NO317938B1

NO317938B1 - Pantropisk neurotrofinpolypeptid, fremgangsmate for fremstilling av dette, isolert nukleinsyre, ekspresjonsvektor, vertscelle samt farmasoytisk preparat

Info

Publication number: NO317938B1
Application number: NO19965123A
Authority: NO
Inventors: Roman Urfer; Leonard G Presta; John W Winslow
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1994-06-03
Filing date: 1996-12-02
Publication date: 2005-01-10
Also published as: BR9508019B1; ATE280825T1; FI964833A0; WO1995033829A1; FI964833A; FI120237B; US7528233B2; US5981480A; ES2231786T3; US5728803A; EP0763107B1; AU2659295A; US7935671B2; PT763107E; US6333310B1; BR9508019A; MX9605971A; CN1159439C; US20060270838A1; CA2191064C

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende patentsøknad omfatter pantropisk neurotrofinpolypeptid, fremgangsmåte for fremstilling av dette, isolert nukleinsyre, ekspresjonsvektor, vertscelle samt farma-søytisk preparat. Nærmere bestemt gjelder den pantropiske, neurotrofiske faktorer som har flere neurotrofiske spesifisiteter (MNTS-varianter).

Oppfinnelsens bakgrunn

Overlevelse og vedlikehold av differensiert funksjon

av neuroner hos vertebrater påvirkes av tilgjengeligheten av spesifikke proteiner som betegnes neurotrofiner. Overlevelse av neuroner under utvikling avhenger av tilførselen av disse faktorer fra deres målområder, og den begrensede produksjon av neurotrofiner fører til død av overflødige neuroner (for oversiktsartikler, se (1); (2)). De forskjellige neurotrofiner skiller seg funksjonelt fra hverandre ved sin evne til å understøtte overlevelse av distinkte neuronpopulasjoner i sentralnervesystemet og det perifere nervesystem (3), (4);

(5), (80). Neurotrofinfamilien er en svært homolog familie som omfatter NT3 (6), (7); (5); (8); (9); (10), nervevekstfaktor (NGF) (11); (12), hjerneavledet, neurotrofisk faktor (BDNF) (13); (14) og neurotrofin 4/5 (NT4/5) (15), (16), (17). Undersøkelser tyder på at neurotrofiner overfører intracellulær signalisering i det minste delvis via ligandav-hengig aktivering av en klasse av tyrosinkinaseholdige reseptorer med Mr = 140-145 000 betegnet trk-familien (18); (19) (21); (20) (22); (23); (24); (25); (26). Således innledes sig-naloverføringsveien for neurotrofiner ved denne høyaffinitets-binding til og aktivering av spesifikke tyrosinkinaseresep-torer og påfølgende autofosforylering av reseptoren (19); (27). Selv om det er en viss grad av reseptor-kryssinteraksjon mellom neurotrofinene og de forskjellige medlemmer av trk-familien, synes den hovedsakelige spesifisitet å være NGF/trkA, BDNF/trkB og NT3/trkC, mens NT4/5 primært synes å interagere med trkB med samme effektivitet som BDNF (27); (19) (21); (25); (22); (28); (18); (28a). Mens trkC utelukkende responderer på NT3 (25); (26), kan trkA og trkB under visse betingelser respondere in vitro til flere neurotrofiner (6); (23). Neuronmiljøet begrenser imidlertid trkA og trkB i deres evne til å respondere på ikke-foretrukne, neurotrofiske ligander (29). I tillegg til trk-familien av reseptorer kan neurotrofinene også bindes til en forskjellig reseptorklasse betegnet p75 lavaffinitets-NGF-reseptor (p75; (30); (31)) som har en ukjent mekanisme for transmembransignalisering, men er strukturelt beslektet med en reseptorgenfamilie som omfatter tumornekrosefaktorreseptoren (TNFR) , CD40=, 0X40 og CD27 (32) ; (33); (34), (35); (36); (37). Rollen til gp75 i dannelse av høyaffinitetsbindingsseter og i neurotrofiners signaloverfør-ingsvei er foreløpig uklar (for oversiktsartikler se (38); (39)) .

En undersøkelse av den primære aminosyresekvens for neurotrofinene avslører syv områder, hvert på 7-10 aminosyrerester som står for 85% av sekvensdivergensen blant familie-medlemmene .

Nervevekstfaktor (NGF) er et homodimert protein hvor hvert polypeptid består av 12 0 aminosyrer som har fremtredende virkninger på utviklende sensoriske og sympatetiske neuroner i det perifere nervesystem. NGF virker via spesifikke celleover-flatereseptorer på responsive neuroner og understøtter neuronoverlevelse, fremmer neurittutvekst og gir økt neurokjemisk differensiering. NGF-virkninger følges av endringer i neuron-membraner (40), (41), fosforyleringsstatus hos neuronproteiner (42), (43), og i mengden av visse mRNA og proteiner som sannsynligvis spiller en rolle i neurondifferensiering og -funksjon (se f.eks. (44)).

Cholinerge neuroner fra forhjerne responderer også på' NGF og krever muligens NGF for trofisk understøttelse (45). Fordeling og ontogenese av NGF og dens reseptor i sentralnervesystemet (CNS) antyder faktisk at NGF virker som en målav-ledet, neurotrofisk faktor--for basale, cholinerge neuroner i forhjernen (46) , (81) .

Lite er kjent når det gjelder hvilke aminosyrerester i NGF som er nødvendige for interaksjonen med trkA-tyrosin-kinasereseptoren. Vesentlige tap av biologisk aktivitet og reseptorbinding ble observert med rensede homodimerer av NGF fra menneske og mus som representerte homogene, forkortede former modifisert i amino- og karboksyendene. (47); (48) ; (49). hNGF-varianten med 109 aminosyrer (10-118) som er et resultat av tap av de første 9 N-terminale aminosyrerester og de to siste aminosyrerestene fra den C-terminale ende av renset, rekombinant, human NGF, er 300 ganger mindre effektiv når det gjelder å fordrive muse-[125l] NGF fra den humane trkA-reseptor sammenlignet med (l-118)HNGF (49). Den er 50 til 100 ganger mindre aktiv for overlevelse av dorsalrotganglion og sympatetisk ganglion enn (l-118)hNGF (48). (1-118)HNGF har betydelig lavere trkA-tyrosinkinase-autofosforyleringsaktivitet (49) . NT3-transkripsjon er påvist i et stort antall perifere vev (f.eks. nyre, lever og hud) så vel som i sentralnervesystemet (f.eks. cerebellum og hippocampus) (5); (7), (82). Under utviklingen er NT3-mRNA-transkripsjon mest fremtredende i områder i sentralnervesystemet hvor proliferasjon, migrasjon og differensiering av neuroner foregår (50). Understøttende bevismateriale for en rolle i neuronutviklingen omfatter den fremmende virkning av NT3 på "neural crest"-celler (51) og stimulert proliferasjon av oligodendrocyttforløperceller in vivo (79). NT3 understøtter også in vitro overlevelse av sensoriske neuroner fra "nodose ganglion" (NG) (7); (5), (83) og en populasjon av muskel-sensoriske neuroner fra dorsalrot-ganglionet (DRG) (52). I tillegg til disse in vitro undersøk-elser viste en rapport nylig at NT3 forebygger in vivo degenerering av voksne, sentrale, noradrenerge neuroner fra locus coerulus i en modell som ligner celletapsmønsteret observert i .Alzheimers sykdom. For tiden foreligger ingen publiserte rap-porter som omhandler aminosyrerestene som er nødvendige for trkC-binding.

Det har vært gjort noen begrensede forsøk på å danne kimære eller pan-neurotrofiske faktorer. (Se (53); (56); (54), 55)) .

Oppsummering av oppfinnelsen

Det er et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe pantropisk neurotrofinpolypeptid, hvori substitusjonen gir trkB-binding, slik at det D15-substituerte pantropiske hNT3 binder til trkB og trkC, og D16-substituert hNGF binder til trkB og minst to andre neurotrofinreseptorer utvalgt fra gruppen bestående av trkA, trkC og gp75, kjenne-tegnet ved at det omfatter en aminosyresekvens til humant NT-3(hNT-3) eller human NGF (hNGF) med en aminosyre substituert i aminosyreposisjon tilsvarende D15 i hNT3 eller D16 i hNGF.

Det er et videre formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe isolerte nukleinsyrer som koder for pantropiske neurotrofiner, og ekspresjonsvektorer og vertsceller som inneholder nukleinsyren som koder for de pantropiske neurotrofiner ifølge oppfinnelsen.

I samsvar med formålene ovenfor tilveiebringer foreliggende oppfinnelse isolerte nukleinsyrer som koder for neurotrofinene ifølge foreliggende oppfinnelse. Videre tilveiebringes ekspresjonsvektorer som inneholder DNA som koder for et pantropisk neurotrofin, operativt koblet til transkripsjons- og translasjonsregulerende DNA, og vertsceller som inneholder nukleinsyrene.

Nok en side ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fremgangsmåter for fremstilling av pantropiske neurotrofiner som omfatter dyrking av en vertscelle som er transformert med en ekspresjonsvektor og fremkalling av ekspresjon av nukleinsyren som koder for det pantropiske neurotrofin, slik at et rekombinant neurotrofin fremstilles.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser den høye homologi mellom muse-NGF (SEKV.ID NR. 1) og humant NT-3 (SEKV.ID NR. 2), noe som tillater modellering av NT-3 basert på den tredimensjonale struk tur til NGF. Piler angir p-plater. p-platene er betegnet som i McDonald et al. (1991) (59). Aminosyrer som er forskjellige i NGF og NT-3, er i grå bokser. Seksjoner med uordnet struktur er stiplede. Figurene 2A, 2B, 2C, 2D og 2E viser de biologiske virkninger av utvalgte mutanter når det gjelder overlevelse av dorsalrotganglionneuroner og neurittutløpere på PC12/trkC-celler. E9-kylling-DRG-neuroner dyrket i 72 timer i nærvær av kondisjonert medium fra 293-celler inneholdende NT-3 eller mutante proteiner. Responsen indusert av mutanter, er uttrykt som prosent av NT-3-responsen. A) 5 ng/ml NT-3, R103A/D105A og

R103A. B) 1 ng/ml NT-3, R103M, R103K, NI, Y51A. C) 0,2 ng/ml NT-3, Y11A, T22Q og K80A Q83A. Den angitte feil er standardav-viket for målinger in triplo. Responsen på medium fra narretransfekterte celler ble subtrahert fra hvert målepunkt og var 23%, 23% og 2 9% for eksperimentet med 200 pg/ml, 1 000 pg/ml hhv. 5 000 pg/ml. (D) Responsen av PC12/trkC-celler indusert av kondisjonert medium inneholdende enten NT-3 eller mutanten R68A. Måleresultatene viser prosent celler med neuritter indusert av forskjellige neurotrofindoser. Summen av celler med og uten neuritter var konstant for NT3 og R68A for alle doser. (E) Overlevelse av neuroner fra DRG. Respons indusert av NT-3, R68A eller R114A/K115A uttrykt som antall overlevende celler. Resultatene er middelverdi for målinger in triplo ± SD. Responsen indusert med narretransfektert, kondisjonert medium, ble subtrahert fra måleverdiene og var 20 ± 4 overlevende celler. Figurene 3A, 3B og 3C viser bindingsepitopene i NT3 mot reseptorene trkC og gp75. NT3-modellen er vist med bind-ingsdeterminanter fra monomer A og B vist i lyse- hhv. mørke-grått. (A) Epitop for trkC-reseptor. (B) TrkC-epitopen sett fra siden. Posisjonen av D15 og Y51 relativt til trkC-bind-ingsdeterminanter. (C) Epitop for gp75-reseptor. Figurene 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 41 og 4J viser gjennomsøking av NT3-mutanter for forbedrede BDNF- og NGF-lignende aktiviteter. PC12-celler eller PC12-cellelinjen som uttrykker trkB, ble utsådd på kollagenbelagte skåler. PC12/trkB-cellelinjen ble behandlet med PC12-medium tilsatt

.enten BDNF (A), NT3 (B), mutant D15A (C) eller supernatant fra narretransfekterte 293-celler (E). PC12-cellene ble behandlet med PC12-medium tilsatt enten NGF (F), NT3 (G) , Sl (H), D15A

(D), MNTS-1 (I) eller supernatant fra narretransfekterte 293-celler (J). Representative felter ble fotografert tre dager

etter behandling.

Figurene 5A, 5B, 5C og 5D viser at MNTS-1 bindes med høy affinitet til humant trkA, trkB og trkC. Forskyvningskur-ver med reseptor-immunoadhesiner ble bestemt i nærvær av en konstant mengde av merket neurotrofin (50 pM for trkA, trkB og trkC; 100 pM for gp75) og økende mengder umerket konkurrent; (O) HNGF, (A) hBDNF, (□) NT-3, (A) MNTS-1, (X) Sl, ( + ) D15A.

(A) Forskyvning av <125>I-NGF fra human trkA. (B) Forskyvning av 1<25>I<->BDNF fra human trkB. (C) Forskyvning av <12>SI-NT-3 fra human

trkC. (D) Forskyvning av <125>I-NT-3 fra human gp75.

