JP2005503143A - Kvベータ1.1サブユニットの非機能性N末端を含んでいるノックイントランスジェニック哺乳動物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2001年7月27日に出願された仮出願番号60/308,485、および2001年9月9日に出願された対応する仮出願番号60/331,140からの優先権を主張し、これらの全開示を出典明示により本明細書中に組み込む。
【0002】
発明の分野
本発明は、不完全な電位感受性カリウムチャネルベータ1サブユニット(Kvβ1)(ここで、該Kvβ1サブユニットは、チャネルのN型の不活性化を付与することができないが、Kv1ファミリーα−サブユニットと会合して、チャネルの表面発現を高める能力は保持する)を含んでいるトランスジェニック哺乳動物に関する。トランスジェニック哺乳動物は、精神医学および神経学的疾患のモデルとして、および不安緩解化合物を同定するのに有用である。
【0003】
本発明の背景
電位−ゲートカリウムチャネル(Kv)は、哺乳動物における神経の興奮に寄与する。いくつかのK+チャネル(A−型K+チャネル)は、その速不活性化のために、神経の発火の調節因子として作用する速不活性化因子である。脳組織におけるKvチャネルの離散した局在性により、これらのチャネルが、発作の伝播および虚血性傷害に頻繁に関与する経路における活性ポテンシャル伝播および神経伝達物質放出のコントロールにおける必須のエレメントであることが示唆される(Rhodes et al. (1997) J. Neurosci. 17: 8245-8258を参照されたい)。
【0004】
いくつかのKvチャネルは、シェーカー−関連スーパーファミリーのメンバーであり、膜に埋めこまれたαサブユニットおよび補助的な細胞質性βサブユニットが集合して成る。Kvβ1、Kvβ2、およびKvβ3と名づけられる3つのKvβ遺伝子により、5つのβサブユニットが提供される。さらに、Kvβ1遺伝子のオールターナティブスプライシングにより、そのN−末端配列およびその発現パターンが異なる3つの組織特異的β1サブユニットイソ形態、Kvβ1.1、Kvβ1.2、およびKvβ1.3が提供される。Kvβ1.2およびKvβ1.3は心臓組織で発現されるが、Kvβ1.1は脳組織、特に海馬CA1領域および線条において発現される。
【0005】
Kvチャネルのβ−サブユニットは、細孔を形成しているα−サブユニットの表面発現、安定性、転写後のプロセシング、および不活性化動態を調節するのに重要な役割を果たす。所定のαサブユニットを有する補助Kvβ1のいずれかの同時発現により、発現されるKvチャネルの不活性化動態が劇的に促進された(Rettig et al. (1994) Nature 369: 289-294; Majumder et al. (1995) FEBS Lett. 361, Morales et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 6272-6277; England et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6309-6313; England et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 28531-28534;: 13-16; McCornmack et al. (1995) FEBS Lett. 370: 32-36; Heinemann et al. (1996) J. Physiol. (Loud.) 493: 625-633)。Kvチャネルの不活性化は、Kvβ1サブユニットのアミノ末端における「ボール」ドメインにより付与されることがすでに示されている(Rettig、既出)。加えて、Kvβ1.1サブユニットは同時発現されるαサブユニットの表面発現を促進するので、Kvβ1.1サブユニットは、対応するKv1ファミリーα−サブユニットの折りたたみにおいてシャペロン様の機能を有することが示唆されている(Shi et al. (1996) ニューロン(Neuron) 16: 843-852; Acclili et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 25824-25831)。対応するKv1ファミリーα−サブユニットと会合するKvβ1サブユニットの能力は、そのアミノ末端の欠失にも関わらず保持され、結果的に、感染した哺乳動物細胞を用いる実験にて示されているように、チャネルの不活性化を付与する能力は喪失する(Nakahira et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 7084-7089)。懸著には、全Kvβ1.1サブユニットの機能の完全な喪失により、ノックアウトマウスにいては、海馬および線条ニューロンにおけるA型Kvチャネルの活性の低下が生じる(Giese et al. (1998) 学習&記憶(Learning & Memory) 5: 257-273)。しかし、それがN−タイプの不活性化であろうと、そのシャペロン様機能であろうと、Kvβ1.1サブユニットの機能がどのように、動物の変化した認識、不安および運動調節に寄与するかは不明である。
【0006】
PCT公開文献WO00/24871号は、A型K+チャネルのKvβ1.1サブユニットの全てを損傷しているノックアウト変異を有するトランスジェニックマウスを開示する。WO00/24871号は、しかし、Kvβ1.1サブユニットの一部のみが不活性化されて、機能性を保持するKvβ1.1サブユニットの部分が残っている変異を有するトランスジェニック哺乳動物は記載していない。特に、WO00/24871号は、N型の不活性化を付与する能力を除き、β1.1サブユニットの全機能部分が保持されているKvβ1.1サブユニットの変異を有するトランスジェニック動物は提供しない。
【0007】
Kvβ1.1サブユニットの別個の部分が非機能性となっている、特に、N型の不活性化が喪失しているトランスジェニック哺乳動物モデルであって、パニックおよび不安障害、認識障害、癲癇、虚血性卒中、および運動障害の治療に用い得る化合物(「ディスアクチベーター」)および治療法を同定するためのトランスジェニック哺乳動物モデルを提供することが望まれ得る。
【0008】
発明の概要
本発明は、A型カリウムチャネルにおける変異Kvβ1.1サブユニットをコードする内在遺伝子クラスターを有するトランスジェニック齧歯動物であって、変異Kvβ1.1サブユニットがチャネルのN型不活性化を付与することはできないが、Kv1ファミリーα−サブユニットと会合する能力は保持するノックインサブユニットである齧歯動物に関する。
【0009】
好ましい具体例において、トランスジェニック齧歯動物は、マウス(「KIマウス」)であり、変異ノックインKvβ1.1サブユニットは、ホモ接合変異によりコードされる。ノック−インKvβ1.1サブユニットは、置換変異、挿入変異、フレームシフト変異、およびストップコドン変異から成る群から選択される変異によりコードされてよく、最も好ましくは、KIマウスは、Y迷路によりアッセイされるように、Kvβ1.1サブユニットが完全に非機能性であるマウス(KOマウス)と比較して、有意に異なる学習または記憶パターンを示す。一態様において、Y迷路試験は好ましくは、KOマウスと比較して、4時間の試験間間隔後に有意に学習または記憶が改善されるが、KIマウスはKOマウスと比較して30分の試験間感覚後に有意に損なわれた学習または記憶を有することを、好ましくは示す。他の好ましい具体例では、コンテクスチュアル恐れ条件付けアッセイを用いて、KIマウスがKOマウスおよび野生型Kvβ1.1サブユニットを有する同じ系統のマウス(「WTマウス」)と比較して、有意に損なわれた学習パターンを有することを示す。さらに他の好ましい具体例では、高架のゼロ迷路アッセイを用いて、KIマウスが、KOおよびWTマウスと比較して有意に低下した不安パターンを有することを示す。さらに他の態様において、ストレス誘導性のコルチコステロンレベルに関するアッセイを用いて、KIマウスがKOおよびWTマウスと比較して有意に低下した不安パターンを有することを示す。同様に、本発明の他の態様において、ストレス誘導性の高体温に関するアッセイを用いて、KIマウスが、KOおよびWTマウスと比較して有意に低下した不安パターンを有することを示す。
【0010】
本発明はさらに、そのゲノムが、内在Kvβ1.1サブユニット遺伝子のN末端のコドン1−70(即ち、配列番号1)、好ましくはコドン1−36においてホモ接合変異を含み、該変異が置換変異であり、齧歯動物が、そのゲノムが完全に非機能性のKvβ1.1サブユニットをコードするホモ接合体変異を含む第2の齧歯動物に対して有意に異なる認識パターンを示すトランスジェニック齧歯動物に関する。好ましくは、置換変異は、免疫反応性のエピトープタグを含み、および最も好ましくは、置換変異が、血球凝集素エピトープタグである。本発明のさらなる態様において、トランスジェニック齧歯動物はマウスである。
【0011】
