FI120237B - Pantrofiininen neurotroofiini-polypeptidi - Google Patents

Description

PANTROFIININEN NEUROTROOFIINI-POLYPEPTIDI

Keksinnön ala Tämä patenttihakemus koskee proteiineja, jotka ovat osallisina hermokudoksen, erityisesti hermosolujen, kasvussa, säätelyssä ja ylläpitämisessä. Erityisesti se koskee pantrofiinisia neurotroofisiä tekijöitä, joilla on monta neurotroofista spesifisyyttä (MNTS-muunnelmat).

Keksinnön tausta

Selkärankaisten hermosolujen erilaistuneen toiminnan säilymiseen ja ylläpitämiseen vaikuttaa neurotrofiineiksi kutsuttujen spesifisten proteiinien saatavillaolo. Kehittyvien hermosolujen eloonjääminen riippuu näiden tekijöiden saannista niiden kohdealueilta ja neurotrofiinien rajoitettu tuotanto johtaa tarpeettomien hermosolujen kuolemaan [katsauksen saamiseksi katso (1) ; (2) ] . Erilaiset neurotrofiinit poikkeavat toiminnallisesti toisistaan kykynsä puolesta tukea selvästi erottuvien hermosolupopulaatioiden eloonjäämistä keskushermostossa ja ääreishermostossa; (3), (4); (5), (80).

Neurotrofiiniryhmä on erittäin homologinen ryhmä, joka sisältää NT3: n (6), (7); (5); (8); (9); (10); hermokasvutekijän (NGF) (11) ; (12) ; aivoperäisen neurotroofisen tekijän (BDNF) • · j·.·. (13); (14); ja neurotrofiini 4/5:n (NT4/5) [(15) (16), (17)].

• · *. I Tutkimukset viittaavat siihen, että neurotrofiinit • · · • · · * * välittävät intrasellulaarista viestintää ainakin osittain ··· ···· aktivoimalla ligandista riippuvaisella tavalla sellaisten • · · *·ί·* tyrosiinikinaasia sisältävien reseptoreiden luokkaa, joiden • ·· V * MT = 140 - 145 000 ja jotka tunnetaan trk-reseptoreina (18); (19), (21); (20), (22); (23); (24); (25); (26). Siten neu- : Γ: rotrofiinien signaalia välittävä reaktiosarja alkaa tällä suu- :***· rella affiniteetilla tapahtuvalla sitoutumisella spesifisiin ··· tyrosiinikinaasireseptoreihin ja niiden aktivoitumisella ja • · · • · *..· sen jälkeen tapahtuvalla reseptorin autofosforylaatiolla (19) ; • · *···* (27) . Vaikka neurotrof iinien ja erilaisten trk-reseptoreiden Γ**: välillä ilmenee jonkinasteista ristikkäistä • · ··· • · • · ··· 2 reseptorivuorovaikutusta, vallitsevat spesifisyydet näyttävät olevan NGF/trkA, BDNF/trkB ja NT3/trkC, kun taas NT4/5 näyttää toimivan vuorovaikutuksessa ensisijaisesti trkB:n kanssa yhtä tehokkaasti kuin BDNF (27); (19) (21); (25); (22); (28); (18); (28a). Samalla kun trkC reagoi yksinomaan NT3:een (25); (26), trkA ja trkB voivat reagoida in vitro tietyissä olosuhteissa moniin neurotrofiineihin (6); (23). Kuitenkin neuronaalinen ympäristö rajoittaa trkA:n ja trkB:n kykyä reagoida ei-edullisiin neurotroofisiin ligandeihin (29). Reseptoreiden trk-ryhmän lisäksi neurotrofiinit voivat sitoutua myös eri reseptoriluokkaan, josta käytetään termiä p75 matalan affiniteetin NGF-reseptori (p75); [(30); (31)], jolla on tuntematon transmembraaninen viestintämekanismi, muuta joka on rakenteellisesti lähellä reseptorigeeniperhettä, joka sisältää tuumorinekroositekijän reseptorin (TNFR), CD40:n, 0X40:n ja CD27:n [(32); (33); (34), (35); (36); 37)]. Gp75:n osuus suuren affiniteetin sitoutumispaikkojen muodostamisessa ja neurotrofiinien signaalien välittämisreaktioissa on vielä epäselvä [katsauksen saamiseksi katso (38); (39)].

Neurotrofiinien primaarisen aminohapposekvenssin tutkiminen paljastaa seitsemän aluetta, joilla on kullakin 7 y.' - 10 jäännöstä ja jotka selittävät 85 % sekvenssien eroavai- • · I suudesta ryhmän jäsenten kesken.

• · · ·. I Hermokasvutekijä (NGF) on 12 0 aminohapon polypeptidin • · · *·’·* muodostama homodimeerinen proteiini, jolla on huomattavat • · · ··.: vaikutukset ääreishermoston tuntohermosolujen ja sympaattisten ·.·.· hermosolujen kehittymiseen. NGF toimii spesifisten solun pinnan • · · ’ reseptoreiden kautta reagoivien hermosolujen pinnalla hermosolujen eloonjäämisen ja neuriittien kasvun ylläpitämi- seksi ja neurokemiallisen erilaistumisen tehostamiseksi. NGF: n .**·. toimintoja seuraavat muutokset hermosolujen membraaneissa (40), • · · (41); hermosolujen proteiinien fosforylaatiotilassa (42), (43) • » · : ·* ja sellaisten tiettyjen mRNA-molekyylien ja proteiinien • · *·..* runsaudessa, joilla on todennäköisesti osuutta hermosolujen ·'·*: erilaistumisessa ja toiminnassa [katso esimerkiksi (44) ] .

• · • · · • · • · • · · 3

Etuaivojen kolinergiset hermosolut reagoivat myös NGF:ään ja voivat edellyttää NGF:ää troofisen ylläpitämisen vuoksi (45). Todellakin NGF:n ja sen reseptorin jakautuminen ja ontogeneesi keskushermostossa (CNS) viittavat siihen, että NGF toimii kohteesta peräisin olevana neurotroofisena tekijänä basaalisille etuaivojen kolinergisille hermosoluille (46) , (81) .

Tiedetään vähän NGF:n aminohappojäännöksistä, jotka ovat välttämättömiä trkA-tyrosiinikinaasireseptorin kanssa tapahtuvan vuorovaikutuksen kannalta. Biologisen aktiivisuuden ja reseptorisitoutumisen merkittäviä häviöitä havaittiin ihmisen ja hiiren NGF:n puhdistetuilla homodimeereilla, jotka edustivat homogeenisiä typistettyjä muotoja, jotka oli muunnettu amino- ja karboksipäätteistä (47); (48), (49). 109 aminohapon lajin (10-118)hNGF, joka oli tulosta puhdistetun rekombinantin humaanisen NGF:n N-päätteen 9 jäännöksen häviöstä ja C-päätteen kahden viimeisen jäännöksen häviöstä, on 300 kertaa tehottomampi hiiren [125I]NGF:n syrjäyttämisessä ihmisen trkA-reseptorista kuin (1-118)HNGF (49). Se on 50 - 100 kertaa vähemmän aktiivinen dorsaalisen juuriganglion ja sympaattisen ganglion eloonjäämisessä verrattuna (1-118)hNGF:ään (48). (1-118) HNGF: llä on huomattavasti pienempi • · *. * trkA-tyrosiinikinaasin autofosforylaatioaktiivisuus (49).

• · · \ [ NT3:n transkriptio on havaittu laajassa valikoimassa • · · *·*·* perifeerisiä kudoksia (esim. munuaisessa, maksassa, ihossa) • · · ...ί sekä keskushermostossa (esim. pikkuaivoissa, hippokampuksessa) (5); (7), (82). Kehittymisen aikana NT3 : n mRNA: n transkriptio • · · ·/· l on huomattavinta niillä keskushermoston alueilla, joilla hermosolujen proliferaatio, siirtyminen ja erilaistuminen ovat :*·*; käynnissä (50). Asiaa tukevat todisteet NT3: n osuudesta .·**. hermosolujen kehittymisessä sisältävät NT3:n edistävän • · · vaikutuksen hermostopienan soluihin (51) ja oligodendrosyyt- • · · : ·* tien prekursorisolujen proliferaation stimuloimisen in vivo • · * ·...* (79). NT3 ylläpitää myös in vitro tuntohermosoluj en ·*·*: eloonjäämistä nodoosigangliosta (NG) (nodose ganglion) (7) ; • · • · · • · • · • · · 4 (5), (83) ja lihaksen tuntohermosolujen populaation eloon jäämistä dorsaalisesta juurigangliosta (DRG) (52). Näiden in vitro -tutkimusten lisäksi hiljattain esitetty raportti osoitti, että NT3 estää in vivo locus coeruluksen täysin kehittyneiden keskeisten noradrenergisten hermosolujen rappeutumisen mallissa, joka muistuttaa solukatomallia, joka on havaittu Alzheimerin taudissa. Viime aikoina ei ole julkaistu trkC:n sitoutumisen kannalta välttämättömiä aminohappojäännöksiä koskevia raportteja.

On tehty joitakin rajoitettuja yrityksiä luoda kimeerisiä tai pan-neurotroofisia tekijöitä [katso (53); (56) ; (54), (55)].

Yhteenveto keksinnöstä

Keksinnön kohde on pantrofiinisten neurotrofiinien tuottaminen ja näiden pantrofiinisten neurotrofiinien käyttökelpoisten määrien tuottaminen käyttäen yhdistelmä-DNA-tekniikkaa.

Keksinnön muu kohde on tuottaa pantrofiiniset neurotrofiinit koodaavat rekombinantit nukleiinihapot, ja eks-pressiovektorit ja isäntäsolut, jotka sisältävät pantrofiiniset neurotrofiinit koodaavan nukleiinihapon.

Keksinnön kohde on erityisesti patenttivaatimuksen 1 • · I. I johdanto-osan mukainen pantrofiininen neurotrofiini- • · · L· • · ‘ polypeptidi, joka sisältää ihmisen NT-3 (hNT-3) tai ihmisen • · · ***** NGF (hNGF) aminohapposekvenssin, jossa aminohappo on • · · ···· substituoitu aminohappoasemassa, j oka vastaa asemaa D15 NT3 : ssa *.:.* tai asemaa D16 hNGF: ssa.

• · · V * Edellä esitettyjen mukaisesti tämä keksintö tuottaa rekombinantit pantrofiiniset neurotrofiinit ja eristetyt tai :*·*: rekombinantit nukleiinihapot, jotka koodaavat tämän keksinnön neurotrof iinit. Tuotetaan myös ekspressiovektorit, jotka • · · ..*. sisältävät pantrofiinisen neurotrofiinin koodaavan DNA:n, joka • · · ·#>·* on kytketty toiminnallisesti transkriptiota ja translaatiota • · ’···’ säätelevään DNA:han, ja isäntäsolut, jotka sisältävät ·***: nukleiinihapot.

• · • · · • * • · • · · 5 Tämän keksinnön muu näkökohta tuottaa menetelmät pantrofUnisten neurotrofiinien tuottamiseksi, jolloin menetelmät käsittävät ekspressiovektorilla transformoidun isäntäsolun viljelemisen ja pantrofiinisen neurotrofiinin koo-daavan nukleiinihapon ilmentymisen aikaansaamisen rekom-binantin neurotrofiinin tuottamiseksi.

Keksinnön ominaispiirteet selviävät alan ammattimiehille seuraavasta kuvauksesta yhdessä liitteenä olevien kuvien kanssa. Keksinnön tunnusomaiset piirteet on määritelty patenttivaatimuksissa.

Lyhyt selostus piirroksista

Kuva 1 esittää, että suuri homologia hiiren NGF:n (SEQ. ID. NO. 1) ja ihmisen NT-3:n (SEQ. ID. NO. 2) välillä sallii NT-3:n mallin rakentamisen perustuen NGF:n 3D-rakenteeseen. Nuolet osoittavat β-juosteita. β-juosteen merkinnät kuten lähteessä McDonald et ai., (1991) (59). Aminohapot, jotka poikkeavat NGF:n ja NT-3:n välillä, ovat harmaissa laatikoissa. Osat, joissa on sekava rakenne, on varjostettu viivoituksella.

Kuvat 2A, 2B, 2C, 2D ja 2E esittävät valittujen mu-tanttien biologisia vaikutuksia dorsaalisten juuriganglioiden (DRG) hermosolujen eloonjäämiseen ja neuriitin pitenemiseen PC12/trkC-soluissa. E9-kananpojan DRG-hermosoluja viljeltiin • · 72 tunnin ajan 293-solujen käytetyn elatusaineen läsnäollessa, • · ‘.I joka sisälsi NT-3:n proteiineja tai mutanttiproteiineja.

• · · ' l Mutanttien aiheuttama vaste ilmaistu prosenttina NT-3:n vas- • · · ···· teestä. A) 5 ng/ml NT-3:a, R103A/D105A: ta ja R103A:ta. B) 1 :.i.: ng/ml NT-3:a, R103M:ää, R103K:ta, Nl:tä, Y51A:ta. C) 0,2 ng/ml * · · ’.· · 0,2 ng/ml NT-3:a, YllA:ta, T22Q:ta ja K80A Q83A:ta. Virhe on kolmen kerranteen määritysten keskihajonta.

Valetransfektoiduista (mock transfected) soluista saadun elatusaineen vaste vähennettiin kustakin tietopisteestä ja oli ··» vastaavasti 23 % 200 pg/ml:n kokeessa, 23 % 1 000 pg/ml:n • · · kokeessa ja 29 % 5 000 pg/ml:n kokeessa. (D) Joko NT: 3: a tai • · *·;·’ R68A-mutanttia sisältävän käytetyn elatusaineen aiheuttama :1·1: PC12/trkC-solujen vaste. Niiden solujen pro- • · • · · • · • · • · · 6 senttiosuus, joiden neuriitit neurotrofiinien eri annosten indusoimia. Sekä neuriitteja omaavien ja neuriitteja omaa-mattomien solujen summa oli vakio NT-3:n ja R68A:n osalta kaikilla annoksilla. (E) Hermosolujen eloonjääminen DRG:stä. NT-3:n, R68A:n tai R114A/K115A:n indusoima vaste ilmaistuna elossa olevien solujen lukumääränä. Tulokset ovat kolmen kerranteen määritysten keskiarvo ± keskihajonta. Valetrans-fektoidun käytetyn elatusaineen aiheuttama vaste vähennettiin tietopisteistä ja oli 20 ± 4 elävää solua.

Kuvat 3A, 3B ja 3C esittävät NT-3:n sitoutuvia epi-tooppeja sen reseptoreihin trkC ja gp75. On esitetty NT3-malli, jossa sitoutuvat determinantit monomeereista A ja B on esitetty vastaavasti vaaleanharmaana ja tummanharmaana. (A) Epitooppi trkC-reseptoriin sitoutumiseksi . (B) Sivukuva trkC-epitoopista. D15:n ja Y51:n asemat suhteessa trkC:n sitoutuviin determinantteihin. (C) Epitooppi gp75-reseptoriin sitoutumiseksi.

Kuvat 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 41 ja 4J esittävät NT3-mutanttien seulontaa parannettujen BDNF:n ja NGF:n kaltaisten aktiivisuuksien osalta. PC12-solut tai PC12-solu-linja, joka ilmensi trkB:n, saatettiin viljelyyn kollageenilla päällystetyille maljoille. PC12/trkB-solulinj a käsiteltiin • · PC12-elatusaineella, joka oli täydennetty joko BDNF:llä (A), • · NT3:lla (B) , mutantti-Dl5A: 11a (C) tai valetransfektoitujen • · · *· 293-solujen päällysnesteellä (E). PC12-solut käsiteltiin • φ · ···· PC12-elatusaineella, joka oli täydennetty joko NGF:llä (F), :.i.: NT3:11a (G), Sl:llä (H), Dl5A:lla (D) , MNTS-l:llä (I) tai • · · V · valetransfektoitujen 293-solujen päällysnesteellä (J).

Edustavat alueet valokuvattiin kolmen päivän kuluttua käsittelystä.

;***: Kuvat 5A, 5B, 5C ja 5D esittävät, että MNTS-1 sitoutuu • · · suurella affiniteetilla ihmisen trkA-, trkB- ja • · · • · *,.· trkC-reseptoreihin. Syrjäyttämiskäyrät käyttäen reseptorin im- • · *···’ munoadhesiine j a (immunoadhesins) määritettiin, kun läsnä : ·’: olivat vakiomäärä leimattua neurotrofiinia (trkA:n, trkB:n ja • · 1 · · • · • · »·« 7 trkC:n tapauksessa 50 pM; gp75:n tapauksessa 100 pM) ja lisääntyvät määrät leimaamatonta kilpailijaa; (o) HNGF, (Δ) hBDNF, ( ) NT-3, (Δ) MNTS-1, (X) SI, ( + ) D15A. (A) 125I-NGF:n syrjäyttäminen ihmisen trkA-reseptorista. (B) I-BDNF:n syrjäyttäminen ihmisen trkB-reseptorista. (C) 125I-NT-3:n syrjäyttäminen ihmisen trkC-reseptorista. (D) I-NT-3:n syrjäyttäminen ihmisen gp75-reseptorista.

Kuvat 6A, 6B ja 6C kuvaavat MNTS-1:n indusoimaa trkA:n, trkB: n j a trkC: n autofosf orylaatiota. PC 12-muunnelma saatettiin alttiiksi neurotroofisille tekijöille ja mutanteille konsentraation ollessa 25 ng/ml 5 minuutin ajaksi 37 °C:n lämpötilassa ja määritykset suoritettiin, kuten on kuvattu kokeellisissa menetelmissä. (A) PC12-solujen vaste, kun mitään tekijää ei ollut lisätty ja kun oli lisätty NGF:ää, NT-3:a, Sl:tä, Dl5A:ta, MNTS-1:tä ja valetransfektoitujen 293-solujen päällysnestettä. (B) PC12/trkB-solujen vaste, kun mitään tekijää ei ollut lisätty ja kun oli lisätty NGF:ää, BDNF:ää, puhdistettua NT-3:a, ilmentynyttä NT-3:a, D15A:ta ja valetransfektoitujen 293-solujen päällysnestettä. (C) PC12/trkC-solujen vaste, kun mitään tekijää ei ollut lisätty ja kun oli lisätty NGF:ää, NT-3:a, D15A:ta, Sl:tä, MNTS-1:tä ja valetransfektoitujen 293-solujen päällysnestettä.

• · !.! Neurotroofisten tekijöiden alla olevat numerot osoittavat • · · • · * immunosaostamiseen käytetyn antiseerumin tyyppiä, 443 on • · · *· pan-trk-antiseerumi, 656 on spesifinen trkC-antiseerumi.

• · ·

Kuva 7 esittää, että MNTS-1 on yhtä tehokas kuin φ NT-3/BDNF/NGF-koktaili koskien DRG-hermosolujen eloonjäämistä.

• · · ·.* · DRG:stä hermosolujen eloonjäämisen riippuvaisuus annoksesta.

NT3:n/BDNF:n/NGF:n (1:1:1) koktailin ylläpitämien solujen :*·*; lukumäärä (o) ja MNTS:n ylläpitämien solujen lukumäärä (Δ) .

:***; Tulokset on ilmoitettu kolmen kerranteen määritysten kes- • · · kiarvona ± keskihajonta. Tiedot sovitettiin neljän parametrin • · « *#<** yhtälöön NMTS-l:n osalta (katkoviiva) ja koktailin osalta • · *·♦·* (yhtenäinen viiva) . MNTS-1:n laskettu EC50-arvo oli 36 pg/ml :*·*: ja koktailin 44 pg/ml.

• · ··· ♦ ♦ • · ··· 8

Kuva 8 esittää erilaisten neurotrofiinien homologiaa, muuttuvia alueita ja vakioisia alueita. On esitetty NGF (SEQ. ID. NO 3), BDNF (SEQ. ID. NO. 4), NT3 (SEQ. ID. NO. 5) ja NT4/5 (SEQ. ID. NO. 6) ja muuttuvat alueet on laatikoitu.

Kuvat 9A, 9B ja 9C esittävät [125I]hNGF:n kilpailevaa syrjäyttämistä joko trkA-reseptorista, p75-reseptorista tai trkA + p 75 -reseptoreista hNGF:n puhdistettujen N-terminaalin osalta muunnettujen muotojen lisääntyvän konsentraation vaikutuksesta. Yläkuva (12A), keskimmäinen kuva (12B) ja alakuva (12C) esittävät syrjäyttämistä MH3T3-soluista, A875-melanoomasoluista ja PC12 -feokromosytoomasoluista, jotka ilmentävät vastaavassa järjestyksessä trkA-reseptorin, p75-reseptorin ja trkA + p75 -reseptorit. Kilpailevat ligandit ovat seuraavat: (o - o) 111/111 = (10-118)hNGF:n homodimeerit; (o - o) 118-118 = (1-118)hNGF:n homodimeerit; (Δ - Δ) 115 -115 = (6-118)hNGF:n homodimeerit; ( - ) hiiren NGF = (1-118)mNGF:n homodimeerit. Reseptorisitoutuminen toteutettiin 4 °C:n lämpötilassa ja analysointi toteutettiin, kuten esimerkeissä on kuvattu. Esitetyt tiedot edustavat kokonaissitoutumista (spesifistä ja ei-spesifistä) ja edustavat kunkin solulinjan vähintään kolmea erillistä sitoutumis-koetta. Tämän kokeen IC50 on esitetty taulukossa 5.

• · '••1 Kuvat 10A ja 10B esittävät hNGF:n N-päätteen osalta ty- • · *.I pistettyjen muotojen indusoimaa trkA:n autofosforylaatiota.

• · · * i Yläkuva (10A) esittää pl40trlcÄ-vyöhykkeen autof osf orylaation • · · ···· intensiteettiä hNGF-muunnelman molaarisen konsentraation • · · funktiona, kun taas alakuva (10B) esittää kunkin vyöhykkeen • · · V · heijastavalla densitometrillä määritetyn optisen tiheyden määrää. Autofosforyloitunut pl4 0trkÄ-vyöhyke identifioitiin käyttämällä anti-trkA-immunoblottausta nitroselluloosalla ja sen jälkeen immunosaostamalla antifosfotyrosiinilla. Esitetyt • · · tiedot edustavat kahta toisistaan riippumatonta koetta.

• · · • t

Kuvat 11A ja 11B esittävät hNGF-mutanttien ilmentymistä 0 0 *···* ja proteiinianalyysejä. Kuva A esittää SDS-PAGE:n avulla erotettujen, metabolisesti leimattujen mutanttien 1-8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 autoradiografia (katso taulukon 1 selostus). Mutantit ilmennettiin tilapäisesti ihmisen 293-soluissa ja leimattiin 35S-metioniinilla ja kysteiinilla. Käytetty elatusaine im-munosaostettiin puhdistetulla polyklonaalisella kaniinin anti-hNGF-vasta-aineella ja sakat analysoitiin SDS-PAGE:n avulla, kuten esimerkeissä on kuvattu. Linjat, jotka on merkitty wt:llä (wt = villi tyyppi) esittävät solujen transfektiota villin tyypin (1-120) hNGF:n ilmentävällä vektorilla ja linjat, jotka on merkitty B:lla esittävät pelkästään AdVA-vektoria. Kuva B esittää ei-leimatun mutantin tai villin tyypin hNGF:n noin 0,1 pg:n Western-immunoblot-analyysiä. Nämä näytteet otettiin käytetystä elatusaineesta transfektion jälkeen rinnakkain edellä kuvattujen metabolisesti leimattujen solujen kanssa. Immunoblottaus toteutettiin käyttäen samaa polyklonaalista anti-hNGF-vasta-ainetta, kuin kuvassa A on kuvattu. Tuloksia voidaan verrata niiden mutanttien muuttuvaan detektioon, jotka immunoblotattiin rinnakkain samassa kokeessa, ja saattaa reagoimaan spesifisen monoklonaalisen hNGF-vasta-aineen kanssa, kuten kuvassa 18 on esitetty. Linja, joka on leimattu NGF:llä, esittää signaalia 0,1 pg:sta puhdistettua (1-120)hNGF:ää. Kummankin kuvat vasemmanpuoleinen akseli osoittaa molekyylimassan merkintäaineiden suhteellista • · .· ’· liikkuvuutta kD:na.

• · ·

Kuvat 12A, 12B, 12C, 12D, 12E ja 12F esittävät • · · *· [125I]hNGF:n kilpailevaa syrjäyttämistä soluista, jotka • · · ilmentävät trkA:n (yläkuvat 12A ja B) , p75:n (keskikuvat, 12C ja 12D) ja p75:n + trkArn (alakuvat, 12E ja 12F) hNGF:n mutant- ··· ·.·· tien lisääntyvien konsentraatioiden vaikutuksesta. Selvyyden vuoksi tiedot on jaettu kahteen kuvaan kummankin solulinjan osalta. Suhteellisen sitoutumisaffiniteetin vertailemiseksi :***: tutkittiin neljä mutanttia ja hNGF:n villin tyypin kontrolli • · · jokaisesta solulinjasta yhdessä kokeessa. Kumpikin kahdesta • · · • · * * kuvasta edustaa vähintään kahta erillistä sitoutumiskoetta • · · • · ’···' yhdestä transfektiosta ja yhtä sitoutumiskoetta ylimääräisestä :***: transfektiosta. Sitoutumiskokeet toteutettiin 4 °C:n lämpö- • · ··· • · • · ··· 10 tilassa, kuten esimerkeissä on kuvattu. Kokonaissitoutuminen on esitetty kuten kuvassa 12. IC50 suhteessa villin tyypin hNGF:ään on esitetty taulukossa 5.

Kuvat 13A ja 13B esittävät hNGF-mutanttien aiheuttamaa trkArn autofosforylaatiota. Yläkuva (13A) esittää pl40trkÄ:n autoradiografia trkA:n ilmentävien solujen stimulaation jälkeen osoitetuilla mutantin tai villin tyypin hNGF:n konsentraatioilla. trkA:n autofosforylaation määrät määritettiin kuten kuvassa 10. Alakuva (13B) on edellisen autoradiograf in densitometrinen määrällinen määritys . Esitetyt tiedot edustavat vähintään kahta koetta, joissa verrataan kaikkien mutanttien aikaansaamaa trkA:n autofosforylaatiota yhden kokeen sisällä, ja ovat yhdenmukaisia tietojen kanssa, jotka on saatu muista kokeista, joissa on verrattu 3-4 mutant-tia/koe hNGF:ään.

Kuva 14 esittää hNGF-mutanttien biologista aktiivisuutta määritettynä PC12-solujen neuriitin kasvun avulla. PC12 soluja viljeltiin 48 tunnin ajan mutantin tai villin tyypin hNFG:n osoitettujen konsentraatioiden läsnäollessa. Niiden solujen kokonaismäärä prosentteina, joilla oli neuriitteja annetulla mikroskooppikentällä, esitetään normalisoituna mak-simaaliseen (1-118) hNGF:n herättämään vasteeseen, kuten esi- • · • · merkeissä on kuvattu. Esitetyt arvot ovat vähintään kahden • · ’.I määrityksen/mutantti keskiarvo.