Figurene 6A, 6B og 6C viser autofosforylering av trkA, trkB og trkC indusert av MNTS-1. PC12-variantcellene ble behandlet med neurotrofiske faktorer og mutanter ved 25 ng/ml i 5 minutter ved 37 °C og analysert som beskrevet i Experimen-tal Procedures. (A) Respons av PC12-celler på tilsetning av ingen faktor, NGF, NT-3, Sl, D15A, MNTS-1 og supernatant fra narretransfekterte 293-celler. (B) Respons av PC12/trkB-celler på tilsetning av ingen faktor, NGF, BDNF, renset NT-3, uttrykt NT-3, D15A og supernatant fra narretransfekterte 293-celler. (C) Respons av PC12/trkC-celler på tilsetning av ingen faktor, NGF, NT-3, D15A, Sl, MNTS-1 og supernatant fra narretransfekterte 293-celler. Tallene under de neurotrofiske faktorer angir type antiserum benyttet til immunopresipitering, 443 er et pan-trk-antiserum, 656 er et trkC-spesifikt antiserum. Figur 7 viser at MNTS-1 er like aktivt som sammenblandet NT-3/BDNF/NGF for overlevelse av DRG-neuroner. Doseav-hengighet for overlevelse av neuroner fra DRG. Antall celler holdt i live av sammenblandet NT3/BDNF/NGF (1:1:1) (•) og MNTS (A). Resultatene er gitt som middelverdien av målinger in triplo ± SD. Verdiene ble tilpasset en fire-parameters ligning for MNTS-1 (stiplet linje) og blanding (heltrukket linje). De beregnede EC-50-verdier for MNTS-1 og blanding var 36 pg/ml hhv. 44 pg/ml. Figur 8 viser homologien, variable områder og konstante områder for de forskjellige neurotrofiner. NGF (SEKV.ID NR. 3), BDNF (SEKV.ID NR. 4), NT3 (SEKV.ID NR. 5) og NT4/5 (SEKV.ID NR. 6) er vist med de variable områder innrammet. Figurene 9A, 9B og 9C viser konkurranseforskyvning av [<12S>I]hNGF fra enten trkA-, p75- eller trkA + p75-reseptorer med økende konsentrasjon av rensede, N-terminalt modifiserte former av hNGF. Øvre (12A), midterste (12B) og nedre (12C) felter viser forskyvning fra MH3T3-, A875 melanom- og PC12 feokromocytom-celler som uttrykker trkA-, p75- hhv. trkA + p75-reseptorer. De konkurrerende ligander er som angitt: (•-•) 111/111 = homodimerer av (10-118)hNGF; (0-0) 118-118 = homodimerer av (1-118)hNGF; (A-A) 115-115 = homodimerer av (6-118)hNGF; ( - ) muse-NGF = homodimerer av (1-118)mNGF. Reseptorbinding ble utført ved 4 °C og analysert som beskrevet i eksemplene. De oppgitte måleverdier representerer totalbinding (spesifikk og ikke-spesifikk) og er representative for minst tre uavhengige bindingseksperimenter for hver cellelinje. IC50 for dette eksperiment er gitt i tabell 5. Figurene 10A og 10B viser autofosforylering av trkA indusert av N-terminalt forkortede former av hNGF. Øvre felt (10A) viser intensiteten av autof osf oryler ingen av pl40<trkA->båndet som funksjon av den molare konsentrasjon av hNGF-variant, mens nedre felt (10B) er en kvantitering av hvert bånds optiske tetthet bestemt ved reflekterende densitometri. Det autof osf orylerte pl40<trkA->bånd ble identifisert ved anti-trkA-immunoblotting på nitrocellulose etter immunopresipitering med antifosfotyrosin. De oppgitte verdier er representative for to uavhengige eksperimenter. Figurene 11A og 11B viser ekspresjons- og proteinana-lyse av hNGF-mutanter. Felt A viser et autoradiogram av metabolsk merkede mutanter 1-8 (se tabell 1 for beskrivelse) separert ved SDS-PAGE. Mutantene ble transient uttrykt i humane 293-celler og merket med <3>SS-metionin og -cystein. Kondisjonerte medier ble immunopresipitert med et renset, poly-klonalt anti-hNGF-antistoff fra kanin, og utfelt materiale ble analysert ved SDS-PAGE som beskrevet i eksemplene. Sporene merket wt eller B, viser transfeksjon av celler med villtype (1-12 0)hNGF-ekspresjonsvektor hhv. AdVA-vektor alene. Felt B viser Western-immunoblotanalyse av tilnærmet 0,1 ug umerket mutant- eller vi11type-hNGF. Disse prøver er tatt fra kondi sjonerte medier etter transfeksjon i parallell med de metabolsk merkede celler beskrevet ovenfor. Immunoblottingen ble utført med det samme polyklonale anti-hNGF-antistoff som er .beskrevet i felt A. Resultatene står i kontrast til den variable påvisning av mutantene immunoblottet i parallell i det samme eksperiment og behandlet med et spesifikt, monoklonalt hNGF-antistoff som vist i figur 18. Sporet merket NGF, viser signalet fra 0,1 ug renset (1-120) hNGF. Venstre akse i begge felt angir den relative mobilitet for molekylmassemarkørene i kD. Figurene 12A, 12B, 12C, 12D, 12E og 12F viser konkur-ranse forskyvning av [125l]hNGF fra celler som uttrykker trkA (toppfeltene, 12A og B), p75 (midtfeltene, 12C og 12D) og p75 + trkA (nedre felter, 12E og 12F) med økende konsentrasjoner av hNGF-mutanter. For klarhets skyld er måleverdiene inndelt i to felter for hver cellelinje. For sammenligning av relativ bindingsaffinitet ble fire mutanter og hNGF-villtypekontrollen analysert i hver cellelinje i ett eksperiment. Hvert av de to felter er representativt for minst to uavhengige bindingseksperimenter fra én transfeksjon og ett bindingseksperiment fra ytterligere en transfeksjon. Bindingseksperimentene ble utført ved 4 °C som beskrevet i eksemplene. Totalbinding er vist som 1 figur 12. IC50 i forhold til vi 11 type-hNGF, er vist i tabell 5. Figurene 13A og 13B viser autofosforylering av trkA utløst av hNGF-mutanter. Toppfeltet (13A) viser et autoradiogram av pl40<trkA> etter stimulering av trkA-uttrykkende celler med de angitte konsentrasjoner av mutant- eller vi11type-hNGF. TrkA-autofosforyleringsnivåene ble bestemt som i figur 10. Nedre felt (13B) er den densitometriske kvantitering av auto-radiogrammet ovenfor. Verdiene som oppgis, er representative for minst to eksperimenter som sammenligner trkA-autofosforyleringen utløst av alle mutantene i ett eksperiment, og står i samsvar med verdier fra andre eksperimenter hvor 3-4 mutanter sammenlignes med hNGF pr. eksperiment. Figur 14 viser den biologiske aktivitet av hNGF- mutanter bestemt ved neurittutvekst i PC12-celler. PC12-celler ble dyrket i nærvær av de angitte konsentrasjoner av mutant- eller villtype-hNGF i 48 timer. Prosent celler som sender ut neuritter, i prosent av totale celler i et gitt mikroskopisk felt, er angitt, normalisert i forhold til maksimalresponsen som ble utløst av (1-118)hNGF som beskrevet i eksemplene. De angitte måleverdier er gjennomsnittsverdier for minst to bes-temmelser pr. mutant. Figurene 15A, 15B, 15C, 15D og 15E viser karakterisering av rensede mutanter i det N-terminale område. A. Sølv-farging av SDS-PAGE (15% akrylamid) av 1 ug renset H4D-mutant 2 (spor 1), renset hNT3/hNGF N-terminal, kimær mutant 6 (spor 2), delvis renset (l-120)hNGF (spor 3-N) og molekylmassemar-kører i kD (spor 4-M). Detaljer vedrørende rensing og analyse er gitt i seksjonen Materialer og fremgangsmåter. B. Konkurranseforskyvning av [<125>I]hNGF med renset H4D-mutant 2, hNT3/hNGF N-terminal, kimær mutant 6 og renset (1-120)hNGF. Toppfeltet (15B) viser binding til NIH3T3-celler som uttrykker trkA, nedre felt (15D) viser binding til A875-celler (p75). C. Toppfeltet (15C) viser konsentrasjonsavhengigheten (M) av pl40<trkA->autofosforylering påvist ved antifosfotyrosinimmuno-blotting som i figurene 10 og 13. Nedre felt (18E) viser den-sitometrisk kvantitering av immunoblotresultatene. Figurene 16A og B viser interaksjon av monoklonalt antistoff med det N-terminale område i hNGF. A. Immunoblot av 0,1 ug av mutantene 1-6 og 8 (mutant 7 utelatt grunnet lav konsentrasjon), hNGF (wt) og kontrolltransfekterte, kondisjonerte medier (B). Kondisjonerte medier ble påsatt SDS-PAGE, immunoblottet til nitrocellulose og behandlet med monoklonalt anti-hNGF-antistoff 14.14. Den relative mobilitet av mutantene er vist som 14 kD. B. Konkurranseforskyvning av 25 pM [<125>I]hNGF fra enten trkA-uttrykkende eller p75-uttrykkende celler med økende konsentrasjoner av det samme, monoklonale antistoff som ble benyttet i felt A. Figur 17 viser en skjematisk tegning av en hNGF-monomer basert på røntgenkrystallstrukturen av NGF fra mus, som viser den primære aminosyresekvens (SEKV.ID NR. 3), grunnegen-skapene til sekundærstrukturen og aminosyrerester modifisert ved mutagenese. Gulfargede aminosyrerester viser aminosyrerester som er forskjellige i hNGF og hNT3 og som ble erstattet .med de tilsvarende hNT3-rester i hNGF ved utbytting av domener. Store, svarte tall plassert nær blokker av 5-8 gule aminosyrerester, nummererer dette variable neurotrofinområde. Disse variable områder omfatter også amino- og karboksyendene. Rødfargede aminosyrerester angir de rester som ble mutert alene eller i par, og representerer aminosyrer som hovedsakelig er eksponert mot løsemidlet. Figurene 18A, 18B og 18C viser organiseringen av hNGF. Figur 18A viser posisjonen av de variable områder i primærsekvensen til hNGF. Figur 18B viser hNGF-mutanter med kimære, variable domener som inneholder et enkelt, variabelt hNT3-domene. Listen, 18C, angir de spesifikke aminosyrerester i hNGF som ble erstattet med aminosyrerester fra hNT3 i en gitt mutant. Figurene 19A og 19B viser karakterisering av en ny reseptorbindingsfremgangsmåte benyttet for analyse av strukturelle hNGF-varianter. A) En sammenligning av bindingsegen-skapene til trkA-IgG-immunoadhesjonsbaserte analyser med de til holo-trkA-reseptorer uttrykt i NIH3T3-cellelinjer. TrkA-IgG-konkurransebindingsprofilene ligner svært på dem fra holo-trkA-cellelinjer (20A), mens trkA-IgG viser samme neurotrofin-selektivitet (20B; NGF>>NT3>BDNF). Bindingsverdiene som presenteres her, benytter individuelle immunoadhesjonsanalyser for trkA-, B-, C- og p75-IgG. Reseptorbindingsegenskapene for flere varianter ble bekreftet i holo-trkA-cellebindingsana-lyser. Figurene 2OA og 2OB viser binding av hNGF/hNT3 kimære mutanter til trkA-IgG- og gp75-reseptorer. Mutantenes relative affinitet er fremstilt som forholdet mellom IC50 for mutanten og 1C50 for hNGF beregnet fra konkurransebindingskurver. Gjen-nomsnittsforholdet fra tre uavhengige bindingseksperimenter er gitt. Mutanten hvor det N-terminale NGF-domene er utbyttet med det tilsvarende domene fra NT3 (mutant 6), viste et signifikant tap av trkA-binding, mens binding av gp75 ikke påvirkes. Disse resultater er i samsvar med verdiene oppnådd ved holo-trkA-binding i celler ved 4 °C (figur 18B, C). Kimære mutanter som inneholder den første beta-sving fra NT3 (mutantene 10 og 19), har fire ganger lavere evne til å bindes til gp75. Erstatning av basiske aminosyrerester med alanin i første beta-. sving (mutant 21) eller i den C-terminale ende (mutant 24) fører til signifikant tap av gp75-binding. Figurene 2IA og 2IB viser evnen til de kimære hNGF/hNT3-mutanter til å utløse trkA-tyrosinkinase-autofosforylering hhv. neurittutvekst i PC12-celler. TrkA-uttrykkende CHO-celler ble stimulert med hNGF, hNT3 eller kimære mutanter med utbyttede hNGF/hNT3-domener, og autofosforyleringen ble bestemt ved en f osf otyrosin-ELISA-analyse (OD450/65o) ■ 1 samsvar med trkA-bindingen er det liten stimulering av trkA-autofosforylering ved de N-terminale, kimære hNGF/hNT3-mutanter. 2-3 gangers redusert aktivitet var resultatet av domeneutbytnin-gen i pre-beta-sving 1-området (V18, V20, G23), noe som tyder på en mulig rolle for disse aminosyrerester for NGF-trkA-spesifisitet. For PC12-celledifferensiering ble EC50 for neurittutvekst bestemt for alle mutanter og uttrykt som forholdet mellom mutantens EC50 og EC50 for hNGF. Igjen observeres den største virkningen med den N-terminale hNGF/hNT3-domeneutbytningsmutant, men imidlertid observeres tap av bioaktivitet også med pre-beta-sving 1-området i samsvar med trkA-bindingen og autofosforyleringen. Figurene 22A og 22B viser den pan-neurotrofiske aktivitet av hNGF/hNT3-domeneutbytningsmutanter. Aktiviteten måles ved trkC-IgG-konkurransebinding og neurittutvekst i trkC-transfekterte PC12-celler. Konkurransefortrengning av [<125>I]hNT3 observeres kun for hNT3 {IC50 = 45 pM) og mutanten med hNGF/hNT3-domeneutbytning i variabelt område 4 (mutant 16; IC50 = 80 nM). På lignende måte førte hNGF/hNT3-domeneutbytning i variabelt område 4 til signifikant neurittutvekst i trkC-transfekterte PC12-celler som ikke responderer på hNGF. Sammenligning av trkA-avhengig binding, autofosforylering og PC12-celleaktiviteter for mutant 16 (figurene 19, 20) viser lite tap av endogen hNGF-lignende aktivitet. Mutanten med domeneutbytning i den N-terminale del (mutant 6) som inneholder den N-terminale del av NT3, interagerer ikke med trkC. Figur 23 viser de to N-terminale domeneutbytnings-mutantene: hNT3-NH2/hNGF er mutant 6 og inneholder hNT3-restene 1-6 (YAEHKS-) som erstatter hNGF-restene 1-7, på et gjenværende hNGF-skjelett. hNGF-NH2/NT3 er P2 (Sl) og inneholder hNGF-restene 1-7 (SSSHPIF-) som erstatter hNT3-restene 1-6, på et gjenværende skjelett av hNT3. Figurene 24A, 24B og 24C viser den pan-neurotrofin-reseptorbindende aktivitet av P2 (Sl) med trkA, trkC hhv. gp75. Konkurransebindingsanalyser ble utført ved forskyvning av [<125>I]hNGF eller [125I]hNT3 fra reseptor-IgG-immunoadhe-sjonene ved den angitte faktor. P2 (NGF-NH2/NT3) , den N-terminale domeneutbytningsmutant av hNT3 som inneholder den N-terminale ende av hNGF, viser hNGF-lignende trkA-bindingsaktivitet samtidig som trkC-aktiviteten er bevart. NT3-NH2/NGF (mutant 6), den tilsvarende N-terminale domeneutbytningsmutant av hNGF som inneholder den N-terminale ende av hNT3, viser redusert trkA-binding og ingen binding til trkC. Figurene 25A og 25B viser pan-neurotrofinbioaktivi-teten til P2 (Sl) i normale, trkA-uttrykkende PC12-celler hhv. trkC-transfekterte PC12-celler med redusert hNGF-respons. Pro-senten av PC12-celler som bærer neuritter ved en gitt konsentrasjon av neurotrofin eller variant, ble normalisert i forhold til den maksimale respons som utløses av det naturlige neurotrofin. EC50 for P2 (NGF-NH2/NT3) i trkA-PC12-cellene er 0,4 ng/ml (15 pM) og 0,2 ng/ml (7 pM) i de trkC-transfekterte PC12-celler, verdier som ligner på EC50 for hNGF hhv. hNT3. Figurene 26A og 26B viser binding av hNGF-punkt-mutanter til trkA- og gp75-reseptorer. Mutantenes affinitet ble bestemt ved konkurransebinding og er angitt som forholdet mellom mutant ICSo og IC50 for naturlig hNGF. IC50 ble bestemt ved konkurransebindingskurver utført minst to ganger fra to uavhengige transfeksjoner for hver mutante hNGF. Standardav-viket for IC5o-forholdene for 4-6 uavhengige målinger for hver mutant er gitt. Aminosyrerestene i hNGF som ble analysert for bindingseffekter, var hovedsakelig eksponert på overflate, anslått ut fra krystallstrukturen for NGF fra mus. Figur 27 viser den biokjemiske aktivitet til hNGF-mutanter målt ved en trkA-autofosforylerings-ELISA-analyse. EC50 for hver mutant i forhold til EC50 for hNGF (EC50 = 120 pM) er angitt. Muterte aminosyrerester med størst virkning på potensen er angitt med aminosyrerestnummer. Muterte aminosyrerester med ytterligere virkninger på graden av autofosforylering (effektivitet) er angitt med aminosyrerestnummer og stjerne (<*>). Figur 28 viser bioaktiviteten av utvalgte hNGF-mutanter i trkA-PC12-celle-neurittutvekstanalysen. Forholdet mellom EC50 for neurittutvekst for hver mutant og EC50 for hNGF er fremstilt grafisk. Muterte aminosyrerester med de største virkninger er angitt. Alle andre mutanter blir for tiden undersøkt. ;Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen ;Enbokstavskoder for aminosyrene benyttes heri, som kjent innen faget, i henhold følgende tabell: ;Således identifiseres en aminosyrerest ved enbok-stavskoden for aminosyren fulgt av posisjonsnummeret for aminosyreresten. Det bør forstås at posisjonsnummeret tilsvarer den aktuelle neurotrofinryggrad; således betyr D15A NT3 at asparaginsyren i posisjon 15 i NT3 er endret til et alanin. Denne asparaginsyre som foreligger i et "konstant område" som definert nedenfor, tilsvarer posisjon 16 i NGF da NGF har en ekstra aminosyre i sin N-terminale ende som vist i figur 8. ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer pantropiske neurotrofiner. Generelt er et neurotrofin et protein som deltar i utvikling, regulering og vedlikehold av nervesystemet, og særlig av neuroner. I dag er det kjent minst fem viktige neurotrofiske faktorer: nervevekstfaktor (NGF), neurotrofin-3 (NT3), neurotrofin-4 (NT4, noen ganger også betegnet neurotrofin-5 (NT5) eller NT4/5), hjerneavledet, neurotrofisk faktor (BDNF) og cilia-neurotrofisk faktor (CNTF). ;Med begrepet "pantropiske neurotrofiner" eller "pantropiske, neurotrofiske faktorer" eller grammatikalske ekvivalenter av disse menes heri et neurotrofin som i motsetning til naturlig forekommende neurotrofiner har flere neurotrofinspesifisiteter. Det vil si at det inneholder domener som gir forskjellige neurotrofinspesifisiteter. I én utførelse betyr dette at de pantropiske neurotrofiner ifølge foreliggende oppfinnelse vil binde til en rekke neurotrofiske reseptorer. Således vil f.eks. naturlig forekommende NGF som er den naturlige eller native ligand for trkA-reseptoren, ikke i vesentlig grad bindes til hverken trkB- eller trkC-reseptoren med høy affinitet, NGF vil f.eks. bindes til disse reseptorer med 500-1 000 ganger lavere Ku enn BDNF hhv. NT3. Imidlertid kan et pantropisk NGF, dvs. et pantropisk neurotrofin hvis aminosyre-ryggrad er basert på NGF, bindes til i det minste trkA-, trkB-og p75-reseptoren. Alternativt vil et pantropisk NGF bindes til trkA-, trkC- og p75-reseptoren. En foretrukket utførelse tillater binding til trkA-, trkB-, trkC- og p75-reseptoren. På tilsvarende måte vil naturlig forekommende BDNF og NT4/5 som er de naturlige ligander for trkB-reseptoren, ikke i vesentlig grad bindes til hverken trkA- eller trkC-reseptoren som ovenfor. Således vil pantropisk BDNF eller NT4/5 bindes til trkB og enhver kombinasjon av trkA, trkC og p75 som vist ovenfor for pantropisk NGF. ;I alternative utførelser vil det naturlig forekommende neurotrofin bindes med lav affinitet til flere neurotrofinreseptorer. I denne utførelse bindes det pantropiske neurotrofin til disse reseptorer med affiniteter som er høyere enn de som forekommer naturlig, og med lignende affinitet som observeres for den naturlige ligand. For eksempel bindes NT3 sterkt til trkC og svakt til trkA og trkB. Således vil et pantropisk NT3 bindes til trkC med sin normale bindingsaffinitet, og vil bindes til enten trkA med en affinitet som tilsvarer den naturlige ligand for trkA, NGF, eller til trkB med en affinitet som tilsvarer affiniteten til de naturlige trkB-ligander BDNF eller NT4/5, eller begge. ;I den foretrukne utførelse er bindingsaffiniteten for det pantropiske neurotrofin for neurotrofinreseptorer minst tilnærmet 50-60%, fortrinnsvis tilnærmet 75-80%, og mest foretrukket tilnærmet 90% av bindingsaffiniteten til den naturlige ligand. Således vil et pantropisk NGF bindes til trkB- eller trkC-reseptoren med minst 50% av bindingen til BDNF eller NT4/5, hhv. NT3. En fagmann vil vite at denne affinitet kan måles på en rekke forskjellige måter. Den foretrukne fremgangsmåte er bruk av konkurranseanalyser som vist i (84) og i eksempel 2. Generelt angis bindingsaffiniteter som IC50, dvs. konsentrasjonen av umerket konkurrent som gir 50% inhibering av bindingen av merket ligand til reseptoren. ;I alternative utførelser måles neurotrofinets pantropisitet ikke ved bindingsaffinitet til neurotrofinreseptorer, men snarere ved analyse av neuronoverlevelse eller neurittutvekst. Således understøtter alle neurotrofiner over-levelsen av embryonale, sensoriske neuroner fra "neural crest" (77), (78), (7), (17). Overlevelse av embryonale, sympatetiske neuroner understøttes bare av NGF, mens overlevelse av "placode"-avledede, sensoriske neuroner kan understøttes av NT3 og BDNF (85). Overlevelse av sensoriske neuroner fra dor-salrotganglionet understøttes både av NGF og BDNF (13) . NT3 utløser neurittutvekst i sensoriske neuroner fra dorsalrotganglion, sympatetiske kjedeganglier og "nodose"-ganglion og understøtter også overlevelse av "nodose" ganglieneuroner og dorsalrotganglionneuroner. Således kan neuronoverlevelses-analyser eller neurittutvekstanalyser utføres for å måle de pantropiske neurotrofiners pantropisitet. ;Således bestemmes neurotrofinspesifisitet ved neuro-trof inreseptorbinding og ved neuronaloverlevelsesanalyser og/eller neurittutvekstanalyser. Således betyr et pantropisk neurotrofin med NGF-spesifisitet et neurotrofin som i det minste viser samme bindingsegenskaper, neuronoverlevelses-analysespesifisitet eller neurittutvekstanalysespesifisitet som NGF. På tilsvarende måte vil et pantropisk neurotrofin med BDNF-, NT3- eller NT4/5-spesifisitet vise i det minste de samme bindingsegenskaper, neuronoverlevelsesanalysespesifisi-tet eller neurittutvekstanalysespesifisitet som BDNF, NT3 hhv. NT4/5. ;I en ytterligere utførelse fremstilles pantropiske neurotrofiner ved å konstruere kovalente heterodimerer. Normalt er neurotrofiner homodimerer som består av to identiske monomerer som er ikke-kovalent forbundet. I denne utførelse gis, som skissert nedenfor, pantropisiteten ved at hver monomer inneholder domener som gir forskjellige neurotrofiske spesifisiteter. Alternativt kan pantropisiteten dannes ved kovalent sammenkobling av to forskjellige neurotrofiner med forskjellige spesifisiteter slik at en kovalent heterodimer dannes. Således kan f.eks. en NGF-monomer kobles kovalent til en NT3-monomer, noe som fører til et pantropisk neurotrofin med både NGF- og NT3-spesifisitet. På samme måte kan kovalente heterodimerer fremstilles med enhver kombinasjon av NGF, NT3, NT4/5, BDNF eller CNTF slik at det dannes pantropiske neurotrofiner med minst to spesifisiteter. I tillegg kan denne fremgangsmåte utføres med monomerer som selv er pantropiske, noe som fører til kovalente dimerer av enhver kombinasjon av pantropiske monomerer og monomerer med en enkelt spesifisitet. Således kan en pantropisk, kovalent dimer være en homodimer av to pantropiske monomerer. For å kunne omfattes av definisjonen ifølge foreliggende oppfinnelse må imidlertid den pantropiske, kovalente dimer ha minst to, og fortrinnsvis tre, neurotrofin-spesif isiteter . ;Den kovalente kobling utføres fortrinnsvis som en direkte fusjon av nukleinsyren slik at den C-terminale ende av den første monomer festes direkte til den N-terminale del av den andre monomer når proteinet uttrykkes, ved at det dannes en enkelt nukleinsyre som koder for dimeren. I alternative utførelser kan en linker benyttes, f.eks. korte repetisjoner av glysin eller glysin og serin; f.eks. kan en linker som gly-gly eller gly-gly-ser-gly-gly benyttes. Dette utføres ved be-nyttelse av teknikker som er velkjente innen faget. Andre teknikker for kovalent sammenkobling av proteiner er velkjente innen faget. ;Pantropiske neurotrofiner oppnår pantropisk binding, eller, som diskutert ovenfor, pantropisk neuronoverlevelse, ved at de inneholder domener som gir neurotrofinreseptor-spesifisitet eller -binding. Et domene kan defineres på to forskjellige måter. I den første utførelse er et domene en del av neurotrofinet som gir en viss neurotrofisk spesifisitet. I denne utførelse inneholder en enkelt monomer av det pantropiske neurotrofin ett eller flere domener som gir forskjellige spesifisiteter. Domenene kan variere i størrelse fra en enkelt aminosyre til tilnærmet 10-15 aminosyrer. Domenet kan bestå av en kombinasjon av aminosyrer fra et forskjellig neurotrofin enn vertsneurotrofinet, dvs. at et domene fra ett neurotrofin kan substitueres inn i et andre neurotrofin og gi pantropisitet til det andre neurotrofin. Alternativt kan domenet oppstå ved aminosyresubstitusjoner som ikke er basert på homologi med eksisterende neurotrofiner, som skissert nedenfor. I den foretrukne utførelse omfatter domenet en kontinuerlig aminosyresekvens, dvs. at et enkelt strekk med aminosyrer erstattes. I andre utførelser kan domenet bestå av diskontinuerlige aminosyrer, f.eks. kan flere områder innen neurotrofinet gi spesifisitet, og følgelig vil erstatning i flere posisjoner i , neurotrofinet være nødvendig for pantropisitet. ;I noen utførelser er det mer enn ett domene i et neurotrofin som kan gi neurotrofisk spesifisitet, noe som vil avhenge av det gitte neurotrofin. BDNF har f.eks. et antall domener som synes å gi BDNF-spesifisitet. Foreliggende oppfinnelse viser at en enkelt aminosyreendring i NT3, fra asparaginsyre i posisjon 15 til alanin, gir BDNF-spesifisitet til NT3. Dette domene kan også importeres inn i NGF- og NT4/5-sekvensene i posisjonene som tilsvarer posisjon 15 i NT3, dvs. posisjon 16 i NGF eller posisjon 18 i NT4/5. Det bør forstås at aminosyrene som tilsvarer hverandre, bestemmes ved å under-søke sammenstillinger av sekvensene som vist i figur 8. I tillegg til dette domene foreligger andre domener i BDNF som gir BDNF-spesifisitet. For eksempel kan innføring av BDNF-sekvensen fra posisjon 78 til 88 (QCRTTQSYVR), eller fra posisjon 93-99 (SKKRIG) gi BDNF-spesifisitet (55). ;På lignende måte har NT3 et antall domener som kan gi NT3-spesifisitet når de innføres i et annet neurotrofin. Et antall aminosyrerester i NT3 er vist å være viktig i NT3-trkC-reseptorbinding så vel som i bioaktivitetsanalyser. Nærmere bestemt bidrar mutasjoner i posisjonene R103, D105, K80, Q83, E54, R56, T22, Y51, V97, Yll, E7, R8, E10 og R68 alle til NT3-spesifisitet da mutasjoner i disse posisjoner i NT3 gir redusert NT3-aktivitet. Av disse ligger K80, Q83, T22 og V97 i variable områder som vist i figur 8, mens resten foreligger i konstante områder. I tillegg kan aminosyrerester i nærheten av disse rester også gi NT3-spesifisitet. I noen utførelser kan endringer i de konstante områder også gi NT3-spesifisitet. Alternativt ga mutasjoner i posisjonene R31 og E92 økt NT3-binding, nærmere bestemt viste R31A- og E92A-NT3 økt trkC-binding. Disse mutasjoner kan direkte importeres i neurotrofiner forskjellige fra NT3 ved bruk av fremgangsmåtene beskrevet nedenfor. Aminosyrene i alle disse posisjoner kan endres som skissert nedenfor. ;NGF har et antall domener som kan gi NGF-spesifisitet når de innføres i et annet neurotrofin. De N-terminale aminosyrer i NGF gir NGF-spesifisitet når de erstatter de N-terminale rester i NT3. Nærmere bestemt kan de 7 N-terminale aminosyrer (SSSHPIF) i NGF erstatte de 6 N-terminale aminosyrer i NT3 (YAEHKS), noe som gir et pantropisk NT3 med NGF-spesifisitet. Det eksakte antall N-terminale aminosyrerester fra NGF er ikke avgjørende; som vist i eksemplene, og særlig i eksempel 3 synes histidin i aminosyreposisjon 4 å være ganske viktig for NGF-spesifisitet; således kan fra tilnærmet 4 til tilnærmet 10 N-terminale aminosyrerester utbyttes selv om en enkelt aminosyreendring vil være tilstrekkelig i noen utførelser. På tilsvarende måte har et antall andre aminosyrerester i NGF blitt vist å være viktige i NGF-trkA-reseptorbinding så vel som i bioaktivitetsanalyser. For eksempel er det et antall aminosyrerester som ved mutasjon gir tap av NGF-aktivitet. Dette viser viktigheten av aminosyreresten for NGF-spesifisitet. ;Disse rester omfatter, men er ikke begrenset til, H4, P5, V18, V20, G23, D30, Y52, R59, R69, H75, Y79, T81 og R103. Av disse ;er D30, R59, Y79 og T81 i "variable områder", dvs. områder som varierer mellom de forskjellige neurotrofiner som vist i figur 8, mens resten foreligger i konstante områder. I noen utførel-ser vil aminosyrerestene fra de variable områder mer sannsyn-lig gi NGF-spesifisitet da aminosyrerester fra konstante områder kan være viktige for generell struktur og egenskaper uten å gi spesifisitet. Imidlertid kan, som vist ovenfor for DISA-mutasjonen, mutasjoner i de konstante områder også gi spesifisitet. Videre er det et antall aminosyresubstitusjoner i NGF som gir økt NGF-binding og/eller -bioaktivitet. Følgelig kan disse substitusjoner innføres i andre neurotrofinskjeiet-ter for å gi NGF-spesifisitet. Disse rester omfatter, men er ikke begrenset til, Ell, F12, D24, E41, N46, S47, K57, D72, N77, H84, D105 og K115. ;Når de først er identifisert, kan restene som er viktige i neurotrofinspesifisitet, erstattes med enhver annen aminosyrerest ved bruk av teknikker som beskrives i eksemplene og velkjente teknikker for setestyrt mutagenese. Generelt ut-velges aminosyrene som skal erstattes, basert på egenskaper kjent blant fagfolk. Når f.eks. små endringer i egenskaper ønskes, utføres substitusjoner generelt i henhold til følgende tabell: ;Vesentlige endringer i funksjon eller immunologisk identitet utføres ved å utvelge substitusjoner som er mindre konservative enn dem vist i tabell 1. For eksempel kan substitusjoner utføres som i større grad påvirker strukturen av polypeptidkjeden i det endrede område, f.eks. alfa-heliks-eller beta-plate-strukturen; ladningen eller hydrofobisiteten i molekylet ved målsetet eller volumet av sidekjeden. De substitusjoner som generelt forventes å gi de største endringer i polypeptidets egenskaper, er slike hvor (a) en hydrofil aminosyrerest, f.eks. seryl eller treonyl, erstatter (eller erstattes med) en hydrofob aminosyrerest, f.eks. leucyl, isoleucyl, fenylalanyl, valyl eller alanyl; (b) et cystein eller prolin erstatter (eller erstattes med) enhver annen aminosyrerest; (c) en aminosyrerest med en elektropositiv sidekjede, f.eks. lysyl, arginyl eller histidyl, erstatter (eller erstattes med) en elektronegativ aminosyrerest, f.eks. glutamyl eller aspar-tyl; eller (d) en aminosyrerest med en stor sidekjede, f.eks. fenylalanin, erstatter (eller erstattes med) en aminosyre uten sidekjede, f.eks. glysin. I en foretrukket utførelse endres aminosyrerestene til alaninrester. ;Andre domener i hvert neurotrofin kan finnes ved å benytte teknikkene som beskrives heri. Nærmere bestemt tillater modelleringsteknikkene i eksempel 1 identifisering av mulige spesifisitetsseter. I tillegg kan homologscanning-mutagenese, tilfeldig mutagenese og kassettmutagenese alle benyttes for å fremstille mulige pantropiske neurotrofiner som så kan gjennomsøkes for reseptorbinding ved bruk av teknikkene beskrevet i eksemplene, og som er velkjente innen faget. ;I en kovalent heterodimer kan et domene også betegne hele neurotrofinmonomeren. Således kan en pantropisk, kovalent heterodimer bestå av et domene som gir NT3-spesifisitet, dvs. NT3-monomeren, kovalent koblet til et domene som gir BDNF-spesif isitet , dvs. BDNF-monomeren. På samme måte kan en NT3-monomer kobles til en NGF-monomer, eller en NGF-monomer kobles til en BDNF-monomer. I tillegg kan kovalente heterodimerer også lages med NT4/5- og CNTF-monomerer. I disse utførelser er domenet stort og omfatter generelt mesteparten av eller hele vi11type-neurotrof inaminosyre sekvensen. ;I den bredeste utførelse bindes et pantropisk neurotrofin til minst tre forskjellige neurotrofinreseptorer. I den foretrukne utførelse bindes det pantropiske neurotrofin til minst fire forskjellige neurotrofinreseptorer. ;Med begrepet "neurotrofinreseptor" eller grammatikalske ekvivalenter av dette menes heri en reseptor som binder en neurotrofinligand. I noen utførelser er neurotrofinreseptoren medlem av tyrosinkinasefamilien av reseptorer, generelt betegnet "trk"-reseptorene, som uttrykkes på overflaten av bestemte neuronpopulasjoner. Trk-familien omfatter, men er ikke begrenset til, trkA (også kjent som pl40trlc) , trkB (også kjent som pl45<trkB>) og trkC (også kjent som pl45trkc) . I andre utførelser er neurotrofinreseptoren P751*3™, også betegnet p75 eller lavaffinitets-nervevekstfaktorreseptor (LNGFR). Det bør forstås at andre foreløpig uoppdagede neurotrofinreseptorer også kan binde de pantropiske neurotrofiner ifølge foreliggende oppfinnelse, noe som lett vil kunne fast slås av en fagmann.