他の具体例において、本発明は、生殖細胞および体細胞が、該齧歯動物または該齧歯動物の先祖に胎児段階で導入された組換え活性化Kvβ1.1トランスジーン配列を含み、Kvβ1.1トランスジーンが、カリウムチャネルのN型不活性化を付与することができないがKv1ファミリーα−サブユニットと会合する能力は保持するβサブユニットをコードする、トランスジェニック齧歯動物に関する。
【0012】
他の態様では、本発明により、以下の工程から成る単離ノックイン哺乳動物細胞を作製する方法が提供される;(1)内在Kvβ1.1遺伝子およびトランスジーンKvβ1.1の間の相同組換えを為すこと、ここで該トランスジーンKvβ1.1は、(a)Kvβ1.1サブユニットのコドン1−70の全部または部分を置換する免疫活性タグをコードしている配列、(b)一対の繰り返し部位が隣接する選択可能なマーカー、および(c)該タグおよび選択可能なマーカーの両方が隣接している、内在Kvβ1.1遺伝子に相同な1対の配列を含む;(2)さらに組換えを為して、選択可能なマーカーを除去すること、ここで、トランスジーンKvβ1.1は、N型不活性化は付与することができないがKv1ファミリーαサブユニットと会合する能力は保持するβサブユニットをコードする。好ましくは、哺乳動物細胞は、トランスジーンに関してホモ接合である。最も好ましくは、免疫活性タグは、コドン1−36の全部または部分を置換する。
【0013】
さらに他の具体例では、本発明により、ノック−インKvβ1.1サブユニットを有するA型カリウムチャネルを発現している哺乳動物細胞であって、ノック−インKvβ1.1サブユニットが、チャネルのN型不活性化を付与することができないが、Kv1ファミリーα−サブユニットと会合する能力は保持し、該細胞が、ノックインKvβ1.1サブユニットの発現をコントロールする内在核酸配列を含み、そして該ノック−インKvβ1.1サブユニットが、置換変異、挿入変異、フレームシフト変異、およびストップコドン変異から成る群から選択される変異によりコードされる、哺乳動物細胞が提供される。好ましくは、細胞は、ウマ、ウシ、齧歯動物、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、非ヒト霊長類、ヒト、ウサギ、およびハムスターから成る群から選択される。最も好ましくは、細胞はネズミの細胞である。他の態様において、細胞は、内在核酸配列のコドン1−70の全部または一部が置換されており、より好ましくはコドン1−36が置換されており、そして置換体が免疫活性エピトープタグを含む変異を含む。最も好ましくは、細胞は置換変異に関してホモ接合である。
【0014】
さらなる具体例において、本発明により、Kvβ1.1遺伝子のコドン1−70において、より好ましくはコドン1−36において変異をコードしている核酸構築物であって、該核酸がA型カリウムチャネルのノックインサブユニットをコードし、該核酸ノックインサブユニットがA型カリウムチャネルのN型不活性化を付与することができないがKv1ファミリーαサブユニットと会合する能力は保持する、核酸構築物が提供される。変異は、置換変異、挿入変異、フレームシフト変異、およびストップコドン変異であってよいが、好ましくは置換変異である。より好ましくは、変異は、Kvβ1.1遺伝子のコドン1−70、好ましくはコドン1−36の全部を置換している免疫反応性エピトープを含む。さらに、核酸構築物は、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)いずれかである核酸を含む。他の態様では、核酸構築物は、哺乳動物細胞かベクターのいずれかの中にある。
【0015】
他の態様において、本発明により、相同組換えにより内在Kvβ1.1遺伝子の発現を破壊するための核酸構築物であって、該構築物が、Kvβ1.1遺伝子のコドン1−70の全部または一部を置換している免疫反応性のエピトープタグ、選択可能なマーカー、および、タグおよび選択可能なマーカーの両方に隣接している一対の核酸配列を含み、該対が内在Kvβ1.1遺伝子の一部に対して相同である、核酸構築物が提供される。より好ましくは、免疫反応性のエピトープタグは、コドン1−36の全部または一部を置換する。好ましくは、免疫反応性のエピトープタグは、血球凝集素エピトープタグであり、選択可能なマーカーはneo遺伝子である。より好ましくは、選択可能なマーカーには、LoxP核酸配列がさらに隣接している。最も好ましくは、核酸構築物はベクター中にある。
【0016】
さらに他の具体例では、本発明により、Kvβ1.1サブユニット活性のモジュレーターに関して試験化合物を前スクリーニングする方法であって、(a)試験化合物をノックインKvβ1.1サブユニットと接触させること、および(b)ノックインKvβ1.1サブユニットの活性に検出可能な変化を提供する試験化合物の1つを選択すること、ここで、ノックインKvβ1.1サブユニットは、N型不活性化を付与し得ないが、Kv1ファミリーαサブユニットと会合する能力は保持する、の工程から成る方法が提供される。1つの具体例において、ノック−インKvβ1.1サブユニットは試験サンプル中にあり、該試験サンプルは、細胞を含み、および接触させる工程は、該試験化合物を細胞に投与することを含む。加えて、検出する工程は、Kvβ1.1サブユニットがKv1ファミリーαサブユニットと会合するかどうかを決定するための、免疫アッセイを用いてよい。1の具体例では、選択される試験化合物は、Kvβ1.1サブユニットに結合する。好ましくは、試験化合物は、場所がアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー、またはデコンボリューション、「1−ビーズ1−化合物」法から、またはアフィニティクロマトグラフィー選択により作製される合成ライブラリーから成るライブラリーの群から選択される小分子である。
【0017】
別法として、本発明により、Kvβ1.1サブユニット活性のモジュレーターに関する試験化合物を、(a)試験化合物を野生型Kvβ1.1サブユニットおよびノック−インKvβ1.1サブユニットと接触させること、および(b)野生型Kvβ1.1サブユニットの活性に検出可能な変化を提供するが、ノック−インKvβ1.1サブユニットの活性には検出可能な変化を提供せず、ノック−インKvβ1.1サブユニットがN型の不活性化を付与することができないが、Kv1ファミリーα−サブユニットと会合する能力は保持する試験化合物の1つを選択することにより、前スクリーニングする方法が提供される。1つの具体例では、野生型およびノック−インKvβ1.1サブユニットが1つの試験サンプル中に存在する。別法として、野生型Kvβ1.1サブユニットが第1の試験サンプル中に存在し、ノック−インKvβ1.1サブユニットが第2の試験サンプル中に存在する。試験サンプルは細胞を含んでよく、この場合、接触させる工程は、該試験化合物を細胞へ投与することを含む。1つの具体例において、Kv1ファミリーα−サブユニットが試験化合物と共に存在していてよく、免疫アッセイを用いて、検出可能な変化がKv1ファミリーα−サブユニットとの会合を欠くことによるかどうかを決定してよい。1つの具体例において、選択された試験化合物はKvβ1.1サブユニットに結合する。加えて、前記のごとく、試験化合物は、場所がアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー、またはデコンボリューション、「1−ビーズ1−化合物法」から作製された、またはアフィニティクロマトグラフィー選択によるライブラリーの群から選択される小分子であってよい。
【0018】
他の好ましい具体例において、本発明により、Kvβ1.1サブユニットの活性を変更するための試験化合物の効力を、試験化合物を野生型Kvβ1.1サブユニットおよび変異体Kvβ1.1サブユニットと接触させ、次いで第2試験サンプル中の野生型Kvβ1.1サブユニットの活性においては変化を検出するが、ノック−インKvβ1.1サブユニットには変化がないことを検出することにより評価する方法であって、ノック−インKvβ1.1サブユニットがN型の不活性化は付与することができないが、Kv1ファミリーα−サブユニットと会合するところの方法が提供される。好ましくは、試験化合物により、野生型Kvβ1.1サブユニットの活性が、10%以上まで、より好ましくは50%以上まで低下する。1つの具体例では、野生型Kvβ1.1サブユニットが第1試験サンプル中に存在し、ノック−インKvβ1.1サブユニットが、第2試験サンプル中に存在する。好ましくは、接触化させる工程には、該試験化合物を齧歯動物に投与することが含まれ、およびより好ましくは、齧歯動物はマウスである。
【0019】
