JPH10501138A

JPH10501138A - 汎親和性神経栄養因子

Info

Publication number: JPH10501138A
Application number: JP8501183A
Authority: JP
Inventors: アーファー，ロマン; プレスタ，レオナード・ジー; ウィンスロー，ジョン・ダブリュー
Original assignee: ジェネンテク・インコーポレイテッド
Priority date: 1994-06-03
Filing date: 1995-06-01
Publication date: 1998-02-03
Also published as: BR9508019A; EP0763107A1; DE69533698D1; NZ287762A; US5981480A; PT763107E; MX9605971A; NO965123D0; US7528233B2; AU695144B2; FI964833A0; US7935671B2; US5728803A; US20100184656A1; US20060270838A1; CA2191064C; US6503728B1; FI964833A; DE69533698T2; NO965123L

Abstract

(57)【要約】複数の神経栄養特異性を有する汎親和性神経栄養因子を提供する。本発明の汎親和性神経栄養因子は神経障害の治療に有用である。該汎親和性ニューロトロフィンをコードしている核酸および発現ベクターをも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】汎親和性神経栄養因子発明の分野本出願は神経組織、特にニューロンの成長、調節、もしくは維持に関与する蛋白に関する。詳細には、本出願は多様な神経栄養特異性を有する汎親和性神経栄養因子（ＭＮＴＳ変異体）に関する。発明の背景脊椎動物ニューロンの生存、および分化した機能の維持は、ニューロトロフィンと呼ばれる特異蛋白の利用能の影響を受ける。発達中のニューロンの生存は、その標的野からのこの因子の供給に依存し、ニューロトロフィンの産生の制限は、不必要なニューロンの死滅をもたらす（(1);(2)参照）。種々のニューロトロフィンは中枢および末梢神経系における異なるニューロンのポピュレーションの生存を支持する能力が機能的に異なる(3),(4);(5),(80)。ニューロトロフィンファミリーはＮＴ３(6),(7);(5);(8);(9);(10)、神経成長因子（ＮＧＦ）(11);(12)、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）(13);(14)、およびニューロトロフィン４／５（ＮＴ４／５）(15),(16),(17)を含む高度にホモローガスなファミリーである。ニューロトロフィンは少なくとも部分的に、ｔｒｋｓとして知られるＭ_r＝140 -145000の一群のチロシンキナーゼ含有リセプターのリガンド依存性活性化を介して細胞内シグナリングを変換することが研究によって示唆されている(18);(19 ),(21);(20),(22);(23);(24);(25);(26)。したがって、ニューロトロフィンの該シグナルの変換経路は、ニューロトロフィンが特異的チロシンキナーゼリセプターと高親和性に結合することによって該リセプターが活性化し、次いで該リセプターが自己リン酸化することによって起こる(19);(27)。ニューロトロフィンと種々のｔｒｋｓの間にはある程度の交差リセプター相互作用がみられるが、ＮＧＦ／ｔｒｋＡ、ＢＤＮＦ／ｔｒｋＢ、およびＮＴ３／ｔｒｋＣの特異性が顕著であり、一方、ＮＴ４／５はＢＤＮＦと同様な効率で主としてｔｒｋＢと相互作用するようである(27);(19)(21);(25);(22);(28);(18);(28a)。ｔｒｋＣはもっはらＮＴ３(25);(26)のみと反応するが、ｔｒｋＡおよびｔｒｋＢはin vitroのある環境化で多くのニューロトロフィンと反応することができる(6);(23)。しかし、ニューロンの環境は、ｔｒｋＡとｔｒｋＢの、好ましくない神経栄養リガンドと反応する能力を制限する(29)。ｔｒｋファミリーのリセプターに加えて、ニューロトロフィンは、未知の貫膜シグナリング機序を有するが、腫瘍壊死因子リセプター（ＴＮＦＲ）、ＣＤ４０、ＯＸ４０、およびＣＤ２７を含むリセプター遺伝子ファミリー(32);(33);(34),(35);(36);(37)と構造的に関連があるｐ７５低親和性ＮＧＦリセプター（ｐ７５;(30):(31)）と呼ばれる別の群のリセプターと結合することもできる。ニューロトロフィンの高親和性結合部位の形成およびシグナル転換経路におけるｇｐ７５の役割はまだわかっていない（(38);(39)参照）。ニューロトロフィンの一次アミノ酸配列に関する試験により、該ファミリーメンバー間の配列の相違の８５％を占める、各々７−１０残基からなる７領域が証明されている。神経成長因子（ＮＧＦ）は、末梢神経系の感覚および交感ニューロンの発達に対する顕著な効果を有する１２０個のアミノ酸ポリペプチドホモダイマー蛋白である。ＮＧＦは反応性ニューロン上の特異的細胞表面リセプターを介して作用することによってニューロンの生存を維持し、神経突起の生長を促し、神経化学的分化を増強する。ＮＧＦ作用は、ニューロンの膜(40),(41)、ニューロン蛋白のリン酸化の状態(42),(43)、およびニューロンの分化と機能に役割を果たすと思われる多量のｍＲＮＡと蛋白の変化を伴う（実施例（４４）参照）。前脳コリン作動性ニューロンはＮＧＦとも反応し、栄養維持のためにＮＧＦを必要とするかも知れない(45)。さらに、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＮＧＦとそのリセプターの分布と個体発生は、ＮＧＦが前脳基底部のコリン作動性ニューロンに対し標的由来神経栄養因子として作用することを示唆している(46),(81) 。ｔｒｋＡ−チロシンキナーゼリセプターとの相互作用に必要なＮＧＦのアミノ酸残基についてはほとんど知られていない。生物活性とリセプター結合の有意な低下は、アミノおよびカルボキシ末端が修飾された、同種のトランケート形を示すヒトおよびマウスＮＧＦの精製ホモダイマーを用いて観察された(47);(48);(4 9)。精製組換えヒトＮＧＦのＮ末端の最初の９残基とＣ末端の少なくとも２残基が失われて生じる１０９アミノ酸のＮＧＦである（１０−１１８）ｈＮＧＦは、（１−１１８）ＨＮＧＦに比べてヒトｔｒｋＡリセプターからマウス［¹²⁵Ｉ］ＮＧＦに置換する効率が３００倍悪い(49)。（１０−１１８）ｈＮＧＦは（１− １１８）ｈＮＧＦに比べて背根神経節と交感神経節の生存において５０〜１００倍活性が低い(48)。（１−１１８）ＨＮＧＦはかなり低いｔｒｋＡチロシンキナーゼ自己リン酸化活性を有する(49)。ＮＴ３の転写は広範囲の末梢組織（例えば、腎、肝臓、皮膚）および中枢神経系（例えば、小脳、海馬）において検出されている(5);(7):(82)。成長時において、ＮＴ３ｍＲＮＡの転写はニューロンの増殖、遊走、および分化が進行している中枢神経系領域において最も顕著である(50)。ニューロンの成長における役割を支持する証拠には、ＮＴ３の、神経クレスト細胞促進効果(51)、in vivoでの乏突起神経膠細胞前駆体細胞の増殖の刺激(79)が含まれる。ＮＴ３は、結節性神経節（ＮＧ）からの感覚ニューロン(7);(5),(83)、および背根神経節（ＤＲＧ）からの筋肉感覚ニューロンのポピュレーションのin vitroにおける生存も維持する。これらのin vitro研究に加え、最近の報告において、ＮＴ３は、アルツハイマー病と細胞の損失パターンが似ているモデルにおけるコエルルス（coerulus ）座の成人中枢ノルアドレナリン作動性ニューロンのin vivoにおける変性を予防することが示された。現在のところｔｒｋＣとの結合に必要なアミノ酸残基に関する公表された報告はみられない。キメラまたは汎神経栄養因子を作出するための試みは限られている（(53);(56 );(54),(55)）。発明の要約本発明の目的は、汎親和性ニューロトロフィンを提供し、組換えＤＮＡ技術を用いてこれら汎親和性ニューロトロフィンの有効量を製造することである。さらに本発明の目的は、汎親和性ニューロトロフィンをコードしている組換え核酸と、汎親和性ニューロトロフィンをコードしている核酸を含む発現ベクターおよび宿主細胞を提供することである。さらに本発明は、汎親和性ニューロトロフィンの製造法と患者のニューロン性障害の治療法を提供することを目的とする。上記目的にしたがって、本発明は組換え汎親和性ニューロトロフィンおよび本発明のニューロトロフィンをコードしている分離された核酸や組換え核酸を提供することである。転写および翻訳を調節するＤＮＡと機能的に結合した汎親和性ニューロトロフィンをコードしているＤＮＡと該核酸を含む宿主細胞を含有する発現ベクターをも提供する。さらに本発明は、発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、汎親和性ニューロトロフィンをコードする核酸を発現させることにより組換えニューロトロフィンを製造することを含む汎親和性ニューロトロフィンの製造法を提供することを目的とする。さらに、患者に本発明の汎親和性ニューロトロフィンを投与することを含む神経障害を治療する方法を提供する。さらに本発明の目的および特徴は、以下の詳細な説明、特許請求の範囲および図から当業者には明らかであろう。図面の簡単な説明図１は、マウスＮＧＦ（配列番号１）とヒトＮＴ−３（配列番号２）の高いホモロジーにより、ＮＧＦの３Ｄ構造に基づくＮＴ−３のモデリングが可能であることを示す。矢印はβ鎖を示す。β鎖の名称はMcDonaldら（1991）(59)に記載の通りである。ＮＧＦとＮＴ−３のアミノ酸の相違は灰色のボックス中に示している。障害のある構造を有する部分には細い平行線を付している。図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、および２Ｅは、背根神経節ニューロンの生存およびＰＣ／ｔｒｋＣ細胞の神経突起の発現に対する選択した突然変異体の生物学的影響を示す。Ｅ９雛ＤＲＧニューロンはＮＴ−３または突然変異体蛋白を含む２９３細胞の順化培地存在下で７２時間培養された。突然変異体によって誘導された反応はＮＴ−３反応の％で表わした。Ａ）ＮＴ−３、Ｒ１０３Ａ／Ｄ１０５Ａ、およびＲ１０３Ａ５ｎｇ／ｍＬ。Ｂ）ＮＴ−３、Ｒ１０３Ｍ、Ｒ１０３Ｋ、Ｎ１、およびＹ５１Ａ１ｎｇ／ｍｇ。Ｃ）ＮＴ−３、Ｙ１１Ａ、Ｔ２２Ｑ、およびＫ８０ＡＱ８３Ａ０．２ｎｇ／ｍＬ。誤差はトリプリケートの実験値のＳＤである。モックトランスフェクト細胞からの培地の反応を各データポイントから引いたが、２００ｐｇ／ｍＬ、１０００ｐｇ／ｍＬ、および５０００ｐｇ／ｍＬの実験につきそれぞれ２３％、２３％、および２９％であった。（Ｄ）ＮＴ−３またはＲ６８Ａ突然変異体を含む順化培地によって誘導されたＰＣ１２／ｔｒｋＣ細胞の反応。種々の濃度のニューロトロフィンによって誘導された神経突起を持った細胞のパーセンテージ。神経突起を持った細胞と持たない細胞の合計はＮＴ３およびＲ６８Ａのすべての用量において一定であった。（Ｅ）ＤＲＧからのニューロンの生存。生存細胞数で表わしたＮＴ−３、Ｒ６８Ａ、またはＲ１１４Ａ／Ｋ１１５Ａによって誘導された反応。結果はトリプリケートで行った実験値の平均値±ＳＤである。モックトランスフェクト順化培地によって誘導された反応はデータポイントから差し引かれ、生存細胞数は２０±４個であった。図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、ＮＴ３のリセプターであるｔｒｋＣおよびｇｐ７５に結合するＮＴ３のエピトープを示す。ＮＴ３モデルはモノマーＡおよびＢからの結合決定基を用いて示しており、それぞれ明および暗灰色で示している。（Ａ）ｔｒｋＣリセプターに対するエピトープ。（Ｂ）ｔｒｋＣエピトープの側面からの様子。ｔｒｋＣ結合決定基に対するＤ１５およびＹ５１の位置。（Ｃ）ｑｐ７５リセプターに対するエピトープ。図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄ、４Ｅ、４Ｆ、４Ｇ、４Ｈ、４１、および４Ｊは、ＢＤＮＦおよびＮＧＦ様活性の改良されたＮＴ３突然変異体のスクリーニングを示す。ｔｒｋＢを発現しているＰＣ１２細胞またはＰＣ１２細胞系をコラーゲンをコートした皿に入れた。ＰＣ１２／ｔｒｋＢ細胞系はＢＤＮＦ（Ａ）、ＮＴ３（Ｂ）、突然変異体Ｄ１５Ａ（Ｃ）、またはモックトランスフェクト２９３細胞（Ｅ）上清のいずれかを添加したＰＣ１２培地で処理された。ＰＣ１２細胞はＮＧＦ（Ｆ）、ＮＴ３（Ｇ）、Ｓ１（Ｈ）、Ｄ１５Ａ（Ｄ）、ＭＮＴＳ−１（Ｉ）、またはモックトランスフェクト２９３細胞（Ｊ）上清のいずれかを添加したＰＣ１２培地で処理された。示した領域は処理後３日目に撮影した写真である。図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、および５ＤはＭＮＴＳ−１がヒトｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、およびｔｒｋＣと高親和性で結合することを示す。リセプターイムノアドヘシンを用いた置換曲線は一定量の標識ニューロトロフィン（ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、およびｔｒｋＣでは５０ｐＭ、およびｇｐ７５では１００ｐＭ）存在下で、非標識競合物である（ｏ）ＨＮＧＦ、（△）ｈＢＤＮＦ、（□）ＮＴ−３、（▲）ＭＮＴＳ−１、（Ｘ）Ｓ１、（＋）Ｄ１５Ａを増量させながら決定した。（Ａ）ヒトｔｒｋＡからの¹²⁵Ｉ−ＮＧＦの置換。（Ｂ）ヒトｔｒｋＢからの¹²⁵Ｉ−ＢＤＮＦの置換。（Ｃ）ヒトｔｒｋＣからの¹²⁵Ｉ−ＮＴ−３の置換。（Ｄ）ヒトｇｐ７５からの¹²⁵Ｉ−ＮＴ−３の置換。図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃは、ＭＮＴＳ−１によって誘導されたｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、およびｔｒｋＣの自己リン酸化を示す。ＰＣ１２変異体細胞を、神経栄養因子と突然変異体２５ｎｇ／ｍＬに３７℃で５分間ばく露し、実験手順の記載に従ってアッセイした。（Ａ）無因子、ＮＧＦ、ＮＴ−３、Ｓ１、Ｄ１５Ａ、ＭＮＴＳ−１、およびモックトランスフェクト２９３細胞上清の添加によるＰＣ１２細胞の反応。（Ｂ）無因子、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、精製ＮＴ−３、発現ＮＴ−３、Ｄ１５Ａ、およびモックトランスフェクト２９３細胞上清の添加によるＰＣ１２／ｔｒｋＢ細胞の反応。（Ｃ）無因子、ＮＧＦ、ＮＴ−３、Ｄ１５Ａ、Ｓ１、ＭＮＴＳ−１、およびモックトランスフェクト２９３細胞上清の添加によるＰＣ１２／ｔｒｋＣ細胞の反応。神経栄養因子の下の数は免疫沈降法に用いた抗血清の種類を示し、４４３は汎ｔｒｋ抗血清、および６５６はｔｒｋＣ特異抗血清である。図７は、ＭＮＴＳ−１がＤＲＧニューロンの生存に対してＮＴ−３／ＢＤＮＦ／ＮＧＦカクテルと同様に有効であることを示す。ＤＲＧからのニューロンの生存の用量依存性。ＮＴ３／ＢＤＮＦ／ＮＧＦカクテル（１：１：１）（●）、およびＭＮＴＳ（▲）によって維持された細胞数。結果はトリプリケートの実験値の平均値±ＳＤで示している。データはＭＮＴＳ−１（ダッシュの破線）とカクテル（実線）の４パラメーター方程式に当てはめた。ＭＮＴＳ−１とカクテルのＥＣ−５０計算値はそれぞれ３６ｐｇ／ｍＬと４４ｐｇ／ｍＬであった。図８は種々のニューロトロフィンのホモロジー、可変領域、および定常領域を示す。ＮＧＦ（配列番号３）、ＢＤＮＦ（配列番号４）、ＮＴ３（配列番号５）、およびＮＴ４／５（配列番号６）を枠で囲った可変領域とともに示す。図９Ａ、９Ｂ、および９Ｃは、精製Ｎ末端修飾型ｈＮＧＦの濃度を増加させることにより、ｔｒｋＡ、ｐ７５、またはｔｒｋＡ＋ｐ７５リセプターのいずれかからの［¹²⁵Ｉ］ｈＮＧＦの競合置換を示す。