I en foretrukket utførelse er det pantropiske neurotrofin et pantropisk NT3. I denne sammenheng er et pantropisk NT3 et pantropisk neurotrofin som har en aminosyresekvens som er homolog med aminosyresekvensen til NT3, med domener som gir andre neurotrofinspesifisiteter. I den foretrukne utførelse erstatter domenene NT3-rester, dvs. at et visst antall aminosyrer fjernes fra NT3-sekvensen og et identisk eller lignende antall aminosyrer innføres for å gi tilleggsspesifisitet. For eksempel omfatter det MNTS-1- (multiple, neurotrofiske spesifisiteter-1) pantropiske NT3 de første 7 aminosyrer i NGF som erstatter de 6 N-terminale aminosyrerester i NT3, pluss D15A-substitusjonen. Det MNTS-1-pantropiske NT3 har NT3-, NGF- og BDNF-spesifisiteter og bindes også til p75-reseptoren. Andre pantropiske NT3 fremstilles ved å innføre minimale endringer i den N-terminale del. Da H4 og P5 er konservert i forskjellige NGF og 2 hydrofobe rester i posisjon 6 og 7 er konservert, fremstilles f.eks. de følgende varianter: 1) YASHPIF-hNT3; 2) YAHPIF-hNT3; 3) YASHPIS-hNT3; 4) YAEHPIF-hNT3; 5) YAQHPIF-hNT3. Når D15A-substitusjonen innføres i tillegg, viser de resulterende neurotrofiner NGF-, NT3- og BDNF-spesifisitet. Alternativt gir erstatning av variabelt område 2 eller 3 eller 4, eller kombinasjoner av disse, i NT3 med tilsvarende område fra NGF, et pantropisk neurotrofin med både NT3- og NGF-spesifisitet.

I en foretrukket utførelse er det pantropiske neurotrofin pantropisk NGF. I denne sammenheng er et pantropisk NGF et pantropisk neurotrofin som har en aminosyresekvens som er homolog med aminosyresekvensen til NGF, med domener som gir andre neurotrofinspesifisiteter. I den foretrukne utførelse erstatter domenene NGF-rester, dvs. at et antall aminosyrer er delert fra NGF-sekvensen, og et identisk eller lignende antall aminosyrer er innført, noe som gir en tilleggsspesifisitet. For eksempel fremstilles et pantropisk NGF med en D16A-substitusjon, som gir BDNF-spesifisitet, pluss substitusjoner i det prevariable område 1 (V18E + V20L + G23T) og i variabelt område 4 (Y79Q + T81K + H84Q + F86Y + K88R). Alternativt kan substitusjonene i prevariabelt område 1 utføres med kun én enkelt aminosyresubstitusjon i variabelt område 4; f.eks. kan V18E + V20L + G23T og enten Y79Q, T81K, H84Q, F86Y eller K88R utføres.

I én utførelse er det pantropiske neurotrofin et pantropisk NT4/5. NGF-spesifisitet kan f.eks. innføres i NT4/5 ved å erstatte de 9 N-terminale aminosyrer i NT4/5 med de 7 N-terminale aminosyrer i NGF.

I én utførelse har binding til p75-reseptoren av det pantropiske neurotrofin blitt vesentlig redusert eller fjernet. For eksempel er det, som vist i figur 26, en rekke aminosyrerester som bidrar til p75-binding, og hvor mutasjoner fører til redusert p75-binding. I NT3 fører mutasjoner i posisjonene R68, Yll, K73, R114, K115, Y51, K73, R31 og H33, og i NGF, mutasjoner i posisjonene F12, 131, K32, K34, K50, Y52, R69, K74, K88, L112, S113, R114 og K115, alle til redusert p75-binding. Da F12, 131, K50, Y52, R69 og K74 alle ligger i konstante områder i neurotrofinene, som vist i figur 8, forventes disse endringer å endre p75-binding også i de andre neurotrofiner. De andre aminosyrerester kan også endres.

I tillegg til aminosyreendringene skissert ovenfor, vil fagfolk forstå at en viss variabilitet i aminosyresekvensen vil tolereres uten at neurotrofinets spesifisitet eller egenskaper endres. Således kan pantropiske neurotrofiner ha aminosyresubstitusjoner, -innføyelser eller -delesjoner sammenlignet med villtypesekvensene som ikke påvirker pantropisiteten, men kun er sekvensvariasjoner. I noen utførelser vil disse mutasjoner finnes i de samme posisjoner som er identifisert som viktige for spesifisiteten, dvs. at i noen tilfeller kan nøytrale mutasjoner utføres uten å endre neurotro-finspesifisiteten.

De pantropiske neurotrofiner ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles på en rekke måter ved bruk av rekombinant teknologi. Med begrepet "rekombinant nukleinsyre" menes heri en nukleinsyre i en form som ikke normalt finnes i naturen. Det vil si at en rekombinant nukleinsyre flankeres av en nukleotidsekvens som ikke naturlig flankerer nukleinsyren, eller har en sekvens om ikke normalt finnes i naturen. Rekombinante nukleinsyrer kan i utgangspunktet dannes in vitro ved manipulering av nukleinsyrer ved restriksjonsendonukleaser, eller alternativt ved bruk av teknikker som polymerasekjede-reaksjon. Det vil forstås at når først en rekombinant nukleinsyre er fremstilt og innført på nytt i en vertscelle eller organisme, vil den replikere ikke-rekombinant, dvs. ved å benytte in vivo-cellemaskineriet til vertscellen snarere enn in vi tro-manipulasjoner; imidlertid er slike nukleinsyrer som først er fremstilt rekombinant, selv om de deretter er repli-kert ikke-rekombinant, fortsatt å betrakte som rekombinante innen oppfinnelsens formål.

