkA (10) sowie die PC12-Zellen-Differnezierungsaktivitäten (Tab. 6) von (6-118)hNGF waren ähnlich jenen, die durch (1-118)hNGF hervorgerufen wurden. Jedoch ist (10-118)hNGF bei der Autophosphorylierung zumindest 10 Mal weniger potent als (1-118)hNGF und ist bei der Stimulierung der PC12-Zellen-Neuritenauswuchs 80 Mal weniger potent (10; Tabelle 6), was mit früheren Ergebnissen im Einklang steht (48) (49). Zusammen legen diese Ergebnisse nahe, dass die ersten fünf Aminosäuren des N-Terminus für volle hNGF-trkA-Bindungsaktivität wichtig sind, jedoch werden potente Rezeptoraktivierung und Bioaktivität größtenteils beibehalten. Der zusätzliche Verlust der nächsten vier Reste scheint nachteiliger für die trkA-Bindung und Aktivierung zu sein und hat außerdem eine gewisse Wirkung auf die Bindung an p75.
Die mutierten hNGF-Formen können durch metabolische Markierung, gefolgt von Immunopräzipitation oder Immunoblotanalyse von unmarkiertem konditioniertem Medium nachgewiesen werden und sind als vollständig prozessierte Polypeptide von 14 kD dargestellt (11). Die Konzentration jeder der Mutanten wurde mit einem ELISA unter Einsatz eines polyklonalen Anti-hNGF-Antikörpers bestimmt. Ähnliche Expressionsausmaße zusammen mit der Gegenwart einer vorwiegenden, einzelnen prozessierten Spezies, die von einem polyklonalen Antikörper in drei verschiedenen Arten der Immunoreaktivität erkannt wurde, legt nahe, dass die Mutanten eine Strukturstabilität ähnlich jener von hNGF der Wildform aufweisen.
Der Ersatz aller drei geladenen Aminosäuren durch Alanin (Mut 4: H4A + H8A + R9A) resultierte im Verlust der nachweisbaren kompetitiven Verdrängung von [¹²⁵I)hNGF von trkA bei 4°C über einen Konzentrationsbereich von hNGF der Wildform, welche den Tracer vollständig verdrängt (IC₅₀ = 1 × 10^–10 M; maximale Verdrängung = 1 × 10^–9 M, 12, oben, Tabelle 5). Der Verlust an Rezeptorbindung korreliert außerdem mit dem zumindest 10fachen Verlust an Potenz und der 4- bis 5fachen scheinbaren Verminderung der Effizienz der maximalen trkA-Autophosphorylierung. Mutante 4 weist eine 85 Mal niedrigere EC₅₀ der PC12-Differenzierung im Vergleich zu (1-118)hNGF auf (14), was mit dem PC12-Rezeptorbindungsprofil, das die Verdrängung größtenteils von p75 wiederzuspiegeln scheint, und mit einer nicht verdrängbaren Komponente im Einklang steht, was die Bindung der Mutante an trkA mit einer niedrigeren Affinität wiederzuspiegeln scheint (12, unten).
His4- und Arg9-Varianten wurden einzeln analysiert. Die N-terminale Region von hNT3 sowie hBDNF enthält ein Histidin, was die Möglichkeit einer konservierten funktionellen Rolle nahe legt. Der Ersatz von His4 von hNGF durch entweder Alanin (Mutante 1) oder Asparaginsäure (Mutante 2) resultiert in einem drastischen Verlust an trkA-Bindung, Autophosphorylierung und PC12-Zelldifferenzierung (12, 13, 14). Wie durch die Variation der Sequenz zwischen hNGF und anderen NGF-Spezies an Position 9 nahe gelegt wird, hatte die Mutation R9A keine ausgeprägten Wirkungen auf trkA- oder p75-Aktivitäten. Jedoch wurde eine etwas niedrigere Potenz für die trkA-Autophosphorylierung und PC12-Zelldifferenzierung beobachtet (12, oben, Mitte, 13 und 14). Bei 25°C zeigten die P5A- und H8A-Varianten einen 3fachen bzw. 1,5fachen Verlust an trkA-Bindung im Vergleich zu hNGF, wogegen H4D ungefähr die 40fache Bindungspotenz verlor; es wurde keine Veränderung der Bindung an p75 beobachtet. Alle obigen Mutationen zeigten einen weniger als 2fachen Verlust der Bindung an p75, ob bei 4°C oder 25°C, was nahe legt, dass die aus der Mutagenese resultierenden globalen Auswirkungen auf die Struktur minimal waren.