上段（１２Ａ）、中段（１２Ｂ）、および下段（１２Ｃ）のパネルはそれぞれｔｒｋＡ、ｐ７５、およびｔｒｋＡ＋ｐ７５リセプターを発現しているＭＨ３Ｔ３、Ａ８７５、メラノーマ、およびＰＣ１２クロム親和細胞腫からの置換を示す。競合リガンドの表示は以下の通りである。（●−●）１１１／１１１＝（１０−１１８）ｈＮＧＦのホモダイマー、（○−○）１１８−１１８＝（１−１１８）ｈＮＧＦのホモダイマー、（▲− ▲）１１５−１１５＝（６−１１８）ｈＮＧＦのホモダイマー、および（▼−▼ ）マウスＮＧＦ＝（１−１１８）ｍＮＧＦのホモダイマー。リセプターとの結合は実施例に記載のごとく４℃で実施し、分析を行った。示したデータは全結合（特異的および非特異的）を示し、各細胞系につき少なくとも３回別々に行った結合実験の結果を示している。この実験のＩＣ₅₀は表５に示す。図１０Ａおよび１０ＢはＮ末端トランケート型のｈＮＧＦによって誘導されたｔｒｋＡの自己リン酸化を示す。上段のパネル（１０Ａ）はｈＮＧＦ変異体のモル濃度の作用としてのｐ１４０^trkAバンドの自己リン酸化の強さを示し、一方、下段のパネル（１０Ｂ）は反射濃度計によって測定した各バンドの光学密度の値を示す。自己リン酸化したｐ１４０^trkAバンドは抗ホスホチロシンで免疫沈降させ後にニトロセルロース上で抗ｔｒｋＡイムノブロッティングを行うことによって同定された。示したデータは２回の独立した実験のものである。図１１Ａおよび１１Ｂは、ｈＮＧＦ突然変異体の発現と蛋白分析の結果を示す。パネルＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分けた代謝標識突然変異体１〜８のオートラジオグラフを示す（表１の説明参照）。突然変異体はヒト２９３細胞において一過性に発現し、³⁵Ｓ−メチオニンおよびシステインで標識された。順化培地を精製ウサギ抗ｈＮＧＦポリクローナル抗体で免疫沈降させ、その沈降物を実施例に記載のごとくＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ｗｔまたはＢで標識したレーンはそれぞれ野生型（１−１２０）ｈＮＧＦ発現ベクターまたはＡｄＶＡベクター単独による細胞のトランスフェクションを示す。パネルＢは非標識突然変異体または野生型ｈＮＧＦ約０．１μｇのイムノブロット分析の結果を示す。これらの試料は上記代謝標識細胞と同時にトランスフェクトした後の順化培地から得られる。イムノブロッティングはパネルＡに記載の同じ抗ｈＮＧＦポリクローナル抗体を用いて行なった。これらの結果は、同じ実験で同時にイムノブロットし、図１８に示すｈＮＧＦ特異モノクローナル抗体と反応させた突然変異体の種々の検出と対比させることができる。ＮＧＦで標識したレーンは精製（１−１２０）ｈＮＧＦ０．１μｇからのシグナルを示す。両パネルの左軸は分子量マーカー（ｋＤ）の相対移動度を示す。図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ、１２Ｅ、および１２Ｆは、ｈＮＧＦ突然変異体の濃度増加によるｔｒｋＡ（上段パネル、１２ＡおよびＢ），ｐ７５（中段パネル、１２Ｃおよび１２Ｄ）、およびＰ７５＋ｔｒｋＡ（下段パネル、１２Ｅおよび１２Ｆ）発現細胞からの［¹²⁵Ｉ］ｈＮＧＦの競合置換を示す。分かりやすくするために、各細胞系ごとにデータを２つのパネルに分けた。相対結合親和性を比較するために、１実験の各細胞系につき４変異体とｈＮＧＦ野生型コントロールを試験した。２つのパネルの各々は、１トランスフェクションからの少なくとも２つの別々の結合実験と、さらなるトランスフェクションからの１つの結合実験を示す。結合実験は実施例に記載のごとく４℃で行った。全結合は図１２に示す。野生型ｈＮＧＦのＩＣ₅₀は表５に示す。図１３Ａおよび１３ＢはｈＮＧＦ突然変異体によって誘発されたｔｒｋＡの自己リン酸化を示す。上段パネル（１３Ａ）は示した濃度の突然変異体または野生型ｈＮＧＦでｔｒｋＡ発現細胞を刺激した後のｐ１４０^trkAのオートラジオグラフを示す。ｔｒｋＡの自己リン酸化レベルは図１０のごとく測定した。下段パネル（１３Ｂ）は濃度計による上記オートラジオグラフの定量値である。示したデータはすべての突然変異体によって誘発されたｔｒｋＡの自己リン酸化を１実験内で比較する少なくとも２つの実験のものであり、実験あたり３〜４突然変異体とｈＮＧＦを比較している他の実験からのデータと一致する。図１４は、ＰＣ１２細胞の神経突起の生長によって測定されたｈＮＧＦ突然変異体の生物活性を示す。示した濃度の突然変異体または野生型ｈＮＧＦの存在下でＰＣ１２細胞を４８時間成長させた。示した顕微鏡視野内の、神経突起を延ばしている全細胞のパーセンテージを、実施例に記載のごとく（１−１１８）ｈＮＧＦによって誘発された最大反応に標準化して示している。示した値は突然変異体あたり少なくとも２回の実験の平均である。図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｄ、および１５Ｅは、精製Ｎ末端領域突然変異体の特徴を示す。Ａ．精製Ｈ４Ｄ突然変異体２（レーン１）、精製ｈＮＴ３／ｈＮＧＦＮ末端キメラ突然変異体６（レーン２）、部分精製（１−１２０）ｈＮＧＦ（レーン３−Ｎ）、および分子量マーカー（ｋＤ）（レーン４−Ｍ）１μ ｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥ(１５％アクリルアミド)の銀染色。精製および分析の詳細は材料および方法の項に示した。Ｂ．精製Ｈ４Ｄ突然変異体２、ｈＮＴ３／ｈＮＧＦＮ末端キメラ突然変異体６、および精製（１−１２０）ｈＮＧＦによる［¹ ²⁵ Ｉ］ｈＮＧＦの競合置換。上段パネル（１５Ｂ）はｔｒｋＡ発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞との結合を示し、下段パネル（１５Ｄ）はＡ８７５細胞（ｐ７５）との結合を示す。Ｃ．上段パネル（１５Ｃ）は図１０および１３と同様に行った抗ホスホチロシンイムノブロットによって測定したｐ１４０^trkAの自己リン酸化の濃度依存性（Ｍ）を示す。下段パネル（１８Ｅ）はイムノブロットデータの濃度計による定量を示す。図１６ＡおよびＢは、ｈＮＧＦのＮ末端領域とモノクローナル抗体との相互作用を示す。Ａ．突然変異体１−６、および８（突然変異体７は低濃度のため省略）、ｈＮＧＦ（ｗｔ）、およびコントロールトランスフェクト順化培地（Ｂ）０．１μｇのイムノブロット。順化培地をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロース上にイムノブロットし、これを抗ｈＮＧＦモノクローナル抗体１４.１４と反応させた。突然変異体の相対移動度は１４ｋＤと示されている。Ｂ．パネルＡで用いたのと同じモノクローナル抗体の濃度を増加することによるｔｒｋＡ発現およびｐ７５発現細胞のいずれかからの２５ｐＭ［¹²⁵Ｉ］ｈＮＧＦの競合置換。図１７は、ネズミＮＧＦのＸ線結晶構造に基づいてｈＮＧＦモノマーを図解したものであり、一次アミノ酸配列（配列番号３）、二次構造の基本的特徴、および突然変異誘発によって修飾された残基を示す。黄色の陰をつけた残基はｈＮＧＦとｈＮＴ３とで異なる残基を示し、ドメインスワップ（交換物）としてｈＮＧＦ中の対応するｈＮＴ３残基で置換された。５−８黄色残基のブロック近傍に位置する大きな黒い数字は特定のニューロトロフィン可変領域の数である。これらの可変領域はアミノおよびカルボキシ末端も含む。赤色の陰をつけた残基は突然変異した単一またはペアの残基を示し、ほとんど溶媒にばく露されたアミノ酸を示す。図１８Ａ、１８Ｂ、および１８ＣはｈＮＧＦの構成を示す。図１８ＡはｈＮＧＦの一次配列内の可変ドメインの位置を示す。図１８ＢはｈＮＴ３の単一可変ドメインを含むｈＮＧＦの可変ドメインキメラ突然変異体を示す。１８Ｃの一覧表には示した突然変異体内のｈＮＴ３で置換されたｈＮＧＦの特定の残基を含む。図１９Ａおよび１９Ｂは、ｈＮＧＦの構造変異体を分析するために用いた新しいリセプター結合法の特性を示す。Ａ）ｔｒｋＡ−ＩｇＧ免疫吸着をベースにしたアッセイの結合特性とＮＩＨ３Ｔ３細胞系に発現したホロ−ｔｒｋＡリセプターのそれとの比較。ｔｒｋＡ−ＩｇＧ競合結合プロフィールはホロ−ｔｒｋＡ細胞系（２０Ａ）のそれと非常に似ているが、一方、ｔｒｋＡ−ＩｇＧは同じニューロトロフィン選択性を示す（２０Ｂ、ＮＧＦ＞＞ＮＴ３＞ＢＤＮＦ）。ここに示した結合データは、個々にｔｒｋＡ、Ｂ、Ｃ、またはｐ７５−ＩｇＧ免疫吸着アッセイを利用している。種々の変異体のリセプター結合特性はホロ−ｔｒｋＡ細胞結合アッセイによって立証された。図２０Ａおよび２０Ｂは、ｈＮＧＦ／ｈＮＴ３キメラ突然変異体のｔｒｋＡ− ＩｇＧおよびｇｐ７５リセプターへの結合を示す。該突然変異体の相対親和性は、突然変異体のＩＣ₅₀の、競合結合曲線から得られたｈＮＧＦのそれに対する比としてプロットされている。平均比は３回の独立した結合実験からのものである。ＮＧＦ／ＮＴ３Ｎ末端ドメインスワップ突然変異体（突然変異体６）ではｔｒｋＡ結合の有意な低下が生じるが、一方、ｇｐ７５結合には影響はみられない。これらの結果は、４℃における細胞のホロ−ｔｒｋＡ結合から得られるデータと一致している（図１８ＢおよびＣ）。ＮＴ３の第一β−ターンを含むキメラ突然変異体（突然変異体１０および１９）はｇｐ７５に対する結合力が４倍低い。第一β−ターン（突然変異体２１）またはＣ末端（突然変異体２４）中の塩基性残基のアラニン置換はｇｐ７５結合の有意な減少をもたらす。図２１Ａおよび２１Ｂは、ｈＮＧＦ／ｈＮＴ３キメラ突然変異体の、それぞれｔｒｋＡのチロシンキナーゼによる自己リン酸化とＰＣ１２細胞神経突起の生長を誘発する能力を示す。ｔｒｋＡ発現ＣＨＯ細胞は、ｈＮＧＦ、ｈＮＴ３、またはｈＮＧＦ／ｈＮＴ３ドメインスワップキメラ突然変異体で刺激され、自己リン酸化はホスホチロシン−ＥＬＩＳＡアッセイ（ＯＤ_450/650）によって測定された。ｔｒｋＡ結合と同様に、ｔｒｋＡの自己リン酸化はＮ末端ｈＮＧＦ／ｈＮＴ３キメラ突然変異体によってほとんど刺激されない。プレ−βターン１領域（Ｖ１８、Ｖ２０、Ｇ２３）内のドメインスワップによって、２〜３倍の活性低下が生じ、このことはＮＧＦ−ｔｒｋＡ特異性の決定においてこれら残基が役割を果たす可能性を示す。ＰＣ１２細胞の分化については、すべての突然変異体について神経突起の生長のＥＣ₅₀を測定し、ｈＮＧＦのＥＣ₅₀との比で表した。さらに、Ｎ末端ｈＮＧＦ／ｈＮＴ３ドメイン−スワップ突然変異体において最大の効果がみられるが、ｔｒｋＡ結合および自己リン酸化と一致してプレ−βターン１領域においても生物活性の低下がみられる。図２２Ａおよび２２Ｂは、ｈＮＧＦ／ｈＮＴ３ドメイン−スワップ突然変異体の汎神経栄養活性を示す。この活性は、ｔｒｋＣトランスフェクトＰＣ１２細胞の神経突起の生長とｔｒｋＣ−ＩｇＧ競合結合によって測定される。［¹²⁵Ｉ］ｈＮＴ３の競合置換はｈＮＴ３（ＩＣ₅₀＝４５ｐＭ）および可変領域４ｈＮＧＦ／ｈＮＴ３ドメインスワップ突然変異体（突然変異体１６、ＩＣ₅₀＝８０ｎＭ）でのみ観察される。同様に、可変領域４におけるｈＮＧＦ／ｈＮＴ３ドメインスワップは、ｈＮＧＦと反応しないｔｒｋＣトランスフェクトＰＣ１２細胞における有意な神経突起の成長を生じる。突然変異体１６のｔｒｋＡ依存性結合、自己リン酸化、およびＰＣ１２細胞活性の比較（図１９および２０）は、内因性ｈＮＧＦ様活性がほとんど低下しないことを示す。ＮＴ３のＮ末端を含むＮ末端ドメインスワップ−突然変異体（突然変異体６）はｔｒｋＣと相互作用しない。図２３は、２つのＮ末端ドメイン−スワップ突然変異体を示す。すなわち、ｈＮＴ３−ＮＨ２／ｈＮＧＦは突然変異体６であり、ｈＮＧＦの残りのバックボーン上のｈＮＧＦ残基１−７が置換したｈＮＴ３残基１−６（ＹＡＥＨＫＳ−）を含む。ｈＮＧＦ−ＮＨ２／ＮＴ３は、Ｐ２（Ｓ１）であり、ｈＮＴ３の残りのバックボーン上のｈＮＴ３残基１−６が置換したｈＮＧＦ残基１−７（ＳＳＳＨＰＩＦ−）を含む。図２４Ａ、２４Ｂ、および２４Ｃは、それぞれｔｒｋＡ、ｔｒｋＣ、およびｇｐ７５を用いるＰ２（Ｓ１）の汎ニューロトロフィンリセプター結合活性を示す。競合結合アッセイは示した因子によるリセプター−ＩｇＧ免疫吸着物からの［¹²⁵ Ｉ］ｈＮＧＦまたは［¹²⁵Ｉ］ｈＮＴ３の置換によって行われた。ｈＮＧＦＮ末端を含むｈＮＴ３のＮ末端ドメイン−スワップ突然変異体であるＰ２（ＮＧＦ−ＮＮ₂／ＮＴ３）はｔｒｋＣ活性を保持したままｈＮＧＦ様ｔｒｋＡ結合活性を示す。ｈＮＴ３Ｎ末端を含むｈＮＧＦの逆Ｎ末端ドメイン−スワップ突然変異体であるＮＴ３−ＮＮ₂／ＮＧＦ（突然変異体６）はｔｒｋＡとの結合の低下を示し、ｔｒｋＣには結合しない。図２５Ａおよび２５Ｂは、それぞれ正常ｔｒｋＡ発現ＰＣ１２細胞およびｈＮＧＦ反応が低下したｔｒｋＣトランスフェクトＰＣ１２細胞におけるＰ２（Ｓ１）の汎ニューロトロフィン生物活性を示す。示した濃度のニューロトロフィンまたは変異体で神経突起を有するＰＣ１２細胞のパーセントは天然ニューロトロフィンによって誘発される最大反応に対して標準化された。それぞれｈＮＧＦおよびｈＮＴ３のＥＣ₅₀と同様に、ｔｒｋＡＰＣ１２細胞中のＰ２（ＮＧＦ−ＮＮ₂ ／ＮＴ３）のＥＣ₅₀は０．４ｎｇ／ｍＬ（１５ｐＭ）であり、ｔｒｋＣトランスフェクトＰＣ１２細胞では０．２ｎｇ／ｍＬ（７ｐＭ）である。図２６Ａおよび２６Ｂは、ｔｒｋＡおよびｇｐ７５リセプターに対するｈＮＧＦ点突然変異体の結合を示す。該突然変異体の親和性は競合結合によって測定され、天然ｈＮＧＦのＩＣ₅₀に対する突然変異体のＩＣ₅₀の比で示す。ＩＣ₅₀は各突然変異体ｈＮＧＦの２つの独立したトランスフェクションから少なくとも２回行った競合結合曲線によって決定された。各突然変異体につき４〜６回の独立した測定値に対するＩＣ₅₀比のＳＤを示す。結合に対する影響を試験したｈＮＧＦの残基は、ネズミＮＧＦ結晶構造から予測されるようにほぼ表面が露出していた。図２７はｔｒｋＡの自己リン酸化ＥＬＩＳＡアッセイによって測定したｈＮＧＦ突然変異体の生化学的活性を示す。ｈＮＧＦのＥＣ₅₀（ＥＣ₅₀＝１２０ｐＭ）に対する各突然変異体のＥＣ₅₀を示す。有効性に対する最大の影響を有する突然変異した残基を残基番号によって示す。自己リン酸化の程度（有効性）にさらに影響を及ぼす突然変異残基は残基番号とアスタリスク（＊）で示す。図２８はｔｒｋＡ−ＰＣ１２細胞神経突起生長アッセイにおける選択したｈＮＧＦ突然変異体の生物活性を示す。各突然変異体の神経突起生長に関するＥＣ₅₀ は、ｈＮＧＦの反応との比でプロットしている。最大効果を有する突然変異残基を示す。他のすべての突然変異体については目下試験中である。発明の詳細な説明本明細書では、当該技術分野で知られている、下記の表に示すアミノ酸の１文字コードを用いる。したがって、アミノ酸残基の確認は１文字アミノ酸コードと、その後に記した残基の位置の番号で行う。この位置番号は特定のニューロトロフィンのバックボーンに対応すると理解すべきであり、従って、Ｄ１５ＡＮＴ３は、ＮＴ３の１５位のアスパラギン酸がアラニンに変化していることを意味する。図８に示すようにＮＧＦにはＮ末端にさらにアミノ酸が付加されているので、以下に定義するごとく「定常領域」内に認められるこのアスパラギン酸はＮＧＦの１６位に対応する。本発明は汎親和性ニューロトロフィンを提供するものである。一般に、ニューロトロフィンは神経系、特にニューロンの成長、調節および維持に関与する蛋白である。現在のところ、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ４、ニューロトロフィン−５（ＮＴ５）またはＮＴ４／５と呼ばれることもある）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＴ）、および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）の少なくとも５種類の重要な神経栄養因子が知られている。本明細書において用語「汎親和性ニューロトロフィン」または「汎親和性神経栄養因子」、または文法的等価物は、天然に生じるニューロトロフィンとは異なり、多くのニューロトロフィン特異性を有するニューロトロフィンを意味する。