CN1556814A - 含有非功能性Kvβ1.1亚基N末端的敲入转基因哺乳动物 - Google Patents
含有非功能性Kvβ1.1亚基N末端的敲入转基因哺乳动物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种含有缺陷型电压灵敏钾通道β1亚基(Kvβ1)的转基因哺乳动物，其中所述Kvβ1亚基不能赋予所述K+的N－型失活但保留与Kv1家族α－亚基共缔合的能力，从而增强了通道表面表达。编码Kvβ1亚基的Kvβ1.1基因在其失活结构域的整个密码子1－70或其一部分中最好具有一种突变。所述转基因哺乳动物可用作精神病和神经病的模型，以鉴定出抗焦虑化合物和促认知功能。本发明也提供用于筛选和评价试验化合物的方法，所述试验化合物可以调节Kvβ1.1活性、准确地讲是可以使钾通道失活或者与α－亚基共缔合。
Description
本申请要求于2001年7月27日申请的同时待审的临时申请顺序号60/308,485的优先权以及于2001年11月09日申请的同时待审的临时申请顺序号60/331,140的优先权，所述临时申请的全部公开内容通过引用结合到本文中。
发明领域
本发明涉及一种含有缺陷型电压灵敏钾通道β1亚基(Kvβ1)的转基因哺乳动物，其中所述Kvβ1亚基不能赋予所述通道的N型失活但保留与Kv1家族α-亚基共缔合的能力，从而增强了通道表面表达。所述转基因哺乳动物可用作精神病和神经病的模型并且可用来鉴定抗焦虑化合物。
发明背景
电压门控钾通道(Kv)影响哺乳动物的神经兴奋性。某些K+通道(A-型K+通道)是快速失活剂，所述快速失活剂由于其快速失活而对神经元起动起调节剂的作用。Kv通道在脑组织中的分散定位提示，这些通道是在控制通常与癫痫发作传播和局部缺血性损伤相关的途径中动作电位传播和神经递质释放的必需元件(参见Rhodes等，(1997)J.Neurosci.17：8245-8258)。
某些Kv通道是Shaker相关超家族的成员，并且由膜整合α亚基和辅助胞质β亚基装配而成。三个Kvβ基因，称为Kvβ1、Kvβ2和Kvβ3，提供五个β亚基。此外，所述Kvβ1基因的可变剪接提供三个组织特异性β1亚基同种型即Kvβ1.1、Kvβ1.2和KvB1.3，该同种型在其N末端序列和其表达模式方面不同。Kvβ1.2和Kvβ1.3在心脏组织中表达，而Kvβ1.1在脑组织中表达，特别是在海马CA1区和纹状体中表达。
Kv通道的β-亚基在调节表面表达、稳定性、翻译后加工和成孔α-亚基的失活动力学方面起重要的作用。任何辅助Kvβ1亚基与某些α亚基的共表达已导致已表达Kv通道的失活动力学的显著加速作用(Rettig等(1994)Nature 369：289-294；Majumder等(1995)FEBS Lett.361，Morales等(1995)J.Biol.Chem.270：6272-6277；England等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6309-6313；England等，(1995)J.Biol.Chem.270：28531-28534；：13-16；McCormack等(1995)FEBS Lett.370：32-36；Heinemann等(1996)J.Physiol.(Loud.)493：625-633)。先前已经表明，Kv通道的失活是由Kvβ1亚基的氨基末端内的“球状(ball)”结构域所赋予的(Rettig，参见上文)。另外，已经提出，Kvβ1.1亚基在相应的Kv1家族α-亚基折叠时具有蛋白伴侣样功能，这是因为它们促进共表达的α亚基的表面表达(Shi等(1996)Neuron 16：843-852；Accili等(1997)J.Biol.Chem.272：25824-25831)。Kvβ1亚基共缔合相应的Kv1家族α-亚基的能力得到保留，尽管其氨基末端有缺失，对赋予通道失活的能力有损失，正如在用转染的哺乳动物细胞的实验中所表明的(Nakahira等(1996)J.Biol.Chem.271：7084-7089)。重要的是，完整Kvβ1.1亚基功能的完全丧失导致在剔除小鼠的海马神经元和纹状体神经元中A-型Kv通道活性被降低(Giese等(1998)Learning& Memory 5：257-273)。然而，现在仍不清楚Kvβ1.1亚基的功能性如何，其是N-型失活还是其蛋白伴侣样功能导致动物经改变的认识、焦虑和运动控制。
PCT公布号WO 00/24871公开了一种具有剔除突变的转基因小鼠，所述剔除突变使A-型K+通道的完整Kvβ1.1亚基不起作用。然而，WO 00/24871没有描述具有其中仅Kvβ1.1亚基的一部分被失活以留下保留功能性的Kvβ1.1亚基部分的突变的转基因哺乳动物。特别是，WO 00/24871没有提供具有Kvβ1.1亚基突变的转基因动物，其中β1.1亚基除赋予N-型失活的能力以外的所有功能特性均被保留。
人们希望提供这样的转基因哺乳动物模型：其中使Kvβ1.1亚基的特定部分变成非功能性的，特别是，其中N-型失活已被丧失，以便鉴定出可用于治疗惊恐性障碍和焦虑性障碍、认知障碍、癫痫、局部缺血性中风和运动障碍的化合物(“disinactivator”)和疗法。
发明概述
本发明涉及一种具有编码A-型钾通道的突变型Kvβ1.1亚基的内源基因簇的转基因啮齿动物，其中所述突变型Kvβ1.1亚基是一种不能赋予所述通道的N-型失活但保留与Kv1家族α-亚基共缔合能力的敲入亚基。
在一个优选的实施方案中，所述转基因啮齿动物是小鼠(“KI小鼠”)，并且所述突变型敲入Kvβ1.1亚基由纯合突变编码。所述敲入Kvβ1.1亚基可以由选自以下的一种突变编码：置换突变、插入突变、移码突变和终止密码子突变，最优选根据Y形迷宫测定，所述KI小鼠与其中Kvβ1.1亚基是完全非功能性的小鼠(“KO小鼠”)相比，表现出显著不同的学习或记忆模式。一方面，所述Y形迷宫实验将最好表明，在4小时实验中间间隔后，所述KI小鼠与所述KO小鼠相比，具有显著改善的学习或记忆，但在30分钟实验中间间隔后，所述KI小鼠与所述KO小鼠相比，具有显著减退的学习或记忆。在另一个优选的实施方案中，环境恐惧条件反射测定(contextual fearconditioning assay)用来表明，所述KI小鼠与KO小鼠和具有野生型Kvβ1.1亚基的同一品系的小鼠(“WT小鼠”)相比，具有显著减退的学习模式。在再一个优选的实施方案中，高架O形迷宫测定(elevatedzero maze assay)用来表明，所述KI小鼠与KO小鼠和WT小鼠相比，具有显著减轻的焦虑模式。再一方面，应激诱导的皮质酮水平测定用来表明，所述KI小鼠与KO小鼠和WT小鼠相比，具有显著减轻的焦虑模式。同样，在本发明的另一方面，应激诱导的体温过高测定用来表明，所述KI小鼠与KO小鼠和WT小鼠相比，具有显著减轻的焦虑模式。
本发明也涉及一种其基因组在内源Kvβ1.1亚基基因N末端的密码子1-70(即SEQ ID NO：1)、最好是密码子1-36中包含一个纯合突变的转基因啮齿动物，其中所述突变是置换突变，并且所述啮齿动物与其基因组包含一个编码一种完全非功能性Kvβ1.1亚基的纯合突变的第二种啮齿动物相比，表现出显著不同的认知模式。优选所述置换突变包含一个免疫反应性附加表位，最优选所述置换突变是血凝素附加表位。在本发明的再一方面，所述转基因啮齿动物是小鼠。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种其生殖细胞和体细胞含有一种在胚胎期引入到所述啮齿动物或所述啮齿动物的祖先中的重组活化Kvβ1.1转基因序列的转基因啮齿动物，其中所述Kvβ1.1转基因编码一种不能赋予钾通道的N-型失活但保留与Kv1家族α-亚基共缔合的能力的β亚基。
另一方面，本发明提供一种制备分离的敲入哺乳动物细胞的方法，所述方法包括下述步骤：(1)在内源Kvβ1.1基因和转基因Kvβ1.1之间实现同源重组，其中所述转基因Kvβ1.1包含(a)一种编码取代Kvβ1.1亚基的整个密码子1-70或其一部分的免疫反应性标志的序列，(b)一个邻接一对重复位点的选择标记，和(c)一对与内源Kvβ1.1基因同源的、邻接所述标志和所述选择标记两者的序列；和(2)实现进一步重组，以去除所述选择标记，其中所述转基因Kvβ1.1编码一种不能赋予N-型失活但保留与Kv1家族α-亚基共缔合的能力的β亚基。优选所述哺乳动物细胞对于所述转基因而言为纯合的。最优选所述免疫反应性标志取代整个密码子1-36或其一部分。
在再一个实施方案中，本发明提供一种表达具有敲入Kvβ1.1亚基的A-型钾通道的哺乳动物细胞，其中所述敲入Kvβ1.1亚基不能赋予所述通道的N-型失活但保留与Kv1家族α-亚基共缔合的能力，其中所述细胞包含一种控制敲入Kvβ1.1亚基表达的内源核酸序列，并且所述敲入Kvβ1.1亚基由选自以下的一种突变编码：置换突变、插入突变、移码突变和终止密码子突变。优选所述细胞选自马、牛、啮齿动物、猫、狗、猪、山羊、绵羊、非人类灵长类、人类、兔子和仓鼠。最优选所述细胞为鼠类细胞。另一方面，所述细胞包含一个突变，其中所述内源核酸序列的整个密码子1-70或其一部分被取代，更优选密码子1-36被取代，并且所述置换包含一个免疫反应性附加表位。最优选所述细胞对于所述置换突变而言为纯合的。
在再一个实施方案中，本发明提供一种在Kvβ1.1基因的密码子1-70中、更优选在密码子1-36中编码一个突变的核酸构建体；其中所述核酸编码一种A-型钾通道的敲入亚基，并且所述核酸敲入亚基不能赋予A-型钾通道的N-型失活但保留与Kv1家族α-亚基共缔合的能力。所述突变可以是置换突变、插入突变、移码突变和终止密码子突变，但最好是置换突变。最优选所述突变包含一个取代Kvβ1.1基因的整个密码子1-70、特别是密码子1-36的免疫反应性附加表位。此外，所述核酸构建体包含核酸，所述核酸或者是脱氧核糖核酸(DNA)，或者是核糖核酸(RNA)。另一方面，所述核酸构建体或者存在于哺乳动物细胞中，或者存在于载体中。
另一方面，本发明提供一种通过同源重组破坏内源Kvβ1.1基因表达的核酸构建体，其中所述构建体包含一个取代Kvβ1.1基因的整个密码子1-70或其一部分的免疫反应性附加表位、一个选择标记和一对邻接所述标志和所述选择标记两者的核酸序列，其中所述序列对与所述内源Kvβ1.1基因的一部分同源。更优选所述免疫反应性附加表位取代整个密码子1-36或其一部分。优选所述免疫反应性附加表位是血凝素附加表位，或者所述选择标记是neo基因。更优选所述选择标记还邻接Lox P核酸序列。最优选所述核酸构建体存在于载体中。
在再一个实施方案中，本发明提供一种就Kvβ1.1亚基活性的调节剂初步筛选试验化合物的方法，所述方法包括下述步骤：(a)使试验化合物与敲入Kvβ1.1亚基接触；和(b)选择一种在敲入Kvβ1.1亚基活性方面有可检测变化的试验化合物，其中所述敲入Kvβ1.1亚基不能赋予N-型失活但保留与Kv1家族α-亚基共缔合的能力。在一个实施方案中，所述敲入Kvβ1.1亚基存在于试验样品中，所述试验样品包括细胞，而所述接触步骤包括将所述试验化合物给予所述细胞。另外，所述检测步骤可以包括采用免疫测定来确定所述Kvβ1.1亚基是否与Kv1家族α-亚基共缔合。在一个实施方案中，所选择的试验化合物与Kvβ1.1亚基结合。优选所述试验化合物是选自以下的一组文库的小分子：由空间可寻址平行固相文库或溶液相文库构成的文库或者由重叠合法(deconvolution)、“单珠单化合物”方法(″one-beadone-compound″methods)或者通过亲和层析选择法制成的合成文库。
另一方面，本发明提供一种就Kvβ1.1亚基活性的调节剂初步筛选试验化合物的方法，所述方法包括下述步骤：(a)使试验化合物与野生型Kvβ1.1亚基和敲入Kvβ1.1亚基接触；和(b)选择一种在所述野生型Kvβ1.1亚基活性方面有可检测变化但是在所述敲入Kvβ1.1亚基活性方面没有可检测变化的试验化合物，其中所述敲入Kvβ1.1亚基不能赋予N-型失活但保留与Kv1家族α-亚基共缔合的能力。在一个实施方案中，所述野生型Kvβ1.1亚基和敲入Kvβ1.1亚基存在于一种试验样品中。另一方面，所述野生型Kvβ1.1亚基存在于第一种试验样品中，而所述敲入Kvβ1.1亚基存在于第二种试验样品中。所述试验样品可以包括细胞，在这种情况下，所述接触步骤包括将所述试验化合物给予所述细胞。在一个实施方案中，Kv1家族α-亚基也与所述试验化合物同时存在，并且可以用免疫测定来确定所述可检测变化是否由于缺乏与Kv1家族α-亚基共缔合所致。在一个实施方案中，所选择的试验化合物与所述Kvβ1.1亚基结合。另外，如上所述，所述试验化合物可以是选自以下的一组文库的小分子：由空间可寻址平行固相文库或溶液相文库构成的文库或者由重叠合法、“单珠单化合物”方法或者通过亲和层析选择法制成的合成文库。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供一种评价试验化合物调节Kvβ1.1亚基活性的功效的方法，即通过使所述试验化合物与野生型Kvβ1.1亚基和突变型Kvβ1.1亚基接触，然后检测所述第二种试验样品中在所述野生型Kvβ1.1亚基活性方面有变化但是在所述敲入Kvβ1.1亚基活性方面没有变化，其中所述敲入Kvβ1.1亚基不能赋予钾通道的N-型失活但是与Kv1家族α-亚基共缔合。所述试验化合物降低所述野生型Kvβ1.1亚基活性优选大于10％，更优选大于50％。在一个实施方案中，所述野生型Kvβ1.1亚基存在于第一种试验样品中，而所述敲入Kvβ1.1亚基存在于第二种试验样品中。所述试验样品可以包括细胞、组织或转基因啮齿动物。优选所述接触步骤包括将所述试验化合物给予所述啮齿动物，更优选所述啮齿动物是小鼠。
在一个可供选择的优选实施方案中，所述接触步骤包括使所述试验化合物与组织或细胞接触。在再一个优选的实施方案中，所述方法包括下述步骤：使所述试验化合物与第三种试验样品接触，然后检测所述第三种试验样品中在完全非功能性Kvβ1.1亚基活性方面没有变化，其中所述第三种试验样品的特征为表达完全非功能性Kvβ1.1亚基。此外，在所述接触步骤包括使所述试验样品与细胞接触的情况下，所述检测步骤包括免疫测定，以确定所述野生型Kvβ1.1亚基是否与Kv1家族α-亚基共缔合。更优选所述剔除亚基存在于啮齿动物中，而该实施方案中的检测步骤包括一个行为实验例如Y形迷宫、环境恐惧条件反射和高架O形迷宫。另一方面，所述剔除亚基存在于啮齿动物中，而该实施方案中的检测步骤包括一个生理学测定例如激素水平测定、体温过高测定和电生理学测定。
在再一个实施方案中，本发明包括一种评价试验化合物使A-型钾通道失活的功效的方法，即通过使试验化合物与野生型Kvβ1.1亚基和敲入Kvβ1.1亚基接触，然后检测在所述野生型Kvβ1.1亚基活性方面有变化但是在所述敲入Kvβ1.1亚基活性方面没有变化，其中所述敲入Kvβ1.1亚基由Kvβ1.1基因序列编码，所述Kvβ1.1基因序列在整个密码子1-70或其一部分、更优选密码子1-36中包含一个突变。在一个实施方案中，所述野生型Kvβ1.1亚基活性方面的变化是由钾通道的N-型失活被抑制所引起的。优选所述野生型Kvβ1.1亚基活性方面的变化使所述野生型亚基具有与所述敲入Kvβ1.1亚基相同的活性。在另一个优选的实施方案中，通过使转基因啮齿动物经历高架O形迷宫，来测量所述活性。或者，通过使转基因啮齿动物经历环境刺激，然后测量所述啮齿动物的皮质酮水平，来测所述活性。在另一个可供选择的实施方案中，通过获取转基因啮齿动物的组织并且使所述组织经历电生理学实验，来测量所述活性。最优选所述转基因哺乳动物是小鼠。在再一个可供选择的实施方案中，通过采用体外结合测定来测量所述活性。此外，在另一个实施方案中，所述试验化合物与所述野生型Kvβ1.1亚基结合但不与所述敲入Kvβ1.1亚基结合。在一个最优选的实施方案中，所述方法还包括使所述试验化合物与完全非功能性Kvβ1.1亚基接触，然后检测在所述完全非功能性Kvβ1.1亚基活性方面没有变化。在该实施方案中，所述试验化合物降低所述野生型Kvβ1.1亚基活性优选大于10％，更优选大于50％。