Um zu überprüfen, ob die spezifische N-terminale Sequenz von hNGF für die Wechselwirkung von Neurotrophin mit trkA erforderlich ist, wurden chimäre Mutanten (Mutanten 5 und 6) durch Ersetzen des N-Terminus von hNGF (SSSHPIF) durch jenen von hBDNF (HSDPA) oder hNT3 (YAEHKS) erzeugt. Diese Mutanten werden daher die dibasischen His8-, Arg9-Reste von hNGF beibehalten. Sogar bei einer 10 Mal höheren Konzentration von (1-118)hNGF, was in vollständiger Rezeptorverdrängung bei 4°C resultiert, waren die resultierenden chimären Neurotrophine unfähig, [¹²⁵I]hNGF von trkA zu verdrängen (12A) und sind bei der Hervorrufung der trkA-Autophosphorylierungsaktivität weniger potent als die Mutanten 1 und 2 (13). Die Bindungswechselwirkungen dieser Mutanten mit p75 sind von jenen von (1-118)hNGF ununterscheidbar, obgleich die PC12-Rezeptorverdrängung hauptsächlich eine p75-Wechselwirkung sein könnte (12, unten). Ähnlich zur dreifachen Alaninmutante 4 waren die N-terminalen chimären Mutanten beim Vergleich mit allen hNGF-Strukturvarianten die schwächsten Induktoren der PC12-Zelldifferenzierung; die IC₅₀ verschob sich nahezu um das 100fache. Diese Ergebnisse weisen auf die Notwendigkeit der spezifischen N-terminalen Sequenz von hNGF für die trkA umfassende hochaffine Bindung und Agonistenaktivität hin, nicht jedoch für die Bindung an p75.
Um zu verifizieren, dass N-terminate Sequenzvarianten fähig sind, die hochaffinen trkA-Wechselwirkungen von hNGF einzuschränken, während die Gesamtstruktur erhalten bleibt, wurden die H4D-Mutante 2 und die hNT3/hNGF-Mutante 6 in großen Mengen exprimiert und gereinigt. Bei der höchstmöglichen Konzentration, 2.000 Mal höher (2 × 10^–7 M) als die IC₅₀ für (1-118)hNGF (IC₅₀ = 1 × 10^–10 M), wurden für die Mutanten 2 und 6 nur 30% bzw. 10% [¹²⁵I]NGF von trkA verdrängt, während die Bindungsprofile von p75 ähnlich waren (15). Im Einklang mit den in 13 dargestellten Ergebnissen waren die gereinigten Mutanten hinsichtlich der Fähigkeit zur Aktivierung der trkA-Autophosphorylierung signifikant weniger potent als (1-118)hNGF. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Gesamtstrukturstabilität nach beiden diesen Aminosäureersetzungen erhalten beleibt und bestätigen, dass der Verlust der hochaffinen trkA-Bindung und Autophosphorylierung auf diese speziellen Modifizierungen zurückzuführen sind.
Chimäre Mutanten wurden außerdem erzeugt, um zunächst die Rolle zweier anderer variablen hNGF-Regionen als mögliche Determinanten der trkA-Rezeptorspezifität zu vergleichen. Sechs Reste in der variablen Beta-Wende-Region 3 (Arg59-Ser66) und sieben Reste in de variablen Beta-Wende-Region 5 (Met92-Ala98) wurden gegen die entsprechenden hNT3-Reste in den Mutanten 7 bzw. 8 ausgetauscht. Mutante 7 war bei der Verdrängung von [¹²⁵I]NGF von trkA etwas potenter als hNGF, während Mutante 8 weniger gut an p75 band (3- bis 5fach). Ansonsten zeigten diese Mutanten kaum einen Unterschied zu hNGF hinsichtlich ihrer trkA- und p75-Bindungsprofile und ihrer Fähigkeit, die trkA-Autophosphorylierung oder P12-Neuritenauswuchs zu unterstützen (12, 13, 14). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Regionen 3 und 5 weniger zur trkA-Bindungswechselwirkung als der N-Terminus beitragen. Die niedrigere Affinität der Mutante 8 für p75 könnte strukturelle Veränderungen um den konservierten Rest Lys95 herum darstellen, dessen Wechselwirkung mit p75 nachgewiesen wurde (54).