すなわち、それは種々のニューロトロフィン特異性をもたらすドメインを含んでいる。ある態様では、これは本発明の汎親和性ニューロトロフィンが種々の神経栄養リセプターと結合するであろうことを意味している。したがって、例えば、ｔｒｋＡリセプターに対する天然もしくは本来のリガンドである天然に生じるＮＧＦは高親和性のｔｒｋＢまたはｔｒｋＣリセプターのいずれかと認め得るほどには結合せず、例えば、ＮＧＦはそれぞれＢＤＮＦまたはＮＴ３より５００〜１０００倍低いＫ_Dでこれらリセプターと結合する。しかし、汎親和性ＮＧＦ、すなわち、アミノ酸バックボーンがＮＧＦに基づいている汎親和性ニューロトロフィンは少なくともｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、およびｐ７５リセプターと結合するかも知れない。あるいはまた、汎親和性ＮＧＦはｔｒｋＡ、ｔｒｋＣ、およびｐ７５リセプターと結合するであろう。好ましい態様ではｔｒｋＢ、ｔｒｋＣ、およびｐ７５リセプターと結合することができる。同様に、ｔｒｋＢリセプターの天然のリガンドである天然に生じるＢＤＮＦおよびＮＴ４／５は上記のごとくｔｒｋＡまたはｔｒｋＣリセプターとは認め得るほどには結合しない。したがって、汎親和性ＢＤＮＦまたはＮＴ４／５は、ｔｒｋＢ、および汎親和性ＮＧＦについて既述したようなｔｒｋＡ、ｔｒｋＣ、およびｐ７５のあらゆる組合せとも結合するであろう。別の態様において、天然に生じるニューロトロフィンは、多くのニューロトロフィンリセプターとの結合親和性が乏しいであろう。この態様において、汎親和性ニューロトロフィンは、天然リガンドにみられる親和性と同様な、通常認められるより高い親和性でこれらのリセプターと結合する。例えば、ＮＴ３はｔｒｋＣと強く結合し、ｔｒｋＡおよびｔｒｋＢと弱く結合する。したがって、汎親和性ＮＴ３は正常な結合親和性でｔｒｋＣと結合し、そして天然ｔｒｋＡリガンドであるＮＧＦと同じ親和性でｔｒｋＡと結合するか、または天然ｔｒｋＢリガンドであるＢＤＮＦやＮＴ４／５またはその両方と同様の親和性でｔｒｋＢと結合するであろう。好ましい態様において、ニューロトロフィンリセプターに対する汎親和性ニューロトロフィンの結合親和性は天然リガンドの結合親和性の少なくとも約５０〜６０％、好ましくは約７５〜８０％、最も好ましくは約９０％である。したがって、汎親和性ＮＧＦは、それぞれＢＤＮＦもしくはＮＴ４／５またはＮＴ３の結合の少なくとも５０％でｔｒｋＢまたはｔｒｋＣリセプターと結合するであろう。この親和性は当業者に理解されている種々の方法で測定される。好ましい方法は、（84）および実施例２に記載の競合アッセイを使用することである。一般に、結合親和性はＩＣ₅₀、すなわち該リセプターに対する標識リガンドの結合の５０％を阻害する非標識競合物の濃度で示される。別の態様では、ニューロトロフィンの汎親和性は、ニューロトロフィンリセプターに対する結合親和性ではなく、ニューロン生存アッセイもしくは神経突起生長アッセイによって測定される。したがって、すべてのニューロトロフィンは胎児神経クレスト由来感覚ニューロンの生存を維持する(77),(78),(7),(17)。胎児交感ニューロンの生存はＮＧＦによってのみ維持されるが、プラコード（原基）由来感覚ニューロンの生存はＮＴ３とＢＤＮＦによって維持される(85)。背根神経節の感覚ニューロンの生存はＮＧＦとＢＤＮＦの両者によって維持される(13) 。ＮＴ３は背根神経節、交感鎖神経節、および結節性神経節からの感覚ニューロンの神経突起の生長を誘発し、結節性神経節ニューロンと背根神経節ニューロンの生存を維持する。したがって、ニューロン生存アッセイまたは神経突起生長アッセイを実施することにより汎親和性ニューロトロフィンの汎親和性を決定することができる。すなわち、ニューロトロフィン特異性は、ニューロトロフィンリセプター結合アッセイとニューロン生存アッセイ、および／または神経突起生長アッセイによって決定される。したがって、ＮＧＦ特異性を有する汎親和性ニューロトロフィンとは少なくともＮＧＦの結合特性、ニューロン生存アッセイ特異性、または神経突起生長アッセイ特異性を有するニューロトロフィンをいう。同様に、ＢＤＮＦ、ＮＴ３またはＮＴ４／５特異性を有する汎親和性ニューロトロフィンは、少なくともそれぞれＢＤＮＦ、ＮＴ３またはＮＴ４／５の結合特性、ニューロン生存アッセイ特異性、または神経突起生長アッセイ特異性を有する。さらなる態様において、汎親和性ニューロトロフィンは共有結合したヘテロダイマーを構築することによって作製される。通常、ニューロトロフィンは非共有結合的に連結している２つの同じモノマーからなるホモダイマーである。この態様では、以下に概説するように、汎親和性は種々の神経栄養親和性をもたらすドメインを含む各モノマーによって付与される。あるいはまた、異なる特異性を有する、２つの異なるニューロトロフィンを共有結合させることにより共有結合ヘテロダイマーを作製し、汎親和性を生じさせてよい。したがって、例えば、ＮＧＦモノマーはＮＴ３モノマーと共有結合することによりＮＧＦ特異性とＮＴ３特異性の両方を有する汎親和性ニューロトロフィンを生じさせてもよい。同様に、ＮＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ４／５、ＢＤＮＦ、またはＣＮＴＦのあらゆる組合せによって共有結合ヘテロダイマーを作製し、少なくとも２つの特異性を有する汎親和性ニューロトロフィンを作製してよい。さらに、この方法は、それ自身が汎親和性であり、汎親和性および単一特異性モノマーのあらゆる組合せの共有結合ダイマーを生じるモノマーを用いて実施してよい。すなわち、汎親和性共有結合ダイマーは２つの汎親和性モノマーのホモダイマーであってよい。しかし、本発明の定義中に含めるには、汎親和性共有結合ダイマーは少なくとも２つ、好ましくは３つのニューロトロフィン特異性を有する必要がある。共有結合的連結（共有結合）は、蛋白が発現する際に第一モノマーのＣ末端が第二モノマーのＮ末端と直接連結するように核酸を直接融合させ、該ダイマーをコードする単一の核酸を生成することが好ましい。別の態様において、例えばグリシンの短反復やグリシンとセリンの短反復のようなリンカーを使用してよく、例えば、gly-glyまたはgly-gly-ser-gly-glyのようなリンカーを使用してよい。これは当業者によく知られた技術を用いて行われる。蛋白を共有結合させるための他の技術は当該技術分野でよく知られている。汎親和性ニューロトロフィンはニューロトロフィンリセプター特異性または結合をもたらすドメインを含むことによって汎親和性結合や上記の汎親和性ニューロンの生存を達成する。ドメインは１または２通りに定義してよい。第一の態様において、ドメインはいくつかのニューロトロフィン特異性をもたらすニューロトロフィンの一部である。この態様では、汎親和性ニューロトロフィンの単一モノマーには異なる特異性をもたらす１またはいくつかのドメインが含まれる。該ドメインのサイズは単一アミノ酸から約１０〜１５アミノ酸の範囲であり得る。該ドメインは宿主ニューロトロフィンと異なるニューロトロフィンからのアミノ酸の組合せからなってよい。すなわち、１つのニューロトロフィンからのドメインが第二ニューロトロフィン内に置換され、第二ニューロトロフィンに対する汎親和性をもたらしてよい。あるいはまた、このドメインは下記のように存在するニューロトロフィンに対するホモロジーに基づかないアミノ酸置換体から生じてよい。好ましい態様において、該ドメインはアミノ酸の連続配列、すなわち、アミノ酸の単一ストレッチが置き換えられているものを含む。他の態様では、該ドメインは不連続アミノ酸を含んでいてよく、例えば、ニューロトロフィン内のいくつかの領域が特異性をもたらしてよく、したがって、汎親和性を示すためにニューロトロフィン内のいくつかの位置が置換する必要がある。ある態様において、特定のニューロトロフィンに依存する神経栄養特異性をもたらすことができるニューロトロフィン内の１つ以上のドメインがある。例えば、ＢＤＮＦはＢＤＮＦ特異性をもたらすと思われる多くのドメインを有する。本発明は、ＮＴ３中の単一アミノ酸の変化（１５位のアスパラギン酸のアラニンへの変化）がＮＴ３にＢＤＮＦ特異性をもたらすことを示している。このドメインを、ＮＧＦおよびＮＴ４／５配列のＮＴ３の１５位に対応する位置（すなわちＮＧＦの１６位またはＮＴ４／５の１８位）に導入することもできる。対応するアミノ酸は図８に示すように該配列の整合実験によって決定されるものと理解すべきである。該ドメインに加えて、ＢＤＮＦ特異性をもたらすＢＤＮＦ内の他のドメインがある。例えば、７８−８８位（ＱＣＲＴＴＱＳＹＶＲ）または９３−９９位（ＳＫＫＲＩＧ）からのＢＤＮＦ配列の置換はＢＤＮＦ特異性をもたらすかも知れない(55)。同様に、ＮＴ３は、異なるニューロトロフィン内に置換されることによりＮＴ３特異性をもたらすかも知れない多くのドメインを有する。ＮＴ３の多くの残基はＮＴ３ｔｒｋＣリセプター結合および生物活性アッセイにおいて重要であることが示されている。すなわち、Ｒ１０３、Ｄ１０５、Ｋ８０、Ｑ８３、Ｅ５４、Ｒ５６、Ｔ２２、Ｙ５１、Ｖ９７、Ｙ１１、Ｅ７、Ｒ８、Ｅ１０、およびＲ６８位の突然変異は、ＮＴ３のこれらの位置の突然変異はＮＴ３活性の低下をもたらすことから、すべてＮＴ３特異性に関与している。これらのうち、Ｋ８０、Ｑ８３、Ｔ２２、およびＶ９７は図８に示すように可変領域内にあり、残りは定常領域内にある。さらに、該残基近傍の残基がＮＴ３特異性をもたらすかも知れない。いくつかの態様において、定常領域の変化がＮＴ３特異性をもたらしてもよい。あるいはまた、Ｒ３１およびＥ９２位の突然変異はＮＴ３結合の増加をもたらした。すなわち、Ｒ３１ＡおよびＥ９２ＡＮＴ３はｔｒｋＣ結合の増加を示した。これらの突然変異は下記の手順を用いてＮＴ３を除くニューロトロフィン中に直接導入することができる。これらの位置のあらゆるアミノ酸を下記のごとく変化させてよい。ＮＧＦは異なるニューロトロフィン内に置換したときにＮＧＦ特異性をもたすかも知れない多くのドメインを有する。ＮＴ３のＮ末端残基をＮＧＦのＮ末端アミノ酸と置換すると、該アミノ酸はＮＧＦ特異性を与える。すなわち、ＮＴ３の６Ｎ末端アミノ酸（ＹＡＥＨＫＳ）をＮＧＦの７Ｎ末端アミノ酸（ＳＳＳＨＰＩＦ）で置換し、ＮＧＦ特異性を有する汎親和性ＮＴ３を生じさせてよい。ＮＧＦＮ末端残基の正確な数は決定的ではないが、実施例、特に実施例３に示すように４位のアミノ酸であるヒスチジンはＮＧＦ特異性にとってかなり重要であり、したがって、いくつかの態様では単一アミノ酸の変化で充分であろうが、約４〜約１０個のＮ末端残基を置換してよい。同様に、ＮＧＦの他の多くの残基はＮＧＦｔｒｋＡリセプター結合および生物活性アッセイに重要であることが示されている。例えば、突然変異したときにＮＧＦ活性を失う多くの残基がある。このことはＮＧＦ特異性に対するの該残基の重要性を示すものである。これらの残基には、Ｈ４、Ｐ５、Ｖ１８、Ｖ２０、Ｇ２３、Ｄ３０、Ｙ５２、Ｒ５９、Ｒ６９、Ｈ７５、Ｔ８１、およびＲ１０３が含まれるが、これらには限定されない。これらのうち、Ｄ３０、Ｒ５９、Ｙ７９、およびＴ８１は「可変領域」、すなわち、図８に示すように異なるニューロトロフィン間で変化する領域内にあり、残りは定常領域内にある。ある態様では、定常領域の残基は一般構造および特性に重要であり、特異性をもたらさないと思われるので、可変領域の残基がよりＮＧＦ特異性をもたらすようである。しかし、Ｄ１５Ａ突然変異について既述したように、定常領域の突然変異も特異性をもたらし得る。さらに、ＮＧＦ結合および／または生物活性を増大させるＮＧＦ中の多くのアミノ酸置換がある。したがって、これらの置換を他のニューロトロフィンバックボーン中に導入し、ＮＧＦ特異性をもたらしてよい。これら残基にはＥ１１、Ｆ１２、Ｄ２４、Ｅ４１、Ｎ４６、Ｓ４７、Ｋ５７、Ｄ７２、Ｎ７７、Ｈ８４、Ｄ１０５、およびＫ１１５が含まれるがこれらには限定されない。確認されたら、ニューロトロフィン特異性に重要な残基は、実施例に記載の技術およびよく知られた部位指向性突然変異誘発技術を用いてあらゆる他のアミノ酸残基と置換することができる。一般に、置換すべきアミノ酸は当業者に理解された特性に基づいて選ばれる。例えば、この特性の小さな変化を所望するときは、一般に以下の表に従って置換が行われる。機能または免疫学的同一性の実質的な変化は、表Ｉに示した置換より保存性の低い置換を選択することによってなされる。例えば、置換を行うことにより、変化領域のポリペプチドバックボーンの構造、例えばα−らせんまたはβ−シート構造、標的部位における分子の価電や疎水性、または側鎖の大きさにより有意な影響を与えるかも知れない。一般に、ポリペプチドの特性に最も大きな変化を生じると予測される置換は、（ａ）ある疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニル）をある疎水性残基（例えばシリルまたはトレオニル）で置換するか（またはその逆）、（ｂ）システインまたはプロリン以外の残基をシステインまたはプロリンで置換するか（またはその逆）、（ｃ）ある電気的陰性な残基（例えば、グルタミルまたはアスパーチル）を電気的陽性の側鎖を有する残基（例えば、リシル、アルギニル、またはヒスチジル）で置換するか（またはその逆）、または（ｄ）側鎖を持たない残基（例えばグリシン）を大きな側鎖を有する残基（例えばフェニルアラニン）で置換する（またはその逆）ような置換である。好ましい態様において、該残基はアラニン残基に変化する。各ニューロトロフィン内の他のドメインは本明細書に開示された技術を用いて見いだされるかも知れない。すなわち、実施例１のモデル化技術により推定上の特異性部位を同定することができる。さらに、ホモログ（相同体）スキャンニング突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発はすべて、推定上の汎親和性ニューロトロフィンを作製するのに使用してよく、次いで実施例に記載の技術や当該技術分野で知られた技術を用いてリセプターとの結合をスクリーニングしてよい。共有結合ヘテロダイマーに関して、ドメインは完全なニューロトロフィンモノマーを指してもよい。すなわち、汎親和性共有結合ヘテロダイマーはＢＤＮＦ特異性を与えるドメイン（すなわちＢＤＮＦモノマー）に共有結合したＮＴ３特異性をもたらすドメイン（すなわちＮＴ４モノマー）を含むことができる。同様に、ＮＴ３モノマーはＮＧＦモノマーとペアになるか、またはＮＧＦモノマーがＢＤＮＦモノマーとペアになってもよい。さらに、共有結合ヘテロダイマーはＮＴ４／５およびＣＮＴＦモノマーを用いて作製してもよい。これらの態様において、該ドメインは大きく、一般に野生型ニューロトロフィンアミノ酸配列のほとんどまたはすべてを含む。最も広い態様において、汎親和性ニューロトロフィンは少なくとも３種類の異なるニューロトロフィンリセプターと結合する。好ましい態様において、該汎親和性ニューロトロフィンは少なくとも４種類の異なるニューロトロフィンリセプターと結合する。本明細書において用語「ニューロトロフィンリセプター」またはその文法的等価物とはニューロトロフィンリガンドに結合するリセプターを意味する。いくつかの態様において、ニューロトロフィンリセプターは異なるニューロンポピュレーションの表面に発現している一般に「ｔｒｋ」リセプターと呼ばれる多くのチロシンキナーゼリセプターファミリーのメンバーである。ｔｒｋＡファミリーには、ｔｒｋＡ（ｐ１４０^trkとしても知られる）、ｔｒｋＢ（ｐ１４５^trkBとしても知られる）、およびｔｒｋＣ（ｐ１４５^trkCとしても知られる）が含まれるがこれに限定されるものではない。別の態様において、ニューロトロフィンリセプターはｐ７５または低親和性神経成長因子リセプター（ＬＮＧＦＲ）とも呼ばれるｐ７５^NGFRである。当業者に容易に確かめられるように、他のまだ発見されていないニューロトロフィンリセプターも本発明の汎親和性ニューロトロフィンに結合してもよいと理解すべきである。好ましい態様において、汎親和性ニューロトロフィンは汎親和性ＮＴ３である。