• · · -* ’ * Kuvat 15A, 15B, 15C, 15D ja 15E esittävät puhdistettujen • · · ···· N-terminaalisen alueen mutanttien karakterisointia. A.

• · · *·ί·’ SDS-PAGE:n (15-%:inen akryyliamidi) hopeavärjäys koskien 1 pg

• M

*.* · puhdistettua H4D-mutantti 2: ta (linja 1), puhdistettua hNT3/hNGF:n N-terminaalista kimeerista mutantti 6:tta (linja Ϊ 2), osittain puhdistettua (1-120) hNGF: ää (linja 3-N) ja mo- lekyylimassan merkintäaineita KD:na (linja 4-M) . Puhdistamisen • · · ja analyysin yksityiskohdat ilmenevät aineisto ja menetelmät *..* -osasta. B. Puhdistetun H4D-mutantti 2: n, hNT3/hNGF:n • · *···* N-terminaalisen kimeerisen mutantin 6 ja puhdistetun : (1-120) hNGF: n kilpailu [125I]hNGF:n syrjäyttämiseksi. Yläkuva • · · • · • · • · · 11 (15B) esittää sitoutumista NIH3T3-soluihin, jotka ilmentävät trkA:n, alakuva (15D) esittää sitoutumista A875-soluihin (p75) . Yläkuva (15C) esittää pl40trkA:n autofosf orylaation konsentraatioriippuvuutta (M), joka on havaittu käyttämällä antifosfotyrosiini-immunoblottausta, kuten kuvissa 10 ja 13. Alakuva (18E) esittää immunoblottaustietojen densitometristä määrällistä määritystä.

Kuvat 16A ja B esittävät monoklonaalisen vasta-aineen vuorovaikutusta hNGF:n N-terminaalisen alueen kanssa. A. Immunoblottaus käyttäen 0,1 pg: aa mutantteja 1 - 6 ja 8 (mutantti 7 jätetty pois pienen konsentraation vuoksi), hNGF:ää (villi tyyppi) ja kontrollilla transfektoitua elatusainetta (B) . Käytetty elatusaine levitettiin SDS-PAGE: lie, immunoblotattiin nitroselluloosalle ja saatettiin reagoimaan monoklonaalisen anti-hNGF-vasta-aineen 14.14 kanssa. Mutanttien suhteellinen liikkuvuus on esitettynä 14 kD:na. B. Kilpaileva 25 pM:n [125I]hNGF:n syrjäyttäminen joko trkA:n ilmentävistä tai p75:n ilmentävistä soluista kuvassa A käytetyn samanlaisen monoklonaalisen vasta-aineen lisääntyvien konsentraatioiden vaikutuksesta.

Kuva 17 esittää kaavamaista piirrosta hNGF-monomeerista perustuen hiiren NGF:n röntgensädekiderakenteeseen, jolloin • · mainittu kuva osoittaa primaarista aminohapposekvenssiä (SEQ.

• · \l ID. NO. 3) , sekundaarisen rakenteen peruspiirteitä ja • · · * mutageneesin avulla muunnettuja jäännöksiä. Keltaiset ·«· *··· varjostetut jäännökset osoittavat jäännöksiä, jotka eroavat • · · ’···* toisistaan hNGF:n hNT3:n välillä ja on korvattu vastaavilla ··· • · · V * hNT3-jäännöksillä hNGF:ssä domainin vaihtona. Suuret mustat numerot, jotka sijaitsevat lähellä 5-8 keltaisen jäännöksen ··· Σ,ί ! lohkoja, tarkoittavat nimenomaista neurotrofiinin muuttuvaa J *: aluetta. Näihin muuttuviin alueisiin sisältyvät myös amino- ja karboksipäätteet. Punaiset varjostetut jäännökset • · osoittavat jäännöksiä, jotka on mutatoitu yksitellen tai • · ···* pareittain ja edustavat aminohappoja, jotka ovat eniten • · · Σ *: alttiina liuottimelle.

• · ·*· • · • · ··· 12

Kuvat 18A, 18B ja 18C esittävät hNGF:n organisaatiota.

Kuva 18A esittää muuttuvien domainien asemaa hNGF:n primaarisessa sekvenssissä. Kuva 18B esittää hNGF:n muuttuvan domainin kimeerisiä mutantteja, jotka sisältävät yhden hNT-3:n muuttuvan domainin. Luettelo, 18C, sisältää hNGF:n spesifiset jäännökset, jotka on korvattu hNT3:lla annetussa mutantissa.

Kuvat 19A ja 19B esittävät hNGF:n rakenteellisten mutanttien analysoimiseksi käytetyn uuden reseptorisitoutu- mismenetelmän karakterisointia. A) trkA-IgG-immunoadheesioon perustuvien määritysten sitoutumisominaisuuksien vertailu hNIH3T3-solulinjojen ilmentämien holo-trkA-reseptoreiden sitoutumisominaisuuksiin. TrkA-IgG:n kilpailevan sitoutumisen profiilit ovat hyvin samanlaiset kuin holo-trkA-solulinjoilla (20A), kun taas trkA-IgG osoittaaa samaa neurotro- fiiniselektiivisyyttä (20 B; NGF»NT3>BDNF). Nyt esitetyissä sitoutumista koskevissa tiedoissa käytetään yksittäisiä trkA:n -B:n tai -C:n tai p75-IgG:n immunoadheesiomäärityksiä. Useiden muunnelmien reseptorisitoutumista koskevat tunnuspiirteet vahvistettiin holo-trkA-solujen sitoutumismäärityksissä.

Kuvat 20A ja 20B esittävät hNGF/hNT3:n kimeeristen mutanttien sitoutumista trkA-IgG- ja gp75-reseptoreihin.

.. . Mutanttien suhteelliset affiniteetit on piirretty mutantin • · * IC50-arvon ja hNGF:n IC5o-arvon suhteena, jolloin mainitut arvot • · · • · \ * on saatu kilpailevan sitoutumisen käyristä. Keskimääräinen • · · ’·*·’ suhde on saatu kolmesta toisistaan riippumattomasta • · · sitoutumiskokeesta. NGF/NT3:n N-terminaalinen domaininvaih- ·.·.· tomutantti (mutantti 6) johtaa trkA-sitoutumisen merkittävään • · · ' häviöön, kun taas gp75-sitoutumiseen sillä ei ole vaikutusta.

Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia tietojen kanssa, jotka saatiin ;*·*; holo-trkA-sitoutumisesta soluissa 4 °C:n lämpötilassa (kuva .*·*. 18B, C) . Kimeeriset mutantit, jotka sisältävät NT3:n • · · ensimmäisen beta-käännöksen (beta-turn) (mutantit 10 ja 19), • · · : ·* ovat menetettäneet 4-kertaisesti kykynsä sitoutua • · · • · gp7 5-reseptoriin. Emäksisten jäännösten korvaaminen ·*·*; alaniinilla ensimmäisessä beta-käännöksessä (mutantti 21) tai • * • · · • · • · • · · 13 C-päätteessä (mutantti 24) johtaa merkittävään gp75-si-toutumisen häviöön.

Kuva 21A esittää hNGF/hNT3:n kimeeristen mutanttien kykyä aiheuttaa trkA-tyrosiinikinaasin autofosforylaatio ja kuva 2 IB esittää mainittujen mutanttien kykyä aiheuttaa PC12-solujen neuriittien kasvu. TrkA:n ilmentäviä CHO-soluja stimuloitiin hNGFtllä, hNT3:lla tai kimeerisillä hBGF/hNT3:n domaininvaihtomutanteilla ja autofosforylaatio määritettiin käyttämällä fosfotyrosiini-ELISA-määritystä (OD450/65o) · Yhdenmukaisesti trkA-sitoutumisen kanssa N-terminaalinen hNGF/hNT3:n kimeerinen mutantti stimuloi hiukan trkA:n auto-fosforylaatiota. Domainin vaihdosta pre-beta-käännöksen 1 alueella (V18, V20, G23) seuraa 2-3 -kertainen aktiivisuuden häviö osoittaen näiden jäännösten mahdollista osuutta NGF-trkA:n spesifisyyden määräämisessä. PC12-solujen erilaistumisen tapauksessa neuriitin kasvun EC50-arvo määritettiin kaikkien mutanttien osalta ja ilmaistiin suhteena hNGF:n EC50-arvon kanssa. Jälleen suurin vaikutus havaittiin käytettäessä N-terminaalisen hNGF/hNT3:n domainin vaihdon omaavaa mutanttia, mutta kuitenkin havaittiin myös bioaktii-visuuden häviö pre-beta-käännöksen 1 alueen osalta, mikä on yhdenmukaista trkA-sitoutumisen ja autofosforylaation kanssa.

• ·

Kuvat 22A ja 22B esittävät hNGF/hNT3:n domaininvaih- *. ; tomutanttien pan-neurotroofista aktiivisuutta. Aktiivisuus on • · · ’·’·* mitattu trk-IgG:n kilpailevan sitoutumisen ja neuriittien • · · •••ί kasvun avulla trkC-transfektoiduissa PC12-soluissa.

[125I]hNT3:n kilpaileva syrjäyttäminen havaittiin vain hNT3:n • · · :.· · tapauksessa (IC5o = 45 pM) ja muuttuvan alueen 4 hNGF/hNT3:n domaininvaihtomutantin tapauksessa (mutantti 16; IC50 = 80 nM) . :*·*: Samoin hNGF/hNT3:n domainin vaihto muuttuvalla alueella 4 johtaa merkitsevään neuriitin kasvuun trkC-transfektoiduissa • · · PC12-soluissa, jotka eivät reagoi hNGF:ään. TrkA-riippuvaisen • · · • sitoutumisen, autofosforylaation ja PC12-solujen toimintojen • · *···' vertailu mutantin 16 osalta (kuvat 19, 20) paljastaa ·’·*: endogeenisen hNGF:n kaltaisen aktiivisuuden pienen häviön.

• · • · · • · • « • · · 14 NT3:n N-päätteen sisältävä N-terminaalinen do-maininvaihtomutantti (mutantti 6) ei toimi vuorovaikutuksessa trkCrn kanssa.

Kuva 23 esittää kahta N-terminaalisen domainin vaihdon omaavaa mutanttia: hNT3-NH2/hNGF on mutantti 6 ja sisältää hNT3-jäännökset 1-6 (YAEHKS-), jotka korvaavat hNGF:n jäännöksiä 1-7 hNGF:n jäljellä olevassa rungossa. hNGF-NH2/NT3 on P2 (SI) ja sisältää hNGF:n jäännökset 1-7 (SSSHPIF-) , jotka korvaavat hNT3:n jäännöksiä 1-6 hNT3:n jäljellä olevassa rungossa.

Kuvat 24A, 24B ja 24C esittävät PS(Sl):n pan-neurot-rofiinin reseptorisitoutumisaktiivisuutta vastaavasti käytettäessä trkArta, trkC:tä ja gp75:ttä. Kilpailevan sitoutumisen määritykset toteutettiin syrjäyttämällä [125I]hNGF tai [125I]hNT3 reseptori-IgG-immunoadheesioista mainitun tekijän vaikutuksesta. P2 (NGF-NH2/NT3) , N-terminaalisen hNT3:n domainin vaihdon omaava mutantti, joka sisältää hNGF:n N-päätteen, osoittaa hNGF:n kaltaista trkA-sitoutumisaktiivisuutta samalla säilyttäen trkC-aktiivisuuden. NT3-NH2/NGF (mutantti 6) hNGF:n päinvastainen N-terminaalisen domainivaihdon omaava mutantti, joka sisältää hNT3:n N-päätteen, osoittaa vähentynyttä trkA-si-toutumista eikä lainkaan sitoutumista trkC:hen.

• · I.’ Kuvat 25A ja 25B esittävät vastaavasti P2(Sl):n • · · • · *. * pan-neurotroofista bioaktiivisuutta normaaleissa trkA:n • · · ’·*·’ ilmentävissä PC12-soluissa ja trkC-transf ektoiduissa ··· • ••ί PC12-soluissa, joilla on vähentynyt hNGF-vaste. Neuriitteja kantavien PC12-solujen prosenttiosuus neurotrof iinin tai • · « · muunnelman annetulla konsentraatiolla normalisoitiin maksimivasteeseen, jonka luonnollinen neurotrofiini aiheutti. P2 (NGF-NH2/NT3) :n EC5o-arvo trkA PC12-soluissa on 0,4 ng/ml (15 pM) ja 0,2 ng/ml (7 pM) trkC-transfektoiduissa PC12-soluissa • · · vastaten hNGF:n ja hNT3:n EC50-arvoja.

• · · • ·* Kuvat 26A ja 26B esittävät hNGF:n pistemutanttien · · • m *···* sitoutumista trkA- ja gp75-reseptoreihin. Mutanttien af- ·*·*: finiteetit määritettiin kilpailevan sitoutumisen avulla ja • · • · · • · • · • · · 15 esitetään mutantin IC50-arvon suhteena luonnollisen hNGF:n ICso-arvoon. IC5o määritettiin kilpailevan sitoutumisen käyrien avulla, jolloin mainittu sitoutuminen oli toteutetti vähintään kaksi kertaa kunkin mutantin hNGF:n kahdesta toisistaan riippumattomasta transfektiosta. Esitetään 4-6 toisistaan riippumattoman mittauksen IC50-arvojen keskihajonta kunkin mutantin osalta. hNGF:n jäännökset, joiden vaikutus sitoutumiseen tutkittiin, olivat eniten pinnaltaan alttiita, kuten hiiren NGF:n kiderakenne on ennustanut.

Kuva 27 esittää hNGF-mutanttien biokemiallista aktiivisuutta, joka on mitattu käyttämällä trkA-autofosforylaatio-ELISA-määritystä. On esitetty kunkin mutantin EC5o-arvo suhteessa hNGF:n EC50-arvoon (EC50 = 120 pM) . Mutatoituja jäännöksiä, joilla on suurimmat vaikutukset tehoon, osoittaa jäännöksen numero. Mutatoituja jäännöksiä, joilla on ylimääräisiä vaikutuksia autofosforylaation laajuuteen (tehokkuuteen), osoittavat jäännöksen numero ja tähti (*).

Kuva 28 esittää valittujen hNGF-mutanttien biologista aktiivisuutta trkA-PC12-solujen neuriittien kasvua koskevassa määrityksessä. On piirretty kunkin mutantin neuriitin kasvun EC5o-arvon suhde verrattuna hNGF:n vasteeseen. Mutatoidut jäännökset, joilla on suurimmat vaikutukset, on osoitettu.

• · !. Kaikkia muita mutantteja tutkitaan tällä hetkellä.

• · · • · *. * Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus • » · *·*·* Aminohappojen yhden kirjaimen koodeja on käytetty tässä, • · · • ••ί kuten alalla on tunnettua, seuraavan taulukon mukaisesti:

Taulukko 1 • · · V · Kolmen kirjaimen Yhden kirjaimen

Aminohappo lyhenne lyhenne

Alaniini Ala A

.**·. Arginiini Arg R

• · ·

Asparagiini Asn N

• · ·

• ·* Asparagiinihappo Asp D

• ·

*···* Kysteiini Cys C

Glutamiini Gin Q

• · • · · • · • · • · · 16

Glutamiinihappo Glu E

Glysiini Gly G

Histidiini His H

Isoleusiini Ile I

Leusiini Leu L

Lysiini Lys K

Metioniini Met M

Fenyylialaniini Phe F

Seriini Ser S

Treoniini Thr T

Tryptofaani Trp W

Tyrosiini Tyr Y

Väliini Vai V

Proliini Pro P

Siten aminohappojäännöksen nimitys on yhden kirjaimen aminohappokoodi, jota seuraa jäännöksen asemaa osoittava numero. On ymmärrettävä, että asemanumero vastaa kysymyksessä olevaa neurotrofiinirunkoa, siten D15A NT3 tarkoittaa sitä, että asparagiinihappo NT3:n asemassa 15 on muutettu alaniiniksi. Tämä asparagiinihappo, joka on havaittu "vakioisella alueella", kuten jäljempänä on määritetty, vastaa NGF:n asemaa 16, koska NGFillä on ylimäärinen aminohappo N-päätteessä, kuten kuvassa • · I. I 8 on esitetty.

• · · • · *. * Tämä keksintö koskee pantrofiinisia neurotrofiineja.

• · · *·*·* Yleisesti neurotrof iini on proteiini, joka on osallisena ·«· ···: hermojärjestelmän ja erityisesti hermosolujen kehityksessä, säätelyssä ja ylläpitämisessä. Tällä hetkellä on olemassa • · · :,· · ainakin viisi tunnettua tärkeätä neurotroofista tekijää: hermokasvutekijä (NGF), neurotrofiini-3 (NT3), neurotrofiini-4 (NT4, jota kutsutaan joskus myös neurotrofiini-5 : ksi (NT5) tai .***. NT4/5: ksi) , aivoperäinen neurotroofinen tekijä (BDNF) ja »·· siliaarinen neurotroof inen tekijä (CNTF) .

• ♦ · • ·* Termillä "pantrofiiniset neurotrofiinit" tai "pan- • · *···’ trofiiniset neurotroofiset tekijät" tai niiden kieliopillisil- ·*·’: la ekvivalenteilla tarkoitetaan tässä neurotrofiinia, • · • · · • · • · • · · 17 jolla on monta neurotrofiinin spesifisyyttä toisin kuin luonnossa esiintyvillä neurotrofiineilla. Tämä tarkoittaa, että se sisältää domaineja, jotka suovat erilaisia neurotrofiinin spesifisyyksiä. Yhdessä suoritusmuodossa tämä tarkoittaa, että tämän keksinnön pantrofiiniset neurotrofiinit sitoutuvat erilaisiin neurotroofisiin reseptoreihin. Siten esimerkiksi luonnossa esiintyvä NGF, joka on trkA-reseptorin luonnollinen tai luontainen ligandi, ei sitoudu olennaisesti trkB-reseptoriin eikä trkC-reseptoriin suurella affiniteetilla, esimerkiksi NGF sitoutuu näihin reseptoreihin 500 - 1 000 kertaa pienemmällä Kd-arvolla kuin vastaavasti BDNF tai NT3. Kuitenkin pantrofiininen NGF eli pantrofiininen neurotrofiini, jonka aminohapporunko perustuu NGF:ään, voi sitoutua ainakin trkA-reseptoriin, trkB-reseptoriin ja p75-reseptoriin. Vaihtoehtoisesti pantrof iininen NGF sitoutuu trkA-reseptoriin, trkC-reseptoriin ja p75-reseptoriin. Edullinen suoritusmuoto tekee mahdolliseksi trkA-, trkB-, trkC ja p75-reseptorisitoutumisen. Samaten luonnossa esiintyvät BDNF ja NT4/5, jotka ovat trkB-reseptorin luonnollisia ligandeja, eivät sitoudu olennaisesti trkA-reseptoriin tai trkC-reseptoriin, kuten edellä. Näin ollen pantrofiininen BDNF tai NT4/5 sitoutuvat trkB-reseptoriin tai mihin tahansa trkArn, trkC:n • · I ja p75:n yhdistelmään, kuten edellä on esitetty pantrofiinisen • · *, * NGF:n tapauksessa.

• · · *·’·* Vaihtoehtoisissa suoritusmuodoissa luonnossa esiintyvä • · · ···! neurotrofiini sitoutuu heikolla affiniteetilla useisiin neurotrof iinireseptoreihin. Tässä suoritusmuodossa pan- • · · V * trofiininen neurotrofiini sitoutuu näihin reseptoreihin af finiteeteilla, jotka ovat suurempia kuin normaalisti havaitut, vastaavia kuin luonnollisella ligandilla havaitut affiniteetit.

.*'*· Esimerkiksi NT3 sitoutuu voimakkaasti trkC:hen ja heikosti ··· trkA: hän ja trkB:hen. Näin ollen pantrof iininen NT3 sitoutuu • · · • ·* tkrC:hen normaalilla sitoutumisaffiniteetillaan ja joko • · · -* -* • · *··.’ trkA:han affiniteetilla, joka on samanlainen kuin trA:n ·’·*· luonnollisella ligandilla, NGF:llä, tai trkB:hen af- • · • · · • · • · • · · 18 finiteetilla, joka on samanlainen kuin trkB:n luonnollisilla ligandeilla, BDNF:llä tai NT4/5:llä, tai molempiin.

Edullisessa suoritusmuodossa pantrofiinisen neurotrofiinin sitoutumisaffiniteetti neurotrofiinireseptoreihin on vähintään noin 50 - 60 %, edullisesti noin 75 - 80 %, ja edullisimmin noin 90 %, luonnollisen ligandin sitoutumisaffiniteetista. Näin ollen pantrofiininen NGF sitoutuu trkB- tai trkC-reseptoriin siten, että sen sitoutuminen on vähintään 50 % vastaavasti BDNF:n tai NT4/5:n, tai NT3:n sitoutumisesta. Tämä affiniteetti mitataan eri tavoin, kuten alan ammattimiehet tietävät. Edullinen menetelmä on kilpailumääritysten käyttö, kuten on esitetty lähteessä (84) j a esimerkissä 2 . Yleensä sitoutumisaf f initeetit ilmoitetaan IC5o-arvona eli leimaamattoman kilpailijan konsentraationa, joka estää 50 % leimatun ligandin sitoutumisesta reseptoriin.

Vaihtoehtoisissa suoritusmuodoissa neurotrofiinin pantrofiinisyyttä ei mitata käyttämällä sitoutumisaf-finiteettia neurotrofiinireseptoreihin, vaan käyttämällä hermosolujen eloonjäämisen tai neuriitin kasvun määrityksiä. Näin ollen kaikki neurotrofiinit ylläpitävät alkion hermos-topienasta peräisin olevien tuntohermosolujen eloonjäämistä • · !. (77), (78), (7), (17). Alkion sympaattisten hermosolujen • φ *. ‘ eloonjäämistä ylläpitää vain NGF, kun taas alkion ulkolehden • · · ***** paksuntumasta peräisin olevien tuntohermosolujen eloonjäämistä • · · • ••ί ylläpitävät NT3 ja BDNF (85). Dorsaalisen j uuriganglion

*.:.* tuntohermosolujen eloonjäämistä ylläpitävät sekä NGF että BDNF

• · · : (13) . NT3 indusoi tuntohermosolujen neuriittien kasvun dorsaalisesta juurigangliosta, sympaattisista ketjugangli- :*·*: öistä ja nodoosigangliosta sekä ylläpitää nodoosiganglion her- ;***; mosolujen ja dorsaalisen juuriganglion hermosolujen eloon- • · · ..*. jäämistä. Näin ollen hermosolujen eloonjäämismääritykset ja • · i • ·* neuriitin kasvumääritykset voidaan toteuttaa pantrofiinisten • · *···' neurotrofiinien pantrofiinisyyden määrittämiseksi.

·’·*: Täten neurotrofiinin spesifisyys määritetään neurot- • · • · · • · • · • · · 19 rofiinin reseptorisitoutumisen ja hermosolujen eloonjäämis-määritysten ja/tai neuriitin kasvumääritysten avulla. Näin ollen pantrofUninen neurotrofiini, jolla on NGF-spesifisyys, tarkoittaa neurotrofiinia, joka osoittaa ainakin NGF:n sitoutu-misominaisuuksia, hermosolujen eloonjäämismäärityksen spesifisyyttä tai neuriitin kasvumäärityksen spesifisyyttä. Samaten pantrofiininen neurotrofiini, jolla on BDNF-, NT3- tai NT4/5-spesifisyys, osoittaa vastaavasti BDNF:n, NT3:n tai NT4/5:n sitoutumisominaisuuksia, hermosolujen eloonjäämismäärityksen spesifisyyttä tai neuriitin kasvumäärityksen spesifisyyttä.

Ylimääräisessä suoritusmuodossa pantrofiinisia neurotrof iineja valmistetaan muodostamalla kovalenttisia hete-rodimeereja. Normaalisti neurotrofiinit ovat homodimeereja, jotka sisältävät kaksi identtistä monomeeria, jotka ovat liittyneet ei-kovalenttisesti. Tässä suoritusmuodossa, kuten jäljempänä on esitetty, pantrofiinisyyden tuottavat molemmat monomeerit, jotka sisältävät domaineja, jotka tuottavat erilaisen neurotroofisen spesifisyyden. Vaihtoehtoisesti pant-rofiinisyys voidaan luoda kiinnittämällä kovalenttisesti kaksi erilaista neurotrofiinia, joilla on erilaiset spesifisyydet, kovalenttisen heterodimeerin luomiseksi. Näin ollen • · !. I esimerkiksi NGF-monomeeri voidaan kiinnittää kovalenttisesti • · · • · *. * NT3-monomeeriin, mikä johtaa pantrofiiniseen neurotrofiiniin, • · · * ;* jolla on sekä NGF- että NT3-spesifisyys. Samaten kovalenttiset • · · dimeerit voidaan valmistaa käyttämällä mitä tahansa NGF: n, NT3:n, NT4/5:n, BDNF:n tai CNTF:n yhdistelmää pantrofiinisen • · · ·.· · neurotrofiinien luomiseksi, joilla on vähintään kaksi spesi fisyyttä. Lisäksi tämä menetelmä voidaan toteuttaa käyttäen monomeereja, jotka ovat itsessään pantrofiinisia, mikä johtaa :***: pantrof iinisen monomeerin ja yhden spesifisyyden omaavan • · · monomeerin minkä tahansa yhdistelmän kovalenttisiin • · · •##|* dimeereihin. Näin ollen pantrof iininen kovalenttinen dimeeri • · *···* voi olla kahden pantrof iinisen monomeerin homodimeeri.

:*·*; Kuitenkin tämän keksinnön määritelmään sisältyy, että • · • · » • · • · 20 pantrofUnisella kovalenttisella dimeerilla täytyy olla vähintään kaksi ja edullisesti kolme neurotrofiinis-pesifisyyttä.

Kovalenttinen kiinnittäminen toteutetaan edullisesti nukleiinihapon suorana fuusiona siten, että kun proteiini ilmentyy, ensimmäisen monomeerin C-pääte kiinnittyy suoraan toisen monomeerin N-päätteeseen luoden dimeerin koodaavan yhden nukleiinihapon. Vaihtoehtoisissa suoritusmuodoisa voidaan käyttää kytkijää, kuten glysiinin, tai glysiinin ja seriinin lyhyitä toistuvia jaksoja, kuten esimerkiksi kytkijää gly-gly tai gly-gly-ser-gly-gly. Tämä toteutetaan käyttäen alalla hyvin tunnettua tekniikkaa. Muut tekniset menetelmät proteiinien kytkemiseksi kovalenttisesti ovat alalla tunnettuja.