Um die relativen Expressionsausmaße der vollständig prozessierten hNGF-Strukturvarianten einer M_r = 14.000 zu ermitteln, wurden monoklonale und polyklonale Antikörper gegen hNGF auf ihre Fähigkeit hin getestet, Mutanten mittels Immunoblotting zu erkennen (11 und 12). Wenn gleiche Mengen der in konditioniertem Medium exprimierten N-terminalen Mutanten immunogeblottet wurden, verloren mehrere die Fähigkeit, vom monoklonalen Antikörper erkannt zu werden, während alle vom affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörper erkannt wurden. Die H4D-Mutante sowie die N-terminalen chimären hBDNF- oder hNT3-Mutanten zeigten kein Immunoblotsignal, wogegen die H4A + H8A + H9A-Mutante weniger schädlich war (16A). H4A- oder R9A-Mutationen beeinflussten nicht die Antikörperbindung. Der monoklonale Antikörper wurde dann hinsichtlich der Fähigkeit getestet, mit der Bindung von [¹²⁵I]NHF an trkA oder p75 zu konkurrieren. Ansteigende Antikörperkonzentrationen hemmten die Bindung an beide Rezeptoren; eine IC₅₀ = 1 × 10^–9 M gegenüber 4 × 10^–8 besagt, dass er bei der Blockierung der Bindung von hNGF an trkA 40 Mal effektiver als p75 ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der N-Terminus zumindest einen Teil des Epitops des monoklonalen hNGF-Antikörpers bildet und die Bindung des Antikörpers an hNGF seine Wechselwirkung mit trkA mit relativ hoher Affinität blockiert. Die schwächere Hemmung der Bindung an p75 legt nahe, dass entweder ein Epitop niedrigerer Affinität außerhalb des N-Terminus zu hNGF-p75-Bindungskontakten beitragen könnte oder dass eine sterische Hemmung des Antikörpers die p75-Bindung teilweise stören könnte. Vorläufige Untersuchungen legen nahe, dass ein schwächer bindendes Epitop für diesen Antikörper tatsächlich in der durch die chimäre hNT3/hNGF-Mutante 7 repräsentierten Beta-Wende-Region 3 existiert. Die Rolle dieser Region bei der Bindung von hNGF an p75 und trkA wird zurzeit untersucht. Obgleich behauptet werden könnte, dass der Verlust der trkA-Bindung in Gegenwart des Antikörpers auf die Bindung an ein sekundäres Epitop oder auf sterische Hemmung zurückzuführen ist, stehen die Daten mit dem bevorzugten Verlust der trkA- gegenüber der p75-Bindung, der für mehrere der oben dargelegten N-terminalen Varianten beobachtet wurde, im Einklang.
Beispiel 4
Erzeugung und Charakterisierung von hNGF-Aminosäurevarianten: hNGF- und hNT3-Pan-Neurotrophine
Identifizierung von Zielresten für die Mutationsanalyse
NGF und seine Neurotrophin-Familienmitglieder NT3, BDNF und NT4/5 haben ungefähr 56% Sequenzidentität gemeinsam. Die Rezeptorbindungspezifität kann teilweise durch die Aminosäuresequenzunterschiede unter den Neurotrophin-Familienmitgliedern ermittelt werden. Diese Reste könnten direkt an den trk-Rezeptor binden oder als Hemmungsbeschränkung auf die trk-Wechselwirkungen anderer Variablen fungieren oder könnten konservierte Reste sein. Domänenaustauschmutanten von hNGF zwischen hNGF und hNT3 wurden erzeugt, um die Rolle der divergenten Reste bei der Festlegung der trk-Rezeptorspezifität zu testen. Ein Vergleich von Neurotrophin-Primärsequenzen offenbart, dass 7 Regionen von je 7–10 Aminosäuren vorliegen, die den Großteil (80%) der Sequenzunter schiede enthalten (8, 18A und 18B). Zwischen hNGF und hNT3 unterscheiden sich 52 von 120 Aminosäuren. Einundvierzig dieser 52 Unterschiede (79%) treten zwischen den 7 divergenten Regionen auf. Unter 9 NGF-Spezies, einschließlich Mensch, Vögeln und Fröschen, sind 24 der 52 Reste konserviert, was einen Beitrag zur trkA-Bindungsspezifität nahe legt. Eine Untersuchung der Röntgenstrahlenkristallstruktur von Maus-NGF offenbart, dass vier der variablen Regionen/Domänen strukturell als Beta-Wenden gekennzeichnet sind, eine variable Region ist ein Beta-Faltblatt und die letzten beiden sind Amino- und Carboxytermini. Jede der divergenten Regionen enthält mehrere geladene und polare Seitenketten, die dem Lösungsmittel zugänglich und zur Wechselwirkung mit Rezeptoren fähig sind. Dreizehn chimäre oder Domänenaustauschmutanten wurden durch Ersetzen mehrerer Reste oder aller einzelner sieben variablen Regionen von hNGF durch die entsprechende hNT3-Domäne erzeugt. Zwei zusätzliche Regionen niedrigerer Divergenz wurden ebenfalls ersetzt: prä-variable Region 1 und 4. Folglich wurden insgesamt 90% der divergenten Aminosäurereste hinsichtlich ihrer Rolle bei der Festlegung der trkA- und trkC-Spezifität beurteilt. Die chimären Mutanten wurden durch Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese und Säugetierzellexpression wie im Beispiel 3 beschrieben erzeugt.