På tilsvarende måte er et "rekombinant protein" et protein som er fremstilt ved bruk av rekombinante teknikker, dvs. ved ekspresjon av en rekombinant nukleinsyre som beskrevet ovenfor. Et rekombinant protein skiller seg fra naturlig forekommende protein ved minst én eller flere egenskaper. For eksempel kan proteinet separeres isolert fra noen eller alle proteiner og forbindelser med hvilke det normalt er forbundet i sin villtypevert. Definisjonen omfatter produksjon av pantropiske neurotrofiner fra én organisme i samme eller en forskjellig organisme eller vertscelle. For eksempel kan proteinet fremstilles i samme organisme som den er avledet fra, men i signifikant høyere konsentrasjon enn hva man normalt ser, f.eks. ved bruk av en induserbar promoter eller høyeks-presjonspromoter, slik at forhøyede nivåer av proteinet fremstilles. Alternativt kan proteinet være i en form som ikke normalt finnes i naturen, f.eks. ved addisjon av en epitop-merkelapp eller aminosyresubstitusjoner, -innføyelser eller

-delesjoner.

Ved å benytte nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen som koder for pantropiske neurotrofiner, kan en rekke ekspresjonsvektorer fremstilles. Ekspresjonsvektorene kan være enten selvreplikerende, ekstrakromosomale vektorer, eller vektorer som integrerer i et vertsgenom. Generelt omfatter ekspresjonsvektorer transkripsjonsregulerende og translasjonsregulerende nukleinsyrer operativt koblet til nukleinsyren som koder for det pantropiske neurotrofin. "Operativt koblet" betyr i denne sammenheng at det transkripsjonsregulerende og translasjonsregulerende DNA er plassert relativt til den kodende sekvens for det pantropiske neurotrofin på en slik måte at transkrip-sjon initieres. Generelt vil dette si at promoteren og transkripsjonsinitierings- eller startsekvenser er plassert 5' for området som koder for det pantropiske neurotrofin. Den transkripsjons- og translasjonsregulerende nukleinsyre vil generelt være tilpasset vertscellen som benyttes for ekspresjon av det pantropiske neurotrofin; f.eks. vil transkripsjons- og translasjonsregulerende nukleinsyresekvenser fra pattedyrceller benyttes for ekspresjon av det pantropiske neurotrofin i pattedyrceller. En rekke typer av passende ekspresjonsvektorer og egnede, regulatoriske sekvenser er kjent innen faget for en rekke vertsceller.

Generelt kan de transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser omfatte, uten å være begrenset til, promoter sekvenser , signalsekvenser, ribosomalbindingsseter, transkripsjonsstart- og -stoppsekvenser, translasjonsstart- og -stoppsekvenser, termineringssekvenser og poly A-signalsekvenser, og enhancer- eller aktivatorsekvenser. I en foretrukket utførelse omfatter de regulatoriske sekvenser en promoter og transkripsjonsstart- og -stoppsekvenser.

Promotersekvenser koder for enten konstitutive eller induserbare promotere. Hybride promotere som kombinerer elementer fra mer enn én promoter, er også kjent innen faget, og er anvendbare i oppfinnelsen.

I tillegg kan ekspresjonsvektoren inneholde ytterligere elementer. For eksempel kan ekspresjonsvektoren ha to replikasjonssysterner slik at den kan opprettholdes i to organismer, f.eks. i pattedyrceller for ekspresjon og i en pro-karyotisk vert for kloning og amplifisering. For integrerende ekspresjonsvektorer inneholder ekspresjonsvektoren videre minst én sekvens som er homolog til vertscellegenomet, og fortrinnsvis to homologe sekvenser som flankerer ekspresjons-konstruktet. Den integrerende vektor kan være rettet mot et spesifikt locus i vertscellen ved å utvelge en passende homolog sekvens til å inngå i vektoren. Konstrukter for integrerende vektorer er velkjente innen faget.

I tillegg inneholder ekspresjonsvektoren i en fore-trukken utførelse et seleksjonsmarkørgen som tillater seleksjon av transformerte vertsceller. Seleksjonsgener er velkjente innen faget og vil variere med den anvendte vertscelle.

De pantropiske neurotrofiner ifølge oppfinnelsen

fremstilles ved å dyrke en vertscelle som er transformert med en ekspresjonsvektor som inneholder nukleinsyre som koder for et pantropisk neurotrofin, under passende betingelser for induksjon eller ekspresjon av det pantropiske neurotrofin. Be-tingelsene som passer for pantropisk neurotrofinekspresjon,

vil variere med valget av ekspresjonsvektor og vertscelle, og vil lett kunne fastsettes av en fagmann. For eksempel vil bruk av konstitutive promotere i ekspresjonsvektoren kreve optimal-isering av vertscellens vekst og proliferasjon, mens bruk av

en induserbar eller represserbar promoter krever egnede vekst-betingelser for induksjon eller derepresjon. I en foretrukket utførelse renses eller isoleres det pantropiske neurotrofin etter ekspresjonen. De pantropiske neurotrofiner kan isoleres eller renses på en rekke måter kjent blant fagfolk, avhengig av hvilke andre bestanddeler som foreligger i prøven. Gjengse ^rensefremgangsmåter omfatter elektroforetiske, molekylære, immunologiske og kromatografiske teknikker, heriblant ionebyt-ter-, hydrofob, affinitets- og reversfase-HPLC-kromatografi og kromatofokusering. Ultrafiltrerings- og diafiltreringsteknik-ker i forbindelse med proteinkonsentrering er også anvendbare. For generell veiledning i egnede renseteknikker, se (57). Den nødvendige rensingsgrad vil avhenge av anvendelsen av det pantropiske neurotrofin. I noen tilfeller vil rensing være unød-vendig .

Egnede vertsceller omfatter gjær, bakterier, arkebak-terier, sopp som filamentøs sopp, og plante- og dyreceller, heriblant pattedyrceller. Av spesiell interesse er Saccharomyces cerevisiae og andre gjær, E. coli, Bacillus subtilis, Pichia pastoris, SF9-celler, C129-celler, 293-celler, Neuro-spora, og CHO-, COS-, HeLa-celler, immortaliserte myeloid- og lymfoidcellelinjer fra pattedyr. En foretrukket vertscelle er en pattedyrcelle, og de mest foretrukne vertsceller omfatter CHO-celler, C0S-7-celler og den humane, føtale nyrecellelinje 293.

I en foretrukket utførelse uttrykkes de pantropiske neurotrofiner ifølge oppfinnelsen i pattedyrceller. Pattedyr-ekspresjonssystemer er også kjent innen faget.

Visse gener kan uttrykkes mer effektivt når introner foreligger. Imidlertid har flere cDNA blitt effektivt uttrykt fra vektorer som mangler spleisesignaler. I noen utførelser vil således nukleinsyren som koder for det pantropiske neurotrofin, inneholde introner.

Fremgangsmåtene for innføring av eksogene nukleinsyrer i pattedyrverter, så vel som andre verter, er velkjent innen faget og vil variere med den anvendte vertscelle, og omfatter dekstranmediert transfeksjon, kalsiumfosfatutfelling, polybrenmediert transfeksjon, protoplastfusjon, elektroporering, innkapsling av polynukleotid(ene) i liposomer og direkte mikroinjeksjon av DNA inn i kjernen.

I én utførelse fremstilles pantropiske neurotrofiner i gjærceller. Gjærekspresjonssystemer er velkjente innen faget og omfatter ekspresjonsvektorer for Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans og C. mal tosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragrilis og K. lactis, Pichia guillerimondii og P. Pastoris, Schizosaccharomyces pombe og Yarrowia lipolytica. Fremgangsmåter for innføring av eksogene nukleinsyrer i gjær-verter så vel som andre verter, er velkjente innen faget og vil variere med den anvendte vertscelle.

I en foretrukket utførelse uttrykkes pantropiske neurotrofiner i bakteriesysterner. Ekspresjonsvektorer for bakterier er velkjente innen faget og omfatter vektorer for bl.a. Bacillus subtilis, E. coli, Streptococcus cremoris og Streptococcus lividans. De bakterielle ekspresjonsvektorer trans-formeres inn i bakterievertsceller ved bruk av teknikker som er velkjente innen faget, som f.eks. kalsiumkloridbehandling, elektroporering og andre.

I én utførelse fremstilles pantropiske neurotrofiner i insektsceller. Ekspresjonsvektorer for transformasjon av insektsceller, og i særdeleshet baculovirusbaserte ekspresjonsvektorer, er velkjente innen faget. Utgangsstoffer og fremgangsmåter for baculovirus/insektscelleekspresjonssystemer er kommersielt tilgjengelige som sett, f:eks. "MaxBac"-settet fra Invitrogen i San Diego.

Rekombinante baculovirusekspresjonsvektorer er utviklet for infeksjon av flere typer insektsceller. For eksempel har rekombinante baculovirus blitt utviklet for Åedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melangaster, Spodoptera frugiperda og Trichopluaia ni.

Når de først er uttrykt, benyttes pantropiske neurotrofiner som neurotrofiske faktorer. Disse pantropiske neurotrofiner kan brukes i en rekke diagnostiske og terapeutiske anvendelser.

De pantropiske neurotrofiner ifølge foreliggende oppfinnelse er anvendbare i diagnostiske fremgangsmåter for påvisning av neurotrofinreseptorer. For eksempel kan de pantropiske neurotrofiner ifølge foreliggende oppfinnelse merkes. Med et "merket, pantropisk neurotrofin" menes heri et pantropisk neurotrofin som har tilkoblet minst ett grunnstoff, en isotop eller en kjemisk forbindelse som tillater påvisning av det pantropiske neurotrofin eller det pantropiske neurotrofin bundet til en neurotrofinreseptor. Generelt faller merkelapper inn i tre klasser: a) isotopisk merking som kan være radioak-tive eller tunge isotoper,- b) immunmerking som kan være antistoffer eiler antigener,- og c) fargede eller fluorescente fargestoffer. Merkingen kan innføres i det pantropiske neurotrofin i enhver posisjon. Når de først er merket, anvendes pantropiske neurotrofiner til påvisning av neurotrofinreseptorer, enten in vitro eller in vivo. For eksempel kan nærvær av neurotrofinreseptorer være en indikasjon på forekomst av visse celletyper, noe som er nyttig i diagnose. Det vil si at en subpopulasjon av visse celletyper kan demonstreres ved binding av det merkede, pantropiske neurotrofin til cellene via reseptorene.

I tillegg er de pantropiske neurotrofiner ifølge foreliggende oppfinnelse anvendbare som standarder i neurotro-finanalyser. For eksempel kan aktiviteten av et pantropisk neurotrofin i en gitt analyse bestemmes ved å benytte kjente neurotrofinstandarder, hvoretter det pantropiske neurotrofin kan benyttes i diagnose og kvantifisering av neurotrofiner.

Videre er de pantropiske neurotrofiner ifølge foreliggende oppfinnelse anvendbare som bestanddeler i dyrkningsmedier for bruk ved dyrkning av nerveceller in vivo, da mange nervecellekulturer krever vekstfaktorer. En fagmann vil forstå at de pantropiske neurotrofiner ifølge foreliggende oppfinnelse kan erstatte andre neurotrofiske faktorer som ofte benyttes som bestanddeler i dyrkningsmedier. Mengden som skal til-settes av de pantropiske neurotrofiner, kan lett fastslås ved bruk av gjengse analyser.

De pantropiske neurotrofiner ifølge foreliggende oppfinnelse er også anvendbare for fremstilling av antistoffer som kan benyttes ved diagnose, identifisering og lokalisering av neurotrofiner eller neurotrofinantistoffer i en organisme eller en pasient. For eksempel kan de pantropiske neurotrofiner benyttes for fremstilling av polyklonale eller monoklonale antistoffer, noe som er velkjent for fagfolk. Antistoffene kan så merkes og benyttes for å vise nærvær eller fravær av neurotrofinene. Således kan diagnose av neurale forstyrrelser forbundet med neurotrofiner, fastslås. Alternativt påvises antistoffene indirekte ved å benytte et sekundært antistoff. For eksempel kan primære antistoffer fremstilles i mus eller kaniner, hvoretter anti-mus- eller anti-kanin-antistoffer benyttes for påvisning av primærantistoffene. Alle disse fremgangsmåter, så vel som lignende fremgangsmåter som er velkjente innen faget, tillater påvisning av neurotrofiner i en rekke vev.

I tillegg er antistoffene som fremkalles mot de pantropiske neurotrofiner ifølge foreliggende oppfinnelse, anvendbare for rensing av neurotrofiner og pantropiske neurotrofiner. Da aminosyresubstitusjonene i de pantropiske neurotrofiner generelt er små, deler neurotrofinene og de pantropiske neurotrofiner mange immunepitoper. Således vil antistoffer rettet mot de pantropiske neurotrofiner, binde naturlig forekommende neurotrofiner og vil følgelig være anvendbare i rensing. For eksempel kan rensemetoder basert på affinitetskroma-tografiske teknikker, anvendes, noe som er velkjent innen faget.

I den foretrukne utførelse tilføres de pantropiske neurotrofiner ifølge foreliggende oppfinnelse til en pasient for behandling av neurale forstyrrelser. Med "neurale forstyrrelser" menes heri forstyrrelser i det sentrale og/eller perifere nervesystem som er forbundet med neurondegenerering eller

-skade. Spesifikke eksempler på neurale forstyrrelser omfatter, men er ikke begrenset til, Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, Huntingtons chorea, slag, ALS, perifere neuropatier og andre tilstander som særpreges ved nekrose eller tap av neuroner, enten sentrale neuroner, perifere neuroner eller motorneuroner, i tillegg til behandling av nerver som er skadet grunnet traumer, brannskader, nyresvikt eller nyre-skader. For eksempel kan perifere neuropatier forbundet med visse tilstander, f.eks. neuropatier forbundet med diabetes, AIDS eller kjemoterapi, behandles ved å benytte de pantropiske neurotrofiner ifølge foreliggende oppfinnelse. I tillegg forebygger tilførsel av NT3 in vivo degenerering av sentrale, noradrenerge neuroner i locus coerulus i voksne, i en modell som ligner mønsteret for celletap som forefinnes i Alzheimers sykdom (86). I tillegg har tilførsel av NT3 blitt vist å fremme

skuddskyting i kortikospinaltrakten under utvikling, så vel som etter ryggmargsskader hos voksne (58). Faktisk ble, ved tilførsel av NT3 med antistoffer som inhiberer myelinassosi-erte, vekstinhiberende proteiner, regenerering over lange av-stander observert. Således kan de pantropiske neurotrofiner _ ifølge foreliggende oppfinnelse benyttes i stedet for NT3 i denne anvendelse.

I denne utførelse tilføres en terapeutisk effektiv dose av et pantropisk neurotrofin til en pasient. Med "terapeutisk effektiv dose" menes heri en dose som gir den ønskede effekt. Den eksakte dose vil avhenge av forstyrrelsen som skal behandles, og vil kunne fastslås av en fagmann ved bruk av kjente teknikker. Generelt tilføres de pantropiske neurotrofiner ifølge foreliggende oppfinnelse i en dose på tilnærmet 1 ug/kg til tilnærmet 100 mg/kg pr. dag. I tillegg kan, som

kjent innen faget, justeringer for alder så vel som kropps-vekt, generell helsetilstand, kjønn, kost, tilførselstids-

punkt, medikamentinteraksjoner og sykdommens styrke, være nød-vendig og vil kunne fastslås ved rutineeksperimentering av en fagmann.

For foreliggende oppfinnelses formål omfatter en "pasient" både mennesker og andre dyr og organismer. Således er fremgangsmåtene anvendbare både for human terapi og for anvendelse av en veterinær.

Tilførsel av de pantropiske neurotrofiner ifølge foreliggende oppfinnelse kan utføres på en rekke måter, heriblant, men ikke begrenset til, oralt, subkutant, intravenøst, intracerebralt, intranasalt, transdermalt, intraperitonealt, intramuskulært, intrapulmonalt, vaginalt, rektalt eller intra-okulart. De pantropiske neurotrofiner kan tilføres kontinuerlig ved infusjon i væskereservoarene i sentralnervesystemet selv om bolusinjeksjon kan aksepteres, ved bruk av teknikker som er velkjente innen faget, f.eks. pumper eller implantering. I noen tilfeller, f.eks. ved behandling av sår, kan de pantropiske neurotrofiner tilføres direkte som en løsning eller spray.

De farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder pantropisk neurotrofin i en form som er egnet for tilførsel til en pasient. I den foretrukne utførelse foreligger de farmasøytiske preparater i en vannløselig form og kan omfatte ting som bærerstoffer, eksipienser, stabilisa-torer, buffere, salter, antioksidanter, hydrofile polymerer, aminosyrer, karbohydrater, ioniske eller ikke-ioniske, over-flateaktive stoffer og polyetylen- eller propylenglykol. De pantropiske neurotrofiner kan foreligge i en form som gir fri-gjøring over tid for implantering, eller kan være pakket i mikrokapsler ved bruk av teknikker som er velkjente innen faget.

Hensikten med de påfølgende eksempler er å beskrive mer detaljert bruk av oppfinnelsen beskrevet ovenfor, så vel som å beskrive de beste fremgangsmåter utarbeidet for utfør-else av forskjellige sider ved oppfinnelsen. Det bør forstås at disse eksempler på ingen måte har til hensikt å begrense oppfinnelsens sanne område, men snarere presenteres for illus-trerende formål.

Eksempler

Eksempel 1

Molekylær modellering av NT- 3 og identifisering av mål for mutasj onsanalyse

Koordinatene for den tredimensjonale struktur av muse-NGF ble erholdt fra N.Q. McDonald og T.L. Blundell. Molekylær modellering av humant NT-3 ble utført på en Silicon Graphics Iris arbeidsstasjon ved bruk av det interaktive pro-gram Insightll. Figurene av NT-3-strukturer ble fremstilt ved bruk av programmet MidasPlus (University of California, San Francisco).

Da den tredimensjonale struktur av muse-NGF (mNGF) ble tilgjengelig (59), ble en rasjonell tilnærming til den strukturelle basis for neurotrofisk funksjon ved bruk av pro-teinmodifiseringsteknikker mulig. Strukturen av NGF består av en tett forent dimer av to identiske polypeptidkjeder. Fold-ingen av hver monomer dannes av forlengede segmenter med vridde, antiparallelle p-plater sammenbundet med svinger. Molekylet har en forlenget form og gir en flat, hydrofobisk overflate som danner grensesnittet mellom de forenede monomerer (59). En slående egenskap ved strukturen er arrangemen-tet av disulfidbindingene som nå er kjent som cysteinknute-motivet (60) . Dette motiv finnes også i det ellers ubeslektede TGF-p (61); (60) og PDGF-BB (87). Flere områder i mNGF-strukturen, heriblant amino- og karboksyendene og løkken mellom aminosyrerestene 43 og 48, var dårlig definert, noe som antyder svært fleksible, strukturelle elementer.