この場合、汎親和性ＮＴ３は他のニューロトロフィン特異性をもたらすドメインを有する、ＮＴ３のアミノ酸配列とホモローガスなアミノ酸配列を有する汎親和性ニューロトロフィンである。好ましい態様において、ＮＴ３残基が該ドメインで置換される。すなわち、いくつかの番号のアミノ酸がＮＴ３配列から欠失し、同じまたは同様の番号のアミノ酸で置換され、さらに特異性をもたらす。例えば、ＭＮＴＳ−１（多神経栄養特異性−１）汎親和性ＮＴ３は、ＮＴ３の６個のＮ末端残基の、ＮＧＦの最初の７個のアミノ酸による置換とＤ１５Ａ置換を含む。他の汎親和性ＮＴ３はＮ末端中の最小限の変化によって作製される。例えば、Ｈ４とＰ５はＮＧＦ間で保存され、６および７位の２個の疎水性残基が保存されているので、以下の変異体、１）ＹＡＳＨＰＩＦ−ｈＮＴ３、２）ＹＡＨＰＩＦ −ｈＮＴ３、３）ＹＡＳＨＰＩＳ−ｈＮＴ３、４）ＹＡＥＨＰＩＦ−ｈＮＴ３、および５）ＹＡＱＨＰＩＦ−ｈＮＴ３が作製される。Ｄ１５Ａ置換が加わると、得られるニューロトロフィンはＮＧＦ、ＮＴ３、およびＢＤＮＦ特異性を有する。あるいはまた、ＮＴ３の可変領域２または３または４、もしくはその組合せをＮＧＦからの対応領域で置換すると、ＮＴ３およびＮＧＦ特異性の両方を有する汎親和性ニューロトロフィンが得られる。好ましい態様において、汎親和性ニューロトロフィンは汎親和性ＮＧＦである。この場合、汎親和性ＮＧＦは他のニューロトロフィン特異性をもたらすドメインを有する、ＮＧＦのアミノ酸配列とホモローガスなアミノ酸配列を有する汎親和性ニューロトロフィンである。好ましい態様において、ＮＧＦ残基は該ドメインで置換される。すなわち、いくつかの番号のアミノ酸がＮＧＦ配列から欠失し、同じまたは同様の番号のアミノ酸が置換され、さらに特異性がもたらされる。例えば、汎親和性ＮＧＦにおいて、ＢＤＮＦ特異性をもたらすＤ１６Ａ置換を行い、さらにプレ可変領域１（Ｖ１８Ｅ＋Ｖ２０Ｌ＋Ｇ２３Ｔ）および可変領域４（Ｙ７９Ｑ＋Ｔ８１Ｋ＋Ｈ８４Ｑ＋Ｆ８６Ｙ＋Ｋ８８Ｒ）において置換を行う。あるいはまた、プレ可変領域１の置換は可変領域４の単一アミノ酸のみを置換することによって行うことができ、例えば、Ｖ１８Ｅ＋Ｖ２０Ｌ＋Ｇ２３Ｔ、およびＹ７９Ｑ、Ｔ８１Ｋ、Ｈ８４Ｑ、Ｆ８６Ｙ、またはＫ８８Ｒの１つを行ってよい。ある態様において、汎親和性ニューロトロフィンは汎親和性ＮＴ４／５である。例えば、ＮＴ４／５の９個のＮ末端アミノ酸をＮＧＦの７個のＮ末端アミノ酸で置換することによってＮＴ４／５にＮＧＦ特異性を与えてよい。ある態様において、汎親和性ニューロトロフィンによるｐ７５リセプターへの結合は、実質的に減少または除去される。例えば、図２６に示すように、突然変異によってｐ７５結合が減少する、ｐ７５結合に関与する種々のアミノ酸残基がある。ＮＴ３のＲ６８、Ｙ１１、Ｋ７３、Ｒ１１４、Ｋ１１５、Ｙ５１、Ｋ７３、およびＨ３３位の突然変異、およびＮＧＦのＦ１２、１３１、Ｋ３２、Ｋ３４、Ｋ５０、Ｙ５２、Ｒ６９、Ｋ７４、Ｋ８８、Ｌ１１２、Ｓ１１３、Ｒ１１４、およびＫ１１５位の突然変異はすべて、Ｐ７５結合の減少をもたらす。Ｆ１２、Ｉ３１、Ｋ５０、Ｙ５２、Ｒ６９、およびＫ７４はすべて、図８に示すように該ニューロトロフィンの定常領域内にあるので、これらの変化は他のニューロトロフィンのｐ７５結合をも変化させるものと予想される。その他の残基を変化させてもよい。上記のアミノ酸変化に加えて、アミノ酸配列の可変性が該ニューロトロフィンの特異性や特性を変化させることなく許容される場合があることを当業者は理解する。すなわち、該汎親和性ニューロトロフィンは、野生型配列に比べて、汎親和性に影響しない、単なる配列の変異であるアミノ酸の置換、挿入、または欠失を有することができる。いくつかの態様において、これらの突然変異は特異性に重要であることが確認されている同じ位置内にみいだされよう。すなわち、ある場合では、ニューロトロフィン特異性を変化させることなく、中立的突然変異を行ってよい。本発明の汎親和性ニューロトロフィンは組換え技術を用いる種々の方法によって製造することができる。本明細書において用語「組換え核酸」とは、通常天然にはみいだされない形の核酸をいう。すなわち、組換え核酸は、天然では該核酸と側面を接しない核酸配列と側面を接するか、通常天然にはみられない配列を有する。組換え核酸は、制限エンドヌクレアーゼによる核酸の操作によるかまたはポリメラーゼ鎖反応のような技術を用いて最初にin vitroで形成させることができる。組換え核酸は、作製され、宿主細胞や有機体内に再導入されると、非組換え的、すなわちin vitro操作ではなく宿主細胞のin vivo細胞機構を用いて複製されるであろうが、一旦組換えによって作製されたそのような核酸は実質的に非組換え的に複製されるが、これも本発明の目的の組換え体とみなされる。同様に、「組換え蛋白」は組換え技術を用いて、すなわち上記の組換え核酸の発現を介して製造される蛋白である。組換え蛋白は、少なくとも１またはそれ以上の特性によって天然に生じる蛋白と区別される。例えば、該蛋白は、該蛋白、および通常その野生型宿主と関連する化合物のいくつかまたはすべてから単離してよい。この定義には、同じまたは異なる有機体または宿主細胞中のある有機体から汎親和性ニューロトロフィンを製造することが含まれる。例えば、例えば該蛋白レベルを増加させるような誘導性または高発現プロモーターを用い、該蛋白が誘導される同じ有機体中で、通常みられるより有意に高濃度で該蛋白を製造してよい。あるいはまた、該蛋白はエピトープｔａｇの付加やアミノ酸置換、挿入、および欠失といった、通常天然にはみられない形であってよい。汎親和性ニューロトロフィンをコードする本発明の核酸を用いて、種々の発現ベクターが作製される。この発現ベクターは自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノム内に統合されるベクターのいずれかであってよい。一般に、発現ベクターは、汎親和性ニューロトロフィンをコードしている核酸と機能的に結合している転写および翻訳調節核酸を含んでいる。この場合の「機能的に結合する」とは、転写が開始されるように、転写および翻訳調節ＤＮＡが汎親和性ニューロトロフィンのコード配列に対して位置することをいう。一般に、これはプロモーターおよび転写開始もしくは出発配列が汎親和性ニューロトロフィンコード領域の５ ’側に位置することを意味しよう。該転写および翻訳調節核酸は、一般に汎親和性ニューロトロフィンを発現させるのに用いる宿主細胞に適切であり、例えば哺乳動物細胞からの転写および翻訳調節核酸配列は、哺乳動物細胞中に汎親和性ニューロトロフィンを発現させるのに用いられよう。種々の宿主細胞において多くの種類の適切な発現ベクターおよび適切な調節配列が当該技術分野で知られている。一般に、該転写および翻訳調節配列には、プロモーター配列、シグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終止配列、翻訳開始および終止配列、末端およびポリＡシグナル配列、およびエンハンサーまたはアクチベーター配列を含んでいてよいが、これには限定されない。好ましい態様において、調節配列はプロモーター、および転写開始および終止配列を含む。プロモーター配列は構成的または誘導性プロモーターのいずれかをコードしている。１以上のプロモーターのエレメントと結合するハイブリッドプロモーターは当該技術分野でも知られており、本発明において有用である。さらに、発現ベクターはさらにエレメントを含んでいてよい。例えば、発現ベクターは２つの複製系を持っていてよく、したがって２種類の有機体中、例えば発現させるために哺乳動物細胞中、およびクローニングと増幅のために原核生物宿主中で維持されてもよい。さらに、発現ベクターを統合するために、発現ベクターは宿主細胞ゲノムとホモローガスな少なくとも１つの配列、好ましくは発現構造物の隣に位置するホモローガスな２つの配列を含む。統合ベクターは、該ベクターに包含するのに適したホモローガスな配列を選択することによって宿主細胞中の特定の座を指向してよい。さらに、好ましい態様において、発現ベクターは形質転換宿主細胞の選択を許す選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当該技術分野で知られており、用いる宿主細胞によって異なるであろう。本発明の汎親和性ニューロトロフィンは、該汎親和性ニューロトロフィンの発現を誘導させるかまたは発現させる適切な条件下で、汎親和性ニューロトロフィンをコードしている核酸を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって生成することができる。汎親和性ニューロトロフィンの発現に適した条件は選択する発現ベクターと宿主細胞によって異なるであろうし、当業者に容易に確認されよう。例えば、発現ベクターに構成的プロモーターを使用するには宿主細胞の成長と増殖の最適化が不可欠であり、一方、誘導性または抑制性プロモーターを使用するには誘導または脱抑制をもたらす適切な成長条件が不可欠である。好ましい態様において、汎親和性ニューロトロフィンは発現後に精製もしくは単離される。汎親和性ニューロトロフィンは試料中にどのような他の成分が含まれているかによって、当業者に知られた種々の方法によって単離または精製してよい。標準的精製法には、イオン交換、疎水性、アフィニティ、ならびに逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー、およびクロマトフォーカシングを含むクロマトグラフィー、電気泳動、分子、および免疫学的技術が含まれる。蛋白濃縮、ならびに限外濾過および透析技術も有用である（適切な精製技術に関する一般的手引書（５７）参照）。必要な精製度は汎親和性ニューロトロフィンの使用法に応じて異なるであろう。場合によっては精製する必要はないであろう。適切な宿主細胞には、酵母、細菌、原始細菌、糸状菌のようなカビ、植物細胞、および哺乳動物細胞を含む動物細胞が含まれる。特に興味がもたれるものには、Saccharomyces cerevisiaeならびに他の酵母、E.coli、Bacillus subtilis、P ic hia pastoris、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、Neurospora、およびＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ細胞、不死化哺乳動物骨髄様およびリンパ様細胞系がある。好ましい宿主細胞は哺乳動物細胞であり、最も好ましい宿主細胞にはＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞、およびヒト胎児腎細胞系２９３である。好ましい態様において、本発明の汎親和性ニューロトロフィンは哺乳動物細胞中に発現される。哺乳動物発現系も当該技術分野で知られている。いくつかの遺伝子はイントロンが存在するときにより効率的に発現されるかもしれない。しかし、多くのｃＤＮＡはスプライシングシグナルを欠くベクターから効率的に発現されている。したがって、いくつかの態様において、汎親和性ニューロトロフィンをコードしている核酸にはイントロンが含まれる。哺乳動物宿主および他の宿主に外来性核酸を導入する方法は当該技術分野でしられており、用いる宿主細胞によって異なるであろうし、デキストラン介在トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン介在トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポーレーション、リポソームへのポリヌクレオチドのカプセル化、および核内へのＤＮＡの直接注入が含まれる。ある態様において、汎親和性ニューロトロフィンは酵母細胞に導入される。酵母発現系は当該技術分野でよく知られており、Saccharomyces cerevisiae、Cand ida albicans、およびC.maltosa、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces fragi les、およびK.lactis、Pichia guillerimondii、およびP.pastoris、Schizosacc haromyces pombe、およびYarrowia lipolyticaが含まれる。酵母宿主および他の宿主内に外来性核酸を導入する方法は当該技術分野で知られており、用いる宿主細胞によって異なるであろう。好ましい態様において、汎親和性ニューロトロフィンは細菌系に発現される。細菌のための発現ベクターは当該技術分野でよく知られており、特にBacillus s ubtilis、E.coli、Streptococcus cremoris、およびStreptococcus lividansのためのベクターが含まれる。細菌発現ベクターは、塩化カルシウム処理やエレクトロポーレーションその他のような当該技術分野でよく知られた技術を用いて細菌宿主細胞中に形質転換される。ある態様において、汎親和性ニューロトロフィンは昆虫細胞中で生成される。昆虫細胞を形質転換するための発現ベクター、特にバクロウイルスベースの発現ベクターは当該技術分野でよく知られている。バクロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料と方法はキットの形（例えば「MaxBac」キット(Invitrogen，San D iego)）で市販品として利用可能である。昆虫細胞への感染用に組換えバクロウイルス発現ベクターが開発されている。例えば、組換えバクロウイルスは、Aedes aegypti、Autographa californica、B ombyx mori、Drosophila melangaster、Spodoptera frugiperda、およびTrichop lusia ni用に開発されている。発現した汎親和性ニューロトロフィンは神経栄養因子として使用される。この汎親和性ニューロトロフィンは種々の診断的および治療的用途に応用してよい。本発明の汎親和性ニューロトロフィンはニューロトロフィンリセプターを検出するための診断法に有用である。例えば、本発明の汎親和性ニューロトロフィンは標識されてもよい。本明細書において、「標識汎親和性ニューロトロフィン」とは、汎親和性ニューロトロフィン、またはニューロトロフィンリセプターに結合した汎親和性ニューロトロフィンを検出することができるように、少なくとも１つのエレメント、放射性同位元素、または化学的化合物が結合している汎親和性ニューロトロフィンをいう。一般に、標識は、ａ）放射活性もしくは重同位元素であってよい同位元素標識、ｂ）抗体または抗原であってよい免疫標識、およびｃ）着色もしくは蛍光色素の３種類に分けられる。これら標識は汎親和性ニューロトロフィンのあらゆる位置に取り込まれてもよい。標識された汎親和性ニューロトロフィンは、in vitroまたはin vivoでニューロトロフィンリセプターを検出するのに用いられる。例えば、ニューロトロフィンリセプターの存在は診断に有用なある細胞種の存在を示すことができる。すなわち、ある細胞種のサブポピュレーションは、標識汎親和性ニューロトロフィンが該リセプターを介して細胞に結合することによって示されるかも知れない。さらに、本発明の汎親和性ニューロトロフィンは、ニューロトロフィンアッセイの標準品として有用である。例えば、いかなる特定のアッセイにおける汎親和性ニューロトロフィンの活性も既知のニューロトロフィン標準品を用いて検出してよく、したがって該汎親和性ニューロトロフィンをニューロトロフィンの診断および定量に用いてよい。さらに、多くの神経細胞培養が成長因子を必要とするため、本発明の汎親和性ニューロトロフィンはin vivoで神経細胞を培養するための培養培地成分として有用である。当業者が理解するであろうように、本発明の汎親和性ニューロトロフィンは、培地成分としてしばしば用いられる他の神経栄養因子と置き換えることができる。加える汎親和性ニューロトロフィンの量は標準的アッセイを用いて容易に決定することができる。