Die Auswahl der einzelnen hNGF-Reste zur Mutagenese war in erster Linie durch ihre Position in der Röntgenstrahlenkristallstruktur van Maus-NGF festgelegt. Es wurde angenommen, dass eine minimale Strukturveränderung aus den Sequenzunterschieden zwischen menschlichem und Maus-NGF resultiert, da die ersetzten Reste größtenteils funktionell konserviert sind (10/12). Die computererzeugte Modellierung von Maus-NGF auf Basis der Röntgenstrahlenkristallstruktur-Koordinaten und im Beispiel 1 beschrieben, offenbart Aminosäuren, deren Seitenketten in das Lösungsmittel hineinragen und mit den trkA- und gp75-Rezeptoren Wechselwirken könnten. Einige dieser umfassen variable Reste, die durch die Domänenaustauschmutationen signifikant modifiziert wurden, jedoch stellen viele davon Reste dar, die unter hNGF und hNT3 in den variablen und konservierten Regionen konserviert sind. Reste, von denen eine minimale Seitenkettenexposition vorhergesagt wird, wie z. B. jene, die an der Bildung der Dimerschnittstelle (F12, V14, W21, F49, Y52, F54, W76, T85, F86, W99, F101, T106, A107, V109, V111), des hydrophoben Innenraums (V36, V38, F53, I71, A89, I102 und I104) und der strukturabhängigen und verborgenen Wasserstoffbindungen (Q51, S78, T91, R100) beteiligt sind, wurden minimal modifiziert. Von den disulfidbildenden Cysteinresten sowie Glycinen und Alaninen wurde nur A97 modifiziert. Ausnahmen wurden in den folgenden Fällen gemacht: Reste I30 und Y52, die Oberflächenseitenketten aufweisen, obgleich sie an der Dimerschnittstelle auftreten, Reste L39, L90, M92 und A97, die ebenfalls ein Stück der hydrophoben Oberfläche bilden, und D16, K25, D30, E55, K57, R59, R69, D72, H75, die trotz Wasserstoffbindung eine gewisse Lösungsmittelexposition der Seitenkette zeigen. Die meisten Reste wurden auf Alanin geändert (64); in manchen Fällen wurden andere Ersetzungen vorgenommen, um die Struktur zu erhalten, während die Rolle einer spezifischen Funktionalität bei Rezeptorwechselwirkungen getestet wurde.
Herstellung und Rezeptorbindungscharakterisierung von hNGF-Varianten
Mutagenese, Expression und Proteincharakterisierung von hNGF-Varianten wurden wie im Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. Nach der Oligonucleotid-gerichteten Mutagenese wurden alle Mutanten durch Didesoxynucleotidsequenzierung verifiziert. Die hNGF-Mutanten wurden in menschlichen 293-Zellen exprimiert (11A, B) und im Anschluss an eine Amicon-Konzentrierung (10 ×) und EL1SA-Quantifizierung wurde beobachtet, dass die meisten hNGF-Varianten in Ausmaßen exprimiert worden sind, die den normalen hNGF-Kontrollen ähnlich waren (5–25 μg/ml) mit Ausnahme von Mutanten, welche die variablen Regionen 2 oder 3 ersetzten (0,6–1 μg/ml). Beide dieser chimären Moleküle resultieren in Insertionen oder Deletionen von Prolinresten zuzüglich anderen signifikanten Änderungen der Seitenkettenfunktionalität, und daher könnten die niedrigen Ausbeuten eine strukturelle Instabilität widerspiegeln. Trotzdem ermöglichten die verfügbaren Mengen die Bestimmung von Bindungsaffinitäten der hNGF-Varianten für trkA- und gp75-Rezeptoren. Die Bindungsaffinität jeder hNGF-Variante wurde durch Konkurrenzbindung unter Ein satz von Immunoadhäsinkonstrukten der trk- und gp75-Rezeptoren (88) und radioiodierten Neurotrophinen wie im Beispiel 2 beschrieben bestimmt. Jede hNGF-Variante wurde zumindest 2 Mal in 293-Zellen exprimiert und Bindungsexperimente wurden 2–3 Mal für jede Transfektion durchgeführt. Die relative Affinität im Vergleich zu normalem hNGF wird als das Verhältnis der mittleren IC₅₀ für alle Bestimmungen einer Variante zur IC₅₀ von hNGF ausgedrückt.