附图简述
图1A是一幅内源Kvβ1基因结构及其外显子组构的示意图。5′端的三个外显子(外显子1.1、1.2、1.3)共享C末端的共同结构域(外显子3-15)但被可变剪接，所以每个外显子编码独特的N末端蛋白序列。外显子1.1编码靶向突变的失活结构域。这三个外显子1.1、1.2和1.3在基因上的相对顺序是不确定的。
图1B说明使所述内源Kvβ1.1基因靶向突变的策略。打靶载体(最上面)设计用以掺入一个取代外显子1.1的33号密码子的3x HA标志和一个邻接lox的新霉素盒(Flox-Neo)。通过同源重组(第一个箭头)，所述突变型外显子和Flox-Neo发生交换，取代了外显子1.1。由Cre-重组酶介导的第二次重组(第二个箭头)去除所述内含子中的Flox-Neo，留下一个拷贝的LoxP位点(最下面)。限制位点EcoRI和BamHI分别由″R″和″B″表示。
图1C是DNA印迹的示意图，其中用BamHI消化ES细胞。对于野生型Kvβ1等位基因，用来自图1B的5′探针鉴定出一个～7.0kb条带，而在三个中靶的ES克隆(51、145和191)中鉴定出另一个～1.0kb条带，该条带是由位于3x HA内的BamHI位点产生的。
图1D和图1E是RNA酶保护分析结果的示意图，表明敲入Kvβ突变型(Kvβo)mRNA(图1D)和野生型Kvβ(WT)(图1E)的表达模式。与3xHA外显子1互补的探针在杂合KI动物和纯合KI动物(分别为wt/KI和KI/KI)中产生一个被保护的420bp条带，而在野生型(WT)中产生一个较短的被保护的220bp条带，这是由于缺少正常kvβ1.1mRNA N末端的3xHA序列所致。相反，采用与正常kvβ1.1 mRNA互补的探针，通过RPA分析，证明来自WT mRNA、全保护的480bp片段，而两个邻接3xHA序列的片段(210和140)在KI mRNA中被保护。带有Flox-Neo盒的动物没有显示来自任一探针的特异性条带，表明完全缺乏Kvβ1.1表达和KO基因型。
图1F是采用来自不同基因型的样品通过PCR分析的结果的示意图。Kvβo KI引物扩增外显子1.1的3′外显子-内含子边界和Neo-Flox下游30bp的位点之间的片段，从而使得可以鉴定出纯合野生型动物(w/w)、纯合KO动物(o/o)、纯合KI动物(I/I)和杂合KI动物(w/I)。所述KI等位基因包括存在一个loxP重复序列，因此提供要比WT等位基因(230bp)长的扩增序列(264bp)。
图1G是所进行的蛋白质印迹的示意图，以分析Kvβ1、Kvβ2、突触蛋白1(对照)或HA在WT小鼠和突变型小鼠的皮质、纹状体、海马、小脑、中脑和丘脑中的表达。将所指定的脑区进行解剖并分析其特异性免疫反应性。
图2A-2B说明在WT 129/SvEv小鼠与KO小鼠和KI小鼠在Y形迷宫中的不同学习和记忆模式(实施例2)。图2A说明在30分钟、2小时和4小时的实验中间间隔(ITI)后，所述迷宫中首选新臂的小鼠百分率。图2B说明在30分钟、2小时和4小时的ITI后，花费在新臂中的时间(2分钟周期)的百分率。
图3A-3B说明在环境恐惧条件反射实验中，C57BI6背景(图3A)和129/SvEv背景(图3B)下的WT小鼠、KI小鼠和KO小鼠之间的不同学习模式。
图4A-4B说明在高架O形迷宫的开放场区中，在C57BI6背景(图4A)和129/SvEv背景(图4B)下的三种不同基因型即WT、KI和KO所花费的时间百分率。
图5A说明不同剂量的氯氮对雄性WT(129/SvEv)小鼠应激诱导的体温过高的影响。插图显示初次测量的体温。
图5B说明野生型小鼠(WT；129/SvEv)、Kvβ敲入小鼠(KI)和剔除小鼠(KO)中对应激诱导的体温过高的反应。插图显示初次测量的体温。
图6说明在Kvβ敲入小鼠中癫痫发作阈值是不变的。
图7说明c-fos mRNA在KI小鼠、KO小鼠和野生型小鼠的顶叶皮质中的原位杂交定量测定。
发明详述
本发明涉及这样的发现：与带有Kvβ1.1的一个剔除突变的转基因小鼠(KO)或野生型小鼠(WT)相比，在Kvβ1.1基因中带有一个敲入突变的转基因小鼠(KI)表现出显著不同的行为表型。所述KI小鼠的β-亚基缺乏使Kv1-家族K+通道失活的能力但保留与Kv1家族α-亚基共缔合的能力，从而增强了通道表面表达。在三个不同的行为示例即Y形迷宫实验、环境恐惧条件反射和高架O形迷宫中，KI小鼠始终如一地表现出与KO小鼠不同的行为模式。根据花费在Y形迷宫的新臂上的时间所表明的(参见实施例2)，KI小鼠与KO小鼠和WI小鼠相比，表现出半小时实验中间间隔(ITI)的滞留不足；但在4小时ITI时，与KO小鼠相比，表现出滞留改善。在所述环境恐惧条件反射实验中，KI小鼠与KO小鼠和WT小鼠相比，表现出显著减退(参见实施例4)。此外，在机能测定例如高架O形迷宫(实施例4)、应激诱导的皮质酮水平(实施例5)和应激诱导的体温过高(实施例6)中，KI小鼠与KO小鼠相比，表现出不同的行为模式和生理模式。
虽然不希望受理论的束缚，但是人们相信所述KI突变诱发与KO不同的表型，反映出特异性缺乏N-型通道失活。KI活性在行为测定和生理学测定中的结果表明一种抗焦虑分布型，因此，提供在筛选用于治疗惊恐性障碍和焦虑性障碍的试验化合物中的潜在作用。
因此，本发明涉及其基因组编码所述KI突变的转基因哺乳动物、特别是转基因小鼠，并且涉及用于产生所述转基因动物的核酸构建体和打靶构建体。另外，所述KI转基因动物提供一种用于评价试验化合物调节Kvβ1.1活性的功效的阳性模型。如下所述，本发明也涉及结合测定、高通量测定和机能测定(特别是行为测定和生理学测定)，以测定试验化合物调节Kvβ1.1活性的能力。
定义
为了便于对本发明的理解，许多术语和短语如下定义：
术语Kvβ1.1是指A-型钾通道的β1亚基，特别是摇动器样电压门控钾通道(Kv)的β1.1亚基同种型。所述Kv通道通常由4种相同的亚基构成，它们围绕中央充满水的小孔结合在一起。该孔打开时让钾离子通过，或者在对细胞电位变化作出反应时关闭；因此，是“电压门控的”。所述Kv通道和所述β1.1亚基是本领域技术人员已知的。
本文所用的敲入Kvβ1.1突变(″KI″)是指Kvβ1.1基因中的突变，因此突变型Kvβ1.1基因编码不能赋予K+通道的N-型失活但能够与Kv1家族α-亚基共缔合的缺陷型β1.1亚基，从而增强了通道表面表达。本文所用的KI亚基是指由所述KI突变编码的突变型β1.1亚基，而KI哺乳动物是指具有已表达KI突变的哺乳动物。在优选的实施方案中，通过在Kvβ1.1基因的密码子1-70中诱导突变而产生KI突变。Kvβ1.1的密码子1-70在SEQ ID NO：1中提供。Kvβ1.1的优选DNA序列和氨基酸序列范围示于SEQ ID NO：1中。所述突变最好是其中整个密码子1-36或其一部分被置换的置换突变，如实施例1和SEQ ID NO：2的″Kvβo″突变所示。在特别优选的实施方案中，免疫反应性标志取代Kvβ1.1基因的整个内源密码子1-70或至少1-36并且有助于检测与α-亚基的共免疫沉淀。另一方面，可以将任何外源核酸序列插入到所述内源Kvβ1.1基因中，以产生所述KI突变。Kvβ1.1敲入哺乳动物或其组织或细胞既包括杂合子哺乳动物(即一个突变型等位基因和一个野生型等位基因)，又包括纯合突变体(即两个突变型等位基因)。
Kvβ1.1剔除突变(″KO″)是指Kvβ1.1基因中的突变，因此所述突变型Kvβ1.1基因编码不能赋予钾通道的N-型失活或者不能与Kv1家族α-亚基共缔合的β-亚基，或者其中完全不存在所述Kvβ1.1基因。简而言之，所述KO突变编码完全非功能性Kvβ1.1亚基。本文所用的KO亚基是指由所述KO突变编码的突变型β1.1亚基，而KO哺乳动物是指具有已表达KO突变的哺乳动物。术语“Kvβ1.1-剔除”既指杂合子哺乳动物，又指纯合突变体哺乳动物，以及它们的组织或细胞。Kvβ1.1-剔除突变的一个实例示于实施例1中，其中将新霉素标记插入到Kvβ1.1基因的一个内含子中并且完全破坏所述基因的功能性。
术语野生型Kvβ1.1(″WT″ )是指具有天然存在的编码完全功能性Kvβ1.1亚基的核苷酸序列和氨基酸序列的Kvβ1.1基因，其中编码所述Kvβ1.1亚基的基因任何时候在下一代或祖先各代中都没有进行过缺失天然存在的材料或者包括外源遗传材料的实验操作。
术语“经遗传修饰的”是指含有和/或表达包含诱导型突变的基因的细胞，进而修饰所述细胞的基因型和表型，随后修饰其后代。该术语包括细胞内源核苷酸的任何添加或破坏，包括插入突变、移码突变或终止密码子突变。术语“突变型(mutated)”或“突变体(mutant)”及其各种符合语法规则的衍生物，是指包含诱导型突变的任何基因或者由其编码的基因产物。本文所用的突变型Kvβ1.1基因通常是指编码敲入Kvβ1.1亚基或剔除Kvβ1.1亚基的基因。
术语本发明的“非人类哺乳动物”包括任何脊椎动物，例如啮齿动物、非人类灵长类、绵羊、牛、反刍动物、兔形目动物、猪、山羊、马、犬、猫、鸟类等。优选的非人类哺乳动物选自啮齿动物目，包括大鼠和小鼠，最优选小鼠。
本文所用的术语“转基因”是指通过将外源核酸序列导入胚胎干(ES)细胞、新受精卵或早期胚胎中而置于题述哺乳动物体内的外源核酸序列。术语“外源核酸序列”是指通过实验操作而导入动物基因组中的任何核酸序列，可以包括在该哺乳动物中发现的核酸序列，只要所导入的基因相对于天然存在的基因而言含有某些修饰(例如免疫反应性附加表位、点突变、存在选择标记基因、存在loxP位点等)。
术语“打靶构建体”是指寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列包含修饰(例如免疫反应性附加表位、插入突变、终止密码子突变、存在选择标记基因、存在loxP位点等)和与内源Kvβ1基因同源的、邻接所述修饰的序列。一般而言，将所述打靶构建体连接到能够将所述构建体导入宿主细胞中的打靶载体例如质粒中。所述同源序列允许所述打靶构建体或载体同源重组到靶细胞或受体细胞(例如ES细胞)的染色体中的内源Kvβ1基因的至少一个等位基因中。所述打靶构建体或载体可以含有不止一种修饰。优选本发明的打靶构建体和载体为“置换型”打靶构建体和载体，其中两个同源区均邻接所述基因修饰，并且导致位于所述同源区之间中靶基因部分被置换。相比之下，插入型构建体和载体仅具有一个含有中靶基因的同源区，并且导致相邻部分插入到所述中靶基因中，通常插入到羧基末端或氨基末端。如果在本发明中使用插入型构建体或载体，则所述同源区必须击中靶，以插入到Kvβ1.1基因的氨基末端。如本文所证明的，同源重组允许打靶构建体和载体的整合，以破坏Kvβ1的失活结构域，导致不能赋予N-型失活。
本文所用的术语“选择标记”是指编码酶活性的基因，所述酶活性给表达所述选择标记的细胞赋予抗生素抗性或抗药性。本发明的选择标记最好是“正”选择标记；正选择标记通常是显性选择标记，即可以被检测的编码酶活性的基因，无论是存在于哺乳动物细胞中还是存在于细胞系(包括ES细胞)中。
本文所用的术语“调节活性”包括正常蛋白活性(例如野生型Kvβ1.1活性)的刺激、增强、抑制和/或抑制解除。所述术语不包括所述蛋白表达水平的正调节或负调节。
关于WT亚基、KI亚基或KO亚基所用的术语“活性”是指特定亚基行使其正常功能的能力，即正常WT亚基活性既与Kv1家族α亚基共缔合又使钾通道失活，正常KI亚基活性通常与Kv1家族α亚基共缔合但不使通道失活，而正常KO亚基活性完全不能共缔合或者使钾通道失活。因此，“活性方面的可检测变化”或“检测活性方面的变化”是偏离特定亚基的正常功能，正如通过以下描述的结合测定和功能分析所测定的。本发明的结合测定通常使用放射性标记来检测结合，因此检测活性方面的变化，而所述功能分析将运用行为或生理学的统计学显著性偏差，来检测亚基活性方面的变化。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指两个或更多个亚单位氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物(peptidomimetics)的聚合物。所述亚单位可以通过肽键或其它键例如酯键、醚键等连接。本文所用的术语“氨基酸”包括天然氨基酸和/或非天然氨基酸或合成氨基酸，包括甘氨酸以及D或L旋光异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟物。三个或更多个氨基酸的肽通常称为寡肽。多于三个或更多个氨基酸的肽链称为多肽或蛋白。
本文所用的术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，包括任何长度的核苷酸的聚合物形式，或者为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何已知或未知的三维结构，并且可以行使任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括修饰核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。对核苷酸结构的修饰可以在所述聚合物装配之前或之后进行(如果存在的话)。核苷酸序列可能间隔有非核苷酸组分。多核苷酸可以在聚合后进行进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。所述术语也包括双链分子和单链分子。随非另有说明或需要，作为多核苷酸的本发明任何实施方案包括双链形式以及已知或预计构成双链形式的两条互补单链形式的每条互补单链形式。
“抗体”包括能够结合抗原上存在的表位的免疫球蛋白分子。本文所用的所述术语不仅包括完整的免疫球蛋白分子例如单克隆抗体和多克隆抗体，而且包括抗独特型抗体、突变体、片段、融合蛋白、双特异性抗体、人源化蛋白和包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的各种修饰。
本文所用的术语“结合配偶体”或“捕获试剂”或“结合对”的成员是指特异性地结合其它分子以形成结合复合物的分子，例如抗体-抗原、凝集素-糖类、核酸-核酸、生物素-抗生物素蛋白等。
本文所用的术语“结合”或“特异性结合”就生物分子(例如小分子、蛋白质、核酸、抗体等)而言，是指测定分子的不均一群体(例如蛋白质和其它生物制剂)中存在所述生物分子的结合反应。因此，在指定条件(例如就抗体而论为免疫测定条件或者就核酸而论为严格性杂交条件)下，具体的配体或抗体与其特定“靶”分子结合而不以显著量与样品中存在的其它分子结合。
术语“模拟(mimic)”或“模仿(imitate)”当用于指试验化合物模仿突变型Kvβ1.1亚基活性的能力时，是指所述化合物产生与表达突变型Kvβ1.1基因即KI突变或KO突变的哺乳动物中观察到的作用基本相似的作用(例如行为、电生理学、生物化学)的能力。
术语“试验化合物”是指在本文描述的一种或多种测定中被筛选出的化合物。所述化合物实际上可以是任何化合物。它可以以单个分离的化合物存在，也可以是化学文库(例如组合文库)的一个成员。在一个最优选的实施方案中，所述试验化合物是一种小分子。