本発明の汎親和性ニューロトロフィンは有機体または患者内のニューロトロフィンまたはニューロトロフィン抗体の診断、同定、および局在部位の測定に用いることができる抗体を産生するのにも有用である。例えば、汎親和性ニューロトロフィンを用いて、当業者によく知られているようにポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作製することができる。次いで該抗体を標識し、ニューロトロフィンの存在もしくは非存在を検出するのに用いることができる。したがって、ニューロトロフィンに関連する神経障害を診断することができるかも知れない。例えば、一次抗体をマウスまたはウサギで作製し、次いで標識抗マウスまたは抗ウサギ抗体を用いて一次抗体が検出される。これらの方法のいずれかおよび当業者によく知られた同様の方法によって種々の組織中のニューロトロフィンを検出することができる。さらに、本発明の汎親和性ニューロトロフィンに対して生じた抗体は、ニューロトロフィンおよび汎親和性ニューロトロフィンを精製するのにも有用である。一般に、汎親和性ニューロトロフィンのアミノ酸置換は小さいので、該ニューロトロフィンと汎親和性ニューロトロフィンは多くの免疫エピトープを共有している。したがって、汎親和性ニューロトロフィンに対して生じた抗体は天然に生じるニューロトロフィンと結合するであろうし、したがって精製に有用である。例えば、アフィニティクロマトグラフィ技術に基づく精製計画は当該技術分野でよく知られている。好ましい態様において、本発明の汎親和性ニューロトロフィンは神経障害を治療するために患者に投与される。本明細書において「神経障害」とは、ニューロンの変性や損傷に関連する中枢および／または末梢神経系の障害をいう。神経障害の具体的な例として、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、卒中、ＡＬＳ、末梢ニューロパシー、および外傷、火傷、腎機能不全もしくは傷害によって損傷した神経の治療に加えて、中枢、末梢、または運動ニューロンのニューロンの壊死または減少を特徴とする他の状態が挙げられるがこれには限定されない。例えば、糖尿病、ＡＩＤＳまたは化学療法に関連するニューロパシーのようなある状態に関連する末梢ニューロパシーを、本発明の汎親和性ニューロトロフィンを用いて治療してよい。さらに、ＮＴ３を投与することにより、アルツハイマー病と細胞の減少パターンが似ているモデルにおけるコエルルス座の成熟中枢ノルアドルナリン作動性ニューロンのin vivoにおける変性が予防される(86)。さらに、ＮＴ３の添加は発達中および成体の脊髄障害後の皮質脊髄路の急速な生長を促すことが示されている(58)。実際に、ミエリン関連成長阻害蛋白を阻害する抗体と共にＮＴ３を投与すると、長期にわたる再生が認められた。したがって、この用途ではＮＴ３の代わりに本発明の汎親和性ニューロトロフィンを用いることができる。この態様では、汎親和性ニューロトロフィンの治療的有効量が患者に投与される。本明細書において「治療的有効量」とは、投与により効果が生じる用量をいう。的確な量は治療すべき障害に依存し、既知の技術を用いて当業者に確認されよう。一般に、本発明の汎親和性ニューロトロフィンは約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日で投与される。さらに、当該技術分野で知られているように、年齢、体重、一般健康状態、性別、食事、投与する時、薬剤の相互作用、および疾病の重症度による調節が必要かも知れず、これらは当業者によって日常的実験法により確認されよう。本発明の目的の「患者」には、ヒトならびに他の動物および有機体が含まれる。すなわち、この方法はヒトの療法と獣医学的用途に応用可能である。本発明の汎親和性ニューロトロフィンの投与は、経口、皮下、静脈内、脳内、鼻腔内、経皮、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内、直腸内、もしくは眼内を含む種々の経路で行うことができるがこれらに限定されない。汎親和性ニューロトロフィンは、ボーラス注射に耐え得るが、ポンプや埋め込み物のような当該技術分野でよく知られた技術を用いてＣＮＳの液リザーバー内に注入することによって連続的に投与してよい。場合によっては、例えば創傷の治療において、汎親和性ニューロトロフィンは溶液またはスプレーとして直接適用してよい。本発明の医薬組成物は、患者に投与するのに適した形の汎親和性ニューロトロフィンを含む。好ましい態様において、該医薬組成物は水溶性の形であり、担体、賦形剤、安定化剤、緩衝剤、塩、抗酸化剤、疎水性ポリマー、アミノ酸、炭水化物、イオン性または非イオン性界面活性剤、およびポリエチレンもしくはプロピレングリコールのような物が含まれていてよい。汎親和性ニューロトロフィンは埋め込み物のための時間放出型であってよく、また当該技術分野でよく知られた技術を用いてマイクロカプセル内に封入してもよい。以下の実施例において、上記の本発明の使用法をより充分に説明し、本発明の種々の目的を実施するための予期される最良の方法を示す。この実施例は例示のために示すのであって、本発明の本質的な範囲を何等制限するものではないと理解される。実施例実施例１突然変異分析のためのＮＴ−３の分子モデリングと標的の同定マウスＮＧＦの三次元構造の対等物はN.Q.McDonaldとT.L.Blundellから得た。ヒトＮＴ−３の分子モデリングは対話式プログラムのInsightIIを用いてSilicon Graphics Iris Workstationによって行った。ＮＴ−３構造の表示はMidasPlus プログラム（University of California at San Francisco）を用いて作製された。マウスＮＧＦ（ｍＮＧＦ）の三次元構造が利用可能になることで(59)、蛋白工学技術を用いる神経栄養機能の構造的根拠への合理的なアプローチが可能となった。ｍＮＧＦの構造は２つの同じアミノ酸ポリペプチド鎖が密に結合したダイマーからなる。各モノマーの折り畳みは、ターンによって結合した捻れた逆平行β −シートの伸張部分によって形成される。この分子は伸張した形状を有し、結合したモノマーのインターフェイスを形成する平らな疎水性表面をもたらす(59)。この構造の顕著な特徴は、現在システイン−ノットモチーフとして知られているジスルフィド結合の配置である(60)。このモチーフは、このモチーフ以外には関連のないＴＧＦ−β(61);(60)およびＰＤＧＦ−ＢＢ(87)にもみいだされる。アミノおよびカルボキシ末端および残基４３〜４８のループを含むｍＮＧＦ構造のいくつかの領域は充分に定義されていないが、柔軟性の高い構造エレメントを示している。ヒトＮＴ−３（ｈＮＴ−３）の配列はｍＮＧＦと５６％が同一であり、７０％が同様である（図１）。配列の違いは、構造的に定義されていないＮ末端および残基４３〜４８のループ領域に集中している。システイン残基の相対位置はニューロトロフィンファミリーのすべてのメンバーと同様に保存されており、ｈＮＴ −３の同様のシステイン−ノットモチーフの存在を示唆する。ｈＮＴ−３およびマウスＮＧＦの配列の類似性は、それら配列がともに同じ基本３次元折り畳みを共有することを示唆し、したがってｍＮＧＦはｈＮＴ−３モデルの骨格として用いられた。モデル構築の第２段階において、ｍＮＧＦとｈＮＴ−３の間で異なっていた側鎖をInsightIIプログラム（Biosym Technology，SanDiego，CA）を用いてｈＮＴ−３アミノ酸と置換した。可能であれば、ｈＮＴ−３側鎖の構造はｍＮＧＦのそれと同様に保持され、そうでない場合は該構造はロータマー（rotamer ）ライブラリー(62)、パッキング、および水素結合の検討に基づいた。最後に、Ａｓｎ９３の挿入、次いでループ９３−９５の調整はProtein Data Bankの結晶構造の研究から突きとめられた(63)。最終モデルは１０４アミノ酸からなり、６個のN末端（Ｔｙｒ１−Ｓｅｒ６）、４個のＣ−末端（Ｉｌｅ１１６−Ｔｈｒ１１９）および５個のループ残基（Ｇ４４−Ｖ４８）を含んでいない。このモデルによって、重要な構造的状況に関与すると思われる残基の確認することができ、該残基を突然変異分析から除外することができた。該残基はインターフェース（Ｗ２０、Ｆ５２、Ｙ５３、Ｗ９９、Ｗ１０１）、構造的に重要な水素結合もしくは疎水性の接触（Ｓ１２、１３０、Ｑ５０、Ｐ６２、Ｓ８３、Ｒ１００、Ｔ１０６、Ｓ１０７）、またはジスルフィド結合（Ｃ１５、Ｃ５７、Ｃ６７、Ｃ７９、Ｃ１０８、Ｃ１１０）のいずれかに関与するか、蛋白内部に埋め込まれていた（Ｖ１３、Ｓ１６、Ｓ１８、Ｖ２１、Ｄ２９、１３０、Ｖ３５、Ｖ３７、Ｉ１０２、Ｉ１０４）。しかし、場合によってはこれらの残基を変化させることが望ましいであろう。さらに、グリシンおよびアラニン残基はＧｌｙ４４を除いて変化しなかった。ｍＮＧＦ／ｔｒｋＡ相互作用に関する関連研究とは対照的に、複数の残基が置換(53)(56)(55)されるかまたは残基が欠失(49)するよりも、主にアミノ酸の単一残基またはペアが置換された。残基はほとんどアラニンに変化した(64)。場合により、リセプターリガンド相互作用に対する立体障害を潜在的に生じるような構造中への置換物としてより大きなアミノ酸を設計することが可能であった。突然変異体の最初のセットは、表面が露出しており、従ってｔｒｋＣおよびｇｐ７５リセプターとの結合に潜在的に関与する、主としてβ鎖に位置する保存された残基と保存されていない残基をプローブした。ＮＧＦ機能について提唱された現在の仮説(55)によれば、β鎖とその末端をつなぐループに位置する互いに異なる（divergent）残基はリセプター結合および特異性の主要な決定基である。ｈＮＴ−３突然変異体の第２セットではｈＮＴ−３とそのリセプターの相互作用に対する該残基の重要性を評価した。突然変異体の全セットは本質的にＮＴ−３分子の全表面に及んだ。実施例２ＮＴ３および汎親和性ＮＴ３の特異的アミノ酸置換の生成ヒトＮＴ−３は以前にクローンされ、配列決定され、ｐＲＫ型ベクター中にサブクローンされ、E.coliに２本鎖および１本鎖ＤＮＡを産生させ、そしてサイトメガロウイルスプロモーターの調節下で、哺乳動物系に成熟ＮＴ−３を発現させた(65)。このベクターにおける突然変異誘発はKunkel(66)(67)の方法に従って行われた。E.coli XL1-Blue株中に形質転換した後、Sequenaseバージョン２．０キット（U.S．Biochemical Corp.）を用いる１本鎖ＤＮＡ配列決定により所望の突然変異が存在するかをスクリーニングした。すべての陽性クローンにおいて成熟ＮＴ−３の完全なコード配列が証明された。ＱＩＡＧＥＮＤＮＡ精製キット（Qia gen Inc.，Chatsworth CA）を用いて、XL-1 Blueから２本鎖ＤＮＡが分離された。次いで、このＤＮＡはヒト胎児腎細胞系２９３をトランスフェクションするために使用された(68)。すべての他の組換えＤＮＡ操作は記載に従って実施された (69)。よく知られた技術を用いてすべての突然変異体のためのプライマーを作製した。Ｄ１５Ａ突然変異のためのプライマーは５’−ＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＴＧＧＣＡＣＡＴＡＣＣＧＡＧ−３’（配列番号７）であり、Ｓ１突然変異体のためのプライマー（ＮＧＦの７個のＮ末端アミノ酸に対するＮＴ３の６個のＮ末端アミノ酸のＮ末端スワップ）は５’−ＧＴＡＣＴＣＣＣＣＴＣＧＧＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＣＴＣＧＡＧＧＡＣＣＧＴＴＴＣＣＧＣＣＧＴＧ−３’（配列番号８）であった。野生型および突然変異体ニューロトロフィンの発現ｈＮＴ−３または突然変異体ｈＮＴ−３をコードする配列のいずれかを含むプラスミドＤＮＡをカルシウムリン酸沈澱によりヒト胎児腎細胞系２９３中に導入した(70)。７５％コンフルエントの細胞をプラスミドＤＮＡ１０μｇ／１５ｍｍ細胞培養皿でトランスフェクトし、血清加培地中で１５時間培養した。次に、この培地を除去して組換えウシインスリン１０ｍｇ／Ｌ、トランスフェリン１ｍｇ／Ｌ、および微量元素を添加した無血清培地（ＰＳＯ４）に交換した。４８および９６時間後に上清を回収し、セントリプレップ−１０ろ過装置（Amicon,Berve rly MA）で約２０倍濃縮し、ろ過滅菌した。ニューロトロフィン突然変異体の定量特異的ｈＮＴ−３ＥＬＩＳＡは、モルモットからのプロテインＡ精製ポリクローナル抗血清（Genentech）に基づいた。９６ウェルプレート（MaxiSorp，Nunc ，Kamstrup，Denmark）の各ウェルを０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中の４μｇ／ｍＬ抗血清１００μＬで４℃にて一夜コーティングした。ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０１％チメロサール、ｐＨ７．４）を用いる１時間のブロッキング工程の後、ウェルをＥＬＩＳＡ緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％ツイーン２０＋０．０１％チメロサール、ｐＨ７．４）で６回洗浄した。未知の濃度のｈＮＴ−３突然変異体試料または精製組換えｈＮＴ−３を容量１００μＬまでＥＬＩＳＡ緩衝液で希釈し、ウェルに加えた。連続的に振とうさせながら、プレートを室温で２時間インキュベーションした。ＥＬＩＳＡ緩衝液で洗浄した後、ウェルをビオチニル化抗ｈＮＴ−３抗体（Gene ntech）１００μＬと２時間インキュベーションし、次いでＥＬＩＳＡ緩衝液で洗浄した。１：５００００希釈のストレプトアビジン／ホースラディッシュパーオキシダーゼ（Zymed,43-4323）１００μＬをウェルに加えて３０分間インキュベーションし、次いでＥＬＩＳＡ緩衝液で洗浄した。最後に、０．０１２％Ｈ₂ Ｏ₂、および０．０４％O-フェニレンジアミンを含むＰＢＳ溶液１００μＬを用いて１５〜２０分間発色させた。４．５ＮＨ₂ＳＯ₄５０μＬを加えて反応を止めた。Ｖｍａｘカイネティックマイクロプレートリーダー（Molecular Devices ，Palo Alto CA）により４９０ｎｍと４０５ｎｍで吸光度を測定した。５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３、１．５６、および０．７８ｎｇ／ｍＬの濃度の精製組換えｈＮＴ−３（Genentech）を用いて標準曲線を決定した。未知のＮＴ−３濃度の試料を1:10、1:30、1:90、1:270、1:810、1:2430、1:7290、および1:21870に連続希釈し、試料あたり複数のデータポイントを得た。標準蛋白のアッセイから得られたデータポイントを４パラメータに適合させる操作を用いて標準曲線を決定した。濃縮後のＮＴ−３突然変異体の量は１２０ｎｇ／ｍＬ〜３６μｇ／ｍＬであった。ＥＬＩＳＡアッセイではモックトランスフェクト細胞からの上清中にＮＴ− ３は検出されず、ＮＧＦトランスフェクト細胞の上清からの組換えヒトＮＧＦとも交差反応しなかった（データ示さず）。ＮＴ−３突然変異体の各発現セットについて、天然ｈＮＴ−３発現を行い、同時にＥＬＩＳＡにより定量し、リセプター結合試験のための比較ｗｔ濃度を得た。すべての突然変異体は少なくとも２回発現させ、定量し、アッセイした。ヨー素化精製組換えｈＮＴ−３、ｈＢＤＮＦ、およびｈＮＧＦ（Genentech）はEnzymob ead放射性ヨー素化試薬（Bio-Rad）法の改良法を用いるラクトパーオキシダーゼ処理によって標識された(71)。通常、ニューロトロフィン２μｇを３０００〜３５００ｃｐｍ／ｆｍｏｌの範囲の比活性となるようヨー素化した。標識物質を４ ℃で保存し、製造から２週間以内に使用した。結合アッセイ安定なラットｔｒｋＣ発現細胞系（NIH3T3/trkC、(26)）からの膜を作製するために細胞ベースの結合アッセイを用いた。以前の記載に従って競合置換アッセイを行なった(26)。