TrkA-Autophosphorylierungsaktivität und PC12-Zelldifferenzierungs-Biotest
Die biochemische Aktivierung von trkA-Kinase durch hNGF-Varianten wurde durch Ermittlung der trkA-Autophosphorylierung wie im Beispiel 3 beschrieben festgestellt. Es wurde ein quantitativer Test entwickelt (89), der dosisabhängige Bestimmungen der EC₅₀ für die trkA-Autophosphorylierung ermöglicht. Eine trkA-Rezeptorvariante, die einen aus einem Herpes-Simplex-Oberflächenprotein stammenden Peptid-Epitopmarker enthielt, wurde in CHO-Zellen in 96-Napf-Platten stabil exprimiert (88). Die Affinität des Epitop-markierten trkA für hNGF ist identisch mit jener des normalen Rezeptors (88). Die Zellen (doppelte Näpfe für jede Konzentration) werden mit 8 ansteigenden Konzentrationen der hNGF-Variante (10 pM–10 nM) für 10 Minuten bei 37°C stimuliert. Die Zellen werden mit Triton X-100-Lysepuffer wie im Beispiel 3 beschrieben lysiert und auf eine mit einem gegen den Epitopmarker gerichteten monoklonalen Antikörper beschichtete Platten übertragen. Nach der Bindung wird das eingefangene trkA dann mit einem HRP-konjugierten monoklonalen Antiphosphotyrosin-Antikörper zur Reaktion gebracht und die Farbreaktion entwickelt. Die Absorption wird dann abgelesen und gegen die Konzentration aufgetragen. Die EC₅₀ für hNGF beträgt 100–120 pM. Die Differenzierung von PC12-Zellen wurde wie im Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, jedoch wurden die Zellen zuerst für 7–10 Tage gezüchtet oder mit NGF geprimt. Neuriten tragende Zellen wurden dann geerntet und in 24-Napf-Platten in normalem Wachstumsmedium und entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit der hNGF-Variante ausplattiert. Der prozentuelle Anteil an Neuriten tragenden Zellen nach 72 Stunden wurde wie im Beispiel 2 beschrieben quantifiziert. hNGF/hNT3-Pan-neurotrophe Varianten wurden auf hNT3-artige trkC- Bioaktivität in trkC-transfizierten PC12-Zellen beurteilt, die nicht auf hNGF reagierten (freundlicherweise von Dr. Pantelis Tsolfous und Dr. Luis Parada, NCl, bereitgestellt).
Ergebnisse
Mutagene Analyse variabler Reste durch hNGF/hNT3-Chimären
Dreizehn chimäre Mutanten wurden durch Ersetzen mehrerer oder aller Reste jeder der 7 sieben variablen hNGF-Regionen durch die entsprechende hNT3-Region erzeugt (siehe 8, 18A, B). Zwei weniger variable Regionen, eine im Beta-Faltblatt A und die andere in einer konservierten, die Beta-Faltblätter B und C verbindenden Beta-Wende, wurden ebenfalls ersetzt. Konkurrenzbindungsexperimente wurden mit den hNGF-Varianten durchgeführt, wobei [¹²⁵I]hNGF von trkA- oder gp75-Immunoadhäsin-Fusionsproteinen verdrängt wurde. Diese Rezeptoren enthalten die extrazelluläre Domäne von trkA oder gp75, und den Fc-Abschnitt von menschlichem IgG. Diese Immunoadhäsionen binden hNGF mit Affinitäten ähnlich denen der Holo-trkA- und p75-Rezeptoren und weisen eine ähnliche Rangordnung von Affinitäten für die Neurotrophine auf (19A, B). Die IC₅₀ für jede hNGF-Variante wurde gemittelt und als Verhältnis zur für normales hNGF ermittelten IC₅₀(IC₅₀ hNGF = 100 pM; 23A) ausgedrückt. Die signifikanteste Wirkung auf die trkA-Bindung ist wie vorhin beschrieben (12, 15) ein nahezu 300facher Verlust der Bindungsaffinität aufgrund des N-terminalen Domänenaustauschs mit hNT3. Ein zwei- bis dreifacher Bindungsverlust wird für die Dreiresteänderung in der prä-variablen Region 1 (Beta-Faltblatt A: V18E + V20L + G23T) beobachtet. Ein weniger als 2facher Verlust der trkA-Bindung wird für andere hNGF-Varianten beobachtet, wogegen eine erhöhte Bindung für die chimäre Mutante der variablen Region 3 (Beta-Wende 3) und den C-Terminus beobachtet wird (20A). Im Einklang mit dem Verlust an trkA-Bindungsaffinitäten zeigen Dosis-Reaktions-Kurven für die trkA-Autophosphorylierung und PC12-Zelldifferenzierung (Neuritenauswuchs) Aktivitätsverluste durch die N-terminalen Varianten und Varianten der prä-variablen Region 1 an (21A, B). Die Bindung an gp75 wird um das 5- und 7fache durch den Austausch der variablen Region 1 bzw. der prä-variablen Region 4 von NT3 vermindert (20B). Ein zwei- bis dreifacher Verlust der gp75-Bindung wird außerdem für die Mutante der variablen Region 5 beobachtet. Der durch den V1-Austausch hervorgebrachte Verlust an gp75-Bindung ist wahrscheinlich auf den Austausch von K32 gegen R, K34 gegen H und E35 gegen Q zurückzuführen, da Alanin-Ersetzungen dieser Reste in einem Verlust an gp75-Bindung resultieren (8; (54)).