Pantrofiiniset neurotrofiinit tuottavat pantrofiinisen sitoutumisen tai, kuten edellä on selostettu, pantrofiinisen hermosolujen eloonjäämisen, sisältämällä domaineja, jotka tuottavat neurotrofiinin reseptorispesifisyyden tai -sitou-misen. Domaini voidaan määritellä kahdella tavalla. Ensimmäisessä suoritusmuodossa domaini on neurotrofiinin osa, joka tuottaa jonkin neurotrofiinin spesifisyyden. Tässä suoritusmuodossa pantrofiinisen neurotrofiinin yksi monomeeri sisältää yhden tai useita domaineja, jotka tuottavat erilaiset • · ··.·, spesifisyydet. Domaini voi vaihdella kooltaan yhdestä • · *.I aminohaposta noin 10 - 15 aminohappoon. Domaini voi koostua • · · • · · * * sellaisten aminohappojen yhdistelmästä, jotka ovat eri neu- • · · ···· rotrofiinista kuin isäntäneurotrofiini, eli yhdestä neurot- • · · *·ϊ·* rofiinista peräisin oleva domaini voidaan substituoida toiseen ··· * neurotrofiiniin, jolloin se tuottaa pantrofiinisyyden toiselle neurotrofiinille. Vaihtoehtoisesti domaini voi olla tulosta : aminohapposubstituutioista, jotka eivät perustu olemassa olevien neurotrofiinien suhteen homologiaan, kuten jäljempänä ··· on esitetty. Edullisessa suoritusmuodossa domaini käsittää • · · • · *..* aminohappojen keskeytymättömän sekvenssin eli aminohappojen • · *·”* yksi jakso on korvattu. Toisessa suoritusmuodossa domaini voi : **: koostuu keskeytyvistä aminohapoista, esimerkiksi • · · • · • · • · · 21 neurotrofiinissa useat alueet voivat tuottaa spesifisyyden ja siten korvaukset useissa asemissa neurotrofiinissa ovat välttämättömiä pantrofiinisyyden kannalta.

Joissakin suoritusmuodoissa neurotrofiinissa on enemmän kuin yksi domaini, joka voi tuottaa neurotroofisen spesifisyyden, joka riippuu nimenomaisesta neurotrofiinista. BDNF:llä on esimerkiksi joukko domaineja, jotka näyttävät tuottavan BDNF-spesifisyyden. Tämä keksintö osoittaa, että yhden aminohapon muutos NT3:ssa asemassa 15 asparagiinihaposta alaniiniksi tuottaa BDNF:n spesifisyyden NT3:lle. Tämä domaini voidaan myös tuoda NGF:n ja NT4/5:n sekvensseihin asemiin, jotka vastaavat asemaa 15 NT3:ssa, eli asemaan 16 NGFrssä tai asemaan 18 NT4/5:ssä. Pitäisi ymmärtää, että vastaavat aminohapot määritetään asettamalla sekvenssit järjestykseen riveihin, kuten kuvassa 8 on esitetty. Tämän domainin lisäksi on olemassa muita domaineja BDNF:ssä, jotka tuottavat BDNF-spesifisyyden. Esimerkiksi BDNF:n sekvenssin substituutio asemissa 78 - 88 (QCRTTQSYVR) tai asemissa 93 - 99 (SKKRIG) voi tuottaa BDNF-spesifisyyden (55).

Samaten NT3:lla on joukko domaineja, jotka voivat tuottaa NT3-spesifisyyden, kun ne on substituoitu eri neu-rotrofiiniin. Muutamien NT3:n jäännösten on osoitettu olevan • · tärkeitä NT3:n reseptorisitoutumismäärityksessä sekä bioak- • · *. I tiivisuusmäärityksessä. Erityisesti mutaatiot asemissa R103, • · · ’•V D105, K80, Q83, E54, R56, T22, Y51, V97, Yli, E7, R8, ElO ja • · · ···· R68, edistävät kaikki osaltaan NT3-spesifisyyttä, koska mu- • · · *·ί·* taatiot näissä asemissa NT3:ssa aiheuttavat NT3:n aktiivisuuden • · · ·.· · vähenemisen. Näistä K80, Q83, T22 ja V97 ovat muuttuvilla alueilla, kuten kuvassa 8 on esitetty, ja muut on havaittu • · · ::: vakioisilla alueilla. Lisäksi näiden jäännösten lä- :***; hiympäristössä olevat jäännökset voivat myös tuottaa NT3:n • · · spesifisyyden. Joissakin suoritusmuodoissa muutokset väki- • · · • · öisillä alueilla voivat myös tuottaa NT3 : n spesifisyyden. Vaih- • · *···’ toehtoisesti mutaatiot asemissa R31 ja E92 ovat aiheuttaneet j*·*: NT3:n sitoutumisen lisääntymistä; erityisesti R31A- ja E92A-NT3 • t · • · • · • · · 22 osoittivat lisääntynyttä trkC-sitoutumista. Nämä mutaatiot voidaan tuoda suoraan neurotrofiineihin NT3:n lisäksi käyttäen jäljempänä kuvattuja menetelmiä. Aminohapot missä tahansa näistä asemista voidaan vaihtaa, kuten jäljempänä on esitetty.

NGF:llä on joukko domaineja, jotka voivat tuottaa NGF:n spesifisyyden, kun ne on substituoitu eri neurotrofiiniin. NGF:n N-terminaaliset aminohapot tuottavat NGF:n spesifisyyden, kun niillä on korvattu NT3:n N-terminaaliset jäännökset. Erityisesti NGF:n seitsemällä N-terminaalisella aminohapolla (SSSHPIF) voidaan korvata NT3:n kuusi N-terminaalista aminohappoa (YAEHKS), mikä johtaa pantrofUniseen NT3:een, jolla on NGF:n spesifisyys. NGF:n N-terminaalisten jäännösten tarkka lukumäärä ei ole ratkaiseva; kuten esimerkeissä ja erityisesti esimerkissä 3 on esitetty, histidiini aminohappoasemassa 4 näyttää olevan melko tärkeä NGF:n spesifisyyden kannalta; näin ollen noin 4-10 N-terminaalista jäännöstä voidan vaihtaa, vaikkakin joissakin suoritusmuodoissa yhden aminohapon vaihto voi olla riittävä. Samaten on osoitettu, että muutamat muut NGF:n jäännökset ovat tärkeitä NGF:n trkA-reseptorisitoutumismäärityksessä sekä bioaktii-visuusmäärityksessä. Esimerkiksi on olemassa joukko jäännöksiä, jotka mutatoituina menettävät NGF-aktiivisuuden. Tämä osoittaa * · jäännöksen tärkeyden NGF:n spesifisyyden kannalta. Näihin • · jäännöksiin sisältyvät, rajoittumatta kuitenkaan niihin, H4, • · · *·*:* P5, V18, V20, G23, D30, Y52, R59, R69, H75, Y79, T81 ja R103.

·· · •••j Näistä D30, R59, Y79 ja T81 ovat "muuttuvilla alueilla", eli • · · *·ί·* alueilla, jotka vaihtelevat eri neurotrofiinien välillä, kuten ··· V : kuvassa 8 on esitetty, ja jäljellä olevat jäännökset ovat vakioisilla alueilla. Joissakin suoritusmuodoissa muuttuvan : alueen jäännökset aiheuttavat todennäköisemmin NGF:n j***; spesifisyyden, koska vakioisen alueen jäännökset voivat olla ··· tärkeitä yleisen rakenteen ja tunnuspiirteiden kannalta eivätkä • · · • ♦ saata tuottaa spesifisyyttä. Kuitenkin kuten edellä on esitetty • ♦ *···* Dl5A-mutaation yhteydessä, mutaatiot vakioisilla alueilla :***: voivat yhtä hyvin tuottaa spesifisyyden. Lisäksi NGF:ssä on • · · • · • · • « « 23 joukko aminohapposubstituutioita, jotka lisäävät NGF:n sitoutumista ja/tai bioaktiivisuutta. Näin ollen nämä substituutiot voidaan tuoda muiden neurotrofiinien runkoihin NGF:n spesifisyyden tuottamiseksi. Näihin jäännöksiin sisältyvät, rajoittumatta kuitenkaan niihin, Ell, F12, D24, E41, N46, S47, K57, D72, N77, H84, D105 ja K115.

Kun neurotrofiinin spesifisyyden kannalta tärkeät jäännökset on identifioitu, ne voidaan korvata millä tahansa muilla aminohappojäännöksillä käyttäen esimerkeissä kuvattua tekniikkaa ja hyvin tunnettua tekniikkaa suunnatun mutageneesin tuottamiseksi. Yleisesti substituoitavat aminohapot valitaan alan ammattimiesten tuntemiin tunnusomaisiin ominaisuuksiin perustuen. Esimerkiksi kun halutaan pieniä muutoksia tunnusomaisiin ominaisuuksiin, substituutiot toteutetaan yleensä seuraavan taulukon mukaisesti:

Taulukko 2

Alkuperäinen Esimerkilliset jäännös substituutiot

Ala Ser

Arg Lys

Asn Gin, His

Asp Glu

Cys Ser • · *. I Gin Asn • · ·

Glu Asp ··· •••j Gly Pro *·!·* His Asn, Gin ··· *.* * Ile Leu, Vai

Leu Ile, Vai I Lys Arg :***: Met Leu, Ile ···

Phe Met, Leu, Tyr

• · · · · -L

Ser Thr • · **;·* Thr Ser ; Trp Tyr ·»· • · • · ··· 24

Tyr Trp, Phe

Val lie, Leu

Merkittävät muutokset toiminnassa ja immunologisessa identiteetissä toteutetaan valitsemalla substituutiot, jotka ovat vähemmän konservatiivisia, kuin taulukossa I esitetyt substituutiot. Esimerkiksi voidaan toteuttaa substituutioita, jotka vaikuttavat merkittävämmin: polypeptidin rungon rakenteeseen muutoksen alueella, esimerkiksi alfaheliksi- tai beta-levyrakenteeseen; molekyylin varaukseen tai hydrofo-bisuuteen kohdepaikassa; tai sivuketjun kokoon. Subsituutiot, joiden yleisesti odotetaan tuottavan suurimmat muutokset polypeptidin ominaisuuksissa, ovat substituutioita, joissa (a) hydrofiilisellä jäännöksellä, esim. seryylillä tai treonyy-lillä, on substituoitu hydrofobinen jäännös, esim. leusyyli, isoleusyyli, fenyylialanyyli, valyyli tai alanyyli (tai mainitulla hydrofobisella jäännöksellä on substituoitu mainittu hydrofiilinen jäännös); (b) kysteiinillä tai proliinilla on substituoitu mikä tahansa muu jäännös (tai kysteeni tai proliini on substituoitu millä tahansa muulla jäännöksellä); (c) jäännöksellä, jolla on elektropositiivinen sivuketju, esimerkkinä lysyyli, arginyyli tai histidyyli, on j·^ substituoitu elektronegatiivinen jäännös, esim. glutamyyli tai • · aspartyyli (tai mainitulla elektronegatiivisella jäännöksellä • · · • φ *. ; on substituoitu mainittu elektropositiivinen jäännös); tai (d) • · · ’·’·* jäännöksellä, jolla on kookas sivuketju, esimerkkinä • · · • ••Ϊ fenyylialaniini, on substituoitu jäännös, jolla ei ole sivuketjua, esim. glysiini (tai mainitulla sivuketjuttomalla • · · V : jäännöksellä on korvattu mainittu kookkaan sivuketjun omaava jäännös). Edullisessa suoritusmuodossa jäännökset on vaihdettu alaniinijäännöksiin.

Kussakin neurotrofiinissa olevat muut domainit voidaan • · • · · löytää käyttäen tässä julkaistua tekniikkaa. Erityisesti • t « • ·’ esimerkin 1 mallinrakennustekniikka tekee mahdolliseksi • · · • · otaksuttujen spesif isyyspaikkoj en identifioinnin. Lisäksi ·*·*: homologipyyhkäisymutageneesiä, satunnaista mutageneesiä ja • · • · · • · • · • · · 25 kasettimutageneesiä voidaan kaikkia käyttää otaksuttujen pantrofiinisten neurotrofiinien muodostamiseksi, jotka voidaan sitten seuloa reseptorisitoutumisen osalta käyttäen esimerkeissä kuvattua ja alalla hyvin tunnettua tekniikkaa.

Kovalenttisen heterodimeerin yhteydessä domaini voi myös viitata kokonaiseen neurotrofiinimonomeeriin. Näin ollen pantrofiininen kovalenttinen heterodimeeri voi koostua domainista, joka tuottaa NT3:n spesifisyyden, eli NT3-mono-meerista, joka on kovalenttisesti kiinnittynyt domainiin, joka tuottaa BDNF:n spesifisyyden, eli BDNF-monomeeriin. Samaten NT3-monomeeri voi muodostaa parin NGF-monomeerin kanssa tai NGF-monomeeri voi muodostaa parin BDNF-monomeerin kanssa. Lisäksi kovalenttisia heterodimeereja voidaan valmistaa myös NT4/5- ja CNTF-monomeerien kanssa. Näissä suoritusmuodoissa domaini on suuri ja yleensä se käsittää suurimman osan villin tyypin neurotrofiinin aminohapposekvenssistä tai sen kokonaan.

Laajimmassa suoritusmuodossa pantrofiininen neurotrofiini sitoutuu vähintään kolmeen erilaiseen neurotrofiinireseptoriin. Edullisessa suoritusmuodossa pantrofiininen neurotrofiini sitoutuu vähintään neljään erilaiseen neurotrofiinireseptoriin.

.. . Termillä "neurotrofiinireseptori" tai sen kieliopil- • · [ lisillä ekvivalenteilla tarkoitetaan tässä reseptoria, joka • · · • · ·. i sitoo neurotrofiiniligandin. Joissakin suoritusmuodoissa • · · *·*·* neurotrof iinireseptori on reseptoreiden tyrosiinikinaasiryh- • · · män jäsen, jolloin mainittuja reseptoreita kutsutaan myös ·.·.· "trk"-reseptoreiksi ja ne ilmentyvät selvästi erottuvien • · · ί.ί ί hermosolupopulaatioiden pinnalla. Trk-ryhmä sisältää, ra joittumatta kuitenkaan niihin, trkA:n (tunnetaan myös nimellä :*·*; pl40trk) ; trkB:n (tunnetaan myös nimellä pl45trkB) ja trkC:n .**·. (tunnetaan myös nimellä pl45trkc) . Muissa suoritusmuodoissa neurotrof iinireseptori on p75NGFR, jota kutsutaan myös nimellä • · · : ·’ p75 tai nimellä pienen affiniteetin omaava hermokasvuteki- • · järeseptori (LNGFR) . On ymmärrettävä, että muutkin vielä ‘ keksimättömät neurotrofiinireseptorit voivat sitoa tämän • · • · · • · • · • · · 26 keksinnön pantrofiinisia neurotrofiineja, kuten on helposti alan ammattimiesten varmennettavissa.

Edullisessa suoritusmuodossa pantrofiininen neurotrofiini on NT3. Tässä yhteydessä pantrofiininen NT3 on pantrof iininen neurotrof iini, jonka aminohapposekvenssi on homologinen NT3:n aminohapposekvenssin kanssa ja sillä on do-maineja, jotka tuottavat muita neurotrofiinin spesifisyyksiä. Edullisessa suoritusmuodossa domaineilla on substituoituja NT3-jäännöksiä; eli jokin määrä aminohapoista on poistettu NT3-sekvenssistä ja sama tai vastaava määrä aminohappoja on substituoitu tuottaen ylimääräisen spesifisyyden. Esimerkiksi pantrofiininen MNTS-1 (monta neurotroofista spesifisyyttä -1) -NT3 käsittää NGF:n ensimmäiset 7 aminohappoa, jotka korvaavat NT3:n 6 N-terminaalista jäännöstä, plus D15A-substituution. Pantrof Unisella MNTS-1-NT3:11a on NT3:n, NGF:n ja BDNF:n spesifisyydet ja se sitoutuu myös p75-reseptoriin. Muut pantrofiiniset NT3:t on valmistettu käyttäen minimaalia muutoksia N-päätteen sisällä. Esimerkiksi koska H4 ja P5 ovat säilyneet NGF:ien kesken ja 2 hydrofobista jäännöstä asemissa 6 ja 7 ovat säilyneet, valmistetaan seuraavat muunnelmat: 1) YASHPIF-hNT3; 2) YAHPIF-hNT3; 3) YASHPIS-hNT3; 4) YAEHPIF-hNT3; ..#.φ 5) YAQHPIF-hNT3. Kun lisätään D15A-substituutio, niin • · I. I tulokseksi saatavat neurotrofiinit osoittavat NGF:n, NT3:n ja • · · \ · BDNF:n spesifisyyttä. Vaihtoehtoisesti NT3:n muuttuvan alueen • · · ’·*·’ 2 tai 3 tai 4 tai niiden yhdistelmien korvaaminen vastaavalla • · · NGF:n alueella tuottaa pantrof iinisen neurotrof iinin, jolla ·.·.· on sekä NT3:n että NGF:n spesifisyys.

• · · ί.ί ! Edullisessa suoritusmuodossa pantrof iininen neurotrofiini on pantrofiininen NGF. Tässä yhteydessä :*·*; pantrof iininen NGF on pantrof iininen neurotrof iini, jonka .·*·. aminohapposekvenssi on homologinen NGF:n aminohapposekvenssin • · · kanssa ja sillä on domainit, jotka tuottavat muita • · · • ·* neurotrofiinispesifisyyksiä. Edullisessa suoritusmuodossa • · · NGF-jäännöksiä on substituoitu domaineilla eli joku määrä •V. aminohapoista on poistettu NGF:n sekvenssistä ja sama tai • · • · # • · • · • · · 27 vastaava määrä aminohappoja on substituoitu niiden tilalle tuottaen ylimääräisen spesifisyyden. Esimerkiksi on valmistettu eräs pantrofiininen NGF, jolla on D16A-substituutio, joka tuottaa BDNF:n spesifisyyden, plus substituutiot esi-muuttuvalla alueella 1 (V18E + V20L + G23T) ja muuttuvalla alueella 4 (Y79Q + T81K + H84Q + F86Y + K88R). Vaihtoehtoisesti substituutiot esi-muuttuvalla alueella 1 voidaan toteuttaa käyttäen vain yhden aminohapon substituutioita muuttuvalla alueella 4; esimerkiksi voidaan valmistaa V18E + V20L + G23T ja yksi seuraavista: Y79Q, T81K, H84Q, F86Y tai K88R).

Yhdessä suoritusmuodossa pantrofiininen neurotrofiini on pantrofiininen NT4/5. Esimerkiksi NGF:n spesifisyys voidaan tuottaa NT4/5:lle korvaamalla NT4/5:n N-terminaaliset 9 aminohappoa NGF:n N-terminaalisilla 7 aminohapolla.

Yhdessä suoritusmuodossa pantrofiinisen neurotrofiinin sitoutuminen p75-reseptoriin on vähentynyt olennaisilta osin tai sitä ei ilmene lainkaan. Esimerkiksi, kuten kuvassa 26 on esitetty, on olemassa erilaisia aminohappojäännöksiä, jotka edistävät osaltaan p75-sitoutumista ja joissa mutaatiot johtavat vähentyneeseen p75-sitoutumiseen. NT3:ssa mutaatiot ..... asemissa R68, Yli, K73, R114, K115, Y51, K73, R31 ja H33 ja I. : NGF:ssä mutaatiot asemissa F12, 131, K32, K34, K50, Y52, R69, • · · *. 1 K74, K88, L112, S113, R114 ja K115 johtavat kaikki • · · *·1·1 vähentyneeseen p7 5-sitoutumiseen. Koska F12, 131, K50, Y52, • · · ...: R69, ja K74 ovat kaikki neurotrofiinien vakioisilla alueilla, ·.·.· kuten kuvassa 8 on esitetty, näiden muutosten odotetaan • · · ί.ί ί muuttavan p75-sitoutumista myös muissa neurotrofuineissa.

Muita jäännöksiä voidaan muuttaa yhtä hyvin.

;1·1: Edellä esitettyjen aminohappomuutosten lisäksi alan .1··. ammattimiehet ymmärtävät, että jonkin verran aminohapposek- • · · ..·. venssin vaihtelevuutta on sallittu muuttamatta neurotrofiinin I « · : ·1 spesifisyyttä ja tunnusomaisia piirteitä. Siten pantro- fiinisilla neurotrofiineilla voi olla villin tyypin sekvens- ·’·1. seihin verrattuna aminohapposubstituutioita, -insertioita tai • · • · · • · · · 28 -deleetioita, jotka eivät vaikuta pantrofiinisyyteen, vaan ovat pelkästään sekvenssin muunnelmia. Joissakin suoritusmuodoissa näitä mutaatioita havaitaan samoissa asemissa, jotka on identifioitu tärkeiksi spesifisyydelle eli joissakin tapauksissa voidaan tehdä neutraaleja mutaatioita muuttamatta neu-rotrofiinin spesifisyyttä.

Tämän keksinnön pantrofiinisia neurotrofiineja voidaan valmistaa eri tavoin käyttäen rekombinanttitekniikkaa. Termillä "rekombinantti nukleiinihappo" tarkoitetaan tässä nukleiinihappoa muodossa, jota ei normaalisti tavata luonnossa. Tämä tarkoittaa, että rekombinanttia nukleiinihappoa reunustaa nukleotidisekvenssi, joka ei luonnollisesti reunusta nukleiinihappoa, tai sillä on sekvenssi, jota ei normaalisti tavata luonnossa. Rekombinantteja nukleiinihappoja voidaan alunperin muodostaa in vitro käsittelemällä nukleiinihappo restriktioendonukleaaseilla tai vaihtoehtoisesti käyttäen tekniikkaa, kuten polymeraasiketjureaktiota. On ymmärrettävä, että kun rekombinantti nukleiinihappo on valmistettu ja saatettu uudelleen isäntäsoluun tai -organismiin, se kahdentuu ei-rekombinantilla tavalla eli käyttäen isäntäsolun solukoneistoa in vivo päin vastoin kuin in vitro -käsittelyissä, ..... kuitenkin tällaisia nukleiinihappoja, jotka on tuotettu • · !. rekombinantilla tavalla, pidetään yhä rekombinantteina tämän • · · *. ; keksinnön tarkoituksia varten, vaikka ne myöhemmin kahdentuvat • · · *·*·* ei-rekombinantilla tavalla.

• · · ...ί Samaten "rekombinantti proteiini" on proteiini, joka ·.!.· on valmistettu käyttäen rekombinanttitekniikkaa eli ilmentä- • · · ϊ.ί · mällä edellä kuvattu rekombinatti nukleiinihappo. Rekom- binantin proteiinin erottavat luonnossa esiintyvästä prote- iinista ainakin yksi tai useampi tunnusomainen piirre. Esi- .'*·. merkiksi proteiini voidaan eristää joistakin tai kaikista • · · ..·. proteiineista ja yhdisteistä, joiden kanssa se on normaalisti • · · • ·* yhteydessä sen villin tyypin isännässä. Määritelmä sisältää • · *...* pantrof Unisten neurotrof iinien tuotannon yhdestä organismista ·*·*· saman tai eri organismin tai isännän solussa. Esimerkiksi • « · • · • · • · · 29 proteiini voidaan valmistaa samassa organismissa, josta se on peräisin, mutta merkittävästi suurempana konsentraationa kuin normaalisti, esim. käyttämällä indusoivaa tai suuren ekspression promoottoria siten, että valmistetaan lisääntyneet määrät proteiinia. Vaihtoehtoisesti proteiini voi olla muodossa, jossa sitä ei normaalisti tavata luonnossa, kuten epitooppimerkin additiossa, tai aminohappojen substituutioissa, insertioissa tai deleetioissa.

Käyttäen tämän keksinnön nukleiinihappoja, jotka koodaadat pantroofiset neurotrofiinit, valmistetaan valikoima ekspressiovektoreita. Ekspressiovektorit voivat olla joko itse-replikoituvia ekstrakromosomaalisia vektoreita tai vektoreita, jotka yhdistyvät isännän genomiin. Yleensä ekspressiovektorit sisältävät transkriptiota ja translaatiota säätelevän nukleiinihapon, joka on kytketty toiminnallisesti pant-rofiinisen neurotrofiinin koodaavaan nukleiinihappoon. Tässä yhteydessä "toiminnallisesti kytketty" tarkoittaa, että transkriptiota ja translaatiota säätelevä DNA sijaitsee pantrofiinisen neurotrofiinin koodaavan sekvenssin suhteen siten, että transkriptio aloitetaan. Yleisesti tämä tarkoittaa että promoottorin ja transkription aloitus- tai lähtösekvenssit sijaitsevat 5'-asemassa pantrofiinisen neurotrofiinin • · I. I koodaavan alueen suhteen. Transkriptiota ja translaatiota • · · \* säätelevä nukleiinihappo on yleensä ominainen isäntäsolulle, ♦ · · *·*·* jota käytetään pantrof iinisen neurotrof iinin ilmentämiseksi; ··· esimerkiksi transkriptiota ja translaatiota säätelevän nuk-leiinihapon sekvenssejä, jotka ovat peräisin nisäkkään soluista, ··* ί.ϊ ί käytetään pantrofiinisen neurotrof iinin ilmentämiseksi nisäkkään soluissa. Sopivien ekspressiovektoreiden lukuisia j*·*; tyyppejä ja sopivia säätelysekvensse jä tunnetaan alalla erilaisten isäntäsolujen osalta.

• · ·

Yleensä transkriptiota ja translaatiota sääteleviin • · · : ·* sekvensseihin voivat sisältyä, rajoittumatta kuitenkaan niihin, • · · • · promoottorisekvenssit, signaalisekvenssit, ribosomaaliset ·*·*; sitoutumispaikat, transkription aloitus- ja lopetussekvenssit, • · • · · • · • · • · · 30 translaation aloitus- ja lopetussekvenssit, lopetus- ja polyA-signaalisekvenssit ja tehostin- ja aktivaatto-risekvenssit. Edullisessa suoritusmuodossa säätelevät sekvenssit sisältävät promoottorisekvenssin ja transkription aloitus- ja lopetussekvenssit.

Promoottorisekvenssit koodaavat joko konstitutiivisia tai indusoituvia promoottoreita. Alalla tunnetaan myös hyb-ridipromoottorit, joissa yhdistyvät usemman kuin yhden promoottorin elementit, ja ne ovat käyttökelpoisia keksinnössä.

Lisäksi ekspressiovektori voi sisältää ylimääräisiä elementtejä. Esimerkiksi ekspressiovektorilla voi olla kaksi replikaatiojärjestelmää, mikä tekee mahdolliseksi sen ylläpitämisen kahdessä organismissa, esimerkiksi nisäkkään soluissa ilmentämistä varten ja prokaryoottisessa isännässä kloonausta ja monistusta varten. Lisäksi ekspressiovektoreiden yhdistämiseksi ekspressiovektori sisältää vähintään yhden sekvenssin, joka on homologinen isäntäsolun genomin kanssa, ja edullisesti kaksi homologista sekvenssiä, jotka reunustavat ekspressiorakennelmaa. Yhdistyvä vektori voidaan suunnata spesifiseen lokukseen isäntäsolussa valikoimalla sopiva homologinen sekvenssi sisällytettäväksi vektoriin. Rakennelmat ··,·. yhdistyviä vektoreita varten ovat hyvin tunnettuja alalla.