Sekvensen av humant NT-3 (hNT-3) er 56% identisk og 70% lik mNGF (figur 1). Sekvensforskjellene forekommer hyppigst i den strukturelt udefinerte, N-terminale ende og i løkkeområdet mellom aminosyrerestene 43 og 48. Den relative posisjon av cysteinrestene er konservert, som den er i alle medlemmer av neurotrofinfamilien, noe som antyder forekomst av et tilsvarende cysteinknutemotiv i hNT-3. Sekvenslikheten mellom hNT-3 og muse-NGF antyder at begge har den samme basiske, tredimensjonale folding, og derfor ble mNGF benyttet som skjelett for hNT-3-modellen. I annet trinn av modellbyggingen ble sidekjeder som er forskjellige i mNGF og hNT-3, erstattet med hNT-3-aminosyrene ved bruk av InsightlI-programmet (Biosym Technology, San Diego, CA). Hvor det er mulig, ble konforma-sjoner av hNT-3-sidekjeder beholdt mest mulig like de i mNGF, ellers ble de basert på rotamerbiblioteker (62), pakkings- og hydrogenbindingsbetraktninger. Endelig ble innføyelse av Asn93 og påfølgende justering av løkken 93-95 modellert ved et søk i krystallstrukturene i Protein Data Bank (63). Den endelige modell består av 104 aminosyrer og omfatter ikke de seks N-terminale (Tyrl-Ser6), de fire C-terminale (Ile 116-Thr 119) og fem løkkerester (G44-V48). Denne modell tillater identifisering av aminosyrerester som sannsynligvis deltar i viktige strukturelle sammenhenger, noe som gjør at de bør ekskluderes fra mutasjonsanalyse. Disse aminosyrerester var enten invol-vert i grensesnittet (W2 0, F52, Y53, W99, W101) i strukturelt viktige hydrogenbindinger eller hydrofobe kontakter (S12, 130, Q50, P62, S83, R100, T106, S107), i disulfidbindinger (C15, C57, C67, C79, C108, C110) eller begravd i proteinets indre (V13, S16, S18, V21, D29, 130, V35, V37, 1102, 1104). I noen tilfeller vil det imidlertid være ønskelig å endre disse aminosyrerester. I tillegg ble glysin- og alaninrester ikke endret, bortsett fra Gly 44. I motsetning til beslektede studier av mNGF/trkA-interaksjoner ble hovedsakelig enkeltaminosyrerester eller par av aminosyrer substituert, snarere enn å utbytte flere aminosyrerester (53), (56), (55) eller delering av aminosyrerester (49). Aminosyrerestene ble hovedsakelig endret til alanin (64). I noen tilfeller var det mulig å modellere større aminosyrer som erstatninger i strukturen for å prøve å danne steriske hindringer for reseptor-ligand-interaksj onen.

Det første sett med mutasjoner ble utført for å undersøke både konserverte og ikke-konserverte aminosyrerester lokalisert hovedsakelig i p-plater, som er overflateeksponert og derfor mulige deltakere i binding til trkC- og gp75-reseptorene. Den gjeldende hypotese som er foreslått for NGF-funksjon (55), er at divergente aminosyrerester plassert i løkker som sammenbinder p-plater og polypeptidets ender, er de vik-tigste determinanter for reseptorbinding og -spesifisitet. Et andre sett av hNT-3-mutanter evaluerte betydningen av disse aminosyrerester for interaksjonen mellom hNT-3 og dets reseptorer. Det totale sett av mutanter dekket i det vesentlige hele overflaten av NT-3-molekylet.

Eksempel 2

Dannelse av spesifikke aminosyresubstitusjoner i NT3 og pantropiske NT 3

Humant NT-3 var tidligere klonet, sekvensert og sub-klonet i en vektor av pRK-type som tillater produksjon av dob-belt- og enkelttrådet DNA i E. coli, så vel som ekspresjon av modent NT-3 i et pattedyrsystem under kontroll av cytomegalo-viruspromoteren (65). Mutagenese av denne vektor ble utført ifølge fremgangsmåten til Kunkel (66), (67). Etter transfor-mering inn i E. coli-stammen XLl-Blue, ble koloniene gjennom-søkt for nærvær av den ønskede mutasjon ved å sekvensere enkelttrådet DNA ved bruk av "Sequenase" versjon 2.0-settet (U.S. Biochemical Corp.). Hele sekvensen som koder for modent NT-3, ble bekreftet for alle positive kloner. Dobbelttrådet DNA ble isolert fra XL-1 Blue med "Qiagen" DNA-rensingssettet (Qiagen Inc., Chatsworth, CA). Dette DNA ble deretter benyttet for transfeksjon av den føtale, humane nyrecellelinje 293 (68). Alle andre rekombinante DNA-manipuleringer ble utført som beskrevet (69). Velkjente teknikker benyttes for å danne primerne for alle mutasjonene. Primeren for D15A-mutasjonen

var 5'-GGTCACCCACAAGCTTTCACTGGCACATACCGAG-3<1> (SEKV.ID NR. 7),

og primeren for Sl-mutanten (N-terminalutbytningen av de 6 N-terminale aminosyrer i NT3 med de 7 N-terminale aminosyrer i

NGF) var 5'-GTACTCCCCTCGGTGGAAGATGGGATGGCTCGAGGACCGTTTCCGCCGT-G-3<1> (SEKV.ID NR. 8).

Ekspresjon av villtype- og mutante neurotrofiner

Plasmid-DNA som inneholdt den kodende sekvens for enten hNT-3 eller mutant hNT-3, ble innført i den humane, føtale nyrecellelinje 2 93 ved kalsiumfosfatutfelling (70). Cellene som var 75% konfluente, ble transfektert med 10 ug plasmid-DNA pr. 15 mm celledyrkningsskål og inkubert i 15 timer i medium tilsatt serum. Deretter ble mediet fjernet og utskiftet med serumfritt medium (PS04) tilsatt 10 mg/l rekombinant, bovint insulin, 1 mg/l transferrin og sporele-menter. Supernatanten ble oppsamlet etter 48 og 96 timer, konsentrert tilnærmet 20 ganger med centriprep-10-filtreringsen-heter (Amicon, Beverly, MA) og sterilfiltrert.

Kvantifisering av neurotrofinmutanter

Den spesifikke hNT-3-ELISA var basert på protein A-renset, polyklonalt antiserum fra marsvin (Genentech). Hver brønn i en 96-brønners plate ("MaxiSorp"; Nunc, Kamstrup, Dan-mark) ble belagt over natten ved 4 °C med 100 ul antiserum (4 ug/ml) i 0,05 M natriumkarbonatbuffer (pH 9,6). Etter et blokkeringstrinn på 1 time med blokkeringsbuffer (PBS + 0,5% BSA + 0,01% timerosal, pH 7,4) ble brønnene vasket seks ganger med ELISA-buffer (PBS + 0,5% BSA + 0,05% "Tween-20" + 0,01% timerosal, pH 7,4). Renset, rekombinant hNT-3 eller prøver av hNT-3-mutanter med ukjent konsentrasjon ble fortynnet med ELISA-buffer til et volum på 100 ul og tilsatt brønnene. Platene ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur under kontinuerlig omristing. Etter vask med ELISA-buffer ble brønnene inkubert med 100 ul biotinylert anti-hNT-3-antistoff (Genentech) i 2 timer og igjen vasket med ELISA-buffer. 100 ul 1:50 000 fortynnet streptavidin/pepperrotperoksidase (Zymed,

43-4323) ble tilsatt brønnene og inkubert i 30 minutter, fulgt av et vasketrinn med ELISA-buffer. Endelig ble fargen utviklet i 15-20 minutter med 100 ul PBS-løsning tilsatt 0,012% H202 og 0,04% o-fenylendiamin. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 50 ul 4,5 N H2S04. Absorpsjonen ble avlest ved 490 nm og 405 nm i en "Vmax" kinetisk mikroplateleser (Molecular Devices, Palo Alto, CA). Standardkurven ble bestemt ved å benytte renset, rekombinant hNT-3 (Genentech) ved konsentrasjoner på 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56 og 0,78 ng/ml. Prøvene med ukjent NT-3-konsentrasjon ble seriefortynnet 1:10, 1:30, 1:90, 1:270, 1:810, 1:2430, 1:7290 og 1:21870 for å erholde flere måleverdier pr. prøve. Standardkurven ble beregnet ved å benytte en fire-parameters tilpasning av måleverdiene erholdt fra analyse av standardproteinet.

Mengdene av NT-3-mutanter etter konsentrering varierte mellom 120 ng/ml og 36 ug/ml. ELISA-analysen kunne ikke påvise NT-3 i supernatanter fra narretransfekterte celler og kryssreagerte heller ikke med rekombinant, human NGF fra supernatanter fra NGF-transfekterte celler (måleverdier ikke oppgitt). For hvert sett med ekspresjon av NT-3-mutanter ble en ekspresjon av nativt hNT-3 utført og kvantifisert ved ELISA i parallell for å erholde en sammenlignbar vektkonsentrasjon for reseptorbindingsundersøkelser. Alle mutanter ble uttrykt, kvantifisert og analysert minst to ganger.

Jodering

Renset, rekombinant hNT-3, hBDNF og hNGF (Genentech) ble merket ved laktoperoksidasebehandling ved en modifisering av fremgangsmåten for "Enzymobead"-radiojoderingsreagenset (Bio-Rad) (71). Vanligvis ble 2 ug av neurotrofinene jodert til spesifikke aktiviteter i området 3 000-3 500 cpm/fmol. Merket stoff ble lagret ved 4 °C og benyttet innen 2 uker etter fremstilling.

Bindingsanalyser

Cellebaserte bindingsanalyser benyttet membranprepar-ater fra stabile cellelinjer som uttrykker rotte-trkC (NlH3T3/trkC, (26)). Konkurrerende forskyvningsanalyser ble utført som beskrevet tidligere (26). Mutanter ble analysert for bindingsaffinitet til trkC-reseptoren to ganger for hver av de mange ekspresjoner, med et duplikatsett av måleverdier. Denne fremgangsmåte tillot estimering av feilen i affinitets-bestemmelsen for hver av mutantene. Urenset, rekombinant NT-3 fra midlertidig uttrykkende celler ble sammenlignet med renset NT-3 for evnen til å forskyve 125-I-merket NT-3 fra trkC-reseptorer uttrykt på NIH/3T3-celler. Begge fortrengte merket NT-3 med lignende IC-50-verdier: 7 pM for urenset NT-3 og 9 pM for renset NT-3. Dette antydet at urenset NT-3 fra supernatanter fra uttrykkende 293-celler kunne kvantifiseres nøyak-tig og deretter benyttes for reseptorbindingsstudier. Bind-ingsanalysenes spesifisitet ble vist ved den manglende evne til NGF, BDNF og supernatant fra narretransfekterte celler til å fortrenge bundet, merket NT-3 fra trkC (resultater ikke vist).

Reseptor-immunoadhesinproteiner ble konstruert med bruk av ekstracellulære domener fra humant trkA, trkB, trkC og gp75 koblet til konstante domener fra immunoglobulin (Genentech, ikke publiserte resultater). En 96-brønners plate (Cor-ning, ELISA-brønnbånd) ble belagt med 100 ul anti-humant Fc-IgG F(ab')2 fra geit (5 ug/ml) (Organon Technika, West Chester, PA) i belegningsbuffer i 15 timer ved 4-8 °C. Væsken ble sugd ut av brønnene som ble vasket tre ganger med PBS og inkubert i 2 timer med 100 ul av en løsning med 40 ng/ml reseptor-immunoadhesinprotein i bindingsbuffer (Leibovitz's L-15-medium tilsatt 5 mg/ml BSA (Intergen, Purchase, PA), 0,1 mg/ml cytokrom C fra hestehjerte (Sigma) og 20 mM HEPES, pH 7,2). Etter et vasketrinn med PBS ble 50 ul bindingsbuffer umiddelbart tilsatt brønnene for å forhindre inntørking. Lagringsløsninger av hvert av de native og mutante proteiner ble seriefortynnet med bindingsbuffer for å gi et konsentrasjonsområde fra 4 096 - 2 pM. 25 ul seriefortynnet prøve ble tilsatt pr. brønn, fulgt av 25 ul merkede neurotrofiner. Sluttkonsentrasjonen av merkede neurotrofiner i hver brønn var tilnærmet 50 pM for trkA-, trkB- og trkC-analyser og 100 pM for gp75-bindingsanalyser. Etter 3 timers inkubering ved romtemperatur ble brønnene vasket med PBS + 0,5% "Tween-20", og bundet radioaktivitet ble målt. Alle fortrengningseksperi-menter ble analysert ved å benytte en fire-parameters til-pasningsprosedyre på settet av måleverdier med programvare-pakken "Kaleidagraph". Alle bindingsresultater i søylediagram-mer er uttrykt som IC-50mut/IC-50wt.

Stimulering av autofosforylering av trk- reseptorer på PC12-cellelinjer med neurotrofiske faktorer

Tilnærmet 1 x IO<7> celler ble behandlet ved 37 °C i

5 minutter med 25 ng/ml neurotrofin. NP-40-lyse på skålene og immunopresipitering med antiserum 443 (pan-trk) eller 656 (trkC-spesifikt) ble utført som tidligere beskrevet (26). Fos-fotyrosininnholdet ble analysert ved Western-overføring med det monoklonale antistoff 4G10 som tidligere beskrevet (23). 4G10 ble påvist som tidligere beskrevet (26).

Differensieringsanalyser på PC12- celler og PC12- celler som uttrykker trkB og trkC

Tilnærmet IO<3> PC12-celler som uttrykte de forskjellige trk-familiemedlemmer (trkC; (26), trkB; Soppet, ikke publiserte observasjoner), ble utsådd i 35 mm kollagenbelagte vevsdyrkningsskåler som inneholdt totalt 2 ml medium. PC12-celler som uttrykte trkC, ble analysert ved tre forskjellige konsentrasjoner (10 ng/ml, 1 ng/ml, 100 pg/ml), og utgangs-PC12-cellene som kun uttrykte trkA eller PC12-celler som uttrykte trkB, ble behandlet med supernatanter som inneholdt 10 ng/ml mutant NT-3. For hver behandling ble minst 200 celler tellet. Fraksjonen av neurittbærende celler ble bestemt ved å telle celler som hadde utvekster med lengde minst to ganger lengden av cellelegemet etter 3-4 dager. -

Disseksjon av embryovev og neuronkulturer

Kyllingembryoer i forskjellige utviklingstrinn ble erholdt ved å inkubere egg fra hvite Leghorn-kyllinger (SPAFAS, Reinholds, PA) ved 38 °C i en egginkubator i det på-krevde tidsrom. Dorsalrotganglier, "nodose"-ganglier fra embryodag 8 (E8) og sympatetiske ganglier fra embryodag 11 (Ell) ble dissekert i Leibowitz-15- (L-15) medium tilsatt lx penicillin/streptomycin ved å benytte urmakerpinsett og wol-framnåler laget skarpe ved elektrolyse. Embryoganglier fra kylling ble trypsinert ved 37 °C i 20 minutter og deretter vasket med dyrkningsmedium (F14 tilsatt 10% varmeinaktivert hesteserum og 5% varmeinaktivert, fatalt kalveserum) og så forsiktig finfordelt med en flammepolert pipette slik at en enkeltcellesuspensjon ble erholdt. Kyllingembryocellene ble utsådd i 35 ml skåler belagt med polyornitin (0,5 mg/ml i 0,15 M boratbuffer ved pH 8,6 over natten) og laminin (20 ml/ml i 4-6 timer ved 37 °C) i 2 ml dyrkningsmedium tilsatt 2 ng/ml neurotrofin, eller neurotrofin ved konsentra-sjonene oppgitt i figurteksten. Alle celler med neuronal mor-fologi som lå innenfor et kvadrat på 5x5 mm i sentrum av hver skål, ble tellet 72 timer senere.

Resultatene er vist i tabellene 3 og 4.

Eksempel 3

Fremstilling, rensing og karakterisering av N- terminale NGF-varianter

Flere ladede og uladede aminosyrerester er konservert hos NGF-proteiner fra forskjellige arter. Først og fremst er His4, Pro5 og His8 konservert i 7 av 8 kjente NGF-sekvenser, mens Arg9 kun eksisterer i human NGF og kylling-NGF, mens Met forekommer hyppigst i denne NGF-posisjon hos andre arter. 10 mutanter ble dannet ved oligonukleotidstyrt mutagenese som enten: 1) erstattet noen av de ladede aminosyrerester i den N-terminale ende av hNGF med alanin enten hver for seg eller samtidig, 2) erstattet His4 med negativt ladet asparaginsyre som foreligger i posisjon 3 i den N-terminale hBDNF-sekvens (65), eller 3) dannet kimære hNGF-molekyler som inneholdt de første 5 eller 6 aminosyrerester fra hBDNF hhv. hNT3, eller andre variable områder fra hNT3. De resulterende mutantkon strukter ble fremstilt i vektorer som inneholdt en human CMV-promoter (70) og ble forbigående uttrykt i humane 293-celler som beskrevet nedenfor.

Renset, rekombinant (1-118), (6-118) og (10-118) ble renset fra kondisjonert medium fra transfektert CHO-cellelinje ved bruk av reversfase-HPLC og høyytelses-ionebytterkromatografi som beskrevet av Burton et al. (1992) (48) og Kahle et al. (1992) (49), og karakterisert ved N-terminal sekvensanalyse, SDS-PAGE og aminosyreanalyse (resultater ikke vist). Disse prosesserte varianter dannes ved in situ-proteolyse under kondisjonering av CHO-cellemediene ved hittil ikke karakteriserte, proteolytiske enzymer eller prosesseringsveier. Renheten av hver form var 99% basert på SDS-PAGE, og konsentrasjonen ble bestemt ved kvantitativ aminosyreanalyse. Rensing og analyse av H4D-mutanten 2 (20 ug fra 300 ml medium) og den N-terminale hNT3/hNGF-mutant 6 (5 ug fra 300 ml medium) fra serumfritt medium kondisjonert med transfekterte 293-celler (se nedenfor), ble utført som nettopp beskrevet for variantene forkortet i den N-terminale ende.