Diese Ergebnisse zeigen an, dass die Bindungswechselwirkungen von hNGF und gp75 einige der variablen Neurotrophinreste umfassen.
Der Verlust an trkA-Bindung und Rezeptoraktivierung legt nahe, dass die variablen Reste im N-Terminus und in der prä-variablen Region 1 zur trk-Rezeptorspezifität beitragen. Diese Möglichkeit wurde getestet, indem die Rezeptorbindung an trkC-IgG-Immunoadhäsin und Neuritenauswuchs in trkC-transfizierten PC12-Zellen, die nicht auf NGF reagieren, ermittelt wurde. Überraschenderweise wurden trkC-Wechselwirkungen nicht durch den N-Terminus von hNT3 übertragen (Mutante 6, 22A, B), jedoch resultierte der Austausch von vier Aminosäuren in der variablen Region 4 von hNGF (T81K, HY84, F86Y, K88R) in einer signifikanten trkC-Wechselwirkung (22A, B). Die niedrigere trkC-Affinität und Potenz der Neuritenauswuchs dieser Variante zeigt an, dass wahrscheinlich andere Regionen zu effizienten trkC-Wechselwirkungen beitragen. Die Mutante der prä-variablen Region 1 wird nun für trkC-Wechselwirkungen evaluiert, sowie der Beitrag der einzelnen Reste in der variablen Region 4. Jedoch legen überlappende Mutationen in der variablen Region 4 nahe, dass mehrere Reste von V4 für die trk-Spezifität notwendig sein könnten. Beispielsweise aktiviert die Beta-Wende-3/4-Variante, die drei variable Reste austauscht und bei T81K überlappt (S73, Y79, T81K), die Neuritenauswuchs in trkC-PC12-Zellen um nur 5–10%, sowie auch die Mutante der variablen Region 4 (22B). Trotzdem wird die trk-Funktion durch die Alaninmutante Y79A + T81A beeinflusst, was ein weiterer Hinweis darauf ist, dass die variablen Reste dieser Region an den trk-Rezeptorwechselwirkungen beteiligt sind. Die Erhaltung der trkA-Aktivitäten durch die Mutante der variablen Region 4 legt nahe, dass die 4 hNT3-Reste mit der trkA-Bindung kompatibel sind, jedoch könnten die äquivalenten hNGF-Reste eine hemmende Beschränkung auf die Wechselwirkung von hNGF mit trkC ausüben.
Obgleich die N-terminale Domäne des Neurotrophins nicht eine allgemeingültige trk-Spezifitätsdomäne zu sein scheint, scheint diese hNGF-Region eine Hauptdeterminante der trkA-Wechselwirkung zu sein. Der Ersatz der ersten sechs NT3-Reste durch die ersten sieben hNGF-Reste resultiert in einer pantropen Variante, die trkA sowie trkC mit hoher Affinität und Potenz bindet und aktiviert (24, 25 und 26). Darüber hinaus behält sie eine hochaffine Bindung mit gp75 bei. Folglich wäre es möglich, ein effektives pantropes trkA/trkC-Neurotrophin zu erzeugen, das mit hNT3 beginnt und variable hNGF-Regionen umfasst, wie z. B. den N-Terminus, V2, V3, V4 und V5. Umgekehrt könnte hNGF so modifiziert werden; dass es ähnliche pantrope trkA/trkC-Eigenschaften aufweist, indem variable Regionen im hNT3-Beta-Faltblatt (C1) und V4 ausgetauscht werden. Obgleich die die variable Region 2 ersetzende hNGF/hNT3-Chimäre nicht in einer Steigerung der trkC-Aktivität resultierte, resultierte sie sehr wohl in einem geringen Verlust an trkA-Bindung (1,5fach). Der reziproke Domänenaustausch, der die variable Region 2 von hNT3 durch die entsprechende hNGF-Domäne ersetzte, wird derzeit auf eine Steigerung der trkA-Aktivität getestet und ist ein Kandidat-trkA/trkC-Pantropin.
Mutagene Analyse einzelner variabler und konservierter hNGF-Reste: Strukturmodell von hNGF-Resten, die mit trkA und gp75 wechselwirken.