• · j. I Lisäksi edullisessa suoritusmuodossa ekspressiovektori • · *. * sisältää valikoivan markkerigeenin transformoitujen isän- • · · ** täsolujen valikoimiseksi. Valintageenit ovat alalla hyvin • · · tunnettuja ja ne vaihtelevat käytetyn isäntäsolun mukaan.

• · ·

Keksinnön pantrof iinisia neurotrof iine j a tuotetaan • · · ·.· · viljelemällä isäntäsolua, joka on transformoitu pantrofiinisen neurotrofiinin koodavan nukleiinihapon sisältävällä eks- pressiovektorilla, sopivissa olosuhteissa, jotka indusoivat ;***; tai aiheuttavat pantrof iinisen neurotrof iinin ilmentymisen.

• · ·

Olosuhteet, jotka ovat sopivia pantrof iinisen neurotrof iinin • · · •>#* ilmentämistä varten, vaihtelevat riippuen ekspressiovektorin • · *···* ja isäntäsolun valinnasta ja alan ammattimies selvittää ne ·*·*: vaivatta. Esimerkiksi konstitutiivisten promoottoreiden käyttö • · • · · • · • · ·· · 31 ekspressiovektorissa edellyttää isäntäsolun kasvun ja lisääntymisen optimointia, kun taas indusoituvan tai repres-soituvan promoottorin käyttö edellyttää sopivia kasvuolosuhteita induktiota ja derepressiota varten. Edullisessa suoritusmuodossa pantrofiininen neurotrofiini puhdistetaan tai eristetään ilmentämisen jälkeen. Pantrofiiniset neurotrofiinit voidaan eristää tai puhdistaa ammattimiesten tuntemin eri tavoin riippuen siitä, mitä muita aineosia näytteessä on. Standardimaisiin puhdistusmenetelmiin sisältyvät elekt-roporeettinen, molekulaarinen, immunologinen ja kromatografinen tekniikka, mukaan luettuna ionivaihtokromatografia, hydrofobinen kromatografia, affiniteetti- ja käänteisfaasi-HPLC-kromatografia ja kromatofokusointi.

Ultrasuodatustekniikka ja diasuodatustekniikka ovat myös käyttöeklpoisia proteiinin väkevöinnin kanssa. Yleisen opastuksen saamiseksi sopivasta puhdistustekniikasta katso lähde (57). Tarvittava puhdistusaste vaihtelee riippuen pantro-fiinisen neurotrofiinin käytöstä. Joissakin tapauksissa ei tarvita lainkaan puhdistusta.

Sopiviin isäntäsoluihin sisältyvät hiiva, bakteerit, arkebakteerit, sienet, kuten rihmasienet, ja kasvi- ja eläinsolut, mukaan luettuna nisäkässolut. Erityisen kiinnos- • · tavia ovat Saccharomyces cerevisiae ja muut hiivat, E. coli, • · I Bacillus subtilis, Pichia pastoris, SF9-solut, C129-solut, • · · 32 tehokkaasti vektoreista, joilta puuttuvat pujontasignaalit. Näin ollen joissakin suoritusmuodoissa pantrofiinisen neurotrofiinin koodaava nukleiinihappo sisältää introneita.

Menetelmät eksogeenisen nukleiinihapon tuomiseksi nisäkäsisäntiin sekä muihin isäntiin ovat alalla hyvin tunnettuja ja vaihtelevat riippuen käytetystä isännästä ja niihin sisältyvät dekstraanin välittämä transfektio, kalsiumfos-faattisaostus, polybreenin välittämä transfektio, protoplasti-fuusio, elektroporaatio polynukleotidi(e)n kapseloiminen liposomeihin ja suora DNA:n mikroinjektio tumiin.

Yhdessä suoritusmuodossa pantrofiinisia neurotrofiine-ja tuotetaan hiivasoluissa. Hiivassa tapahtuvat ilmentä-misjärjestelmät ovat alalla hyvin tunnettuja ja niihin sisältyvät ekspressiovektorit seuraavia hiivoja varten: Sac-charomyces cerevisiae, Candida albicans ja C. maltosa, Han-senula polymorpha, Kluyveromyces fragilis ja K. lactis, Pichia guillerimondii ja P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe ja Yarrovia lipolytica. Menetelmät eksogeenisen nukleiinihapon tuomiseksi hiivaisäntiin sekä muihin isäntiin ovat alalla hyvin tunnettuja ja vaihtelevat riippuen käytetystä isäntäsolusta.

Edullisessa suoritusmuodossa pantrofiiniset neurotrof iinit ilmennetään bakteeri j ärj estelmissä. Eks- • i I, I pressiovektorit bakteereja varten ovat alalla hyvin tunnettuja • · » • · *. * ja niihin sisältyvät vektorit seuraavia bakteereja varten: • · ·

Bacillus subtilis, E. coli, Streptococcus cremoris ja • ••ί Streptococcus lividans mm. Bakteerien ekspressiovektorit transformoidaan bakteeri-isäntäsoluihin käyttäen alalla hyvin • · · ·,· · tunnettua tekniikkaa, kuten kalsiumkloridikäsittelyä, elektroporaatiota jne.

Yhdessä suoritusmuodossa pantrofiiniset neurotrofiinit ;***. tuotetaan hyönteissoluissa. Ekspressiovektorit hyönteissolu- • · · jen transformaatiota varten je erityisesti bakulo-virukseen • · · • ·* perustuvat ekspressiovektorit ovat alalla hyvin tunnettuja .

• · *···* Aineet ja menetelmät bakulovirus/hyönteisolu-ekspressiojär- ·*·*: jestelmiä varten on saatavissa kaupallisesti pakkauksen muo- • · • · · • « • · • · · 33 dossa: esimerkiksi "MaxBac"-pakkaus Invitrogen-yhtiöltä, San Diego.

Rekombinantit bakulovirus-ekspressiovektorit on kehitettu infektoitavaksi useisiin hyönteissoluihin. Esimerkiksi rekombinantit bakulovirukset on kehitettu seuraavia hyönteisiä varten: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melangaster, Spodoptera frugiperda ja Trichoplusia ni.

Kun pantrofiiniset neurotrofiinit on ilmennetty, niitä käytetään neurotroofisinä tekijöinä. Näitä pantrofiinisia neurotrofiineja voidaan käyttää erilaisissa diagnostisissa ja hoidollisissa sovellutuksissa.

Tämän keksinnön pantrofiiniset neurotrofiinit ovat käyttökelpoisia diagnostisissa menetelmissä neurotro-fiinireseptoreiden havaitsemiseksi. Esimerkiksi tämän keksinnön pantrofiiniset neurotrofiinit voivat olla leimattuja. "Leimatulla pantrofUnisella neurotrofiinilla" tarkoitetaan tässä pantrofiinista neurotrofiinia, johon on kiinnittyneenä vähintään yksi elementti, isotooppi tai kemiallinen yhdiste pantrofiinisen neurotrofiinin havaitsemiseksi tai neurotro-fiinireseptoriin sitoutuneen pantrofiinisen neurotrofiinin havaitsemiseksi. Yleensä leimat jaetaan kolmeen luokkaan: a) • · !. ! isotooppileimat, jotka voivat olla radioaktiivisia tai raskaita • · *, * isotooppeja; (b) immuunileimoihin, jotka voivat olla • · · '·’·* vasta-aineita tai antigeenejä; ja c) värillisiin tai fluo- ·· · ·»·· resoiviin väriaineisiin. Leimat voidaan lisätä pantrofiiniseen neurotrof iiniin mihin tahansa asemaan. Kun pantrofiiniset • · · ·.· · neurotrofiinit on leimattu, niitä käytetään neurotro- fiinireseptoreiden havaitsemiseksi joko in vitro tai in vivo.

Esimerkiksi neurotrof iinireseptoreiden läsnäolo voi olla ;***. merkki tiettyjen solutyyppien läsnäolosta; mikä on käyttö- • · · kelpoista diagnoosissa. Tämä tarkoittaa, että tiettyjen so- • · · • lutyyppien alapopulaatio voidaan osoittaa sitomalla leimattu • » *···* pantrofiininen neurotrofiini soluihin reseptoreiden kautta.

·*·’: Lisäksi tämän keksinnön pantrofiiniset neurotrofiinit • · • · · • · • · • · · 34 ovat käyttökelpoisia standardeina neurotrofiinimäärityksissä. Esimerkiksi pantrofiinisen neurotrofiinin aktiivisuus missä tahansa erityisessä määrityksessä voidaan määrittää käyttäen tunnettuja neurotrofiinistandardeja ja sitten pantrofiinista neurotrofiinia voidaan käyttää neurotrofiinien diagnoosissa ja määrän määrittämisessä.

Lisäksi tämän keksinnön pantrofiiniset neurotrofiinit ovat käyttökelpoisia elatusaineen aineosina käytettäväksi hermosolujen viljelyssä in vivo, koska monet hermosoluviljelmät edellyttävät kasvutekijöitä. Kuten alan ammattimiehet ymmärtävät, tämän keksinnön pantrofiiniset neurotrofiinit voivat korvata muita neurotrofisia tekijöitä, joita käytetään usein elatusaineen aineosina. Lisättävä pantrofiinisten neurotrofiinien määrä voidaan määrittä helposti käyttäen standardimäärityksiä.

Tämän keksinnön pantrof iiniset neurotrof iinit ovat myös käyttökelpoisia vasta-aineiden muodostamiseksi, joita voidaan käyttää neurotrofiinien tai neurotrofiinin vasta-aineiden diagnoosissa, identifioinnissa ja paikallistamisessa organismissa tai potilaassa. Esimerkiksi pantrofiinisia neurotrof iineja voidaan käyttää polyklonaalisten tai mono- ··.·. klonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi, kuten alan am- • · I mattimiehet hyvin tietävät. Vasta-aineet voidaan sitten leimata • · *. * ja käyttää neurotrofiinien läsnäolon tai puuttumisen • · · *·*·* havaitsemiseksi. Näin ollen voidaan tehdä neurotrofiineihin » ··· ···· liittyvien hermossairauksien diagnoosi. Vaihtoehtoisesti • ·*· vasta-aineet voidaan havaita epäsuorasti käyttämällä toista ·«· V· vasta-ainetta. Esimerkiksi primaariset vasta-aineet voidaan muodostaa hiirissä tai kaniineissa ja sitten leimattuja an- ti-hiiri- ja anti-kaniini-vasta-aineita käytetään primaaristen ·***. vasta-aineiden havaitsemiseksi. Jompi kumpi näistä mene- ··· telmistä sekä vastaavat alalla hyvin tunnetut menetelmät • · · • ·* tekevät mahdolliseksi neurotrofiinien havaitsemisen erilai- ··· • · *···* sista kudoksista.

;*·*: Lisäksi vasta-aineet, jotka on muodostettu tämän • · ··· • · • · ··· 35 keksinnön pantrofUnisille neurotrofiineille ovat myös käyttökelpoisia neurotrof iinien ja pantrof Unisten neurotrof iinien puhdistamiseksi. Koska yleensä pantrof Unisten neurotrof iinien aminohapposubstituutiot ovat pieniä, monet immuuniepitoopit ovat yhteisiä neurotrofiineille ja pantrofiinisille neurotrofiineille. Näin ollen pantrofUnisille neurotrofii-neille muodostetut vasta-aineet sitovat luonnossa esiintyviä neurotrofiineja ja ovat siten käyttökelpoisia puhdistuksessa. Esimerkiksi voidaan käyttää puhdistuskaavioita, jotka perustuvat affiniteettikromatografiatekniikkaan, kuten alalla on tunnettua.

Tämän keksinnön farmaseuttiset koostumukset sisältävät pantrofiinisen neurotrofiinin muodossa, joka on sopiva annettavaksi potilaalle. Edullisessa suoritusmuodossa farmaseuttiset koostumukset ovat vesiliukoisessa muodossa ja voivat sisältää aineita, kuten kantajia, täyteaineita, sta-biloimisaineita, puskureita, suoloja, hapettumisenestoaineita, hydrofiilisiä polymeerejä, aminohappoja, hiilihydraatteja, ioniaktiivisia tai ei-ioniaktiivisia pinta-aktiivisia aineita ja polyeteeni- tai -propeeniglykolia. Pantrofiiniset neurotrofiinit voivat olla ajan suhteen vapautuvassa muodossa implantaatiota varten tai ne voivat olla suljettuina mik- • * I. I rokapseleihin käyttäen alalla tunnettua tekniikkaa.

• · · • · *. * Seuraavat esimerkit kuvaavat täydellisemmin edellä • · · ’·*·* kuvatun keksinnön käyttötapaa sekä esittävät parhaat mallit, • · · • ••ί jotka ovat mahdollisia keksinnön eri näkökohtien toteuttami- seksi. On ymmärettävää, että nämä esimerkit eivät rajoita ··· ' millään tavoin tämän keksinnön todellista piiriä, vaan pa remminkin ne on tuotettu kuvaavia tarkoituksia varten.

:*·*; Esimerkit

Esimerkki 1 • · • · · NT-3:n molekyylimallin rakentaminen ja kohteiden identifiointi • · · * ** mutaatioanalyysiä varten • · *···’ Hiiren NGF:n kolmiulotteisen rakenteen koordinaatit ·*·’: saatiin N. Q. McDonald'ilta ja T. L. Blundell' ilta. Ihmisen • · • · · • · • · • · · 36 NT-3:n molekyylimallin rakentaminen toteutettiin Silicon Graphics Iris Workstation -työasemalla käyttäen interaktiivista InsightII-ohjelmaa. NT-3:n rakenteiden kuvaukset tuotettiin käyttäen MidasPlus-ohjelmaa (Kalifornian yliopisto, San Francisco).

Kun hiiren NGF:n (mNGF:n) kolmiulotteinen rakenne saatiin käyttöön (59), mahdolliseksi tuli järkevä lähestymistapa neurotroofisen toiminnan rakenteelliseen perustaan käyttäen proteiinien muokkaustekniikkaa. mNGF:n rakenne koostuu tiukasti liittyneestä dimeerista, jolla on kaksi identtistä aminohappopolypeptidiketjua. Kummankin monomeerin kiertymisen muodostavat käännösten kytkemien, kiertyneiden vastakkaisiin suuntiin olevien β-levyjen pidentyneet segmentit. Molekyylillä on pitkänomainen muoto ja se tuottaa tasaisen hydrofobisen pinnan, joka muodostaa yhteenliittyneiden monomeerien rajapinnan (59) . Rakenteen silmiinpistävä ominaisuus on disulfidisidosten järjestyminen, joka nyt tunnetaan kysteiini-solmumotiivina (cysteine-knot motif) (60) . Tämä motiivi on havaittu myös muuten toisilleen vieraissa TGF-B:ssa (61); (60) ja PDGF-BB:ssä (87) . mNGF:n rakenteen useat alueet, mukaan luettuna amino- ja karboksipäätteet ja silmukka jäännösten 43 ja 48 välillä, eivät olleet kovin tarkasti • · j.I rajattuja osoittaen erittäin joustavia rakenteellisia ele- • · I menttej ä.

• · · ***** Ihmisen NT-3:n (hNT-3:n) sekvenssi on 56-% risesti • · · ···: identtinen ja 70-%:isesti samanlainen kuin mNGFrllä (kuva 1).

*.:.* Sekvenssin erot ovat ryhmittyneet rakenteellisesti mää- • · · : rittelemättömään N-päätteseen ja silmukka-alueelle jäännösten 43 ja 48 välillä. Kysteiinijäännösten suhteellinen asema on :*·*: säilynyt, kuten kaikissa neurotrof iiniryhmän jäsenissä, ;***. viitaten samanlaisen kysteiini-solmumotiivin läsnäoloon kuin • · · ..*. hNT-3:ssa. hNT-3:n ja hiiren NGF:n sekvenssien samanlaisuus • · » • ·* viittaa siihen, että molemmilla on samanlainen perustavaa • · *···* laatua oleva kolmiulotteinen kiertyminen ja sen vuoksi mNGF:ää ·’·*: käytettiin runkona (scaffold) hNT-3-mallille. Mallin • · ·«· • · • · • · · 37 rakentamisen toisessa vaiheessa sivuketjut, jotka olivat erilaisia mNGF:n ja hNT-3:n välillä, korvattiin hNT-3:n aminohapoilla käyttäen InsightII-ohjelmaa (Biosym Technology,

San Diego, CA). Mikäli mahdollista, hNT-3:n sivuketjujen konformaatiot pidettiin samanlaisina kuin mNGFrllä, muutoin ne perustuivat rotameerikirjastoihin (62), pakkaus- ja ve- tysitoutumisnäkökohtiin. Lopuksi Asn99:n insertio ja sitten silmukan 93 - 95 säätäminen etsittiin kiderakenteista Protein

Data Bank -tietopankista (63). Lopullinen malli koostuu 104 aminohaposta eikä sisällä kuutta N-terminaalista (Tyri - Ser6) , neljää C-terminaalista (Ilell6 - Thrll9) eikä viittä silmukkajäännöstä (G44 - V48). Tämä malli teki mahdolliseksi niiden jäännösten identifioinnin, jotka ovat todennäköisesti osallisina tärkeissä rakenteellisissa yhteyksissä, mikä johti niiden poissulkemiseen mutaatioanalyysistä. Nämä jäännökset olivat joko osallisina rajapinnassa (W20, F52, Y53, W99, W101), rakenteellisesti tärkeissä vetysidoksissa tai hydrofobisissa kontakteissa (S12, 130, Q50, P62, S83, R100, T106, S107), disulfidisidoksissa (C15, C57, C67, C79, C108, C110) tai ne olivat piilossa proteiinin sisällä (V13, S16, S18, V21, D29, 130, V35, V37, 1102, 1104). Kuitenkin joissakin tapauksissa ;·§·φ näiden jäännösten muuttaminen on toivottavaa. Lisäksi glysiini- • · I, ja alaniinijäännöksiä ei muutettu lukuunottamatta jäännöstä *. * Gly 44. Vastakohtana asiaan liittyville tutkimuksille, jotka • · · *·*·* koskivat mNGF/trkA-vuorovaikutusta, pääasiassa aminohappojen • · · • ••ϊ yksittäiset jäännökset tai parit substituoitiin monien jäännösten vaihtamisen (53) , (56) , (55) , tai jäännösten • · · · poistamisen (49) sijasta. Jäännökset vaihdettiin pääasiassa alaniiniin (64). Joissakin tapauksissa oli mahdollista :*·*: suunnitella suurempia aminohappoja korvikkeina rakenteeseen ·**’. mahdollisesti steerisen esteen luomiseksi • · • · · reseptori-ligandi-vuorovaikutukselle.

9 9 9

Ensimmäinen mutaatioiden sarja selvitti sekä säilyneitä • · ’···* että ei-säilyneitä jäännöksiä, jotka sijaitsivat pääasiassa ·*·’: β-juosteissa, joiden pinta on alttiina ja sen vuoksi mahdol- 9 · • •9 9 · 9 9 9 9 9 38 lisesti osallisena sitoumisessa trkC- ja gp75-reseptoreihin. Tämän hetkinen NGF:n toimintaa koskeva olettamus (55) viittaa siihen, että erilaiset jäännökset, jotka sijaitsevat β-juosteet ja päätteet yhdistävissä silmukoissa, ovat tärkeimmät determinantit reseptorisitoutumisen ja spesifisyyden kannalta. Toinen hNT-3-mutanttien sarja arvioi näiden jäännösten tärkeyttä hNT-3:n ja sen reseptorien vuorovaikutukselle. Mu-tanttien kokonaissarja peitti oleellisesti NT-3-molekyylin pinnan kokonaisuudessaan.

Esimerkki 2 NT3-neurotrofiinin ja pantrofiinisten NT-3-neurotrofiinien spesifisten aminohapposubstituutioiden tuottaminen

Ihmisen NT-3 oli aikaisemmin kloonattu, sekvensoitu ja subkloonattu pRK-tyyppiseen vektoriin, joka mahdollistaa kaksijuosteisen ja yksijuosteisen DNA:n tuotannon E. coli -bakteerissa sekä valmiin NT-3:n ilmentymisen nisäkkään järjestelmässä sytomegalovirus-promoottorin (65) kontrolloimana. Tähän vektoriin kohdistuva mutageneesi toteutettiin Kunkel'in menetelmän mukaisesti (66) (67). Transformaation jälkeen E.

coli -bakteerikantaan XLl-Blue, pesäkkeistä seulottiin halutun mutaation läsnäolo sekvensoimalla yksijuosteinen DNA käyttäen Sequenase version 2.0 -pakkausta (U. S. Biochemical Corp.).

• · !. ' Valmiin NT-3:n koodaava sekvenssi kokonaisuudessaan • · · • · *. * varmistettiin oikeaksi kaikista positiivisista klooneista.

*·’·’ Kaksijuosteinen DNA eristettiin XL-l-Blue-kannasta QIAGEN DNA

• · · ···: -puhdistuspakkauksen avulla (Qiagenlnc., Chatsworth, CA) . Tätä DNA: ta käytettiin sitten ihmisen sikiön munuaisen solulinjan • · · ϊ.ί · 293 transfektiota varten (68). Kaikki muut rekombinantit DNA-manipulaatiot toteutettiin, kuten on kuvattu (69). Hyvin :*·*: tunnettua tekniikkaa käytettiin alukkeiden tuottamiseksi .**·. kaikkia mutaatioita varten. Aluke D15A-mutaatiota varten oli • · 5' -GGTCACCCACAAGCTTTCACTGGCACATACCGAG-3' (SEQ. ID. NO. 6) ja i · « • ·’ aluke Sl-mutanttia varten (NT3:n 6 N-terminaalisen aminohapon • « *·.·* vaihto NGF:n 7 N-terminaaliseen aminohappoon) oli ;*·*: (5 ' -GTACTCCCCTCGGTGGAAGATGGGATGGCTCGAGGACCGTTTCCGCCGTG-3 ' • · • · · • · • · • · · 39 (SEQ. ID. NO. 7).

Villin tyypin ja mutanttien neurotrofiinien ilmentyminen

Plasmidi-DNA, joka sisälsi joko hNT3:n tai mutantin hNT-3:n koodaavat sekvenssit, tuotiin ihmisen sikiön munu- aissolulinjaan 293 kalsiumfosfaattisaostuksen avulla (70) .

Transfektoitiin 75 % yhtenäiseksi levyksi kasvaneista soluista 10 pg:lla plasmidi-DNA:ta/15 mm:n soluviljelymalja ja inkuboitiin 15 tunnin ajan seerumia sisältävässä elatusaineessa.

Sitten elatusaine poistettiin ja vaihdettiin seerumittomaan elatusaineeseen (PS04), joka oli täydennetty 10 mg:lla/l rekombinanttia nautaeläimen insuliinia, 1 mg:lla/l transferriiniä ja hivenalkuaineilla. Päällysneste kerättiin 48 tunnin ja 96 tunnin kuluttua ja väkevöitiin suunnilleen 20-kertaisesti centriprep-10-suodatusyksiköiden avulla (Ami- con, Beverly MA) ja suodatettiin steriilisti.

Neurotrofiinimutanttien määrän määrittäminen

Spesifinen hNT-3-ELISA perustui Protein A

-puhdistettuun polyklonaaliseen antiseerumiin, joka oli peräisin marsusta (Genentech). Päällystettiin 96-kuoppaisen levyn (MaxiSorp; Nunc, Kamstrup, Tanska) jokainen kuoppa yöksi 4 °C:n lämpötilassa 100 pl:lla (konsentraatio 4 pg/ml) antisee- rumia 0,05 M natriumkarbonaattipuskurissa (pH-arvo 9,6).

Tukkimispuskurilla toteutetun 1 tunnin tukkimisvaiheen jälkeen *. * (PBS + 0,5-%:inen BSA + 0,01-%:inen Thimerosal, pH-arvo 7,4) *·*;* kuopat pestiin kuusi kertaa ELISA-puskurilla (PBS + 0,5-%:inen • · · BSA + 0,05-%:inen Tween-20 + 0,01-%:inen Thimerosal, pH-arvo 7,4). Puhdistettu rekombinantti hNT-3 tai hNT-3-mutanttien • · · * näytteet, joiden konsentraatio oli tuntematon, laimennettiin ELISA-puskuriin 100 μΐ:n tilavuuteen ja lisättiin kuoppiin.

Levyjä inkuboitiin 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ravistaen j***· keskeytymättömästä. Kuopat pestiin ELISA-puskurilla, minkä ··· jälkeen niitä inkuboitiin 100 μ1:η kanssa biotinyloitua « * * ·φ>·* anti-hNT-3-vasta-ainetta (Genentech) 2 tunnin ajan ja pestiin *···* jälleen ELISA-puskurilla. Kuoppiin lisättiin 100 μΐ 1 : 50 000 -laimennusta streptavidiinia/piparjuuriperoksidaasia (Zymed, • · • · · • · • · • · · 40 43-4323) ja inkuboitiin 30 minuutin ajan, jonka jälkeen seurasi pesuvaihe ELISA-puskurilla. Lopuksi väriä kehitettiin 15 - 20 minuutin ajan käyttäen 100 μΐ PBS-liuosta, joka sisälsi 0,012 % H2C>2:a ja 0,04 % o-fenyleenidiamiinia. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 50 μΐ 4,5 N H2S04:a. Absorptio luettiin aallonpituuksilla 490 nm ja 405 nm käyttämällä kineettistä Vmax -mikrolevylukulaitetta (Molecular Devices, Palo Alto, CA) .

Standardikäyrä määritettiin käyttäen puhdistettua rekombinanttia hNT-3:a (Genentech), jonka konsentraatiot olivat 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56 ja 0,78 ng/ml. Näytteet, joiden NT-3-konsentraatio oli tuntematon, laimennttiin sarjassa 1 : 10, 1 : 30, 1 : 90, 1 : 270; 1 : 810; 1 : 2 430, 1 : 7 290 ja 1 : 21 870 monien tietopisteiden saamiseksi näytettä kohden. Standardikäyrä määritettiin käyttäen standardiproteiinin määrityksestä saatujen tietopisteiden neljän parametrin sovitusta.

NT-3-mutanttien määrät väkevöimisen jälkeen vaihtelivat välillä 120 ng/ml - 36 pg/ml. ELISA-määritys ei havainnut NT-3:a päällysnesteissä, jotka olivat peräisin vale- transfektoiduista soluista, eikä se myöskään reagoinut ristiin ihmisen rekombinantin NGF:n kanssa, joka oli peräisin NGF:llä transfektoitujen solujen päällysnesteistä (tietoja ei I. esitetty) . Kutakin NT-3-mutanttien ilmentymisten sarjaa varten • * *. ; toteutettiin luontaisen hNT-3:n ilmentyminen ja sen määrä • · · ’·*·* määritettiin ELISA: 11a rinnakkain vertailevan paino- « · · •••ϊ konsentraation saamiseksi reseptorisitoutumistutkimuksia • · · varten. Kaikki mutantit ilmennettiin, niiden määrä määritettiin • · · ·.· : ja ne analysoitiin vähintään kaksi kertaa.