Mutagenese ble utført ved den oligonukleotidstyrte fremgangsmåte (72) med de modifikasjoner som er angitt i "BioRad Muta-Gene"-settet (66), (BioRad, Richmond, CA). Muta-

sjonene ble bekreftet ved DNA-sekvensering av enkelttrådede fagmidkloner ved kjedetermineringsmetoden (73). hNGF-mutantene ble uttrykt i kondisjonert medium etter forbigående transfeksjon av humane 293-celler (68), (70). Mediet benyttet for oppsamling, var 50:50 F12/DMEM serumfritt medium tilsatt N2-supplement og ble oppsamlet etter 48 timers dyrkning i det serumfrie medium. Det kondisjonerte medium ble konsentrert 10 ganger med Amicon-konsentratorer. Konsentrasjonen av hNGF-mutantene ble bestemt ved en enzymkoblet immunoanalyse (ELISA) som benyttet rensede, polyklonale anti-hNGF-antistoffer fra kanin. Konsentrasjonen av mutantene varierte fra 3-8 ug/ml. Hver mutant ble uttrykt minst tre ganger, og konsentrasjonen ble bestemt ved ELISA 2-3 uavhengige ganger.

Mutantene ble også analysert ved metabolsk merking av transfekterte 293-celler (60 mm skåler, 1,2 ml medium) ved tilsetning av 200 uCi <3>SS-metionin og cystein (Amersham) . Etter 18 timer ble mediet oppsamlet og fikk reagere med enten poly-klonalt

anti-hNGF-antistoff fra kanin eller monoklonalt anti-stoff fra mus i 3-4 timer ved 4 °C, oppsamlet ved utfelling med protein A-kuler (Pharmacia) og påsatt 15% akrylamid SDS-PAGE-geler (Novex). Etter elektroforese ble gelene tørket og pålagt røntgenfilm. Umerkede mutanter ble fremstilt som beskrevet ovenfor, og porsjoner på 0,1 ug ble frysetørket, løst i SDS-PAGE-prøvebuffer, analysert ved elektroforese på de samme geler og overført til nitrocellulose ved bruk av gjengse fremgangsmåter (BioRad). Blottene ble behandlet med polyklonalt anti-hNGF-antistoff fra kanin eller monoklonalt anti-hNGF-antistoff fra mus over natten ved 4 °C og vasket, og mutantene ble påvist med alkalisk fosfatasekoblede anti-kanin- eller anti-muse-IgG-antistoffer fra geit.

Analyse fra reseptorbinding, trkA- autofosforylering og neurittutvekst i PC12- celler

[<125>I]hNGF ble fremstilt ved å benytte "Enzymobead"-fremgangsmåten (BioRad) ifølge fremgangsmåten til Escandon

(71). Den spesifikke radioaktivitet, bestemt ved TCA-utfelling av uttak av startreaksjonsblandingen og gelfiltreringskromatografert [<125>I]hNGF, var i gjennomsnitt 60-90 uCi/ug. Reseptor-bindingsanalyser ble utført over natten ved 4 °C i NIH3T3-celler som uttrykte rekombinante rotte-trkA-celler (erholdt fra dr. Luis Parada), p75-uttrykkende, humane melanomceller A875 (ATCC) og PC12-rotteceller (erholdt fra dr. Louis Reichardt) som beskrevet for trkB-uttrykkende NIH3T3-celler (23). Den benyttede konsentrasjon av NIH3T3-trkA-celler og A875-p75-celler var 1 x IO<6> celler pr. ml, og 5 x 10<5> celler pr. ml for PC12-celler. Sluttkonsentrasjonen av [<125>I]hNGF var 50 pM i et volum på 0,2 ml. Uspesifikk binding, definert som [12<S>I]hNGF bundet i nærvær av 1 x 10"s M umerket hNGF, varierte mellom 15-25% i de fleste tilfeller for NIH3T3-trkA-cellene, 20-35% for p75-A875-melanomcellene og 20-30% for trkA + p75 PC12-cellene målt ved filterbindingsanalysen. Måleverdiene ble tilpasset en forskyvningsisoterm, og IC50 ble beregnet ved å benytte en fire-parameters ligning med programmet "Kaleidagraph". I noen tilfeller ble reseptorbinding utført med celler ved 25 °C i 90 minutter, og bundet [125I]hNGF ble atskilt fra fritt ved sentrifuge-ring gjennom en sukrosepute.

Autofosforylering av trkA ble utført ved 37 °C i

5 minutter, og fosforyleringsomfanget ble bestemt ved en variasjon av fremgangsmåten beskrevet av Kaplan (19). "Triton X-100" lyserte trkA-celler ble immunoutfelt med monoklonalt antifosfotyrosinantistoff 4G10 immobilisert til agarosekuler (UBI), fraksjonert ved SDS-PAGE (8% akrylamid-Novex), immunoblottet og påvist med poly-klonalt anti-trkA-antistoff fra kanin (erholdt fra dr. David Kaplan). Påvisning av trkA ble utført med alkalisk fosfatase (AP)-koblet anti-kanin-IgG-anti-stoff fra geit (TAGO). PC12-celler ble dyrket til 20-30% konfluens i Primaria polykationiske 24-brønners plater, og mediet skiftet til serumfritt DMEM med høy glukose, tilsatt N2 med villtype eller mutante varianter av hNGF. Etter 48 timer ble antall celler med neuritter som var lengre enn to celle-legemer, tellet i et representativt synsfelt og uttrykt som prosent av totalt antall celler i feltet, vanligvis 100-140 celler. Aktiviteten av hver mutant og NGF-kontro11en ble bestemt minst to ganger i uavhengige eksperimenter. Prosent responsive celler ved maksimal hNGF-konsentrasjon varierte fra 55-75% mellom eksperimenter med gjennomsnittsverdi 63% beregnet fra 13 målinger. For å korrigere for variasjon i maksimalresponsen mellom eksperimenter, ble denne gjennomsnittsverdi benyttet til normalisering av alle måleverdier.

Inhibering av' [ 1251] hNGF- binding til trkA- og p75- celler med et monoklonalt antistoff rettet mot hNGF

Under de samme betingelser som i filterbindingsanalysen beskrevet ovenfor, ble økende konsentrasjoner av et monoklonalt-hNGF-ant i stoff tilsatt 25 pM [125I]hNGF og inkubert i 30 minutter ved 25 °C. Deretter ble 1 x IO<6> celler pr. ml av enten NIH3T3-trkA-eller A875-p75-celler tilsatt (0,2 ml sluttvolum) og inkubert ved 4 °C over natten under kraftig omristing. Prøvene ble så fortynnet, filtrert gjennom Whatman GF/C-filtre og tellet.

Resultater

Resultatene er vist i tabell 5 og 6.

For innledende karakterisering av de N-terminale aminosyrerester som er nødvendige for full hNGF-aktivitet, ble den (6-118)-forkortede form av hNGF isolert fra kondisjonert medium fra CHO-celler som uttrykte rekombinant hNGF. Varianten med ni fjernede aminosyrer (10-118)hNGF ble fremstilt ved begrenset proteolyse som beskrevet (48). (6-118)- og (10-ll8)hNGF ble renset ved høyytelsesionebytterkromatografi (HPIEC) og karakterisert ved reversfase-HPLC, N-terminal sekvensanalyse, SDS-PAGE og aminosyreanalyse (resultater ikke vist).

Den relative evne til renset (6-118)hNGF for fortrengning av [<12S>I]hNGF fra cellelinjer som uttrykker trkA, p75 og trkA + p75, ble så sammenlignet med evnen til (10-118)hNGF, (1-118)- eller (l-120)hNGF, og (l-118)mNGF (figur 9). Som antydet av disses ekvivalente bioaktivitet (74), viste innledende eksperimenter ingen forskjell i bindingsegenskaper for (1-118) sammenlignet med (1-120)hNGF (ikke vist). Relative IC50-verdier for hNGF og trkA (80-100 pM) , p75 (2-300 pM) og PC12-celler (50 pM) tilsvarer innen en faktor på 2-3 IC50- og Ka-verdiene rapportert av andre (49), (75), (76), (20, 21). I samsvar med Vroegop et al. observerer vi en noe høyere affinitet for hNGF til p75 enn den som vanligvis rapporteres (IC50 = 0,3 nM mot 1-2 nM) .

Delesjon av de første fem aminosyrer fører til

9 gangers tap av binding til NIH3T3-celler som uttrykker rekombinant rotte-trkA, mens små bindingsforskjeller foreligger med p75-uttrykkende, humane melanomceller A875 (ingen endring) eller med PC12-celler som uttrykker trkA + p75 (tre ganger). I motsetning til dette ble et 265 og 82 gangers tap av binding til trkA- hhv.'PC12-celler observert for (10-118)hNGF sammenlignet med (1-118)hNGF, mens et 10 gangers tap av binding til p75 foreligger. Den mellomliggende forskyvningsevne til (10-118)hNGF observert med PC12-celler, sammenlignet med trkA- og p75-celler, antyder bidrag fra begge reseptorer til forskyvningsisoterm-profilen (fig. 9C). Celler som uttrykker rekombinante rotte-trkA-celler og human NGF merket med radioaktivt jod, ble benyttet i denne undersøkelse, mens en tidligere undersøkelse av (10-118)hNGF av Kahle et al. (1992) benyttet celler som uttrykte humant trkA og muse-NGF merket med radioaktivt jod. Således observeres tilsvarende forskjeller mellom (1-118)hNGF- og (10-118)hNGF-binding uavhengig av om trkA og radioaktivt merket NGF fra menneske eller gnager benyttes i analysen. Videre har (1-118)hNGF 2-3 ganger større affinitet til både humant trkA og rotte-trkA enn (1-118)mNGF, uansett om radioaktivt merket NGF fra mus eller menneske representerer den fortrengbare markør. Autofosforylering av trkA (fig. 10) og PC12-celledifferensie-ringsaktivitetene (tabell 6) til (6-118)hNGF tilsvarte dem utløst av (1-118)hNGF. Imidlertid er (10-118)hNGF minst 10 ganger mindre aktiv enn (1-118)hNGF i trkA-autofosforylering og 80 ganger mindre aktiv for stimulering av neurittutvekst i PC12-celler (fig. 10, tabell 6), i samsvar med tidligere resultater (48), (49). Vurdert sammen, antyder disse resultater at de første fem N-terminale aminosyrer er viktige for full hNGF-trkA-bindingsaktivitet, mens kraftig reseptoraktivering og bioaktivitet i det vesentlige bibeholdes. Ytterligere tap av de neste fire aminosyrerester synes å være mer skadelig for trkA-binding og - aktivering, og har også noen virkning på binding til p75.

De mutante hNGF-former kan påvises ved metabolsk merking fulgt av immunoutfelling eller ved immunoblotanalyse av umerket, kondisjonert medium, og foreligger som fullt prosesserte polypeptider på 14 kD (fig. 11). Konsentrasjonen av hver av mutantene ble bestemt ved ELISA med et polyklonalt anti-hNGF-antistoff. Like ekspresjonsnivåer, sammen med forekomsten av i det vesentlige et enkelt prosessert protein som gjenkjennes av et polyklonalt antistoff i tre forskjellige typer immunoreaktivitet, antyder at mutantene har en strukturell stabilitet som tilsvarer den til vi11type-hNGF.

Erstatning av alle de tre ladede aminosyrer med alanin (Mut 4:H4A'+ H8A + R9A) førte til tap av påvisbar kompetitiv "forskyvning av [125I]hNGF fra trkA ved 4 °C over et konsentrasjonsområde av villtype-hNGF som ga fullstendig forskyvning av markøren (ICSo = 1 x 10"<10> M, maksimal forskyvning = l x IO"<9> M, fig. 12, øverst, tabell 5). Tap av reseptorbinding samsvarer med minst 10 gangers redusert aktivitet og 4-5 gangers tilsynelatende reduksjon i effektivitet for maksimal trkA-autofosforylering. Mutant 4 har 85 ganger lavere EC50 for PC12-differensiering enn (l-118)hNGF (fig. 14), i samsvar med PC12-reseptorbindingsprofilen som synes å vise fortrengning i det vesentlige fra p75 og en ikke-fortrengbar komponent, noe som kan være et resultat av lavere affinitet for binding av mutanten til trkA (fig. 12, nederst).

His4- og Arg9-varianter ble så analysert hver for seg. Det N-terminale område i både hNT3 og hBDNF inneholder et histidin, noe som antyder en mulig konservert, funksjonell rolle. Erstatning av His4 i hNGF med enten alanin (mutant 1) eller asparaginsyre (mutant 2) førte til et dramatisk tap av trkA-binding, autofosforylering og PC12-celledifferensiering (figurene 12, 13, 14). Som antydet av sekvensvariasjonen mellom hNGF og andre NGF-arter i posisjon 9, hadde mutasjonen R9A ingen stor virkning på trkA- og p75-aktiviteter. Imidlertid ble en noe lavere aktivitet observert for trkA-fosforylering og PC12-celledifferensiering (figur 12, øverst, i midten, figurene 13 og 14) . Ved 25 °C viste P5A- og H8A-variantene 3, hhv. 1,5 gangers tap av trkA-binding sammenlignet med hNGF, mens H4D ga tilnærmet 40 gangers tap av bindingsevne; ingen endring i binding til p75 ble observert. Alle mutantene ovenfor viste mindre enn 2 gangers tap av binding til p75 både ved 4 °C og 25 °C, noe som antyder at globale, strukturelle virkninger av mutagenesen er minimale.

For å analysere om den spesifikke, N-terminale sekvens i hNGF kreves for neurotrofininteraksjon med trkA, ble kimære mutanter (mutantene 5 og 6) dannet ved å erstatte den N-terminale ende av hNGF (SSSHPIF) med den N-terminale ende av hBDNF (HSDPA) eller hNT3 (YAEHKS). Disse mutanter bevarer således de dibasiske aminosyrerester His8 og Arg9 i hNGF. Selv ved 10 ganger høyere konsentrasjon enn den (1-118)hNGF-konsentrasjon som gir fullstendig fortrengning fra reseptoren ved 4 °C, var de resulterende, kimære neurotrofiner ute av stand til å fortrenge [<125>I]hNGF fra trkA (fig. 12A) og var mindre aktive enn mutantene 1 og 2 i utløsing av trkA-autofosforyleringsaktivitet (fig. 13). Bindingsinteraksjoner av disse mutanter med p75 kan ikke skilles fra de til (1-118)hNGF, mens PC12-reseptorfortrengningen i det vesentlige kan være en p75-interaksjon (fig. 12, nederst). På samme måte som trippelalaninmutant 4 var de N-terminale, kimære mutanter de svakeste utløsere av PC12-celledifferensiering sammenlignet med alle strukturelle varianter av hNGF, da IC50 var forskjøvet tilnærmet 100 ganger. Disse resultater antyder at den spesifikke, N-terminale hNGF-sekvens er påkrevet for høyaffini-tetsbinding og agonistaktivitet som involverer trkA, men ikke for binding til p75.

For å bekrefte at de N-terminale sekvensvarianter kan forhindre høyaffinitetsinteraksjoner mellom hNGF og trkA samtidig som totalstrukturen beholdes, ble H4D mutant 2 og hNT3/hNGF mutant 6 uttrykt i store mengder og renset. Ved den høyest mulige konsentrasjon, 2 000 ganger høyere (2 x 10"<7> M) enn IC50 for (1-118) hNGF (IC50 = 1 x 10"<10> M) , forekom kun 30% og 10% fortrengning av [<12S>I]NGF fra trkA ved 4 "C for mutant 2, hhv. mutant 6, mens bindingsprofilen til p75 var i det vesentlige uendret (fig. 15). I samsvar med resultatene vist i fig. 13, var de rensede mutanter vesentlig mindre aktive enn (1-118)hNGF ved evnen til å aktivere trkA-autofosforylering. Disse resultater antyder at den totale, strukturelle stabilitet bibeholdes ved disse aminosyreerstat-ninger og bekrefter at tap av høyaffinitets-trkA-binding og autofosforylering skyldes disse spesifikke modifikasjoner.

Kimære mutanter ble også dannet for en innledende sammenligning av rollene til to andre variable områder i hNGF som mulige determinanter for trkA-reseptorspesifisitet. 6 aminosyrerester i det variable beta-svingområdet 3 (Arg59-Ser66) og 7 aminosyrerester i det variable beta-svingområde 5 (Met92-Ala98) ble erstattet med de tilsvarende hNT3-aminosyrerester i mutant 7, hhv. 8. Mutant 7 var noe mer aktiv i forskyvning av [<125>I]NGF fra trkA enn hNGF, mens mutant 8 ble bundet mindre effektivt til p75 (3-5 ganger). Ellers viste disse mutanter små forskjeller fra hNGF i trkA- og p75-bindingsprofiler, evne til understøttelse av trkA-autofosforylering og PC12-neurittutvekst (figurene 12, 13, 14). Disse-resultater antyder at område 3 og 5 bidrar mindre til trkA-bindingsinteraksjonen enn det N-terminalen gjør. Den lavere affinitet av mutant 8 til p75 kan representere strukturelle endringer rundt den konserverte aminosyrerest Lys95 som er vist å interagere med p75 (54).

For å bestemme relative ekspresjonsnivåer av den fullt prosesserte form med Mr = 14 000 av de strukturelle hNGF-varianter, ble monoklonale og polyklonale antistoffer mot hNGF analysert for evne til å gjenkjenne mutanter ved immunoblotting (figurene 11 og 12). Når like mengder av de N-terminale mutanter uttrykt i kondisjonert medium ble immunoblottet, hadde flere av dem mistet evnen til å gjenkjennes av det monoklonale antistoff, mena alle ble gjenkjent av det affinitetsrensede, polyklonale antistoff. H4D-mutanten og de kimære hBDNF og hNT3 N-terminale mutanter viste intet immunoblotsignal, mens H4A + H8A + H9A-mutanten var mindre påvirket (fig. 16A). H4A- og R9A-mutasjonene påvirket ikke antistoffbinding. Det monoklonale antistoff ble så analysert for evne til å konkurrere med binding av [<125>I]NGF til trkA eller p75. Økende antistoffkonsentrasjoner inhiberte binding av [<125>I]NGF til begge reseptorer, og en ICS0 = 1 x IO"<9> M sammenlignet med 4 x IO"<8> M antyder at det er 40 ganger mer effektivt ved blokkering av binding av hNGF til trkA enn til p75. Disse resultater antyder at den N-terminale ende danner i det minste en del av epitopen til det monoklonale hNGF-antistoff og at binding av antistoffet til hNGF blokkerer interaksjonen med trkA med relativt høy affinitet. Den svakere inhibering av binding til p75 antyder enten at en epitop med lavere affinitet som ligger utenfor den N-terminale ende, kan bidra til hNGF-p75-bindings-kontakter, eller at sterisk inhibering av antistoffet delvis kan interferere med p75-binding. Foreløpige undersøkelser antyder at en svakere bindingsepitop for dette antistoff faktisk foreligger i beta-svingområdet 3 representert ved den kimære hNT3/hNGF-mutant 7. Dette områdets rolle for binding av hNGF til p75 og trkA blir for tiden undersøkt. Selv om det kan innvendes at tap av trkA-binding i nærvær av antistoffet skyldes binding til en sekundær epitop eller sterisk inhibering, er måleverdiene i samsvar med det preferensielle tap av trkA-binding sammenlignet med p75-binding som observeres for flere av de N-terminale varianter som er presentert ovenfor.