术语“小分子”是指大小与一般用于药物中的有机分子相当的分子。所述术语不包括生物大分子(例如蛋白质、核酸等)，而是包括肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或它们的组合。优选的小分子的大小范围至多约5000Da，更优选至多2000Da，最优选至多约1000Da。另外，所述小分子可以包括多种化学类别，而最好是具有能够使蛋白质相互作用的官能团(例如胺、羰基、羟基或羧基)的有机分子。典型的小分子化合物将包括被一个或多个上述官能团取代的环碳或杂环结构和/或芳族或多芳族结构。
本文所用的“试验样品”是指适合于本发明测定的任何样品，包括但不限于细胞样品、组织样品和/或整个动物。所述试验样品最好是从生物体或生物体的组成部分(例如细胞、组织、液体)中获得的生物样品。
在以下小节中进一步详细地描述本发明的各个方面。以下小节更详细地描述本发明。小节的应用并不是用来限制本发明；各小节可适用于本发明的任何方面。
I.转基因Kvβ1.1敲入哺乳动物的产生
A.打靶构建体的设计
本发明的敲入转基因最好包括仅使Kvβ1.1基因的一部分失活的外源DNA序列，特别是使K+通道快速失活的氨基末端中的“球状”结构域。所述突变可以是被取代的或插入到内源Kvβ1.1基因中的置换突变、插入突变、移码突变或终止密码子突变。这样的转基因最好含有至少一种与功能将被破坏的内源Kvβ1.1基因的某一部分相同的DNA序列。在Kvβ1.1等位基因的整个密码子1-70(SEQ ID NO：1)或其一部分中存在所述突变将功能性地破坏所述失活结构域的表达(参见例如图1A)。
优选所述突变或者通过干扰Kvβ1.1蛋白的失活结构域的转录或翻译的起始或者通过使其转录或翻译过早终止而导致功能破坏。更优选所述转基因是置换型突变，因为它们增加内源Kvβ1.1基因中所述构建体的稳定性并且降低第二次重组和回复突变的可能性。
在一个优选的实施方案中，通过将编码免疫反应性附加表位和/或选择标记的表达盒连接到编码Kvβ1.1基因产物的DNA序列中，产生用来产生所述转基因的核酸构建体(“打靶构建体”)。所述打靶构建体还包含至少一个邻接与内源Kvβ1.1基因的至少一部分同源的表达盒的序列部分。与氨基末端相邻的一个同源序列的存在将使得在Kvβ1.1基因的失活结构域中能够有一个插入突变。然而，在一个最优选的实施方案中，所述打靶构建体既包含免疫反应性附加表位又包含选择标记，进而它们两者均邻接一对与内源Kvβ1.1同源的序列(参见例如实施例1)。所述序列对最好与编码密码子1-70即通道失活所需的失活结构域的内源Kvβ1.1序列同源。
另一方面，所述盒也被插入到这样的位置中，致使剪接出所述盒则引入移码突变，导致非功能性回复突变。在再一个可供选择的实施方案中，所述盒可以提供使转录或翻译过早终止的终止密码子。尽管可以利用这些可供选择的实施方案开发本发明的转基因哺乳动物，但是通过这些方法来检测成功地整合到所述内源序列中需要广泛使用DNA杂交和PCR分析。因此，最好是掺入一个免疫反应性附加表位，以便跟踪并分离所述敲入Kvβ1.1亚基。
可以将免疫反应性附加表位与所述打靶构建体融合，以提供抗标志抗体可以选择性结合的表位。所述附加表位最好置于对应于Kvβ1.1基因的密码子1-70、更优选对应于密码子1-36的打靶构建体的氨基末端。在转录和翻译之后，采用抗所述标志亚基的抗体，可以检测出敲入Kvβ1亚基中这种已附加表位的形式的存在。另外，提供所述附加表位使得采用与抗标志抗体或结合所述附加表位的另一种亲和基质类型容易通过亲和纯化而纯化的Kvβ1亚基。另一方面，可以将所述打靶构建体与编码免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区例如IgG分子的Fc区的核酸序列融合，以供与无关的附加表位特异性结合。
各种附加表位及其相应的抗体是本领域众所周知的。实例包括多聚组氨酸(poly-his)或多聚组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标志；所述流感HA标志多肽及其抗体12CA5；c-myc标志及其8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体；和单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标志及其抗体。其它附加表位包括Flag-肽；KT3表位肽；微管蛋白表位肽；和T7基因10蛋白肽标志。
优选的“正”选择标记包括细菌氨基糖苷3′磷酸转移酶基因(′neo′)，它赋予哺乳动物细胞对药物G418的抗性；细菌潮霉素G磷酸转移酶基因(hyg)，它赋予对抗生素潮霉素的抗性；细菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(也称为gpt基因)，它赋予在霉酚酸存在下生长的能力；以及hprt基因、nDtII基因或其它基因，它们赋予对氨基酸或核苷类似物或抗生素等的抗性。在所述转基因中编码正选择标记的DNA(例如neoR)一般与表达调节序列连接，以允许其在ES细胞中独立转录。此外，也可以使用“负”选择标记，所述负选择标记编码其表达对在合适选择培养基中生长的细胞有细胞毒性的酶活性。例如，用HSV-tk基因作为负选择标记。HSV-tk基因在更昔洛韦或阿昔洛韦存在下生长的细胞中的表达有细胞毒性；因而细胞在含有更昔洛韦或阿昔洛韦的选择培养基中的生长选择出能够表达功能性HSV-TK酶的细胞。在使用正选择标记和负选择标记的一个实例中，表达活性HPRT酶的细胞不能在某些核苷类似物(例如6-硫鸟嘌呤，8-氮嘌呤等)存在下生长，但却能够在补充HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)的培养基中生长。相反，不能表达活性HPRT酶的细胞不能在含有HATG的培养基中生长，但是对如6-硫鸟嘌呤等的类似物有抗性。
B.同源重组
本发明最好利用同源重组来控制特定DNA序列(转基因)整合到哺乳动物细胞中天然存在的Kvβ1.1序列中的位点，从而破坏该基因的正常功能性。同源重组是本领域众所周知的。总之，同源重组是在有丝分裂期间发生的自然过程，因此两个具有相同或基本相似(即“同源”)的序列的核酸分子使所述DNA序列与同源序列发生本质上“转换”或者在同源序列内发生“转换”，致使每个最初存在的分子的一个区现在连接到另一分子的一个区中。
可以通过本领域技术人员熟知的方法，对同源重组的过程进行操作，以靶向特定基因。最常用的技术是使用正选择标记或负选择标记或它们两者，来鉴定并分离转化细胞。此外，通过利用诸如三甲基补骨脂素或UV光的刺激剂，来提高DNA分子之间的重组频率是可行的。
在一个优选的实施方案中，所述打靶构建体包含一个表达盒，进而包含免疫反应性附加表位和/或选择标记，并且所述表达盒邻接至少一个与内源Kvβ1.1基因的一部分同源的序列。优选设计所述打靶构建体以将免疫反应性附加表位连接到对应于内源Kvβ1.1基因的整个中靶区或其一部分(即编码密码子1-70、特别是密码子1-36的失活结构域)的核酸序列中。所述免疫反应性附加表位随后允许通过蛋白质印迹或免疫测定进行鉴定和分离。另一方面，或者除所述免疫反应性附加表位之外，还可以将诸如neo的正选择标记插入到对应于内源Kvβ1失活结构域的序列中或所述序列附近，致使所述盒的表达提供抗生素抗性(neo提供对抗生素G418的抗性)。在所述最优选的实施方案中，所述表达盒既包含免疫反应性附加表位，又包含选择标记。此外，所述打靶构建体还包含一对邻接所述表达盒两侧并且与内源Kvβ1.1的氨基末端部分同源的第一个和第二个序列。
所述内源基因的这些第一个和第二个同源序列将所述转基因靶向ES细胞中的特定Kvβ1等位基因。在通过同源重组打靶的一个成功实例中，位于所述同源序列之间的核酸区准确地整合到ES细胞的一个等位基因的中靶内源基因中，并且取代所述中靶内源基因的一部分。因此，中靶Kvβ1等位基因的一个拷贝由于与所述转基因同源重组而被破坏。此后，用G418进行选择，选择出含有通过同源重组整合到所述基因组中的转基因的转染ES细胞。此外，通过与抗所述免疫反应性附加表位的抗体亲和结合，可以根据整合到编码Kvβ1亚基中而对所述转基因进行检测。
在本发明的最优选的实施方案中，最好没有掺入到转基因动物细胞中的已表达抗生素抗性基因，也就是说，所述抗生素抗性基因可能具有有害作用即相邻基因或甚至在长距离中靶基因上的“相邻效应”。因此，在一个最优选的实施方案中，一旦所述构建体与内源Kvβ1.1基因一起经历同源重组，则在允许待切除的抗生素抗性基因的敲入构建体中包括一个或多个遗传元件。
在该最优选的实施方案中，所述抗生素抗性选择标记邻接重复重组位点，例如LoxP位点。在基因组DNA中存在直接重复例如loxP使得重组酶蛋白例如Cre-重组酶能够切除间插DNA(neo基因)，仅留下中靶基因座中的一个LoxP位点。该LoxP位点的存在(即使有也很少)影响表达。在该实施方案中，将所述选择标记插入到内含子中并且仅用其来鉴定所述内源基因中打靶构建体的成功整合。一旦转染成功，则Cre-重组酶可以在ES细胞中或者在转基因小鼠的特定组织中表达，以有效去除所述neo标记。Westphal等，Proc Natl Acad Sci(1996)93：5860。
如上所述，通过在外显子1.1的一部分(如实施例1所述)中、最优选在密码子1-36中、特别是在密码子1-15中产生一个突变，可以对所述Kvβ1失活结构域进行突变。还应该注意到，将密码子7的半胱氨酸残基转变为除丝氨酸残基以外的任何其它密码子(错义密码子、终止密码子等)，将会破坏所述失活结构域。通过取代内源外显子1.1序列的一部分即免疫反应性附加表位、选择标记、终止密码子，或者插入到所述序列中，或者通过产生移码突变，可以进行所述突变。然而，在最优选的实施方案中，仅所述免疫反应性附加表位破坏所述氨基末端并且保留在最后的中靶基因中。所述选择标记在转化后被切除。优选将所述附加表位整合到所述细胞的两个等位基因中所述Kvβ1.1基因的失活结构域中，但发生该事件的频率低(单突变事件频率的平方)。因此，可以进行杂合动物的杂交育种，以产生在两个等位基因中均具有敲入Kvβ1.1的纯合动物。
优选所述DNA分子为双链DNA分子，但是在本发明中也可以使用单链DNA分子。另外，可以将所述DNA分子导入细胞中，或者作为DNA或者作为RNA，所述RNA进而可以通过逆转录酶或其它方法转变成DNA。用于实施本发明的一个说明性的最佳模式在实施例1中提供。
C.细胞转化
为了产生本发明的敲入哺乳动物，通过将上述打靶构建体导入能够产生胚胎的所有细胞类型(包括生殖细胞)的全能细胞例如胚胎干(″ES″)细胞中而使细胞转化。在本发明中可以使用各种各样的ES细胞。通过培养来源于鼠胚泡的细胞，已经分离出小鼠ES细胞(Evans等(1981)Nature 292：154-156；Bradley等(1984)Nature 309：255-258；Gossler等(1986)Proc.Acad.Sci USA 83：9065-9069；和Robertson等(1986)Nature 322：445-448)。然而，最好使用ES细胞的原代分离株。原代分离株可以直接从胚胎例如CCE细胞系或其ES细胞的克隆分离株中获得(Schwartzberg等(1989)Science 212：799-803)。总的来讲，人们知道，原代分离株对于分化成哺乳动物是更有效的，特别是克隆选择的ES细胞在产生转基因动物方面的效率比CCE祖细胞系约高10倍。克隆分离的ES细胞系的某些实例包括AB1(hprt+)和AB2.1(hprt-)。
优选所述ES细胞在基质细胞例如原代胚胎G418 R成纤维细胞和/或STO细胞上进行培养。成纤维细胞和/或基质细胞防止异常ES细胞克隆过度生长。最优选将所述细胞在分化抑制因子(″DIF″)例如白细胞抑制因子(″LIF″)存在下进行培养，以防止过早分化。其它已知的DIF包括制瘤素M、具有可溶性IL-6受体(sIL-6R的白介素6(IL-6)和睫状神经营养因子(CNTF)、T-LIF(美国专利第5,849,991号)和某些细胞因子。此外，可以用可表达DIF转化基质细胞，然后可以培养ES细胞。
将外源核酸导入哺乳动物宿主和宿主细胞的方法是本领域众所周知的，并且视宿主细胞而变化。这些技术包括电穿孔、DEAE-葡聚糖介导的转染、磷酸钙共沉淀、原生质体或原生质球融合、脂质转染、微注射或病毒感染。然后可以将转染ES细胞导入胚泡期胚胎的囊胚腔中并且对所述转基因哺乳动物的种系产生影响。
另外，在将所述ES细胞导入囊胚腔之前，可以使用如上所述的各种选择方案(例如neo选择标记)来选择掺入了所述转基因的转染ES细胞。另一方面，可以使用DNA杂交或PCR来确定所述转基因的整合情况。
1.微注射
另外，用于产生含有所述转基因的转基因哺乳动物的替代方法是本领域已知的。按照相应的不同技术，可以使用各个发育期的胚胎细胞。在使用合子的情况下，微注射是优选的技术，如美国专利第4,873,191号中所描述的，所述专利的内容通过引用结合到本文中。在小鼠中，当雄性原核达到直径约20微米时，可以制备1-2皮升(pl)的DNA注射液。此外，可以在第一次切割之前注射所述合子，从而确保将所述构建体掺入到转基因动物的所有体细胞和生殖细胞中(Brinstei等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，4438-4442)。所产生的转基因哺乳动物将能够使外源DNA传递到将来的后代。此外，在该实施方案中，不一定需要首先将所述打靶构建体导入自我复制的质粒或病毒中。
2.逆转录病毒转化
在另一个实施方案中，用逆转录病毒感染将转基因导入非人类哺乳动物中。逆转录病毒感染的技术利用已在体外培养至胚泡期的胚胎并且靶向用于感染的卵裂球(Jaenich(1976)Proc.Natl.Acad.SciUSA 73：1260-1264)。酶促处理去除胚泡的透明带并且促进通过携带转基因的复制缺陷型逆转录病毒的感染(Van der Putten等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，6148-6152)。然后将所述转染卵裂球在病毒生产细胞单层上进行培养。另外，可以将病毒或病毒生产细胞注射到囊胚腔中(Jahner等(1982)Nature，298：623-628)。在该实施方案中，所产生的转基因哺乳动物对于所述转基因将会是嵌合的，这是因为仅所述细胞的亚组掺入了所述转基因。另外，转基因的逆转录病毒插入可以发生在基因组的不同位置，一般将会在子代中分离。在该技术的略微变化中，也可以通过中妊娠(midgestation)胚胎的子宫内逆转录病毒感染，将所述转基因导入种系中，从而产生所述转基因的更广泛的整合(Jahner等(1982)，参见上文)。
3.电穿孔到ES细胞中
在一个最优选的实施方案中，通过电穿孔，将含有所述打靶构建体的转基因导入ES细胞中(Toneguzzo等，(1988)Nucleic Acids Res.，16：5515-5532；Quillet等(1988)J.Immunol.，141：17-20；Machy等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：8027-8031)。然后将细胞进行培养，并选择出成功整合所述转基因的细胞，如上所述(例如在G418培养基中的neo)。另一方面，可以通过放射性标记核苷酸或者通过其它不需要选择标记序列表达的检测分析例如通过PCR扩增技术，来检测所述转基因。
4.其它非人类转基因哺乳动物
本领域技术人员将会认识到，除小鼠以外，还有许多可以用于本发明的其它天然或转基因哺乳动物。如同所述鼠类模型一样，可以用这些动物的合子或ES细胞作为供导入所述转基因的胚胎靶。在每种情况下，产生具有理想缺陷型Kvβ亚基表型(即所述哺乳动物的特征性表型)的转基因非人类哺乳动物。