別の好ましい具体例において、接触させる工程は、試験化合物を組織または細胞と接触させることを含む。さらに好ましい具体例において、方法は、試験化合物を第3試験サンプルと接触させること、および第3試験サンプルにおける完全な非機能性のKvβ1.1サブユニットの活性には変化がないことを検出することを含み、第3の試験サンプルが完全な非機能性のKvβ1.1サブユニットの発現により特徴づけられるところの工程を含む。さらに、接触させる工程が、試験化合物を細胞と接触させることを含む場合、検出する工程には、野生型Kvβ1.1サブユニットがKv1ファミリーα−サブユニットと会合するかどうかを決定するための免疫アッセイが含まれる。より好ましくは、ノック−アウトサブユニットは、齧歯動物にあり、この具体例における検出する工程には、Y迷路などの行動試験、コンテクスチュアル恐れ条件付け、および高架ゼロ迷路が含まれる。別法として、ノックアウトサブユニットは齧歯動物にあり、この具体例における検出の工程には、ホルモンアッセイ、高体温アッセイ、および電気生理学的アッセイなどの生理学的アッセイが含まれる。
【0020】
さらに他の具体例においては、本発明は、A型カリウムチャネルを不活性化する試験化合物の効力を、試験化合物を野生型Kvβ1.1サブユニットおよびノック−インKvβ1.1サブユニットと接触させること、次いで野生型Kvβ1.1サブユニットの活性の変化およびノック−インKvβ1.1サブユニットの活性の変化の不在を検出することにより評価する方法であって、ノック−インKvβ1.1サブユニットが、コドン1−70、より好ましくはコドン1−36の全部または一部における変異を含むKvβ1.1遺伝子配列によりコードされるものが含まれる。1つの具体例では、野生型Kvβ1.1サブユニットの活性における変化は、カリウムチャネルのN型の不活性化の阻害により引き起こされる。好ましくは、野生型Kvβ1.1サブユニットの活性の変化により、野生型サブユニットは、ノック−インKvβ1.1サブユニットと同じ活性を有するようになる。他の好ましい具体例では、活性は、トランスジェニック齧歯動物を高架ゼロ迷路へと供することにより測定する。別法として、活性は、トランスジェニック齧歯動物を環境刺激へと供し、次いで齧歯動物のコルチコステロンレベルを測定することにより測定する。他の別の具体例において、活性は、組織をトランスジェニック齧歯動物から採取すること、次いで組織を電気−生理学的試験に供することにより測定する。最も好ましくは、トランスジェニック哺乳動物はマウスである。さらに他の具体例では、活性は、インビトロ結合アッセイを用いることにより測定する。さらに、他の具体例において、試験化合物は野生型Kvβ1.1サブユニットに結合するが、ノック−インKvβ1.1サブユニットには結合しない。最も好ましい具体例において、方法は、試験化合物を完全に非機能性のKvβ1.1サブユニットと接触させること、次いで完全に非機能性のKvβ1.1サブユニットの活性に変化がないことを検出することをさらに含む。好ましくはこの具体例において、試験化合物により、野生型Kvβ1.1サブユニットの活性が、10%以上まで、およびより好ましくは50%以上まで低下する。
【0021】
図面の簡単な説明
図1Aは、内在Kvβ1遺伝子構造およびそのエキソン組成を図示したものである。5’末端の3つのエキソン(エキソン1.1、1.2、1.3)は、C末端に共通のドメイン(エキソン3−15)を有するが、二者択一的にスプライシングされ、その結果、それぞれはユニークなN−末端タンパク質配列をコードする。エキソン1.1は変異に関してターゲットされた不活性化ドメインをコードする。3つのエキソン1.1、1.2、および1.3の遺伝子上での相対順序は未知である。
【0022】
図1Bは、内在Kvβ1.1遺伝子を変異に関してターゲットした方法を示す。ターゲッティングベクター(上)を設計し、エキソン1.1の33番目のコドンの代わりの3×HAタグ、およびlox隣接ネオマイシンカセット(Flox-Neo)を組み込んだ。相同組換え(最初の矢印)により、変異体エキソンおよびFlox−Neoがエキソン1.1に交換する。Creレコンビナーゼにより媒介される第2の組換え(2番目の矢印)により、イントロンからFlox-Neoが除去され、1コピーのLoxP部位が残る(下)。制限部位EcoRIおよびBamHIを、「R」および「B」とそれぞれ示す。
【0023】
図1Cは、ES細胞をBamHIで消化したサザンブロットを図示したものである。図1Bからの5’プローブを用いて、野生型Kvβ1対立遺伝子に関する〜7.0kbのバンドが同定され、一方で、3×HA内に位置するBamHI部位から生じた更なる〜1.0kbのバンドが3つのターゲットされたESクローン(51、145、および191)に同定された。
【0024】
図1Dおよび1Eは、RNaseタンパク質分析の結果を図示したものであり、ノック−インKvβ変異体(Kvβ0)mRNA(図1D)および野生型Kvβ(WT)の発現パターンを示す(図1E)。3×HAエキソン1に対して相補的なプローブにより、ヘテロ接合およびホモ接合KI動物(それぞれ、wt/KIおよびKI/KI)において420bpの保護されたバンド、および野生型(WT)において、正常なkvβ1.1mRNAのN末端の3×HA配列が喪失していることにより220bpのより短い保護されたバンドを得た。正常なKvβ1.1mRNAに相補的なプローブを用いるコンバースRPA分析により、WTmRNAから完全に保護された480bpのフラグメントが示され、一方で、3×HA配列に隣接している2つのフラグメント(210および140)がKImRNAにおいて保護された。Flox−Neoカセットを有する動物は、いずれのプローブからも特定のバンドを示さず、Kvβ1.1発現およびKO遺伝子タイプの完全な欠損を示す。
【0025】
図1Fは、種々の遺伝子タイプからのサンプルを用いるPCR分析の結果を図示したものである。Kvβ0KIプライマーはエキソン1.1の3’エキソンイントロン結合およびNeo−Floxの30bp下流の部位の間のフラグメントを増幅し、それにより、ホモ接合野生型(w/w)、ホモ接合KO(o/o)、ホモ接合KI(I/I)、およびヘテロ接合KI(w/I)動物の同定が可能となる。KI対立遺伝子には、loxP繰り返し配列の存在が含まれ、そしてそれにより、WT対立遺伝子(230bp)よりさらに長い増幅された配列(264bp)を得た。
【0026】
図1Gは、WTおよび変異体マウスからの皮質、線条、海馬、小脳、中脳、および視床におけるKvβ1、Kvβ2、シナプシン1(コントロール)またはHAの発現を分析するために行ったウェスタンブロットを図示したものである。指定の脳領域を切り出し、特定の免疫反応に関して分析した。
図2A−2Bは、Y迷路におけるWT129/SvEvマウス対KOおよびKIマウスの間の個々の学習および記憶パターンを示す。図2Aは、30分、2時間、および4時間の試験間の間隔(ITI)後の、迷路の新規なアームを最初に選択するマウスの割合を示す。図2Bは、30分、2時間、および4時間のITI後の、新規なアームにおいて費やされた(2分間の)時間の割合を示す。
【0027】
図3A−3Bは、コンテクスチュアル恐れ条件付け試験における、両C57BI6(図3A)および129/SvEv(図3B)地のWT、KI、およびKOマウス間の個々の学習パターンを示す。
図4A-4Bは、高架ゼロ迷路のオープンゾーン部分において、C57BI6(図4A)および129/SvEv(図4B)地両方の、3つの異なるゲノタイプ、WT、KI、およびKOが費やした時間の割合を示す。
図5Aは、雄のWT(129/SvEv)マウスにおけるストレス誘導性の高体温症における、クロロジアセポキシドの種々の投与量の効果を示す。
図5Bは、野生型(WT;129/SvEv)、Kvβノック−イン(KI)およびノックアウト(KO)マウスにおける、ストレス誘導性の高体温症に対する反応を示す。挿入図は、初期測定における体温を示す。
【0028】
図6は、Kvβノック−インマウスにおいて発作の閾値が変化していないことを示す。
図7は、KI、KO、および野生型マウスの頭頂皮質におけるc−fos mRNAのインサイチュハイブリダイゼーション定量を示す。
【0029】
発明の詳細な記載
本発明は、Kvβ1.1遺伝子にノックイン変異(KI)を有するトランスジェニックマウスが、Kvβ1.1のノックアウト変異を有するトランスジェニックマウス(KO)または野生型マウス(WT)と比較して、有意に異なる行動的表現型を示すという発見に関する。KIマウスにおけるβサブユニットは、Kv−1ファミリーK+チャネルを不活性化する能力を欠くが、Kv1ファミリーαサブユニットと会合し、そしてそれによりチャネルの表面発現を高める能力は保持する。3つの異なる行動規範、Y迷路試験、コンテクスチュアル恐れ条件付け、および高架ゼロ迷路において、KIマウスは、KOマウスとは異なる行動パターンを一貫して示した。Y迷路の新規なアームにおいて費やされる時間により示されるように(実施例2を参照されたい)、KIマウスは、KOおよびWTマウスと比較して半時間の試験間間隔(ITI)にて記憶(retention)の欠損を示したが、4時間のITIにてKOマウスに対して改善された記憶を示した。コンテクスチュアル恐れ条件付け試験において、KIマウスはKOおよびWTマウスと比較して有意な欠損を示した(実施例4を参照されたい)。さらに、KIマウスは、高架ゼロ迷路(実施例4)、ストレス誘導性のコルチコステロンレベル(実施例5)およびストレス誘導性の高体温(実施例6)のような機能アッセイにおいて、KOマウスと比較して異なる行動および生理学的パターンを示す。
【0030】