デュプリケートのデータポイントセットを用いて複数の発現のそれぞれについてｔｒｋＣリセプターに対する突然変異体の結合親和性を２回アッセイした。この方法によって各突然変異体に関する親和性の測定誤差を推定することができた。一過性の発現細胞からの非精製組換えＮＴ−３の、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に発現したｔｒｋＣリセプターからの１２５−Ｉ標識ＮＴ−３と置換する能力を精製ＮＴ−３と比較した。いずれも非精製ＮＴ−３および精製ＮＴ− ３に対する同様のＩＣ−５０：７ｐＭおよび９ｐＭで標識ＮＴ−３と置換した。このことは、発現２９３細胞の上清からの非精製ＮＴ−３が正確に定量され、次いでリセプター結合試験に用いられ得ることを示した。結合アッセイの特異性はＮＧＦ、ＢＤＮＦ、およびモックトランスフェクト細胞上清がｔｒｋＣからの結合標識ＮＴ−３と置換することができないことによって証明された（データ示さず）。免疫グロブリンの定常ドメインと融合したｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、ｔｒｋＣ、およびｇｐ７５細胞外ドメインを用いてリセプターイムノアドヘシン蛋白が構築された（Genentech、未発表の結果）。９６ウェルプレート（Corning，ELISAウェルストリップ）をコーティング緩衝液中の５μｇ／ｍＬヤギＦ（ａｂ'）₂抗ヒトＦｃＩｇＧ（Organon Technika，West Chester，PA）１００μＬで４〜８℃にて１５時間コーティングした。ウェルを吸引し、ＰＢＳで３回洗浄し、結合緩衝液（５ｍg／ｍＬＢＳＡ（Intergen，Purchase，PA）、０．１ｍｇ／ｍＬウマ加熱シトクロームＣ（Sigma）、および２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２を加えた Leibovitz's L-15培地）中の４０ｎｇ／ｍＬリセプターイムノアドヘシン蛋白溶液１００μＬと２時間インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄した後、乾燥を防ぐためウェルに速やかに結合緩衝液５０μＬを加えた。天然および突然変異体蛋白ストック溶液をそれぞれ結合緩衝液で連続希釈し、４０９６〜２ｐＭの濃度範囲を得た。ウェルあたり連続希釈液２５μＬ、次いで標識ニューロトロフィン２５μＬを加えた。各ウェルの標識ニューロトロフィンの最終濃度はｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、およびｔｒｋＣアッセイで約５０ｐＭ、ｇｐ７５結合アッセイで１００ｐＭであった。室温で３時間インキュベーションした後、ウェルをＰＢＳ＋０．５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、結合した放射活性をカウントした。すべての置換実験はKaleidagraphソフトウェアパッケージを用いてデータセットに対して４パラメータ適合法を適用することによって分析された。全ての結合を棒グラフで示し、ＩＣ−５０mut/IC-50wtで表している。神経栄養因子によるＰＣ１２細胞系におけるｔｒｋリセプターの自己リン酸化の刺激約１×１０⁷個の細胞を２５ｎｇ／ｍｌニューロトロフィンで３７℃にて５分間処理した。抗血清４４３（pan-trk）または６５６（trkC特異的）によるＮＰ −４０プレート分解および免疫沈降は以前の記載に従って行なった(26)。ホスホチロシン含有量は以前の記載に従ってモノクローナル抗体４Ｇ１０を用いるウエスタントランスファーにより分析された(23)。４Ｇ１０は以前の記載のごとく検出された(26)。ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣ発現ＰＣ１２およびＰＣ１２細胞の分化アッセイ種々のｔｒｋファミリーメンバー（ｔｒｋＣ；(26)ｔｒｋＢ；Soppet、未公表の研究）を発現する約１０³個のＰＣ１２細胞を、総量２ｍＬの培地を含む３５ｍｍコラーゲンコーティング組織培養皿にいれた。ｔｒｋＣ発現ＰＣ１２細胞を３種類の異なる濃度（１０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬ）でアッセイし、ｔｒｋＡのみを発現する親ＰＣ１２細胞またはｔｒｋＢを発現するＰＣ１２細胞をＮＴ−３突然変異体の上清１０ｎｇ／ｍＬで処理した。各処理につき少なくとも２００個の細胞をカウントした。３〜４日後に細胞体の長さの少なくとも２倍の突起を有する細胞の数を数えることにより、神経突起を有する細胞の割合を決定した。胎児細胞とニューロン培養の解剖異なる発生段階にあるニワトリ胎児は、３８℃で所望の時間ふ卵器内で白色レグホンニワトリ卵（SPAFAS，Reinhold，PA）をふ卵することによって得られた。背根神経節、８日齢胎児からの結節性神経節（Ｅ８）、および１１日齢胎児からの交感神経節（Ｅ１１）を、時計修理用ピンセットと電気分解によってとがらしたタングステン針を用いて１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むLeibowit z-15（L-15）培地中で解剖した。ニワトリ胎児神経節を３７℃で２０分間トリプシン処理し、次いで培養培地（１０％加熱不活化ウマ血清および５％加熱不活化ウシ胎児血清含有Ｆ１４）で洗浄し、火炎仕上げしたピペットで静かにトリチュレートし、単細胞懸濁液を得た。ニワトリ胎児細胞を２ｎｇ／ｍＬまたは本文に記載の濃度のニューロトロフィン存在下、培養培地２ｍＬを入れたポリオルニチン（０．５ｍｇ／ｍＬ０．１５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．６）、一夜）およびアミニン（２０ｍＬ／ｍＬ、３７＿Ｃ、４〜６ｈｒ）でコーティングした３５− ｍｍ皿上に置いた。７２時間後に、各皿の中心の５×５−ｍｍグリッド内のニューロンの形態を有するすべての細胞を数えた。結果を表３および４に示す。実施例３Ｎ末端ＮＧＦ変異体の作製、精製、および特徴づけ多くの荷電および非荷電残基が他の動物種のＮＧＦ蛋白間に保存されている。特に、Ｈｉｓ４、Ｐｒｏ５、およびＨｉｓ８は８個の知られたＮＧＦ配列の７個中に保存されており、Ａｒｇ９はヒトとニワトリのＮＧＦにのみ存在するが、他の動物種のＮＧＦのこの位置ではＭｅｔが優勢である。１）ｈＮＧＦのＮ末端の荷電した残基のいくつかが個々にまたは一緒にアラニンで置換されるか、２）Ｈｉｓ４が、Ｎ末端ｈＢＤＮＦ配列の３位にある負に荷電したアスパラギン酸で置換されるか、または３）それぞれｈＢＤＮＦまたはｈＮＴ３の最初の５〜６残基またはｈＮＴ３の他の可変領域を含むキメラｈＮＧＦ分子を生じるオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発によって１０の突然変異が生じた。得られる突然変異体構築物はヒトＣＭＶプロモーター(70)を含むベクターにおいて生じ、下記のごとくヒト２９３細胞中に一過性に発現した。精製組換え（１−１１８）、（６−１１８）、（１０−１１８）は、Burtonら（1992）(48)およびKahleら（1992）(49)の記載に従って逆相ＨＬＰＣおよび高速イオン交換クロマトグラフィーを用いてトランスフェクトＣＨＯ細胞系順化培地から精製され、Ｎ末端配列分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびアミノ酸分析によって特徴づけられた（データ示さず）。これら処理された変異体は、まだ特徴付けられていない蛋白分解酵素またはプロセッシング経路によってＣＨＯ細胞培地の順化中にin situ蛋白分解によって生じる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づく各型の純度は９９％であり、その濃度は定量アミノ酸分析によって決定された。Ｈ４Ｄ突然変異体２（培地３００ｍＬから２０μｇ）およびＮ末端ｈＮＴ３／ｈＮＧＦ突然変異体６（培地３００ｍＬから５μｇ）の精製および分析は、Ｎ末端トランケート変異体について記載したようにトランスフェクト２９３細胞（下記参照）で順化した無血清培地から行なった。突然変異誘発は、RioRad Muta-Geneキット(66)（BioRad，Richmond，CA）に記載の、改良されたオリゴヌクレオチド指向法によって行なわれた。突然変異は鎖終止法による１本鎖ファージミッドクローンのＤＮＡ配列決定によって確認された(73)。ｈＮＧＦ突然変異はヒト２９３細胞の一時的なトランスフェクション後に順化培地中に発現した(68)(70)。回収に用いた培地は、Ｎ２添加物を含む５０：５０Ｆ１２／ＤＭＥＭ無血清培地であり、４８時間後に無血清培地中に回収された。Amiconコンセントレーターを用いて順化培地を１０倍濃縮した。ｈＮＧＦ突然変異体の濃度は、精製ウサギ抗ｈＮＧＦポリクローナル抗体を用いる酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定された。各突然変異体の濃度は３〜８μ ｇ／ｍＬの間で変動した。各突然変異体は少なくとも３回発現され、濃度はＥＬＩＳＡにより２−３回独立して測定された。突然変異体は³⁵Ｓ−メチオニンおよびシステイン（Amercham）各２００μＣｉを加え、トランスフェクトされた２９３細胞（６０ｍｍプレート、１．２ｍＬ培地）を代謝標識することによっても分析された。１８時間後、培地を回収し、４ ℃で３〜４時間ウサギ抗ｈＮＧＦポリクローナル抗体またはマウスモノクローナル抗体のいずれかと反応させ、プロテインＡビーズ（Pharmacia）で沈澱させて回収し、１５％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Novex）に流した。電気泳動後、ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムの隣合わせに置いた。上記のごとく非放射性標識突然変異体が作製され、部分標本０．１μｇを、凍結乾燥し、ＳＤＳ− ＰＡＧＥ試料緩衝液に再溶解し、ゲル電気泳動し、次いで標準的方法（BioRad）に従ってニトロセルロース上に移した。ブロットを４℃で一夜ウサギ抗ｈＮＧＦポリクローナルまたはマウスｈＮＧＦモノクローナル抗体で処理し、洗浄し、突然変異体をアルカリホスファターゼ連結ヤギ抗ウサギまたは抗マウスＩｇＧ抗体によって検出した。リセプター結合、ｔｒｋＡ自己リン酸化、およびＰＣ１２神経突起生長アッセイ［¹²⁵Ｉ］ｈＮＧＦはEscandon(71)の方法に従ってEnzymobead法（BioRad）を用いて作製された。出発反応混合物およびゲルろ過クロマトグラフィーにかけた［¹²⁵Ｉ］ｈＮＧＦの部分標本の、ＴＣＡ沈澱によって測定された比放射能は平均６０〜９０μＣｉ／μｇであった。リセプター結合アッセイは、ラットｔｒｋＡ細胞組換え発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞（Luis Parada博士より分与）、ｐ７５発現Ａ８７５ヒトメラノーマ細胞（ＡＴＣＣ）、およびｔｒｋＢ発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞)として記載されたラットＰＣ１２細胞（Louis Reichardt博士より分与）(23) を用い、４℃で一夜行なわれた。用いたＮＩＨ３Ｔ３−ｔｒｋＡおよびＡ８７５ −Ｐ７５細胞の濃度は１×１０⁶個／ｍＬであり、ＰＣ１２細胞では５×１０⁵個／ｍＬであった。［¹²⁵Ｉ］ｈＮＧＦの最終濃度は容量０．２ｍＬ中に５０ｐＭであった。１×１０^-6Ｍ非標識ｈＮＧＦ存在下で生じる［¹²⁵Ｉ］ｈＮＧＦの結合と定義される非特異的結合は、フィルター結合アッセイにおいて、ＮＩＨ３Ｔ３ｔｒｋＡ細胞ではほとんどの場合１５〜２５％、ｐ７５−Ａ８７５メラノーマ細胞で２０〜３５％、およびｔｒｋＡ⁺ｐ７５ＰＣ１２細胞で２０〜３０％の間で変動した。データを置換等温線に当てはめ、Kleidagraphプログラム内の４パラメーター方程式を用いてＩＣ₅₀を計算した。場合により、リセプター結合は細胞を用いて２５℃で９０分間実施し、結合した［¹²⁵Ｉ］ｈＮＧＦはショ糖クッション遠心によって分別除去された。ｔｒｋＡの自己リン酸化は３７℃で５分間行い、Kaplan(19)記載の方法の変法によってリン酸化の程度を測定した。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶解ｔｒｋＡ細胞は、アガロースビーズ固定化抗ホスホチロシンモノクローナル抗体４Ｇ１０（ＵＢＩ）で免疫沈澱させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％アクリルアミド−Ｎｏｖｅｘ）で電気泳動し、ウサギ抗ｔｒｋＡポリクローナル抗体（David Kaplan博士より分与）を用いてプローブした。ｔｒｋＡの検出はアルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）によった。Primaria多カチオン性２４ウェルプレート上で２０〜３０％コンフルエントまでＰＣ１２細胞を増殖させ、野生型または突然変異体ｈＮＧＦを含むＮ２を添加した無血清高グルコースＤＭＥＭに培地を変えた。４８時間後、２細胞体より長く神経突起を伸ばした細胞の数を代表する視野中で数え、その視野内の全細胞（通常１００〜１４０細胞）の％で表わした。突然変異体およびＮＧＦコントロール各々の活性は別の実験において少なくとも２回測定した。最高濃度のｈＮＧＦにおける反応細胞のパーセントは実験間で５５〜７５％と変動し、１３回の実験の平均値は６３％であった。実験間の最大反応の変動を説明するために、これらの平均値を用いてすべてのデータを標準化した。ｈＮＧＦに対するモノクローナル抗体によるｔｒｋＡおよびｐ７５細胞に対する［¹²⁵Ｉ］ｈＮＧＦの結合の阻害上記のフィルター結合アッセイと同じ条件下で、抗ｈＮＧＦモノクローナル抗体を濃度を増加させながら２５ｐＭ［¹²⁵Ｉ］ｈＮＧＦに加え、２５℃で３０分間インキュベーションした。次に、ＮＩＴ３Ｔ３−ｔｒｋＡまたはＡ８７５−ｐ７５細胞１×１０⁶個／ｍＬを加え（最量０．２ｍＬ）、勢い良く混合しながら４℃で一夜インキュベーションした。次に、この試料を希釈し、Whatman GF/C濾紙で濾過してカウントした。結果結果を表５および６に示す。完全なｈＮＧＦ活性に必要なＮ末端アミノ酸残基の特徴付けを始めるために、（６−１１８）トランケート型のｈＮＧＦを組換えによってｈＮＧＦを発現しているＣＨＯ細胞の順化培地から単離した。９アミノ酸トランケート型（１０−１１８）ｈＮＧＦは既述の限られた蛋白分解によって生じた(48)。（６−１１８）および（１０−１１８）ｈＮＧＦは高速イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＩＥＣ）によって精製され、逆相ＨＰＬＣ、Ｎ末端配列分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびアミノ酸分析によって特徴づけられた（データ示さず）。次いで、ｔｒｋＡ、ｐ７５、およびｔｒｋＡ＋ｐ７５を発現している細胞系からの［¹²⁵Ｉ］ｈＮＧＦを置換する精製（６−１１８）ｈＮＧＦの相対的有効性を、（１０−１１８）ｈＮＧＦ、（１−１１８）または（１−１２０）ｈＮＧＦ、および（１−１１８）ｍＮＧＦのそれと比較した（図９）。それらの生物活性の等価性が示唆するように(74)、最初の実験から（１−１１８）対（１−１２０）ｈＮＧＦの結合特性に差がないことが示された（示さず）。ｈＮＧＦおよびｔｒｋＡ（８０−１００ｐＭ）、ｐ７５（２−３００ｐＭ）、およびＰＣ１２細胞（５０ｐＭ）の相対ＩＣ₅₀は他の文献(49)(75)(76)(20,21)に記載のＩＣ₅₀およびＫ_d値に対して２〜３の係数内である。Vroegopらと同じく、通常報告されているよりわずかに高いｐ７５に対するｈＮＧＦの親和性が観察されている（ＩＣ₅₀ ＝０．３ｎＭ対１〜２ｎＭ）。