Jodaus

Puhdistetut rekombinantit hNT-3, hBDNF ja hNGF (Ge-nentech) leimattiin käsittelemällä laktoperoksidaasilla • · · käyttäen Enzymobead -radiojodausreagenssi- (Bio-Rad) -mene- • · * telmän muunnelmaa (71) . Tavallisesti jodattiin 2 pg neurot- • · *···* rofiineja spesifiseen aktiivisuuteen, joka oli 3 000 - 3 500 cpm/fmol) . Leimattua materiaalia varastoitiin 4 °C:n lämpö- « · • · · • » • · • · · 41 tilassa ja se käytettiin 2 viikon kuluessa valmistuksesta.

Sitoutumismääritykset

Soluun perustuvissa sitoutumismäärityksissä käytettiin rotan tkrC:n [NIH3T3/trkC, (26)] ilmentävistä stabiileista solulinjöistä saatujen membraanien valmisteita. Kilpailevat syrj äyttämismääritykset toteutettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu (26) . Mutanttien sitoutumisaffiniteetti trkC-reseptoriin määritettiin kahdesti kunkin ilmentymisen osalta tietopisteiden kahtena rinnakkaisena sarjana. Tämä menetelmä teki mahdolliseksi kunkin mutantin affiniteetti-määrityksen virheen arvioinnin. Väliaikaisesti ilmentävistä soluista saadun puhdistamattoman rekombinantin NT-3:n kykyä syrjäyttää 125-I-leimattu NT-3 NIH/3T3-solujen pinnalla ilmentyneistä trkC-reseptoreista verrattiin puhdistetun NT-3:n vastaavaan kykyyn. Kummatkin syrjäyttivät leimatun NT-3:n, IC50-arvojen ollessa vastaavia: puhdistamattoman NT-3:n IC-50-arvo oli 7 pM ja puhtaan NT-3:n 9 pM. Tämä osoitti, että ilmentävien 293-solujen päällysnesteistä saadun puhdistamattoman NT-3:n määrä voitiin määrittää tarkasti ja käyttää myöhemmin reseptorisitoutumistutkimuksissa. Sitoutumismääri-tysten spesifisyys osoitettiin NGF:n, BDNF:n ja valetrans-fektoitujen solujen päällysnesteen kyvyttömyytenä syrjäyttää I sitoutunut leimattu NT-3 trkC:stä (tietoja ei ole esitetty).

• · · *.; Reseptori-immunoadheesioproteiinit muodostettiin • · « *·1·* käyttäen ihmisen trkA:n, trkB:n, trkC:n ja gp75:n ekstrasel- • · · • ••ί lulaarisia domaineja, jotka fuusioitiin immunoglobuliinin vakioisiin domaineihin (Genentech, julkaisemattomat tulokset) .

··· : Päällystettiin 96-kuoppainen levy (Corning, ELISA-kuoppien stripit) 100 pl:lla (konsentraatio 5 pg/ml) vuohen F (ab' )2-anti-humaaninen-Fc-IgG:11a (Organon Technika, West ;***. Chester, PA) päällystyspuskurissa 15 tunnin ajaksi 4-8 °C:n • · · lämpötilassa. Kuopat imettiin, pestiin 3 kertaa PBS-liuoksella • · · • ·1 ja niitä inkuboitiin 2 tunnin ajan 100 μ1:η kanssa *··.1 (konsentraatio 40 ng/ml) reseptori-immunoadhesiiniprote- iiniliuosta sitoutumispuskurissa (Leibovitz's L-15 -elatusaine, • « • · · · · 42

joka oli täydennetty 5 mg:lla/ml BSA:a (Intergen, Purchase, PA), 0,1 mg:lla/ml hevosen sydämen sytokromi C:tä (Sigma) ja 20 mmol:lla/l HEPES:ä, pH-arvo 7,2. PBS-pesuvaiheen jälkeen kuoppiin lisättiin välittömästi 50 μΐ sitoutumispuskuria kuivumisen estämiseksi. Sekä luontaisen että mutantin proteiinin varastoliuokset laimennettiin sarjassa käyttäen sitoutumispuskuria, jolloin saatiin konsentraatioalue 4096 -2 pM. Lisättiin 25 μΐ sarjalaimennusta/kuoppa ja sen jälkeen 25 μΐ leimattuja neurotrofiineja. Leimattujen neurotrofiinien lopullinen konsentraatio kussakin kuopassa oli noin 50 pM trkA-, trk-B ja trkC-määrityksissä ja 100 pM

gp75-sitoutumismäärityksissä. Kolmen tunnin inkuboinnin jälkeen huoneenlämpötilassa kuopat pestiin PBS:llä + 0,5-%:isella Tween 20:llä ja sitoutunut radioaktiivisuus laskettiin. Kaikki syrjäyttämiskokeet analysoitiin käyttämällä tietosarjan neljän parametrin sovitusmenetelmää ja Kaleidagraph-oh- jelmistopakettia. Kaikki sitoutumistulokset pylväsdiagrammissa on ilmoitettu suhteena IC-50mut/IC-50wt. Neurotroofisten tekijöiden aiheuttama trk-reseptoreiden autofosforylaation stimulaatio PC-12-solulinjoissa Noin 1 x 107 solua käsiteltiin 37 °C:n lämpötilassa 5 minuutin ajan 25 ng:lla/ml neurotrofiinia. NP-40-maljalyysi I ja immunosaostus antiseerumilla 443 (pan-trk) tai 656 • * · • · *. * (trkC-spesifinen) toteutettiin, kuten edellä on kuvattu (26).

• · ·

Fosfotyrosiinipitoisuus analysoitiin Western-siirron avulla • · · ···· käyttäen monoklonaalista vasta-ainetta 4G10, kuten aikaisemmin on kuvattu (23) . 4G10 havaittiin, kuten aikaisemmin on kuvattu :T: (26) .

PC12-solujen ja trkB:n ja trkC:n ilmentävien PC12-solujen :*·*: erilaistumismääritykset

Noin 103 PC12-solua, jotka ilmensivät erilaisia ·«· trk-ryhmän jäseniä (trkC; (26) trkB; Soppet, julkaisemattomat • · · havainnot), saatettiin viljeltäväksi 35 mm:n kollageenilla • · *···* päällystetyille kudosviljelymaljoille, jotka sisälsivät yh- ·***: teensä 2 ml elatusainetta. PC12-solut, jotka ilmensivät trkCrn, • · • · · • · • m • · · 43 analysoitiin käyttäen kolmea erilaista konsentraatiota (10 ng/ml, 1 ng/ml, 100 pg/ml), ja parentaaliset PC12-solut, jotka ilmensivät vain trkA:n, tai PC12-solut, jotka ilmensivät trkB:n, käsiteltiin 10 ng:lla/ml NT-3-mutantin päällysnesteitä. Kutakin käsittelyä varten laskettiin vähintään 200 solua. Neuriitteja kantavien solujen osuus määritettiin laskemalla sellaisten solujen lukumäärä, joilla oli haarakkeita, joiden pituus oli vähintään kaksi kertaa solukeskuksen pituus, 3 -4 päivän kuluttua.

Alkiokudosten preparointi ja hermosoluviljelmät

Kananpojan alkiot eri kehitysvaiheissa saatiin hautomalla valkoisten Leghorn-kanojen munia (SPAFAS, Reinholds, PA) 38 °C:n lämpötilassa kananmunien haudontalaitteessa tarvittava aika. Dorsaaliset juurigangliot, nodoosigangliot alkiopäivänä 8 (E8) ja sympaattiset gangliot alkiopäivänä 11 (Eli) preparoitiin Leibowitz-15-elatusaineessa (L-15-elatus-aineessa), joka sisälsi 1 x penisilliiniä/streptomysiiniä, käyttäen kellosepän pihtejä ja elektrolyyttisesti terotettuja volframineuloja. Kananpojan alkion ganglioita käsiteltiin trypsiinillä 37 °C:n lämpötilassa 20 minuutin ajan ja sitten ne pestiin elatusaineessa (F14, jossa oli 10 % lämmön avulla .· . inaktivoitua hevosen seerumia ja 5 % lämmön avulla inaktivoitua !. \ vasikkasikiön seerumia) ja ne trituroitiin varovasti tulen • · · • · *. ; avulla puhdistetulla pipetillä, jolloin saatiin yksittäisiä • · · *·1·1 soluja sisältävä suspensio. Kananpojan alkion solut saatettiin • · · ...! viljelyyn 35 mm:n maljoille, jotka oli päällystetty ·.·.· polyornitiinilla (0,5 mg/ml 0,15 M boraattipuskurissa, pH-arvo • · · ·/· ' 8,6, yön yli) ja laminiinilla (20 ml/ml 4-6 tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa), 2 ml:ssa elatusainetta, kun läsnä oli 2 ng/ml neurotrofiinia tai kaikki tekstissä mainitut konsentraatiot. Kaikki solut, joilla oli neuronaalinen morfologia 5x5 mm:n • · · ristikolla kunkin maljan keskellä, laskettiin 72 tuntia • · · • ·1 myöhemmin.

• 1

Tulokset on esitetty taulukoissa 3 ja 4.

• · · • · · • · • · · · • · • · • · · uu CN u ... . ·

rH QQQQO

o 1-« + + + + + + +·+· + + · + + + + * + +· + + O. ij + + + + + + -^ + +24-2+ + +24- + + 4+ 2+ +2+1 i + * + 4-) < 3 > * a a

> o JH

^11^X4 I I I i ) I j I I I I 2 I I I < I I I I I 2 I < < < > 1 1 1 1

03 O ^ M \ CQ

c -p ·* Q Q

'2 g P I ........I I 2 I I I I I t I I I Z t I I t 1 1 · 1 •rH ·"

•H O

1 in u _ *

3 o * Q ^ Q

^^1+4 + + + + + + 4- + + ++ 2+1+ + +4-4-4-+2+ + + +1 1 + 1 + o _

c ^ O

Π) 4-) CM >v H MNl/IOfS

£ > rH OO - Ο <N Ο ΤΓ Ο ΗΗΠΗΗ ._j · * ri · · · 4{ · .....

2 O O O O 44 O O O 0 0 OOOOO

5 ΙΛ +4 + 44 0+4+4+1fs44 + 44 +1 +1 44 --5 J\ o o p- O O O (N . r4 +N0»00 CO o o cd · 'f cd r* cd ω πνηΑΟ' D M < . · CD ---5- ····'· 0O^*-Hr4 +40 H H H O H ^ fH H OJ H Ö i_) 4-> X H 3 θ\ X m E 00 0

3 I <N · O

, ιρ, Ο σ% p- m m mm vo p- o m p- · m σ» '"j ___UO 0 0^+4 cn tOrH^r .η n vo m m p j 0 · ... cm ... -+n · +< frt cli—1 0 000 ©+4 00 0 oo+ioo r r-} ^ ** +4+(+1 +1 CM +4 + + +00+10 “ w ο oi m m in in m cm cd m · ο σ% · O ID ΙΛ Γ4 (N* l/lh h in o * CO P- <· ... t-4 ... · m <N · i-4 +4 1-4 O m rH «4 (N +4 (N +4 r4 rH O +4 i-4

C

O

c ··· ·η cd ©oni-HTrmp-vomiocDrMrMOvmcorHOinrMp-in m J · J gr o γνηγ«.(νηη(ΝΟη(ν o0«NiocDr4oimrN μ h η n cm

* * 5 r-ι o oooooooooo o°o^ooooo O O O O ° ® O ° <N

J , * ~ £- + +1+1+4+4+4+444+4+4+ +4 +4 + ++444 +1+1 + + + +^^+^ +1 • · tI m Ο Π ΙΛ © « ν Ό P* Π f** · r "]in D> (N fN νβ (ΝΠ · ΙΛ V ω (N * * in ’ r- • · y{ z£ o (iffKNvfl + rop^tH^D+VfN^mHvnoiQHtfii^cDSr^rve #e 4-) ^ ............Λ............00.0.

··· '<-* 2 r4 00m0r4000rH020 HfSNHHINOZHHOH^H^O

• · · rn Λ Λ Λ

# * I

.:. ^ • i., ···· h .

...

...

...

¢-

! ! ! £ ^ O -Γ ΙΟ Ov T-< O VO O (N

. ζ!λ o lO (N LO H H p- (ΰ 03 H in Ov HCOP-fSh OuA m 0\ 4P (N O O (Λ *H CO i-4 (Ninv'imHHO'mNvN + inmrim'flHrsHvfflnnp + HHp

E -H :cO

(—I 4-3

4-4 rH CO

.*:*. c -h ·η ::: <d > α.

• E >> *:* £ <1) ... o Ovi 2 ·.:.* -h r- m T* 4_) \ S-

.*·*. CO O H 4-> < :S

·· cöQvZcd ίο -¾

··· ohcd< >· < < o E

• -h >> C ^ ** ® m <N «-4

... r en rn *""* ^ ® o>Q »H

:...: ro £ « o ^ ® “ %<X)C< <“ ’**. 2¾ "ri 2, < < OK < O ^ οω ω < < u. < < < < < r ω r CO < ω n ri n O in n φφ### ίΝηπΓ(ί)ιηΐΒΦθθΗΗ + οη5ΓθΜ>ΗΗΗΡθθθθθ . . ,2 O SZ \ Hr-tfN(MNnj(NnjfNnnTinininin'iM£)CDoa)0'cn0O'HHHr<H ^ Σ Cl h jd QUhQiiWWtOHfHJU>»>'[Jc;>Q:ica:jo3wv)>fiifl:ffDiQ ^ 45 + +

α Ο D Q D Q

^ + + 1 1· 1 .... . ^ + + + + + + + + + + + + + + + ^ + +Z+1+ Z Z Z Z 2 + + + + + ++ + + + + + + + + +

Q O Q O

1 ♦ 1 2 1 I 1 2 1 Z 1 1 2 1 1 ‘ · 1 < I f I I I I tit

Q O Q Q Q

1 Z iZi + i Z 1 Z 1 f 1 z ιιι··ι iiii«i » t 1

Q OO Q

+ + ♦ Z + ♦ 2 + Z + +- +Z++++++ + + + + + + + + +

Q

Z

" O' r-• m m · O un esi p- cd n h voin m n h +<r-> t-< r- o O cd t-< +· 1 · ....

OO O'VD «NO O Ort © +· +< ,VD +· +· +( +4+( +(

OtN P-· «/> rH «ΗΟ191 O

cd cd tnpvi 2 3 4 5 O «n © in th * 1 CD 1 1 ....

«-< Ο ,-| CDP'J «-< Ο ΙΛ r“< r1 n n p-1 cd on rt (NH ο O' . . . . . . n

O O O «h 0 O

+·+«+·+«+· +« o Ο Ο ΙΛ r- CD +· P- Ο η ΗΠ r+ LTl Π rH ri V H iH »-< i\1, »-( © CD Π (N <N LH+Ϊ1 © Π (N (N H Vfi r-( O' Γ' © O P- © γ- 4Γ O' • · cd »-» © cm »-< t-< O m <n »-< m rs1 cm o cm o rs in n rs nno » · . .... .... ...... .........

··· 0 0000 0 00 o oooooo 000000 000 • · · +1 +·+·+·♦· +« Ή +< +« +· +· ♦( +· +( +( +· +1 +· +1 +| +1 +| 4( +1

Je1 m 0 · tn in · © · in ^ © r^oi^vrgyj Η®ηιΛ©ν »-tm© »-( Q vd Q us n O QmOOO <n 1-4 ® o\ © © '0 cm © .-< © O' pj 0 ·-1 O' I!! ^rZ O Z Η π H Z O Z +-» 1-< T-tOOOO1-· »H»-«f-»00«-( »-ι»-·ο • · • ^ • · · 4-^ ·.·· 2 ω

• ~ 4J

• · · z ^ • · · Ή ··· , u

··· 4_5 'J

··· Φ r-( r-t © O «H © ©VO O UT> O' ·νΟ fS §

• <D «o m + oov »-h p- © © cdtt©oot-< 0 1-< cm η Ο ΐηΡΜΓ'·. G

rH CiOfSHH OpOH Η ® ΟΙΝίΝΗΠΠ t-( Η ΙΛ Ι/' + CD ΙΛΗΟ 4_) t 1a :ca Jj, ··· :5 ω n :::2- w " • H s: r-H —. .n 0 .···. >> «H -g Ä a • · >> z s 5 ··· ΓΛ— »— ^ ^ Λ :c^ >1 — 2 ·1· χ o U- <-1 <[ <; 1r 3

-£) fH M JT < ^ < <%» © ^· < < X

··· £» ω cl — m ^ w p^· p2 p^ © O ^

··· CO ShS .r—. m ^ «022 O' — ϋ -C

4

? · 2^<WW<<^0 ^ PC •JfNO’H

®^tO © in -v. ^ ^^1SN \ iou 03 . (« Of W CO -t£ .< << <<<<<<— Λ>

.XL V. a --s.mCOm r->© HOun + n +r O

.···. ^ < W < X n »» VO un U3 r~ r- ov > .,

:: E-CO ιωζιχ Z J

... ' Z Z ^ < E ^ 'V -v. ^ J£ 0 . Ο ^.ω ,—I <<<<ω <<<<<<<< <<<<<< << z z 5 C <ii.<(<u<C»4i-4 >r_^ »—4 r+ m o4tn^,m©r».cDO' O' © + »-4 «-· ro mmU.Z ic • · ή vU^n^nnH wp. w + v + + + + lo in © o1 r^· p~ O'O'UU) ^ E :r z — ω re ω >· cc J cccioa β: z o Z to a. > 1: qi^^oqo co <c 46

Taulukko 4

Neurotrofiini DRG NG SYMP

(°i NT-3:sta + (¾ NT-3:sta + (% MGF:stä) 5 BDNF:stä+NGF:scä’ BDNF:Stä NT-3 12.9=4=1.9 41.8±11.6 1-1±0.5 BDNF 35.4±1.6 65.4±19.7 N.D.

NGF S3.7±2.8 N.D. 100.0±3.7 NT-3+BDNF 53.7±2.2 100.0±1.8 N.D.

10 NT-3+NGF 66.5±0.6 N.D. N.D.

NT-3+BDNF+NGF 100.0±0.8 N.D. N.D.

D15A 11 4±0.4 46.6±10.0 1.4dfc0.6 SI 69.3±4.5 46.0±12.4 91.9±5.7 MNTS-’l 93.0±5.6 86.4±12.4 100.3±6.7 N.D. = ei määritetty

Esimerkki 3 N-terminaalisten NGF-muunnelmien tuottaminen, puhdistus ja karakterisointi

Useita varattuja ja varauksettomia jäännöksiä on säi-lynyt muista lajeista peräisin olevien NGF-proteiinien kes- • · *. * kuudessa. Erityisesti His4, Pro5 ja His8 ovat säilyneet • · · •4 ·* seitsemässä tunnetuista 8 NGF-sekvenssistä; Arg9 esiintyy • · · vain ihmisen ja kanan NGF:ssä, kun taas Met on vallitsevana muiden lajien NGF:n tässä asemassa. Muodostettiin 10 mutant-tia oligonukleotidisuunnatun mutageneesin avulla, joka joko: • · · : 1) korvasi jotkut hNGF:n N-päätteen varatuista jäännöksistä alaniinilla yksitellen tai yhdessä, 2) korvasi His4:n nega- :*·*: tiivisesti varatulla asparagiinihapolla, joka on N-terminaa- .·**. lisen hBDNF:n sekvenssin asemassa 3 (65) ; tai (3) muodosti • · · ·. kimeerisiä hNGF-molekyylejä, jotka sisälsivät joko hBDNF:n • · · *·:·* ensimmäiset 5 jäännöstä tai hNT3:n ensimmäiset 6 jäännöstä • · · • · ·...* tai hNT3:n muita muuttuvia alueita. Tulokseksi saadut mu- ;***; tanttirakennelmat muodostettiin vektoreissa, jotka sisälsi- • · · vät ihmisen CMV-promoottorin (70) , ja ilmennettiin väliai- A7 kaisesti ihmisen 293-soluissa, kuten jäljempänä on kuvattu.

Puhdistetut rekombinantit (1-118), (6-118) ja (10- 118) oli puhdistettu transfektoidun CHO-solulinjan käytetystä (conditioned) elatusaineesta käyttäen käänteisfaasi-HPLCrtä ja suuren erotuskyvyn ioninvaihtokromatografiaa, kuten ovat kuvanneet Burton et ai. (1992) (48) ja Kahle et ai., (1992) (49), ja ne oli karakterisoitu käyttämällä N- terminaalisen sekvenssin analyysiä, SDS-PAGE:a ja aminohap-poanalyysiä (tietoja ei ole esitetty). Nämä prosessoidut muunnelmat ovat tulosta CHO-solujen elatusaineen käytön aikana tapahtuneesta in situ proteolyysistä, jonka ovat aiheuttaneet vielä karakterisoimattomat proteolyyttiset entsyymit tai prosessointireaktiosarjat. Kunkin muodon puhtaus oli 99 % perustuen SDS-PAGE:en ja konsentraatio määritettiin kvantitatiivisen aminohappoanalyysin avulla. H4D-mutantti 2:n (20 μg 300 ml:sta elatusainetta) ja N-terminaalisen hNT3/hNGF-mutantti 6:n (5 μq 300 ml:sta elatusainetta) puhdistus ja analysointi toteutettiin transfektoitujen 293-so-lujen elatusaineena olleesta seerumittomasta elatusaineesta (katso jäljempänä), kuten juuri on kuvattu N-terminaalisten typistettyjen muunnelmien tapauksessa.

.. . Mutageneesi toteuttiin käyttämällä oligonukleotidi- • · ! suunnattua menetelmää (72) , joka käsitti muunnelmat, kuten • · · *# ·* ne on osoitettu BioRad Muta-Gene -pakkauksessa (66) ; (Bio- • · · *·*·* Rad, Richmond, CA) . Mutaatiot varmistettiin oikeiksi yksi- • · · juosteisten phagemid-kloonien DNA-sekvensoinnin avulla käyt-tämällä ketjunpäättämismenetelmää (73) . hNGF-mutantit ilmen- • · · : tyivät jo käytetyssä elatusaineessa ihmisen 293-solujen ti lapäisen transfektion jälkeen (68) (70). Keräämiseen käytet-ty elatusaine oli seerumiton 50 : 50 F12/DMEM-elatusaine, joka sisälsi N2-täydennyksen, ja kerääminen toteutettiin 48 • · · *. tunnin kuluttua seerumittomasta elatusaineesta. Jo käytössä • · · ollut elatusaine väkevöitiin 10-kertaisesti käyttäen Amicon- • · *···' väkevöintilaitetta. hNGF-mutanttien konsentraatio määritet- :***: tiin entsyymisidotun immunomäärityksen (ELISA) avulla käyt- ·:··· täen puhdistettuja kaniinin polyklonaalisia anti-hNGF-vasta- 48 aineita. Kunkin mutantin konsentraatio vaihteli välillä 3 -8 μq/ml. Kukin mutantti ilmennettiin vähintään kolme kertaa ja konsentraatio määritettiin ELISA:11a 2-3 toisistaan riippumatonta kertaa.

Mutantit analysoitiin myös metabolisesti leimaamalla tranfektoidut 293-solut (60 mm: n levyt, 1,2 ml elatusainet-ta) lisäämällä 200 μΟί sekä 35S-metioniinia että kysteiinia (Amersham). Sitten 18 tunnin kuluttua elatusaine kerättiin talteen ja saatettiin reagoimaan joko kaniinin polyklonaali-sen anti-hNGF-vasta-aineen kanssa tai hiiren monoklonaalisen vasta-aineen kanssa 3-4 tunnin ajaksi 4 °C:n lämpötilaan, tuote kerättiin talteen saostamalla Protein-A-helmien (Pharmacia) avulla ja levitettiin 15-%:isille akryyliamidi-SDS-PAGE-geeleille (Novex). Elektroforeesin jälkeen geelit kuivattiin ja pantiin seuraavaksi röntgensädefilmille. Ra-dioleimaamattomat mutantit tuotettiin, kuten edellä on kuvattu, ja 0,1 ^g:n näytteet kylmäkuivattiin, liuotettiin uudlleen SDS-PAGE-näytepuskuriin, saatettiin elektroforeesiin samoille geeleille ja siirrettiin nitroselluloosalle standardimaisten menetelmien mukaisesti (BioRad). Blottaus-tuotetta käsiteltiin kaniinin polyklonaalisella anti-hNGF- .. . vasta-aineella tai hiiren monoklonaalisella anti-hNGF-vasta- • · · • · ; aineella yön yli 4 °C:n lämpötilassa, se pestiin ja mutantit • · · •# i havaittiin emäksisen fosfataasin kanssa kytkettyjen vuohen • · · ’·*·* anti-kaniini- tai anti-hiiri-IgG-vasta-aineiden avulla.

• · ·

Reseptorisitoutumista, trkA:n autofosforylaatiota ja PC12:n neuriitin kasvua koskevat määritykset V · [125I]hNGF tuotettiin käyttäen Enzymobead-menetelmää (BioRad) Escandon'in menetelmän mukaisesti (71). Spesifinen :*·*: radioaktiivisuus, joka oli määritetty saostamalla TCA:lla .***. lähtöaineiden reaktioseoksen näytteet ja geelisuodatus-kro- ***** , ...

·. matografoimalla [ I]hNGF, oli keskimäärin 60 - 90 μCl/μq. - • · · *·|·* Reseptorisitoutumismääritykset toteutettiin yön kuluessa _ • · ’···* 4 °C:n lämpötilassa käyttäen NIH3T3-soluja, jotka ilmensivät :***: rekombinaation tuloksena rotan trkA:n (saatu ystävällisesti ··· ·;··· tri Luis Parada'lta), p75:n ilmentäviä ihmisen A875-melanoo- 4-9 niasoluja (ATCC) ja rotan PC12-soluja (saatu ystävällisesti tri Louis Reichardt'lta), kuten on kuvattu trkB:n ilmentävien NIH3T3-solujen yhteydessä (23) . Käytettävät NIH3T3-trkA-ja A875-p75-solujen konsentraatiot olivat 1 x 106 solua/ml; ja PC12-solujen konsentraatio oli 5 x 105 solua/ml. [125I]hNGF:n lopullinen konsentraatio oli 50 pM 0,2 ml:n tilavuudessa. Ei-spesifinen sitoutuminen, joka on määritelty [125I]hNGF:n konsentraationa, joka on sitoutunut, kun läsnä on 1 x 106 M leimaamatonta hNGF:Ää, vaihteli NIH3T3-trkA-solujen tapauksessa välillä 15 - 25 %, p75-A875-melanoomasolujen tapauksessa välillä 20 - 35 %, ja trkA + p75-PC12-solujen tapauksessa välillä 20 - 30 %, käytettäessä suodatinsitoutu-mismääritystä. Tiedot sovitettiin syrjäyttämisisotermiin ja IC50-arvo laskettiin käyttäen 4-parametrin yhtälöä Kaleida-graph-ohjelmassa. Joissakin tapauksissa reseptorisitoutumi-nen toteutettiin soluilla 25 °C:n lämpötilassa 90 minuutin kuluessa ja sitoutunut [125I]hNGF erotettiin vapaasta sakka-roosityynysentrifugoinnin avulla.