Unter Verwendung der oben beschriebenen Kristallstruktur von Maus-NGF beurteilten die Erfinder mittels Punktmutagenese 45 hNGF-Reste, wovon viele Seitenkettenfunktionalitäten aufweisen, die dem Lösungsmittel exponiert sind und zu trkA- und gp75-Wechselwirkungen fähig sind. Die Konkurrenzbindungsanalyse offenbart, dass H4-, P5A-, S13-, D30-, I31-, Y52-, R59-, R69-, Y79-, T81- und R103-Mutationen die trkA-Bindung um das 1,8- bis 10fache beeinflussen, während Mutationen der Reste E41, K57, D72, N77 die Bindung um das 1,5- bis 2fache steigern (27). Diese Ergebnisse zeigen an, dass diese Reste an trkA-Wechselwirkungen beteiligt sind und legen nahe, dass Varianten sowohl aus variablen Resten (H4, P5, I31, R59, Y79, T81), als auch aus konservierten Resten (S13, D30, Y52, R69, R103) erzeugt werden könnten, welche die trk-Spezifität beeinflussen könnten. Mutationen an den Resten F12, I31, K32 + K34 + E35, K50, Y52, R69, K74, H75, K88, L112, S113, R114 und K115 resultieren in 3→50fachen Verlusten an gp75-Bindung (30). Insbesondere wurde keine Verdrängung in Gegenwart von 10 nM Mutanten beobachtet, welche Änderungen in den Resten F12, K32 + K343 + E35, Y52, R69, K88 und R114 + K115 repräsentieren, was nahe legt, dass diese Reste entscheidende Determinanten der gp75-Bindung sind.
Die Autophosphorylierungsanalyse unter Verwendung von Epitop-markiertem trkA zeigt Verminderungen der Potenz der Aktivierung um das 1,5- bis 6fache durch Mutationen in den Resten H4, P5, D30, Y52, R69, Y79 + T81 und R103 an (28). Signifikante (20–60%) Verminderungen der Effizienz der Autophosphorylierung werden für alle diese Mutationen mit Ausnahme des Rests F12 beobachtet. Diese Ergebnisse stehen mit der Potenz der PC12-Zelldifferenzierung im Einklang; 2- bis 50fache Verminderungen der EC50 der Neuritenauswuchs werden für die Mutationen der Reste H4, F12, D30, Y52, R69, Y79 + T81 und R103 beobachtet. Andere hNGF-Varianten werden gegenwärtig evaluiert, einschließlich Mutationen von P5. Interessanterweise können Reste, bei denen Mutationen sowohl die trkA-Bindung, als auch die Potenz der trkA-Autophosphorylierung minimal beeinflussen, die Effizienz der Autophosphorylierung vermindern. Die Verminderung der trkA-Autophosphorylierung kann die verminderte Potenz der durch Mutationen von R69 und Y79 + T81 hervorgerufenen PC12-Zelldifferenzierung erklären. Alternativ dazu vermindern Mutationen bei R69 die p75-Bindung außerordentlich, wobei die Rolle von p75 bei der hNGF-Signaltransduktion gegenwärtig unklar ist und der Verlust an p75-Wechselwirkung zu einer verminderten biologischen Wirkung beitragen könnte. Diese Möglichkeit wird mit anderen hNGF-Varianten untersucht, welche die hNGF-Bindung an gp75 vermindern.
Reste, die mit den trkA- und gp75-Rezeptoren wechselwirken, wurden mittels Computer modelliert – erzeugt an der Struktur von Maus-NGF. Zwei hauptsächliche mit trkA wechselwirkende Regionen wurden durch diese Analyse aufgefunden: 1) Der N-Terminus (H4, P5) mit unbekannter Kristallstruktur und 2) eine von Y79, T81, H84 und R103 gebildete Oberfläche der Beta-Faltblätter C und D. Die Reste V18, V20, G23, Y52, R59 und R69 der Beta-Faltblätter A und B tragen in einem gewissen Ausmaß zu einer erweiterten Oberfläche bei, welche die Beta-Faltblatt-Stränge umhüllen würde. Nahe dem Bereich von Y52 und den Resten des Beta-Faltblatts A befinden sich D30 und I31 des zweiten Protomers. Diese beiden Reste exponieren eine relativ geringe Fläche in das Lösungsmittel, jedoch ist es möglich, dass sie zu einer durchgehenden Bindungsoberfläche beitragen, die mit den Beta-Faltbfattresten gebildet werden.
Es wurden zwei mit p75 wechselwirkende Hauptregionen gefunden: 1) Variable Region 1 des einen Protomers und Beta-Faltblatt B und C des anderen Protomers, 2) konservierte Reste im C-Terminus und in der Beta-Wende 3, ebenfalls von unterschiedlichen Protomeren. Im Gegensatz zu den für trkA interessanten Resten in einer Spalte, die von Beta-Faltblatt-Paaren gebildet werden, scheinen die mit p75 wechselwirkenden Reste gut exponiert zu sein. Wie von (54) gezeigt wurde, ragen K32 und K34 aus der variablen Region der Beta-Haarnadelwende 1 heraus. Die Erfinder finden, dass die benachbarten Reste K50 und Y52 aus dem anderen Protomer zur p75-Bindung beitragen. K88, das signifikant zur p75-Bindung beiträgt, befindet sich in dieser Region, ist jedoch nicht in hohem Ausmaß exponiert. Die andere Bindungsoberfläche setzt sich aus K74 (Beta-Wende 3), R114 und K115 (C-Terminus) des einen Terminus und F12, R69 aus dem anderen Protomer zusammen.