最初の５個のアミノ酸残基の欠失によって、組換えによりラットｔｒｋＡを発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する結合は９倍低下したが、一方、ｐ７５発現Ａ８７５ヒトメラノーマ細胞（変化無し）またはｔｒｋＡ＋ｐ７５発現ＰＣ１２細胞（３倍）との結合にはほとんど差がみられなかった。これに対して、（１０ −１１８）ｈＮＧＦでは（１−１１８）ｈＮＧＦに比べて、ｔｒｋＡおよびＰＣ１２細胞に対する結合がそれぞれ２６５および８２倍低下し、一方、ｐ７５に対する結合は１０倍低下した。ｔｒｋＡおよびｐ７５細胞に比べてＢＣ１２細胞において観察された（１０−１１８）ｈＮＧＦによる中間の置換有効性は、置換等温線のプロフィールへの両リセプターの関与を示唆している（図９Ｃ）。組換えにより発現したラットｔｒｋＡ細胞と放射性ヨー素化ヒトＮＧＦが本研究に用いられたが、Kahleら（1992）による（１０−１１８）ｈＮＧＦの以前の研究ではヒトｔｒｋＡ発現細胞と放射性ヨー素化マウスＮＧＦが用いられた。したがって、ヒトまたはゲッ歯類ｔｒｋＡまたは放射性標識ＮＧＦがこの分析において用いられたにもかかわらず、（１−１１８）ｈＮＧＦおよび（１０−１１８）ｈＮＧＦ結合間に同様な差が観察された。さらに、放射性ヨー素化マウスまたはヒトＮＧＦが置換可能なトレーサーを示すかどうかにかかわらず、（１−１１８）ｈＮＧＦは（１−１１８）ｍＮＧＦよりヒトまたはラットｔｒｋＡに対する親和性が２〜３倍高い。（６−１１８）ｈＮＧＦのＰＣ１２細胞分化活性（表６）とｔｒｋＡ（図１０）の自己リン酸化は（１−１１８）ｈＮＧＦによって誘発されたものとどうようであった。しかし、以前の結果と同じく（48）、（１０−１１８）ｈＮＧＦはｔｒｋＡの自己リン酸化に関して（１−１１８）ｈＮＧＦより少なくとも１０倍有効性が低く、ＰＣ１２神経突起の生長の刺激に関しては８０倍有効性が低い（図１０、表６）。したがって、これらの結果はＮ末端の最初の５個のアミノ酸が完全なｈＮＧＦ−ｔｒｋＡ結合活性にとって重要であるが、有力なリセプター活性と生物活性はほどんど維持される。さらに次の４残基の損失はｔｒｋＡ結合および活性化にとってさらに有害であり、ｐ７５との結合になんらかの影響を及ぼすようである。突然変異体型のｈＮＧＦは、非標識順化培地の代謝標識、次いで免疫沈降やイムノブロットアッセイによって検出可能であり、１４ｋＤの完全にプロセッシングされたポリペプチドとして示されている（図１１）。各突然変異体の濃度はポリクローナル抗ｈＮＧＦ抗体を用いるＥＬＩＳＡによって測定された。同様な発現レベルは、異なる３つのタイプの免疫反応性におけるポリクローナル抗体によって認識された単一プロセッシング種の優勢な存在と共に、該突然変異体は野生型ｈＮＧＦと同様な構造的安定性を共有することを示唆している。３個の荷電アミノ酸すべてのアラニンへの置換（Ｍｕｔ４：Ｈ４Ａ＋Ｈ８Ａ＋Ｒ９Ａ）は、完全にトレーサーが置換している野生型ｈＮＧＦの濃度範囲（ＩＣ₅₀＝１×１０^-10Ｍ、最大置換＝１×１０^-9Ｍ、図１２、上段、表５）にわたり、４℃においてｔｒｋＡからの［¹²⁵Ｉ］ｈＮＧＦの検出可能な競合置換の低下をもたらした。リセプター結合の低下は最大ｔｒｋＡ自己リン酸化効果の明らかな４〜５倍の低下と有効性の少なくとも１０倍の低下とも関連がある。突然変異体４では、主としてｐ７５からの置換を反映していると思われるＰＣ１２リセプター結合プロフィール、およびｔｒｋＡに対する該突然変異体の低親和性結合を反映すると思われる置換できない成分（図１２、下段）に一致して、（１−１１８）ｈＮＧＦに比べてＰＣ１２分化のＥＣ₅₀が８５倍低かった（図１４）。次に、Ｈｉｓ４およびＡｒｇ９変異体を個々に分析した。ｈＮＴ３およびｈＢＤＮＦのＮ末端領域はヒスチジンを含み、保存された機能的役割の可能性を示唆する。アラニン（突然変異体１）またはアスパラギン酸（突然変異体２）によるｈＮＧＦのＨｉｓ４の置換は、ｔｒｋＡ結合、自己リン酸化、およびＰＣ１２細胞分化の劇的な低下をもたらす（図１２、１３、１４）。ｈＮＧＦと他のＮＧＦ種間の９位の配列の変異が示唆するように、突然変異体Ｒ９ＡはｔｒｋＡまたはｐ７５活性に大きな影響を及ぼさなかった。しかし、ｔｒｋＡリン酸化およびＰＣ１２細胞分化に対する有効性はわずかに低かった（図１２、上段、中段、図１３および１４）。２５℃ではＰ５ＡおよびＨ８Ａ変異体のｔｒｋＡ結合はｈＮＧＦに比べてそれぞれ３倍および１．５倍の低下を示したが、Ｈ４Ｄの結合有効性には約４０倍の低下がみられ、ｐ７５に対する結合には変化がみられなかった。上記突然変異体ではすべて、４℃または２５℃において約２倍以下のｐ７５に対する結合の低下がみられ、突然変異誘発によって生じる構造への全体的影響はわずかであることを示唆した。ｈＮＧＦの特異的Ｎ末端配列がｔｒｋＡとニューロトロフィンとの相互作用に必要であるかどうかを試験するために、ｈＮＧＦのＮ末端（ＳＳＳＨＰＩＦ）をｈＢＤＮＦのＮ末端（ＨＳＤＰＡ）またはｈＮＴ３のＮ末端（ＹＡＥＨＫＳ）と置換することにより、キメラ突然変異体（突然変異体５および６）が作製された。したがって、これらの突然変異体はｈＮＧＦの二塩基性Ｈｉｓ８、Ａｒｇ９残基を保持するであろう。４℃における完全なリセプター置換を生じる（１−１１８）ｈＮＧＦの１０倍高濃度においても、得られるキメラニューロトロフィンはｔｒｋＡからの［¹²⁵Ｉ］ｈＮＧＦを置換することができず（図１２Ａ）、ｔｒｋＡ自己リン酸化活性の誘発において突然変異体１および２より有効性が低い（図１３）。ｐ７５を有するこれら突然変異体の結合相互作用は（１−１１８）ｈＮＧＦのそれと区別できず、一方、ＰＣ１２リセプターの置換はほとんどがｐ７５との相互作用であるかも知れない（図１２、下段）。アラニン３個の突然変異体４と同様に、Ｎ末端キメラ突然変異体は、ｈＮＧＦのすべての構造変異体に比べて、ＰＣ１２細胞の分化の最も弱いインデューサーであった（ＩＣ₅₀はほぼ１００倍シフトした）。これらの結果は、ｈＮＧＦの特異的Ｎ末端配列はｔｒｋＡに対する高親和性の結合とアゴニスト活性に必要であるが、ｐ７５に対する結合には必要でないことを示している。Ｎ末端配列の変異体が、全体の構造を維持しながら、高親和性ｔｒｋＡ相互作用からｈＮＧＦを制限することができることを確認するために、Ｈ４Ｄ突然変異体２およびｈＮＴ３／ｈＮＧＦ突然変異体６を大量に発現させて精製した。（１ −１１８）ｈＮＧＦに対するＩＣ₅₀（ＩＣ₅₀＝１×１０^-10Ｍ）より２０００倍以上（２×１０^-7Ｍ）の、考えられる最高濃度において、４℃でのｔｒｋＡからの［¹²⁵Ｉ］ＮＧＦの置換は突然変異体２および６でそれぞれ３０％と１０％のみであったが、一方、ｐ７５の結合プロフィールは同様であった（図１５）。図１３に示す結果と同じく、精製突然変異体のｔｒｋＡ自己リン酸化活性化能は（１−１１８）ｈＮＧＦより有意に有効性が低かった。これらの結果は、このアミノ酸の置換後に全体の構造安定性が維持されることを示唆し、高親和性ｔｒｋＡ結合および自己リン酸化の低下がこれらの特異的修飾によることを確証する。まず、ｔｒｋＡリセプター特異性の考えられる決定基としてのｈＮＧＦの他の２つの可変領域の役割を比較するためにキメラ突然変異体も作製された。β−ターン可変領域３内の６残基（Ａｒｇ５９−Ｓｅｒ６６）とβターン可変領域５内の７残基（Ｍｅｔ９２−Ａｌａ９８）をそれぞれ突然変異体７および８の対応するｈＮＴ３残基で置換した。突然変異体７はｔｒｋＡからのｈＮＧＦより［¹²⁵ Ｉ］ＮＧＦの置換においてわずかに有効性が高く、一方、突然変異体８はｐ７５と良好な結合を示さなかった（３〜５倍）。他の点では、これら突然変異体はｔｒｋＡおよびｐ７５結合プロフィール、ｔｒｋＡ自己リン酸化の支持能、またはＰＣ１２神経突起生長においてｈＮＧＦとほとんど差がなかった（図１２、１３、１４）。これらの結果は、領域３および５がＮ末端よりｔｒｋＡ結合相互作用に関与しないことを示唆する。ｐ７５に対する突然変異体８の低親和性は、ｐ７５との相互作用を示す保存されたＬｙｓ９５近傍の構造変化を示しているかも知れない(54)。Ｍ_r＝１４０００の完全にプロセッシングされた型のｈＮＧＦの構造変異体の相対発現レベルを決定するために、ｈＮＧＦに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体の突然変異体認識能をイムノブロッティングにより試験した（図１１および１２）。順化培地中で発現したＮ末端突然変異体の等量をイムノブロッティングすると、いくつかがモノクローナル抗体によって認識される能力を失っていたが、すべてがアフィニティ精製されたポリクローナル抗体によって認識された。Ｈ４Ｄ突然変異体、およびｈＢＤＮＦまたはｈＮＴ３のＮ末端キメラ突然変異体はイムノブロットシグナルを示さなかったが、Ｈ４Ａ＋Ｈ８Ａ＋Ｈ９Ａ突然変異体の有害性は低かった（図１６Ａ）。Ｈ４ＡまたはＲ９Ａ突然変異体は抗体との結合に影響しなかった。次に、該モノクローナル抗体の、ｔｒｋＡまたはｐ７５に対する［¹²⁵Ｉ］ＮＧＦの結合と競合する能力について試験した。抗体濃度を増加させるといずれのリセプターに対する［¹²⁵Ｉ］ＮＧＦの結合にも抑制的であり、ＩＣ₅₀＝１×１０^-9対４×１０^-8はｐ７５よりもｔｒｋＡに対するｈＮＧＦの結合をブロックする効果が４０倍大きいことを示す。これらの結果は該Ｎ末端がｈＮＧＦモノクローナル抗体のエピトープの少なくとも一部を形成し、ｈＮＧＦに対する抗体の結合が比較的高親和性にｔｒｋＡとの相互作用をブロックすることを示唆する。ｐ７５に対する結合のより弱い阻害は、Ｎ末端の外側の低親和性エピトープがｈＮＧＦ−ｐ７５結合の接触に関与するかも知れないか、抗体の立体阻害がｐ７５結合を部分的に干渉するかも知れないことを示唆している。予備的研究は、さらにこの抗体との結合がより弱いエピトープがｈＮＴ３／ｈＮＧＦキメラ突然変異体７によって示されたβターン３領域に存在することを示唆する。ｐ７５およびｔｒｋＡに対するｈＮＧＦの結合におけるこの領域の役割については現在検討中である。該抗体存在下におけるｔｒｋＡとの結合の低下は二次エピトープへの結合によるか、立体阻害によるものであると主張することができるかも知れないが、このデータは上記のいくつかのＮ末端変異体において観察されたｔｒｋＡ対ｐ７５結合の選択的な低下と一致する。実施例４ｈＮＧＦアミノ酸変異体の産生と特徴付け：ｈＮＧＦおよびｈＮＴ３汎ニューロトロフィン突然変異分析のための標的残基の同定ＮＧＦおよびそのニューロトロフィンファミリーのメンバーであるＮＴ３、ＢＤＮＦ、およびＮＴ４／５は同じ配列を約５６％共有している。リセプター結合特異性は、一部ニューロトロフィンファミリーメンバー間のアミノ酸配列の違いによって決定されるかもしれない。これらの残基はｔｒｋリセプターと直接結合するか、他の可変または保存残基のｔｒｋ相互作用を強制的に阻害するものとして機能してよい。ｈＮＧＦのドメイン−スワップ突然変異体をｈＮＧＦとｈＮＴ３の間で作製し、ｔｒｋリセプター特異性の決定における互いに異なる残基の役割について試験した。ニューロトロフィンの一次配列の比較は、配列の違いのほとんど（８０％）を含む、各アミノ酸７−１０個の７領域があることを証明している（図８、１８Ａ、および１８Ｂ）。ｈＮＧＦとｈＮＴ３間で１２０個のアミノ酸のうち５２個が異なる。これら５２の相違のうちの４１（７９％）が７つの互いに異なる領域内に生じる。ヒト、トリ、ヘビ、およびカエルを含む９種類のＮＧＦにおいて、５２残基のうちの２４個が保存され、ｔｒｋＡ結合特異性に関与することが示唆されている。ネズミＮＧＦのＸ線結晶構造試験から、４つの可変領域／ドメインがβ−ターンとして構造的に特徴づけられ、１つの可変領域は β−シートであり、最後の２つがアミノおよびカルボキシ末端であることが明らかになっている。互いに異なる領域は各々溶媒の影響を受けやすく、リセプターと相互作用することができるいくつかの荷電した極性側鎖を含んでいる。ｈＮＧＦの個々の７つの可変領域のいくつかの残基またはすべてをｈＮＴ３の対応ドメインで置換することにより、１３個のキメラまたはドメイン−スワップ、突然変異体が作製された。相違の少ないさらに２つの領域も置換された（プレ可変領域１および４）。したがって、互いに異なるアミノ酸残基の全部で９０％において、ｔｒｋＡおよびｔｒｋＣ特異性を決定するそれらの役割について評価された。このキメラ突然変異体は、実施例３に記載のごとく哺乳動物細胞での発現およびオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発によって作製された。突然変異誘発のためのｈＮＧＦの個々の残基の選択は、主としてネズミＮＧＦのＸ線結晶構造内のそれらの位置によって決定された。置換された残基はほとんど機能的に保存される（１０／１２）ことから、最小限の構造変化はヒトおよびマウスＮＧＦ間の配列の差によって生じるものと思われた。Ｘ線結晶構造の座標に基づく、実施例１に記載のネズミＮＧＦのコンピューターで作製したモデルは、溶媒中に側鎖を突き出し、ｔｒｋＡおよびｇｐ７５リセプターと相互作用するかもしれないアミノ酸を明らかにしている。これらのいくつかにはドメイン−スワップ突然変異によって有意に修飾された可変残基が含まれるが、多くが、可変および保存領域内のｈＮＧＦとｈＮＴ３との間に保存された残基を示す。ダイマーインターフェース（Ｆ１２、Ｖ１４、Ｗ２１、Ｆ４９、Ｙ５２、Ｗ７６、Ｔ８５、Ｆ８６、Ｗ９９、Ｆ１０１、Ｔ１０６、Ａ１０７、Ｖ１０９、Ｖ１１１）、疎水性の内部（Ｖ３６、Ｖ３８、Ｆ５３、１７１、Ａ８９、１１０２、および１１０４）、および構造依存性の、埋没した水素結合（Ｑ５１、Ｓ７８、Ｔ９１、Ｒ１００）を形成するのに関与している残基のような最小限の側鎖が露出していると予測される残基は最小限に修飾された。ジスルフィド結合を形成するシステイン残基と、グリシンおよびアラニンのうちＡ９７のみが修飾された。以下の場合が例外であった。すなわち、ダイマーインターフェースに現われるが表面側鎖を有する残基１３０およびＹ５２、疎水性表面パッチをも形成する残基Ｌ３９、Ｌ９０、Ｍ９２、およびＡ９７、および水素が結合しているがある側鎖が溶媒で曝露されているＤ１６、Ｋ２５、Ｄ３０、Ｅ５５、Ｋ５７、Ｒ５９、Ｒ６９、Ｄ７２、Ｈ７５。ほとんどの残基がアラニンに変化しており(64)、ある場合にはリセプター相互作用の特異的機能性の役割を試験している間に構造を維持するために他の置換がなされた。ｈＮＧＦ変異体の産生とリセプター結合特性ｈＮＧＦ変異体の突然変異誘発、発現、および蛋白特性は、実施例３に記載のごとく実施された。オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発後、すべての突然変異体はジデオキシヌクレオチド配列決定によって確認された。ｈＮＧＦ突然変異体はヒト２９３細胞中に発現され（図１１Ａ、Ｂ）、Amicon濃縮（１０×）とＥＬＩＳＡによる定量の後、ほとんどのｈＮＧＦ変異体は、可変領域２または３が置換した突然変異体（０．６〜１ｕｇ／ｍＬ）を除いて、正常ｈＮＧＦコントロール（５〜２５ｕｇ／ｍＬ）と同様のレベルで発現していることが観察された。これらのキメラ分子はいずれもプロリン残基の挿入または欠失、ならびに側鎖機能性の他の有意な変化を生じていることから、低い回収率は構造が不安定であることを反映しているかも知れない。それにもかかわらず、利用可能な量によって、ｔｒｋＡおよびｇｐ７５リセプターに対するｈＮＧＦ変異体の結合親和性を決定することができた。各ｈＮＧＦ変異体の結合親和性は、ｔｒｋおよびｇｐ７５リセプターのイムノアドヘシン構築物(88)と実施例２に記載の放射性ヨー素化ニューロトロフィンを利用する競合結合によって決定された。各ｈＮＧＦ変異体は２９３細胞中で少なくとも２回発現され、結合試験は各トランスフェクションにつき２〜３回行なわれた。正常ｈＮＧＦに対する相対親和性はｈＮＧＦのＩＣ₅₀ に対する変異体のすべての測定値の平均ＩＣ₅₀の比で表わしている。ｔｒｋＡ自己リン酸化活性とＰＣ１２細胞分化バイオアッセイ実施例３に記載のｔｒｋＡ自己リン酸化を評価することにより、ｈＮＧＦ変異体によるｔｒｋＡキナーゼの生化学活性を測定した。ｔｒｋＡ自己リン酸化のＥＣ₅₀を用量依存的に決定することができる定量アッセイが開発された(89)。