TrkA:n autofosforylaatio toteutettiin 37 ’C:n lämpötilassa reaktioajan ollessa 5 min ja fosforylaation laajuus määritettiin käyttämällä Kaplan'in kuvaaman menetelmän muunnelmaa (19). Triton X-100:lla hajotetut trkA-solut im- • · · : ·* munosaostettiin monoklonaalisen, agaroosihelmille immobi- • · · : .* lisoidun antifosfotyrosiinivasta-aine 4G10:n (UBI) avulla, « · ·.·.· saatettiin elektroforeesiin SPD-PAGE:lle ((8-%:inen akryy- t#|{* liamidi-Novex) , immunoblotattiin ja tutkittiin käyttämällä : S*S koettimena kaniinin polyklonaalista anti-trkA-vasta-ainetta :’·*: (saatu ystävällisesti tri David Kaplan' ilta) . TrkA:n havait- seminen toteutettiin käyttämällä emäksisen fosfataasin (AP) kanssa kytkettyä vuohen anti-kaniini-IgG-vasta-ainetta (TA- .···. GO) . PC12-solut kasvatettiin 20 - 30 %:n yhteensulautumiseen • · ’·* saakka polykationisilla, 24-kuoppaisilla Primaria-levyillä, • · · *.!.* elatusaine vaihdettiin runsaasti glukoosia sisältävään see- ··· ·...· rumittomaan DMEM-elatusaineeseen, joka oli täydennetty .*·*. N2:lla ja sisälsi hNGF:n villiä tyyppiä tai mutanttimuunnel- • · · mia. Sitten 48 tunnin kuluttua solut, joista työntyi ulos- • · 50 päin neuriitteja, joiden pituus oli yli kaksinkertainen so-lukeskuksen pituuteen verrattuna, laskettiin edustavalta, silminnähtävältä kentältä ja lukumäärä ilmoitettiin prosenttina kentällä olevien solujen kokonaismäärästä, tavallisesti 100 - 140 solua. Kunkin mutantin ja NGF-kontrollin aktiivisuus määritettiin vähintään kaksi kertaa erillisissä kokeissa. Reagoivien solujen prosenttiosuus hNGF:n maksimikonsent-raatioilla vaihteli välillä 55 - 75 % kokeiden välillä, jolloin keskiarvo oli 63 % laskettuna 13 määrityksestä. Vaihtelun ottamiseksi huomoon maksimivasteessa kokeiden välillä, tätä keskiarvoa käytettiin kaikkien tietojen normalisoimiseksi .

[125I]hNGF:n sitoutumisen estäminen trkA- ja p75-so-luihin hNGF:n monoklonaalisen vasta-aineen vaikutuksesta

Lisättiin samoissa olosuhteissa kuin edellä kuvatussa suodatinsitoutumismäärityksessä lisääntyviä konsentraatiota monoklonaalista anti-hNGF-vasta-ainetta 25 pM [125I]hNGF:ään ja saatuja seoksia inkuboitiin 30 minuutin ajan 25 °C:n lämpötilassa. Sitten lisättiin 1 x 106 solua/ml joko NIH3T3-trkA-soluja tai A875-p75-soluja (lopullinen tilavuus 0,2 ml) ja inkuboitiin 4 °C:n lämpötilassa yön yli sekoittaen voi- • · · • ·* makkaasti. Sitten näytteet laimennettiin ja suodatettiin • e e : *.* Whatman GF/C-suodattimilla ja toteuttiin laskenta.

• · ·.·.· Tulokset ..*·* Tulokset on esitetty taulukoissa 5 ja 6.

e • · · ♦ · · ··· ··· • · e • · · ··· • · · • · e ··· • e • · ··· • — • · · • · · ·· · _ • · • · ··· ··· e · • · ♦ ·· • · 51 Ή <0 ft _

tn *** O

u O VO · CN o VO VO VO CO VO O ^ VO

p Z , , pg , .··.····· 5 in \ h (N co <h Hncont^nnjooj 5 2,¾--------------- S +e -P +

'H X

m ΐ <=

-H I O

ij U m n · vo in co o co σι r~ on ^ Q W · · |“H · ······ · * *

.p I O H TT O O H "C H O H r-IO rH

ft --------------- 0)

UI

0) u h t" S ~ O O · ·*ί O t" ® O VO O CD® «“<

“ -H > H H H t-l H O O H H H HO V

ffl § 3-------------

-H 4J E

H 3 ^ rH lOt" φ ^ O* c ηί -h tr q

m _H ^ O O · H O ·» H 0\ H H in® H

r* SU H , , ^ . ······ ·· · >3 o n ci n *r (N h rH h m <n m «-H cd 3 £------------- m « ä 0 (D ϋ o •H OS y Q O o

K 2 · U O DU O

\ o o in <n ο o o in o o O «r n VU 4_) . · VO · · «f H · .» V H · ·

5 3 H (Λ N N H Λ Λ| H Λ Λ ΛΟ H

§ E------------- 1 * P ϋ ϋ c +1. ο ο o

0) c · o · O

+J vr ® N O D Ν,ΟΟ,.Οΐη® • · UI (J · · H · · H · H··

*. * -H M O f" N H H Λ N Λ O H

• · · rH . ___ . _______ ___ — ___ - - ----------

: .· IH

·*·*· m W

. . . Φ a. f" m • : +i < O ~ ft <* ··· O * O I * * SN.

...: S vmn wWä^·

. -2 o in H VO VO N C7V

::: ™ * vo < h h ® 2 ··· W ^ Q « « k 2 <f ··· £ pv «. £·« ^ «k • ' · .. .S movntOf" in m < 2 u • t, c ft K £ H H ftftH^r®

rn c I I " VO rt VO Oi CV

g :rt H H 2 ft >, < ft w ft O < ... 75 :cö 1 w W oi « - 1 σ' rr n - - ^ ::: 4-1 ·“> _ « < « « s w w 2 w > • O 3 „ - O < » · « oio ntv .···. 4-> -p o 1 > « οι < Q < vo ie ci oi • · φ -P p ICDU ® n N Q W Q < *:* > j <u ti <° H - » KW W ' ‘ ‘ -

C li £ Q) * N Eh k * k 2 X Q »J

::: φ § h y, £· © n < o < < sk >< oun n« ... φ j φ Ä n m ov v^ei^HOHiniociOi ... +j qgw«s sa:aswswaQs;o< : : jp J, I______________ • * +J - _ .··*. · M S ~ ~ ® ~ *...* m y c ® m h ω

• _ j -H H H H H

..... 0 4-> rH _i I _j

·· * φ rH CO 7 V O I

3 m (U e I I O I

•5 £ (UH H ® rt rt JJ

" t ρω v— — *— w ϊ h <n n ^ m ®t" ® H -H CC ft ft ft ft ft

25 SS ϋϋΟϋ U-P^Jp+J+J P4J 4J

£ ^ rt i 5555 522233 33 3

OSE Λ JZ Λ B ÄSSSXJE X X X

t=- —1- - --- 1"--^· I I I I . 1 1 - ί 52 π3 •o rt) p tn

•H

tn

•H

fr.

rj O

(0 z •H sz e h φ ΰ is

o C

•H to n Λ ^ o v r- > r- _

5 O VO · LT) · · r-( · ΊΓ · r- OV

· · o i . rt m . in h in · jj ΗΗΠ I η<νπ<νοο<-ι®ηο tn Λ3------------- •ä > β m :nj rt •H c & §

5(0 *H

H ^ * $

>1 L

3 C g

Q) U

•H C ,-1 5 «s £

C O

C ' C

3 rt c*rfN O O O O O V (N

3 O li H N N fN «-I O n · · · <N H

g HQj...|....fMVO<N··

£ woo^r i oninoHHHOO

G to ------------- Q) ς! P u tn o •H Cm

·· · H W

: * : h o 0) o :*.·. oi ° : .· p s . . c - to • · · Q) _ X ?.

!° < s fc *:* P JaCO o ···· LI s

• _ H O SZ

• · · C . v- \

• · · m jrt X *H

• · · Γί P Cd -P

... U U) r-J Γ-· • -2 Π 5 m m oo r*^rjnr*r*cDir\ tn 8 ^”θΓ>ηοο^Ηο\ΝθοωΝ

o ^ SsHf-tOHHOOOOOOOH

··· JJ 3 cg : : : o) d g------------- • > tn a ·***· e -h

« > S

. O) H rt rt ·η . +) -H -PS D — : : : λ p -h ή g •i. c x e o) > ... ^ e -h c 5 • u tn c +3 *...* . _ j* a . ία <° rt d -h ^ P Σε 2 • · tn O Ή 1 g ^ ^ o, Λ • x tn N g ω oo h oo

•J**J Λί·Η B ,H r-t H ιΗ iH

3D1 I i—I r"t rH | fH

rH O 1 -H I | o I +j

3 >h y gc-tvoHH:* I

rt) O 8 μ ^ ^ ^ w r-trMln^-invor-oo

Cj >rP II rl L k [u L· L·

I «JSJCJSEÄSS.SKSSSK

SoOUUU-P+J!4J+»4J*J4J4J

53

Edelliseen taulukkoon liittyen: aTrkaA:n autofosforylaatio toteutettiin käyttämällä konsentraatioita 1 x ΙΟ'10, 1 x 10'9 ja 1 x 10'8 M, kuten on kuvattu kokeellisissa menetelmissä ja kuvien 2 ja 5 selostuksissa. Arvot edustavat immunoblotatun autofosforyloitu-neen pl40trkA:n vyöhykkeen densitometrisen alan suhdetta NIH3T3-trkA-solujen stimulaation jälkeen hNGFrn rakenteellisten muunnelmien vaikutuksesta verrattuna (l-118)hNGF:n (typistetyn hNGFrn) tai villin tyypin hNGFrn (mutanttien) vaikutukseen.

bPC12-solujen erilaistuminen määritettiin neuriitin kasvun avulla, kuten on kuvattu kokeellisissa menetelmissä ja kuvan 6 selostuksessa. EC50-arvot ja suhteet on otettu kuvassa 6 esitetyistä tiedoista ja edustavat kunkin mutantin osalta kahden erillisen kokeen keskiarvoa.

Täydellisen hNGFrn aktiivisuuden kannalta välttämättömien N-terminaalisten aminohappojäännösten karakterisoinnin aloittamiseksi hNGFrn typistetty (6-118)-muoto eristettiin rekombinaation tuloksena hNGFrn ilmentävien CHO-solujen käytetystä elatusaineesta. Yhdeksän aminohapon typistetty muoto (10-118)hNGF muodostettiin rajoitetun proteolyysin ... avulla, kuten on kuvattu lähteessä (48). (6-118)hNGF ja (10- • · · *. * 118)hNGF puhdistettiin suuren erotuskyvyn ioninvaihtokroma- • · · ·* tografian avulla (HPIEC) ja karakterisoitiin käänteisfaasi- • · · *·*·* HPLCrn, N-terminaalisen sekvenssianalyysin, SDS-PAGErn ja aminohappoanalyysin avulla (tietoja ei ole esitetty) .

Puhdistetun (6-118)hNGF:n suhteellista kykyä syrjäytti t tää [125I]hNGF solulinjoista, jotka ilmensivät trkArn, p75:n ja trkA + p75:n, verrattiin (10-118)hNGF:n, (1-118)hNGFrn ;*·*; tai (l-120)hNGF:n ja (l-118)mNGF:n vastaavaan kykyyn (kuva .***. 9). Kuten (l-118)hNGF:n ja (1-120)hNGFrn yhtäläisyys bioak- • · · ·. tiivisuudessa antoi viitteitä (74), ensimmäiset kokeet eivät • · · *···’ osoittaneet eroa (1-118) :n sitoutumisominaisuuksissa verrat- • · · ' * *···* tuna (l-120)hNGF:ään (ei esitetty) . hNGFrn ja trkArn (80 - 100 pM) , p75:n (2 - 300 pM) ja PC12-solujen (50 pM) suhteel- • · · ·:··· liset IC50-arvot ovat 2-3 tekijän sisällä suhteessa IC50- ja 54

Kd-arvoihin, jotka muut ovat raportoineet (49), (75), (76), (20, 21). Yhdenmukaisesti Vroegop'in et ai. kanssa havaitsimme hNGF:n hieman suuremman affiniteetin p75-reseptoriin kuin yleensä on raportoitu (IC50 = 0,3 nM vs 1 - 2 nM) .

Ensimmäisten viiden aminohapon deleetio johtaa 9-ker-taiseen sitoutumisen vähenemiseen rekombinaation tuloksena rotan trkArn ilmentäviin NIH3T3-soluihin, kun taas vähän eroa ilmenee p75:n ilmentävien ihmisen A875-melanoomasolujen (ei muutosta) tai trkA:n + p75:n ilmentävien PC12-solujen (3-kertainen) sitoutumisessa. Sitä vastoin 265- ja 82-ker-tainen sitoutumisen häviö vastaavasti trkA- ja PC12-soluihin havaittiin (10-118)hNGF:llä verrattuna (l-118)hNGF:ään, kun taas p75:een ilmeni 10-kertainen sitoutumisen häviö. (10- 118)hNGF:n syrjäyttämisen keskinkertainen teho, joka havaittiin BC12-soluilla suhteessa trkA- ja p75-soluihin, viittaa näiden molempien reseptoreiden osuuteen syrjäyttämis-isoter-min profiilissa (kuva 9C) . Tässä tutkimuksessa käytettiin rekombinaation tuloksena ilmentäviä rotan trkA-soluja ja ra-diojodattua ihmisen NGF:ää, kun taas aikaisemmassa Kahle'n et ai. (1992) (10-118)hNGF-tutkimuksessa käytettiin humaanisia trkArn ilmentäviä soluja ja radiojodattua hiiren NGFrää. Näin ollen samanlaiset erot havaitaan (1-118)hNGF:n ja (10- • · 118)hNGF:n sitoutumisen välillä huolimatta siitä, käytetään- *. * ko ihmisen vaiko jyrsijän trkA:ta vaiko radioleimattua ♦ ♦ ♦ ***** NGFrää analyysin aikana. Lisäksi (1-118)hNGF:llä on 2 - 3 «·· ···· kertaa suurempi affiniteetti joko ihmisen tai rotan trkArhan *.:.* kuin (l-188)mNGF: llä, huolimatta siitä, edustaako ra- • · · * diojodattu hiiren vaiko ihmisen NGF syrjäytettävää merkki ainetta. (6-118)hNGF:n aiheuttama trkArn autofosforylaatio-:*:’: (kuva 10) ja PC12-solujen erilaistumisaktiivisuus olivat :1: samanlaiset kuin (1-118)hNGF:n aiheuttamat. Kuitenkin (10- ··· *. 118)hNGF on vähintään 10-kertaisesti tehottomampi kuin (1- • ♦ · ' 118)hNGF trkArn autofosforylaatiossa ja 80-kertaisesti te- • ♦ ’···* hottomampi PC12-solujen neuriittien kasvun stimuloinnissa :*[*: (kuva 10, taulukko 6), mikä on yhdenmukaista aikaisempien ·;··· tulosten kanssa (48) , (49) . Yhteenvetona nämä tulokset viit- 55 taavat siihen, että N-päätteen ensimmäiset viisi aminohappoa ovat tärkeitä täydellisen hNGF-trkA-sitoutumisaktiivisuuden kannalta, mutta tehokas reseptorin aktivointi ja bioaktiivi-suus ovat enimmäkseen säilyneet. Vielä seuraavien neljän jäännöksen menettäminen näyttää olevan haitallisempaa trkA-sitoutumiselle ja aktivoitumiselle ja sillä on jokin vaikutus sitoutumiseen p75-reseptoriin.

hNGF:n mutanttimuodot voidaan havaita käyttämällä metabolista leimausta, sen jälkeen immunosaostusta tai lei-maamattoman käytetyn elatusaineen immunoblot-analyysiä, ja ne on esitetty 14 kD:n täysin prosessoituina polypeptideinä (kuva 11) . Kunkin mutantin konsentraatio määritettiin ELISA: n avulla käyttäen polyklonaalista anti-hNGF-vasta-ainet-ta. Samanlaiset ilmentymisen määrät yhdessä polyklonaalisen vasta-aineen tunnistaman, yhden prosessoidun lajin vallitsevan läsnäolon kanssa kolmessa erilaisessa immunoreaktii-visuustyypissä viittaavat siihen, että mutanteilla on yhteistä samanlainen rakenteellinen stabiilisuus kuin villin tyypin hNGF:llä.

Kaikkien kolmen varatun aminohapon korvaaminen alaniinilla (Mut 4: H4A + H8A + R9A) johti [125H]hNGF:n ha- .. . väittävän kilpailevan syrjäyttämisen häviöön trkArsta 4 °C:n • · *. * lämpötilassa verrattuna merkkiaineen täydellisesti syrjäyt- • · · • ·* tävän villin tyypin hNGF:n konsentraatioalueeseen (IC50 = 1 *.*.* x lO'10 M, maksimaalinen syrjäyttäminen = 1 x 10‘9, kuva 12, ..!!* ylhäällä, taulukko 5) . Reseptorisitoutumisen häviö korreloi myös maksimaalisen trkA-autofosforylaation kyvyn vähintään • · · : : : 10-kertaisen häviön ja 4 - 5-kertaisen näennäisen tehokkuu- den vähenemisen kanssa. Mutantilla 4 on 85-kertaa pienempi ;*·*; PC12-solujen erilaistumisen EC50-arvo verrattuna (1- .*·*. 118)hNGF:ään (kuva 14), mikä on yhdenmukaista PC12-resepto- • · · ·. risitoutumisprofiilin kanssa, joka näyttää heijastavan syr- • · ♦ *·:·* jäyttämstä suuresti p75:stä, ja ei-syrjäytettävään kom- • · ponenttiin, joka voi heijastaa mutantin alempaa sitoutu- :***: misaffiniteettia trkA:han (kuva 12, alhaalla).

♦ · · ....j His4- ja Arg9-muunnelmat analysoitiin sitten kumpikin 56 erikseen. Sekä hNT3:n että hBDNF:n N-terminaalinen alue sisältää histidiinin, mikä viittaa säilyneen funktionaalisen tehtävän mahdollisuuteen. hNGF:n His4:n korvaaminen joko alaniinilla (mutantti 1) tai asparagiinihapolla (mutantti 2) johtaa trkA-sitoutumisen, trkA:n autofosforylaation ja PC12-solujen erilaistumisen dramaattiseen häviöön (kuvat 12, 13, 14). Kuten vaihtelu sekvenssissä hNGF:n ja muiden NGF-lajien välillä asemassa 9 antaa viitteitä, mutaatiolla R9A ei ollut suuria vaikutuksia trkArn tai p75:n aktiivisuuksiin. Kuitenkin havaittiin hiukan pienempi teho trkA:n fosforylaation ja PC12-solujen erilaistumisen osalta (kuva 12, ylhäällä, keskellä, kuvat 13 ja 14) . P5A-muunnelma osoitti 25 °C:n lämpötilassa trkA-sitoutumisen 3-kertaista ja H8A-muunnelma 1,5-kertaista trkA-sitoutumisen häviötä suhteessa hNGF:ään, kun taas H4D kadotti suunnilleen 40-kertaisesti sitoutumiskyvyn; sitoutumisessa p75-reseptoriin ei havaittu muutosta. Kaikki edellä esitetyt mutantit osoittivat vähemmän kuin 2-kertais-ta sitoutumisen häviötä p75-reseptoriin riippumatta siitä, oliko lämpötila 4 °C vai 25 °C, mikä viittaa siihen, että mutageneesista johtuvat yleiset rakenteelliset vaikutukset ovat minimaalisia.

Tarkoituksena tutkia, edellyttikö neurotrofiinin vuo- • · rovaikutus trkArn kanssa hNGFrn spesifistä N-terminaalista i « · sekvenssiä, muodostettiin kimeeriset mutantit (mutantit 5 ja • · · ***** 6) korvaamalla hNGFrn N-pääte (SSSHPIF) hBDNFrn N-päätteellä (HSDPA) tai hNT3rn N-päätteellä (YAEHKS) . Nämä mutantit säi- ·.:.* lyttäisivät siten hNGFrn kaksiemäksiset His8- ja Arg9-jään- • · · · nökset. Jopa 10-kertaa suuremmilla konsentraatioilla kuin millä (1-118)hNGF johtaa täydelliseen reseptorin syrjäyttä- :*:’: miseen 4 °Crn lämpötilassa, tuloksena olevat kimeeriset neu- :***: rotrofiinit olivat kyvyttömiä syrjäyttämään [125I]hNGF:n • · · *. trkArsta (kuva 12A) ja olivat tehottomampia kuin mutantit 1 • · · *;;; ja 2 herättämään trkArn autofosforylaatioaktiivisuutta (kuva • · *·;·* 13) . Näiden mutanttien sitoutumisvuorovaikutukset p75-resep- : : torin kanssa olivat mahdottomia erottaa (1-118)hNGF:n vas- *:**: taavista vuorovaikutuksista, kun taas PC12:n resepto- 57 risyrjäyttäminen voi olla enimmäkseen p75-vuorovaikutusta (kuva 12, alhaalla). Samoin kuin kolminkertainen alaniinimu-tantti 4, N-terminaaliset kimeeriset mutantit olivat heikoimmat PC12-solujen erilaistumisen indusoijät verrattuna kaikkiin hNGF:n rakenteellisiin mutantteihin; IC50-arvo muuttui 100-kertaisesti. Tulokset osoittavat, että trkA:ta koskeva suurella affiniteetilla tapahtuva sitoutuminen ja agonistiaktiivisuus edellyttävät hNGF:n spesifistä N-ter-minaalista sekvenssiä, mutta sitoutuminen p75:teen ei edellytä sitä.

Tarkoituksena osoittaa, että N-terminaaliset sekvens-simuunnelmat kykenevät rajoittamaan hNGFrää koskien suurella affiniteetilla tapahtuvia trkA-vuorovaikutuksia samalla säilyttäen yleisen rakenteen, H4D-mutantti 2:ta ja hNT3/hNGF-mutantti 6:tta ilmennettiin suuria määriä ja ne puhdistettiin. Suurimmalla mahdollisella konsentraatiolla, joka oli 2 000 kertaa suurempi (2 x 10'7 M) kuin (l-118)hNGF:n IC50-arvo (IC50 = 1 x 10"10 M) , mutantti 2 syrjäytti vain 30 % ja mu-tantti 6 10 % [ 125I ]NGF: stä trkA-reseptorista 4 0C:n lämpötilassa, samalla kun p75:n sitoutumisprofiilit olivat samanlaisia (kuva 15) . Yhdenmukaisesti kuvassa 13 esitettyjen .. . tulosten kanssa puhdistetut mutantit olivat merkitsevästi • ♦ I tehottomampia kuin (1-118)hNGF kyvyssään aktivoida trkA:n • · · ·.** autofosforylaatiota. Nämä tulokset viittaavat siihen, että • · · *·*·’ yleinen rakenteellinen stabiilisuus säilytetään näiden kum- • · · •••J man tahansa aminohappokorvauksen jälkeen, ja vahvistavat, että suurella affiniteetilla tapahtuvan trkA-sitoutumisen ja ··· V: autofosforylaation häviäminen johtuvat näistä spesifisistä muutoksista.

Valmistettiin myös kimeeriset mutantit hNGF:n kahden :***: muun muuttuvan alueen osuuden vertailemiseksi ensin trkA- • · · *. reseptorispesifisyyden mahdollisina determinantteina. Kuusi • · · jäännöstä beta-käännöksen muuttuvalla alueella 3 (Arg59- • · *···* Ser66) ja seitsemän jäännöstä beta-käännöksen muuttuvalla alueella 5 (Met92-Ala98) vaihdettiin vastaavien hNT3-jään- ·;··· nösten kanssa vastaavasti mutanteissa 7 ja 8. Mutantti 7 oli 58 hiukan tehokkaampi [125I]NGF:n syrjäyttämisessä trkA:sta kuin hNGF, kun taas mutantti 8 sitoutui heikommin p75-reseptoriin (3 - 5-kertaisesti). Muuten nämä mutantit osoittivat vähäistä eroa hNGFrstä trkA- ja p75-sitoutumisprofiileissaan, kyvyssään ylläpitää tkrA:n autofosforylaatiota tai PC12-solu-jen neuriitin kasvua (kuvat 12, 13, 14). Nämä tulokset viit-taavat siihen, että alueet 3 ja 5 myötävaikuttavat vähemmän trkA-sitoutumisvuorovaikutukseen kuin N-pääte. Mutantin 8 pienempi affiniteetti p75-reseptoriin voi edustaa rakenteellisia muutoksia säilyneen jäännöksen Lys95 ympärillä, jonka on osoitettu toimivan vuorovaikutuksessa p75:n kanssa (54).

Tarkoituksena määrittää hNGF:n rakenteellisten muunnelmien täysin prosessoidun muodon (MT = 14 000) ilmentymisen suhteelliset määrät, tutkittiin hNGF:n monoklonaalisten ja polyklonaalisten vasta-aineiden kyky tunnistaa mutantit im-munoblottaamalla (kuvat 11 ja 12) . Kun immunoblotattiin yhtä suuret määrät N-terminaalisia mutantteja, jotka oli ilmennetty käytetyssä elatusaineessa, useimmat olivat menettäneet ominaisuuden, jolla monoklonaalinen vasta-aine tunnistaa ne, kun taas affiniteettipuhdistettu polyklonaalinen vasta-aine tunnisti ne kaikki. H4D-mutantti ja kimeeriset, N-terminaa-liset hBDNF- tai hNT3-mutantit eivät osoittaneet immunoblot- • · • · signaalia, kun taas H4A+H8A+H9A-mutantti oli vähemmän vähin- • · gollinen (kuva 16A). H4A- tai R9A-mutaatiot eivät vaikutta- • · · * neet vasta-aineen sitoutumiseen. Sitten monoklonaalisesta ·« · **” vasta-aineesta tutkittiin kyky kilpailla [125I]NGF:n sitoutu- • · · *·|·* misen kanssa tkrA- tai p7 5-reseptoreihin. Lisääntyvät kon- *·’ * sentraatiot vasta-ainetta estivät [ I ]NGF: n sitoutumista kumpaankin reseptoriin; IC50 = 1 x 10'9 M vs 4 x 10‘8 M osoit- • · · V : taa, että se on 40-kertaa tehokkaampi estämään hNGF:n sitou- • · · tumista trkA-reseptoriin kuin p75-reseptoriin. Nämä tulokset . .·. viittaavat siihen, että N-pääte muodostaa ainakin osan • · · hNGF:n monoklonaalisen vasta-aineen epitoopista ja vasta- • · *!* aineen sitoutuminen hNGF:ään estää sen vuorovaikutuksen ··· ·...· trkA-reseptorin kanssa suhteellisen suurella affiniteetilla.