尽管通过微注射产生转基因哺乳动物最成功是在小鼠中，但是也可以通过微注射合子产生其它的转基因哺乳动物，包括兔子、绵羊、牛和猪(Jaenisch(1988)Science 240：1468-1474；Hammer等(1986)J.Animal.Sci，63：269；Hammer等(1985)Nature 315：680；Wagner等(1984)Theriogenology 21：29)。然而，最优选本发明的转基因哺乳动物是小鼠或大鼠，其微注射成功率大约为10-30％。另外，采用其它非人类哺乳动物ES细胞，可以使用逆转录病毒介导的方法或电穿孔技术。对于小鼠和猪的ES细胞系的来源本领域先前已有报道(Robertson，Embryo-Derived Stem Cell Lines(胚胎来源的干细胞系)，载于：Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach(E.J.Robertson主编)，IRL Press，Oxford(1987)；PCT公布号WO/90/03432；PCT公布号94/26884)。另外，虽然优选来源于哺乳动物例如啮齿动物、兔子、绵羊、山羊、鱼、猪、牛、灵长类和人类的细胞或者从所述哺乳动物中分离的细胞，但是ES细胞系可以来源于任何物种(例如鸡等)或者从所述物种中分离出来。在本发明的最优选的实施方案中，使用鼠类ES细胞。
正如本领域所公知的，对其它非人类哺乳动物Kvβ1.1等位基因的转化需要该物种的Kvβ1.1基因序列。鼠类Kvβ1.1基因序列保藏于Genbank中，保藏号为AF033003；而大鼠Kvβ1.1序列保藏于Genbank中，保藏号为X70662。Kvβ1.1基因在其它非人类哺乳动物中的结构和功能也是本领域众所周知的，并且是公众可得到的。此外，对于给定物种的所需Kvβ1.1序列可以容易地通过使用已知Kvβ1.1序列的探针、杂交或本领域众所周知的其它这类技术来获得。在低严格性下使用合适的探针并且通过常规方法对所述基因的其余部分测序，可以对靶哺乳动物的基因组文库进行筛选(即DNA印迹)。
一旦获得所需物种的靶Kvβ1.1序列，则可以如上所述(采用各种置换突变、插入突变、终止密码子突变或移码突变)设计靶构建体，以使Kvβ1.1的球状结构域失活。然后，采用如上所述的方法和下文实施例1中描述的方法，本领域技术人员可以进行将所述打靶载体导入所述物种的ES细胞或合子中，从而产生本发明的转基因哺乳动物。
II.体外结合测定
A.初步筛选测定
在本发明的一个实施方案中，所述敲入Kvβ1.1亚基(在失活结构域中掺入了置换突变、插入突变、终止密码子突变或移码突变)可用于根据试验化合物调节Kvβ1.1亚基活性的能力，对试验化合物进行初步筛选。在这些实施方案中，所述敲入Kvβ1.1亚基尤其可用于鉴定干扰正常Kvβ1.1亚基的特定功能即Kvβ1.1亚基或者与Kv1家族α亚基共缔合的能力或者其使所述钾通道失活的能力的化合物。在一个初步筛选实施方案中，使试验化合物与敲入Kvβ1.1亚基接触，并且选择能够提供敲入Kvβ1.1亚基活性方面可检测变化的试验化合物。最有可能的是，所述可检测变化将会检测试验化合物与敲入Kvβ1.1亚基的结合。另外，可以用免疫测定来确定敲入Kvβ1.1亚基是否与Kv1家族α亚基共缔合或者试验化合物之一是否阻止共缔合。在该实施方案中，可以用所述结合测定来初步筛选出较Kv1家族α亚基优先结合Kvβ1.1的试验化合物，反之亦然。
另一方面，在比较方法中采用结合测定，试验化合物根据其结合野生型(″WT″)Kvβ1.1亚基但不结合突变型敲入(″KI″)Kvβ1.1亚基的能力进行初步筛选，从而鉴定出用于抑制通道失活的潜在候选物。在进行以下描述的另外的结合测定和复合物功能分析之前，可以使用这些初步筛选结合测定中的每一种。
采用固定或不固定靶结合蛋白(KI、WT、KO Kvβ1.1和Kv1α)的结合测定是本领域已知的，并且可以用来对试验化合物进行筛选。可以用纯化的基于细胞的或基于蛋白(无细胞)的筛选测定来鉴定这类化合物。例如，可以将突变型Kvβ1.1(KI)亚基以纯化形式固定在载体上，并且可以在存在和不存在潜在抑制性化合物的情况下测定与突变型Kvβ1.1亚基的结合，即可以在Kv1家族α亚基存在下测量竞争性结合。相反。可以将Kv1家族α亚基固定在载体上并且在突变型KI Kvβ1.1存在下使其与试验化合物接触。
所述体外结合测定可以用来进行各种各样的有用的比较分析，以揭示出Kvβ1.1亚基活性的另外的调节剂。在一个优选的比较性方案中，可以将纯化野生型Kvβ1.1亚基(″WT″)固定在载体上，并且可以在存在或不存在试验化合物的情况下测量与WT Kvβ1.1亚基的结合，然后将其与以纯化形式也固定在载体上并使其与试验化合物接触的敲入Kvβ1.1进行比较。WT Kvβ1.1亚基和KI Kvβ1.1亚基可以同时存在于同一试验样品中，或者可以存在于不同的试验样品中。该实施方案可用来鉴定能够模拟KI Kvβ1.1亚基活性的化合物。然后将与所述WT成功结合但不与所述KI结合的试验化合物进行如下描述的另外的结合测定和功能分析，以将其用作针对焦虑性障碍的潜在治疗药物。所述KO亚基还可以用作针对所述WT基因型和KI基因型的对照。合适的结合测定还可以使用WT Kvβ1.1亚基、KI Kvβ1.1亚基或KO Kvβ1.1亚基的纯化多肽形式，或者可以使用特征为表达上述基因型的每种基因型的细胞。
最优选设计所述初步筛选测定，使得可以根据与题述WT Kvβ1亚基、KI Kvβ1亚基或KO Kvβ1亚基的相互结合活性，对大量的试验化合物同时进行筛选和评价。
B.高通量筛选
本发明的初步筛选测定最好适合于“高通量”模态。传统的研究方法需要研究具有某些所需特性(调节特性、抑制特性等)的“先导化合物”，然后修饰所述先导化合物，以产生变异体，并且评价所述变异体的功效。另一方面，高通量筛选使得能够更快速地发现药物并已变成用于产生试验化合物的优选方法。
在一个优选的实施方案中，高通量筛选方法包括提供含有大量潜在具有所需活性的试验化合物的文库。然后如本文所述，在一个或多个测定中，对这样的“组合化学文库”进行筛选，以鉴定那些表现出所需特征性活性的文库成员(特定化学种类或亚类)。然后可以将经鉴定的化合物用作常规“先导化合物”或者它们本身可以用作潜在或实际的治疗药。
1.潜在Kvβ1.1调节剂的组合化学文库
组合化学文库是通过化学合成或生物合成产生的通过将各种化学“构件”例如试剂组合在一起的不同化合物的集合物。例如，线性组合化学文库例如多肽文库通过将一组称为氨基酸的化学构件以给定化合物长度(即多肽化合物中的氨基酸数)的每种可能的方式组合在一起而形成的。通过化学构件的这样的组合混合，可以合成数百万的化合物。优选文库根据候选小分子进行筛选。这样的文库的实例包括空间可寻址平行固相文库或溶液相文库或者由重叠合法、“单珠单化合物”方法或者通过亲和层析选择法制成的合成文库。
组合化学文库的制备和筛选是众所周知的。实例包括但不限于肽文库(参见例如美国专利5,010,175)。肽合成决不是所设想的并且计划供本发明使用的唯一方法。也可以使用产生化学多样性文库的其它化学，这样的化学包括但不限于肽(PCT公布号WO 91/19735)、编码肽(PCT公布号WO 93/20242)、随机生物寡聚体(PCT公布号WO92/00091)、苯并二氮杂类(美国专利5,288,514)、diversomers例如乙内酰脲类、苯并二氮杂类和二肽类(Hobbs等(1993)Proc.Nat Acad.Sci.USA 90：6909-6913)、插烯多肽(Hagihara等(1992)J.Amer.Chem.Soc.114：6568)、具有β-D-葡萄糖支架的非肽类肽模拟物(Hirschmann等(1992)J.Amer.Chem.Soc.114：9217-9218)、小型化合物文库的类似有机合成(Chen等(1994)J.Amer.Chem.Soc.116：2661)、寡聚氨基甲酸酯(Cho等(1993)Science 261：1303)和/或肽基膦酸酯(Campbell等(1994)J.Org.Chem.59：658)。一般参见Gordon等(1994)J. Med.Chem.37：1385；核酸文库(参见例如Strategene Corp.)；肽核酸文库(参见例如美国专利5,539,083)；抗体文库(参见例如Vaughn等(1996)NatureBiotechnology，14(3)：309-314和PCT/US96/10287)；糖类文库(参见例如美国专利5,593,853)和小型有机分子文库(参见例如苯并二氮杂类，Baum(1993)C & EN，Jan 18，第33页；类异戊二烯类，美国专利5,569,588；噻唑烷酮类和间噻嗪烷酮类，美国专利5,549,974，吡咯烷类，美国专利5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利5,506,337；苯并二氮杂类，美国专利5,288,514等)。
用于制备组合文库的装置是市售的(参见例如357 MPS，390 MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。
已经开发出许多用于溶液相化学的熟知的机器人系统。这些系统包括自动化工作站，如由Takeda Chemical Industries，LTD.开发的自动化合成装置(Osaka，日本)和许多利用模拟由化学家进行的手工合成操作的机器人臂的机器人系统(Zymate II，Zymark Corporation，Hopkinton，Mass.；Orca，Hewlett-Packard，Palo Alto，Calif.)。任何上述装置都适合用于本发明。对这些装置(如果有的话)性质和实施的各种修改以便它们可以如本文所述进行操作，对于相关领域的技术人员而言将会是显而易见的。
另外，许多组合文库本身是市售的(参见例如ComGenex，Princeton，N.J.；Asinex，Moscow，RU；Tripos，Inc.，St.Louis，MO；ChemStar，Ltd.，Moscow，RU；3D Pharmaceutical，Exton，PA；MartekBiosciences，Columbia，MD等)。
2.化学文库的高通量测定
如上所述，用于调节Kvβ1.1多肽的结合特异性和/或活性的试验化合物的初步筛选测定优选适合于高通量筛选。更优选所述初步筛选测定能够检测Kvβ1.1多肽的特征性活性的抑制。用于存在、不存在或定量测定特定核酸或蛋白产物的高通量测定是本领域技术人员众所周知的。
结合测定同样是众所周知的。因此，例如，美国专利5,559,410公开了用于蛋白质的高通量筛选方法，美国专利5,585,639公开了用于核酸结合的高通量筛选方法(即在阵列中)，而美国专利5,576,220和5,541,061公开了用于配体/抗体结合的高通量筛选方法。
用于初步筛选测定的高通量筛选系统都是市售的(参见例如Zymark Corp.，Hopkinton，MA；Air Technical Industries，Mentor，OH；Beckman Instruments，Inc.Fullerton，CA；Precision Systems，Inc.，Natick，MA等)。这些系统通常将整个程序全部自动化，所述程序包括适合于所述测定的检测器中所有样品和试剂的吸取、液体分配、定时保温和微量滴定板的最后读数。这些数字化系统提供高通量和快速开始以及高度的灵活性和用户化。这些系统的生产商提供了每个高通量系统的详细方案。因此，例如，Zymark Corp.提供了描述用于检测调节基因转录、配体结合等的筛选系统的技术公告。
C.用于评价试验化合物功效的测定
一旦许多化合物已被鉴定出来，则可以用体外结合测定和功能分析来进一步评价这类试验化合物调节Kvβ1.1活性的功效。
体外结合测定可以用来定量测定和测量试验化合物的结合能力，供比较性评价用。在一个涉及评价试验化合物对Kvβ1.1亚基共缔合的作用的实施方案中，通过将敲入Kvβ1.1亚基或其片段与Kv1α亚基混合而形成第一种结合混合物，然后测量所述第一种结合混合物中的结合量。另外，通过将敲入Kvβ1.1亚基、Kv1α亚基和试验化合物混合而形成第二种结合混合物，然后测量所述第二种结合混合物中的结合量。将所述第一种结合混合物和第二种结合混合物中的结合量进行比较。如果第二种结合混合物与第一种结合混合物相比结合减少，则认为试验化合物能够阻止Kvβ1.1亚基与Kv1α亚基的共缔合。更优选，所述测定将会定量测定所述试验化合物降低敲入Kvβ1.1亚基或其片段的结合活性的程度优选大于10％、更优选大于约50％或更高。任选的是，可以加入添加剂以研究其与β1和Kv1α亚基即β2亚基的相互作用。结合混合物的配制和最优化在本领域技术人员的知识范围内。这样的结合混合物也可以含有增强结合或使结合最优化所必需的缓冲剂和盐，并且在本发明的筛选测定中可以包括另外的对照测定。
另一方面，人们可以评价试验化合物抑制钾通道失活的功效，即通过使试验化合物与野生型Kvβ1.1亚基和敲入Kvβ1.1亚基接触，然后检测在野生型Kvβ1.1亚基方面有变化但在敲入Kvβ1.1亚基活性方面没有变化。在该后一实施方案中，有效的试验化合物将会降低WT Kvβ1.1亚基活性优选大于10％，更优选大于约50％(而KI活性和KO活性不被降低)。在该后一实施方案中，测量视所述亚基结合能力而变的野生型Kvβ1.1活性，而可以用下面描述的其它功能分析来具体评价所述试验化合物抑制通道失活的功效。通过这些方法，可以鉴定出对Kvβ1亚基具有抑制活性的、可能适合作为治疗药物的试验化合物。可以将野生型Kvβ1.1亚基和敲入Kvβ1.1亚基混合在一种试验样品中，或者它们可以分别提供，以便野生型Kvβ1.1存在于第一种试验样品中，而敲入Kvβ1.1存在于第二种试验样品中。此外，所述试验样品可以包括细胞、组织或转基因哺乳动物。
结合测定例如蛋白质印迹和免疫测定可以用来确定所存在的Kvβ1多肽的量。用于检测/或定量测定Kvβ1亚基的标准分析方法包括电泳、毛细管电泳、高效液相层析法(HPLC)、薄层层析法(TLC)、超扩散层析法等，或各种免疫学方法例如流体或凝胶沉淀反应、免疫扩散(单向或双向)、免疫电泳、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、蛋白质印迹法等。在一个优选的实施方案中，在电泳蛋白质分离(例如单向电泳或双向电泳)中检测/定量测定题述Kvβ1.1多肽，这是本领域众所周知的。蛋白质印迹(免疫印迹)分析用来检测并定量测定Kvβ1.1多肽的存在，所述试验样品中的多肽通过凝胶电泳根据分子量进行分离，然后转移到合适的支持体上(例如硝化纤维滤膜或尼龙滤膜)，并与特异性抗所述靶多肽的抗体一起在样品中温育。正如本领域所公知的，靶多肽(β1.1或Kv1α亚基)本身可以直接标记或者用标记的抗体(例如标记的绵羊抗小鼠抗体)依次检测。
在一个优选的实施方案中，免疫测定用来检测所述Kvβ1亚基的存在。本文所用的免疫测定是一种利用抗体特异性结合所述被分析物(例如靶多肽)的测定。因此，所述免疫测定的特征为检测本发明多肽与抗体的特异性结合，而与应用其它物理或化学特性来分离、靶向或定量题述Kvβ1被分析物不同。任何公知的免疫结合测定(参见例如美国专利4,366,241、4,376,110、4,517,288和4,837,168)都适合对本文鉴定的多肽的检测或定量测定。免疫结合测定(或免疫测定)通常利用“捕获试剂”特异性结合并通常固定所述被分析物(题述WTKvβ1.1多肽、KI Kvβ1.1多肽或KO Kvβ1.1多肽)。在优选的实施方案中，所述捕获试剂是抗体。在一个最优选的实施方案中，免疫测定用来确定题述Kvβ1.1亚基(WT、KI或KO)是否与所述Kv1α亚基共缔合，如下面的实施例1所描述的。