理論により拘束されることなく、KI変異体は、N型チャネル不活性化の特異的な欠損を反映する、KOとは異なる表現型を顕在化することが考えられる。行動および生理学的アッセイにおけるKI活性の結果により、不安特性が示唆され、それゆえ、パニックおよび不安障害の治療のための試験化合物をスクリーニングすることにおける、潜在的な役割が示唆される。
【0031】
本発明はそれゆえ、そのゲノムがKI変異をコードするトランスジェニック哺乳動物、特にマウス、およびその作製に用いられる核酸構築物およびターゲッティング構築物に関する。加えて、KIトランスジェニック動物により、Kvβ1.1活性を調節する試験化合物の効力を評価するためのポジティブなモデルが提供される。本発明は、さらに、以下に示すごとくKvβ1.1活性を調節することができる試験化合物の結合アッセイ、高処理量アッセイ、および機能アッセイ(特に、行動および生理学的アッセイ)に関する。
【0032】
定義
本発明の理解をさらに容易にするために、多くの用語および語句を以下に定義する。
Kvβ1.1なる用語は、A型カリウムチャネルのβ1サブユニット、特にシェーカー様電圧ゲートカリウムチャネル(Kv)のβ1.1サブユニットイソ型を意味する。Kvチャネルは、典型的には、中心の水で満たされた孔の周りに集合している4つの同一のサブユニットから成る。この孔が開き、それを通じてカリウムイオンの通過が可能となるか、または細胞電位の変化に反応して閉じる、すなわち、「電圧ゲートされる」。Kvチャネルおよびβ1.1サブユニットは、当該分野の専門家に公知である。
【0033】
本明細書中に用いられるように、ノック−インKvβ1.1変異(「KI」)は、変異したKvβ1.1遺伝子が、K+チャネルのN型不活性化を付与することができないが、Kv1ファミリーαサブユニットと会合し、それによりチャネル表面発現は保持することができる不完全なβ1.1サブユニットをコードする、Kvβ1.1遺伝子における変異を意味する。本明細書中に用いるように、KIサブユニットは、KI変異によりコードされる変異β1.1サブユニットを意味し、KI哺乳動物は、発現されたKI変異を有する哺乳動物を意味する。好ましい具体例において、KI変異は、Kvβ1.1遺伝子のコドン1−70に変異を誘導することにより作製される。Kvβ1.1のコドン1−70は、配列番号1に示す。Kvβ1.1の好ましいDNAおよびアミノ酸配列は、配列番号1に示す。好ましくは、変異はコドン1−36の全部または部分が置換されている、実施例1および配列番号2の「Kvβ0」変異に示すような置換変異である。特に好ましい具体例において、免疫活性タグが、Kvβ1.1遺伝子の内在コドン1−70の全部または少なくとも1−36を置換し、α−サブユニットとの同時免疫沈降を検出するのに役立つ。別法として、いずれかの外来核酸配列を内在Kvβ1.1遺伝子に挿入して、KI変異を作製してよい。Kvβ1.1ノック−イン哺乳動物、またはそれからの組織または細胞には、ヘテロ接合哺乳動物(即ち、1つの変異対立遺伝子と1つの野生型対立遺伝子)およびホモ接合変異体(即ち、2つの変異対立遺伝子)の両方が含まれる。
【0034】
Kvβ1.1ノックアウト変異(「KO」)なる用語は、変異したKvβ1.1遺伝子が、カリウムチャネルのN型不活性化を付与することができず、Kv1ファミリーα−サブユニットと会合もできない、またはKvβ1.1遺伝子が完全に存在しないβサブユニットをコードする、Kvβ1.1遺伝子における変異を意味する。簡単には、KO変異は、完全に非機能性のKvβ1サブユニットをコードする。本明細書中に用いられるように、KOサブユニットは、KO変異によりコードされる変異β1.1サブユニットを意味し、KO哺乳動物は、発現されたKO変異を有する哺乳動物を意味する。「Kvβ1.1−ノックアウト」なる用語は、ヘテロ接合哺乳動物およびホモ接合変異体哺乳動物の両方、およびそれ由来の組織または細胞を意味する。Kvβ1.1−ノックアウト変異の例を実施例1に示すが、ここでは、ネオマイシンマーカーをKvβ1.1遺伝子のイントロンに挿入し、そして遺伝子の機能を完全に破壊する。
【0035】
野生型Kvβ1.1(「WT」)なる用語は、完全な機能性Kvβ1.1サブユニットをコードしている天然に生じるヌクレオチドおよびアミノ酸配列であって、Kvβ1.1サブユニットをコードしている遺伝子が、その世代または先祖の世代のいずれの時点でも、天然に生じる物質を欠失させるために、または外来の遺伝子物質を含めるために実験的に操作されていないKvβ1.1遺伝子を意味する。
【0036】
「遺伝的に変更された」なる用語は、細胞のゲノタイプまたは表現型および次いでその子孫を変更する誘導変異を含む遺伝子を含んでいるおよび/または発現している細胞を意味する。この用語には、挿入変異、フレームシフト変異、またはストップコドン変異を含む細胞の内在ヌクレオチドに対するいずれかの付加または破壊が含まれる。「変更した」または「変異体」、およびその種々の文法上由来する語は、導入された遺伝子変異またはそれからコードされる遺伝子産物を含むあらゆる遺伝子を意味する。本明細書中に用いられるように、変異Kvβ1.1遺伝子は、典型的には、ノック−インKvβ1.1サブユニットまたはノックアウトKvβ1.1サブユニットのいずれかをコードする遺伝子を意味する。
【0037】
本発明の「非ヒト動物」なる用語は、齧歯動物、非−ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類などのいずれかの脊椎動物が含まれる。好ましい非ヒト哺乳動物は、ラットおよびマウスを含む齧歯目から選択され、最も好ましくは、マウスである。
【0038】
本明細書中に用いる「トランスジーン」なる用語は、外来遺伝子を胎児幹(ES)細胞、新たに受精した卵または初期胚へ導入することにより対象哺乳動物へ挿入される外来核酸配列を意味する。「外来核酸配列」なる用語は、実験操作により動物のゲノムへと導入されるあらゆる核酸配列を意味し、導入された遺伝子が天然に生じる遺伝子に対していくつかの変更(例えば、免疫活性エピトープタグ、ポイント変異、選択可能なマーカー遺伝子の存在、loxP部位の存在など)を含む限り、その哺乳動物中に見出される核酸配列を含んでよい。
【0039】
「ターゲッティング構築物」なる用語は、変更(例えば、免疫反応性のエピトープタグ、挿入変異、ストップコドン変異、選択可能なマーカー遺伝子の存在、loxP部位の存在など)、および変更に隣接する内在Kvβ1遺伝子に相同な配列を含むオリゴヌクレオチド配列を意味する。ターゲティング構築物は、一般に、宿主細胞へと構築物を導入することができるターゲティングベクター、例えば、プラスミドにライゲートする。相同配列により、標的またはレシピエントの細胞(例えばES細胞)の染色体中の内在Kvβ1遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子への、ターゲティング構築物またはベクターの相同組換えが可能となる。ターゲティング構築物またはベクターは、1つ以上の変異を含んでよい。好ましくは、本発明のターゲティング構築物またはベクターは、ホモロジーの2つの領域が遺伝子変異に隣接し、その結果、ホモロジー領域間にあるターゲットされた遺伝子の部分の置換を生じる「置換型」である。これに対し、挿入型の構築物およびベクターは、ターゲットされた遺伝子と相同の1つの領域のみを有し、ターゲットされた遺伝子への、典型的にはカルボキシ−、またはアミノ−末端いずれかにおける隣接部分の挿入を生じる。挿入型の構築物またはベクターを本発明に用いる場合、相同領域はKvβ1.1遺伝子のアミノ末端への挿入をターゲットしなければならない。本明細書中に示すように、相同組換えにより、構築物およびベクターをターゲットして、Kvβ1の不活性化ドメインを破壊し、N型の不活性化を不可能とするインテグレーションが可能となる。
【0040】
本明細書中に用いるように、「選択可能なマーカー」なる用語は、選択可能なマーカーを発現する細胞において抗生物質または薬物に対する耐性を付与する酵素活性をコードする遺伝子を意味する。本発明の選択可能なマーカーは、好ましくは「ポジティブ」であり、ポジティブな選択可能なマーカーは、典型的には、ドミナントな選択可能なマーカー、即ち、哺乳動物細胞または細胞株(ES細胞を含む)に存在する場合はいつも検出することができる酵素活性をコードする遺伝子である。
【0041】
本明細書中に用いられるように、その種々の文法形態(例えば、「調節された」、「調節」、「調節している」など)において、「調節活性」なる用語は、正常なタンパク質活性(例えば、野生型Kvβ1.1活性)の刺激、強化、阻害、および/または緩解が含まれる。該用語は、タンパク質の発現レベルのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションは包含しない。
【0042】
WT、KI、またはKOサブユニットに関連して用いられる「活性」なる用語は、その標準的な機能を行う特定のサブユニットの能力を意味し、即ち、標準的なWTサブユニット活性は、Kv1ファミリーαサブユニットとの会合およびカリウムチャネルの不活性化の両方であり、標準的なKIサブユニット活性は、典型的にはKv1ファミリーαサブユニットと会合するが、チャネルは不活性化せず、および標準的なKOサブユニット活性は、完全にカリウムチャネルを会合または不活性化することができない。「活性における検出可能な変化」、または「活性の変化を検出する」は、それゆえ、以下に記載する結合アッセイおよび機能アッセイにより測定されるような、特定のサブユニットの標準的な機能からの逸脱である。本発明の結合アッセイは、典型的には、結合およびそれゆえ活性の変化を検出するための放射能標識を用い、機能アッセイは、行動または生理学における統計学的に有意な逸脱を用いて、サブユニット活性における変化を検出する。
【0043】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」なる用語は本明細書中交換して用いられ、2つまたはそれ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似物、またはペプチドミメティクスのポリマーを意味する。サブユニットは、ペプチド結合または他の結合、例えば、エステル、エーテルなどにより結合してよい。本明細書中に用いられるように、「アミノ酸」なる用語は、グリシンおよび両DまたはL光学異性体、およびアミノ酸類似体、およびペプチドミメティクスを含む、天然および/または非天然いずれかまたは合成アミノ酸を含む。3つまたはそれ以上のアミノ酸のペプチドは、一般に、オリゴペプチドと呼ばれる。3つ以上またはそれ以上のアミノ酸のペプチド鎖は、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【0044】
本明細書中に用いられるように、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」なる用語は、交換して用いられ、あらゆる長さの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドいずれかのヌクレオチドまたはその類似体のポリマー形態を含む。ポリヌクレオチドは、いずれかの三次元構造を持ち、公知または未知のいずれかの機能をなし得る。以下は、ポリヌクレオチドの無制限の例である:遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれかの配列の単離DNA、いずれかの配列の単離RNA、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの変更されたヌクレオチドを含んでよい。もし存在するはらば、ヌクレオチド構造の変更は、ポリマーの重合の前後に為されてよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断されてよい。ポリヌクレオチドは、ポリマー化後に、標識成分との結合によりさらに変更されてよい。該用語には、二本鎖および一本鎖分子の両方がさらに含まれる。他が特定または必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本発明のあらゆる態様は、二本鎖形態、および二本鎖形態を作ることが公知または予測される、2つの相補的な一本鎖形態のそれぞれを包含する。
【0045】
「抗体」には、抗原上に存在するエピトープと結合することができる免疫グロブリンが含まれる。本明細書中で用いるように、該用語は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体などの完全な免疫グロブリン分子のみならず、所望の特異性の抗原認識部位を含む抗−イディオタイプ抗体、変異体、フラグメント、融合タンパク質、二特異性抗体、ヒト化タンパク質、およびその変更を包含する。
【0046】
本明細書中に用いるように、「結合パートナー」または「捕捉剤」または「結合対」のメンバーなる用語は、他の分子に特異的に結合して、抗体−抗原、レクチン−カルボヒドレート、核酸−核酸、ビオチン−アビジンなどの結合複合体を形成する分子を意味する。
【0047】
本明細書中に用いるように、生物分子(例えば、小分子、タンパク質、核酸、抗体など)に関して「結合する」または「特異的に結合する」なる用語は、分子の異種集団(例えば、タンパク質および他の生物分子)における生物分子の存在を決定する結合反応を意味する。つまり、指定の条件下に(例えば、抗体の場合、免疫アッセイ条件、または核酸の場合、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件)、特異的リガンドまたは抗体は、その特定の「ターゲット」分子に結合し、サンプル中に存在する他の分子には有意量では結合しない。
【0048】
試験化合物が変異したKvβ1.1サブユニットの活性を擬似する試験化合物の能力に関して用いる場合の「ミミック」または「擬似」なる用語は、変異Kvβ1.1遺伝子を発現している哺乳動物、即ち、KIまたはKO変異体において観察されるものと実質上同様の効果(例えば、行動、電気生理学的、生化学的)を生じる化合物の能力を意味する。
【0049】
「試験化合物」なる用語は、本明細書中に記載するアッセイの1つまたはそれ以上においてスクリーンされるべき物質を意味する。該物質は、実質上、いずれかの化学化合物である。それは、単一の単離化合物として存在し得、または化学(例えば、コンビナトリアル)ライブラリーのメンバーであり得る。最も好ましい具体例において、試験化合物は、小分子である。
【0050】
「小分子」なる用語は、医薬に一般に用いられる有機分子に匹敵するサイズの分子を意味する。該用語は、生物学的巨大分子(例えば、タンパク質、核酸など)は除外するが、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、またはその組み合わせを含む。好ましい小分子は、約5000Daまで、より好ましくは2000Daまで、および最も好ましくは約1000Daまでのサイズの範囲である。加えて、小分子は、多くの化学クラスを含んでよいが、好ましくは、タンパク質相互作用が可能な官能基を有する有機分子、アミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボニル基である。典型的な小分子化合物には、1つまたはそれ以上の前記の官能基で置換された、環式炭素または複素環構造および/または芳香族または多芳香族構造が含まれる。
【0051】
本明細書中に用いるように、「試験サンプル」なる用語は、制限するものではないが、細胞サンプル、組織サンプル、および/または全動物を含む、本発明のアッセイに適したあらゆるサンプルを意味する。好ましくは、試験サンプルは、生物体または生物体の成分(例えば、細胞、組織、体液)から得られる生物学的サンプルである。
本発明の種々の態様を、以下のサブセクションにおいて、さらに詳細に記載する。以下のサブセクションにより、本発明をさらに詳細に以下に記載する。サブセクションの使用は、本発明を制限するものではなく、サブセクションは、本発明のあらゆる態様に適用してよい。
【0052】
1.トランスジェニックKvβ1.1ノック−イン哺乳動物の作製
A.ターゲッティング構築物の設計
本発明のノック−イントランスジーンは、好ましくは、Kvβ1.1遺伝子の一部のみ、詳細には、K+チャネルの速不活性化を可能とするアミノ末端における「ボール」ドメインを不活性化する外来DNA配列を含む。変異は、内在Kvβ1.1遺伝子へと置換または挿入される置換変異、挿入変異、フレームシフト変異、またはストップコドン変異であってよい。そのようなトランスジーンは、機能的に破壊されるべき内在Kvβ1.1遺伝子のいくつかの部分と同一である少なくとも1つのDNA配列を、好ましくは含む。Kvβ1.1対立遺伝子のコドン1−70(配列番号1)の全部または部分における変異の存在により、不活性化ドメインの発現が機能的に破壊される(図1Aを参照されたい)。
【0053】
好ましくは、変異により、転写または翻訳の開始の干渉によるか、またはKvβ1.1タンパク質の不活性化ドメインの転写または翻訳のプレマチュアな終結によるかのいずれかにより、機能的破壊を生じる。より好ましくは、トランスジーンは置換型変異であるが、これは、それらが内在Kvβ1.1遺伝子において構築物の安定性を増し、そして第2の組換えおよび転換の見込みを減らすからである。
【0054】
好ましい具体例において、トランスジーンを作製するために用いる核酸構築物(「ターゲッティング構築物」)は、免疫反応性エピトープタグおよび/または選択可能なマーカーをコードしている発現カセットの、Kvβ1.1遺伝子産物をコードしているDNA配列へのライゲーションにより作製される。ターゲッティング構築物は、内在Kvβ1.1遺伝子の少なくとも一部に相同な発現カセットに隣接している少なくとも一つの配列部分をさらに含む。アミノ末端に隣接する相同配列の存在により、Kvβ1.1遺伝子の不活性化ドメインの挿入変異が可能となる。最も好ましい具体例においてはしかし、ターゲティング構築物は、内在Kvβ1.1に相同な一対の配列が隣接する免疫反応性のエピトープタグおよび選択可能なマーカーの両方を含む(実施例1を参照されたい)。一対の配列は、コドン1−70をコードする内在Kvβ1.1配列、チャネルの不活性化に必要とされる不活性化ドメインに、好ましくは相同である。
【0055】
別法として、カセットを、カセットの切り出しにより、非機能性の転換を生じるフレームシフト変異を誘導するような位置に、さらに挿入する。さらに別の具体例においては、カセットにより、転写または翻訳をプレマチュアに終結させるためのストップコドンを提供してよい。これらの別の態様を用いて、本発明のトランスジェニック哺乳動物を開発することが可能であるが、これらの方法による内在配列への統合の成功の検出には、サザンハイブリダイゼーションおよびPCR分析を拡張使用することが必要である。それゆえ、ノック−インKvβ1サブユニットをトラッキングおよび単離するのを容易にする免疫反応エピトープタグを組み込むことが好ましい。
【0056】
免疫反応性のエピトープ-タグをターゲティング構築物に融合して、抗−タグ抗体が選択的に結合することができるエピトープタグを提供してよい。エピトープタグは、Kvβ1.1遺伝子のコドン1−70、およびより好ましくはコドン1−36に対応するターゲティング構築物のアミノ末端に好ましくは挿入する。転写および翻訳後、ノック−インKvβ1サブユニットにおけるそのようなエピトープタグ形態の存在は、タグサブユニットに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供により、Kvβ1サブユニットを、エピトープタグに結合する抗−タグ抗体または他のタイプのアフィニティマトリックスを用いるアフィニティ精製により、容易に精製することが可能となる。別法として、ターゲッティング構築物を、免疫グロブリン、または免疫グロブリンの特定の領域、IgG分子のFc領域などをコードしている核酸配列と融合して、外来エピトープタグへの特異的結合を可能としてよい。
【0057】
種々のエピトープタグおよびそのそれぞれの抗体は、当該分野で周知である。例には、ポリ−ヒスチジン(poly-his)またはポリ−ヒスチジン−グリシン(poly-his-gly)タグ;flu HAタグポリペプチドおよびその抗体12CA5;c-mycタグ、およびそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7、および9E10抗体;および単疱ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)タグおよびその抗体が含まれる。他のエピトープタグには、Flag−ペプチド、KT3エピトープペプチド、チューブリンエピトープペプチド;およびT7遺伝子10タンパク質ペプチドタグが含まれる。
【0058】
好ましい「ポジティブな」選択可能マーカーには、哺乳動物における薬物G418に対する耐性を付与する細菌アミノグリコシド3’ホスホトランスフェラーゼ遺伝子(「neo」)、抗生物質ヒグロマイシンに対する耐性を付与する細菌ヒグロマイシンGホスホトランスフェラーゼ遺伝子(hyg)、マイコフェノール酸の存在下に増殖する能力を付与する細菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(gpt遺伝子とも呼ばれる)ならびにhprt遺伝子、nDtII遺伝子、または、アミノ酸またはヌクレオシド相同物に対する抵抗性を付与する他の遺伝子、または抗生物質などが含まれる。トランスジーン(例えば、neoR)におけるポジティブな選択可能なマーカーをコードしているDNAは、一般に、ES細胞におけるその独立の転写を可能とする発現調節配列に作動可能に連結する。さらに、適当な選択培地中で増殖させた場合に細胞に対して発現が細胞毒性であるところの酵素活性をコードする「ネガティブ」な選択可能なマーカーをさらに用いてよい。例えば、HSV−tk遺伝子をネガティブな選択可能なマーカーとして用いる。ガンシクロビアまたはアシクロビアの存在下で増殖した細胞におけるHSV−tk遺伝子の発現は、細胞毒性である;つまり、ガンシクロビアまたはアシクロビアを含んでいる選択培地中での細胞の増殖により、機能性HSV−TK酵素を発現することができる細胞に対して選択する。ポジティブおよびネガティブな選択可能なマーカーの両方を用いる例において、活性HPRT酵素を発現する細胞は、所定のヌクレオシド類似体(6−チオグアニン、8−アザプリン、など)の存在下に増殖することができないが、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン)を追加した培地中で増殖することができる。逆に、活性HPRT酵素を発現できない細胞は、HATGを含む培地中で増殖できないが、6−チオグアニンなどの類似体に対して耐性である。
【0059】
B.相同組換え
好ましくは、本発明は、特定のDNA配列(トランスジーン)の、哺乳動物細胞の天然に生じるKvβ1.1配列への統合のコントロール部位へ相同組換えを利用し、およびそれによりその遺伝子の正常な機能を破壊する。相同組換えは、当該分野において周知である。該して、相同組換えは、有糸分裂中に起こる天然のプロセスであって、それにより、同一または実質上類似する(即ち「相同の」)配列を有する2つの核酸分子が、相同配列に隣接する、またはその間のDNA配列を本質的に「スイッチし」、その結果、分子に最初に存在するそれぞれの1領域が他の分子の領域へと、ライゲートされる。
【0060】
相同組換えの方法を操作して、当該分野の専門家に周知の方法により、特定の遺伝子をターゲットすることができる。ほとんどの方法は、ポジティブまたはネガティブいずれか、またはその両方の選択可能なマーカーを利用して、形質転換された細胞を同定および単離する。さらに、トリメチルソラレンまたはUV光などの刺激剤を用いることにより、DNA分子間の組換えの頻度を増すことができる。
【0061】
好ましい具体例において、ターゲティング構築物は、免疫反応性エピトープタグおよび/または選択可能なマーカーを含む発現カセットを含み、発現カセットには、内在Kvβ1.1遺伝子の部分に相同な少なくとも1つの配列が隣接する。好ましくは、内在Kvβ1遺伝子のターゲットされる領域(即ち、コドン1−70、特に1−36をコードしている不活性化ドメイン)の全部または一部に対応する核酸配列へと免疫反応性エピトープがライゲートするように、ターゲティング構築物を設計する。免疫反応性エピトープタグにより、ウェスタンブロットまたは免疫アッセイによるさらなる同定および単離が可能となる。別法として、または免疫反応性のエピトープタグに加えて、neoなどのポジティブな選択可能なマーカーを、カセットの発現により抗生物質耐性が得られる(neoにより抗生物質G418に対する耐性が提供される)ように、内在Kvβ1の不活性化ドメインに対応する配列へと、またはその付近へと挿入してよい。最も好ましい具体例において、発現カセットは、免疫反応性のエピトープタグおよび選択可能なマーカーの両方を含む。さらに、ターゲティング構築物は、発現カセットの両サイドに隣接し、そのアミノ末端にて内在Kvβ1.1の部分に対して相同である第1および第2の配列の対をさらに含む。
【0062】
内在遺伝子のこれらの第1および第2相同配列は、ES細胞における特定のKvβ1対立遺伝子に対してトランスジーンを標的する。相同組換えによるターゲティングの好ましい例において、相同配列間に存在する核酸領域が、ES細胞の1つの対立遺伝子におけるターゲットされた外来遺伝子へと特異的に統合するか、またはその部分を置換する。その結果、ターゲットされたKvβ1対立遺伝子の1コピーがトランスジーンでの相同組換えにより破壊される。その後のG418での選択により、相同組換えによりゲノムへと統合されたトランスジーンを含んでいるトランスフェクトされたES細胞を選択する。さらに、コードされるKvβ1サブユニットへ挿入されるトランスジーンの検出を、免疫活性エピトープタグに対する抗体を用いるアフィニティ結合により行ってよい。
【0063】
本発明の最も好ましい具体例において、トランスジェニック動物の細胞へ導入され、そして発現される抗生物質耐性遺伝子を有することが望ましく、即ち、抗生物質耐性遺伝子は、隣接する遺伝子、またはターゲットされた遺伝子において、離れた部分においてさえ、有害な効果、「隣接効果」を有し得る。それゆえ、最も好ましい具体例においては、一度構築物がKvβ1.1遺伝子との相同組換えを被ったならば、抗生物質耐性遺伝子が切り出されることを可能とする、1またはそれ以上の耐性遺伝子をノックイン構築物に含める。
【0064】
この最も好ましい具体例では、抗生物質耐性選択可能マーカーには、LoxP部位などの繰り返し組換え部位が隣接する。ゲノムDNAにおける、loxPなどの直接的な繰り返しの存在により、Cre−リコンビナーゼなどのリコンビナーゼタンパク質が介入しているDNA(neo遺伝子)を切り出し、ターゲットされた位置において単一のLox部位のみを残すことが可能となる。このLoxP部位の存在は、あるとしても、めったに発現に影響を及ぼさない。この具体例において、選択可能なマーカーをイントロンへと挿入し、ターゲッティング構築物の内在遺伝子への統合の成功を同定するためにのみ用いる。一度トランスフェクトされたら、Cre−リコンビナーゼは、ES細胞またはトランスジェニックマウスの特定の組織において発現され、neoマーカーを効果的に除去することができる。Westphal et al. Proc Natl Acad Sci(1996) 93:5860。
【0065】
前記のごとく、Kvβ1不活性化ドメインの変異は、実施例1に示すように、エキソン1.1の部分、最も好ましくはコドン1−36、および特に1−15に変異を作製することにより為されてよい。コドン7におけるシステイン残基の、セリン残基以外のいずれかの他のコドン(ミスセンス、ストップコドンなど)への変換により、不活性化ドメインが破壊される。変異は、内在エキソン1.1配列の部分に、免疫反応性のエピトープタグ、選択可能なマーカー、ストップコドンのいずれかを置換する、または挿入することにより、または別法として、フレームシフト変異を起すことにより、為されてよい。最も好ましい具体例では、しかし、免疫反応性のエピトープタグのみがアミノ末端を破壊し、最終的なターゲット遺伝子に残る。選択可能なマーカーは、形質転換後に切り出される。好ましくは、エピトープタグを細胞の両方の対立遺伝子中のKvβ1.1遺伝子の不活性化ドメインに統合するが、生じるそのような現象の頻度は低い(単一変異現象の頻度の二乗)。それゆえ、ヘテロ接合動物の交差交配を行って、両方の対立遺伝子におけるノック−インKvβ1.1を有するホモ接合体動物を作製してよい。
【0066】
好ましくは、DNA分子は二本鎖だが、一本鎖DNA分子を、本発明に用いてもよい。加えて、DNA分子を細胞に、DNAまたはRNAのいずれかとして導入してよく、これを次いでリバーストランスクリプターゼによりまたは他の手段によりDNAへ変換してよい。例として、本発明を実施するための最良の様式を、実施例1に示す。
【0067】
C.細胞の形質転換
本発明のノック−イン哺乳動物を作製するために、生殖細胞を含む胎児の全細胞タイプを生じることができる全能細胞、例えば胎児幹(「ES」)細胞へ、前記ターゲティング構築物を導入することにより、細胞を形質転換する。多くのES細胞を本発明に用いてよい。マウスからのES細胞が、ネズミ胚盤胞由来の細胞を培養することにより単離されている(Evans et al. (1981) Nature 292: 154-156; Bradley et al. (1984) Nature 309: 255-258; Gossler et al. (1986) Proc. Acad. Sci USA 83: 9065-9069; および Robertson et al. (1986) Nauter 322: 445-448)。好ましくはしかし、ES細胞の一次単離物を用いる。一次単離物は、CCE細胞株などの胎児から、またはそれ由来のES細胞のクローナル単離から直接得てよい(Schwartzberg et al. (1989) Science 212: 799-803)。一次単離物は、哺乳動物へ分化するのにより有効であり、および特に、クローナル選択されたES細胞は、CCE先祖細胞株よりもトランスジェニック動物を産生するのに約10倍、より有効である。クローンとして単離されたES細胞株のいくつかの例には、AB1(hprt+)およびAB2.1(hprt-)が含まれる。
【0068】
好ましくは、ES細胞を一次胎児G418R繊維芽細胞および/またはSTO細胞などの間質細胞にて培養する。繊維芽細胞および/または間質細胞は、異常なES細胞のクローナル過剰増殖を妨げる。最も好ましくは、細胞を分化阻害因子(「DIF」)、白血球阻害因子(「LIF」)などの存在下に培養し、プレマチュアな分化を防ぐ。他の公知のDIFには、オンコスタチン エム(Oncostatin M)、可溶性IL−6レセプターを有するインターロイキン(IL−6)、および毛様体神経組織栄養因子(CNTF)、T−LIF(米国特許第5,849,991号)、および所定のサイトカインが含まれる。さらに、発現可能なDIFで間質細胞を形質転換することができ、この際、ES細胞を次いで培養してよい。
【0069】
哺乳動物宿主および宿主細胞へ外来核酸を導入する方法は当該分野で周知であり、および宿主細胞によって変化する。方法には、エレクトロポーレーション、DEAE−デキストラン−媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム共沈、プロトプラストまたはスフェロプラスト融合、リポフェクション、マイクロ−インフェクションまたはウイルス感染が含まれる。トランスフェクトES細胞を次いで、胚盤胞段階胎児における割腔へと導入し、トランスジェニック哺乳動物の生殖株へ貢献することができる。
【0070】
加えて、ES細胞の割腔への導入前に、前記のような種々の選択プロトコル(例えば、neo選択可能マーカー)を用いて、トランスジーンを導入したトランスフェクトES細胞を選択してよい。別法として、サザンハイブリダイゼーションまたはPCRを用いて、トランスジーンの統合を決定することができる。
【0071】
1.マイクロインジェクション
加えて、別法が、トランスジーンを含んでいるトランスジェニック哺乳動物の作製に関して当該分野で公知である。発生の種々の段階における胎児細胞を、対応している種々の方法に従い、用いることができる。接合体を用いる場合、マイクロ−インジェクションが、米国特許第4,873,191号に記載されているように好ましい方法であり、その内容は本明細書中、出典明示により組み込まれる。マウスにおいて、1−2ピコリットル(pl)のDNA溶液の注入を、雄の前核が、約20マイクロメートルの直径に達する場合になすことができる。さらに、最初の分裂の前に接合体を注入して、それにより、トランスジェニック動物の全体細胞および生殖細胞への構築物の導入を保証することが可能である(Brinstei, et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4438-4442)。生じたトランスジェニック哺乳動物は、将来の子孫へ外来DNAを伝達することができる。さらにこの具体例において、構築物を自己複製しているプラスミドまたはウイルスへとまず導入することは、必ずしも必要でない。
【0072】
2.レトロウイルストランスフェクション
他の具体例において、レトロウイルス感染を用いて、非−ヒト哺乳動物へトランスジーンを導入する。レトロウイルス感染の方法は、インビトロで胚盤胞段階へと培養された胎児を用い、感染のための割球をターゲットする(Jaenich (1976) Proc. Natl. Acad. Sci USA 73: 1260-1264)。酵素処理により、胚盤胞の透明帯を除去し、トランスジーンを有している複製欠損レトロウイルスによる感染を促す(Van der Putten, et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6248-6152)。トランスフェクト割球を次いで、ウイルス産生細胞の単層上にて培養する。加えて、ウイルスまたはウイルス−産生細胞を、割腔へと注入することができる(Jahner et al. (1982) Nature, 298: 623-628)。この具体例において、生じるトランスジェニック哺乳動物は、細胞のサブッセットのみがトランスジーンに組み込まれているので、トランスジーンに関してモザイクである。加えて、トランスジーンのレトロウイルス挿入は、ゲノムの異なる座にて生じ得、これは、子孫において分離する。この方法のわずかな変法においては、妊娠中期の胎児の子宮内レトロウイルス感染により生殖細胞へトランスジーンを導入し、それにより、トランスジーンのより包括的な感染を可能とする(Jahner et al. (1982) 既出)。
【0073】
3.ES細胞への電気穿孔法
最も好ましい具体例では、ターゲッティング構築物を含んでいるトランスジーンをES細胞へと、電気穿孔により導入する(Toneguzzo et al., (1988) 核酸 Res., 16: 5515-5532; Quillet et al. (1988) J. Immunol. 141: 17-20; Machy et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8027-8031)。細胞を次いで培養し、前記のようにトランスジーンを効果的に統合した細胞に関して選択する(例えば、G418培地におけるneo)。別法として、トランスジーンは放射能標識したヌクレオチドにより、またはPCR増幅法によるなど、選択可能なマーカー配列の発現を必要としない検出に関する他のアッセイにより検出してよい。
【0074】
4.他の非−ヒトトランスジェニック哺乳動物
マウスに加え、本発明に用いてよい多くの他の天然またはトランスジェニック哺乳動物が存在することが、当業者には理解される。ネズミモデルに関して同様、これらの動物の接合体またはES細胞を、トランスジーンを誘導するための胎児ターゲットとして用いてよい。各場合に、哺乳動物に特徴的な所望の欠損Kvβサブユニット表現型を有するトランスジェニック非−ヒト哺乳動物が形成される。
【0075】