Eksempel 4

Dannelse og karakterisering av hNGF- aminosyrevarianter:

hNGF og hNT3- pan- neurotrofiner

Identifisering av målaminosyrerester for mutasjonsanalyse

NGF og neurotrofinfamiliemedlemmene NT3, BDNF og NT4/5 viser tilnærmet 56% sekvensidentitet. Reseptorbindings-spesifisiteten kan delvis bestemmes av aminosyresekvensfor-skjellene mellom medlemmene i neurotrofinfamilien. Disse aminosyrerester kan enten bindes direkte til trk-reseptoren, eller fungere som inhiberende begrensninger av trk-inter-aksjonene til andre variable eller konserverte aminosyrerester. Domeneutbytningsmutanter av hNGF ble dannet mellom hNGF og hNT3 for å analysere de divergente aminosyreresters rolle for bestemmelse av trk-reseptorspesifisitet. En sammenligning av neurotrofinenes primærsekvenser viser at det er 7 områder, hvert på 7-10 aminosyrer, som inneholder de fleste (80%) av sekvensforskjellene (figurene 8, 18A og 18B). Mellom hNGF og hNT3 er 52 av 120 aminosyrer forskjellige. 41 av disse 52 forskjeller (79%) foreligger innen de 7 divergente områder. Blant 9 NGF-typer omfattende menneske, fugler, slanger og frosker, er 24 av de 52 aminosyrerester konservert, noe som antyder at disse bidrar til trkA-bindingsspesifisiteten. En undersøkelse av røntgenkrystall-strukturen til NGF fra mus viser at fire av de variable områder/domener strukturelt karakteriseres som beta-svinger, mens ett variabelt område er en beta-plate, og de to siste er amino-og karboksyenden. Hvert av de divergente områder inneholder flere ladede og polare sidekjeder som er tilgjengelige for løsemiddel og i stand til å interagere med reseptorer. 13 kimære eller domeneutbytningsmutanter ble dannet ved å erstatte flere eller alle aminosyrerester i hvert av de syv variable områder i hNGF med det tilsvarende domene fra hNT3. Ytterligere to områder med mindre divergens ble også erstattet: det prevariable område 1 og 4. Således ble totalt 90% av de divergente aminosyrerester evaluert for deres rolle ved bestemmelse av trkA- og trkC-spesifisitet. De kimære mutanter ble dannet ved oligonukleotidstyrt mutagenese og ekspresjon i pattedyrceller som beskrevet i eksempel 3.

Seleksjon av enkeltaminosyrerester i hNGF for mutagenese ble hovedsakelig bestemt ut fra deres posisjon i røntgen-krystallstrukturen til NGF fra mus. Det ble antatt at sekvensforskjellene mellom NGF fra mus og menneske fører til minimale, strukturelle endringer, da de erstattede aminosyrerester hovedsakelig er funksjonelt konservert (10/12). Datamaskin-modellering av NGF fra mus, basert på røntgenkrystallstruktur-koordinatene som beskrevet i eksempel 1, viser aminosyrer som sender sidekjeder inn i løsemidlet og som kan interagere med trkA- og gp75-reseptoren. Noen av disse omfatter variable aminosyrerester som ble signifikant modifisert ved domeneutbyt-ningsmutasjonene, men imidlertid representerer mange aminosyrerester som er konservert mellom hNGF og hNT3 i variable og konserverte områder. Aminosyrerester som forventes å ha minimal sidekjedeeksponering, f.eks. dem som deltar i dannelse av det dimere grensesnitt (F12, V14, W21, F4 9, Y52, F54, W76, T85, F86, W99, F101, T106, A107, V109, Vill), hydrofobe indre (V36, V38, F53, 171, A89, 1102 og 1104) og strukturavhengig og indre hydrogenbinding (Q51, S78, T91, R100), ble minimalt modifisert. Av de disulfidbindingsdannende cysteinrester og glysiner og alaniner ble kun A97 modifisert. Unntak ble gjort i følgende tilfeller: aminosyrerestene 130 og Y52 som har overflateside-kjeder selv om de foreligger i dimergrensesnittet, aminosyrerestene L39, L90, M92 og A97 som også danner et hydrofobt overflateområde, og D16, K25, D30, E55, K57, R59, R69, D72, H75 som viser en viss grad av sidekjedeeksponering til løsemidlet selv om de deltar i hydrogenbindinger. De fleste aminosyrerester ble endret til alanin (64) ; i noen tilfeller ble andre erstatninger utført for å bevare strukturen samtidig som det ble analysert for en spesifikk funksjonsrolle i reseptorinteraksjoner.

Fremstilling og reseptorbindingskarakterisering av hNGF- varianter

Mutagenese, ekspresjon og proteinkarakterisering av hNGF-varianter ble utført som beskrevet i eksempel 3. Etter oligonukleotidstyrt mutagenese ble alle mutanter bekreftet ved dideoksynukleotidsekvensering. hNGF-mutantene ble uttrykt i humane 293-celler (figur 11A, B), og etter Amicon-konsentrering (10X) og ELISA-kvantifisering viste det seg at de fleste hNGF-varianter ble uttrykt i nivåer som tilsvarer nivået for normale hNGF-kontroller (5-25 ug/ml), med unntak av mutanter hvor de variable områder 2 og 3 var erstattet (0,6-1 pg/ml). Begge disse kimære molekyler førte til innføyelse eller delesjon av prolin-rester og til andre signifikante endringer i sidekjedefunksjona-litet, og de lave gjenvinninger kan således reflektere strukturell ustabilitet. Ikke desto mindre tillot de tilgjengelige mengder bestemmelse av hNGF-variantenes bindingsaffinitet til trkA- og gp75-reseptoren. Bindingsaffiniteten for hver hNGF-variant ble bestemt ved konkurransebinding med immunoadhesjons-konstrukter av trk- og gp75-reseptoren (88) og neurotrofiner merket med radioaktivt jod som beskrevet i eksempel 2. Hver hNGF-variant ble uttrykt i 293-celler minst to ganger, og bindingseksperimentene ble utført 2-3 ganger for hver transfeksjon. Den relative affinitet sammenlignet med normalt hNGF, uttrykkes som forholdet mellom gjennomsnittlig IC50-verdi for en variant og IC50 for hNGF.

Bioanalyse av trkA- autofosforyleringsaktivitet og PC12- celle-differensiering

Biokjemisk aktivering av trkA-kinase av hNGF-varianter ble bestemt ved å anslå trkA-autofosforylering som beskrevet i eksempel 3. En kvantitativ analyse som tillater doseavhengig bestemmelse av EC50 for trkA-autofosforylering, ble utviklet (89). En trkA-reseptorvariant som inneholder en peptidepitopmerkelapp avledet fra et Herpes simplex overflateprotein, ble stabilt uttrykt i CHO-celler i 96-brønners plater (88). Affiniteten av det epitopmerkede trkA for hNGF er identisk med den normale reseptors affinitet (88). Cellene (brønner in duplo for hver konsentrasjon) stimuleres med 8 økende konsentrasjoner av hNGF-variant (10 pM-10 nM) i 10 minutter ved 37 °C. Cellene lyseres med "Triton X-100"-lysebuffer som beskrevet i eksempel 3, og overføres til en plate belagt med et monoklonalt antistoff rettet mot epitopmerkelappen. Etter binding får innfanget trkA reagere med et HRP-konjugert, monoklonalt antifosfotyrosinantistoff, og fargereaksjonen får utvikles. Absorbansen måles så og plottes mot konsentrasjonen. EC50 for hNGF er 100-120 pM. Differensiering av PC12-celler ble utført som beskrevet i eksempel 3, men imidlertid ble cellene først dyrket eller initiert i NGF i 7-10 dager. Celler med'neuritter ble så høstet og utsådd i 24-brønners skåler "i normalt dyrkningsmedium i nærvær eller fravær av hNGF-variant. Prosent celler med neuritter etter 72 timer ble kvantifisert som beskrevet i eksempel 2. hNGF/hNT3-pan-neurotrofiske varianter ble evaluert for hNT3-lignende trkC-bioaktivitet i trkC-transfekterte PC12-celler som ikke responderer på hNGF (erholdt fra dr. Pantelis Tsolfous og dr. Luis Parada, NCI).

Resultater

Mutagen analyse av variable aminosyrerester i hNGF/ hNT3- kimære

13 kimære mutanter ble dannet ved å erstatte flere eller alle aminosyrerester i hvert av de 7 variable hNGF-områder med det tilsvarende område fra hNT3 (se figurene 8, 18A, B). To mindre variable områder, ett i beta-plate A og det andre i en konservert beta-sving som sammenbinder beta-platene B og C, ble også erstattet. Konkurransebindingseksperimenter ble utført med hNGF-variantene for forskyvning av [<125>I]hNGF fra trkA- eller gp75-immunoadhesjons-fusjonsproteiner. Disse reseptorer inneholder det ekstracellulære domene fra trkA eller gp75 og Fc-området fra humant IgG. Disse immunoadhesjoner binder hNGF med affiniteter som tilsvarer holo-trkA- og -p75-reseptoren og viser en tilsvarende rangering av affiniteter for neurotrofinene (figur 19A, B) . Gjennomsnittsverdien for IC50 for hver hNGF-variant ble uttrykt i forhold til IC50 bestemt for normal hNGF (ICS0 hNGF = 100 pM, figur 23A). Den mest vesentlige virkning på trkA-bindingen er, som tidligere beskrevet (figurene 12, 15), nesten 3 00 gangers tap av bindingsaffinitet som et resultat av N-terminal domeneutbytning med hNT3. Et 2-3 gangers bindingstap observeres for de tre aminosyreendringer i det prevariable område 1 (beta-plate A: V18E + V20L + G23T). Mindre enn to gangers tap av trkA-binding observeres for andre hNGF-varianter, mens forhøyet binding observeres for den kimære mutant i variabelt område 3 (beta-sving 3) og den C-terminale ende (figur 20A). I samsvar med tap av trkA-bindingsaffinitet viser dose-responskur-ver for trkA-autofosforylering og PC12-celledifferensiering (neuritt-utvekst) tap av aktivitet for variantene i den N-terminale ende og det prevariable område 1 (figur 2IA, B). Binding til gp75 er redusert 5 og 7 ganger ved utbytning av variabelt område 1, hhv. prevariabelt område 4 fra hNT3 (figur 20B). Et 2J3 gangers tap av gp75-binding observeres også for

mutanten i variabelt område 5. Tapet av gp75-binding som følge av VI-utbytningen skyldes sannsynligvis utbytning av K32 til R, K34 til H og E35 til Q, da alaninerstatning av disse aminosyrerester fører til tap av gp75-binding (figur 8; (54)). Disse resultater viser at bindingsinteraksjoner mellom hNGF og trkA og gp75 involverer noen av de variable neurotrofinaminosyrerester.

Tap av trkA-binding og reseptoraktivering antyder at de variable aminosyrerester i den N-terminale ende og prevariabelt område 1 bidrar til trk-reseptorspesifisitet. Denne mulighet ble analysert ved å bestemme reseptorbinding til trkC-IgG-immunoad-hesjon og neurittutvekst i trkC-transfekterte PC12-celler som ikke responderer på NGF. Overraskende nok ble ikke trkC-interaksjoner overført med den N-terminale ende av hNT3 (mutant 6, figur 22A, B), men imidlertid førte utbytning av 4 aminosyrer i variabelt område 4 i hNGF (T81K, H84Q, F86Y, K88R) til en signifikant interaksjon med trkC (figur 22A, B). Den lavere trkC-affinitet og virkning på neurittutvekst for denne variant antyder at andre områder sannsynligvis bidrar til effektive trkC-interaksjoner. Mutanten i prevariabelt område l evalueres nå for trkC-interaksjoner, likeledes bidraget fra., de enkelte aminosyrerester i variabelt område 4. Imidlertid antyder overlappende mutasjoner innen variabelt område 4 at flere aminosyrerester i V4 kan være nødvendige for trk-spesifisiteten. For eksempel aktiverer beta-sving 3/4-varianten hvor tre variable aminosyrerester som overlapper ved T81K (S73, Y79Q, T81K) erstattes, neurittutvekst i trkC-PC12-celler med en effektivitet som kun er 5-10% av effektiviteten til mutanten i variabelt område 4 (figur

22B). Ikke desto mindre påvirkes trk-funksjonen av alaninmutanten Y79A + T81A, noe som ytterligere antyder at de variable områder i dette område deltar i trk-reseptorinteraksjoner. De bevarte trkA-aktiviteter i mutanten i variabelt område 4 antyder at de 4 hNT3-aminosyrerester er kompatible med trkA-binding, men imidlertid

kan de ekvivalente hNGF-aminosyrerester føre til en inhibitorisk begrensning av interaksjonen mellom hNGF og trkC.

Selv om de N-terminale domener i neurotrofinene ikke synes å være generelle trk-spesifisitetsdomener, ser det ut til at dette område i hNGF er en vesentlig determinant for trkA-interaksjon. Erstatning av de første seks aminosyrerester i NT3 med de første syv aminosyrerester fra hNGF fører til en pantropisk variant som binder og aktiverer både trkA og trkC med høy affinitet og effektivitet (figurene 24, 25 og 26). Videre bibeholder varianten høyaffinitetsbinding til gp75. Det kan således være mulig å fremstille et effektivt trkA/trkC-pantropisk neurotrofin med utgangspunkt i hNT3 ved å inkludere variable områder fra hNGF, f.eks. den N-terminale ende, V2, V3, V4 og V5. Omvendt kan hNGF modifiseres slik at den besitter tilsvarende trkA/trkC-pantropiske egenskaper ved å erstatte variable aminosyrerester som ligger i hNT3-beta-plate 1 (Cl) og V4. Selv om hNGF/hNT3-kimæren hvor variabelt område 2 er erstattet, ikke førte til opprettelse av trkC-aktivitet, førte den til et lite tap av trkA-binding (1,5 ganger). Den omvendte domeneutbytning hvor variabelt område 2 i hNT3 erstattes med det tilsvarende hNGF-domene, analyseres nå for overføring av trkA-aktivitet og er en kandidat for et trkA/trkC-pantrofin.

Mutageneseanalyse av variable og konserverte enkeltaminosyrerester i hNGF: En strukturell modell for hNGF- aminosyrerester som interagerer med trkA og gp75

Ved å benytte krystallstrukturen for NGF fra mus som beskrevet ovenfor, evaluerte vi ved punktmutagenese 45 aminosyrerester i hNGF, hvorav mange har sidekjedefunksjonaliteter som er eksponert for løsemidlet og som kan delta i interaksjoner med trkA eller gp75. Konkurransebindingsanalyse viser at mutasjoner i H4, P5A, S13, D30, 131, Y52, R59, R69, Y79, T81 og R103 påvirker trkA-binding 1,8-10 ganger, mens muta-

sjoner i aminosyrerestene E41, K57, D72, N77 gir 1,5-2 ganger forhøyet binding (figur 27) .. Disse resultater antyder at disse aminosyrerester deltar i trkA-interaksjoner og antyder at varianter med endret trk-spesifisitet kan dannes både fra de variable (H4, P5, 131, R59, Y79, T81) og konserverte (S13, D30, Y52, R69, R103) aminosyrerester. Mutasjoner i aminosyrerestene F12, 131, K32 + K34 + E35, K50, Y52, R69, K74, H75, K88, L112, S113, R114 og K115 fører til 3->50 gangers tap av gp75-binding (figur 30). Spesielt ble ingen fortrengning observert i nærvær av 10 nM mutanter som representerer endringer i aminosyrerestene F12, K32 + K34 + E35, Y52, R69, K88 og R114 + K115, noe som antyder at disse aminosyrerester er kritiske determinanter for gp75-binding.

Autofosforyleringsanalyse med epitopmerket trkA antydet 1,5-6 gangers redusert aktiveringsevne som en følge av mutasjoner i aminosyrerestene H4, P5, D30, Y52, R69, Y79 + T81 og RI03 (figur 28). Signifikant (20-60%) redusert innvirkning på trkA-autofosforylering observeres for alle disse mutasjoner, bortsett fra aminosyrerest F12. Disse resultater er i samsvar med virkningen på PC12-celledifferensiering; 2-50 gangers reduksjon i EC50 for neurittutvekst observeres for mutasjoner i aminosyrerestene H4, F12, D30, Y52, R69, Y79 + T81 og R103. Andre hNGF-varianter evalueres for tiden, heriblant mutasjoner i P5. Det er av interesse at aminosyrerester hvor mutasjoner gir minimal påvirkning av både trkA-binding og virkning på trkA-autofosforylering, kan redusere effektiviteten av trkA-autofosforylering. Den reduserte trkA-autofosforylering kan forklare den reduserte virkning på PC12-celledifferensiering som en følge av mutasjoner i R69 og Y79 + T81. Alternativt kan mutasjoner i R69 føre til svært redusert p75-binding, rollen til p75 i hNGF-signaloverføring er foreløpig uklar, og tap av p75-interaksjon kan tenkes å bidra til redusert biologisk virkning. Denne mulighet undersøkes for tiden med andre hNGF-varianter med redusert binding av hNGF til gp75.

Aminosyrerester som interagerer med trkA- og gp75-reseptoren, ble modellert ved datamaskinassistanse med utgangspunkt i strukturen til NGF fra mus. To hovedområder som interagerer med trkA, ble funnet ved denne analyse: 1) Den N-terminale del (H4, P5) med ukjent krystallstruktur, og 2) en flate dannet av Y79, T81, H84 og R103 i beta-platene C og D. Aminosyrerestene V18, V20, G23, Y52, R59 og R69 i beta-plate A og B bidrar til en utvidet overflate som kan pakkes rundt beta-platetrådene. Nær området for aminosyrerestene Y52 og beta-plate A ligger D3 0 og 131 i den andre protomer. Disse to aminosyrerester sender et relativt lite overflateareal inn i løsemidlet, det er imidlertid mulig at de bidrar til en kontinuerlig bindingsoverflate som dannes av beta-platerestene.

To hovedområder som interagerer med p75, ble funnet: 1) Variabelt område 1 i én protomer og beta-plate B og C i den andre protomer, 2) konserverte aminosyrerester i den C-terminale ende og beta-sving 3, også fra forskjellige protomerer. I motsetning til de trkA-interagerende aminosyrerester i en kløft dannet av beta-plateparet, ser aminosyrerestene som interagerer med p75, ut til å være godt eksponert. Som vist i (54), stikker K32 og K34 ut fra det variable område i beta-hårnålssving 1. Vi finner at de to nærliggende aminosyrerester K50 og Y52 fra den andre protomer bidrar til p75-binding. K88 som bidrar i vesentlig grad til p75-binding, ligger i dette område, men er ikke svært eksponert. Den andre bindingsoverflate består av K74 (beta-sving 3), R114 og K115 (den C-terminale ende) fra én terminal, og F12 og R69 fra den andre protomer.

Andre mulige pantropiske molekyler konstrueres og evalueres nå, basert på mutageneseanalysen presentert ovenfor. Et pan-trkA/trkC-molekyl kan dannes ved følgende endringer i hNGF: 1) prevariabelt område 1 {V18E + V20L + G23T) pluss variabelt område 4 (Y79Q + T81K + H84Q + F86Y + K88R); 2) prevariabelt område 1 pluss minimale aminosyrerestendringer i variabelt område 4. Et pan-trkA/trkC-molekyl kan dannes ved å utføre minimale endringer i de første syv aminosyrerester i den N-terminale ende av hNGF og erstatte de første seks aminosyrerester i hNT3. Da H4 og P5 er konservert i NGF og to hydrofobe aminosyrerester i posisjonene 6 og 7 er konservert, er følgende varianter fremstilt: 1) YASHPIF-hNT3; 2) YAHPIF-hNT3; 3) YASHPIS-hNT3; 4) YAEHPIF-hNT3; 5) YAQHPIF-hNT3. Et trkA/trkC-pantrofin kan dannes ved å erstatte variabelt område 2 eller 4 eller 5, eller kombinasjoner av disse elementer, i hNT3 med de tilsvarende områder fra hNGF. Et trkA/trkB-pantrofin kan dannes ved å erstatte de første 9 aminosyrerester i hNT4/5 med de første syv aminosyrerester fra hNGF, eller i kombinasjon med erstatning av aminosyrerester i variabelt'område 4 eller prevariabelt område 1.

Referanser

(1) : Snider, W. D. & Johnson, E. M. (1989) Ann. NeuroL, 26,489-506

(2) : Barde, Y.-A. (1989) Neuron, 2.1525-1534

(3) : Davies et al., J. Neuroscience, 6, 1897 (1986)

(4) : Davies. A. M, Trends in Genetics, 139-143 (1988)

(5) : Maisonpierre, P. C, Belluscio, L.. Squinto, S., Ip, N. Y., Furta, M. E., Lindsay, R. M. og Yancopoulos, G. D. (1990) Science 247,1446-1451 (6) : Rosenthal A, Goeddel, D. V.. Ngyuen, T., Lewis, M., Shih, A., Laramee, G. R., Nikolics, K., og Winslow, W. (1990) Neuron 4,767-773

(7) : Hohn, A., Leibrock, l. Baiiey, K., og Barde, Y.-A, Nature. 344,339-341,J 990

(8) : Kaisho Y. Yoshimura, K og Nakahama, K. (1990) FEBS Lett. 266.187-191

(9) : Emfors. P.. Ibanez, C.F.. Ebendal. T., Olson, L.. og Persson, H. (1990) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87.5454-5458

(10) : Jones, K. R. ag Reichhardt, L. F. (1990) Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 87,8060-8064

(11) : Levi-Montalcini, R. og Angeletti, P. U. (1968) Physiol. Rev., 48,534-569

(12) : Thoenen H.t Bandtlow, C. og Heumann, R. (1987), Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol., 109.145-178

(13) : Barde, Y.-A.. Edgar, D. og Thoenen, H. (1982) EMBO J., 1,549-553

(14) : LcilirocM-,LottSDeich,F.,Hofar^ Barde, Y.-A. (1989) Nature. 341.149-152

(15) : HolbAJk,F eta).,(1991)Neuron.6,845-858

(16) : Berkemeier, L R, Winslow, J. W., Kaplan, D. R, Nikolics, K„ Goeddel, D. V. og Rosenthal. A (1991) Neuron. 7.857-866 (17) : lp. N. Y.. Ibanez, C. F.. Nye, S. R, McClain. J.. Jones, P. F., Gies, D. R.. Belluscio, L., LeBeau, M. M., Espinsosa, R., hl, Squinto, S. P., Persson, H. og Yancopoulos, G. D. (1992) Proe. Nati. Acad. Sei , 89,3060-3064 (18) : Maron-Zanca,D..Osl^R,h^G..CopdaiKl,T. og Barbacid,M.(1989).MoLCefl. Biol.,9.24-33

(19) : Kaplan. DR.. Marttn-Zanca, D., og Parada, L. F. (1991) Nature, 350, 158-160

(20) : Klein, R., Jing. S., Nanduri. V.. ffRourke. E., og Barbacid, M. (1991a) Cell 65,189-197

(21) : Kaplan, DJ^.HenTpstead,B..Maiun-Za«^D.,Chao1M.,pg Parada. L.F. (1991) Science 252,554-558 (22) : Klein, R.. Nanduri, V.. Jing. S., Lamballe. F.. Tapley. P., Bryant, S., Cordon-Cardo. C, Jones. K.R., Reichardt, L.F., og Barbacid, M. (1991b) Cell 66,395^03 (23) : Soppet. D., Escandon, E., Maragos. J., Middlemas, D. S., Reid, S. W., Blair. J.. Burton, L. E., Stanton, B. R.. Kaplan, D. R., Hunter. T., Nikolics, K„ og P«rada, L. F. (1991) Cell. 65,895-903 (24) : Squinto. S. P., Stilt, T. N., Aldrich, T. R, Davis, S., Bianco, S. M.. Radziejewski, C, Glass, D. J., Masiakowski, P., Furth, M. E., Vaknzuela, D. M., DiStefano, P. S. og Yancopoulos, G. D

(1991) Cell, 65, 885-893

(25) : Umballe,F.,Klein,R og Barbacid (1991), Cell, 66,967-979

(26) : TsouUas, P., Soppet, D., Escandon, E., Tessarollo, L., Mendoza-Rarnirez, J.-L., Rosenthal, A., Nikolics, K. og Parada, L. F. (1993) Neuron. 10,975-990 (27) : Cordon-Cardo, C, Tapley, P., Jing, S.. Nanduri, V., 0'Rourke, E., Lamballe, F., Kovary, K., Klein, R.. Jones, K. R., Reichhardt, L. F. op Barbacid. M. (1991), Cell, 66,173-183

(28) : Klein, R., Lamballe, F., Bryant, S., og. Barbacid, M. (1992) Neuron 8.947-956

(28a): Klein, R., Parada, L. F., Coulicr, F og Barbacid. M. (1989), EMBO J., 8.3701 -3709

(29) : lp. N. Y, Stitt, T. N., Tapley. P., Klein, R., Glass, D. J.. Fandl, J., Greene, L. A., Barbacid, M. og Yancopoulos, G. D. (1993) Neuron. 10,137-149 (30) : Johnson, D., Lanahan, A., Buck, C. R., SehgaJ. A., Morgan, C, Mercer, E., Bothwdl, M. og Chao, M. (1986) Cell. 47, 545-554 (31) : Radeke, M. J., Misko, T. P., Hsu, C. Herzenberg. L. A. og Shooter (1987) Nature. 325, 593-597 (32) : Loetscher. H., Pan. Y.-C.E.. Lahm. R-W.. Gente, R., Brockhaus, M., Tabuchi, H.. og Lesslauer, W.

(1990) CeU 61.351-359 (33) : Smith, C.A., Davis. T., Anderson, D., Solam, L., Beckmann. M.P., Jerzy, R., Dower, S.K., Cosman, D , og Goodwiii, R G. (1990) Science 248,1019-1023 (34) : Schall, T.J.. Lewis, M.. Koller, K.J.. Lee, A, Rice, G.R., Wong, G.RW., Gatanga, T., Granger, GA, Lentz, R., Raab, R, Kohr, W.J,, og Goeddel, D.V. (1990) Cell 61.361-370

(35) : Mallet, S., Fossum, S., og Barclay, AN. (1990) EMBO J. 9.1063-1068

(36) : Canwrini, D., Walz, G., Loenen, W.A.M., Borst, J., og Seed, B. (1991) J. Immunol., 147,3165-3169

(37) : Stamenkovic, L, Clarke, E.A. og Seed, B. (1989) EMBO I 8.1403-1410

(38) : BothwcU.M. (1991) Cell, 65.915-918 (39) : -Chao. M. V. (1992) Neuron. 9,583-593

(40) : Connolly et al.. J. Cell. Biol. 90:176-180 (1981)

(41) : Skaper og Varan. Brain Res. 197:379-389 (1980)

(42) : Yu, et al., J. Biol. Chem. 255:10481-10492 (1980)

(43) : Haleqoua. et al., Cell 22:571-581 (1980)

(44) : Tiercy et al., J. Cell. Biol. 103:2367-2378 (1986)

(45) : Hefti, J. Neurosci. 6:2155 (1986)

(46) : Korsching, TINS s. 570-573 (Nov/De sl986)

(48): Burton, L.E., Schmelzer, C.H., Szonyi, E., Yedinak. C. og Gorrell, A. (1992) J. Neurochern. 59,1937-1945 (49) : Kahle, P„ Burton, L. E., Schmelzer, C. R. og Hertel, C. (1992) J. Biol. Chcm, 267, 22707-227 J 0 (50) : Maisonpierre, P. C, Belluscio, L., Friedman, B., Alderson, R. F., Wiegand, S. J., Furth, M. E, Lindsay, R. M. og Yancopoulos. G. D. (1990b). Neuron, S, 501-509

(51) ; Kalcheim, C, Carmeli, C. og Rosenthal, A. (1992) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89.1661-1665

(52) : Hory-Lee, F., Russell. M.. Lindsay og Frank. E. (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 90,2613-2617

(53) : Ibanez. C, Ebendal, T., og Persson. R (1991) EMBO l 10,2105-2110

(54) : Ibanez, C.F.. Ebendal. T., Barbany, G., Murray-Rust, J.. Blundell. T.L., og Persson, R (1992) Cell 69.329-341

(55) . Ibanez, C.F.. Ilag. L.L.. Murray-Rust, J., og Persson. R (1993) EMBO J. 12,2281 -2293

(56) : Suter. U., Angst. C, Tien. C.-L,. Drinkwater, C. C, Lindsay, R M.og Shooter, E. M. (1992) J. Neurosci.. 12.306-318

(57) : Scopes. R.. Protein Purification. Springer-Verlag, NY (1982)

(58) : Schnell, L., Schneider. R., Kolbeck, R, Barde. Y.-A og . Schwab, M. E. (1994), Nature. 367.170-173 (59) : McDonald, N. Q., Lapatto. R., Murray-Rust, J., Gunning. J., Wlodawer, A. oe Blundell, T. L. (1991) Nature, 354,411-414

(60) : Schlunegger, M. P og Gr_tter, M. G. (1992), Nature, 358,430-434

(61) : McDonald, N. Q. og Rendrikson, W. A. (1993), Cell, 73.421-424

(62) : Ponder. J. W. og Richards. F. M. (1987) J. Mot. Biol.. 193.775-791

(63) : Bernstein, F. C, Koetzle, T. F., Williams, G. J. B., Meyer, Jr., E. F., Brice, M. D.. Rodgers, J. R, Kennard, O.. Shimanouchi. T. og-. Tasumi, M (1977) J. Mol. Biol.. 112,535-542

(64) : Cunningham, B. C. og Wells, J. A. (1989) Science, 244.1081-1085

(65) : Rosenthal. A.. Goeddel, D.V.. Nguyen. T., Martin. E., Burton, L.E.. Shih, A. Laramee, G R, Wurrn. F.. Mason, A,Nikolics, K.,og Winslow, J. W. (1991) Endoerinol. 129,1289-1294

(66) : Kunkel, T. A. (1985) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82.488-492

(67) : Kunkel et al. 1987

(68) : Graham, F.L., Smiley. J.. Russell, W.C.. og Nairn, R. (1977) J. Gen Virol. 36,59-77

(70) : Gorman. C. M., Gies, D. R. oe McCray, G. (1990) DNA Protein Eng. Tech., 2,3-10

(71) : Escandon,E., Burton, L.E.. Szonyi,E, og Nikolics. K. (1993) J. Neurosci. Res. 34,601-613

(72) : Zollcr, M.J. og Smith. M. (1983) Methods in Enzymol. 100,468-500

(73) : Messing, J„ Crea, R.. Seeburg, P. (1981) Nucleic Acids Res. 9,309

(74) : Schmelzer, CR, Burton, LE., Chan. W.P., Martin, E., Gorman, C. Canova-Davis, E., Ling. V.T., Sliwkowskl, M.B.. McCray. G.. Briggs, LA, Nguyen, T.R. og Polastri, G. (1992) J. Ncurochem. 59,1675-1683 (75) : Vroegop. S., Decker, D.. Hinzmann, 1., Poorman, R., og Buxser, S. (1992) I. Protein Chem. 11.71-82 (76) : Sutter. A., Riopelle. RI., Hartis-Wattick, R.M, oe Shooter. E M. (1979) I. Biol. Chem. 254. 5972-5982

(77) : Thoenen. H og Barde. Y.A. (1980) Physiol. Rev.. 60.1284-1325

(78) : Lindsay. R.M.. Thoenen. H. og Barde, Y.-A. (1985) Dev. Biol., 112, 319-328.

(79) : Barres et al 1994, manuskript innlevert for publisering

(80) : Davies et al., (1993), J. Neuroscience 13:4215-4223 (1993)

(81) : Sheltonetal.,IDeseTd3er,1984),Proc.NaU. Acad. Sei. USA 81:7951-7955

(82) : Shelton et al., (April, 1986), Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:2714-2718

(83) Rosenthal et al., (1990), Neuron, 4:767-773

(84) : Hulme, E.C. og Birdsall, M.J.M, Strategy og Tactics in Receptor Binding Studies, s.63-212 i Receptor-Ligandmteracuons, red. E.C.Hulme

(85) : Grote et al., Eur. J. Biochem. 204:745-749 (1992)

(86) : Arenas et al.. Nature 367.368-371 (1994)

(87) : Oemeret al., EMBO J., 11:3921-3926 (1992)

(88) : Shelton et al.. (1994), manuskript innlevert for publisering

(89) : Sadick et al.. (1994), manuskript innlevert for publisering

Claims

1. Pantropisk neurotrofinpolypeptid, hvori substitusjonen gir trkB-binding, slik at det D15-substituerte pantropiske hNT3 binder til trkB og trkC, og D16-substituert hNGF binder til trkB og minst to andre neurotrofinreseptorer utvalgt fra gruppen bestående av trkA, trkC og gp75, karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens til humant NT-3(hNT-3) eller human NGF (hNGF) med en aminosyre substituert i aminosyreposisjon tilsvarende D15 i hNT3 eller D16 i hNGF.

2. Polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at substitusjonen er en alaninrest.

3. Polypeptid ifølge krav 2, karakterisert ved at det omfatter en alaninrest substituert i en posisjon tilsvarende D15 i hNT3.

4. Polypeptid ifølge krav 3, karakterisert ved at det er D15A hNT3.

5. Polypeptid ifølge krav 3, karakterisert ved at det videre omfatter en substitusjon av dets første seks aminosyrer med en av de følgende aminosyresekvenser: (1) de første seks aminosyrene i NGF; (2) YAEHKS; (3) YASHPIF; (4) YAHPIF; (5) YASHPIS; (6) YAEHPIF; og (7) YAQHPIF.

6. Polypeptidet ifølge krav 2, karakterisert ved at det omfatter en alaninrest substituert i en posisjon tilsvarende D16 hNGF, hvori polypeptidet binder til trkB, trkA og gp75.

7. Polypeptid ifølge krav 6, karakterisert ved at det er D16A hNGF.

8. Polypeptid ifølge krav 6, karakterisert ved at det videre omfatter en substitusjon i pre-variabelt område 1 aminosyrene V18, V20 og G23, og minst én substitusjon i et variabelt område 4 aminosyre Y79, T81, H84, F86 eller K88 for å gi trkC-bindingsaktivitet, slik at det substituerte D16A-hNGF i tillegg binder trkC.

9. Polypeptid ifølge krav 8, karakterisert ved at det omfatter D16A, V18E, V20L, G23T, Y79Q, T81K, H84Q, F86Y og K88R-substitusjoner.

10. Polypeptid ifølge krav 6, karakterisert ved at det videre omfatter en substitusjon i aminosyreposisjonene E41, K57, D72 eller N77 for å øke trkA-binding.

11. Polypeptid ifølge ethvert av kravene 1-10, karakterisert ved at det omfatter en kovalent heterodimer eller en kovalent homodimer.

12. Isolert nukleinsyre, karakterisert ved at den koder for et polypeptid ifølge ethvert av kravene 1-11.

13. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den inneholder nukleinsyren ifølge krav 12.

14. Vertscelle, karakterisert ved at den inneholder nukleinsyren ifølge krav 12.

15. Fremgangsmåte for fremstilling av polypeptidet ifølge hvert av kravene l-ll, karakterisert ved at den omfatter å utsette en vert inneholdende en nukleinsyre som koder for nevnte polypeptid for betingelser som tillater ekspresjon av nevnte polypeptid.

16. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter polypep-tidet i ifølge ethvert av kravene 1-11 i blanding med en farmasøytisk akseptabel eksipient.