Andere potentielle pantrope Moleküle werden nunmehr auf Basis der oben dargelegten Mutageneseanalyse konstruiert und evaluiert. Ein Pan-trkA/trkC-Molekül kann durch die folgenden Änderungen in hNGF erzeugt werden: 1) prä-variable Region 1 (V18E + V20L + G23T) plus variable Region 4 (Y79Q + T81K + H84Q + F86Y + K88R); 2) prä-variable Region 1 plus minimale Resteersetzungen der variablen Region 4. Ein pan-trkA/trkC-Molekül kann erzeugt werden, indem minimale Änderungen in den ersten sieben Resten des N-Terminus von hNGF vorgenommen und die ersten 6 hNT3-Reste ersetzt werden. Da H4 und P5 unter NGF konserviert sind und 2 hydrophobe Reste an den Positionen 6 und 7 konserviert sind, wurden folgende Varianten hergestellt: 1) YASHPIF-hNT3; 2) YAHPIF-hNT3; 3) YASHPIS-hNT3; 4) YAEHPIF-hNT3; 5) YAQHPIF-hNT3. Ein trkA/trkC-Pantrophin kann erzeugt werden, indem die variablen Regionen 2 oder 4 oder 5, oder Kombinationen dieser Elemente von hNT3 durch die entsprechenden hNGF-Regionen ersetzt werden. Ein trkA/trkB-Pantrophin kann erzeugt werden, indem die ersten 9 Aminosäurereste von hNT4/5 durch die ersten 7 Reste von hNGF ersetzt werden, oder in Kombination mit dem Ersatz von Resten in der variablen Region 4 oder prä-variablen Region 1.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Pantropes Neurotrophinpolypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz von menschlichem NT-3 (hNT-3) oder menschlichem NGF (hNGF) mit einer an der Aminosäureposition, die D15 in hNT3 oder D16 in hNGF entspricht, substituierten Aminosäure, worin die Substitution trkB-Bindung verleiht, so dass das D15-substituierte pantrope hNT3 an trkB und trkC bindet und das D16-substituierte hNGF an trkB bindet, und zwei andere Neurotrophinrezeptoren, die aus trkA und gp75 bestehen.
Polypeptid nach Anspruch 1, worin die Substitution ein Alaninrest ist.
Polypeptid nach Anspruch 2, das einen an einer Position, die D15 in hNT3 entspricht, substituierten Alaninrest umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 3, das D15A-hNT3 ist.
Polypeptid nach Anspruch 3, das außerdem eine Substitution seiner ersten sechs Aminosäuren mit einer der folgenden Aminosäuresequenzen umfasst: (1) die ersten sechs Aminosäuren von NGF; (2) YAEHKS; (3) YASHPIF; (4) YAHPIF; (5) YASHPIS; (6) YAEHPIF; und (7) YAQHPIF.
Polypeptid nach Anspruch 2, das an einer Position, die D16 in hNGF entspricht, einen substituierten Alaninrest umfasst, worin das Polypeptid an trkB, trkA und gp75 bindet.
Polypeptid nach Anspruch 6, das D16A-hNGF ist.
Polypeptid nach Anspruch 6, das außerdem eine Substitution in Aminosäuren V18, V20 und G23 der prävariablen Region 1 und zumindest eine Substitution in einer Aminosäure Y79, T81, H84, F86 oder K88 einer variablen Region 4 umfasst, um trkC-Bindungsaktivität zu verleihen, so dass das substituierte D16A-hNGF auch trkC bindet.
Polypeptid nach Anspruch 8, das D16A-, V18E-, V20L-, G23T-, Y79Q-, T81K-, H84Q-, F86Y- und K88R-Substitutionen umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 9, das D16A-, V18E-, V20L-, G23T-, Y79Q-, T81K-, H84Q-, F86Y-, K88R-NGF ist.
Polypeptid nach Anspruch 6, das außerdem eine Substitution an der Aminosäureposition E41, K57, D72 oder N77 umfasst, um die trkA-Bindung zu erhöhen.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 11, umfassend ein kovalentes Heterodimer oder ein kovalentes Homodimer.
Isolierte Nucleinsäure, die für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 kodiert.
Expressionsvektor, der die Nucleinsäure nach Anspruch 13 enthält.
Wirtszelle, welche die Nucleinsäure nach Anspruch 13 enthält.
Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem eine Wirtszelle, welche eine Nucleinsäure enthält, die für das Polypeptid kodiert, Bedingungen ausgesetzt wird, welche die Expression des Polypeptids ermöglichen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 vermischt mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten.