CN1153528A - 泛向神经营养因子 - Google Patents

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Abstract

提供了具有多重神经营养特异性的泛向神经营养蛋白。本发明的泛向神经营养蛋白可用于治疗神经元疾病。还提供了编码泛向神经营养蛋白的核酸和表达载体。

Description

泛向神经营养因子
发明领域
本发明涉及在神经组织尤其神经元的生长、调控或维持中所相关的蛋白质。具体地，本发明涉及泛向的、具有多重神经营养特异性的神经营养因子(MNTS变异体)。发明背景
脊椎动物神经元的存活和分化功能的维持受称为神经营养蛋白(neu-rotrophin)的特异性蛋白的影响。发育中的神经元的存活取决于来自其靶区域中这些因子的供应，而且神经营养蛋白的限量产生可导致多余神经元的死亡(参见文献(1)，(2))。各种不同神经营养蛋白功能上的差别在于：其支持在中枢和外周神经系统中各种神经元群存活的能力不同〔(3)，(4)，(5)，(80)〕。
神经营养蛋白家族是一个高度同源的家族，它包括NT3〔(6)，(7)，(5)，(8)，(9)，(10)〕、神经生长因子(NGF)〔(11)，(12)〕、脑衍生神经营养因子(BD-NF)〔(13)，(14)〕和神经营养蛋白4/5(NT4/5)〔(15)，(16)，(17)〕。
研究暗示，神经营养蛋白通过已知的trk(一类含酪氨酸激酶的受体，Mr＝140-145,000)的配体依赖性激活作用而转导细胞内信号〔(18)，(19)，(21)，(20)，(22)，(23)，(24)，(25)，(26)〕。因此，神经营养蛋白的信号转导途径是由这种对特异性的酪氨酸激酶受体的高亲和性结合和激活，随后导致受体自磷酸化而引起的〔(19)，(27)〕。尽管在神经营养蛋白和不同trk之间存在某种程度的交叉受体(cross-receptor)相互作用，主导的特异性似乎是NGF/trkA、BDNF/trkB和NT3/trkC，而NT4/5似乎与BDNF同样有效地主要与trkB作用〔(27)，(19)，(21)，(25)，(22)，(28)，(18)，(28a)〕。尽管trkC独特地对NT3产生应答〔(25)，(26)〕，但是trkA和trkB在特定条件下可以在体外应答多种神经营养蛋白。〔(6)，(23)〕。然而，神经元环境的确会限制trkA和trkB对非优选神经营养配体的应答能力(29)。除了trk受体家族，神经营养蛋白还可与称为“p75低亲和NGF受体”的一类不同受体结合〔p75，(30)，(31)〕，它的跨膜信号传导机制未知，但是在结构上与包括肿瘤坏死因子受体(TNFR)、CD40、0×40和CD27在内的受体基因族相关〔(32)，(33)，(34)，(35)，(36)，(37)〕。gp75在神经营养蛋白的高亲和性结合位点的形成以及信号转导途径中作用还不清楚〔参见(38)，(39)〕。
对神经营养蛋白的一级氨基酸序列的检查揭示，有7个含7-10残基的区域造成家族成员中85％的序列差异。
神经生长因子(NGF)是120个氨基酸的多肽同源二聚体蛋白，它在外周神经系统的感觉神经元和交感神经元的发育中起主要作用。NGF通过应答神经元上的特异性细胞表面受体而作用，以支持神经元存活、促进轴突产生和增强神经化学分化。NGF的作用是通过神经元膜〔(40)，(41)〕、神经元蛋白的磷酸化状态〔(42)，(43)〕和某些mRNA和蛋白质的冗余的变化而完成的，从而在神经元分化和功能中起作用(参见例如(44))。
前脑胆碱能神经元也应答NGF，而且需要NGF以得到营养支持(45)。事实上，NGF的分布和个体发生以及在中枢神经系统(central nervous system，CNS)中它的受体都暗示，NGF作为基础前脑胆碱能神经元的靶衍生神经营养因子而发挥作用〔(46)，(81)〕。
对于与trkA-酪氨酸激酶受体相互作用所需的NGF氨基酸残基，人们所知甚少。用纯化的人和鼠NGF同源二聚体观察到生物活性和受体结合的大缺失，这代表了在氨基端和羧基端修饰的同源截短形式〔(47)，(48)，(49)〕。与(1-118)hNGF相比，含109个氨基酸的种类(10-118)hNGF(通过缺失的重组人NGFN末端前9个残基和C末端后2个残基的纯化而得到)，在将鼠〔125I〕NGF从人trkA受体上置换下来方面的效率低300倍(49)。与(1-118)hNGF相比，它在背根神经节和交感神经节存活方面的活性低50-100倍(48)。(1-118)hNGF有相对较低的trkA酪氨酸激酶自磷酸化活性(49)。
在各种外周组织(例如肾、肝、皮肤)以及中枢神经系统(例如小脑、海马)中观察到NT3转录〔(5)，(7)，(82)〕。在发育中，NT3 mRNA转录在中枢神经系统中进行神经元增殖、迁移和分化的区域是最显著的(50)。在神经元发育中发挥作用的有关证据包括：NT3对神经冠细胞的促进效应(51)和体内对少突神经胶质细胞前体细胞增殖的刺激(79)。NT3还可在体外支持来自结状神经节(no-dose ganglion，NG)的感觉神经元〔(7)，(5)，(83)〕和背根神经节(dorsal rootganglion，DRG)的肌肉感觉神经元群的存活(52)。除了这些体外研究之外，最近的报道显示，在模拟Alzheimer氏病中发现的细胞丧失的模型中，NT3在体内可防止成人中枢中蓝斑的去甲肾上腺素能神经元的退化。目前，还没有有关trkC结合所需的氨基酸残基方面的出版报道。
在创建嵌合的或泛神经营养蛋白方面进行的尝试很有限〔(53)，(56)，(54)，(55)〕。发明概述
本发明的一个目的是用重组DNA技术提供泛向神经营养蛋白并产生有用量的这种泛向神经营养蛋白。
本发明的另一目的是提供编码泛向神经营养蛋白的重组核酸、含有编码泛向神经营养蛋白的核酸的表达载体和宿主细胞。
本发明的另一目的是提供产生泛向神经营养蛋白的方法，以及治疗病人的神经元疾病的方法。
根据上述目的，本发明提供了重组泛向神经营养蛋白、以及分离的或重组的编码本发明神经营养蛋白的核酸。还提供了含有可操作地连于转录和翻译调控DNA的、编码泛向神经营养蛋白的DNA的表达载体，以及含有该核酸的宿主细胞。
另一方面，本发明提供了产生泛向神经营养蛋白的方法，它包括：培养已用表达载体转化的宿主细胞，使编码泛向神经营养蛋白的核酸表达以产生重组神经营养蛋白。
此外提供的是通过将本发明的神经营养蛋白施用给病人而治疗神经性疾病的方法。
通过下列与附图结合的详细描述和所附的权利要求书，本发明的其他目的和特征对于本领域的技术人员而言是显而易见的。附图的简要描述
图1显示了鼠NGF(SEQ.ID.NO.1)和人NT3(SEQ.ID.NO.2)之间的高度同源性，这样可基于NGF的三维结构来塑造NT3。箭头指出的是β链。β链的命名同McDonald et a1.(1991)(59)。在NGF和NT3之间不同的氨基酸用灰色框标出。结构不同的部分用斜线框标出。
图2A、2B、2C、2D和2E显示了选定的突变体对背根神经节神经元的存活以及PC12/trkC细胞上轴突延伸方面的生物效应。E9小鸡DRG神经元在含NT3或突变体的293细胞的条件培养基中培养72小时。由突变体诱导的应答用NT3应答的百分比表示。A)5ng/ml NT3、R103A/D105A和R103A，B)1ng/ml NT-3、R103M、R103K、N1、Y51A，C)0.2ng/ml NT3、Y11A、T22Q和K80A Q83A。误差是3个测量值的均方差(SD)。从各数据点中扣减掉来自模拟转染细胞介质的应答，对200pg/ml、1000 Pg/ml、5000Pg/ml试验的扣减值分别为23％、23％和29％。(D)由含有NT3或R68A突变体的条件培养基诱导的PC12/trkC细胞应答。用不同剂量的神经营养蛋白诱导的具有轴突的细胞的百分比。对所有剂量的NT3和R68A而言，具有和不具有轴突的细胞总数是恒定的。(E)DRG神经元的存活情况。由NT-3、R68A或R114A/K115A诱导的应答用存活细胞的数目表示。结果是3个测量值的平均值±SD。由模拟转染的条件培养基诱导的应答被从各数据点中扣减掉，为20±4存活细胞。
图3A、3B和3C显示了NT3与其受体trkC和gP75的结合表位。显示了NT3模型，其中来自单体A和B的结合决定簇分别用浅灰和深灰色表示。(A)对trkC受体的抗原决定簇，(B)trkC抗原决定簇的侧视图。D15和Y51的位置相对于trkC结合决定簇。(C)对gp75受体的抗原决定簇。
图4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I和4J显示了筛选BDNF和NGF等活性更高的NT3突变体的情况。PC12细胞或表达trkB的PC12细胞系被接种在包被有胶原蛋白的培养皿上。用补充有BDNF(A)、NT3(B)、突变体D15A(C)或模拟转染的293细胞的上清液(E)的PC12培养基处理PC12/trkB细胞系。用补充有NGF(F)、NT3(G)、S1(H)、D15A(D)、MNTS-1(I)或模拟转染的293细胞的上清液(J)的PC12培养基处理PC12细胞。在处理3天后对代表性区域进行拍照。
图5A、5B、5C和5D显示，MNTS-1高亲和性地与人trkA、trkB和trkC结合。在恒定量标记神经营养蛋白(对trkA、trkB和trkC为50pM，对gP75为100pM)和数量增加的未标记竞争物存在下，测定用受体免疫粘附素(im-munoadhesin)的置换曲线。(o)hNGF，(△)hBDNF，(□)NT-3，(▲)MNTS-1，(X)S1，(＋)D15A。(A)将125I-NGF从人trkA上置换出。(B)将125I-BDNF从人trkB上置换出。(C)将125I-NT3从人trkC上置换出。(D)将125I-NT3从人gp75上置换出。
图6A、6B和6C显示了由MNTS-1诱导的trkA、trkB和trkC的自磷酸化。在37℃将PC12变异细胞暴露于25ng/ml的神经营养蛋白和突变体5分钟，然后按试验程序中所述进行分析。(A)PC12细胞对不加入因子、加入NGF、NT-3、S1、D15A、MNTS-1和模拟转染的293细胞上清液的应答。(B)PC12/trkB细胞对不加入因子、加入NGF、BDNF、纯化的NT-3、表达的NT-3、D15A和模拟转染的293细胞上清液的应答。(C)PC12/trkC细胞对不加入因子、加入NGF、NT-3、D15A、S1、MNTS-1和模拟转染的293细胞上清液的应答。在神经营养蛋白下方的数字显示了用于免疫沉淀的抗血清的类型，443是泛trk抗血清，656是trkC特异性抗血清。
图7显示，MNTS-1具有与NT-3/BDNF/NGF混合液一样的对DRG神经元存活的影向力。DRG神经元存活依赖于剂量。在NT3/BDNF/NGF(1∶1∶1)混合液(●)和MNTS-1(▲)下存活的细胞数目。结果是3个测量值的平均值±SD。MNTS-1(虚线)和混合液(实线)的数据符合四参数方程。计算出的MNTS-1和混合液的EC-50值分别为36pg/ml和44pg/ml。
图8显示了不同的神经营养蛋白的同源性、可变区和恒定区。显示了NFG(SEQ.ID.NO.3)、BDNF(SEQ.ID.NO.4)、NT3(SEQ.ID.NO.5)和NT4/5(SEQ.ID.NO.6)，其中可变区被框出。
图9A、9B和9C显示了通过增加纯化的N末端修饰的hNGF的浓度，从trkA、p75或trkA＋p75受体中竞争置换〔125I〕hNGF的情况。上面(12A)、中间(12B)和下面(12C)图分别代表了从表达trkA、p75和trkA＋p75受体的MH3T3、A875细胞和P12嗜铬细胞瘤中进行置换的情况。竞争性配体如图所示：(●-●)111/111＝(10-118)hNGF同源二聚体；(○-○)118-118＝(1-118)hNGF同源二聚体；(▲-▲)115-115＝(6-118)hNGF同源二聚体；(-)鼠NGF＝(1-118)mNGF同源二聚体。如实施例中所述，受体结合在4℃进行并分析。所示的数据是总结合(特异和非特异的结合)并且是每个细胞系的至少3次单独结合试验的平均值。该试验的IC50示于表5。
图10A和10B显示了由N末端截短的hNGF诱导的trkA的自磷酸化情况。上图(10A)显示了p140trkA条带的自磷酸化强度是hNGF变异体摩尔浓度的函数，而下图(10B)显示了用反射密度仪测定的各条带的光密度的数值。自磷酸化的p140trkA条带是在用抗磷酸酪氨酸(antiphosphotyrosine)免疫沉淀之后通过在硝酸纤维素膜上的抗trkA免疫印迹而确定的。所示的数据是两次独立试验的平均值。
图11A和11B显示了hNGF突变体的表达和蛋白分析。图A为用SDS-PAGE分离的代谢标记的突变体1-8(描述请参见表1)的放射自显影图。变异体瞬时性地在人293细胞中表达并用35S甲硫氨酸和半胱氨酸标记。用纯化的兔抗-hNGF多克隆抗体免疫沉淀条件培养基，按实施例中所述方法通过SDS-PAGE分析沉淀物。标记Wt或B的泳道代表分别单独用野生型(1-120)hNGF表达载体或AdVA载体对细胞的转染。图B是对约0.1微克非标记突变型或野生型hNGF的Western免疫印迹分析。在平行于上述的代谢标记细胞时进行的转染后，从条件培养基中采集样本。同图A中所述的相同抗-hNGF多克隆抗体免疫进行免疫印迹。结果与同次试验中平行进行被免疫印迹的突变体的变化测量值进行比较，并且与特异hNGF单克隆抗体反应，如图18所示。标记NGF的泳道代表来自0.1微克纯化的(1-120)hNGF的信号。两个图的左侧标出了以千道尔顿(kD)表示的分子量标记物的相对泳动率。
图12A、12B、12C、12D、12E和12F显示了通过增加纯化的hNGF突变体的浓度，从表达trkA(上图，12A和B)、p75(中图，12C和D)和p75＋trkA(下图，12E和F)的细胞中竞争性置换〔125I〕hNGF的情况。为了清楚起见，对各细胞系将数据分成2个图。为了比较相对结合亲和力，在一次试验中的每个细胞系都测试4个突变体和hNGF野生型对照。两个图中的每一个都代表来自一次转染的至少两个独立的结合试验和来自另一次转染的一个结合试验。如实施例中所述，结合试验在4℃进行。总结合示于图12。相对野生型hNGF的IC50列于表5。
图13A和13B显示了由hNGF突变体引发的trkA的自磷酸化。上图(13A)是用所示浓度的突变或野生型hNGF刺激表达trkA的细胞后p140trkA的放射性自显影。trkA自磷酸化的水平如图10进行测量。下图(13A)是对上述放射自显影用密度仪进行定量分析。数据是在一次试验中比较所有突变体引发的trkA自磷酸化的至少两个试验的平均值，它与比较每个hNGF试验中3-4个突变体的其他试验的数据是一致的。
图14显示了用PC12细胞轴突产生确定的hNGF的生物活性。PC12细胞在所示浓度的突变型或野生型hNGF存在下生长48小时。在给定显微镜区域中延伸出轴突的总细胞的百分比，如实施例所述用与(1-118)hNGF引发的最大应答的校正值表示。所示的数值是每个突变体的至少两个测量值的平均值。
图15A、15B、15C、15D和15E显示了对纯化的N末端区域突变体的定性研究。1微克纯化的H4D突变体2(泳道1)、纯化的hNT3/hNGF N-末端嵌合突变体6(泳道2)、部分纯化的(1-120)hNGF(泳道3-N)的SDS-PAGE(15％丙烯酰胺)的银染结果，以及以千道尔顿表示的分子量标记物(泳道4)。纯化和分析的细节在材料和方法章节B中给出。用纯化的H4D突变体2、hNT3/hNGFN-末端嵌合突变体6和纯化的(1-120)hNGF竞争性地置换〔125I〕hNGF。上图(15B)是对表达trkA的NIH3T3细胞的结合，下图(15D)为对A875细胞(p75)的结合。上图(15C)为如图10和13一样用抗磷酸酪氨酸免疫印迹检测的p140trkA自磷酸化的浓度依赖性(M)。下图(18E)表示了免疫印迹数据的密度仪测量数据。
图16A和16B显示了单克隆抗体与hNGF的N末端区域的相互作用。A.对0.1微克突变体1-6和8(突变体7因浓度低而被删去)、hNGF(wt)和对照转染条件培养基(B)的免疫印迹。将条件培养基上样于SDS-PAGE，免疫印迹于硝酸纤维素膜，然后与抗-hNGF单克隆抗体14.14反应。突变体的相对泳动率显示为14kD。B.通过增加图A中所用的相同单克隆抗体的浓度，从表达tr-kA或表达p75的细胞中竞争性置换25pM〔125I〕hNGF。
图17是根据鼠NGF的X光衍射晶体结构而得出的hNGF单体的示意图，它显示了一级氨基酸序列(SEQ.ID.NO.3)、二级结构的基本特征和突变修饰的残基。带黄色阴影的残基是在hNGF和hNT3之间不同的残基，并且当结构域交换时由相应的hNT3残基替换hNGF中的残基。靠近5-8个阴影残基的大黑体数字指出了特定神经营养蛋白可变区域。这些可变区域还包括氨基端和羧基端。红色阴影残基为那些单独或成对突变的残基，而且是大多暴露于溶剂的氨基酸。
图18A、18B和18C显示了hNGF的组织构成。图18A描绘了在hNGF一级序列中可变结构域的位置。图18B描绘了hNGF的可变结构域嵌合突变体，它含有一个hNT3可变结构域。图18C即清单，列出了在给定的突变体中被hNT3置换的hNGF的各个残基。
图19A和19B显示了用于分析hNGF结构变异体的新受体结合程序的特性。A)基于trkA-IgG免疫吸附分析的结合特性与用那些在NIH3T3细胞系中表达的全trkA受体的结合特性之间的比较。trkA-IgG竞争性结合图与全trkA细胞系的竞争性结合图(20A)很相似，而且trkA-IgG显示出相同的神经营养蛋白选择性(20B；NGF＞＞NT3＞BDNF)。目前所示的结合数据利用了各个trkA、B、C或p75-IgG免疫吸附分析。各种变异体的受体结合特性在全-trkA细胞结合分析中加以证实。
图20A和20B显示了hNGF/hNT3嵌合突变体与trkA-IgG和gp75受体的结合。突变体的相对亲和力用竞争性结合曲线上突变体的IC50与hNGF的IC50的比值进行绘制。所示的平均比值来自3次独立的结合试验。NGF/NT3 N末端结构域交换的突变体(突变体6)导致trkA结合的大部分丧失而gP75结合却不受影响。这些结果与在4℃于细胞上进行全-trkA结合试验中获得的数据是一致的(图18B、C)。含有NT3的第一个β转角的嵌合突变体(突变体10和19)与gp75的结合能力低了4倍。用丙氨酸置换第一个β转角(突变体21)或C末端(突变体24)中的碱性残基导致gp75结合的大部分丧失。
图21A和21B显示了hNGF/hNT3嵌合突变体分别引发trkA酪氨酸激酶自磷酸化和PC12细胞轴突产生的能力。用hNGF、hNT3或hNGF/hNT3结构域交换的嵌合突变体刺激表达trkA的CHO细胞，然后用磷酸酪氨酸-ELISA分析(OD450/650)测定自磷酸化。与trkA结合一致，用N末端hNGF/hNT3嵌合突变体可刺激少量trkA自磷酸化。在前β-转角1区域(V18、V20、G23)中的结构域交换导致活性降低2-3倍，这表明这些残基在确定NGF-tr-kA特异性方面可能发挥作用。对于PC12细胞分化，对所有突变体都测定产生轴突的EC50，并以与hNGF的EC50的比值形式表示。同样，在N末端hNGF/hNT3结构域交换的突变体中观察到最大效应，但是在前β-转角1区域也观察到生物活性的下降，这与trkA结合和自磷酸化是一致的。
图22A和22B显示了hNGF/hNT3结构域结合突变体的泛神经营养活性。活性通过trkC-IgG竞争性结合和在trkC转染的PC12细胞中产生轴突试验而测定。〔125I〕hNT3的竞争性置换仅在hNT3(IC50＝45pM)和可变区4hNGF/hNT3结构域结合突变体(突变体16；IC50＝80nM)中观察到。类似地，在可变区4中hNGF/hNT3结构域交换导致在trkC转染的PC12细胞(它对hNGF无应答)中大量产生轴突。比较突变体16的trk依赖性结合、自磷酸化和PC12细胞活性(图19、20)揭示，内源hNGF样活性的丧失很少。含有NT3的N末端的N末端结构域交换突变体(突变体6)不与trkC反应。
图23显示了两个N末端交换突变体：hNT3-NH2/hNGF是突变体6，它在hNGF的骨架上含有hNT3残基1-6(YAEHKS-)以置换hNGF的残基1-7。hNGF-NH2/NT3是P2(S1)，它在hNT3的骨架上含有hNGF残基1-7(SSSHPIF-)以置换hNT3的残基1-6。
图24A、24B和24C显示了P2(S1)分别与trkA、trkC和gP75的泛神经营养蛋白受体结合活性。竞争性结合分析是通过用所示的因子将〔125I〕hNGF或〔125I〕hNT3从受体-IgG免疫吸附上置换下来而进行的。含有hNGF N-末端的hNT3的N-末端结构域交换突变体P2(NGF-NH2/NT3)，具有hNGF样的tr-kA结合活性，也保留trkC活性。NT3-NH2/NGF(突变体6)是含有hNT3的N末端的hNGF(反向N末端结构域交换突变体)，其与trkA的结合力下降并且与trkC不结合。
图25A和25B显示了P2(S1)分别在正常的表达trkA的PC12细胞和trkC转染的、hNGF应答性下降的PC12细胞中的泛神经营养蛋白活性。在给定浓度神经营养蛋白或突变体的条件下，具有轴突的PC12细胞的百分比根据天然神经营养蛋白引发的最大应答而校正。P2(NGF-NH2/NT3)在trkA PC12细胞中的EC50是0.4ng/ml(15pM)，在trkC转染的PC12细胞中是0.2ng/ml(7pM)，这与hNGF和hNT3的EC50类似。
图26A和26B显示了hNGF点突变体与trkA和gp75受体的结合。突变体的亲和性用竞争性结合测定，并且以突变体IC50与天然hNGF的IC50的比值形式表示。对每个突变体hNGF的两次独立转染，至少进行两次试验，根据获得的竞争性结合曲线来确定IC50。列出了各突变体的4-6个独立测量值的IC50的SD。测试出对结合有影响的hNGF残基大多是暴露于表面的，这与根据鼠NGF晶体结构而预测的结果一致。
图27显示了用trkA-自磷酸化ELISA分析测定的hNGF突变体的生化活性。列出了相对于hNGF的EC(EC50＝120pM)的各突变体EC50。对影响潜力最大的突变残基列出其残基编号。对自磷酸化程度(效率)有额外效应的突变残基标上其残基编号和星号(*)。
图28显示了选定的hNGF突变体在trkA-PC12细胞轴突产生分析中的生物活性。根据与hNGF应答相比而得的各突变体的轴突产生的EC50比值进行绘图。列出了效应最大的突变残基。所有其他的突变体目前都被测试。发明详述
如本领域中所知，本文所用的氨基酸单字符如下表所述：
              表1
氨基酸    三字符缩写    单字符缩写
丙氨酸      Ala            A
精氨酸      Arg            R
天冬酰胺    Asn            N
天冬氨酸    Asp            D
半胱氨酸    Cys            C
谷氨酰胺    Gln            Q
谷氨酸      Glu            E
甘氨酸      Gly            G
组氨酸        His         H
异亮氨酸      Ile         I
亮氨酸        Leu         L
赖氨酸        Lys         K
甲硫氨酸      Met         M
苯丙氨酸      Phe         F
丝氨酸        Ser         S
苏氨酸        Thr         T
色氨酸        Trp         W
酪氨酸        Tyr         Y
缬氨酸        Val         V
脯氨酸        Pro         P
因此，氨基酸残基用氨基酸单字符加上残基位置数目表示。应理解，位置编号对应特定的神经营养蛋白骨架；因此D15A NT3表示，在NT3中15位的天冬氨酸变成丙氨酸。这个在下述的“恒定区”中所发现的天冬氨酸，对应于NGF的16位，因为NGF在其N末端多一个氨基酸，如图8所示。
本发明提供泛向神经营养蛋白。一般，神经营养蛋白是一种在神经系统尤其神经元的发育、调控和维持中所涉及的蛋白质。目前，至少有5种已知的重要神经营养因子：神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白3(NT3)、神经营养蛋白4(NT4，有时也称为神经营养蛋白5(NT5)或NT4/5)、脑衍生神经营养因子(BDNF)和睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)。
术语“泛向神经营养蛋白”或“泛向神经营养因子”或语法上的相同术语，在此处指这样的神经营养蛋白：与天然存在的神经营养蛋白不同，它具有多重神经营养蛋白特异性。即，它含有赋予其不同神经营养蛋白特异性的结构域。在一个例子中，这意味着本发明的泛向神经营养蛋白可与各种不同神经营养受体结合。因此，例如对于天然存在的NGF(它是trkA受体的天然配体)，它不能与trkB或trkC受体高亲和性地发生可观的结合；比如NGF与这些受体结合的KD分别比BDNF或NT3的低500-1000倍。然而，泛向NGF(即氨基酸骨架基于NGF的泛向神经营养蛋白)可以至少与trkA、trkB和p75受体结合。或者，泛向NGF可结合trkA、trkC和p75受体。在一个优选例子中，可结合trkA、trkB、trkC和p75受体。类似地，天然存在的BDNF和NT4/5(它们是trkB受体的天然配体)同样不能与trkA或trkC发生可观的结合。因此与所述泛向NGF类似，泛向BDNF和NT4/5可与trkB以及trkA、trkC和p75任何组合发生结合。
在其他例子中，天然存在的神经营养蛋白与若干种神经营养蛋白受体低亲和性地结合。在该例子中，泛向神经营养蛋白可以以比天然发现的亲和性更高的亲和性与这些受体结合，这种亲和性类似在天然配体中所见的亲和性。例如，NT3强烈地与trkC结合，但是与trkA和trkB发生弱结合。因此，泛向NT3以正常结合亲和性与trkC结合，同时又以类似trkA的天然配体即NGF的亲和性与trkA结合，或者以类似trkB的天然配体BDNF或NT4/5的亲和性与trkB结合。
在优选例子中，泛向神经营养蛋白对神经营养受体的结合亲和力至少为天然配体结合亲和力的约50-60％，较佳地为约75-80％，最佳地为约90％。因此，泛向NGF会分别以BDNF或NT4/5、或NT3结合的至少50％与trkB或trkC受体结合。该亲和性可用各种不同方法测定，这是本领域技术人员所知晓的。优选方法是使用竞争性分析，如文献(84)和实施例2中所述。一般结合亲和力以IC50表示，即抑制50％标记配体结合于受体时未标记竞争物的浓度。
在另一些例子中，神经营养蛋白的泛向性不是通过对神经营养蛋白受体的结合亲和力方法测定，而是用神经元存活或轴突产生测试分析方法测定。人们知道，所有的神经营养蛋白支持胚胎神经冠衍生感觉神经元的存活〔(77)，(78)，(7)，(17)〕。胚胎交感神经元的存活仅受NGF的支持，而基板衍生的感觉神经元受NT3和BDNF的支持(85)。背根神经节的感觉神经元的存活受NGF和BDNF两者的支持(13)。NT3引发背根神经节、交感链神经节和结状神经节中感觉神经元的轴突产生，并且支持结状神经节神经元和背根神经节神经元的存活。因此，神经元存活研究或轴突产生测试可用于确定泛向神经营养蛋白的泛向性。
因此，神经营养蛋白特异性可用神经营养蛋白受体结合、神经元存活测试和/或轴突产生测试等方法测定。所以，具有NGF特异性的泛向神经营养蛋白指这样的神经营养蛋白：它至少表现出NGF的结合特性、神经元存活测试特异性或轴突产生测试特异性。类似地，具有BDNF、NT3或NT4/5特异性的泛向神经营养蛋白至少分别表现出BDNF、NT3或NT4/5的结合特性、神经元存活测试特异性或轴突产生测试特异性。
在另一例子中，通过构建共价的异源二聚体而制备泛向神经营养蛋白。一般，神经营养蛋白是同源二聚体，它含有两个以非共价方式相连的相同单体。如下所述，在该例子中，由于各单体含有赋予不同神经营养特异性的结构域，所以被赋予泛向性。或者，通过将特异性不同的两个不同神经营养蛋白共价相连以形成共价异源二聚体从而产生泛向性。这样，例如NGF单体可共价连于NT3单体，形成具有NGF和NT3特异性的泛向神经营养蛋白。类似地，可在NGF、NT3、NT4/5、BDNF或CNTF的任何组合中产生共价异源二聚体，以形成具有至少两种特异性的泛向神经营养蛋白。此外，该程序可对本身已是泛向的单体进行，从而形成泛向的和单一特异性单体的任何组合的共价二聚体。因此，泛向共价二聚体可以是两个泛向单体的同源二聚体。然而，为了将其包括在本发明的定义之中，泛向的共价二聚体必须具有至少两种、较佳为3种神经营养蛋白特异性。
共价连接最好是核酸直接融合从而形成一个编码二聚体的单一核酸，这样当蛋白质被表达时，第一个单体的C末端直接连于第二个单体的N末端。在其他例子中，可以使用接头，例如甘氨酸、或者甘氨酸和丝氨酸的短重复片段；例如可以使用诸如gly-gly或gly-gly-ser-gly-gly接头。这可以用本领域公知的技术完成。其他用于蛋白质共价连接的技术是本领域中众所周知的。
泛向神经营养蛋白通过含有赋予神经营养因子受体特异性或结合性的结构域而实现泛向性结合，或者如上所述实现泛向性神经元存活。结构域可用两种方法中的一种进行定义。在第一种中，结构域是赋予某种神经营养特异性的神经营养蛋白的一部分。在这种情况下，泛向神经营养蛋白的一个单体可含有一个或多个赋予不同特异性的结构域。结构域的大小从一个氨基酸至约10-15个氨基酸不等。结构域可以由除宿主神经营养蛋白之外的不同神经营养蛋白的氨基酸组合而成，即来自一种神经营养蛋白的结构域可以被置换入第二种神经营养蛋白中，从而赋予第二种神经营养蛋白泛向性。或者，如下所述，结构域可以根据氨基酸取代而得出，这些取代并不基于已有神经营养蛋白的同源性。在优选例子中，结构域含有连续的氨基酸序列；即，一段氨基酸被置换。在另一例子中，结构域可由非连续的氨基酸构成；例如是神经营养蛋白中的几个区域赋予特异性，因此在神经营养蛋白中的几个位置上置换都是泛向性所需的。
在某些例子中，在神经营养蛋白中有一个以上结构域能够赋予神经营养特异性，这取决于特定的神经营养蛋白。以BDNF为例，它含有多个赋予BDNF特异性的结构域。本发明显示，在NT3中15位的天冬氨酸转变为丙氨酸这样一个氨基酸的改变，会将BDNF特异性赋予NT3。该结构域也可以被引入NGF和NT4/5序列中对应于NT3中15位的相应位置，即NGF中的16位或NT4/5中的18位。应理解，相应氨基酸的确定是通过序列的排列检查而得出的，如图8中所示。除了该结构域，在BDNF中含有其他赋予BDNF特异性的结构域。例如，BDNF序列中78-88位(QCRTTQSYVR)的置换，或者93-99位(SKKRIG)的置换都可赋予BDNF特异性(55)。
类似地，NT3有多个结构域，当它们被置换入不同的神经营养蛋白时，赋予NT3特异性。已表明，NT3的许多残基在NT3 trkC受体结合以及生物活性测试中是至关重要的。具体地，在R103、D105、K80、Q83、E54、R56、T22、Y51、V97、Y11、E7、R8、E10和R68位置处的突变都与NT3特异性有关，因为在NT3中这些位置的突变会降低NT3活性。其中，K80、Q83、T22和V97位于图8所示的可变区中，其余的位于恒定区。此外，在这些残基附近的残基也赋予NT3特异性。在某些情况下，在恒定区的变化也可赋予NT3特异性。或者，在R31和E92位的突变会导致NT3结合的增加，具体地，R31A和E92A NT3显示出trkC结合增加。用下面所述的方法，这些突变可以直接引入除NT3之外的其他神经营养蛋白中。如下所述，可以对这些位置中任何位置上的氨基酸进行改变。
NGF有多个结构域，当它们被置换入不同的神经营养蛋白时，赋予NGF特异性。NGF的N末端氨基酸，当其替换NT3的N末端残基时，可赋予NGF特异性。具体地，NGF的N末端的7个氨基酸(SSSHPIF)可以替换NT3的N末端的6个氨基酸(YAEHKS)，导致具有NGF特异性的泛向NT3。如实施例尤其实施例3中所述，NGF的N末端残基的确切数目并不重要，尤其在实施例3中，氨基酸4位上的组氨酸对NGF特异性似乎是非常重要的，因此可以互换N末端的约4-10个氨基酸，尽管在某些例子中，单一氨基酸的变化便已足够了。类似地，已表明NGF的其他许多残基在NGF trkA受体结合以及生物活性测试中是至关重要的。例如，有许多残基，当它们突变时，会导致NGF活性下降。这显示出残基对NGF特异性的重要性。这些残基包括但并不限于：H4、P5、V18、V20、G23、D30、Y52、R59、R69、H75、Y79、T81和R103。其中，D30、R59、Y79和T81位于图8所示的可变区(即在不同神经营养蛋白中有所变化的区域)中，其余的位于恒定区。在某些例子中，可变区的残基造成NGF特异性的可能更大，因为恒定区残基对共同的结构和特性而言是重要的，因而可以不赋予特异性。但是，正如在上述的D15A突变中所见，恒定区的变化也可赋予NGF特异性。此外，在NGF中一些氨基酸的取代会导致NGF结合和/或生物活性的增加。因此，这些取代可以被引入其他神经营养蛋白骨架中以赋予NGF特异性。这些残基包括但并不限于：E11、F12、D24、E41、N46、S47、K57、D72、N77、H84、D105和K115。
一旦确定，这些在神经营养蛋白特异性中起重要作用的残基便可用其他任何氨基酸残基进行置换，这可用实施例中所述以及本领域中已知的定点诱变技术。一般，待取代的氨基酸可以根据本领域技术人员知晓的特性进行选择。例如，当特性需要小改动时，一般可根据下表进行置换：
           表2
原来的残基    代表性的取代
Ala               Ser
Arg               Lys
Asn               Gln，His
Asp               Glu
Cys               Ser
Gln               Asn
Glu               Asp
Gly               Pro
His               Asn，Gln
Ile               Leu，Val
Leu               Ile，Val
Lys               Arg
Met               Leu，Ile
Phe               Met，Leu，Tyr
Ser               Thr
Thr               Ser
Trp               Tyr
Tyr               Trp，Phe
Val               Ile，Leu
功能或免疫特征的重大改变可以通过选择那些比表1中所示的保守性更低的取代而实现。例如，可以实现更大地影响下列方面的取代：在变化区域多肽骨架的结构，例如α-螺旋或β-折叠结构；在靶位点上分子电荷或疏水性；侧链的体积。一般预期会使多肽性质产生最大改变的取代是下列取代：(a)亲水残基例如丝氨酰基或苏氨酰基取代(或被取代)疏水残基如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基所取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代(或被取代)其他氨基酸；(c)具有正电荷侧链的残基例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基，与具有负电荷残基例如谷氨酰基或天冬氨酰基之间发生取代或被取代；或(d)侧链体积大的残基如苯丙氨酸与没有侧链的残基如谷氨酸发生取代或被取代。在一个优选例子中，残基被改变为丙氨酸残基。
其他位于各种神经营养蛋白中的结构域可以用此处公开的技术加以发现。具体地，实施例1的模型制作(modelling)技术可以鉴别假设的特异性位点。此外，同源性扫描诱变、随机诱变、盒式诱变技术都可用于产生假设的泛向神经营养蛋白，然后用实施例中及本领域中公知的技术根据与受体的结合而加以筛选。
在共价异源二聚体的情况下，结构域也可以指整个神经营养蛋白单体。因此，泛向的共价异源二聚体可以由赋予BDNF特异性的结构域(即BDNF单体)共价地连于赋予NT3特异性的结构域(即NT3单体)所构成。类似地，NT3单体可以与NGF单体配对，或者NGF单体与BDNF单体配对。此外，共价的异源二聚体也可用NT4/5和CNTF单体构成。在这些例子中，结构域是大的，而且一般包括野生型神经营养蛋白氨基酸序列的大部分或全部。
在普遍例子中，泛向神经营养蛋白可与至少3种不同的神经营养蛋白受体结合。在优选例子中，泛向神经营养蛋白可与至少4种不同的神经营养蛋白受体结合。
此处的术语“神经营养蛋白受体”或其语法上相等词语，指与神经营养蛋白配体结合的受体。在某些例子中，神经营养蛋白受体是酪氨酸激酶受体家族中的成员，一般称为“trk”受体，它们在不同的神经元群的表面表达。trk家族包括但并不限于：trkA(也称为p140trk)、trkB(也称为p145trkB)、trkC(也称为p145trkC)。在某些例子中，神经营养蛋白受体是p75NGFR，它也被称为p75或低亲和性神经生长因子受体(LNGFR)。应理解，其他的以及未发现的神经营养蛋白受体也可与本发明的泛向神经营养蛋白结合，这一点是本领域的技术人员容易确定的。
在优选例子中，泛向神经营养蛋白是泛向的NT3。在这种情况下，泛向NT3是这样的泛向神经营养蛋白：它具有与NT3的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且具有赋予其他神经营养蛋白特异性的结构域。在优选例子中，用结构域取代NT3残基，即从NT3序列中将某些氨基酸去除，然后用相同或相近数目的氨基酸取代，从而赋予其他的特异性。例如，MNTS-1(多重神经营养特异性-1)泛向NT3含有NGF的前7个氨基酸(它们用于置换NT3中N末端的6个氨基酸)，再加上D15A取代。MNTS-1泛向NT3具有NT3、NGF和BDNF特异性，而且还可与p75受体结合。其他泛向NT3是通过N末端的微小改变而制得的。例如，因为H4和P5在NGF中是保守的，而且在6位和7位的2个疏水性残基是保守的，因此可以制备下列变异体：1)YASHPIF-hNT3；2)YAHPIF-hNT3；3)YASHPIS-hNT3；4)YAEHPIF-hNT3；5)YAQHPIF-hNT3。当添加D15A取代时，得到的神经营养蛋白具有NGF、NT3和BDNF特异性。或者，用NGF的相应区域置换NT3的可变区2或3或4或其组合，可以得到具有NT3和NGF两种特异性的泛向神经营养蛋白。
在一个优选例子中，泛向神经营养蛋白是泛向NGF。在这种情况下，泛向NGF是这样的泛向神经营养蛋白：它具有与NGF的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且具有赋予其他神经营养蛋白特异性的结构域。在优选例子中，用结构域取代NGF残基，即从NGF序列中将某些氨基酸去除，然后用相同或相近数目的氨基酸取代，从而赋予其他的特异性。例如，可以制备这样一种泛向NGF，其中引入D16A取代(它赋予BDNF特异性)再加上在前可变区1中的取代(V18E＋V20L＋G23T)和可变区4中的取代(Y79Q＋T81K＋H84Q＋F86Y＋K88R)。或者，在前可变区1中的取代可以与可变区4中仅有的单一氨基酸取代一起；例如可以制备Y79Q、T81K、H84Q、F86Y或K88R之一和V18E＋V20L＋G23T的组合。
在一个例子中，泛向神经营养蛋白是泛向的NT4/5。例如通过用NGF的N末端的7个氨基酸置换NT4/5的末端的9个氨基酸，可以赋予NGF特异性。
在一个例子中，泛向神经营养蛋白与p75受体的结合可被大大削弱或消除。例如，如图26所示，有多个氨基酸与p75残基结合有关，在这些残基处的突变可导致p75结合下降。在NT3中，在R68、Y11、K73、R114、K115、Y51、K73、R31和H33的突变，以及在NGF中，F12、I31、K32、K34、K50、Y52、R69、K74、K88、L112、S113、R114和K115的突变都可导致p75结合下降。因为如图8所示，F12、I31、K50、Y52、R69和K74都在神经营养蛋白的恒定区内，所以预计这些氨基酸改变在其他神经营养蛋白中也可改变p75结合性。其他残基也可加以改变。
除了上述的氨基酸变化外，本领域的技术人员知道，在不改变神经营养蛋白的特异性和特性的情况下，可以容忍某些不同的氨基酸序列。因此，与野生型序列相比，泛向神经营养蛋白可以有仅改变序列多样性而不影响泛向性的氨基酸取代、插入或缺失。在某些情况下，这些突变可能位于对特异性而言至关重要的相同位置上；即在某些情况下，可以在不改变神经营养蛋白特异性的情况下进行中性突变。
本发明的泛向神经营养蛋白可用重组技术以多种方式制备。此处的术语“重组核酸”指处于自然条件下不存在的核酸形式。即，重组核酸的侧翼的核酸序列在自然界中一般并不位于侧翼，或者重组核酸具有在自然条件下不存在的序列。重组核酸最初可以用限制性内切酶对核酸操作，或者用诸如聚合酶链反应之类的技术而在体外形成。一旦重组核酸被制备并重新引入宿主细胞或生物体，那么它便可以非重组地进行复制，即用宿主细胞的体内细胞机制而不是通过体外操作进行复制；然而，这种核酸，一旦是重组产生的，那么尽管随后非重组地进行复制，但对于本发明目的而言仍然被认为是重组的。
类似的，“重组蛋白”指用重组技术产生的蛋白质，即通过上述重组核酸的表达而产生的蛋白质。重组蛋白与天然存在蛋白的区别至少在于一个或多个特性。例如，可从一般在野生型宿主中相关的部分或全部蛋白质和化合物中分离出该蛋白质。该定义包括从相同或不同的生物体或宿主细胞的生物体中产生泛向神经营养蛋白。例如，可在衍生出该蛋白的相同生物体中制备该蛋白，但是在比一般情况下所见的浓度高得多的情况下制备，例如通过使用诱导型或高表达的启动子从而提高蛋白的水平。或者，蛋白质处于自然条件下不存在的形式，比如添加抗原决定簇标记或氨基酸取代、插入和缺失。
用本发明的编码泛向神经营养蛋白的核酸，可以制备各种表达载体。表达载体可以是自我复制型的染色体外的载体或整合入宿主基因组的载体。一般，表达载体包括转录和翻译调控核酸，它们可操作地连于编码泛向神经营养蛋白的核酸。在这种情况下，“可操作地连于”指相对泛向神经营养蛋白的编码序列而言，转录和翻译调控DNA位于能引发转录的位置。一般而言，这意味着启动子和转录起始或开始序列位于泛向神经营养蛋白编码区域的5′。转录和翻译调控核酸一般与用于表达泛向神经营养蛋白的宿主细胞是相匹配的；例如来自哺乳动物细胞的转录和翻译调控核酸序列可用于在哺乳动物中表达泛向神经营养蛋白。对于各种宿主细胞而言，本领域中已知各种类型的合适表达载体和适当的调控序列。
一般，转录和翻译调控序列可以包括但并不限于：启动子序列、信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、终止和polyA信号序列、以及增强子或活化子(activator)序列。在一个优选例子中，调控序列包括启动子以及转录起始和终止序列。
启动子序列是组成型或诱导型启动子。将一个以上启动子的元件组合在一起而形成的杂合启动子在本领域中也是已知的，并且可用于本发明。
此外，表达载体可含有其他元件。例如表达载体可具有两个复制系统，从而可维持于两种生物体中，例如在哺乳动物细胞中表达，在原核宿主中克隆和扩增。此外，对于整合型表达载体，表达载体应含有至少一段与宿主细胞基因组同源的序列，较佳地含有两段位于表达构建物两侧的同源序列。通过选择适当的同源序列并引入载体，可以将整合型载体引入宿主细胞的特定位点。整合型载体的构建物是本领域中已知的。
此外，在一个优选例子中，表达载体含有可选择的标记基因以便选择转化的宿主细胞。选择基因是本领域中已知的，而且可随所用的宿主细胞而改变。
本发明的泛向神经营养蛋白的产生可以通过：在适当的条件下，培养用含有编码泛向神经营养蛋白的核酸的表达载体转化的宿主细胞，以诱导或导致泛向神经营养蛋白的表达。适合泛向神经营养蛋白表达的条件随选用的表达载体和宿主细胞而有所不同，这可以由本领域的技术人员容易地确定。例如，在表达载体中使用组成型启动子需要优化宿主细胞的生长和增殖，而使用诱导型或抑制型启动子需要适当的用于诱导或抑制的生长条件。在一个优选例子中，泛向神经营养蛋白在表达后被纯化或分离。可以用本领域技术人员中熟知的各种方法纯化或分离泛向神经营养蛋白，具体方法取决于样品中存在的其他组份种类。标准纯化方法包括：电泳、分子、免疫和色谱技术，其中包括离子交换、疏水性、亲和性和反相HPLC色谱、层析聚焦。也可以使用与蛋白质浓度结合的超滤和渗滤技术。对于合适的纯化技术，可参见文献(57)。随所用的泛向神经营养蛋白的不同，所需的纯化程度有所不同。在某些情况下，可并不纯化。
适当的宿主细胞包括：酵母、细菌、古细菌(archebacteria)、真菌如丝状真菌、以及植物和动物细胞包括哺乳动物细胞。特别感兴趣的是酿酒酵母和其他酵母、大肠杆菌、枯草杆菌、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、SF9细胞、C129细胞、链孢霉属、和CHO、COS、HeLa细胞、无限增殖的哺乳动物骨髓和淋巴细胞系。优选的宿主细胞是哺乳动物细胞，最优选的宿主细胞包括CHO细胞、COS-7细胞和人胚肾细胞系293。
在一个优选例子中，本发明的泛向神经营养蛋白在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达系统在本领域中也是已知的。
当存在内含子时，某些基因的表达会更有效。然而，从缺乏拼接信号的载体中已经有效地表达了数种cDNA。因此，在某些情况下，编码泛向神经营养蛋白的核酸可含有内含子。
将外源核酸引入哺乳动物宿主以及其他宿主的方法在本领域中是众所周知的，并且随所用的宿主细胞而有所变化，其中包括：葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀法、polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将聚核酸包裹在脂质体中、以及将DNA直接微注射入核中。
在一个例子中，泛向神经营养蛋白在酵母细胞中产生。酵母表达系统在本领域中是众所周知的，其中包括用于下列酵母的表达载体：酿酒酵母、白色念珠菌和麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)、多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromyces fragilis)和乳克鲁维氏酵母(K.lactis)、吉利蒙德氏毕赤酵母(Pichia guillerimondii)和巴斯德毕赤酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和Yarrowia lipolytica。将外源核酸引入酵母宿主以及其他宿主的方法在本领域中是众所周知的，并且随所用的宿主细胞而有所变化。
在一个例子中，泛向神经营养蛋白在细菌系统中产生。细菌表达系统在本领域中是众所周知的，其中包括用于下列细菌的表达载体：枯草杆菌、大肠杆菌、乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)和Streptococcus lividans。将细菌表达载体转化入细菌宿主细胞可以用在本领域中众所周知的技术如氯化钙处理、电穿孔和其他技术。
在一个例子中，泛向神经营养蛋白在昆虫细胞中产生。用于转化昆虫细胞尤其基于杆状病毒的表达载体是本领域中众所周知的。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒形式购得，例如来自Invitrogen(San Diego)的“MaxBac”试剂盒。
已经开发出用于感染若干种昆虫细胞的重组杆状病毒表达载体。例如，已开发出用于埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)、中国桑蚕(Bombyx mori)、黑猩猩果蝇(Drosophia melangaster)、草地(贪)夜蛾(Spodoptera frugiperda)、和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的重组杆状病毒。
一旦表达，泛向神经营养蛋白可用作神经营养因子。这些泛向神经营养蛋白可用于各种诊断和治疗用途。
本发明的泛向神经营养蛋白可用于检测神经营养蛋白受体的诊断方法。例如，本发明的泛向神经营养蛋白可被标记。此处的术语“标记的泛向神经营养蛋白”指这样的泛向神经营养蛋白：它有至少一种元素、同位素或附着的化学物质从而能够检测泛向神经营养蛋白或与神经营养蛋白受体结合的泛向神经营养蛋白。一般，标记物分成3类：a)同位素标记物，它是放射性的或重同位素；b)免疫标记物，它是抗体或抗原；c)着色或荧光染料。标记物可以掺入在泛向神经营养蛋白的任何位置。一旦被标记，泛向神经营养蛋白可用于检测神经营养蛋白受体，无论在体外或体内。例如，神经营养蛋白受体的存在可以指示某种细胞类型的存在，这在诊断中是有用的。即标记的泛向神经营养蛋白通过受体与细胞结合，可以显示一亚群的某种类型细胞。
此外，本发明的泛向神经营养蛋白可用作神经营养蛋白测定的标准物。例如，在某个特定测定中分析神经营养蛋白的活性可用已知的神经营养蛋白标准加以测定，然后可将泛向神经营养蛋白用于诊断和神经营养蛋白的定量。
此外，本发明的泛向神经营养蛋白可用作培养活体神经细胞的培养基中的组份，因为许多神经细胞培养需要生长因子。正如本领域技术人员所知晓的那样，本发明的泛向神经营养蛋白可用于替换通常用作培养基组份的其他神经营养蛋白。泛向神经营养蛋白的加入量可用标准分析方法轻易确定。
本发明的泛向神经营养蛋白也可用于产生抗体，它们可用于生物体或病人中神经营养蛋白或神经营养蛋白抗体诊断、鉴别和定位。例如，如本领域技术人员所知，泛向神经营养蛋白可用于制备多克隆或单克隆抗体。然后标记抗体并用于检测神经营养蛋白的存在与否。因此，可以检测与神经营养蛋白关联的神经性疾病的诊断。或者，抗体可非直接地用第二级抗体检测。例如，可在鼠或兔中制备第一级抗体，然后用标记的抗-鼠或抗-兔抗体来检测第一级抗体。这两种方法中的任一种以及本领域中已知的类似方法，都可在各种组织中检测神经营养蛋白。
此外，产生的针对本发明泛向神经营养蛋白的抗体也可用于纯化神经营养蛋白和泛向神经营养蛋白。因为一般而言泛向神经营养蛋白的氨基酸取代是小规模的，因此许多免疫抗原决定簇是神经营养蛋白和泛向神经营养蛋白所共有的。因此，产生的针对泛向神经营养蛋白的抗体可与天然存在的神经营养蛋白结合，因而在纯化中是有用的。例如，可使用基于亲和色谱技术的纯化分案，这是本领域中众所周知的。
在一个优选例子中，本发明的泛向神经营养蛋白可施用于病人以治疗神经性疾病。此处的术语“神经性疾病”指与神经元退化或损伤相关的中枢和/或外周神经系统的疾病。神经性疾病的具体例子包括但并不限于：Alzheimer病、Parkinson病、Huntington舞蹈病、中风、ALS、外周神经病变和其他特征为神经元坏死或丧失的病症，无论是中枢的、外周的还是运动神经元(motorneuron)，除了治疗因外伤、烧伤、肾衰竭或受伤造成的神经损伤之外。例如，与某些病症相关的外周神经病变如与糖尿病、AIDS或化疗相关的神经病变可用本发明的泛向神经营养蛋白治疗。此外，在模拟Alzheimer病中发现的细胞丧失方式的模型中，施用NT3可防止成人中枢中蓝斑位置处去甲肾上腺素能神经元的退化(86)。此外已表明，添加NT3可增加发育中皮质脊髓束的萌发，以及成年脊髓索损伤后的萌发(58)。事实上，当NT3和抑制髓鞘相关生长抑制蛋白的抗体一起施用时，观察到长距离的再生。因此，本发明的泛向神经营养蛋白在该用途中可替代NT3。
在这种例子中，将治疗有效量的泛向神经营养蛋白给病人施用。此处术语“治疗有效量”指产生施用效果的剂量。确切的剂量将取决于被治疗的疾病，而且可由该领域的技术人员用已知技术确定。一般，本发明的泛向神经营养蛋白的施用量为约1微克/千克至约100毫克/千克每天。另外，如本领域中所知，需要根据年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和疾病严重程度等情况加以调节，这可由该领域的技术人员通过常规试验而确定。
在本发明中“病人”包括人和其他动物及生物体。因此，这些方法可用于人的治疗和兽用。
本发明的泛向神经营养蛋白的施用可用多种方法进行，其中包括但并不限于：口服、皮下、静脉、脑内、鼻内、透过皮肤、腹膜内、肌内、肺内、阴道给药、直肠给药和眼内给药等。泛向神经营养蛋白可通过融入CNS的流体储藏体中而连续施用，尽管丸药注射也是可以接受的(使用本领域公知的技术例如泵或植入法)。在某些情况下，比如在处理伤口时，泛向神经营养蛋白可直接以溶液或喷雾形式施用。
本发明的药物组合物含有泛向神经营养蛋白，它处于适合给病人施用的形式。在优选例子中，药物组合物是水溶性形式，并且可以含有诸如载体、赋形剂、稳定剂、缓冲液、盐分、抗氧化剂、亲水聚合物、氨基酸、碳水化合物、离子或非离子表面活性剂、聚乙二醇或丙二醇等。泛向神经营养蛋白也可以用本领域已知的技术以缓释形式植入，或者以微囊形式包埋。
下列实施例用于更充分地阐述使用上述发明的方式，并举出实施本发明各方面的最佳形式。应理解这些实施例不以任何方式限制本发明的实际范围，而是用于阐述目的。实施例实施例1构建NT-3的分子模型和确定突变分析的目标残基
从N.Q.McDonald和T.L.Blundell获得鼠NGF三维结构的坐标。在Sili-con Graphics Iris Workstation上，利用InsightII反应程序构建NT-3的分子模型。利用MidasPlus程序产生代表性的NT-3结构。(University of Californiaat San Francisco)。
如果获得了鼠NGF(mNGF)的三维结构(59)，利用蛋白质工程技术来获取神经营养功能的结构基础的合理方法将成为可能。mNGF的结构为两条相同氨基酸多肽链紧密缔合而成的二聚体。由扭曲的、交替连接的反平行β-折叠延伸片段形成各单体的折叠。分子为长形，具有平坦的疏水性表面，此表面构成缔合单体的界面(59)。此结构的突出特征是二硫键的分布，现在已知是半胱氨酸-结基元(60)。在不相关的TGF-β〔(61)；(60)〕和PDGF-BB(87)中也发现了这种基元。mNGF结构中的几个区域，包括氨基端和羧基端以及残基43和48之间的环并不十分确定，这表明它们是高度可变的结构元。
人NT-3(hHT-3)的序列与mNGF(图1)具有56％的相同性和70％的相似性。序列差异集中在结构不确定的N-末端和残基43至48之间的环。在神经营养蛋白家族的全部成员中，半胱氨酸的相对位置是保守的，这表明在hNT-3中存在着类似的半胱氨酸一结基元。hNT-3和鼠NGF之间的相似性表明两者具有相同的基本三维折叠结构，所以，mNGF可以用作hNT-3模型的支架。在构建模型的第二步，通过InsightII程序(Biosym Technology，San Diego，CA)，用hNT-3的氨基酸来替换mNGF与hNT-3之间不相同的侧链。如果可能，hNT-3侧链的构象被保持与mNGF的相似，否则，它们将根据对旋转异构体库(62)及压缩和氢键的考虑。最后，根据Protein Data Bank中对晶体结构的研究，插入Asn93并调整环93-95。最终模型由104个氨基酸构成，其中不包括N端的6个(Tyr1-Ser6)和C端的4个(Ile116-Thr119)以及成环的5个残基(G44-V48)。此模型可以确定可能涉及重要结构内容的残基，从而使它们从突变分析中被排除。这些残基不涉及界面(W20、F52、Y53、W99、W101)、具有结构重要性的氢键和疏水键(S12、I30、Q50、P62、883、R100、T106、S107)和二硫键(C15、C57、C67、C79、C108、C110)，也不包埋在蛋白质的内部(V13、S16、S18、V21、D29、I30、V35、V37、I102、I104)。但是，有时会希望改变这些残基。另外，除了Gly44，甘氨酸和丙氨酸都是不变的。与mNGF/trkA相互反应的相关研究相反，取代的主要是单个残基或氨基酸对，而不是替换多个残基(53)(56)(55)或去除残基(49)。残基多数被替换成丙氨酸(64)。有时，为了潜在地给受体配体反应制造空间障碍，可以在结构中引入较大的氨基酸作为替换。
第一套突变作用探测保守和非保守残基，主要位于β链，即暴露在外而可能涉及与trkC和gP75受体结合的表面。有关NGF功能的现有假设(55)认为连接β链与末端的环中的不同残基是受体结合和特异性的主要决定簇。第二套hNT-3突变体评价这些残基对hNT-3与其受体之间反应的重要性。全套突变基本覆盖了NT-3分子的整个表面。实施例2NT3和泛向NT3的特异性氨基酸取代
先期，人NT-3被克隆、测序和亚克隆入pRK型载体，由此能够在E.coli中产生双链和单链的DNA，并在哺乳动物体系中在巨细胞病毒启动子的调控下表达成熟的NT-3(65)。根据Kunkel的方法(66)(67)进行该载体上的诱变。在转化入E.coli菌株XL1-Blue后，利用Sequenase 2.0版试剂盒(U.S.Bio-chemical Corp.)，通过测序单链DNA来筛选有所需突变的菌落。对全部阳性克隆检验成熟NT-3的全部编码序列。利用QIAGEN DNA纯化试剂盒(QiagenInc.，Chatsworth CA)从XL-1 Blue中分离双链DNA。然后用此DNA转染人胚肾细胞系293(68)。其它重组DNA操作均按文献(69)所述。使用已知技术来产生所有突变的引物。D15A突变的引物是GGTCACCCACAAGCTTTCACTGGCACATACCGAG(SEQ.ID.No.7)，S1突变体(以NT-3的6个N末端氨基酸替换NGF的7个N末端氨基酸的N末端替换)的引物是GTACTCCC-CT CGGTGGAAGA TGGGATGGCT CGAGGACCGT TTCCGCCGTG(SEQ.ID.No.8)。野生型和突变型神经营养蛋白的表达
通过磷酸钙沉淀，将含有hNT-3或突变型hNT-3的质粒DNA引入人胚肾细胞293(70)。用10μg质粒DNA/15mm细胞培养皿转染75％汇合的细胞，并在含血清的培养基中培养15小时。然后，去除培养基，换以补充了10mg/l重组牛胰岛素、1mg/l运铁蛋白和微量元素的无血清培养基(PSO4)。48小时和96小时后，收集由centriprep-10 filtration unites(Amicon，Beverly MA)浓缩了约20倍的上清液，并过滤灭菌。神经营养蛋白突变体的定量
利用豚鼠的蛋白质A纯化抗血清(Genentech)进行特异性hNT-3的ELISA。96孔微量滴定板(MaxiSorp；Nunc，Kamstup，Denmark)的每一孔包被溶于0.05M碳酸钠缓冲液(pH9.6)的抗血清(4μg/ml)100μl溶液，于4℃过夜。用封闭缓冲液(PBS＋0.5％BSA＋0.01％乙基汞硫代水杨酸钠，pH7.4)封闭1小时后，用ELISA缓冲液(PBS＋0.5％BSA＋0.05％Tween－20＋0.01％乙基汞硫代水杨酸钠，pH7.4)洗孔6次。将纯化的hNT-3或浓度未知的hNT-3突变体样品在ELISA缓冲液中稀释至100μl，然后加入孔中。微量滴定板在室温下连续振荡培养2小时。用ELISA缓冲液洗涤后，测试孔中加入100μl经生物素标记的抗hNT-3抗体(Genentech)培养2小时，再用ELISA缓冲液洗涤。在测试孔中加入100μl稀释比为1∶50000的链霉亲和素/辣根过氧化物酶(Zymed，43-4323)，培养30分钟，然后用ELISA缓冲液洗涤。最后，使用100μl含0.012％H2O2和0.04％邻苯二胺的PBS溶液显色15-20分钟。加入50μl 4.5N H2SO4来终止反应。在Vmax kinetic microplate reader(MolecularDeveces，Palo Alto CA)上，在490nm和405nm读取吸光度。利用浓度为50、25、12.5、6.25、3.13、1.56和0.78ng/ml的纯化重组hNT-3(Genentech)确定标准曲线。连续稀释浓度未知的NT-3样品：1∶10、1∶30、1∶90、1∶270、1∶810、1∶2430、1∶7290和1∶21870，以获取每份样品的多个数据点。利用标准物蛋白质试验获得的数据点的4参数拟合法确定标准曲线。
浓缩后，NT3突变体量在120ng/ml至36ng/ml之间。ELISA测试在模拟转染细胞的上清液中未测得NT3，而且此检测不与NGF转染细胞上清液中的重组NGF发生交叉反应(数据未示)。对于每次NT3突变体的表达，平行进行一次天然hNT3的表达和定量，以获取用于受体结合研究的可比野生型浓度。对全部突变体进行至少2次表达、定量和分析。碘化
用改良的Enzymobead radioiodination reagent(Bio-Rad)方法(71)，通过乳过氧化物酶处理来标记纯化的hNT-3，hBDNF和hNGF(Genentech)。通常，将2μg神经营养蛋白碘化至比活性3000至3500cpm/fmol。标记后的材料保存于4℃，在制备后的2周内使用。结合试验
以细胞为基础的结合试验使用取自表达鼠trkC(NIH3T3/trkC，(26))的稳定细胞系的细胞膜制剂。根据已有描述(26)进行竞争性取代试验。取一组重复数据，对多重表达的每一种突变体进行两次与trkC受体结合亲合性试验。此方法能够估计各种突变体亲合性测定的误差。瞬时表达细胞中的非纯化重组NT-3就其从NIH/3T3细胞表达的trkC受体上取代125-I标记的NT-3的能力与纯化NT-3进行比较。两者的取代率相似，非纯化NT-3的IC-50为7pM，纯化NT-3的IC-50为9pM。这表明，293表达细胞上清液中的非纯化NT3能够被精确定量，由此可以用于受体结合研究。NGF、BDNF和模拟转染细胞上清液不能从trkC上取代已结合的NT-3(数据未示)，由此证明了此结合试验的特异性。
将人trkA、trkB、trkC和gp75的胞外域与免疫球蛋白的恒定区融合，由此构建受体免疫粘附素(Genentech，未公开的研究结果)。用100μl5μg/ml山羊F(ab′)2抗人Fc IgG(Organon Technika，West Chester，PA)包被缓冲液溶液包被一96孔的微量滴定板(Corning，ELISA well strips)，在4-8℃放置15小时。吸净测试孔，用PBS洗涤3次，然后加入100μl 40ng/ml受体免疫粘附素蛋白的结合缓冲液(补充以5mg/ml BSA(Intergen，Purchase，PA)、0.1mg/ml马心细胞色素C(Sigma)和20mM HEPES的Leibovitz’s L15培养基，pH7.2)溶液，培养2小时。用PBS洗涤后，立刻加入50μl结合缓冲液以防变干。用结合缓冲液连续稀释天然和突变体蛋白储备液，使得浓度在4096-2pM范围内。每孔加入25μl连续稀释液，然后加入25μl标记过的神经营养蛋白。每孔中标记过的神经营养蛋白的最终浓度，在trkA、trkB和trkC试验中是50pM，在gp75结合试验中是100pM。室温培养3小时后，用PBS＋0.5％Tween-20洗孔，计算被结合的放射活性。利用Kaleigraph软件包，使用4参数拟合法对全部取代试验进行分析。条柱图中的全部结合结果均表示为IC-50突变型/IC-50野生型。神经营养因子对PC12细胞系上trk受体的自磷酸化的刺激
用25ng/ml神经营养蛋白在37℃对约1×107个细胞处理5分钟。根据已有描述(26)用抗血清443(泛向trk)或656(trkC特异性)进行NP-40平板裂解和免疫沉淀。根据已有描述(23)，用单克隆抗体4G10，通过Western转移分析磷酸酪氨酸的浓度。根据已有描述(26)检测4G10。PC12细胞和表达trkB和trkC的PC12细胞的分化试验
将约103个表达不同trk家族成员(trkC；(26)trkB；Soppet，未公开的观察结果)的PC12细胞平板培养在总共含2ml培养基的35mm包被胶原蛋白的组织培养皿中。对表达trkC的PC12细胞进行3种浓度(10ng/ml、1ng/ml、100pg/ml)的试验，用10ng/ml的NT-3突变体上清液对只表达trkA的亲代PC12细胞或表达trkB的PC12细胞进行试验。每一种处理，至少计数200个细胞。3-4天后，通过计数含有至少两倍于细胞体长度的轴突部分的细胞个数，测定带轴突细胞所占比例。胚胎组织和神经元培养物的解剖
将白色Leghorn小鸡的卵(SPAFAS，Reinholds，PA)于38℃在卵孵化箱中孵育规定的时间，由此获取不同发育阶段的小鸡胚胎。在含1×青霉素/链霉素的培养基中，用修表镊子和电解切削的钨针解剖胚胎期第8天的背根神经结、节状神经结和胚胎期第11天的交感神经结。鸡胚神经结在37℃用胰蛋白酶消化20分钟，然后在培养基(F14，含10％热失活马血清和5％热失活胎牛血清)中洗涤，然后用灼烧抛光的吸管将其温和捣碎成单细胞悬浮液。鸡胚细胞平板培养在包被聚鸟氨酸(0.5mg/ml，溶于pH8.6的0.15M硼酸缓冲液，放置过夜)和层粘连蛋白(20ml/ml，37℃放置4-6小时)的35mm培养皿中，培养皿含有2ml培养基，有2ng/ml神经营养蛋白，浓度或者如本文中所述。72小时后，计数每个培养皿中部的5×5格内所有具有神经元形态的细胞。
结果列于表3和4。
                                      表3突变          表达             trkC-结合             gp75-结合                轴突延伸自磷酸化                                      (IC50突变体/IC50野生型)  IC50突变体/IC50野生型)    PC12
PC12
         (占野生型的百分   NIH3T3         IA            IA           trkC   trkB   trkA      trkC
         比)人NT-3       100               1.00±0.08    1.00±0.09    1.00±0.1     +      -      -         ++b-链D15A         26                0.63±0.20    0.69±0.07    1.00±0.02    +      +      -         ++E17A/L19A    5                 0.95±0.10                                +      -      -         ++T22Q         42                3.28±0.73    3.55±0.45    0.87±0.04    +      -      -         +D23A         66                0.66±0.21                                +      -      -         ++K24A         3                 1.44±0.14    1.23±0.15                  +      -      -         +S25Q         114               0.86±0.13                                +      -      -         ++S26K         116               0.77±0.27                                +      -      -         ++S25K/S26Y    97                0.63±0.06                                +      -      -         ++I28Q         36                1.17±0.13                                +      -      -         N.D.T36E         289               0.97±0.26                                +      -      -         ++L38E         41                N.D.          1.25±0.23                  N.D.   N.D.   N.D.      N.D.E40A         251               0.44±0.08                                +      -      -         ++Y51A         4                 ＞15.00       21.52±2.32   18.00±1.10   -      -      -         +Y51F         59                1.25±0.22                                +      -      -         ++E54A         3                 2.99±1.62    1.40±0.05                  +      -      -         N.D.R56A         11                2.32±0.89    1.80±0.29                  +      -      -         ++V63A         380               1.12±0.13    0.72±0.01                  +      -      -         ++R68A         67                1.46±0.28    1.55±0.56    118.20±46.40 +/-    -      -         ++K80A/Q83A    12                2.32±0.51    2.72±0.17    1.81±0.06    +      -      -         +R87M                27    0.93±0.20                                +    -    -    ++L89E                1     N.D.          1.18±0.40                  N.D. N.D. N.D. N.D.S91M                49    1.15±0.25                                +    -    -    ++S91E                85    1.54±0.12                                +    -    -    ++S91A/E92A           35    0.55±0.17                                +    -    -    N.D.V97E                39    1.82±0.35    1.53±0.13    1.34±0.17    +    -    -    ++R103A/D105A         74    ＞100.00      130.00±37.0  1.22±0.12    -    -    -    -R103A               426   ＞100.00      82.00±36.00  2.19±0.35    -    -    -    -R103M               100   1.95±0.23    1.89±0.33    1.60±0.10    +    -    -    +R103K               102   ＞100.00      117.00±19.00 0.90±0.12    -    -    -    -D105A               75    0.67±21                                  +    -    -    ++氨基端和羧基端H4A/H7A/R8A/E10A    461   4.15±0.81    3.70±0.07    1.80±0.30    +    -    -    ++(N1)NGF-替换(S1)        18    N.D.          1.00±0.33    0.82±0.15    +   N.D.  +    ++(YAEHKS＞SSSHPIF)E3A                 251   0.68±0.18                                +    -    -    ++H4D                 348   N.D.          1.35±0.13                  N.D. N.D. N.D. N.D.E3A/K5A/S6A(N2)     200   1.65±0.68                                +    -    -    ++Y11A                101   3.34±0.23    4.17±1.27    57.94±23.91  +    -    -    ++R114A/K115A         146   1.05±0.12    1.38±0.18    182.66±37.37 +    -    -    ++环和顺序R31A/H33A/Q34A      0     N.D.                                      N.D. N.D. N.D. N.D.R31A                74    0.38±0.12    8.45±2.18                  +    -    -    N.D.H33A                81    N.D.          1.17±0.20    2.01±0.73    N.D. N.D. N.D. N.D.Q34A                176   1.05±0.05                                +    -    -    N.D.Q34E                166   1.04±0.34                                +    -    -    N.D.R42A/T43A              86    1.28±0.26                               +    -    -    ++N45A/S46A/K49A/Y51A    0     N.D.                                     N.D. N.D. N.D. N.D.G44A                   88    1.17±0.13                               +    -    -    ++N45A                   240   0.88±0.12                               +    -    -    ++S46A                   265   0.95±0.22                               +    -    -    ++P47A                   109   0.64±0.21                               +    -    -    ++V48A                   30    0.62±0.06                               +    -    -    ++K49A                   31    1.06±0.21                               +    -    -    ++E59A R61A              104   1.21±0.09                               +    -    -    ++K58A/E59A/R61A         110   1.68±0.77    1.5±0.39    1.31±0.01    +    -    -    ++K64A/N65A/D72A         52    1.13±0.26                               +    -    -    ++D71A/H74A/N76A         5     0.65±0.20    0.60±0.06                 +    -    -    ++D71A/K73A/H74A         43    0.98±0.37    5.54±1.85                 +    -    -    ++Q78A                   80    1.24±0.26                               +    -    -    ++N93A/N94A/L96A         55    1.01±0.17                               +    -    -    ++K95A                   122   1.13±0.34    1.13±0.13                 +    -    -    ++NGF替换(S2)            87    0.96±0.09                               +    -    -    ++(ENNKLVG＞DGKQAA)
                  表4神经营养蛋白         DRG                     NG                     SYMP
        (占NT-3＋BDNF＋NGF的百分比)  (占NT-3＋BDNF的百分比) (占NGF的百分比)NT-3                12.9±1.9                41.8±11.6             1.1±0.5BDNF                35.4±1.6                65.4±19.7             N.D.NGF                 53.7±2.8                N.D.                   100.0±3.7NT-3＋BDNF          53.7±2.2                100.0±1.8             N.D.NT-3＋NGF           66.5±0.6                N.D.                   N.D.NT-3＋BDNF          100.0±0.8               N.D.                   N.D.＋NGFD15A                11.4±0.4                46.6±10.0             1.4±0.6S1                  69.3±4.5                46.0±12.4             91.9±5.7MUTS-1              93.0±5.6                86.4±12.4             100.3±6.7实施例3N末端NGF变异体的产生、纯化和鉴定
NGF蛋白中的几个带电和不带电残基对其它种类来说是保守的。具体地说，8个已知NGF序列中7个的His4、Pro5和His8是保守的；Arg9只存在于人和鸡的NGF中，其它种类NGF中的此位置多数是Met。通过寡聚核苷酸指导的诱变产生了10种突变体：1)用丙氨酸单独或集合替换hNGF N末端的部分带电残基，2)用位于N末端hBDNF序列位置3的带负电的天冬氨酸替换His4(65)或者3)产生具有hBDNF的前5个残基或hNT3的前6个残基，或其它可以得到hNT3可变区的嵌合hNGF分子。形成的突变体构建物载体含有人CMV启动子的载体，在人293细胞中瞬时表达，如下所述。
按Burton等(1992)(48)和Kahle等(1992)(49)所述，利用反相HPLC和高性能离子交换色谱从被转染的CHO细胞系条件培养基中纯化的纯化重组子(1-118)、(6-118)和(10-118)，然后利用N末端序列分析、SDS-PAGE和氨基酸分析进行鉴定(数据未示)。通过在调节CHO细胞培养基过程中利用至今未知特性蛋白酶的原位蛋白酶解或利用加工途径来产生这些经加工变异体。根据SDS-PAGE，每一种形式的纯度为99％，并利用定量氨基酸分析来测定其浓度。根据对N末端截短变异体的有关描述，从无血清的转染293细胞的条件培养基(参见下文)中纯化和分析H4D突变体2(由300ml培养基得20μg)和N末端hNT3/hNGF突变体6(由300ml培养基得5μg)。
修改BioRad Muta-Gene试剂盒中的指示(66)(BioRad Richmond，CA)，利用寡聚核苷酸定向法(72)进行诱变。利用链终止法，通过单链噬菌粒克隆的DNA测序来检验突变体(73)。在瞬时转染人293细胞后，在条件培养基中表达hNGF突变体(68)(70)。用于收获的培养基是补充有N2的50∶50F12/DMEM无血清培养基，在无血清培养基中培养48小时后进行收获。用Amicon浓缩机将条件培养基浓缩10倍。通过利用纯化的兔抗hNGF多克隆抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)测定hNGF突变体的浓度。各突变体的浓度为3至8μg/ml。每个突变体至少进行3次表达，并在2-3个不同的时间通过ELISA测定浓度。
还利用通过添加200μCi 35S-甲硫氨酸和半胱氨酸(Amersham)代谢标记转染的293细胞(60mm平板，1.2ml培养基)来分析突变体。18小时后，收获培养基，在4℃与兔抗hNGF多克隆抗体或鼠单克隆抗体反应3-4小时，用蛋白A珠(Pharmacia)沉淀收获，然后上样在15％的丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶(Novex)上，电泳后，干燥凝胶然后置于X光胶片上。如上所述产生非放射性标记的突变体，冻干成0.1μg的等份，重溶在SDS-PAGE样品缓冲液中，在相同的凝胶上电泳，按标准法转移到硝酸纤维素膜上(BioRad)。印迹用兔抗hNGF多克隆抗体或鼠抗hNGF单克隆抗体在4℃处理过夜，洗涤，然后用偶联了碱性磷酸酶的山羊抗兔或抗鼠IgG抗体检测突变体。受体结合、trkA自磷酸化和PC12轴突产生试验
根据Escandon的方法(71)，利用Enzymobead法(BioRad)产生〔125I〕hNGF。经对起始反应混合物和凝胶过滤色谱后的〔125I〕hNGF进行TCA沉淀测定，比放射活性一般为60-90μCi/μg。如对表达trkB的NIH3T3细胞的有关描述(23)，在4℃，在重组表达兔trkA的NIH3T3细胞(Dr.Luis Parada提供)上，表达p75的人A875黑素瘤细胞(ATCC)上和兔细胞PC12(Dr.Luis Re-ichardt提供)上，将受体结合试验进行过夜。NIH3T3-trkA细胞和A875-p75细胞的使用浓度为1×106细胞/ml；PC12细胞为5×105细胞/ml。〔125I〕hNGF的最终浓度为50pM，体积为0.2ml。利用滤纸结合试验，NIH3T3 trkA细胞的非特异性结合，即1×10-6M未标记hNGF存在时的结合〔125I〕hNGF，为15-25％。p75-A875细胞为20-35％，trkA＋p75PC12细胞为20-30％。将数据拟合成取代等温线，利用Kaleidagraph程序中的4参数方程计算IC50。有时，受体结合试验在25℃进行90分钟，利用蔗糖梯度离心将结合的〔125I〕hNGF与游离的分离。
trkA的自磷酸化在37℃进行5分钟，利用Kaplan(19)描述的改良方法(19)测定磷酸化程度。利用琼脂糖珠固定化的抗磷酸酪氨酸单克隆抗体4G10(UBI)免疫沉淀三硝基甲苯X-100(Triton X-100)裂解的trkA细胞，SDS-PAGE电泳(8％丙烯酰胺-Novex)，免疫印迹，用兔抗trkA多克隆抗体(Dr.David Kaplan提供)检测。利用偶联了碱性磷酸酶(AP)的山羊抗鼠IgG抗体(TAGO)测定trkA。在Primaria聚阳离子24孔微量滴定板上培养PC12细胞至汇合20-30％，将培养基换成高葡萄糖的无血清DMEM，其中补充了N2，并含有hNGF的野生型或突变型变异体。48小时后，在代表性目测区域计数轴突超过两倍细胞体长的细胞个数，表示为其占此区域总细胞数的百分率，总数通常为100-140个细胞。各种突变体和NGF对照的活性至少在不同试验中测定2次。根据13次的测定，最大hNGF浓度时的应答细胞比例为55-75％，平均值为63％。考虑到不同试验中最大应答的变化，用该平均值校正全部数据。hNGF单克隆抗体对〔125I〕hNGF与trkA和p75结合的抑制
在与滤纸结合试验相同的条件下，提高抗hNGF单克隆抗体的浓度，将它们加入25pM的〔125I〕hNGF中，在25℃孵育30分钟。然后，加入每毫升1×106个NIH3T3-trkA或A875-p75细胞(最终体积为0.2ml)，在4℃孵育过夜，期间剧烈混合。然后将样品稀释，并在Whatman GF/C滤纸上过滤，再计数。结果
结果列于表5和表6。
                      表5
           hNGF结构突变体的相对受体结合亲合度
结构突变体 被改变的残基                                                     受体结合trk                               p75                          trk＋p75IC50 a       突变体/NGFb          IC50 a      突变体/NGF            IC50        突变体/NGF
 hNGF(1-118)  无   0.8     1.0     3.0     1.0     0.5     1.0
 hNGF(6-118)  删除S1-P5   7.2     9.0     3.0     1.0     1.3     2.6
 hNGF(10-118)  删除S1-R9   210.0     265.0     32.0     10.7     41.0     82.0
mNGF(1-118)  S3T，I6V，R9M，M37T，G40A，K502，D60A，P61S，D65E，M92T，G94E，V117T，A120G 1.8 2.2 4.1 1.4 0.6 1.2
 hNGF野生型  无   1.2     1.0     2.0     1.0     0.5     1.0
 突变体1  H4A   无     ＞40c     1.4     0.7     1.8     3.6
 突变体2  H4D   ＞1000c     ≥1000c     1.1     0.6     4.3     8.6
 突变体3  R9A   2.0     1.5     1.9     1.0     1.8     3.6
 突变体4  H4A，H8A，R9A   无     ＞40c     3.1     1.6     3.9     7.8
突变体5  S1H，S3D，H4P，P5A，I6(-)H8R 无 ＞40c 2.1 1.0 1.7 3.6
 突变体6  S1Y，S2A，S3E，P5K，I6S，F7S   ＞1000c     ＞1000c     3.5     1.8     1.0     2.0
突变体7  R59K，D60E，P61A，N62R，D65K，S66N 0.5 0.4 1.6 0.8 0.2 0.4
突变体8  M92D，D93E，G94N，+N94/95，Q96L，A97V，A98G 1.8 1.3 8.1 4.1 1.4 2.5
               表6
       NGF结构突变体的生化及生物活性表
                                 trkA自磷酸化a1×10-8M时的最高水平               PC12轴突的长出b结构突变体       突变体/hNGF       EC50ng/ml        突变体/hNGF
hNGF(1-118)  1.0  0.14  1.0
hNGF(6-188)  1.38  0.22  1.6
hNGF(190-118)  0.38  4.2  30.0
mNGF(1-118)  1.08  --  --
hNGF野生型  1.0  0.20  1.5
突变体1  0.47  3.1  21.4
突变体2  0.14  5.0  35.7
突变体3  0.92  0.30  2.1
突变体4  0.23  12.0  85.7
突变体5  0.07  16.0  114.3
突变体6  0.07  12.0  85.7
突变体7  0.88  0.24  1.7
突变体8  1.29  0.12  0.9
a.按照试验步骤中所述和对图2和图5的说明，在1×10-10、1×10-9和1×10-8M进行TrkA自磷酸化。以上数值代表的是用hNGF结构变异体刺激NIH3T3-trkA细胞后，自身磷酸化p140trkA条带的密度计面积与(1-118)hNGF(截短的hNGF)或野生型hMGF(突变体)之比。b.根据试验步骤中所述，和对图6的说明，根据轴突生长来测定PC12细胞的分化。由图6中的数据得出EC50和比值，它们代表的是每一突变体两个单独试验的平均值。
为了开始测定hNGF完全活性所必需的N末端氨基酸，由重组表达hMGF的CHO细胞的条件培养基中分离出hNGF的截短形式(6-118)。由限制性蛋白水解(48)产生9个氨基酸截短的形式(10-118)。(6-118)和(10-118)hNGF由高性能离子交换色谱(HPIEC)纯化，反相HPLC鉴定，N末端序列分析，SDS-PAGE，和氨基酸分析(数据未示)。
然后，将纯化的(6-118)hNGF取代表达trkA，p75和trkA＋p75的细胞上〔125I〕hNGF的相对能力与(10-118)hNGF、(1-118)hNGF或(1-120)hNGF、和(1-118)mNGF相比(图9)。根据它们生物活性方面的相当性(74)，初期试验未表现出(1-118)与(1-120)hNGF之间的结合特性差异。hNGF与trkA(80-100pM)、p75(2-300pM)和PC12细胞(50pM)的相对IC50与其它IC50和Kd报道值(49)(75)(76)(20，21)相差在2至3个因数内。与Vroegop等一样，我们发现hNGF与p75的亲合性略高于一般报道值(IC50＝0.3nM对1-2nM)。
前5个氨基酸缺失导致与重组表达鼠trkA的NIH3T3细胞的结合降低9倍，而与表达p75的A875人黑素瘤细胞或表达trkA＋p75的PC12细胞中几乎没有差别，前者无变化，后者降低3倍。相反，与(I-118)hNGF相比，(10-118)hNGF与trkA和PC12细胞的结合分别下降265和82倍，与p75的结合下降10倍。相对于trkA和PC12细胞，(10-118)hNGF对BC12细胞具有中等强度的取代能力，这显示两种受体对取代等温线形状的影响(图9C)。在本研究中使用的是重组表达鼠trkA的细胞和放射性碘标记的人NGF，但Kahle等的一个先前(10-118)hNGF研究中使用的是人trkA表达细胞和放射性标记的鼠NGF。所以，不管分析中使用的是人的还是啮齿类的trkA或放射性标记的NGF，都可观察到相似的(1-118)hNGF与(10-118)hNGF的结合差异。此外，不论是用人或鼠的NGF为可取代示踪物，(1-118)hNGF与人或鼠trkA的亲合性比(1-188)mNGF大2-3倍。(6-118)hNGF诱导的trkA自磷酸化(图10)和PC12细胞的分化活性(表6)，与(1-118)hNGF诱导的相似。但是，(10-118)hNGF与(1-118)hNGF相比，其在trkA自磷酸化中的能力低至少10倍，而在刺激PC12轴突产生中低80倍(图10，表6)，这与过去的结果一致(48)(49)。综合起来，这些结果表明，N端的前5个氨基酸对完全的hNGF-tr-kA结合活性是重要的，但它们的缺失能够保留大部分受体激活活性和生物活性。继续缺失其后的4个氨基酸对trkA结合和激活作用的不利影响更严重，同时对与p75的结合有一定的影响。
通过免疫沉淀后的代谢标记，或对非标记条件培养基的免疫印迹分析可检测hNGF突变体形式，其表现为经完全加工的14KD的多肽(图11)。利用多克隆抗hNGF抗体的ELISA测定每种突变体的浓度。表达水平相似，而且由多克隆抗体在三种不同类型的免疫活性方面识别出主要存在单一加工种类，由此表明突变型与野生型hNGF具有相近的结构稳定性。
将三个带电氨基酸全部取代成丙氨酸(突变体4：H4A＋H8A＋R9A)，结果丧失了在4℃从trkA上可测竞争性取代〔125II〕hNGF的能力，而野生型hNGF可完全取代示踪物(IC50＝1×10-10M；最大取代＝1×10-9M，图12，上方，表5)。与受体结合力丧失相关的还有效力下降至少10倍，最大trkA自磷酸化效率明显下降4-5倍。突变体4与(1-118)hNGF相比的PC12分化能力的EC50低85倍(图14)，与PC12受体结合情况一致，后者反应了取代主要来自p75以及是反应了突变体与trkA更低的亲和结合力的非取代成份(图12，下方)。
然后分别分析了His4和Arg9变异体。hNT3和hBDNF的N末端区域都具有一个组氨酸，这暗示可能具有保守性的功能作用。以丙氨酸(突变体1)或天冬氨酸(突变体2)取代His4，使得trkA结合力、自磷酸化和刺激PC12细胞分化能力大大减弱(图12，13，14)。如hNGF与其它种类的NGF在位置9的序列改变所揭示，突变R9A对trkA或p75活性没有大影响。但是，其刺激trkA自磷酸化和PC12细胞分化的能力略低(图12，上，中，图13和14)。在25℃，与hNGF相比，P5A和H8A变异体表现出的trkA结合力分别下降3倍和1.5倍，但H4D丧失了约40倍的结合能力；没有观察到与p75结合力的改变。不论在4℃还是在25℃，所有上述突变体与p75结合力的减弱都在2倍之内，这表明诱变引起的总体结构效应是很小的。
为了测试特异性N末端序列是否是神经营养蛋白与trkA反应所必需的，用hBDNF或hNT3的N末端(分别为HSDPA或YAEHKS)替换hNGF的N末端来生成嵌合突变体(突变体5和6)。这些突变体将由此保留hNGF的二碱性His8、Arg9残基。即便在4℃，浓度比产生完全受体取代的(1-118)hNGF高10倍，形成的嵌合神经营养蛋白也不能从trkA上取代〔125I〕hNGF，而且其诱导trkA自磷酸化活性的能力低于突变体1和2(图13)。这些突变体与p75的结合与(1-118)hNGF没有区别，而PC12受体取代可能主要是与p75相互反应(图12，底)。与三丙氨酸突变体4相似，与hNGF的所有结构变异体相比，N末端嵌合突变体是最弱的PC12细胞分化诱导者，IC50改变近100倍。由此表明，hNGF特异性N末端序列是与trkA有关的高亲合性结合和激活性所必需的，但并非与p75结合所必需。
为了证实保持整体结构不变时，N末端序列变异体能够抑制hNGF与trkA的高亲合性反应，大量表达和纯化H4D突变体2和hNT3/hNGF突变体6。在可能的最高浓度即高于(1-118)hNGF的IC50(IC50＝1×10-10M)2000倍时，在4℃，突变体2和6只分别从trkA上取代30％和10％的〔125I〕NGF，与p75的结合曲线相互类似(图15)。与图13所示的结果相一致，纯化的突变体激活trkA自磷酸化的能力明显低于(1-118)hNGF。这些结果表明，各种氨基酸取代之后保留了整体结构稳定性，而且证实是这些特异性修饰作用导致了与trkA结合的高亲合性和自身磷酸化作用的下降。
还产生了一些嵌合突变体，以初步比较可能为hNGF的trkA受体特异性决定簇的另两个可变区的作用。在突变体7和8中，分别将β转角可变区3内的6个残基(Arg59-Ser66)和β转角可变区5内的7个残基(Met92-Ala98)与突变体7和8内相应的hNT3残基交换。突变体7从trkA取代〔125I〕NGF略强于hNGF，突变体8与p75的结合略差(3-5倍)。此外，这些突变体在其与trkA和p75的结合曲线，显示trkA自磷酸化或PC12轴突产生方面与hNGF的差别很小(图12，13，14)。这些结果表明，区域3和5对与trkA结合反应的影响小于N末端。突变体8与p75的低亲合性可能反应了保守性残基Lys95(显示与p75反应)(54)周围的结构改变。
为了测定hNGF结构变异体其Mr＝14,000全加工形式的相对表达水平，利用免疫印迹测试了抗hNGF单克隆抗体和多克隆抗体识别突变体的能力(图11和12)。在等量的于条件培养基中表达的N末端突变体进行免疫印迹时，有几个不能被单克隆抗体识别但全部能被亲合纯化的多克隆抗体识别。H4D突变体和hBDNF或hNT3N末端嵌合突变体没有表现出免疫印迹信号，而H4A＋H8A＋H9A突变体的影响较小(图16)。H4A或R9A突变不影响抗体结合。然后测试了单克隆抗体竞争〔125I〕NGF与trkA或p75结合的能力。提高抗体浓度能够抑制〔125I〕NGF与两种受体的结合；IC50＝1×10-9M对4×10-8M表明，其封闭hNGF与trkA结合的效力比封闭与p75结合的效力强40倍。这些结果表明，N末端至少构成hNGF单克隆抗体的抗原决定簇的部分，而且，抗体与hNGF的结合以较高的亲合性封闭了后者与trkA的反应。对与p75结合的弱抑制表明，或者在N末端外侧有一个亲合性较低的抗原决定簇可能影响到hNGF-p75结合，或者是抗体的空间障碍部分干扰了与p75的结合。初步研究显示，在β转角3区域的确存在着此抗体的一个弱结合抗原决定簇，由hNT3/hNGF嵌合突变体7代表。现在正对此区域在hNGF与p75和trkA结合中的作用进行研究。虽然，尚不确定在抗体存在下，与trkA结合力下降是由于抗体与某个次级抗原决定簇的结合还是由于空间障碍，但数据与对上述一些N末端变异体观察到的即与trkA的结合下降大于与p75的结合下降一致。实施例4hNGF氨基酸变异体：hNGF和hNT3泛向神经营养蛋白的产生与鉴定突变分析目标残基的确定
NGF与其神经营养蛋白家族成员NT3、BDNF和NT4/5具有56％的序列一致性。神经营养蛋白家族成员间的氨基酸序列差异可能部分决定了受体结合的特异性。这些残基可以直接与trk受体结合，或者起抑制其它可变、或保守残基的trk反应的作用。产生hNGF与hNT3之间的hNGF结构域交换突变体，以测试不同残基决定trk受体结合特异性的作用。神经营养蛋白基本序列比较显示，有7个每个由7-10个氨基酸组成的区域包括了大多数的序列差异(80％)(图8，图18A和18B)。在hNGF和hNT3之间，120个氨基酸中有52个不同。这52个差异中的41个(79％)发生在这7个不同区域内。在包括人、鸟、蛇、蛙在内的9个NGF中，这52个残基中有24个是保守的，表明对与trkA结合特异性的影响。对鼠NGF的X光晶体结构检查揭示，4个可变区/结构域在结构上是β转角，1个可变区是β折叠，最后两个是氨基端和羧基端。每个不同区域具有几个带电和极性的侧链，它们与溶剂接触，并能够与受体反应。将hNGF 7个可变区每一个中的部分或全部残基与hNT3的相应结构域交换，由此产生13个嵌合或结构域交换的突变体。对两个差异较小的附加区域也进行了替换：前可变区1和4。这样，总共对不同氨基酸残基中的90％评价了其在决定trkA和trkC特异性方面的作用。嵌合突变体是根据实施例3中所述的寡聚核苷酸指导的诱变和哺乳动物细胞表达产生的。
进行诱变的hNGF单个残基的选择主要是根据它们在鼠NGF的X光晶体结构中的位置。据推测，因为被替换的残基大多数是功能保守性的，所以人和鼠NGF之间的序列差异只产生很小的结构改变(10/12)。根据X光晶体结构坐标和实施例1所述，由计算机产生的鼠NGF模型揭示了使侧链突出进入溶剂并能够与trkA和gP75受体反应的氨基酸。其中有些是经结构域交换突变作用修饰过的可变残基，但大部分是可变区和保守区内的hNGF和HNT3之间的保守性残基。据估计为侧链暴露度很小的侧链，如那些涉及形成二聚体界面的(F12、V14、W21、F49、Y52、W76、T85、F86、W99、F101、T106、A107、V109、V111)、形成疏水性内部的(V36、V38、F53、I71、A89、I102和I104)和结构依赖性而且包埋在内的氢键的(Q51、S78、T91、R100)，很少被修饰。在形成二硫键的半胱氨酸残基、甘氨酸和丙氨酸中，只有A97被修饰。在下列情况中出现例外：残基I30和Y52虽然位于二聚体界面，但它们具有表面侧链；残基L39、L90、M92和A97也形成疏水性表面部分，虽然通过氢键连接，D16、K25、D30、E55、K57、R59、D72、H75残基仍表现为一定程度的接触溶剂的侧链。大多数残基被替换成丙氨酸(64)；有时，在测试受体反应中的特异性作用时，为了维持结构也进行其它取代。hNGF变异体的产生和受体结合鉴定
按照实施例3所述，进行hNGF变异体的诱变、表达和蛋白质鉴定。寡聚核苷酸指导的诱变后，由双脱氧核苷酸测序鉴定全部突变体。在人293细胞中表达hNGF突变体(图11A和B)，用Amicon浓缩(10X)和ELISA定量后，观察到大多数hNGF变异体的表达水平与一般hNGF对照的相近(5-25ug/ml)，但取代了可变区2或3的突变体例外(0.6-1ug/ml)。两种嵌合分子都产生脯氨酸残基的插入或缺失，加上其它侧链功能的某些改变，所以，低回收率可能反映了结构不稳定性。但是，可得量允许进行hNGF变异体与trkA和gp75受体结合亲合性的测定。使用trk和gp75受体的免疫吸附构建物(88)和放射性标记的神经营养蛋白(实施例2所述)，通过竞争性结合来测定每种hNGF变异体的结合亲合性。每一种hNGF变异体至少在293细胞中表达2次，对每一次转染进行2-3次的结合试验。以一个变异体全部测定的平均IC50与hNGF的IC50之比来表示与一般hNGF相比较的相对亲合性。trkA自磷酸化和PC12细胞分化的生物试验
如实施例3所述，评定trkA的自磷酸化来测定hNGF变异体的trkA激酶生化激活作用。发展了一种定量分析法(89)，允许对trkA自磷酸化的EC50进行剂量依赖性测定。在96孔微量滴定板中，具有取自单纯疱疹表面蛋白的肽抗原决定簇标记的一种trkA受体变异体在CHO细胞中稳定表达(88)。此hNGF的抗原决定簇标记的trkA的亲合性与一般受体的相同(88)。在37℃，用8种不断升高的hNGF变异体浓度(10pM-10nM)刺激细胞(对每一浓度有重复孔)10分钟。如实施例3所述，用三硝基甲苯X-100裂解缓冲液裂解细胞，然后转移到民被针对此抗原决定簇标记的单克隆抗体的微量滴定板上。结合后，捕获的trkA再与结合了HRP的抗磷酸酪氨酸单克隆抗体反应，于是发生显色反应。然后读取吸光度，并对浓度作图。hNGF的EC50为100-120pM。根据实施例3所述，进行PC12细胞的分化，但是，细胞先在NGF中生长或引发7-10天。然后收获带轴突的细胞，并在24孔培养皿中平板培养在加有或不力hNGF变异体的普通生长培养基中。根据实施例2所述，在72小时后，定量测定带轴突的细胞的百分比。在对hNGF不应答的trkC转染的PC12细胞(由Dr.Pantelis Tsol-fous和Luis Parada，NCI提供)中，对hNGF/hNT3泛向神经营养变异体的hNT3样trkC生物活性进行评价。结果利用hNGF/hNT3嵌合体对可变残基的诱变分析
将hNGF 7个可变区每一个中的部分或全部残基与hNT3的相应区域交换，由此产生13个嵌合突变体(参见图8，18A，18B)。对两个较稳定的区域(一个在β折叠A内，一个在连接β平面B和C的一保守性β转角内)也进行了取代。用hNGF变异体进行从trkA或gp75免疫吸附融合蛋白质上取代〔125I〕hNGF的竞争性结合试验。这些受体含有trkA或gp75的胞外域和人IgG的Fc区。这些免疫吸附与hNGF结合的亲合性与全trkA和gp75的相近，表现出对神经营养蛋白的亲合性的数量级相同(图19A，B)。取每一种hNGF变异体IC50的平均值，表示为其与一般hNGF的IC50之比(IC50hNGF＝100pM；图23A)。如前所述(图12，15)，对trkA结合最明显的影响是由与hNT3的N末端结构域交换造成的结合亲合性下降近300倍。前可变区1内的三残基交换(β折叠A：V18E＋V20L＋G23T)，产生2-3倍的结合力下降。其它hNGF变体与trkA结合亲合性的下降小于2倍，但可变区3(β转角3)嵌合突变体和C末端的结合力上升(图20A)。与trkA结合力下降相一致，trkA自磷酸化和PC12细胞分化(轴突的延伸)的剂量应答曲线表明，N末端和前可变区1变异体造成活性丧失(图21A，B)。与NT3可变区1和前可变区4的交换使得与gp75的结合力分别下降5和7倍(图20B)。可变区5突变体与gp75的结合也下降了2-3倍。V1交换表现出的gp75结合力下降可能是由于K32换成了R，K34换成了H，E35换成了Q，因为这些残基的丙氨酸取代会使gp75的结合力下降(图8；(54))。这些结果表明，hNGF与trkA和gp75的结合与部分可变神经营养蛋白残基有关。
trkA结合力和受体激活活性的丧失表明，N末端和前可变区1中的可变残基与trk受体特异性有关。通过测试受体与trkC-IgG免疫粘合体的结合和对NGF不应答的trkC转染的PC12细胞的轴突产生对这一可能进行了检测。令人惊奇的是，hNT3的N末端(突变体6)并不赋予trkC反应(图22A，B)，但是，hNGF可变区4内的四氨基酸交换(T81K、H84Q、F86Y、K88R)产生明显的trkG反应(图22A，B)。此变异体较低的trkC亲合性和轴突产生能力表明其它区域可能与有效的trkC反应有关。现在对前可变区1突变体的trkC反应性进行评价，同样对可变区4内的各残基的作用进行了评价。但是，可变区4内的重叠突变显示，V4中的多个残基是trk特异性所必需的。例如，β转角3/4变异体，即改变了在T81K重叠的3个可变残基(S73、Y79Q、T81K)，在trkC-PC12细胞中的轴突产生活性仅为可变区4突变体的5-10％(图22B)。但是，trk功能受到丙氨酸突变体Y79A＋T81A的影响，进一步表明此区域中可变残基在trk受体反应中的关系。可变区4突变体保留了trkA活性表明4个hNT3残基参与了与trkA的结合，但对等的hNGF残基可能在hNGF与trkC的反应具有抑制作用。
虽然神经营养蛋白的N末端结构域似乎不是通用的trk特异性结构域，但hNGF的该区域似乎是trkA反应的一个重要决定簇。用hNGF的前7个残基取代NT3的前6个残基，产生了一个能够同时高亲合性地结合trkA和trkC并能够高强度地将它们激活的泛向性变异体(图24、25和26)。此外，它保留了与gp75的亲合性结合力。所以，产生一个由hNT3开始，将hNGF的可变区如N末端、V2、V3、V4和V5包括在内的有效的泛神经营养蛋白是可能的。反过来，可以通过交换以hNT3β折叠1内(C1)和V4内的可变残基来对hNGF进行修饰使之具有类似的泛向trkA/trkC性能。虽然取代可变区的hNGF/hNT3嵌合体2不产生trkC活性，但它的确使trkA结合力略有下降(1.5倍)。现在对相反的结构域交换即用相应的hNGF结构域取代hNT3的可变区2，进行测试，测试其产生trkA活性的能力和作为候选的trkA/trkC泛神经营养蛋白。单个hNGF可变残基和保守残基的诱变分析：与trkA和gp75反应的hNGF残基结构模型。
利用前述鼠NGF的晶体结构，通过对hNGF的45个残基的定点诱突进行测定，这些残基中的许多具有与溶剂接触的侧链功能性，而且能够与trkA或gp75反应。竞争性结合分析显示，H4、P5A、S13、D30、I31、Y52、R59、R69、Y79、T81和R103突变影响trKA结合力1.8-10倍，而残基E41、K57、D72、N77的突变增加结合力1.5-2倍(图27)。这些结果揭示了这些残基与trkA反应有关，而且表明由能够影响trk特异性的可变残基(H4、P5、I31、R59、Y79、T81)和保守残基(S13、D30、Y52、R69、R103)都可以产生变异体。在残基F12、I31、K32＋K34＋E35、K50、Y52、R69、K74、H75、K88、L112、S113、R114和K115处的突变使与gp75的结合力下降3→50倍(图30)。特别是，存在10nM的突变体(分别在F12、K32＋K34＋K35、Y52、R69、K88和R114＋R115处被交换)时，没有观察到置换，这表明这些残基是gp75结合的关键性决定簇。
利用抗原决定簇标记的trkA进行的自磷酸化分析显示，在残基H4、P5、D30、Y52、R69、Y79＋T81和R103处的突变使激活能力下降1.5-6倍(图28)。在所有这些突变体中都观察到了trkA自磷酸化效力的显著下降(20一60％)，残基F12突变例外。这些结果与PC12细胞的分化能力相一致；H4、F12、D30、Y52、R69、Y79＋T81和R103处的突变使EC50下降2-50倍。最近对其它hNGF变异体进行了评价，包括P5突变。有趣的是，其突变对trkA结合和激活trkA自磷酸化的影响都很小的残基能够降低trkA自磷酸化的效率。trkA自磷酸化的减弱可以解释由R69和Y79＋T81诱导的PC12细胞分化的减弱。另一方面，R69突变大大降低与p75的结合力，p75在hNGF信号转导中的作用尚不清楚，与p75反应性的丧失可能导致生物活性的降低。正在就降低hNGF与p75结合力的其它hNGF变异体对这种可能性进行研究。
根据鼠NGF的结构，由计算机建立了与trkA和gp75反应的残基的模型。由此试验发现了两个主要的trkA反应区：1)N末端(H4、P5)，晶体结构未知；和2)由β折叠C和D的Y79、T81、H84和R103构成的一表面。β折叠A和B的残基V18，V20，G23，Y52和R69部分参与构成一延伸的包围β折叠链的表面。靠近Y52区域和β折叠A残基的是第二原聚体的D30和I31。这两个残基从表面略微突出进入溶剂，但是，它们可能参与构成由β折叠残基构成的一连续的结合表面。
发现的两个主要的p75反应区是：1)一原聚体的可变区1和另一原聚体的β折叠B和C，2)不同原聚体C末端和β转角3内的保守性残基。与β折叠对形成的间隙间的trkA相关残基相反，p75反应性残基是十分暴露的。正如(54)从β发夹转角1可变区突出的K32和K34所示。我们发现，来自另一原聚体的邻近残基K50和Y52与p75结合有关。对与p75的结合具有重要贡献的K88位于此区域内，但并不高度外露。另一结合表面由K74(β转角3)，末端的R114和K115(C末端)、F12和另一原聚体的R69构成。
根据上述诱变分析发现，现在正对其它有效的泛向神经营养蛋白进行构建和评价。通过hNGF中的以下改变可产生泛向trkA/trkC分子：1)前可变区1(V18E＋V20L＋G23T)加上可变区4(Y79Q＋T18K＋K88R)；2)前可变区1加可变区4中的最少残基取代。在hNGF的N末端的前7个残基进行最少的取代和取代hNT3的前6个残基能够产生泛向trkA/trkC分子。由于H4和P5在各种NGF中是保守的，而且6和7位的2个疏水性残基也是保守的，可以产生以下变异体：1)YASHPIF-hNT3；2)YAHPIF-hNT3；3)YASHPIS-hNT3；4)YAEHPIF-hNT3；5)YAQHPIS-hNT3。用hNGF相应区域取代hNT3的可变区2或4或5或其组合能够产生泛向trkA/trkC神经营养蛋白。用hNGF的前7个残基取代hNT4/5的前9个残基，或结合可变区4或前可变区1内的残基取代，可产生泛向trkA/trkC神经营养蛋白。
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(27)：Cordon-Cardo，C.，Tapley，P.，Jing，S.，Nanduri，V.，O Rourke，E.，Lamballe，F.，Kovary，K.，Klein，R.，Jones，K.R.，Reichhardt，L.F.和Barbacid，M.(1991)，＂细胞＂，66，173-183
(28)：Klein，R.，Lamballe，F.，Bryant，S.，和Barbacid，M.(1992)＂神经元＂(Neuron)8，947-956
(28a)：KleinR.，Parada，L.F.，Coulier，F.和Barbacid，M.(1989)，欧洲分子生物学杂志(EMBOJ.)，8，3701-3709
(29)：Ip，N.Y，Stitt，T.N.，Tapley，P.，Klein，R.，Glass，D.J.，Fandl，J.，Greene，L.A.，Barbacid，M.和Yancopoulos，G.D.(1993)＂神经元＂(Neuron)，10，137-149
(30)：Johnson，D.，Lanahan，A.，Buck，C.R.，Sehgal，A.，Morgan，C.，Mercer，E.，Bothwell，M.和Chao，M.(1986)＂细胞＂，47，545-554
(31)：Radeke，M.J.，Misko，T.P.，Hsu，C.，Herzenberg，L.A.和Shooter(1987)＂自然＂，325，593-597
(32)：Loetscher，H.，Pan，Y.-C.E.，Lahm，H.-W.，Gentz，R.，Brockhaus，M.，Tabuchi，H.，和Lesslauer，W.(1990)＂细胞＂61，351-359
(33)：Smith，C.A.，Davis，T.，Anderson，D.，Solam，L.，Beckmann，M.P.，Jerzy，R.，Dower，S.K.，Cosman，D.，和Goodwin，R.G.(1990)＂科学＂248，1019-1023
(34)：Schall，T.J.，Lewis，M.，Koller，K.J.，Lee，A.，Rice，G.R.，Wong，G.H.W.，Gatanga，T.，G ranger，G.A.，Lentz，R.，Raab，H.，Kohr，W.J.，和Goeddel，D.V.(1990)＂细胞＂61，361-370
(35)：Mallet，S.，Fossum，S.，和Barclay，A.N.(1990)欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)9，1063-1068
(36)：Camerini，D.，Walz，G.，Loenen，W.A.M.，Borst，J.，和Seed，B.(1991)＂免疫学杂志＂(J.Immunol.)，147，3165-3169
(37)：Stamenkovic，I.，Clarke，E.A.，和Seed，B.(1989)欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)8，1403-1410
(38)：Bothwell，M.(1991)＂细胞＂，65，915-918
(39)：Chao，M.V.(1992)＂神经元＂(Neuron)，9，583-593
(40)：Connolly等人，＂细胞生物学杂志＂(J.Cell.Biol.)90：176-1 80(1981)
(41)：Skaper和Varon，＂脑研究＂(Brain Res.)197：379-389(1980)
(42)：Yu，等人，＂生物化学杂志＂(J.Biol.Chem.)255：10481-10492(1980)
(43)：Haleqoua，等人，＂细胞＂22：571-581(1980)
(44)：Tiercy等人，＂细胞生物学杂志＂(J.Cell.Biol.)103：2367-2378(1986)
(45)：Hefti，＂神经科学杂志＂(J.Neu rosci.)6：2155(1986)
(46)：Korsching，TINS第570-573页(Nov/Dec 1986)
(48)：Burton，L.E.，Schmelzer，C.H.，Szonyi，E.，Yedinak，C.，和Gorrell，A.(1992)＂神经化学杂志＂(J.Neurochem.)59，1937-1945
(49)：Kahle，P.，Bu rton，L.E.，Schmelzer，C.H.和Hertel，C.(1992)＂生物化学杂志＂(J.Biol.Chem.)，267，22707-22710
(50)：Maisonpierre，P.C.，Belluscio，L.，Friedman，B.，Alderson，R.F.，Wiegand，S.J.，Furth，M.E.，Lindsay，R.M.和Yancopoulos，G.D.(1990b)，＂神经元＂(Neuron)，5，501-509
(51)：Kalcheim，C.，Carmeli，C.和Rosenthal，A.(1992)＂美国科学院院报＂，89，1661-1665
(52)：Hory-Lee，F.，Russell，M.，Lindsay和Frank，E.(1993)＂美国科学院院报＂，90，2613-2617
(53)：Ibanez，C.，Ebendal，T.，和Persson，H.(1991)欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)10，2105-2110
(54)：Ibanez，C.F.，Ebendal，T.，Barbany，G.，Murray-Rust，J.，Blundell，T.L.，和Persson，H.(1992)＂细胞＂69，329-341
(55)：Ibanez，C.F.，Ilag，L.L.，Mu rray-Rust，J.，和Persson，H.(1993)欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)12，2281-2293
(56)：Suter，U.，Angst，C.，Tien，C.-L.，Drinkwater，C.C.，Lindsay，R.M.and Shooter，E.M.(1992)＂神经科学杂志＂(J.Neurosci.)，12，306-318
(57)：Scopes，R.，＂蛋白质纯化＂(Protein Purification)，Springer-Verlag，NY(1982)
(58)：Schnell，L.，Schneider，R.，Kolbeck，R.，Barde，Y.-A.和Schwab，M.E.(1994)，＂自然＂，367，170-173
(59)：McDonald，N.Q.，Lapatto，R.，Murray-Rust，J.，Gunning，J.，Wlodawer，A.和Blundell，T.L.(1991)＂自然＂，354，411-414
(60)：Schlunegger，M.P.和Gr_tter，M.G.(1992)，＂自然＂，358，430-434
(61)：McDonald，N.Q.和Hendrikson，W.A.(1993)，＂细胞＂，73，421-424
(62)：Ponder，J.W.和Richards，F.M.(1987)＂分子生物学杂志＂(J.Mol.Biol.)，193，775-791
(63)：Bernstein，F.C，Koetzle，T.F.，Williams，G.J.B.，Meyer，Jr.，E.F.，Brice，M.D.，Rodgers，J.R.，Kennard，O.，Shimanouchi，T.和Tasumi，M.(1977)＂分子生物学杂志＂(J.Mol.Biol.)，112，535-542
(64)：Cunningham，B.C.和Wells，J.A.(1989)＂科学＂，244，1081-1085
(65)：Rosenthal，A.，Goeddel，D.V.，Nguyen，T.，Martin，E.，Burton，L.E.，Shih，A.，Laramee，G.R.，Wurm，F.，Mason，A.，Nikolics，K.，和Winslow，J.W.(1991)＂内分泌学＂(Endocrinol.)129，1289-1294
(66)：Kunkel，T.A.(1985)＂美国科学院院报＂，82，488-492
(67)：Kunkel等人1987
(68)：Graham，F.L.，Smiley，J.，Russell，W.C.，和Nairn，R.(1977)＂遗传病毒学杂志＂(J.Gen Virol.)36，59-77
(70)：Gorman，C.M.，Gies，D.R.和McCray，G.(1990)＂DNA蛋白工程技术＂(DNAProtein Eng.Tech.)，2，3-10
(71)：Escandon，E.，Burton，L.E.，Szonyi，E.，和Nikolics，K.(1993)＂神经科学杂志＂(J.Neurosci.)Res.34，601-613
(72)：Zoller，M.J.和Smith，M.(1983)＂酶学方法＂(Methods in Enzymol.)100，468-500
(73)：Messing，J.，Crea，R.，Seeburg，P.(1981)＂核酸研究＂(Nucleic Acids Res.)9，309
(74)：Schmelzer，C.H.，Burton，LE.，Chan，W.P.，Martin，E.，Gorman，C.，Canova-Davis，E.，Ling，V.T.，Sliwkowskl，M.B.，McCray，G.，Briggs，I.A.，Nguyen，T.H.，和Polastri，G.(1992)＂神经化学杂志＂(J.Neurochem.)59，1675-1683
(75)：Vroegop，S.，Decker，D.，Hinzmann，I.，Poorman，R.，和Buxser，S.(1992)＂蛋白质化学杂志＂(I.Protein Chem.)11，71-82
(76)：Sutter，A.，Riopelle，R.I.，Hartis-Wattick，R.M.，和Shooter，E.M.(1979)＂蛋白质化学杂志＂(I.Biol.Chem.)254，5972-5982
(77)：Thoenen，H.和Barde，Y.A.(1980)＂生理学回顾＂(Physiol.Rev.)，60，1284-1325
(78)：Lindsay，R.M.，Thoenen，H.和Barde，Y.-A.(1985)＂生物学回顾＂(Dev.Biol.)，112，319-328.
(79)：Barres等人1994，递交用于出版的手稿
(80)：Davies等人，(1993)，＂神经科学杂志＂(J.Neuroscience)13：4215-4223(1993)
(81)：Shelton等人，(December，1984)，＂美国科学院院报＂81：7951-7955
(82)：Shelton等人，(April，1986)，＂美国科学院院报＂83：2714-2718
(83)Rosenthal等人，(1990)，＂神经元＂(Neuron)，4：767-773
(84)：Hulme，E.C.和Birdsall，M.J.M.，＂在报道分子结合研究中的策略＂(Strategy andTactics in Receptor Binding Studies)，p63-212＂报道分子-配基相互作用＂(Receptor-LigandInteractions)，E.C.Hulme编辑
(85)：Grotz等人，＂欧洲生物化学＂(Eur.J.Biochem.)204：745-749(1992)
(86)：Arenas等人，＂自然＂367：368-371(1994)
(87)：Oefner等人，欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)，11：3921-3926(1992)
(88)：Shelton等人，(1994)，递交用于出版的手稿
(89)：Sadick等人，(1994)，递交用于出版的手稿
                           序列表(1)一般信息：(i)申请人：Genentech，Inc.(ii)发明名称：泛向神经营养因子(iii)序列数目：8(iv)通信地址：
(A)地址：Genentech，Inc.
(B)街道：460 Point San Bruno Blvd
(C)城市：South San Francisco
(D)州：加利福尼亚
(E)国家：美国
(F)邮编：94080(v)计算机可读形式：
(A)记录介质类型：5.25英寸，360Kb软盘
(B)计算机：IBM PC兼容型
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：patin(Genentech)(vi)本申请数据：
(A)申请号：
(B)申请日：
(C)分类：(vii)在先申请数据：
(A)申请号：
(B)申请日：(viii)律师/代理人信息：
(A)姓名：Torchia，Timothy E.
(B)登记号：36,700
(C)卷宗/档案号：905PCT(ix)通讯信息：
(A)电话：415/225-8674
(B)传真：415/952-9881
(C)电传：910/371-7168(2)SEQ ID NO：1信息：(i)  序列特征：
(A)长度：120个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Ser   Ser   Thr   His   Pro   Val   Phe   His   Met   Gly   Glu   Phe   Ser   Val   Cys1                       5                            10                            15Asp   Ser   Val   Ser   Val   Trp   Val   Gly   Asp   Lys   Thr   Thr   Ala   Thr   Asp
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                     35                            40                            45Asn   Ser   Val   Phe   Arg   Gln   Tyr   Phe   Phe   Glu   Thr   Lys   Cys   Arg   Ala
                     50                            55                            60Ser   Asn   Pro   Val   Glu   Ser   Gly   Cys   Arg   Gly   Ile   Asp   Ser   Lys   His
                     65                            70                            75Trp   Asn   Ser   Tyr   Cys   Thr   Thr   Thr   His   Thr   Phe   Val   Lys   Ala   Leu
                     80                            85                            90Thr   Thr   Asp   Glu   Lys   Gln   Ala   Ala   Trp   Arg   Phe   Ile   Arg   Ile   Asp
                     95                           100                           105Thr   Ala   Cys   Val   Cys   Val   Leu   Ser   Arg   Lys   Ala   Thr   Arg   Arg   Gly
                    110                           115                           120(2)SEQ ID NO：2信息：(i)  序列特征：
(A)长度：119个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ IDNO：2：Tyr   Ala   Glu   His   Lys   Ser   His   Arg   Gly   Glu   Tyr   Ser   Val   Cys   Asp1                       5                            10                            15Ser   Glu   Ser   Leu   Trp   Val   Thr   Asp   Lys   Ser   Ser   Ala   Ile   Asp   Ile
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(A)长度：120个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Ser   Ser   Ser   His   Pro   Ile   Phe   His   Arg   Gly   Glu   Phe   Ser   Val   Cys1                       5                            10                            15Asp   Ser   Val   Ser   Val   Trp   Val   Gly   Asp   Lys   Thr   Thr   Ala   Thr   Asp
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                     65                            70                            75Trp   Asn   Ser   Tyr   Cys   Thr   Thr   Thr   His   Thr   Phe   Val   Lys   Ala   Leu
                     80                            85                            90Thr   Met   Asp   Gly   Lys   Gln   Ala   Ala   Trp   Arg   Phe   Ile   Arg   Ile   Asp
                     95                           100                           105Thr   Ala   Cys   Val   Cys   Val   Leu   Ser   Arg   Lys   Ala   Val   Arg   Arg   Ala
                    110                           115                           120(2)SEQ ID NO：4信息：(i)序列特征：
(A)长度：119个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：His   Ser   Asp   Pro   Ala   Arg   Arg   Gly   Glu   Leu   Ser   Val   Cys   Asp   Ser1                       5                            10                            15Ile   Ser   Glu   Trp   Val   Thr   Ala   Ala   Asp   Lys   Lys   Thr   Ala   Val   Asp
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                     50                            55                            60Met   Gly   Tyr   Thr   Lys   Glu   Gly   Cys   Arg   Gly   Ile   Asp   Lys   Arg   His
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                    110                           115                     119(2)SEQ ID NO：5信息：(i)序列特征：
(A)长度：119个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Tyr   Ala   Glu   His   Lys   Ser   His   Arg   Gly   Glu   Tyr   Ser   Val   Cys   Asp1                       5                            10                            15Ser   Glu   Ser   Leu   Trp   Val   Thr   Asp   Lys   Ser   Ser   Ala   Ile   Asp   Ile
                     20                            25                            30Arg   Gly   His   Gln   Val   Thr   Val   Leu   Gly   Glu   Ile   Lys   Thr   Gly   Asn
                     35                            40                            45Ser   Pro   Val   Lys   Gln   Tyr   Phe   Tyr   Glu   Thr   Arg   Cys   Lys   Glu   Ala
                     50                            55                            60Arg   Pro   Val   Lys   Ash   Gly   Cys   Arg   Gly   Ile   Asp   Asp   Lys   His   Trp
                     65                            70                            75Asn   Ser   Gln   Cys   Lys   Thr   Ser   Gln   Thr   Tyr   Val   Arg   Ala   Leu   Thr
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                     95                           100                           105Thr   Ser   Cys   Val   Cys   Ala   Leu   Ser   Arg   Lys   Ile   Gly   Arg   Thr
                    110                           115                     119(2)SEQ ID NO：6信息：(i)序列特征：
(A)长度：130个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Gly   Val   Ser   Glu   Thr   Ala   Pro   Ala   Ser   Arg   Arg   Gly   Glu   Leu   Ala1                       5                            10                            15Val   Cys   Asp   Ala   Val   Ser   Gly   Trp   Val   Thr   Asp   Arg   Arg   Thr   Ala
                     20                            25                            30Val   Asp   Leu   Arg   Gly   Arg   Glu   Val   Glu   Val   Leu   Gly   Glu   Val   Pro
                     35                            40                            45Ala   Ala   Gly   Gly   Ser   Pro   Leu   Arg   Gln   Thr   Phe   Phe   Glu   Thr   Arg
                     50                            55                            60Cys   Lys   Ala   Asp   Asn   Ala   Glu   Glu   Gly   Gly   Pro   Gly   Ala   Gly   Gly
                     65                            70                            75Gly   Gly   Cys   Arg   Gly   Val   Asp   Arg   Arg   His   Trp   Val   Ser   Glu   Cys
                     80                            85                            90Lys   Ala   Lys   Gln   Ser   Tyr   Val   Arg   Ala   Leu   Thr   Ala   Asp   Ala   Gln
                     95                           100                           105Gly   Arg   Val   Gly   Trp   Arg   Trp   Ile   Arg   Ile   Asp   Thr   Ala   Cys   Val
                    110                           115                           120Cys   Thr   Leu   Leu   Ser   Arg   Thr   Gly   Arg   Ala
                    125                           130(2)SEQ ID NO：7信息：(i)序列特征：
(A)长度：34碱基
(B)类型：核酸
(C)股性：单链
(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：GGTCACCCAC AAGCTTTCAC  TGGCACATAC  CGAG  34(2)SEQ ID NO：8信息：  (i)序列特征：
(A)长度：50碱基
(B)类型：核酸
(C)股性：单链
(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：GTACTCCCCT  CGGTGGAAGA  TGGGATGGCT  CGAGGACCGT  TTCCGCCGTG  50

Claims (28)

1.一种泛向神经营养蛋白，其特征在于，它含有：
(a)赋予NGF特异性的结构域；
(b)赋予BDNF特异性的结构域；和
(c)赋予NT3特异性的结构域。
2.如权利要求1所述的泛向神经营养蛋白，其特征在于，该泛向神经营养蛋白与神经营养蛋白受体的结合至少为天然神经营养蛋白配体与该受体结合的80％。
3.如权利要求1所述的泛向神经营养蛋白，其特征在于，该泛向神经营养蛋白至少与4种不同的神经营养蛋白受体结合。
4.如权利要求3所述的泛向神经营养蛋白，其特征在于，所述的受体是tr-kA、trkB和trkC以及p75。
5.如权利要求1所述的泛向神经营养蛋白，其特征在于，该泛向神经营养蛋白是泛向的NT3。
6.如权利要求1所述的泛向神经营养蛋白，其特征在于，该泛向神经营养蛋白是泛向的NGF。
7.如权利要求1所述的泛向神经营养蛋白，其特征在于，该泛向神经营养蛋白是泛向的NT4/5。
8.如权利要求1所述的泛向神经营养蛋白，其特征在于，该泛向神经营养蛋白是泛向的BDNF。
9.如权利要求5所述的泛向神经营养蛋白，其特征在于，该泛向NT3是MNTS-1。
10.一种泛向神经营养蛋白，其特征在于，它含有单一的氨基酸改变，而且该泛向神经营养蛋白至少与3种不同神经营养蛋白受体结合。
11.如权利要求10所述的泛向神经营养蛋白，其特征在于，该泛向神经营养蛋白在对应NT3中D15的位置上用丙氨酸残基置换。
12.如权利要求10所述的泛向神经营养蛋白，其特征在于，它是D15ANT3。
13.如权利要求10所述的泛向神经营养蛋白，其特征在于，它是D16ANGF。
14.编码权利要求1所述的泛向神经营养蛋白的核酸。
15.含有权利要求14所述的核酸的表达载体。
16.含有权利要求14所述的核酸的宿主细胞。
17.一种制备权利要求1所述的泛向神经营养蛋白的方法，其特征在于，包括：将含有编码该泛向神经营养蛋白的核酸的宿主置于允许表达该泛向神经营养蛋白的条件下。
18.一种含有权利要求1所述的泛向神经营养蛋白的药物组合物。
19.一种治疗神经性疾病的方法，其特征在于，它包括：给病人施用权利要求1所述的泛向神经营养蛋白。
20.一种泛向神经营养蛋白，其特征在于它是共价的异源二聚体。
21.如权利要求20所述的泛向神经营养蛋白，其特征在于，该异源二聚体含有NT3单体和NGF单体。
22.如权利要求20所述的泛向神经营养蛋白，其特征在于，该异源二聚体含有NT3单体和NT4/5单体。
23.如权利要求20所述的泛向神经营养蛋白，其特征在于，该异源二聚体含有NT3单体和BDNF单体。
24.如权利要求20所述的泛向神经营养蛋白，其特征在于，该异源二聚体含有NGF单体和BDNF单体。
25.如权利要求20所述的泛向神经营养蛋白，其特征在于，该异源二聚体含有NGF单体和NT4/5单体。
26.一种泛向的共价同源二聚体，其特征在于，它含有两个MNTS-1单体。
27.一种泛向的共价同源二聚体，其特征在于，它含有两个D15A NT3单体。
28.如权利要求6所述的泛向神经营养蛋白，其特征在于，该泛向NGF是D16A-V18E-V20L-G23T-Y79Q-T81K-H84Q-F86Y-K88R-NGF。
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