一般而言，可以将所述靶亚基(WT、KI、KO或Kv1α-)固定在具有单独样品接受区的不溶性支持体(例如微量滴定板、阵列、微珠、膜等)上。另一方面，在所述测定中可以使用包含所述Kvβ1蛋白的细胞。所述不溶性支持体可以由任何材料制成，所述材料可以结合所述靶亚基并且容易地与可溶性材料分离以及另外与总体筛选方法相匹配。这类支持体的表面可以是固体、多孔或任何适当形状，并且通常由玻璃、塑料(例如聚苯乙烯)、多糖、尼龙或硝酸纤维素、Teflon等构成。微量滴定板和阵列尤其方便，因为可以同时利用少量试剂和样品进行许多测定。结合靶亚基的特定方式并不重要，只要它与所述试剂和本发明的总体方法相容、保持靶亚基的活性并且是不扩散的。优选的结合方法包括直接结合“粘性”或离子型支持体的抗体(当所述蛋白与所述支持体结合时所述抗体在空间上不阻断配体结合部位或激活序列)、化学交联、表面上蛋白质或试剂的合成等的应用。在蛋白质或试剂结合后，通过洗涤除去过量未结合的材料。然后所述样品接受区可以通过与牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或其它杂蛋白或其它部分一起温育而被封闭。
如上所述，在一个优选的实施方案中，使靶Kvβ1(WT、KI或KO)蛋白与所述支持体结合，然后向所述测定中加入试验化合物。另一方面，可以使试验化合物与所述支体体结合，然后加入所述Kvβ1蛋白。有作为治疗药物潜在价值的新型试验化合物包括在化学文库、肽类似物等的筛选中鉴定的特异性抗体或非天然结合剂。尤其感兴趣的是用于对人类细胞具有低毒性的试剂的筛选测定。可以用各种各样的测定来鉴定并评价试验化合的功效，所述测定包括标记体外蛋白质-蛋白质结合测定、电泳迁移率变动分析、用于蛋白质结合的免疫测定、磷酸化测定等等。
可以以多种方式进行试验化合物与Kvβ1蛋白结合的测定。在一个优选的实施方案中，将所述试验化合物进行标记，然后直接测定结合。例如，如下进行这一步：即可以通过使整个Kvβ1蛋白或其一部分与固体支持体结合，加入标记候选物(例如荧光标记)，洗去过量的试剂，并测定所述标记是否在所述固体支持体上存在。正如本领域所了解的，可以应用不同封闭步骤和洗涤步骤。
所谓“标记”，在本文中是指用提供可检测信号的分子或化合物直接或间接标记所述化合物，所述分子或化合物例如放射性同位素、荧光素、酶、抗体、粒子例如磁性粒子、化学发光剂或特异性结合分子等。特异性结合分子包括成对分子，例如生物素和链霉抗生物素蛋白、地高辛和抗地高辛等。按照已知的方法，对于特异性结合成员，互补成员将用提供用于检测的分子正常标记，如上所概述的。所述标记可以直接或间接提供一种可检测信号。在一个最优选的实施方案中，所述标记是免疫反应性附加表位，如上所讨论的。
在某些实施方案中，只将其中一种组分进行标记。例如，所述蛋白(或蛋白质性候选物)可以在酪氨酸位置用125I或荧光团进行标记。另一方面，可以用不同的标记例如对于蛋白质用125I而对于候选物用荧光团标记不止一种组分。
在一个优选的实施方案中，通过应用竞争性结合测定来测定试验化合物的结合。在该实施方案中，所述竞争者是已知结合靶Kvβ1亚基的结合部分，也就是说，所述竞争者是Kvα1.1亚基。在一个实施方案中，标记所述试验化合物。将试验化合物或竞争者或者它们两者首先加入到所述蛋白达足以允许结合的时间。可以在利于最佳活性的任何温度下进行温育，对于β1和α1.1的结合温度通常在4-37℃之间。温育时间根据最佳活性进行选择，但也可以将其优化以便于快速高通量筛选。通常，在10分钟和1小时之间将是足够的。一般将过量的试剂除去或洗去。然后加入第二种组分，接着测定标记化合物的存在与否，以表明结合。在一个优选的实施方案中，首先加入竞争者(即Kvα1.1)，接着加入试验化合物。所述竞争者的置换是所述试验化合物结合题述Kvβ1蛋白、因而能够结合题述Kvβ1蛋白并且潜在调节题述Kvβ1蛋白的活性的指标。在该实施方案中，可以标记任一组分。因此，例如，如果标记所述竞争者，则洗涤溶液中存在标记表明被所述试剂置换。另一方面，如果标记试验化合物，则支持体上存在标记表明置换。
在一个替代的实施方案中，首先加入试验化合物，然后温育和洗涤，最后加入所述竞争者(即Kvα1.1亚基)。不被所述竞争者结合可能表明所述试验化合物以较高亲和力与Kvβ1蛋白结合。因此，如果标记试验化合物，则所偶联的支持体上存在的所述标记与竞争者不结合可能表明所述试验化合物能够与Kvβ1蛋白结合。
在一个优选的实施方案中，所述方法包括差别筛选，以评价能够调节题述Kvβ1亚基活性的试验化合物。在该实施方案中，所述方法包括将Kvβ1蛋白和竞争者混合在第一种样品中。第二种样品包含试验化合物、Kvβ1蛋白和竞争者。测定这两种样品中竞争者的结合，这两种样品间结合方面的变化或差异表明存在能够与Kvβ1蛋白结合并潜在调节其活性的试验化合物。也就是说，如果竞争者的结合在第二种样品中相对于在第一种样品中不同，则试验化合物能够与Kvβ1蛋白结合。
另一方面，一个优选的实施方案利用差别筛选来评价试验化合物结合WT Kvβ1蛋白但不能结合KI Kvβ1亚基或KO Kvβ1亚基或者可以结合KI但不能结合KO的功效。可以对Kvβ1蛋白的结构进行建模，并将其用于合理药物设计中，以合成与该位点相互作用的化合物。也可通过筛选能够增强或降低所述蛋白活性的化合物，来鉴定出影响Kvβ1活性的试验化合物。
在所述测定中可以使用阳性对照和阴性对照，例如完全非功能性Kvβ1.1亚基(KO)。所有对照样品和试验样品最好采用至少三个复份，以获得统计学显著性结果。所有样品温育达足以使所述试剂与所述蛋白结合的时间。温育后，洗去所有样品中没有非特异性结合的材料，然后测定试验化合物的结合量，一般是标记试验化合物的结合量。例如，在使用放射性标记的情况下，可以在闪烁计数器中对所述样品计数，以测定结合化合物的量。
在所述筛选测定中可以包括各种各样的其它试剂。这些试剂包括如盐、中性蛋白例如白蛋白、去垢剂等试剂，所述试剂可以用来促进最佳蛋白质-蛋白质结合和/或降低非特异性相互作用或背景相互作用。另外，还可以使用其它提高所述测定效率的试剂，例如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗微生物剂等。可以以任何顺序加入各组分的混合物，以提供必要的结合。
在本发明的某些实施方案中，所述方法还可以包括登记/记录改变数据库中Kvβ1.1和/或A-型K+通道活性的试验化合物。
可供上述免疫测定用的抗体是市售的或者可以容易地制备。抗Kvβ1.1抗体先前描述于Veh等(1995)Eur.J.Neurosci.7：2189-2205。在本发明的免疫测定中可以使用多克隆抗体或单克隆抗体(抗Kvβ1.1抗体)。本领域技术人员将会知道免疫学领域公知的、用以纯化和/或浓缩多克隆抗体以及单克隆抗体的各种技术。参见例如Coligan等(1991)Unit 9，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience)。
在本发明的优选实施方案中，所述免疫测定使用单克隆抗体(″mAb″)。为了制备单克隆抗体，优选对小鼠或大鼠进行免疫。本发明中所用的术语“抗体”包括能够结合表位决定簇的完整分子以及其片段，例如Fab和F(ab′)2’和/或单链抗体(例如scFv)。用于产生分泌mAb的杂交瘤的一般方法是众所周知的。可以采用相对常用的、用以测定目标mAb的结合特异性和/或亲和力的筛选技术(例如酶联免疫吸附测定或″ELISA″，BiaCore等)，完成对mAb中特异性的证实。
另外，可以产生抗体片段和人抗体。采用噬菌体展示技术，可以产生/选择诸如单链抗体(scFv或其它抗体)的抗体片段。预先不进行免疫而是通过展示噬菌体上非常大的多样化V-基因所有组成部分，以产生具有无数的抗半抗原、多糖、自身蛋白、细胞表面抗原等抗体的文库，来产生人抗体
III.功能分析
在一个实施方案中，本发明提供筛选调节Kvβ1.1活性并因此在在焦虑相关任务中有效的药物的方法。所述方法包括在所述化合物存在下检测Kvβ1.1基因产物(例如Kvβ1.1亚基蛋白)的活性水平和/或将其与对照例如KI基因产物或KO基因产物的活性水平进行比较。特别是，可以用KI转基因哺乳动物作为阳性对照，以鉴定潜在的抗焦虑化合物。这些方法的实例在下文进行描述。
A.行为测定
在一个实施方案中，可以采用各种各样的测试认知能力、焦虑或应激反应的行为测定中的任一测定，对Kvβ1.1活性的调节剂进行测定。这样的测定包括将试验化合物给予WT哺乳动物、KI哺乳动物或KO哺乳动物，然后评价所述试验化合物对所述哺乳动物行为的影响。优选的行为测定测量认知即海马相关任务。这样的测定包括但不限于环境条件反射(参见例如Kim和Fanselow(1992)Science，256：675；以及Philips和LeDoux Behav.Neurosci.，106：274)、空间学习(参见例如Morris等(1982)Nature，297：681)、转杆测定、条件性味觉厌恶、群居辨识和偏食的群居传播(Bunsey和Eichenbaum(1995)，Hippocampus，5：546)，其中一些在下文实施例中举例说明。测量焦虑的优选行为测定包括高架O形迷宫、冲突测定和潜在恐惧的惊跳测定。
由于特定时间的行为可依赖于哺乳动物的特定生理状态(例如摄食方案、生殖状态、睡眠时间等)，因此这样的测定最好同时有阳性对照和阴性对照。阴性对照将是以与“试验”哺乳动物相同的方式进行处理但不给予试验化合物(或者给予显著较低的剂量)的哺乳动物。在一个优选的实施方案中，阳性对照将包括具有Kvβ1.1敲入突变的哺乳动物，最好是小鼠。诱导减轻与KI Kvβ1.1哺乳动物的特征性行为相似的焦虑的试验化合物或试验化合物的组合将是能够调节Kvβ1.1活性的化合物。
B.生理学测定
1.激素水平测定
在本发明的另一个实施方案中，激素水平测定可以用来评价动物对应激的反应以及评价试验化合物在减轻应激中的功效。在该实施方案中，试验化合物根据功效进行评价，即研究应激相关激素指标例如皮质酮的产生或c-fos的激活。来自小鼠肾上腺的皮质酮分泌一般被认为是应激的可靠的内分泌标志。动物在对应激反应时分泌该激素，致使可以在应激开始后5分钟内检测到血浆中的皮质酮反应。该反应常常在表现出焦虑水平降低的动物体内分泌量或时间方面发生改变。动物通常经历由环境刺激引发的温和形式的应激。足电击、强迫游泳和限制是在啮齿动物进行的某些共同的环境应激。
在该测定的一个优选的实施方案中，让KI哺乳动物、KO哺乳动物和WT哺乳动物经历环境应激，然后测定其在应激后不同时间间隔的应激相关激素水平。最优选所述激素是血浆皮质酮，并且在应激开始后以0分钟、30分钟、60分钟和90分钟的时间间隔进行测量。在另一个优选的实施方案中，可以通过原位杂交测量c-fos的激活，其水平可以数字化和定量，在下文实施例8中所解释的。
此外，可以对上述激素水平测定进行改进，以包括试验化合物。在一个最优选的实施方案中，给予题述动物一种试验化合物，并且让该动物在足以代谢所述试验化合物的时间后经历环境应激。然后进行激素水平的测量，以确定所述动物是否具有与KI Kvβ1.1哺乳动物、KO Kvβ1.1哺乳动物和WT Kvβ1.1哺乳动物的特征性分布型一致的激素模式。最好是对试验化合物进行研究，其中WT哺乳动物中的给药产生与未处理的KI哺乳动物一致的激素模式。正如在下文实施例5中所描述的，转基因KI小鼠具有提示焦虑模式减轻的皮质酮水平。
2.体温过高测定
其它测定可以用来评价动物对应激的反应以及评价试验化合物减轻应激的功效。应激诱导的体温过高，按照Borsini等(1989)和Vander Heyden等(1997)的方法，可以用来结合WT小鼠、KI小鼠和KO小鼠一起评价其焦虑分布型。Borsini等Psycholopharmacology(1989)98：207-211和Van Der Heyden，(1997)Physiology and Behavior 62：463-470。所述动物通常经历温和形式的环境刺激，通常用直肠探头测量所述动物的体温。如同上述激素水平一样，动物对环境应激反应的体温过高的程度是该动物焦虑的指标。
正如在下文实施例6中所举例说明的，使KI转基因哺乳动物、KO转基因哺乳动物和WT转基因哺乳动物经历环境应激，然后测量体温过高的程度。已知的抗焦虑药例如氯氮也可用来比较性地证实所述动物的反应是否的确与抗焦虑反应相一致。也可以对所述体温过高测定加以改进，以评价试验化合物的功效，其中给予题述动物一种试验化合物，并且让所述动物在足以代谢所述试验化合物的时间后经历环境应激。然后测量体温过高的程度，以确定所述动物是否具有与WT Kvβ1.1哺乳动物、KI Kvβ1.1哺乳动物或KO Kvβ1.1哺乳动物的特征性分布型相一致的体温过高模式。最优选将所述试验化合物给予WT哺乳动物，产生与未处理KI哺乳动物一致的体温过高模式。正如在下文实施例6中所描述的，应激诱导的体温过高使KI小鼠迟钝的程度与给予氯氮的WT小鼠的程度相似，提供对焦虑模式减轻的进一步说明，因此提供一种抗焦虑分布型。
3.电生理学测定
Kvβ1.1活性可以容易地通过各种各样的、本领域已知的电生理学方法进行测定。正如Giese及其同事的工作所解释的，Kvβ1.1活性的剔除既导致重复起动期间峰线增宽，又导致在海马CA1神经元的超极化(sAHP)后缓慢降低。因此，可以给予WT动物、KI动物或KO动物一种试验化合物，然后进行测试，或者对其组织进行测试，以比较其电生理学反应。最优选记录海马的电生理学，更优选记录海马CA1神经元。这样的记录可以在体内进行，然而，在一个优选的实施方案中，这样的记录来自海马薄切片制备物。制备和记录这类制备物的方法是本领域技术人员熟知的，正如在PCT公布号WO00/24871中所表明的，该专利通过引用结合到本文中。最好发现其中给予试验化合物的WT哺乳动物产生与KI哺乳动物一致的电生理学模式的试验化合物。
另外，异源A-型K+通道可以在异源表达系统中表达，致使表达敲入Kvβ1.1及相应的Kv1家族α亚基的细胞可以通过电生理学法进行测量。所述细胞最好是用含有敲入Kvβ1.1和Kv1α或其相应RNA的载体转染的非洲蟾蜍属(Xenopus)卵母细胞或HEK细胞。可以使这些细胞与试验化合物接触，然后可以测量所述试验化合物对A-型通道电导率的影响，并通过全细胞电压钳、电流钳和/或用膜片钳技术进行比较。这些关于蛋白质表达和电生理学记录的方法是本领域技术人员熟知的。
4.作为阳性对照的敲入Kvβ1.1哺乳动物
如上所述，本发明的Kvβ1.1敲入哺乳动物可用于各个方面，特别是作为阳性抗焦虑对照。高水平机能例如焦虑是紧急神经网络特性，因此不能在高度“归纳”者(例如单个突触)模型中进行测定。行为研究例如需要完整的活的哺乳动物。同样，网络相关特性(例如CA1活性模式)需要功能性神经网络。
因此，评价潜在调节剂(例如试验化合物)对这类系统的影响由于应用阳性对照而大大简化。在本发明的正文中，Kvβ1.1敲入哺乳动物的行为为评价用试验化合物处理的“正常”哺乳动物的行为提供了一个良好的参照物。通过与KI动物进行比较，也可以评价其它生理指标，例如激素水平或体温过高。同样，可以将用试验化合物处理的神经制备物的行为表现(例如海马薄切片制备物的电生理学反应)与从Kvβ1.1敲入哺乳动物中获得的神经制备物的行为表现进行比较，以评价所述试验化合物以模拟Kvβ1.1负调节的方式改变电生理学反应的能力。
也可以让KI突变体与显示衰老加速或脑变性加速(例如发现与早老性痴呆相关的衰老加速或脑变性加速)的其它小鼠模型杂交，以确定所述Kvβ1.1敲入是否改善这些哺乳动物模型中的相关行为障碍。
IV.筛选试剂盒
在一个实施方案中，本发明提供用于进行本文描述的测定的试剂盒。所述试剂盒最好包括Kvβ1.1敲入哺乳动物或来源于Kvβ1.1敲入哺乳动物的细胞或组织。所述试剂盒还可以包括可供本文描述的测定方法用的合适缓冲液和其它溶液以及标准品。
另外，所述试剂盒可以包括含有用以实施本发明方法的说明性材料(即方案)。尽管所述说明性材料通常包括写入材料或印刷材料，但是它们并不限于此。本发明考虑了任何能够存储这些说明和将其传送给终端用户的介质。这样的介质包括但不限于电子存储介质(例如磁盘、磁带、盒式磁带机、芯片)、光学介质(例如CD ROM)等等。这样的介质可以包括提供这些说明性材料的因特网站点的地址。
实施例
采用本领域技术人员熟知的和常用的标准技术，实施以下实施例，只是该标准技术另外加以详细描述。给出以下实施例是为了说明本发明，而不应该认为是以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
缺少快速失活所必需的N末端的Kvβ1.1敲入小鼠的产生
产生了带有突变型Kvβ1.1基因的遗传修饰小鼠，所述突变体缺乏使Kv1家族K+通道失活的能力但保留与Kv1家族α-亚基共缔合的能力，从而增强了通道表面表达。与Kvβ1基因剔除不同，敲入小鼠应该保留Kvβ1.1除了赋予N-型失活能力以外的所有功能特性。
A.Kvβ1.1被击中靶的ES细胞的产生
图1A显示在引入免疫反应性附加表位之前的内源小鼠Kvβ31基因结构和外显子组构。这三个Kvβ基因(Kvβ1.1、Kvβ1.2和Kvβ1.3)每个都共享C末端外显子结构域3-15，但在5′端被可变剪接，以编码独特的N末端蛋白序列(外显子1.1、1.2和1.2)。为了设计图1B所示的Kvβ1.1打靶构建体，采用编码由Genbank登录号X70662编码的大鼠Kvβ1.1蛋白(Research Genetics，Bethesda，MD)N末端90个氨基酸的DNA片段，通过筛选基因组文库，从129/SvEv小鼠品系中分离出基因组Bac克隆。对所述Bac克隆作图，分离出一种7.2KbBamHI片段。将含有编码Kvβ1.1蛋白前35个氨基酸的外显子1.1a的1.2Kb EcoRI片段用血凝素附加表位(SEQ ID NO：2)即3x HA通过重叠PCR策略取代，导致产生一种对通道失活功能无效的蛋白(KvBo)。将邻接LoxP序列的新霉素抗性盒在EcoRI位点插入到外显子1.1a下游100bp的内含子中。该经修饰的EcoRI片段通过测序加以证实，并将其再与1.5Kb EcoRI和4.2 RI/BamHI片段连接，以形成所述打靶载体。
通过电穿孔，将BamHI线性化的Kvβ1.1打靶载体导入R1胚胎干(ES)细胞(Nagy等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8424-8428)中。所述细胞根据G418进行选择，并挑出200个菌落进行DNA印迹分析。下面描述的基因组DNA印迹分析产生了3个经历了同源重组以将所述3x HA标志与neoFloxP一起掺入的克隆。
从通过注射到C57BI6小鼠胚泡中，由带有所述3xHA和neoFloxP等位基因的ES克隆#145和#191产生嵌合小鼠。选择80-90％来自每种克隆的雄性被毛嵌合体，进一步与129/SvEv野生型雌性小鼠交配，得到129/SvEv背景下的F1杂合子。让这些子代互交，以产生供分析用的F2纯合子。在关键性内含子中包括neoFloxP通过KvB1基因偶然抑制转录，因而使该等位基因作为Kvb1剔除。在为合成纯合子而进行同胞交配前，让一个亚组的动物与C57/bI6品系远交5代。除非另有说明，否则所有实验都在129/SvEv背景下或在N5-C57/bI6背景下进行。
B.带有Kvβ1.1-(Kvβo)N末端无效突变的敲入小鼠的衍生化
收集来自雌性杂合Kvβo-neoFloxP小鼠的原核并用编码Cre-重组酶的质粒进行微注射。In eutero重组的目的在于切除子代的Neo-Flox盒，留下Kvβ1.1(Kvβo)N末端的3xHA突变和所述内含子内的一个拷贝的Lox-P序列。在将所述微注射原核经输卵管转移到假孕雌性小鼠后，分析新生幼仔中Cre介导的切除NeoFloxP盒的证据。通过PCR分析基因组DNA揭示出，几乎100％的带有所述3x HA标志的子代都经历了体内切除。
C.基因组DNA印迹分析
通过用蛋白酶K于37℃消化3小时，制备来自ES克隆的基因组DNA。在异丙醇中沉淀后，将DNA重悬于TE溶液中，然后用BamHI限制性消化。将DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶上分离，然后转移到尼龙膜上过夜。所述打靶构建体上游300bp BamHI/EcoRI片段用P32dCTP进行放射性标记并将其用作探针。在所述3X HA序列内存在内部BamHI使得可以根据在1.2Kb处杂交的条带代替在来源于野生型Kvβ1等位基因的7.2Kb处杂交的条带而鉴定出中靶ES细胞。neoFloxP的存在随后用针对neo选择盒(TK-新霉素小基因)的探针加以证实。图1C显示：对于野生型Kvβ1等位基因，BamHI/EcoRI探针鉴定出一条～7.0Kb条带，而对于三个中靶ES细胞(191、145、51)，BamHI/EcoRI探针鉴定出额外的～1.0Kb条带。
D.Kvβo(KI)和Kvβneo Flox(KO)的PCR分析
用一对引物(Kvβneo引物)特异性检测所述小鼠基因组内neo-FloxP序列的存在。对应于外显子1.1的3′外显子-内含子边界的正向引物1(SEQ ID NO：3；5′TTGAAAGTGACTTAACTCAGCGC)和Neo-序列特异性反向引物1(SEQ ID NO：4；5′GCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTAC)用来扩增来自带有所述Kvβneo-Flox等位基因的动物的一种400bp片段。纯合KO动物和杂合KO动物均通过该分析得到证实。
采用正向引物1和对应于neoFlox插入片段下游30bp的反向引物2(SEQ ID NO：5；5′GGCCACATCTTAAAGATCGCAC)的第二对引物(Kvβo KI引物)，用来鉴别带有WT等位基因、Kvβo KI等位基因或Kvβo KO等位基因的子代的接合性。用另外的c-fos特异性的引物对作为内部阳性对照(SEQ ID NO：6；fosF引物：5′AGGAGGGAGCTGACAGATACACTCC和SEQ ID NO：7；fosR引物：5′CAAGGATGGCTTGGGCTCAGGGTCGT)。采用来自尾活检样品的基因组DNA(在蛋白酶K中消化的1∶200稀释的尾)，进行30个循环的PCR扩增，每个循环为于94℃、54℃、72℃分别持续30秒、30秒和60秒。用4％琼脂糖凝胶(NuSieve 3∶1，BMA，Rockland，ME)分离所得的条带。如图1E所示，所述Kvβo KI引物自野生型Kvβ1.1等位基因扩增一个230bp片段但自Kvβo KI等位基因扩增一个260bp片段，这是由于后者存在一个拷贝的Lox-P序列所致。所述Kvβo KO引物通常不扩增，这是由于neo-FloxP序列的大小(插入片段大小为1.4Kb)间插在两种引物之间，但采用Kvβneo引物则能获得成功。
E.RNA酶保护分析
采用T7 RNA聚合酶，在P32CTP存在下，通过体外转录合成与野生型Kvβ外显子1.1和3x HA-Ex1互补的RNA探针。根据生产商的说明(RPAIII试剂盒，Ambion，Austin，TX)，使来自Kvβo动物(KI)、Kvβo Neo-Flox动物(KO)和Kvβ1.1野生型动物的海马总RNA(5μg)进行杂交，并将RNA酶抗性条带在6％PAGE上分离。图1D和图1E提供两种探针如针对突变型Kvβo的探针(图1D)和针对WT Kvβ1.1的探针(图1E)的外显子结构以及从相应探针杂交产生的RPA凝胶的示意图。所述3x-HA探针揭示出在WT中由缺失正常Kvβ1.1 mRNA N末端的3x-HA序列产生的一条较短的被保护的220bp条带。在杂合子动物(WT/KI)和纯合子动物(KI/KI)中，相同的探针产生一条420bp条带。相反，针对正常Kvβ1.1 mRNA的探针显示一条被完全保护的、来自WT mRNA的480bp片段，而在KI mRNA中邻接所述3x HA序列的两个片段(210和140)被保护。
综合这些数据证实，编码所述3x-HA突变(Kvβo)的mRNA在KI动物中的表达。重要的是，带有所述Flox-neo盒的动物(n+/n+)没有证明来自任一探针的特异性条带。因此，所述Kvβ+Neo动物是在Kvβ1.1表达方面是完全缺陷的，而对于Kvβ1.1是KO动物。
F.蛋白质印迹分析
抗Kvβ1和Kvβ2的抗体如先前描述的方法使用(Rhodes等，1997，J.Neuroscience 17：7084-9)。抗HA多克隆抗体(BMB，德国)以1∶2000使用。抗突触蛋白多克隆抗体(Chemicon，Temecula，CA)以1∶5000使用。解剖Kvβo(KI)、Kvβo Neo-flox(KO)或野生型Kvβ1.1纯合小鼠的脑区，在含有Triton X100和1x完全蛋白酶抑制剂混合物(BMB，德国)的Triton裂解缓冲液中匀浆。蛋白质样品在SDS-PAGE上分离，然后转移至硝酸纤维素滤纸上。通过化学发光使胶片曝光(Hyperfilm，Amersham)，检测蛋白质印迹上的免疫反应性条带。
蛋白质印迹分析表明，所述纯合KI动物在通过内源Kvβ1表达预测的解剖区并且以与野生型mRNA相当的水平表达Kvβo mRNA和蛋白。将来自皮质、纹状体、海马、小脑、中脑和丘脑的脑区进行解剖，并分析其特异性免疫反应性，如图1G所示。来自每种组织的蛋白提取物(～20μg/泳道)与作为阳性对照的大鼠脑膜(RBM)一起电泳。分析来自正常129/SvEv小鼠的野生型(WT)组织中的Kvβ1、Kvβ2、突触蛋白1和HA。如在WT样品中，分析Kvβo-neofloxP(KO)动物的组织，只是不进行HA测定。仅特异性分析Kvβo动物组织的HA表达。在WT的所有脑区都鉴定出内源Kvβ1蛋白，同时在海马和纹状体中观察到较高的水平。Kvβo突变蛋白表达酷似内源Kvβ1的表达模式，如在Kvβo KI动物的海马和纹状体中HA免疫反应性增强所表明的。
蛋白质印迹分析证实了所述HA标志的存在，并且也证实当用抗Kvβ1抗体时在Kvβo KO小鼠中缺乏Kvβ1的表达。在这些KO小鼠中，当与WT动物相比时，在Kvβ2表达方面没有明显的变化，暗示实际上没有代偿性变化。另外，Nakahira等已经表明，Kvβ1 N末端的缺失对与Kv1家族α-亚基缔合没有负面影响(Nakahira等，J BiolChem(1996)271：7084-7089)。如同先前在Rhodes等，J.Neurosci.(1996)16：4846-4860中描述的方法，使用抗体进行共免疫沉淀揭示出，在KI小鼠中，HA标记的Kvβo与Kv1家族α亚基的正确缔合(数据未显示)。
实施例2
缺少N末端的Kvβ1.1亚基对遗传修饰小鼠空间学习的影响
通过将转基因敲入小鼠的表型与剔除小鼠和野生型小鼠(129/SvEv)(″WT″)的表型进行比较，确定所述N末端在Kvβ1.1亚基中的重要性。如以上实施例1描述的方法，产生小鼠，其中敲入小鼠(″KI″)的Kvβ1.1缺乏功能性N末端，但却能够与α-亚基缔合。所述剔除小鼠(″KO″)具有其中Kvβ1.1被完全失活因而既缺乏所述N末端又缺乏与α-亚基共缔合的能力的突变。
空间学习是可以在Y形迷宫示例中测试的海马依赖性认知技能(Dellu等，″A two trial memory task with automated recording：study inyoung and aged rats(自动记录的双试记忆任务：对幼年大鼠和老年大鼠的研究)″Brain Res.(1992)588：132-139)。所述Y形迷宫新颖方法是一个基于在Y形迷宫中的位置探究的双试辨识任务。每个实验由两个由实验中间间隔(ITI)隔开的5分钟探究期组成。在第一个探究期期间，Y形迷宫的一条臂是闭合的，让所述小鼠用5分钟去探究所述迷宫的两条臂。用一部固定在迷宫上方的照相机记录探究活动，数据通过计算机进行分析。第一次探究采用ITI在30分钟至4小时的范围内，在此期间，将动物放置于一个保持笼中。在第二个探究期期间，将Y形迷宫的所有臂都开放，将啮齿动物放置于一个原始开始臂中，让其用5分钟去探究所述迷宫。记录在所述实验的头2分钟内第一次进入新臂的小鼠百分率、进入新臂和非新臂的次数以及在每条臂中所花费的时间。啮齿动物都有进入并探究新臂的自然倾向(Dellu等，Brain Res.(1992)588：132-139)。
在Y形迷宫双试位置辨识程序中，采用不同的ITI，对129/SvEv背景下的8-10周龄WT小鼠、KI小鼠和KO小鼠(n＝28-30)进行测试。在所测试的所有ITI(30分钟、2小时和4小时)中，在滞留实验期间，所有三个组即WT、KI和KO在新臂中比在非新臂中所花费的时间长得多。然而，如图2A所示，在30分钟ITI时，KO小鼠和WT小鼠通常都比KI小鼠首选新臂的数目多。相比之下，仅WT小鼠在4小时ITI时一致地首选新臂。该模式提示，KI小鼠和KO小鼠间的辨识在30分钟ITI时存在显著性差异，而4小时ITI时消失。另外，如图2B所示，在30分钟ITI时，KO小鼠和WT小鼠在新臂中花费的时间(NA：25.4±3.5秒)比KI小鼠在新臂中花费的时间(NA：13.9±3.4秒，p＜0.05)长得多。相反，在4小时ITI，KI小鼠和WT小鼠比KO小鼠在新臂中花费的时间长(接近显著性，p＝0.055)。KI小鼠30分钟ITI时有滞留缺陷但比KO小鼠在4小时ITI时滞留好，表明Kvβ1.1亚基在空间学习任务中的复杂作用。
实施例3
遗传修饰小鼠的痛觉和生理反应性
也评价129/SVEV背景下的WT小鼠、KI小鼠和KO小鼠在对视觉刺激和伤害性刺激的敏感性方面的差异。WT小鼠、KI小鼠和KO小鼠按8-10只/基因型分组测试其对视觉刺激、触觉刺激、热刺激和化学刺激的反应性。
1.视觉陡壁实验(Visual Cliff Test)
在视觉陡壁实验中，KI小鼠和KO小鼠按8-10只/基因型分组测试，以分析其视觉深度知觉方面的差异(Fox，Animal Behavior(1965)13(2)：232-233)。实验装置为漆成黑色和白色(1″×1″正方形)的网纹盒子(1′×2′×2′)，放在一个顶部敞开的更大盒子(2′×2′×2′8″)里面。黑白网纹地板穿过内盒的顶部延伸出去、侧面向下并一直延伸到较低的地板。透明有机玻璃片(2′×2′)盖在网纹内盒的顶部并完全盖住所述陡壁。在该盒的中央，一个4″×2.5″×1″平台将陡壁侧面与安全侧面分开。
小鼠分组关养，直到实验当天。将该小鼠放置在中心平台上，然后记录跳下平台的潜伏期以及小鼠跳上的那一侧。如果小鼠在3分钟内不跳下平台，则记录“无选择”，并记录3分钟的最长潜伏期。每只动物接受一次实验。
所有KI小鼠和KO小鼠在视觉陡壁任务中具有100％准确度，表明各组间在视觉方面没有差异。
2.用von Frey细丝进行触觉实验
采用von Frey单丝(Chaplan等，″Quantitative assessment of tactileallodynia in the rat paw(大鼠爪中触觉异常性疼痛的定量评价)，″J.Neurosci.Methods，(1994)53：55-63)，对WT小鼠、KI小鼠和KO小鼠按8-10只/基因型分组测试其在触觉反应性方面的差异。