’!**: p75-reseptoriin tapahtuvan sitoutumisen heikompi estäminen 59 viittaa siihen, että pienemmällä affiniteetilla sitoutuva epitooppi N-päätteen ulkopuolella voi myötävaikuttaa hNGF-p75-sitoutumiskontakteihin tai että vasta-aineen steerinen estäminen voi osittain häiritä sitoutumista p75-reseptoriin. Alustavat tutkimukset viittaavat siihen, että tämän vasta-aineen heikommin sitoutuvaa epitooppia ei todellakaan ole beta-käännös-3-alueella, jota edustaa hNT3/hNGF:n kimeerinen mutantti 7. Tämän alueen osuutta hNGF:n sitoutumisessa p75-ja trkA-reseptoreihin tutkitaan parhaillaan. Vaikka voitaisiin väittää, että trkA-sitoutumisen häviö vasta-aineen läsnäollessa johtuu sitoutumisesta sekundaariseen epitooppiin tai steerisestä estämisestä, tiedot ovat yhdenmukaisia tässä esitettyjen useiden N-terminaalisten muunnelmien osalta havaitun trkA-sitoutumisen valikoivan häviön kanssa verrattuna p75-sitoutumiseen.

Esimerkki 4 hNGF-aminohappomuunnelmien tuottaminen ja karakterisointi: hNGF- ja hNT3-pan-neurotrofiinit Kohdejäännösten identifiointi mutaatioanalyysiä varten NGF:llä ja sen neurotrofiiniryhmän jäsenillä, NT3:lla, BDNFrllä ja NT4/5:llä, sekvenssin identtisyys on • · j. ^ noin 56 %. Reseptorisitoutumisspesifisyys voidaan määrittää • · I osittain aminohapposekvenssin erojen mukaan neurotro- • · · **V fiiniryhmän jäsenten kesken. Nämä jäännökset voivat sitoutua • · · •••j suoraan trkA-reseptoriin tai toimia muiden muuttuvien tai • · · *·!·' säilyneiden jäännösten trk-vuorovaikutusten estäjinä. hNGF:n • · · ·.* · domaininvaihtomutantit muodostettiin hNGF:n ja hNT3:n kesken erilaisten jäännösten osuuden tutkimiseksi trk-reseptoris- :: : pesifisyyden määrittämisessä. Neurotrofiinien primaaristen :***: sekvenssien vertailu paljastaa, että on olemassa 7 aluetta, • · · jotka ovat 7-10 aminohapon muodostamia ja jotka kukin si- • · · *11 sältävät suurimmaksi osaksi (80 %) sekvenssieroja (kuvat 8, • · T 18A ja 18B). hNGF:n ja hNT3:n välillä 120 aminohaposta 52 • · · ϊ.,.ϊ ovat erilaisia. Näistä 52 eroavaisuudesta 41 (79 %) esiintyy •f: 7 eri alueella. Yhdeksän NGF-lajin joukosta, mukaan luettuna 60 ihminen, linnut, käärmeet ja sammakot, 24 52 jäännöksestä ovat säilyneet viitaten siihen, että niillä on osuutta tkrA-sitoutumisspesifisyyteen. Hiiren NGF:n röntgensädekideraken-teen tutkiminen paljastaa, että neljälle muuttuvista alueis-ta/domaineista ovat tunnusomaisia beta-käännökset, yksi muuttuva alue on beta-levy ja viimeiset kaksi ovat amino- ja karboksipäätteet. Jokainen eri alue sisältää useita varattuja ja polaarisia sivuketjuja, jotka ovat alttiina liuottimelle ja kykeneviä toimimaan vuorovaikutuksessa reseptorei-den kanssa. Muodostettiin 13 kimeeristä mutanttia tai do-maininvaihtomutanttia korvaamalla hNGF:n seitsemän yksittäisen muuttuvan alueen useita jäännöksiä tai kaikki jäännökset vastaavalla hNT3:n domainilla. Kaksi muuta aluetta, joilla eroavaisuus oli pienempi, korvattiin myös: esimuuttuvat alueet 1 ja 4. Siten yhteensä 90 % erilaisista aminohappojäännöksistä arvioitiin koskien niiden osuutta trkA- ja trkC-spesifisyyden määräämisessä. Kimeeriset mutantit muodostettiin oligonukleotidisuunnatun mutageneesin avulla ja ilmentämällä mutantit nisäkässolussa, kuten esimerkissä 3 on kuvattu .

hNGF:n yksittäisten jäännösten valinta mutageneesiä ·*.*. varten ratkaistiin ensisijaisesti niiden aseman mukaan hii- • · ren NGF:n röntgensädekiderakenteessa. Otaksuttiin, että sek- • · venssien eroista seuraa minimaalinen rakenteen muutos ihmi- • · · * j# sen ja hiiren NGF:n välillä, koska korvatut jäännökset ovat **** enimmäkeen säilyneet toiminnallisesti (10/12) . Hiiren NGF:n • · · ’*j·* tietokoneella tuotettu malli, joka perustuu röntgensädeki- • · · *·* * derakenteen koordinaatteihin ja on selostettu esimerkissä 1, paljastaa aminohapot, joista työntyy sivuketjuja liuottimeen • · · ·.· · ja jotka voisivat olla vuorovaikutuksessa trkA- ja gp75-re- • * · septoreiden kanssa. Jotkut näistä sisältävät muuttuvia jään- . .·. nöksiä, joita muunnettiin merkitsevästi domaininvaihtomutaa- ♦ · · .···. tioilla, mutta kuitenkin monet edustavat jäännöksiä, jotka • · ‘Γ ovat säilyneet hNGFrn ja hNT3:n keskuudessa muuttuvilla ja ··· ·...· vakioisilla alueilla. Jäännöksiä, joilla ennustettiin olevan minimaalinen sivuketjujen alttiinaolo, kuten jäännöksillä, 61 jotka olivat osallisina dimeerisen rajapinnan muodostamisessa (F12, V14, W21, F49, Y52, F54, W76, T85, F86, W99, F101, T106, A107, V109, Vili), hydrofobisen sisäpuolen muodostamisessa (V36, V38, F53, 171, A89, 1102 ja 1104) ja rakenteellisesti riippuvaisen ja piilossa olevan vetysitoutumisen muodostamisessa (Q51, S78, T91, R100), muunnettiin minimaalisesti. Disulfidisidoksen muodostavista kysteiinijäännöksistä ja glysiineistä ja alaniineista vain A97 muunnettiin. Poikkeuksia tehtiin seuraavissa tapauksissa: jäännökset, 130 ja Y52, joilla on pintasivuketjut, vaikka ne ilmenivät di-meerin rajapinnalla, jäännökset L39, L90, M92 ja M97, jotka muodostavat myös hydrofobisen pinnan kohdan, ja D16, K25, D30, E55, K57, R59, R69, D72, H75, jotka osoittavat jonkin verran sivuketjun alttiinaoloa liuottimelle, vaikka ne ovat sidottu vedyllä. Useimmat jäännökset vaihdettiin alaniiksi (64); joissa tapauksissa tehtiin muita korvauksia rakenteen ylläpitämiseksi tutkittaessa spesifisen funktionaalisuuden osuutta reseptorivuorovaikutuksissa.

hNGF-muunnelmien tuotanto ja reseptorisitoutumista koskeva karakterisointi hNGF-muunnelmien mutageneesi, ilmentäminen ja prote- :*·*: iinien karakterisointi toteutettiin, kuten esimerkissä 3 on · j·.·. kuvattu. Oligonukleotidisuunnatun mutageneesin jälkeen kaik- • · ki mutantit vahvistettiin oikeiksi dideoksinukleotidisekven- • · · • soinnin avulla. hNGF-mutantit ilmennettiin ihmisen 293-so- • · · ‘*‘1 luissa (kuvat 11A, B) ja Amicon-väkevöinnin (lOx) ja ELISA- • · ·

Hl määrityksen jälkeen, useimpien hNGF-muunnelmien havaittiin • · · *·’ * ilmentyneen samassa määrin kuin normaalien hNGF-kontrollien (5 - 25 ug/ml), poikkeuksena mutantit, joilla oli korvattu • · · V : muuttuvat alueet 2 tai 3 (0,6-1 ug/ml). Kumpikin näistä • · · ’...· kimeerisistä molekyyleistä johti proliinijäännösten inserti- . oon tai deleetioihin, sekä muihin merkittäviin sivuketjun • · · .···. funktionaalisuuden muutoksiin ja siten pienet talteenotto- • · *·* määrät voivat heijastaa rakenteellista epästabiilisuutta.

··· *...* Siitä huolimatta käytettävissä olleet määrät tekivät mahdol- liseksi hNGF-muunnelmien trkA- ja gp75-reseptoreihin kohdis- 62 tuvien sitoutumisaffiniteettien määrittämisen. Kunkin hNGF-muunnelman sitoutumisaffiniteetti määritettiin kilpailevan sitoutumisen avulla käyttäen trk- ja gp75-reseptoreiden im-munoadheesiorakennelmia (88) ja radiojodattuja neurotro-fiineja, kuten on kuvattu esimerkissä 2. Kukin hNGF-muunnel-ma ilmennettiin 293-soluissa vähintään kahdesti ja sitoutu-miskokeet toteutettiin 2-3 kertaa kunkin transfektion osalta. Suhteellinen affiniteetti verrattuna normaaliin hNGF:ään on ilmaistu muunnelman kaikkien määritysten keskimääräisen IC50-arvon suhteena hNGF: n IC50-arvoon.

TrkA:n autofosforylaatioaktiivisuuden ja PC12-solujen erilaistumisen biologinen määritys hNGF-muunnelmien aiheuttama trkA-kinaasin biokemiallinen aktivoituminen määritettiin määrittämällä trkA:n auto-fosforylaatio, kuten esimerkissä 3 on kuvattu. Oli kehitetty kvantitatiivinen määritys (89), joka sallii trkA:n autofos-forylaation EC50-arvojen annoksesta riippuvaiset määritykset. TrkA-reseptorimuunnelma, joka sisälsi Herpes simplex-viruk-sen pintaproteiinista peräisin olevan peptidiepitooppimer-kin, ilmennettiin stabiilisti CHO-soluissa 96-kuoppaisilla levyillä (88) . Epitooppimerkityn trkA:n affiniteetti hNGF:ään oli samanlainen kuin normaalilla reseptorilla (88).

• · '••1' Soluja (kutakin konsentraatiota kaksi rinnakkaista kuoppaa) • · *. I stimuloidaan käyttämällä hNGF-muunnelman 8 lisääntyvää kon- • · · * * sentraatiota (10 pM - 10 nM) 10 minuutin ajan 37 °C:n lämpö- • * · •••| tilassa. Solut hajotetaan Triton X-100-lyysipuskurilla, ku- • · · *·ί·* ten esimerkissä 3 on kuvattu, ja ne siirretään levylle, joka • · · ·.· * on päällystetty epitooppimerkkiin kohdistuvalla monoklonaa- lisella vasta-aineella. Sitoutumisen jälkeen vangittu trkA ::: saatetaan sitten reagoimaan monoklonaalisen HRP-konjugoidun antifosfotyrosiinivasta-aineen kanssa ja värireaktion anne- ··· # *.# taan kehittyä. Sitten absorbanssi luetaan ja piirretään käy- • · · III rä konsentraation suhteen. hNGF:n EC50-arvo on 100 - 120 pM.

*1* PC12-solujen erilaistuminen toteutettiin, kuten esimerkissä «·· Σ.,.ϊ 3 on kuvattu, mutta kuitenkin soluja kasvatettiin ensin tai *:**: herkistettiin NGF:ssä 7-10 päivän ajan. Sitten kerättiin 63 talteen neuriitteja kantavat solut ja saatettiin viljelyyn 24-kuoppaisille maljoille normaaliin elatusaineeseen joko hNGF-muunnelman läsnäollessa tai ilman sitä. Neuriitteja kantavien solujen prosenttiosuus 72 tunnin kuluttua määritettiin, kuten esimerkissä 2 on kuvattu. Pan-neurotroofisten hNGF/hNT3-muunntelmien hNT3:n kaltainen trkC-bioaktiivisuus määritettiin trkC-transfektoiduissa PC12-soluissa, jotka eivät reagoineet hNGF:ään (saatu ystävällisesti tohtoreilta Pantelis Tsolfous ja Luis Parada, NCI).

Tulokset

Muuttuvien jäännösten mutageeninen analyysi hNGF/hNT3-kimeerien avulla

Muodostettiin 13 kimeeristä mutanttia korvaamalla hNGF:n kunkin 7 muuttuvan alueen useita jäännöksiä tai kaikki jäännökset hNT3:n vastaavalla alueella (katso kuvat 8, 18A, B) . Korvattiin myös kaksi vähemmän muuttuvaa aluetta, yksi beta-levyn A sisällä ja toinen säilyneessä beta-kään-nöksessä, joka yhdistää beta-levyt B ja C. Kilpailevan sitoutumisen kokeet toteutettiin käyttäen hNGF-muunnelmia, jotka syrjäyttävät [125I]hNGF:n trkA:n tai gp75:n immunoad-heesiofuusioproteiineista. Nämä reseptorit sisältävät trkA:n tai gp75:n ekstrasellulaarisen domainin ja ihmisen IgG:n Fc- • · osan. Nämä immunoadheesiot sitovat hNGF:n affiniteeteilla, • ♦ ]·#·# jotka ovat samanlaisia kuin holo-trkA- ja p75-reseptoreilla • · · * ! ja osoittavat samanlaista affiniteettien paremmuusjärjestys- ’*** tä neurotrofiinien suhteen (kuvat 19 A, B) . Kunkin hNGF- • · · **j·* muunnelman keskimääräinen IC50-arvo laskettiin ja ilmaistiin • · · *·* ’ suhteena IC50-arvosta, joka oli määritetty normaalille hNGF:lie (IC50 hNGF = 100 pM; kuva 23A) . Merkitsevin vaikutus • · · ·.· : trkA-sitoutumiseen, kuten edellä on kuvattu (kuvat 12, 15), • · · ϊ.,.ί on lähes 300-kertainen sitoutumisaffiniteetin häviö johtuen . .·. N-terminaalisen domainin vaihdosta hNT3:n kanssa. Sitoutumi- • · · .··*. sen 2-3 -kertainen häviö havaitaan, kun kolme jäännöstä on • » ’·* vaihdettu esimuuttuvalla alueella 1 (beta-levy A: • · · V18E+V20L+G23T) . Pienempi kuin 2-kertainen trkA-sitoutumisen häviö havaitaan muiden hNGF-muunnelmien tapauksessa, kun 64- taas lisääntynyt sitoutuminen havaitaan muuttuvan alueen 3 kimeerisen mutantin (beta-käännös 3) ja C-päätteen tapauksessa (kuva 20A). Yhdenmukaisesti trkA-sitoutumisaffiniteet-tien häviön kanssa trkArn autofosforylaation ja PC12-solujen erilaistumisen (neuriittien kasvu) annos-vastekäyrät osoittavat aktiivisuuden häviöitä N-terminaalisen ja esimuuttuvan alueen 1 muunnelmien ansiosta (kuva 21A, B) . Sitoutuminen gp75-reseptoriin vähenee 5 - 7-kertaisesti vaihdettaessa vastaavasti hNT3:n muuttuva alue 1 ja esimuuttuva alue 4 (kuva 20B). gp75-sitoutumisen 2-3 -kertainen häviö havaitaan myös muuttuvan alueen 5 mutantin tapauksessa. Vl-vaih-don osoittama gp75-sitoutumisen häviö johtuu todennäköisesti K32:n vaihtamisesta R:ään, K34:n vaihtamisesta H:hon ja E35:n vaihtamisesta Q:hun, koska näiden jäännösten alaniinikorvaukset johtavat gp75-sitoutumisen häviöön [kuva 8; (54)].

Nämä tulokset osoittavat, että hNGF:n sitoutumisvuo-rovaikutukset trkA:han ja gp75:een koskevat joitakin muuttuvia neurotrofiinin jäännöksiä.

TrkA-sitoutumisen ja reseptorin aktivoitumisen häviö viittaa siihen, että muuttuvat jäännökset N-päätteessä ja esi-muuttuvalla alueella 1 edistävät osaltaan reseptoris- ··,·, pesifisyyttä. Tämä mahdollisuus tutkittiin määrittämällä • · *. ! reseptorisitoutuminen trkC-IgG-immunoadheesioon ja neuriitin • · · ’ l kasvu trkC-transfektoiduissa PC12-soluissa, jotka eivät rea- ·»· •••j goi NGF:ään. Yllättäen hNT3:n N-pääte (mutantti 6, kuva 22A, • · · *·:·* B) ei tuottanut trkC-vuorovaikutuksia, mutta kuitenkin nel- • · · • · · *.* * jän aminohapon vaihto hNGFrn muuttuvalla alueella 4 (T81K, H84Q, F86Y, K88R) johti merkittävään trkC-vuorovaikutukseen • · · ϊ.ϊ · (kuva 22A, B) . Tämän muunnelman pienempi trkC-affiniteetti ja neuriitin kasvun teho osoittaa, että muut alueet myötä- [·. vaikuttavat todennäköisesti tehokkaisiin trkC-vuorovaikutuk- • · · siin. Nyt esimuuttuvan alueen 1 mutantin trkC-vuorovaikutuk- • · "* siä tutkitaan, kuten yksittäisten jäännösten osuuksia muut- • · · tuvalla alueella 4. Kuitenkin osittain päällekkäiset mutaa-tiot muuttuvalla alueella 4 viittaavat siihen, että V4:n 65 monet jäännökset voivat olla välttämättömiä trk-spesifisyyden kannalta. Esimerkiksi beta-käännnös-3/4-muunnelma, jossa on vaihdettu kolme muuttuvaa jäännöstä, jotka ovat osittain päällekkäin T81K:ssa (S73, Y79Q, T81K), aktivoi neuriitin kasvua trkC-PC12-soluissa vain 5 - 10-%risesti niin hyvin kuin muuttuvan alueen 4 mutantti (kuva 22B) . Siitä huolimatta trk-toimintaan vaikuttaa alaniinimutantti Y79A+T81A, joka saattaa lisäksi tämän alueen muuttuvat jäännökset trk-resep-torivuorovaikuksiin. Muuttuvan alueen 4 aiheuttama trkA-ak-tiivisuuksien säilyminen viittaa siihen, että 4 hNT3:n jäännöstä ovat yhteensopivia trkA-sitoutumisen kanssa, mutta kuitenkin vastaavat hNGF-jäännökset voivat asettaa esteen hNGF:N vuorovaikukselle trkCrn kanssa.

Vaikka neurotrofiinien N-terminaalinen domaini ei näyte olevan yleinen tkr-spesifisyyteen vaikuttava domaini, tämä hNGF:n alue näyttää olevan trkA-vuorovaikutuksen tärkein determinantti. NT3:n ensimmäisten kuuden jäännöksen korvaaminen hNGF:n ensimmäisillä seitsemällä jäännöksellä johtaa pantrofiiniseen muunnelmaan, joka sitoo ja aktivoi sekä trkArn että trkCrn suurella affiniteetilla ja teholla (kuvat 24, 25 ja 26). Lisäksi se säilyttää suurella af- finiteetilla tapahtuvan sitoutumisen gp75:n kanssa. Näin • · ollen voi olla mahdollista tuottaa tehokas pantrofiininen • · trkA/trkC-neurotrofiini lähtien hNT3:sta ja sisällyttäen • · · * ; mukaan hNGF:n muuttuvat alueet, kuten N-päätteen, V2:n, V3:n • · · ·*·* V4:n ja V5:n. Vastakohtana hNGF voidaan muuntaa sisältämään • · · ‘•j·* samanlaisia pantrofiinisia trkA/trkC-ominaisuuksia vaihta- • · · *·* * maila muuttuvat jäännökset hNT3-beta-levyssä 1 (Cl) ja V4:ssä. Vaikka hNGF/hNT3-kimeera, joka korvaa muuttuvan alu- ·♦· V : een 2, ei johtanut trkC-aktiivisuuden saamiseen, se johti • · · tkrA-sitoutumisen pieneen häviöön (1,5-kertaiseen) . Vasta- . )·. vuoroista domaininvaihtoa, joka korvaa hNT3:n muuttuvan alu- • · · IV.' een 2 vastaavalla hNGF-domainilla, tutkitaan nyt trkA-aktii- • · *!' visuuden tuottamisen osalta ja se on ehdolla oleva # ·· ·...· trkA/trkC-pantrof iini.

'·"· Yksittäisten muuttuvien ja säilyneiden hNGF-jäännös- 66 ten mutageeninen analyysi: Niiden hNGF-jäännösten rakennemalli, jotka ovat vuorovaikutuksessa trkA:n ja gp75:n kanssa Käyttäen hiiren NGF:n kiderakennetta, kuten edellä on kuvattu, arvioimme pistemutageneesin avulla 45 hNGF:n jäännöstä, joista monilla on liuottimelle alttiina olevia sivu-ketjufunktionaalisuuksia ja jotka kykenevät trkA- tai gp75-vuorovaikutuksiin. Kilpailevan sitoutumisen analyysi osoitti, että H4-, P5A-, S13-, D30-, 131-, Y52-, R59-, R69-, Y79-, T81- ja R103-muutatiot vaikuttavat trkA-sitoutumiseen 1,8 - 10 -kertaisesti, kun taas jäännösten E41, K57, D72 ja N77 mutaatiot lisäävät sitoutumista 1,5 - 2 -kertaisesti (kuva 27). Nämä tulokset osoittavat, että nömö jäännökset ovat osallisina trkA-vuorovaikutuksissa, ja viittaavat siihen, että muunnelmia voitaisiin tuottaa sekä muuttuvista jäännöksistä (H4, P5, 131, R59, Y79, T81) että säilyneistä jäännöksistä (S13, D30, Y52, R69, R103), jotka voisivat vaikuttaa trk-spesifisyyteen. Mutaatiot jäännöksissä F12, 131, K32+K34+E35, K50, Y52, R69, K74, H75, K88, L112, S113, R114 ja K115 johtavat 3 - >50 -kertaiseen gp75-sitoutumisen häviöön (kuva 30) . Erityisesti ei havaittu lainkaan syrjäyttä-mistä, kun läsnä oli 10 nM mutantteja, jotka edustivat muu- • · j. ^ toksia jäännöksissä F12, K32+K34+E35, Y52, R69, K88 ja • · *. I R114+K115, mikä viittaa siihen, että nämä jäännökset ovat • · · ***** gp75-sitoutumisen ratkaisevia determinantteja.

·· ·

Autofosforylaatioanalyysi käyttäen epitooppimerkittyä *.:.* trkA:ta osoitti, että aktivoitumisteho väheni 1,5 - 6-ker- • · · ·.· * taisesti seuraavissa jäännöksissä tapahtuneiden mutaatioiden vaikutuksesta: H4, P5, D30, Y52, R69, Y79+T81 ja R103 (kuva :T: 28) . TrkA:n autofosforylaation tehokkuuden merkittäviä vä- hennyksiä (20 - 60 %) havaittiin kaikkien näiden mutanttien • ·« *. tapauksessa lukuunottamatta jäännöstä F12. Tulokset ovat • · · yhdenmukaisia PC12-solujen erilaistumisen tehokkuuden kans- • · ***** sa; havaitaan 2-50 -kertainen väheneminen neuriitin kasvun ECS0-arvossa, kun kysymyksessä ovat mutaatiot jäännöksissä ·:··: H4, F12, D30, Y52, R69, Y79+T81 ja R103. Muita hNGF-muunnel- 67 mia arvioidaan parhaillaan, mukaan luettuna P5:n mutaatiot. Mielenkiintoista on, että jäännökset, joissa mutaatiot vaikuttavat minimaalisesti sekä trkA-sitoutumiseen että trkArn autofosforylaation kykyyn, voivat vähentää trkA:n autofosfo-rylaation tehokkuutta. TrkA:n autofosforylaation väheneminen voi selittää mutaatioiden R69 ja Y79+T81 herättämän PC12-solujen erilaistumisen vähentyneen tehon. Vaihtoehtoisesti mutaatiot R69:ssä vähentävät suuresti p75-sitoutumista, p75:n osuus hNGFrn signaalin välittämisessä on tällä hetkellä epäselvä, p75-vuorovaikutuksen häviö voisi myötävaikuttaa vähentyneeseen biologiseen vaikutukseen. Tätä mahdollisuutta tutkitaan muilla hNGF-muunnelmilla, joilla on vähentynyt hNGF:n sitoutuminen gp75-reseptoriin.

Jäännöksistä, jotka toimivat vuorovaikutuksessa trkA-ja gp75-reseptoreiden kanssa, rakennettiin mallit tietokoneen avulla perustuen hiiren NGF:n rakenteeseen. Tämän analyysin avulla havaittiin kaksi tärkeätä trkA:n kanssa vuorovaikutuksessa olevaa aluetta: 1) N-pääte (H4, P5) , jonka kiderakenne on tuntematon ja 2) beta-levyjen C ja D Y79:n, T81:n, H84:n ja R103:n muodostama pinta. Beta-levyjen A ja B jäännöksillä V18, V20, G23, Y52, R59 ja R69 on jotakin osuutta laajentuneeseen pintaan, joka voitaisiin kääriä be- • ·

;·.·. ta-levy-juosteiden ympäri. Lähellä Y52:n ja beta-levyn A

• · ]·,·. jäännösten alaa ovat toisen promoottorin D30 ja 131. Nämä • · · kaksi jäännöstä työntävät suhteellisen pienen pinta-alan **" liuottimeen, mutta kuitenkin on mahdollista, että ne edistä- • · · **|·* vät osaltaan keskeytymätöntä sitovaa pinta-alaa, joka on • ♦ « ’·* * muodostettu bete-levyn jäännösten kanssa.

Havaittiin kaksi tärkeätä p75:n kanssa vuorovaikutuk- ··· ·.· : sessa olevaa aluetta: a) yhden promoottorin muuttuva alue 1 ··· ja toisen promoottorin beta-levy B ja C, 2) säilyneet jään- . .·. nökset C-päättessä ja beta-käännöksessä 3, myös eri promoot- • · · .·**. toreista. Vastakohtana trkA:n kannalta kiinnostaville jään- • ♦ 'V nöksille beta-levyjen parien muodostamassa raossa p75:n • · · *...· kanssa vuorovaikutuksessa olevat jäännökset näyttävät olevan esillä. Kuten lähteessä (54) on esitetty, K32 ja K34 työnty- 68 vät ulos beta-hiuspinnikäännöksen 1 muuttuvasta alueesta. Havaitsimme, että vierekkäiset jäännökset K50 ja Y52 toisesta promoottorista myötävaikuttavat p75-sitoutumiseen, K88, joka myötävaikuttaa merkitsevästi p75-sitoutumiseen, on tällä alueella, mutt ei kovin esillä. Muu sitoutumispinta koostuu yhden päätteen K74:stä (beta-käännös 3), R114:stä ja K115:stä (C-pääte) ja F12:sta ja R69:stä toisesta promoottorista.