ヘルペスシンプレックス表面蛋白から誘導されたペプチドエピトープ標識（tag）を含むｔｒｋＡリセプター変異体は９６ウェルプレートのＣＨＯ細胞中で安定に発現した(88)。ｈＮＧＦに対するエピトープ標識ｔｒｋＡの親和性は正常リセプターのそれと同じである(88)。細胞（各濃度につきデュプリケートウェル）を３７ ℃で１０分間ｈＮＧＦ変異体の濃度を８段階に増加させて（１０ｐＭ−１０ｎＭ）で刺激する。実施例３に記載のごとくＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶解緩衝液で細胞を溶解させ、該エピトープ標識に対するモノクローナル抗体をコートしたプレートに移した。次に、結合後に捕捉されたｔｒｋＡをＨＲＰ結合抗ホスホチロシンモノクローナル抗体と反応させ、発色させた。次に吸光度を読み、濃度に対してプロットした。ｈＮＧＦのＥＣ₅₀は１００〜１２０ｐＭである。ＰＣ１２細胞の分化は実施例３の記載に従って行なったが、細胞は最初に増殖させるか７〜１０日間ＮＧＦでプライムされた。次に、神経突起を保持する細胞を回収し、ｈＮＧＦ変異体の存在下または非存在下で、正常増殖培地中、２４ウェルプレートに接種した。７２時間後、神経突起を保持する細胞のパーセンテージを実施例２の記載に従って定量した。ｈＮＧＦ／ｈＮＴ３汎神経栄養変異体のｈＮＴ３様ｔｒｋＣ生物活性を、ｈＮＧＦに反応しないｔｒｋＣトランスフェクトＰＣ１２細胞（Pantelis TsolfousおよびLuis Parada博士、ＮＣＩより分与）において評価した。結果ｈＮＧＦ／ｈＮＧＦキメラによる可変残基の突然変異分析ｈＮＧＦの７可変領域それぞれのいくつかの残基またはすべてをｈＮＴ３の対応領域で置換することにより１３のキメラ突然変異体を作製した（図８、１８Ａ、Ｂ）。２つの可変性の少ない領域（１つはβシートＡ内、および他は保存されたβ−ターン連結βシートＢおよびＣ内）も置換された。ｈＮＧＦ変異体をｔｒｋＡまたはｇｐ７５免疫吸着融合蛋白からの［¹²⁵Ｉ］ｈＮＧＦと置換させる競合結合実験を行なった。これらリセプターはｔｒｋＡまたはｇｐ７５の細胞外ドメインとヒトＩｇＧのＦｃ部分を含んでいる。これらの免疫吸着物はホロ−ｔｒｋＡおよびｐ７５リセプターと同様な親和性でｈＮＧＦと結合し、ニューロトロフィンと同ランクのオーダーの親和性を示す（図１９Ａ、Ｂ）。各ｈＮＧＦ変異体のＩＣ₅₀を平均し、正常ｈＮＧＦについて測定されたＩＣ₅₀の比で表わした（ＩＣ₅₀ｈＮＧＦ＝１００ｐＭ、図２３Ａ）。既述したように（図１２、１５）、ｔｒｋＡ結合に対する最も重要な効果はｈＮＴ３とのＮ末端ドメインスワップによる結合親和性の約３００倍の低下である。プレ−可変領域１内の３残基の変化によって結合の２〜３倍の低下が観察される（βシートＡ：Ｖ１８Ｅ＋Ｖ２０Ｌ＋Ｇ２３Ｔ）。他のｈＮＧＦ変異体ではｔｒｋＡ結合の低下は２倍以下であるが、可変領域３キメラ突然変異体（β−ターン３）およびＣ−末端（図２０Ａ）では結合の増加が観察される。ｔｒｋＡ結合親和性の低下に一致して、ｔｒｋＡの自己リン酸化およびＰＣ１２細胞分化（神経突起生長）の用量反応曲線は、Ｎ末端およびプレ−可変領域１変異体による活性の低下を示す（図２１Ａ、Ｂ）。ｇｐ７５に対する結合はｈＮＴ３の可変領域１およびプレ−可変領域４の置換によってそれぞれ５および７倍低下する（図２０Ｂ）。可変領域５突然変異体でもｇｐ７５結合の２〜３倍の低下がみられる。Ｋ３２、Ｋ３４およびＥ３５の残基のアラニンによる置換はｇｐ７５結合の低下をもたらすことから、Ｖ１置換によって示されるｇｐ７５結合の低下は、Ｋ３２のＲへの、Ｋ３４のＨへの、そしてＥ３５のＱへの置換によるようである（図８；(54)）。これらの結果は、ｔｒｋＡおよびｇｐ７５に対するｈＮＧＦの結合相互作用に可変ニューロトロフィン残基のいくつかが関与することを示している。ｔｒｋＡ結合およびリセプター活性化の低下は、Ｎ末端およびプレー可変領域１内の可変残基がｔｒｋＡリセプター特異性に関与することを示唆する。この可能性は、ＮＧＦと反応しないｔｒｋＣトランスフェクトＰＣ１２細胞における神経突起の生長およびｔｒｋＣ−ＩｇＧ免疫吸着物に対するリセプターの結合を測定することにより試験された。驚くべきことに、ｔｒｋＣ相互作用はｈＮＴ３のＮ末端によってもたらされなかった（突然変異体６、図２２Ａ、Ｂ）が、ｈＮＧＦの可変領域４中の４アミノ酸の置換（Ｔ８１Ｋ、Ｈ８４Ｑ、Ｆ８６Ｙ、Ｋ８８Ｒ）は有意なｔｒｋＣ相互作用をもたらした（図２２Ａ、Ｂ）。この変異体の神経突起の生長力およびｔｒｋＣ親和性が低いことは、他の領域が効率的なｔｒｋＣ相互作用に関与するらしいことを示している。プレ−可変領域１突然変異体のｔｒｋＣ相互作用は、可変領域４内の個々の残基の関与同様現在評価中である。しかし、可変領域４内の重複している突然変異は、Ｖ４の複数の残基がｔｒｋ特異性に必要かも知れないことを示唆する。例えば、Ｔ８１Ｋ（Ｓ７３、Ｙ７９Ｑ、Ｔ８１Ｋ）が重複している３可変残基が置換しているβ−ターン３／４変異体は、可変領域４突然変異体と同様にｔｒｋＣ−ＰＣ１２細胞の神経突起の生長を５〜１０％しか活性化しない（図２２Ｂ）。それにもかかわらず、ｔｒｋの機能はアラニン突然変異体のＹ７９Ａ＋Ｔ８１Ａによって影響され、さらにｔｒｋリセプター相互作用におけるこの領域の可変残基が関与する。可変領域４突然変異体によるｔｒｋＡ活性の維持は、４個のｈＮＴ３残基がｔｒｋＡ結合と両立するが、同等のｈＮＧＦ残基がｈＮＧＦとｔｒｋＣとの相互作用に対する強制的阻害を示すかも知れないことを示唆している。該ニューロトロフィンのＮ末端ドメインは一般的ｔｒｋ特異性ドメインではないようであるが、ｈＮＧＦのこの領域はｔｒｋＡ相互作用の主要な決定基であるようである。ＮＴ３の最初の６残基のｈＮＧＦの最初の７残基による置換は、高親和性と有効性を有するｔｒｋＡとｔｒｋＣの両方と結合して活性化する汎親和性変異体を生じる（図２４、２５、および２６）。さらに、それによってｇｐ７５との高親和性結合が維持される。したがって、ｈＮＴ３で始まり、Ｎ末端、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、およびＶ５のようなｈＮＧＦの可変領域を含む有効なｔｒｋＡ／ｔｒｋＣ汎親和性ニューロトロフィンを作製することが可能であろう。逆に、ｈＮＧＦβシート１（Ｃ１）およびＶ４内の可変残基を置換することにより同様なｔｒｋＡ／ｔｒｋＣ汎親和性特性を含むようにｈＮＧＦが修飾されるかも知れない。可変領域２が置換しているｈＮＧＦ／ｈＮＴ３キメラは、ｔｒｋＣ活性を増大させなかったが、ｔｒｋＡ結合のわずかな低下（１．５倍）を生じた。ｈＮＴ３の可変領域２が対応するｈＮＧＦドメインで置換している相互ドメインスワップのｔｒｋＡ活性の増大については現在試験中であり、ｔｒｋＡ／ｔｒｋＣパントロフィンの候補である。個々の可変および保存ｈＮＧＦ残基の突然変異分析：ｔｒｋＡおよびｇｐ７５と相互作用するｈＮＧＦ残基の構造モデル上記のネズミＮＧＦの結晶構造を用い、溶媒にばく露された側鎖機能性を有し、ｔｒｋＡまたはｇｐ７５と相互作用することができるものが多いｈＮＧＦの４５残基を、点突然変異誘発によって評価した。競合結合分析は、Ｈ４、Ｐ５Ａ、Ｓ１３、Ｄ３０、１３１、Ｙ５２、Ｒ５９、Ｒ６９、Ｙ７９、Ｔ８１、およびＲ１０３突然変異はｔｒｋＡ結合に１．８〜１０倍影響するが、一方、残基Ｅ４１、Ｋ５７、Ｄ７２、およびＮ７７の突然変異は結合を１．５〜２倍増加させることを示している（図２７）。これらの結果は、これら残基がｔｒｋＡ相互作用に関与することを示し、変異体がｔｒｋ特異性に影響すると思われる可変残基（Ｈ４、Ｐ５、１３１、Ｒ５９、Ｙ７９、Ｔ８１）と保存残基（Ｓ１３、Ｄ３０、Ｙ５２、Ｒ６９、Ｒ１０３）の両方から生じるかもしれないことを示唆する。残基Ｆ１２、１３１、Ｋ３２＋Ｋ３４＋Ｅ３５、Ｋ５０、Ｙ５２、Ｒ６９、Ｋ７４、Ｈ７５、Ｋ８８、Ｌ１１２、Ｓ１１３、Ｒ１１４、およびＫ１１５の突然変異はｇｐ７５結合の３〜＞５０倍の低下を生じる（図３０）。特に、残基Ｆ１２、Ｋ３２＋Ｋ３４＋Ｅ３５、Ｙ５２、Ｒ６９、Ｋ８８、およびＲ１１４＋Ｋ１１５の変化を示す１０ｎＭ突然変異存在下において置換は観察されず、これら残基がｇｐ７５結合に決定的な決定基であることを示唆した。エピトープ標識ｔｒｋＡを用いる自己リン酸化分析は、残基Ｈ４、Ｐ５、Ｄ３０、Ｙ５２、Ｒ６９、Ｙ７９＋Ｔ８１、およびＲ１０３の突然変異により活性化力が１．５〜６倍低下することを示した（図２８）。ｔｒｋＡ自己リン酸化効果の有意な（２０〜６０％）低下が、残基Ｆ１２を除くこれらの突然変異すべてで観察された。これらの結果は、ＰＣ１２細胞分化力と一致しており、残基Ｈ４、Ｆ１２、Ｄ３０、Ｙ５２、Ｒ６９、Ｙ７９＋Ｔ８１、およびＲ１０３の突然変異において神経突起の生長のＥＣ５０の２〜５０倍の低下が観察される。他のｈＮＧＦ変異体はＰ５の突然変異を含めて現在評価中である。興味深いことに、突然変異がｔｒｋＡ結合とｔｒｋＡ自己リン酸化力の両方に最小限の影響を及ぼす残基は、ｔｒｋＡ自己リン酸化の効果を低下させ得る。ｔｒｋＡ自己リン酸化の低下はＲ６９およびＹ７９＋Ｔ８１の突然変異によって誘発されるＰＣ１２細胞分化力の低下を説明すると思われる。あるいはまた、Ｒ６９の突然変異はｐ７５結合を大きく低下させ、ｈＮＧＦシグナルトランスダクションにおけるｐ７５の役割は現在明らかでなく、ｐ７５相互作用の低下は生物学的効果の低下に関与するかもしれない。この可能性はｈＮＧＦのｇｐ７５への結合を低下させる他のｈＮＧＦ変異体を用いて観察されている。ｔｒｋＡおよびｇｐ７５リセプターと相互作用する残基はネズミＮＧＦの構造に基づいてコンピューターで作製することによってモデル化された。この分析により２つの主要なｔｒｋＡ相互作用領域の、１）未知の結晶構造を有するＮ末端（Ｈ４、Ｐ５）、および２）βシートＣおよびＤのＹ７９、Ｔ８１、Ｈ８４、およびＲ１０３によって形成された表面がみいだされた。βシートＡおよびＢの残基Ｖ１８、Ｖ２０、Ｇ２３、Ｙ５２、Ｒ５９、およびＲ６９はβシート鎖を包む伸長した表面にある程度関与している。Ｙ５２およびβシートＡ残基の領域付近には第二プロモーターのＤ３０と１３１がある。これら２つの残基は溶媒中の表面領域に比較的あまり突き出していないが、それらはβシート残基によって形成される連続的結合表面に関与し得る。２つの主要なｐ７５相互作用領域、すなわち、１）１つのプロモーターの可変領域１、および他のプロモーターのβシートＢおよびＣ、２）異なるプロモーターからのＣ末端およびβ−ターン３内に保存された残基が見いだされた。βシートのペアによって形成された割れ目（cleft）内のｔｒｋＡ関連残基と対照的に、ｐ７５関連残基は十分露出しているようである。（５４）に記載のごとく、Ｋ３２およびＫ３４はβ−ヘアピンターン１の可変領域から突き出している。本発明者らは、他のプロモーター近傍の残基Ｋ５０およびＹ５２がｐ７５結合に関与することをみいだしている。ｐ７５結合に有意に関与しているＫ８８はこの領域にあるが、高度には露出していない。他の結合表面は１つの末端のＫ７４（β− ターン３）、Ｒ１１４およびＫ１１５（Ｃ−末端）、および他のプロモーターからのＦ１２、Ｒ６９からなっている。他の潜在的汎親和性分子は現在構築中であり、上記の突然変異誘発分析に基づいて評価されつつある。汎ｔｒｋＡ／ｔｒｋＣ分子はｈＮＧＦの以下の変化によって作製することができる。１）プレ−可変領域１（Ｖ１８Ｅ＋Ｖ２０Ｌ＋Ｇ２３Ｔ）プラス可変領域４（Ｙ７９Ｑ＋Ｔ８１Ｋ＋Ｈ８４Ｑ＋Ｆ８６Ｙ＋Ｋ８８Ｒ）、２）プレ−可変領域１プラス可変領域４の最小限の残基の置換。汎ｔｒｋＡ／ｔｒｋＣ分子はｈＮＧＦのＮ末端の最初の７残基内の最小限の変化を置換し、ｈＮＴ−３の最初の６残基を置換することによって作製することができる。Ｈ４およびＰ５はＮＧＦ間に保存され、６および７位の２個の疎水性残基が保存されているので、以下の変異体が作製されている。１）ＴＡＳＨＰＩＦ−ｈＮＴ３、２）ＹＡＨＰＩＦ−ｈＮＴ３、３）ＹＡＳＨＰＩＳ−ｈＮＴ３、４）ＹＡＥＰＩＦ− ｈＮＴ３、および５）ＹＡＱＨＰＩＦ−ｈＮＴ３。ｔｒｋＡ／ｔｒｋＣパントロフィンはｈＮＴ３の可変領域２または４または５の置換、またはこれらのエレメントの組合せをｈＮＧＦの対応する領域で置換することにより作製することができる。ｔｒｋＡ／ｔｒｋＢパントロフィンはｈＮＴ４／５の最初の９残基をｈＮＧＦの最初の７残基で置換するか、または可変領域４またはプレ−可変領域１内の残基の置換と組み合わせることによって作製することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/36 ＡＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＭ (72)発明者ウィンスロー，ジョン・ダブリューアメリカ合衆国94018カリフォルニア州エル・グラナダ、ベントゥラ・ストリート 954番

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）ＮＧＦ特異性をもたらすドメイン、（ｂ）ＢＤＮＦ特異性をもたらすドメイン、および（ｃ）ＮＴ３特異性をもたらすドメインを含む汎親和性ニューロトロフィン。２．該汎親和性ニューロトロフィンのニューロトロフィンリセプターに対する結合が該リセプターに対する天然ニューロトロフィンリガンドの結合の少なくとも８０％である請求項１に記載の汎親和性ニューロトロフィン。３．汎親和性ニューロトロフィンが少なくとも４種類の異なるニューロトロフィンリセプターと結合するものである請求項１に記載の汎親和性ニューロトロフィン。４．該リセプターがｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、およびｔｒｋＣ、およびｐ７５である請求項３に記載の汎親和性ニューロトロフィン。５．汎親和性ＮＴ３である請求項１に記載の汎親和性ニューロトロフィン。６．汎親和性ＮＧＦである請求項１に記載の汎親和性ニューロトロフィン。７．汎親和性ＮＴ４／５である請求項１に記載の汎親和性ニューロトロフィン。８．汎親和性ＢＤＮＦである請求項１に記載の汎親和性ニューロトロフィン。９．ＭＮＴＳ−１である請求項５に記載の汎親和性ＮＴ３。１０．少なくとも３種の異なるニューロトロフィンリセプターと結合する、単一アミノ酸の変化を含む汎親和性ニューロトロフィン。１１．ＮＴ３のＤ１５に対応する位置に置換されたアラニン残基を有する、請求項１０に記載の汎親和性ニューロトロフィン。１２．Ｄ１５ＡＮＴ３である請求項１０に記載の汎親和性ニューロトロフィン。１３．Ｄ１６ＡＮＧＦである請求項１０に記載の汎親和性ニューロトロフィン。１４．請求項１に記載の汎親和性ニューロトロフィンをコードしている核酸。１５．請求項１４に記載の核酸を含む発現ベクター。１６．請求項１４に記載の核酸を含む宿主細胞。１７．汎親和性ニューロトロフィンをコードする核酸を含む宿主を、汎親和性ニューロトロフィンを発現することができる状態におくことを含む請求項１に記載の汎親和性ニューロトロフィンの製造法。１８．請求項１に記載の汎親和性ニューロトロフィンを含む医薬組成物。１９．請求項１に記載の汎親和性ニューロトロフィンを患者に投与することを含む神経障害の治療法。２０．共有結合したヘテロダイマーを含む汎親和性ニューロトロフィン。２１．該ヘテロダイマーがＮＴ３モノマーとＮＧＦモノマーを含むものである請求項２０に記載の汎親和性ニューロトロフィン。２２．該ヘテロダイマーがＮＴ３モノマーとＮＴ４／５モノマーを含むものである請求項２０に記載の汎親和性ニューロトロフィン。２３．該ヘテロダイマーがＮＴ３モノマーとＢＤＮＦモノマーを含むものである請求項２０に記載の汎親和性ニューロトロフィン。２４．該ヘテロダイマーがＮＧＦモノマーとＢＤＮＦモノマーを含むものである請求項２０に記載の汎親和性ニューロトロフィン。２５．該ヘテロダイマーがＮＧＦモノマーとＮＴ４／５モノマーを含むものである請求項２０に記載の汎親和性ニューロトロフィン。２６．２つのＭＮＴＳ−１モノマーを含む汎親和性共有結合ホモダイマー。２７．２つのＤ１５ＡＮＴ３モノマーを含む汎親和性共有結合ホモダイマー。２８．Ｄ１６Ａ−Ｖ１８Ｅ−Ｖ２０Ｌ−Ｇ２３Ｔ−Ｙ７９Ｑ−Ｔ８１Ｋ−Ｈ８４Ｑ−Ｆ８６Ｙ−Ｋ８８Ｒ−ＮＧＦである請求項６に記載の汎親和性ＮＧＦ。