将小鼠放在高架金属网栅格上，并且用一系列von Frev单丝刺激足趾底面。von Frey细丝必要时以顺序增强或减弱的次序用于刺激正中足底后爪，以尽可能接近反应阈值。阈值由引起对刺激的快速退缩反应的最小力表示。因此，退缩反应导致给予下一个较弱的刺激，缺少退缩导致给予下一个较强的刺激。内推法计算每个基因型的50％阈值。
3.热实验和化学实验
根据来自先前在恒河猴中进行的研究的自适应实验(Negus等，JPharmacol Exp Ther 266：1355-1363，1993；Brandt等，J.Pharmacol.Exp.Ther.296(3)：939-946，2001)，129/SvEv背景下的WT小鼠、KI小鼠和KO小鼠按8-10只/基因型分组测试其对热刺激和化学刺激的反应性方面的差异。
热水用来评价通过遗传操作产生的伤害性反应方面的差异。在热水尾部撤药程序中，所述啮齿动物稍加限制，并将尾部末端(3cm)放置于装有加热至42℃、46℃、50℃、54℃或58℃的水的热水瓶中。记录从热水中将尾部撤药的动物的潜伏期，并将所述潜伏期用作痛觉的度量。如果动物在20秒内不退缩其尾巴，则实验者将尾拿出来，并记录最长潜伏期。
每个实验开始时，测定每种温度下平均基线尾部撤药潜伏期。这些潜伏期用来评价基因型对热刺激敏感性方面的潜在差异。
在基线温度确定之后，将辣椒辣素乳油(0.075mg％浓度)涂抹在整个尾巴上。10分钟后，尾巴用湿布擦干净，以去除过量的乳油，5分钟后再次测定温度效应曲线。已经表明，该方法在小鼠中产生强热过敏反应。
产生每种实验条件下的温度-效应曲线。另外，根据每个温度-效应曲线，计算出产生尾部撤药潜伏期中最大增加一半的温度(即T10)。通过内推法，根据温度-效应曲线上10秒以上的点和10秒以下的点之间绘出的直线来确定T10。热过敏反应定义为温度-效应曲线中向左的位移以及T10值的减少。通过方差分析(ANOVA)对数据进行分析，并通过事后配对t-检验进一步分析显著性主要作用。
WT小鼠、KI小鼠和KO小鼠对触觉刺激(VonFrey细丝)、热刺激(热水尾部撤药)和化学刺激(辣椒辣素)具有相似的反应。这些数据也表明，与Kvβ1.1缔合的Kv-通道不参与对急性伤害性刺激的敏感性。
实施例4
表达缺少N末端的Kvβ1.1亚基的小鼠表现出
减退的环境恐惧条件反射和对高架O形迷宫的不同分布型
先前的研究证明，完全非功能性KVβ1.1剔除小鼠在某些海马形成依赖性认知任务中表现出降低的钾电流失活以及减退的行为表现，而在总体形态或行为方面没有变化(Giese等(1998)Learning &Memory 5：257-273)。因此，所观察到的KO小鼠的表型可能是丧失1)使所述钾通道快速失活和/或2)适当表达所述钾通道的能力的结果。
将分组关养的成年雄性小鼠维持在12小时光照/黑暗周期，并可自由摄食和饮水。将129/SvEv背景和C57/BI6背景下的8-16周龄WT小鼠、KI小鼠和KO小鼠按15-20只/基因型分组。
A.环境恐惧条件反射
在实验前，让小鼠适应实验室30-60分钟。然后将小鼠放置于一个装有一块栅板、纯噪音(64dB)、照明灯和音调(75dB)或咔哒声产生器的减声罩(Med.Associates)中，然后再次让其适应小室一会儿(2分钟)。适应期后，将音调形式或一系列咔哒声的条件刺激(CS)持续30秒，然后瞬时电击(2秒)(通过栅板给予，1.0mAmp，非条件刺激，US)。2分钟ITI后，将动物再次暴露于US和CS。在第二次电击后30秒，从操作式小室中抓出小鼠。大约18小时后，将该小鼠放回操作式小室里面，并观察在对“特定环境(context)”(即除CS以外的相同环境、照明、听觉刺激)反应时的木僵行为。在该观察期后，将小鼠放回其笼内达30-60分钟。该延缓期后，将该小鼠放置于一个新的操作式小室里面并再次观察其木僵行为。该观察期结束时，开启CS并记录木僵反应。对于129/SvEv背景动物，监测这三种条件下的木僵行为3分钟，而对于C57BI6，监测5分钟。每间隔10秒，观察人员记录动物是否木僵(缺乏除呼吸以外的所有运动)。记录每只动物在每种条件下的木僵百分比。运用双因素ANOVA(处理x实验条件)对数据进行分析并且运用费歇耳(Fisher)最小显著性差异检验进行事后比较。
重复以前发表的工作，在表现出高水平木僵的KO动物和WT动物之间均没有观察到差异(较好的环境条件反射)。如图3A和图3B所示，KI动物与KO对照动物和WT对照动物相比，表现出显著降低水平的木僵(减退的环境条件反射)，而与背景小鼠品系无关(p＜0.05)。
B.高架O形迷宫
让小鼠适应准备室至少30分钟。所述O形迷宫由一块分成四个相同的象限(2块封闭，2块开放)的黑色圆形有机玻璃构成。所述封闭象限具有从所述迷宫向上延伸的白色有机玻璃壁(内壁＝20cm；外壁＝30cm)。开放象限具有从所述迷宫边缘向上延伸3mm的透明有机玻璃唇边。所述迷宫的外径为60cm，宽为5cm，并被抬高到距地面55cm。在封闭象限中，将一只小鼠放置于所述O形迷宫中，使其头和前爪分别处于封闭象限中。在迷宫上方的天花板有一只白炽灯控制的红色光条件下进行实验(C57/BI6，15瓦，4勒克斯，129SvEv 42瓦，20勒克斯)。然后用EthovisionPro摄像机跟踪系统，记录小鼠的行为达4分钟。
通过EthovisionPro软件(Noldus Information Technology，Inc.)，记录在开放象限和封闭象限所花费的时间和进入开放象限和封闭象限的数目以及所走的总路程。用单因素ANOVA对数据进行分析并且运用费歇耳最小显著性差异检验进行事后比较。
正如在环境恐惧条件反射实验中，KO动物和KI动物在高架O形迷宫中表现出不同的行为模式。特别是，图4A显示C57BI6背景下KI突变纯合的小鼠与KO小鼠或WT小鼠相比，在开放场区中花费显著更长的时间(p＜0.05)，提示与抗焦虑活性降低一致的分布型。图4B说明在129/SvEv背景动物中，KO动物相对于WT动物和KI动物，在开放场区中花费的时间增加。C57BI6背景小鼠与129/SVEV背景小鼠之间的不同分布型可能是由于129/SvEv小鼠探究水平一般较低，这正是129/SvEv小鼠的特点，它们倾向于在首先被放置的象限(封闭象限)中滞留。通过比较，如图4A和图4B所示，包括WT小鼠在内的所有C57BI6小鼠在更大程度上探究环境并且在开放场区中比129/SVEV小鼠花费的时间长5-20％。
这些数据结合实施例2的Y形迷宫研究一起表明，在KO小鼠中观察到的表型不仅仅是由于丧失所述钾通道的快速失活所致，而且可能反映出钾通道表达或涉及其它钾通道亚基的代偿机制方面的变化。
实施例5
根据应激诱导的皮质酮水平所表明的
敲入Kvβ1.1亚基对焦虑的影响
为了证实KI基因型是否提供不同的焦虑分布型，按照Kalman等，Psychoneuroendocrinology(1994)28(5)：349-360中的方案，使129/SvEv背景下的WT小鼠、KI小鼠和KO小鼠经历环境应激，然后测量皮质酮水平方面的变化。在该实验中，限制在窄小的通风管作为环境应激。将WT小鼠、KI小鼠和KO小鼠放置于通风管中，使活动受限达1小时。在应激期间，测量0分钟、30分钟、60分钟时的血浆皮质酮水平，另外，在处理开始后90分钟时(受限后30分钟)也进行测量，以确定血浆中皮质酮反应的程度和持续时间。初步结果表明，在该处理期间，KI动物表现出皮质酮水平显著降低(数据未显示)(p＜0.05)。
实施例6
通过测量应激诱导的体温过高所表明的
敲入Kvβ1.1亚基对焦虑的影响
按照Borsini等(1989)和Van der Heyden等(1997)的方法，用应激诱导的体温过高作为另外的工具，以评价KI小鼠的抗焦虑分布型(Borsini等，Psycholopharmacology(1989)98：207-211和Van DerHeyden，Physiology and Behavior(1997)62：463-470)。据报道，该模型对防止应激诱导的体温过高的抗焦虑药的作用敏感。
将分组关养的成年雄性小鼠维持在12小时光照/黑暗周期，并可自由摄食和饮水。将129/SvEv背景下的8-11周龄WT小鼠、KI小鼠和KO小鼠按10只/基因型分组。
在实验前，让小鼠适应实验室至少1小时。给小鼠腹膜内注射对照安慰剂溶媒(安慰剂)或抗焦虑氯氮(5mg/kg或10mg/kg)。注射后60分钟，通过将润滑的热敏电阻探头插入保持轻微受限的小鼠直肠内2cm，测量初始核心体温(T1)。在该实验中，直肠探头用作环境应激。采用数字型温度计(Yellow Springs Instruments YSI 2100Tele-thermometer)，读出温度精确至0.1℃。在放入初始直肠探头后10分钟后，进行第二次测量(T2)。如图5A所示，在该程序中，注射所述溶媒的对照小鼠显示体温升高约0.7-0.8℃。先通过单因素ANOVA，然后通过最小显著性差异检验，对数据进行分析(p＜0.05)。
图5A说明，与对照溶媒相比，抗焦虑药氯氮预防应激诱导的体温过高。特别是，剂量水平为10mg/kg的氯氮诱导记录温度下降。此外，如图5B所示，经历相同的程序但在其自身关养房中的未处理KI小鼠(n＝25)，表现出与用10mg/kg氯氮处理的小鼠相当的抗焦虑样反应。相反，未处理KO小鼠(n＝16)和WT小鼠(n＝20)表现出与对照小鼠相同或预期的体温过高。没有观察到基线(T1)温度方面的差异。这些数据进一步证实，根据对KI动物建模，所述Kv1钾通道失活的降低将会产生抗焦虑作用。
实施例7
Kvβ1小鼠的癫痫发作阈值
小鼠在氟烷麻醉下进行手术，以将一根插管(PE 10管)植入颈外静脉中。让小鼠恢复至少48小时，然后测量癫痫发作阈值。通过以流速0.34ml/分钟静脉内给予戊四氮(PTZ；5mg/ml的肝素化盐水)，测定癫痫发作阈值。小鼠除了限制在供观察的一个小室中外其它不受限制。记录每只小鼠第一次抽搐、阵挛性癫痫发作(定义为抬起前肢爪垫)和阵挛性癫痫发作(定义为后肢完全伸直)的潜伏期。将癫痫发作潜伏期的数据转换成每次行为终点时所给予的mg/kg PTZ，如图6所示。
在小鼠的这三种遗传品系(n＝10-12)中，对静脉内输注PTZ的敏感性相同。对用以诱发图6所示的每种反应的最小输注剂量作图。
实施例8
测量c-fos激活的应激评价
将野生型小鼠、KI小鼠和KO小鼠放置于一个狭窄的限区内(50ml一端通气的管)，使活动受限达1小时。连续5天每天限制所述小鼠1小时，此后立即将其处死；将新鲜冷冻脑组织进行处理，供原位杂交组织化学用。c-fos C末端区通过PCR进行克隆，并且用于在P33UTP存在下合成cDNA核糖核酸探针(riboprobe)(SEQ ID NO：8，正向引物5′AGGAGGGAGCTGACAGATCACTTC；SEQ ID NO：9，反向引物5′GTCTGCTGCATAGAAGGAACCGG)。与未经应激的对照c-fos相比，c-fos mRNA水平在所有三个组中都增加。将顶叶皮质中的mRNA信号数字化并定量，如图7所示。KI动物表现出c-fos mRNA水平降低27％(通过ANOVA分析，p＜.05；n＝7只/组)。
人们知道，本文描述的实施例和实施方案仅仅用以说明，根据本发明，各种修改或变化对于本领域技术人员而言将会是显而易见的并且必将包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求书的范围内。本文所引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用全部结合到本文中用于所有目的。
序列表
<110>Wyeth
<120>含有非功能性Kvβ1.1亚基N末端的敲入转基因哺乳动物
<130>AM100651
<160>9
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>210
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>1
atggaagtct ccatagcctg cacagagcac aatttgaaga gtcgaaatgg tgaggaccga
60
cttctgagca agcagagctc caccgccccc aatgtggtga acgcagcccg ggccaaattc
120
cgcactgtcg ctatcatcgc tcgcagcctg gggaccttca cccctcagca tcacatttct
180
ctcaaagagt ccaccgcaaa gcagactggc
210
<210>2
<211>210
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>2
atggtatttt acccatacga tgttcctgac tatgcgggct atccctatga cgtcccggac
60
tatgcaggat cctatccata tgacgttcca gattacgctg ctcagtgccg ggccaaattc
120
cgcactgtcg ctatcatcgc tcgcagcctg gggaccttca cccctcagca tcacatttct
180
ctcaaagagt ccaccgcaaa gcagactggc
210
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ttgaaagtga cttaactcag cgc
23
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gctgaccgct tcctcgtgct ttac
24
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ggccacatct taaagatcgc ac
22
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
aggagggagc tgacagatac actcc
25
<210>7
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
caaggatggc ttgggctcag ggtcgt
26
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
aggagggagc tgacagatca cttc
24
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
gtctgctgca tagaaggaac cgg
23
Claims (97)
1.一种转基因啮齿动物，所述啮齿动物包含一种编码A-型钾通道的突变型Kvβ1.1亚基的内源基因簇，其中所述突变型Kvβ1.1亚基是一种不能赋予所述通道的N-型失活但保留与Kv1家族α-亚基共缔合的能力的敲入亚基。
2.权利要求1的转基因啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠。
3.权利要求1的转基因啮齿动物，其中所述敲入亚基由纯合突变编码。
4.权利要求1的转基因啮齿动物，其中所述敲入亚基由选自置换突变、插入突变、移码突变和终止密码子突变的一种突变编码。
5.权利要求2的转基因小鼠，其中根据Y形迷宫测定，所述小鼠与具有完全非功能性剔除Kvβ1.1亚基的同一品系的小鼠相比，具有显著不同的学习或记忆模式。
6.权利要求5的转基因小鼠，其中在4小时实验中间间隔后，所述小鼠与具有剔除Kvβ1.1亚基的小鼠相比，具有显著改善的学习或记忆。