Muita mahdollisia pantrofiinisia molekyylejä rakennetaan parhaillaan ja niitä arvioidaan perustuen edellä esitettyyn mutageneesianalyysiin. Pan-trkA/trkC-molekyyli voidaan muodostaa tuottamalla seuraavat muutokset hNGF:ään: 1) esimuuttuva alue 1 (V18E+V20L+G23T) plus muuttuva alue 4 (Y79Q+T81K+H84Q+F86Y+K88R) ; 2) esimuuttuva alue 1 plus muuttuvan alueen 4 miminaaliset jäännösten korvaamiset. Pan-trkA/trkC-molekyyli voidaan muodostaa korvaamalla minimaaliset muutokset hNGF:n N-päätteen ensimmäisissä seitsemässä jäännöksessä ja korvaamalla hNT3:n ensimmäiset kuusi jäännöstä. Koska H4 ja P5 ovat säilyneet NGF-neurotrofiinien joukossa ja 2 hydrofobista jäännöstä asemissa 6 ja 7 ovat säilyneet, voidaan tehdä seuraavat muunnelmat: 1) YASHPIF- ·1.1. hNT3; 2) YAHPIF-hNT3; 3) YASHPIS-hNT3; 4) YAEHPIF-hNT3; 5) • 1 YAQHPIF-hNT3 . TrkaA/trkC-pantrof iini voidaan muodostaa kor-vaarnalla hNT3:n muuttuvat alueet 2 tai 4 tai 5 tai näiden • · t *4j elementtien yhdistelmät hNGF: n vastaavilla alueilla.

“Ί TrkA/trkB-pantrofiini voidaan muodostaa korvaamalla hNT4/5:n • · · **j;1 ensimmäiset 9 aminohappoa hNGF:n ensimmäisillä seitsemällä • · 1 *·1 1 jäännöksellä tai yhdistelmässä korvaamalla jäännökset muut tuvalla alueella 4 tai esimuuttuvalla alueella 1.

··· • · · • · · ··· • · • · • · · • · · • i · ···

··« t I

• · • · · ··· • · • · ··· · 69

Kirjallisuusviitteet (1) Snider, W. D. & Johnson, E. M. (1989) Ann Neurol.., 26,489-1)06 (2) : Bärde, Y.-A. (1989) Neuron, 2, 1525-1534 (3) : Davies et ai., J. Neuroscience, 6, 1897 (1986) 5 (4): Envies, A. M., Trends in Genetics, 139-143 (1988) (5) · Maisonpierre, P. C., Belluscio, L., Squinto, S., Ip, N. Y., Furth, M. E., Lindsay, R. M. and Yancopoulos, G. D. (1990) Science 247, 1446-1451 (6) : Rpsenthal A, Goeddel, D. V., Ngyuen, T., Lewis, M., Shih, A·, Laraxnee, G. R., Nikolics, K., and

Winslow, W. (1990) Neuron 4, 767-773 10 (7): Hiohn, A., Leibrock, J., Bailey, K., and Barde, Y.-A., Nature, 344, 339-341,1990 (8) : Kaisho Y, Yoshimura, K. and Nakahama, K. (1990) FEBS Lett. 266, 187-191

(9) : Erafors, P., Ibanez, C.F., Ebendal, T., Olson, L., and Persson, H. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA

87, 5454-5458 (10) : Jones, K. R. and Reichhardt, L. F. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 8060-8064 15 (11). Levi-Montalcini, R. and Angeletti, P. U. (1968) Physiol. Rev., 48,534-569 (12) : Thoenen H., Bandtlow, C. and Heumann, R. (1987), Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol., 109, 145-178 (13) Barde, Y.-A., Edgar, D. and Thoenen, H. (1982) EMBO J., 1,549-553 (14) . Leibrock, J., Lottspeich, F · Hohn, A., Hofer, M., Hengerer, B., Masiakowski, P., Thoeneri',.H., and Barde, j·.·. Y.-A. (1989) Nature, 341, 149-152 • · • t 20 (15) Holböök, F. et al., (1991) Neuron, 6, 845-858 • · (16): Berkemeier, L. R, Winslow, J. W., Kaplan, D. R., Nikolics, K, Goeddel, D. V and Rosenthal, A (1991) • Neuron, 7, 857-866

»•I

• t·· • ·*· (17). Ip, N. Y., Ibanez, C F., Nye, S. H., McClain, J., Jones, P. F., Gies, D. R., Belluscio, L., LeBeau, M.

*** M., Espinsosa, R., Ill, Squinto, S. P., Persson, H. and Yancopoulos, G. D. (1992) Proc. Natl : 25 Acad. Sci., 89,3060-3064 (18) : Martin-Zanca, D., Oskam,R., Mitra, G., Copeland, T. and Barbacid, M. (1989), Mol.Cell. Biol, 9, 24-33 ··· • · · (19) . Kaplan, D.R., Martin-Zanca, D., and Parada, L. F. (1991) Nature, 350, 158-160 • · • · *1* (20): Klein, R., Jing, S., Nanduri, V., O'Rourke, E., and Barbacid, M. (1991a) Cell 65,189-197 • — • ♦ · 1 (21)' Kaplan, D.R., Hempstead, B., Martin-Zanca, D., Chao, M., and Parada, L.F. (1991) Science 252, 554-558 • · • · • 30 (22) Klein, R., Nanduri, V., Jing, S., Lamballe, F., Tapley, P , Bryant, S., Cordon-Cardo, C , Jones, K R , ; ; Reichardt, L F , and Barbacid, M. (1991b) Cell 66,395-403 ··· *·* · (23) Soppet, D., Escandon, E , Maragos, J , Middlemas, D S , Reid, S. W., Blair, J , Burton, L E , Stanton, B R, Kaplan, D R , Hunter, T , Nikolics, K and Parada, L F (1991) Cell, 65,895-903 70 (24) . Squinto, S. P., Stitt. T N., Aldrich, T H.. Davis, S., Bianco, S M, Radziejcwski, C , Glass, D J,

Masiakowski, P., Furth, M E.. Valenzuela, D. M., DiStefano, P S and Yancopoulos, G D (1991) Cell, 65, 885-893 (25) Lamballe, F , Klein, R and Barbacid (1991), Cell, 66.967-979 5 (26): Tsoulfas, P., Soppet, D., Escandon, E., Tessarollo, L., Mendoza-Ramirez, J.-L., Rosenthal, A., Nikolics, K. and Parada, L. F. (1993) Neuron, 10, 975-990 (27) : Cordon-Cardo, C., Tapley, P., Jing, S., Nanduri, V., O’Rourke, E., Lamballe, F., Kovary, K., Klein, R.,

Jones, K. R., Reichhardt, L. F. and Barbacid, M. (1991), Cell, 66,173-183 (28) . Klein, R., Lamballe, F., Bryant, S., and Barbacid, M. (1992) Neuron $, 947-956 10 (28a): Klein, R„ Parada, L. F., Coulier, F. and Barbacid, M. (1989), EMBO J„ 8, 3701-3709 (29) : Ip, N. Y, Stitt, T. N., Tapley, P., Klein, R., Glass, D. J., Fandl, J., Greene, L. A., Barbacid, M. and

Yancopoulos, G. D. (1993) Neuron, 10, 137-149 (30) : Johnson, D., Lanahan, A., Buck, C. R., Sehgal, A., Morgan, C , Mercer, E , Bothwell, M and Chao, 15 M. (1986) Cell, 47, 545-554 (31) : Radelce, M. J., Misko, T. P., Hsu, C., Herzenberg, L. A. and Shooter (1987) Nature, 325, 593-597

(32) : Loetscher, H., Pan, Y.-C.E., Lahm, H.-W., Gentz, R., Brockhaus, M., Tabuchi, H., and Lesslauer, W

(1990) Cell 61,351-359 (33) · Smith, C.A., Davis, T., Anderson, D., Solam, L., Beckmann, M.P., Jerzy, R.. Dower, S.K., Cosman, 20 D„ and Goodwin, R.G. (1990) Science 248, 1019-1023 (34) : Schall, T.J., Lewis, M., Roller, K.J., Lee, A., Rice, G.R., Wong, G.H.W., Gatanga, T„ Granger, G.A.,

Lentz, R„ Raab, H„ Kohr, W.J., and Goeddel, D.V. (1990) Cell 61,361-370 (35) : Mallet,·S., Fossum, S., and Barclay, A.N. (1990) EMBO J. 9,1063-1068 • · • · ·*·*· (36): Camerini, D., Walz, G., Loenen, W.A.M., Borst, J., and Seed, B. (1991) J. Immunol., 147, 3165-3169 • · ϊ.ί,ί 25 (37). Stamenkovic, I., Clarke, E.A., and Seed, B. (1989) EMBO 1.8, 1403-1410 (38) . Bothwell, M. (1991) Cell, 65, 915-918 • · · (39) . Chao, M. V. (1992) Neuron, 9, 583-593 • · · • · · (40) · Connolly et ai., J. Cell. Biol. 90:176-180(1981) .*J*. (41). Skaper and Varon, Brain Res. 197: 379-389 (1980) 30 (42): Yu, etal.,J. Biol. Chem. 255:10481-10492(1980) • · · ; j*; (43): Haleqoua, et al., Cell 22:571-581 (1980) • · · (44) Tierey et al., J. Cell Biol 103:2367-2378 (1986) ;***: (45) Hefti.J Neurosci 6 2155(1986) ··· • · (46) Korsching, TINS pp 570-573 (Nov/Dec 1986) 35 (48) Burton, LE,Schmelzer, C H , Szonyi, E , Yedinak, C , and Gorrell, A (1992) J Neurochem 59,1937- 1945 71 (49) Kahle, P., Burton. L E , Schmelzcr, C, H and Hertcl, C. (] 992) J Biol Chem , 267, 22707-22710 (50) Maisonpierre, P C , Belluscio, L., Fnefdman, B., Alderson, R. F., Wiegand, S J , Furth, M E , Lindsay, R. M. and Yancopoulos, G D. (1990b), Neuron, 5, 501-509 (51) Kalcheim, C., Carmeli, C. and Rosenthal, A. (1992) Proc. Nall. Acad. Sci USA, 89,1661-1665 5 (52): Hory-Lee. F., Russell, M.. Lindsay and Frank, E. (1993) Proc. Nall. Acad Sci. USA, 90,2613-2617 (53) Ibanez, C./Ebendal, T., and Persson, H. (1991) ΕΜΒ0 J. 10, 2105-2110 (54) : Ibanez, C.F., Ebendal, T., Barbany, Q., Murray-Rust, J., Blundell, T.L., and Persson, H. (1992) Cell 69,329-341 (55) : Ibanez, C.F., Ilag, L.L., Murray-Rust. J, and Persson, H. (1993) ΕΜΒ0 J. 12,2281-2293 10 (56). Suter, U., Angst, C , Tien, C.-L, Djinkwater, C. C., Lindsay, R. M.and Shooter, E. M. (1992) J.

Neurosci., 12, 306-318 (57) Scopes. R.. Protein Purification. Springer-Verlae. NY 119821 (58) : Schnell, L., Schneider, R., Kolbeck, R., Barde, Y.-A. and Schwab, M. E. (1994), Nature, 367, 170-173 (59) : McDonald, N. Q., Lapatto, R., Murray-Rust, J., Gunning, J., Wlodawer, A. and Blundell, T. L. (1991) 15 Nature, 354,411-414 (60) : SchJunegger, M. P. and Gr_tter, M. G. (1992), Nature, 358,430-434 (61) ' McDonald, N. Q. and Hendrikson, W. A. (1993), Cell, 73,421-424 (62) : Ponder, J. W. and Richards, F. M. (1987) J. Mol. Biol., 193,775-791 20 (63)' Bernstein, F. C, Koetzle, T. F., Williams, G. J. B., Meyer, Jr., E.F., Brice, M D., Rodgers, J. R., Kennard, O., Shimanouchi, T. and Tasumi, M. (1977) J. Mol. Biol., 112,535-542 ·· · • · · '' 1 (64) Cunningham, B. C. and Wells, J. A. (1989) Science, 244,1081-1085 • · · • · (65)' Rosenthal, A., Goeddel, D.V., Nguyen, T., Martin, E., Burton, L.E., Shih, A.. Laramee, G.R., Wurm, ·.·,· F., Mason, A., Nikolics, K., and Winslow, J. W. (1991) Endocrinol. 129, 1289-1294 ...: 25 (66) Kunkel.T. A. (1985) Proc. Nad. Acad. Sci. USA, 82,488-492 ♦ 1 1 *·· (67). Kunkel et al. 1987 ·1· ! • · · (68) Graham, F.L., Smiley, J., Russell, W.C., and Naira, R. (1977) J. Gen Virol. 36,59-77 (70): Gorman, C. M., Gies, D. R. and McCray, G. (1990) DNA Protein Eng. Tech., 2,3-10 : l (71). Escandon,E., Burton, L.E., Szonyi,E., and Nikolics, K. (1993) J. Neurosci Res. 34,601-613 ; ;1j 20 ety Zoller, M.J. and Smith, M. (1983) Methods in Enzymol. 100,468-500 • ·· :...· (73) Messing, J., Crea, R., Seeburg, P. (1981) Nucleic Acids Res 9, 309 • : · (74) Schmelzer, C.H , Burton, LE , Chan, W P., Martin, E., Gorman, C , Canova-Davis, E , Ling, V T ,

Sliwkowskl, MB, McCray, G., Briggs, I.A., Nguyen, TH, and Polastri, G (1992) J * 1 Neurochem 59, 1675-1683 35 (75) Vroegop, S , Decker, D , Hinzmann, I, Poorman, R.. and Bucser, S (1992) I Protein Chem 11. " 1 -82 72 (76) Sutter, A-, Riopelle, R.I, HarUs-WatUck, R M , and Shooter, E M (1979) I Biol Chem 254, 5972-5987 (77) · Thoencn, H. and Barde, Y A. (1980) Physiol Rev., 60, 1284-1325 (78) Lindsay, R M., Thoenen, H. and Barde, Y.-A (1985) Dev. Biol., 112, 319-328.

(79) Barreset ai 1994, i<äs i ki r j oi tus jätetty j u 1 tcais ta vaks i 5 (80) Davies el ai., (1993). J. Neuroscience 13:4215-4223(1993) (81) : Shelton et ai., (December, 1984), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:7951-7955 (82) · Shelton et al„ (April, 1986), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:2714-,2718 (83) Rosenthal et ai., (1990), Neuron, 4:767-773 (84) . Hulme, E.C. and Birdsall, Strategy and Tactics in Receptor Binding Studies, p63-212 in 10 Receptor-Ligand Interactions, Ed. E.C. Hulme (85) Grotz et ai., Eur. J Biochem. 204:745-749 (1992) (86) Arenas et ai., Nature 367:368-371 (1994) (87) : Oefner et al„ EMBO J„ 11:3921-3926(1992) (88) : Shelton et ai., (1994), käsikirjoitus jätetty julkaistavaksi 15 (89): Sadicketal.,(1994), käsikirjoitus jätetty julkaistavaksi ·· · • · · • · • · • · · • · ♦ • · • · • · • · · • · · • · ··· • · · · • · · • · · • ♦ · • « · • · · • · · • · · • · · • · · 9 • 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9 • 99 • 9 9 1 99 • 9 9 9 99 9 9 999 9 9 9 9 99 9 9 9 9 73 SEKVESSILISTA (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: Genentech, Inc.

(ii) TITLE Of INVENTION: PANTROPIC NEUROTROPHIC FACTORS 5 (iii) NUMBER CF SEQUENCES: 8 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS : (A) ADDRESSEE: Genentech, Inc.

(B) STREET: 460 Point San Bruno Blvd (C) ClTV: South San Francisco 10 (D) STATE: California

(E) COUNTRY: USA

(F) ZIP,: 94080 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: 5.25 inch, 360 Kb floppy disk 15 ’ (B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: patin (Genentech) (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: 20 (B) FILING DATE: (C) CLASSIFICATION: (vii) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: (B) FILING DATE: 25 (vi i i) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Torchia, Timothy E.

(B) REGISTRATION NUMBER: 36,700

: ·* (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: 905PCT

·· · • · · : ** (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: 30 (A) telephone: 415/225-8674 * I (B) TELEFAX: 415/952-9881 (C) TELEX: 910/371-7168 • :.i.: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:l: • · · • · · *·* * (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 35 (A) LENGTH: 120 amino acids ... (B) TYPE: amino acid ::: (D) TOPOLOGY: linear ··· :...: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ T NO:l: ::: Ser Ser Thr His Pro Val Phe His MeL Gly Glu Phe Ser Val Cys III 40 1 5 10 15 • · • t • · ·

Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp :"*: 20 25 30 • · · ’**"· lie Lys Gly Lys Glu Val Thr Val Leu Ala Glu Val Asn lie Asn 35 40 45

7 A

Asn Ser Val Phe Arg Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Ala 50 55 60

Ser Asn Pro Vai Glu Ser Gly Cys Arg Gly He Asp Ser Lys His 65 70 75 5 Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Valj Lys Ala Leu 80 85 90

Thr Thr Asp Glu Lys Gin Ala Ala Trp Arg Phe 11^ Arg He Asp 95 100 105

Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Thij Arg Arg Gly 10 110 115 120 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 119 amino acids (B) TYPE: amino acid 15 (D) TOPOLOGY: linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2 :

Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp 15 10 15

Ser Glu Ser Leu Trp Vai Thr Asp Lys Ser Ser Ala He Asp He 20 20 25 30

Arg Gly His Gin Val Thr Val Leu Gly Glu He Lys Thr Gly Asn 35 40 45

Ser Pro Val Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala 50 55 60 • · · • · · ·' ** 25 Arg Pro Val Lys Asn Gly Cys Arg Gly He Asp Asp Lys His Trp 65 70 75 • · • · ϊ.ί.ί Asn Ser Gin Cys Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr .·. 80 85 90 ·«·« . Ser Glu Asn Asn Lys Leu Vai Gly Trp Arg Trp He Arg He Asp 30 95 100 105 • · · • · · • · ·

Thr Ser Cys Val Cys Ala Leu Ser Arg Lys He Gly Arg Thr 110 115 119 ··· V : (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: ··· (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 35 (A) LENGTH: 120 amino acids (B) TYPE: amino acid .···. (D) TOPOLOGY: linear • · ··· .1. (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3 : • · • · ···

Ser Ser Ser His Pro He Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys * * 40 1 5 10 15 75

Asp Ser Vai Ser Vai Trp Vai Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp 20 25 30

Ile Lys Gly Lys Glu Vai Met Vai Leu Gly Glu Va-1 Asn Ile‘Asn 35 40 45 5 ^sn Ser Vai Phe Lys Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp 50 55 60

Pro Asn Pro Vai Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His 65 70 75

Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Vai Lys Ala Leu 10 80 85 90

Thr Met Asp Gly Lys Gin Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp 95 100 105

Thr Ala Cys Vai Cys Vai Leu Ser Arg Lys Ala Vai Arg Arg Ala 110 115 120 15 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 119 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear 20 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO : 4 :

His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser 15 10 15 lie Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp 20 25 30 ·· · • ·* 25 Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser 35 40 45 I .*

Lys Gly Gin Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro * I 50 55 60 ·«· m·' Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly lie Asp Lys Arg His 30 65 70 75 ··· • · · *·* * Trp Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val Arg Ala Leu 80 85 90 n : Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg lie Gly Trp Arg Phe lie Arg lie 1.. 95 100 105 • · • · ··· 35 Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr lie Lys Arg Gly Arg : no ns 119 ♦ ·· ·,./· (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5: :***: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 119 amino acids “**: 40 (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear 76 (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5 :

Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp 15 10 15

Ser Glu Ser Leu Trp Val Thr Asp Lys Ser Ser Ala lie Asp lie 5 20 25 30

Arg Gly His Gin Val Thr Val Leu Gly Glu lie Lys Thr Gly Asn 35 40 45

Ser Pro Val Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala 50 55 60 10 Arg Pro Val Lys Asn Gly Cys Arg Gly lie Asp Asp Lys His Trp 65 70 75

Asn Ser Gin Cys Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr 80 85 90

Ser Glu Asn Asn Lys Leu Val Gly Trp! Arg Trp lie Arg lie Asp 15 95 100 105

Thr Ser Cys Val Cys Ala Leu Ser Arg Lys lie Gly Arg Thr 110 115 119 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 20 (A) LENGTH: 13 0 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6:

Gly Val Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ser Arg Arg Gly Glu Leu Ala 25 1 5 10 15 • · • · j*.’. Val Cys Asp Ala Val Ser Gly Trp Val Thr Asp Arg Arg Thr Ala : ** 20 25 30 • · • · · • · ·

Val Asp Leu Arg Gly Arg Glu Val Glu Val Leu Gly Glu Val Pro *·* 35 40 45 30 Ala Ala Gly Gly Ser Pro Leu Arg Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Arg 50 55 60 • · ·

Cys Lys Ala Asp Asn Ala Glu Glu Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly 65 70 75 • · · • · ·

Gly Gly Cys Arg Gly Val Asp Arg Arg His Trp Val Ser Glu Cys 35 80 85 90

Lys Ala Lys Gin Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ala Asp Ala Gin I" 95 100 105 • · • · • · ·

Gly Arg Val Gly Trp Arg Trp lie Arg lie Asp Thr Ala Cys Val :***: no ns 120 • · · *”'! 40 Cys Thr Leu Leu Ser Arg Thr Gly Arg Ala 125 130 77 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS : (A) LENGTH: 34 bases (B) TYPE: nucleic acid 5 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7: GGTCACCCAC AAGCTTTCAC TGGCACATAC CGAG 3 4 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO : 8 : 10 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS : (A) LENGTH: 50 bases (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 15 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8: GTACTCCCCT CGGTGGAAGA TGGGATGGCT CGAGGACCGT TTCCGCCGTG 5 0 • · · • · · » · • · ·· · • · · • · • · • · • · · • · · • · • · · • ·· · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · • · • · · . 1 • · · • · · • · · • · · • · • · • · · • « · • · • · • 1 · ·

Claims (17)

1. Pantrofiininen neurotrofiini-polypeptidi, joka sisältää ihmisen NT-3 (hNT-3) tai ihmisen NGF (hNGF) aminohapposekvenssin, jossa aminohappo on substituoitu amino-happoasemassa, joka vastaa asemaa D15 NT3:ssa tai asemaa Dl 6 hNGF:ssa, tunnettu siitä, että substituutio aikaansaa trkB-sitoutumisen, jossa mainittu D15-substituoitu pantrooppinen hNT3 sitoutuu reseptoreihin trkB ja trkC sekä mainittu D16-substituoitu hNGF sitoutuu reseptoriin trkB ja vähintään kahteen muuhun neurotrofiinireseptoriin, jotka on valittu reseptoreiden trkA, trkC ja gp75 joukosta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että mainittu substituutio on alaniinijäännös.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että mainittu alaniinijäännös on substituoitu asemaan, joka vastaa asemaa D15 hNT3:ssa.

·· · • · · ·* 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen polypeptidi, • · · :·’ tunnettu siitä, että mainittu substituutioasema on D15A • · V.; hNT3: ssa.

··· • ·· · ·.·,· 5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen polypeptidi, • ·· ϊ,:: tunnettu siitä, että siinä on edelleen ensimmäiset kuusi aminohappoa substituoitu jollakin seuraavista aminohappo-sekvensseistä: (1) NGF:n kuusi esimmäistä aminohappoa, (2) .*··. YAEHKS, (3) YASHPIF, (4) YAHPIF, (5) YASHPIS, (6) YAEHPIF ja (7) YAQHPIF.

• · · • · · ·*· ··· • · *···* 6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen polypeptidi, jossa alaniinijäännös on substituoitu asemaan, joka vastaa asemaa ··· ·;··· D16 hNGF: ssa, tunnettu siitä, että mainittu polypeptidi sitoutuu reseptoreihin trkB, trkA ja gp75.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen polypeptidi, tunnet tu siitä, että mainittu substituutioasema on D16A hNGF:ssa.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen polypeptidi, tunnet tu siitä, että siinä on edelleen substituutio esimuutosalueessa 1 aminohapoille V18, V20 ja G23 sekä vähintään yksi substituutio muutosalueessa 4 aminohapoille Y79, T81, H84, F86 tai K88 tarkoituksena aikaansaada sellainen trkC-sitoutumisaktiivisuus, jolla substituoitu D16A hNGF lisäksi sitoutuu reseptoriin trkC.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen polypeptidi, tunnet tu siitä, että siinä on substituutio asemissa D16A, V18E, V20L, G23T, Y79Q, T81K, H84Q, F86Y ja K88R.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen polypeptidi, tunnet tu siitä, että se on rakenteeltaan D16A, V18E, V20L, G23T, Y79Q, T81K, H84Q, F86Y, K88R NGF. ·· · • · · ϊ .1

11. Patenttivaatimuksen 6 mukainen polypeptidi, ·· · :1.1 tunnettu siitä, että siinä on lisäksi substituutio • 9 •.V aminohappoasemissa E41, K57, D72 tai N77 tarkoituksena 9 ##1j1 aikaansaada sellainen suurempi trkA-sitoutumisaktiivisuus. • · · • · · ···

12. Minkä tahansa edellä esitetyistä patenttivaatimuksista 1-11 mukainen polypeptidi, t u n -n e t t u siitä, että se sisältää kovalentin heterodimeerin • · · .···. tai kovalentin homodimeerin. • · ··· 9 9

13. Eristetty nukleiinihappo, tunnettu siitä, • · · ·...· että se koodaa minkä tahansa edellä esitetyistä patenttivaatimuksista 1-12 mukaisen polypeptidin. ··· • ·

14. Ekspressiovektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 13 mukaisen nukleiinihapon.

15. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 13 mukaisen nukleiinihapon.

16. Menetelmä minkä tahansa edellä esitetyistä patenttivaatimuksista 1-12 mukaisen polypeptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä isäntäsolu, jossa on mainittua polypeptidiä koodaavaa nukleiinihappoa, altistetaan mainitun polypeptidin ilmentäville olosuhteille.

17. Farmaseuttinen koostumus, jossa minkä tahansa edellä esitetyistä patenttivaatimuksista 1-12 mukaista polypeptidiä on sekoitettu farmaseuttisesti käytettävään ainesosaan. *· · • · · • · • · ·· » • · · • · • · • · • · · • · · • · • · · ·»·· • · · • · · • · · ··· • · · • · · • · · • · · • · · ··· • · • · • · · • · · • · · • · · ··· • · • · • · · 1 • I · · • · • · **#