7.权利要求5的转基因小鼠，其中在30分钟实验中间间隔后，所述小鼠与具有剔除Kvβ1.1亚基的小鼠相比，具有显著减退的学习或记忆。
8.权利要求2的转基因小鼠，其中根据环境恐惧条件反射测定，所述小鼠与具有剔除Kvβ1.1亚基的同一品系的小鼠相比，具有显著减退的学习模式。
9.权利要求8的转基因小鼠，其中根据环境恐惧条件反射测定，所述小鼠与具有野生型Kvβ1.1亚基的同一品系的小鼠相比，具有显著减退的学习模式。
10.权利要求2的转基因小鼠，其中根据高架O形迷宫测定，所述小鼠与具有剔除Kvβ1.1亚基的同一品系的小鼠相比，具有显著减轻的焦虑模式。
11.权利要求10的转基因小鼠，其中根据高架O形迷宫测定，所述小鼠与具有野生型Kvβ1.1亚基的同一品系的小鼠相比，具有显著减轻的焦虑模式。
12.权利要求2的转基因小鼠，其中根据应激诱导的皮质酮水平测定，所述小鼠与具有剔除Kvβ1.1亚基的同一品系的小鼠相比，具有显著减轻的焦虑模式。
13.权利要求12的转基因小鼠，其中根据应激诱导的皮质酮水平测定，所述小鼠与具有野生型Kvβ1.1亚基的同一品系的小鼠相比，具有显著减轻的焦虑模式。
14.权利要求2的转基因小鼠，其中根据应激诱导的体温过高测定，所述小鼠与具有剔除Kvβ1.1亚基的同一品系的小鼠相比，具有显著减轻的焦虑模式。
15.权利要求14的转基因小鼠，其中根据应激诱导的体温过高测定，所述小鼠与具有野生型Kvβ1.1亚基的同一品系的小鼠相比，具有显著减轻的焦虑模式。
16.权利要求2的转基因小鼠，其中根据应激诱导的c-fos水平测定，所述小鼠与具有剔除Kvβ1.1亚基的同一品系的小鼠相比，具有显著减轻的焦虑模式。
17.权利要求16的转基因小鼠，其中根据应激诱导的c-fos水平测定，所述小鼠与具有野生型Kvβ1.1亚基的同一品系的小鼠相比，具有显著减轻的焦虑模式。
18.一种转基因啮齿动物，所述转基因啮齿动物的基因组在内源Kvβ1.1亚基基因N末端的密码子1-70中包含一个纯合敲入突变，其中所述敲入突变是置换突变，并且所述啮齿动物与其基因组包含一个编码一种完全非功能性Kvβ1.1亚基的纯合剔除突变的第二种啮齿动物相比，表现出显著不同的认知模式。
19.权利要求18的转基因啮齿动物，其中所述纯合敲入突变存在于内源Kvβ1.1亚基基因N末端密码子1-36中。
20.权利要求19的转基因啮齿动物，其中所述置换突变包含一个免疫反应性附加表位。
21.权利要求20的转基因啮齿动物，其中所述附加表位是血凝素附加表位。
22.权利要求18的转基因啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠。
23.一种转基因啮齿动物，所述转基因啮齿动物的基因组在内源Kvβ1.1亚基基因N末端密码子1-36中包含一个纯合敲入突变，其中所述敲入突变是置换突变，并且所述啮齿动物与其基因组包含一个编码完全非功能性Kvβ1.1亚基的纯合剔除突变的第二种啮齿动物相比，表现出显著不同的认知模式。
24.一种转基因啮齿动物，所述转基因啮齿动物的所有生殖细胞和体细胞都含有一种在胚胎期引入所述啮齿动物或所述啮齿动物的祖先中的重组活化Kvβ1.1转基因序列，其中所述Kvβ1.1转基因编码一种不能赋予钾通道的N-型失活但保留与Kv1家族α-亚基共缔合的能力的敲入β亚基。
25.一种制备分离的敲入哺乳动物细胞的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)在内源Kvβ1.1基因和转基因Kvβ1.1之间实现同源重组，其中所述转基因Kvβ1.1包含
(a)一个编码一种免疫反应性标志的序列，所述免疫反应性标志取代了Kvβ1.1亚基的整个密码子1-70或其一部分，
(b)一个选择标记，所述选择标记邻接一对重复位点，和
(c)一对与所述内源Kvβ1.1基因同源的序列，所述序列对既邻接所述标志又邻接所述选择标记；且
(2)实现进一步重组，以去除所述选择标记，其中所述转基因Kvβ1.1编码一种不能赋予N-型失活但保留与Kv1家族α-亚基共缔合的能力的敲入β亚基。
26.权利要求25的敲入哺乳动物细胞，其中所述细胞对于所述转基因是纯合的。
27.一种制备分离的敲入哺乳动物细胞的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)在内源Kvβ1.1基因和转基因Kvβ1.1之间实现同源重组，其中所述转基因Kvβ1.1包含
(a)一个编码一种免疫反应性标志的序列，所述免疫反应性标志取代了Kvβ1.1亚基的整个密码子1-36或其一部分，
(b)一个选择标记，所述选择标记邻接一对重复位点，和
(c)一对与所述内源Kvβ1.1基因同源的序列，所述序列对既邻接所述标志又邻接所述选择标记；且
(2)实现进一步重组，以去除所述选择标记，其中所述转基因Kvβ1.1编码一种不能赋予N-型失活但保留与Kv1家族α-亚基共缔合的能力的敲入β亚基。
28.一种哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞表达A-型钾通道的突变型Kvβ1.1亚基，其中所述突变型Kvβ1.1亚基是不能赋予所述通道的N-型失活但保留与Kv1α-亚基共缔合的能力的敲入亚基，其中所述细胞包含一种控制所述突变型Kvβ1.1亚基表达的内源核酸序列，并且所述突变型Kvβ1.1亚基由选自置换突变、插入突变、移码突变和终止密码子突变的一种突变编码。
29.权利要求28的细胞，其中所述哺乳动物细胞选自马、牛、啮齿动物、猫、狗、猪、山羊、绵羊、非人类灵长类、人类、兔子和仓鼠。
30.权利要求28的细胞，其中所述细胞是一种鼠类细胞。
31.权利要求28的细胞，其中所述突变是置换所述内源核酸序列中的整个密码子1-70或其一部分。
32.权利要求28的细胞，其中所述突变是置换所述内源核酸序列中的整个密码子1-36或其一部分。
33.权利要求32的细胞，其中所述置换包含一个免疫反应性附加表位。
34.权利要求32的细胞，其中所述细胞对于所述突变是纯合的。
35.一种核酸构建体，所述核酸构建体在Kvβ1.1基因的密码子1-70中包含一种编码突变的核酸；其中所述核酸编码A-型钾通道的敲入亚基，并且所述敲入亚基不能赋予所述A-型钾通道的N-型失活但保留与Kv1家族α-亚基共缔合的能力。
36.权利要求35的核酸构建体，其中所述突变选自置换突变、插入突变、移码突变和终止密码子突变。
37.权利要求36的核酸构建体，其中所述突变是置换突变。
38.权利要求37的核酸构建体，其中所述突变包含一个取代Kvβ1.1基因的整个密码子1-70的免疫反应性附加表位。
39.权利要求35的核酸构建体，其中所述核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。
40.权利要求35的核酸构建体，其中所述核酸是核糖核酸(RNA)。
41.权利要求35的核酸构建体，其中所述核酸构建体存在于哺乳动物细胞中。
42.权利要求35的核酸构建体，其中所述核酸存在于载体中。
43.一种核酸构建体，所述核酸构建体在Kvβ1.1基因的密码子1-36中包含一种编码突变的核酸；其中所述核酸编码A-型钾通道的敲入亚基，并且所述敲入亚基不能赋予所述A-型钾通道的N-型失活但保留与Kv1家族α-亚基共缔合的能力。
44.一种核酸构建体，所述核酸构建体通过同源重组破坏内源Kvβ1.1基因的表达，所述构建体包含一个取代Kvβ1.1基因的整个密码子1-70或其一部分的免疫反应性附加表位、一个选择标记和一对既邻接所述标志又邻接所述选择标记的核酸序列，其中所述序列对与所述内源Kvβ1.1基因的一部分同源。
45.权利要求44的核酸构建体，其中所述免疫反应性附加表位是血凝素附加表位。
46.权利要求44的核酸构建体，其中所述选择标记是neo基因。
47.权利要求44的核酸构建体，其中所述构建体存在于载体中。
48.权利要求44的核酸构建体，其中所述选择标记还邻接Lox P核酸序列。
49.一种核酸构建体，所述核酸构建体通过同源重组破坏内源Kvβ1.1基因的表达，所述构建体包含一个取代Kvβ1.1基因的整个密码子1-36或其一部分的免疫反应性附加表位、一个选择标记和一对既邻接所述标志又邻接所述选择标记的核酸序列，其中所述序列对与所述内源Kvβ1.1基因的一部分同源。
50.一种就Kvβ1.1亚基活性的调节剂初步筛选试验化合物的方法，所述方法包括下述步骤
(a)使试验化合物与突变型Kvβ1.1亚基接触；和
(b)选择一种在所述突变型Kvβ1.1亚基活性方面有可检测变化的所述试验化合物，
其中所述突变型Kvβ1.1亚基是不能赋予N-型失活但保留与Kv1家族α-亚基共缔合的能力的敲入亚基。
51.权利要求50的方法，其中所述突变型Kvβ1.1亚基存在于细胞中。
52.权利要求51的方法，其中所述接触包括使所述细胞与所述试验化合物接触。
53.权利要求50的方法，其中所述检测包括免疫测定，以确定所述突变型Kvβ1.1亚基是否与Kv1家族α-亚基共缔合。
54.权利要求50的方法，其中所述所选试验化合物与突变型Kvβ1.1亚基结合。
55.权利要求50的方法，其中所述试验化合物为小分子。
56.权利要求55的方法，其中所述试验化合物来自这样的文库：所述文库选自一组由空间可寻址平行固相文库或溶液相文库构成的文库或者一组由重叠合法、“单珠单化合物”方法或者通过亲和层析选择法制成的合成文库。
57.一种就Kvβ1.1亚基活性的调节剂初步筛选试验化合物的方法，所述方法包括下述步骤
(a)使试验化合物与野生型Kvβ1.1亚基和突变型Kvβ1.1亚基接触；和
(b)选择一种在所述野生型Kvβ1.1亚基活性方面有可检测变化但是在所述突变型Kvβ1.1亚基活性方面没有可检测变化的所述试验化合物，
其中所述突变型Kvβ1.1亚基是不能赋予N-型失活但保留与Kv1家族α-亚基共缔合的能力的敲入亚基。
58.权利要求57的方法，其中所述野生型Kvβ1.1亚基和所述突变型Kvβ1.1亚基存在于一种试验样品中。
59.权利要求58的方法，其中所述试验样品包括细胞。
60.权利要求57的方法，其中所述野生型Kvβ1.1亚基存在于第一种试验样品中，而所述突变型Kvβ1.1亚基存在于第二种试验样品中。
61.权利要求60的方法，其中所述试验样品包括细胞。
62.权利要求58或60的方法，其中所述接触包括使所述细胞与所述试验化合物接触。
63.权利要求57的方法，其中Kv1 α-亚基也与所述试验化合物同时存在。
64.权利要求63的方法，其中免疫测定用来确定所述可检测变化是否是由于缺乏与Kv1家族α-亚基共缔合所致。
65.权利要求57的方法，其中所述所选试验化合物与所述Kvβ1.1亚基结合。
66.权利要求57的方法，其中所述试验化合物为小分子。
67.权利要求66的方法，其中所述试验化合物来自这样的文库：所述文库选自一组由空间可寻址平行固相文库或溶液相文库构成的文库或者一组由重叠合法、“单珠单化合物”方法或者通过亲和层析选择法制成的合成文库。
68.一种评价用于调节Kvβ1.1亚基活性的试验化合物的功效的方法，所述方法包括：
(a)使所述试验化合物与野生型Kvβ1.1亚基和突变型Kvβ1.1亚基接触；和
(b)检测在所述野生型Kvβ1.1亚基活性方面有变化但是在所述突变型Kvβ1.1亚基活性方面没有变化，
其中所述突变型Kvβ1.1亚基是不能赋予钾通道的N-型失活但与Kv1家族α-亚基共缔合的敲入亚基。
69.权利要求68的方法，其中所述试验化合物使所述野生型Kvβ1.1亚基的活性降低大于10％。
70.权利要求69的方法，其中所述试验化合物使所述野生型Kvβ1.1亚基的活性降低大于50％。
71.权利要求69的方法，其中所述野生型Kvβ1.1亚基存在于第一种试验样品中，而所述突变型Kvβ1.1亚基存在于第二种试验样品中，并且所述试验样品包括细胞。
72.权利要求68的方法，其中所述野生型Kvβ1.1亚基存在于第一种试验样品中，而所述突变型Kvβ1.1亚基存在于第二种试验样品中，并且所述试验样品包括组织。
73.权利要求68的方法，其中所述野生型Kvβ1.1亚基存在于第一种试验样品中，而所述突变型Kvβ1.1亚基存在于第二种试验样品中，并且所述试验样品包括啮齿动物。
74.权利要求73的方法，其中所述接触包括将所述试验化合物给予所述啮齿动物。
75.权利要求74的方法，其中所述啮齿动物是小鼠。
76.权利要求74的方法，其中所述接触包括使所述组织与所述试验化合物接触。
77.权利要求71的方法，其中所述接触包括使细胞与所述试验化合物接触。
78.权利要求77的方法，其中所述检测包括免疫测定，以确定所述野生型Kvβ1.1亚基是否与Kv1家族α-亚基共缔合。
79.权利要求68的方法，所述方法还包括下述步骤
(a)使所述试验化合物与完全非功能性剔除Kvβ1.1亚基接触；和
(b)检测在所述第三种试验样品中在所述完全非功能性剔除Kvβ1.1亚基活性方面没有变化。
80.权利要求79的方法，其中所述剔除Kvβ1.1亚基存在于啮齿动物中，并且所述检测包括行为实验。
81.权利要求78的方法，其中所述行为实验选自Y形迷宫、环境恐惧条件反射和高架O形迷宫。
82.权利要求79的方法，其中所述剔除Kvβ1.1亚基存在于啮齿动物中，并且所述检测包括生理学测定。
83.权利要求82的方法，其中所述生理学测定选自激素水平测定、体温过高测定和电生理学测定。
84.一种评价使A-型钾通道失活的试验化合物的功效的方法，所述方法包括：
(a)使试验化合物与野生型Kvβ1.1亚基和突变型Kvβ1.1亚基接触；和
(b)检测在所述野生型Kvβ1.1亚基的活性方面有变化但是在所述突变型Kvβ1.1亚基的活性方面没有变化；
其中所述突变型Kvβ1.1亚基由在整个密码子1-70或其一部分中包含一种突变的敲入Kvβ1.1基因序列编码。
85.权利要求84的方法，其中在野生型Kvβ1.1亚基活性方面的所述变化是由所述钾通道的N-型失活被抑制引起的。
86.权利要求84的方法，其中在野生型Kvβ1.1亚基活性方面的所述变化使所述野生型亚基具有与所述突变型Kvβ1.1亚基相同的活性。
87.权利要求84的方法，其中通过使啮齿动物经历高架O形迷宫，来测量所述活性。
88.权利要求84的方法，其中通过使啮齿动物经历环境刺激，然后测量所述啮齿动物的皮质酮水平，来测量所述活性。
89.权利要求84的方法，其中通过使啮齿动物经历环境刺激，然后测量所述啮齿动物的c-fos水平，来测量所述活性。
90.权利要求88的方法，其中所述啮齿动物是小鼠。
91.权利要求84的方法，其中通过获取啮齿动物的组织，然后使所述组织经历电生理学实验，来测量所述活性。
92.权利要求84的方法，其中通过用体外结合测定来测量所述活性。
93.权利要求84的方法，其中所述试验化合物与所述野生型Kvβ1.1亚基结合但不与所述突变型Kvβ1.1亚基结合。
94.权利要求84的方法，其中所述方法还包括使所述试验化合物与完全非功能性剔除Kvβ1.1亚基接触然后检测在所述剔除Kvβ1.1亚基的活性方面没有变化的步骤。
95.权利要求84的方法，其中所述野生型Kvβ1.1亚基的活性被降低大于10％。
96.权利要求95的方法，其中所述野生型Kvβ1.1亚基的活性被降低大于50％。
97.一种评价使A-型钾通道失活的试验化合物的功效的方法，所述方法包括：
(a)使试验化合物与野生型Kvβ1.1亚基和突变型Kvβ1.1亚基接触；和
(b)检测在所述野生型Kvβ1.1亚基的活性方面有变化但是在所述突变型Kvβ1.1亚基活性方面没有变化，
其中所述突变型Kvβ1.1亚基由在整个密码子1-36或其一部分中包含一种突变的敲入Kvβ1.1基因序列编码。
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