マイクロインジェクションによるトランスジェニック哺乳動物の開発が、マウスにおいて最もよく行われている一方で、ウサギ、ヒツジ、ウシ、およびブタを含む接合体のマイクロ注入により他のトランスジェニック哺乳動物を作製することが可能である(Jaenisch (1988) Science 240: 1468-1474; Hammer et al. (1986) J. Anima1. Sci, 63: 269; Hammer et al. (1985) Nature 315: 680; Wagner et al. (1984) 動物繁殖学(Theriogenology) 21: 29)。最も好ましくはしかし、本発明のトランスジェニック哺乳動物は、約10−30%のマイクロインジェクション成功率を有するマウスまたはラットである。加えて、他の非−ヒト哺乳動物ES細胞を用いるレトロウイルス媒介法または電気穿孔法も用いてよい。ES細胞株のマウスおよびブタのための誘導は、当該分野で報告されている(Robertson, 胎児由来の幹細胞系統(Embryo-Derived Stem Cell Lines), In: 悪性奇形腫および胎児幹細胞(Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells): 実際的なアプローチ(A Practical Approach) (E. J. Robertson, ed.), IRL Press, Oxford (1987); PCT公開第WO/90/03432; PCT公開第94/26884)。加えて、ES細胞株は、齧歯動物、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、魚、ブタ、ウシ、霊長類、およびヒトなどの哺乳動物由来またはそれから単離された細胞が好ましいが、あらゆる種(例えば、ニワトリなど)から誘導または単離してよい。本発明の最も好ましい具体例において、ネズミのES細胞を用いる。
【0076】
当該分野で周知のように、他の非−ヒト哺乳動物のKvβ1.1対立変種の形質転換には、これらの種に関するKvβ1.1遺伝子配列が必要である。ネズミのKvβ1.1遺伝子配列は、Genbankに受託番号第AF033003として寄託されており、一方、ラットのKvβ1.1配列は、Genbankに受託番号第X70662として寄託されている。他の非−ヒト哺乳動物におけるKvβ1.1遺伝子の構造および機能は当該分野で周知であり、公に入手可能である。さらに、所定の種に関する所望のKvβ1.1配列は、公知のKvβ1.1配列からのプローブを用いることにより、ハイブリダイゼーションまたは当該分野で周知の他のこのような方法により、容易に得ることができる。ターゲット哺乳動物のゲノムライブラリーは、適当なプローブ、および常套法により配列決定される遺伝子の残る部分との低ストリンジェンシーを用いてスクリーニングしてよい(例えば、サザンブロット)。
【0077】
一度、所望の種に関するターゲットKvβ1.1配列が得られたら、ターゲット構築物を前記のごとく(種々の置換変異、挿入変異、ストップコドン変異、またはフレーム−シフト変異)設計して、Kvβ1.1のボールドメインの不活性化を引き起こすことができる。次いで、前記および以下の実施例1に記載する方法を用いて、当業者は、ターゲッティングベクターを種のES細胞または接合体へ導入し、それにより本発明のトランスジェニック哺乳動物を作製し得る。
【0078】
II.インビトロ結合アッセイ
A.前スクリーニングアッセイ
本発明の一つの具体例において、ノック−インKvβ1.1サブユニット(不活性化ドメインの置換、挿入、ストップコドンまたはフレームシフト変異を組み込む)は、Kvβ1.1サブユニットの活性を調節する能力に関して試験化合物を前スクリーニングするのに有用である。これらの具体例において、ノック−インKvβ1.1サブユニットは、正常のKvβ1.1サブユニットの特定の機能、即ち、Kv1ファミリーαサブユニットと会合するか、またはカリウムチャネルを不活性化するか、いずれかのKvβ1.1サブユニットの能力を干渉する化合物を同定するのに、特に有用である。1つの前スクリーニング態様において、試験化合物をノック−インKvβ1.1サブユニットと接触させ、次いで、ノック−インKvβ1.1サブユニットの能力に検出可能な変化を提供することができる試験化合物を選択する。最も好ましくは、検出可能な変化は、ノック−インKvβ1.1サブユニットに対する試験化合物の結合の検出である。加えて、免疫アッセイを用いて、ノック−インKvβ1.1サブユニットがKv一ファミリーαサブユニットと会合するかどうか、または試験化合物の1つが会合を妨げるかどうかを決定してよい。この具体例において、結合アッセイを用いて、Kvβ1.1に対する結合においてKv1ファミリーαサブユニットに勝る選択性を有する試験化合物またはその逆の化合物を、前スクリーニングすることができる。
【0079】
別法として、比較手段において結合アッセイを用いて、試験化合物を、野生型(「WT」)Kvβ1.1サブユニットに結合するが、変異ノック−イン(「KI」)Kvβ1.1サブユニットには結合しないその能力に関して前スクリーニングし、それにより、チャネルの不活性化を阻害することにおける潜在的な候補物を同定する。これらの前スクリーニング結合アッセイのそれぞれを、更なる結合アッセイ、および以下に記載する複合機能アッセイを行う前に用いてよい。
【0080】
固定した、または固定していないターゲット結合タンパク質(KI、WT、KO Kvβ1.1、およびKv1α)を用いる結合アッセイが、当業者に周知であり、試験化合物をスクリーニングするのに用いてよい。精製細胞に基くまたはタンパク質に基く(細胞フリーの)スクリーニングアッセイを用いて、そのような化合物を同定してよい。例えば、変異Kvβ1.1(KI)サブユニットを精製形態にてキャリアにて固定してよく、変異Kvβ1.1サブユニットに対する結合を、潜在的な阻害化合物の存在および不在下に測定してよく、競合結合アッセイを、Kv1ファミリーαサブユニットの存在下に測定してよい。逆に、Kv1ファミリーαサブユニットをキャリアに固定してよく、および試験化合物を変異KIKvβ1.1の存在下に供してよい。
【0081】
インビトロ結合アッセイを、種々の有用な競合分析のために操作して、Kvβ1.1サブユニット活性のさらなるモジュレーターを明らかにし得る。1つの好ましい比較法において、精製野生型Kvβ1.1サブユニット(「WT」)をキャリアに固定してよく、WTKvβ1.1に対する結合を試験化合物の存在および不在下に測定し、次いで同様に精製形態にてキャリア上に固定し、試験化合物との接触に供したノック−インKvβ1.1と比較してよい。WTおよびKIKvβ1.1サブユニットの両方が同じ試験サンプル中に存在していてよく、または別法として、別の試験サンプル中に存在していてよい。この具体例は、KIKvβ1.1サブユニットの活性を擬似することができる化合物を同定するのに有用であり得る。WTへは有効に結合するが、KIには結合しない試験化合物を次いでさらなる結合アッセイ、ついで以下に記載するような機能アッセイに、不安疾患に関する潜在的な治療剤としての使用のために供してよい。KOサブユニットは、さらにWTおよびKIゲノタイプに対するコントロールとして用いてもよい。適当な結合アッセイは、別に、WT、KI、またはKOKvβ1.1サブユニットの精製ポリペプチド形態を用いてよく、または前記ゲノタイプにそれぞれを発現していることにより特徴づけられる細胞を用いてよい。
最も好ましくは、大量の試験化合物を同時にスクリーニングし得、対象のWT、KI、またはKOKvβ1サブユニットとの結合活性に関して互いに評価し得る前スクリーニングアッセイを設計してよい。
【0082】
B.高処理量スクリーニング
好ましくは、本発明の前スクリーニングアッセイは、「高処理量」様相に従う。伝統的な研究法は、いくつかの所望の特性(調節性、阻害性、など)を有する「リード化合物」の研究、リード化合物を修正して変種を作製すること、および変種の効能を評価することを含む。他方、高処理量スクリーニングにより、より迅速な薬物開発が可能となり、試験化合物を作製するための好ましい方法となる。
【0083】
1つの好ましい具体例では、高処理量スクリーニング法には、所望の活性を潜在的に有する多数の試験化合物を含んでいるライブラリーを提供することを含む。そのような「コンビナトリアルケミカルライブラリー」を次いで、前記のごとく1またはそれ以上のアッセイにおいてスクリーニングして、所望の特徴的な活性を示すこれらのライブラリーメンバー(特に、化学種またはサブクラス)を同定する。同定される化合物を次いで常套の「リード化合物」として用いることができ、またはそれ自体、潜在的または実際の治療として用いることができる。
【0084】
1.潜在的なKvβ1.1モジュレーターのためのコンビナトリアルケミカルライブラリー
コンビナトリアルケミカルライブラリーは、試薬などの多くのケミカル「ビルディングブロック」を組み合わせることによる化学合成または生物学的合成のいずれかにより作製される、種々の化学化合物のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリーなどの鎖状コンビナトリアルケミカルライブラリーを、所定の化合物の長さ(即ち、ポリペプチド化合物のアミノ酸の数)に関してそれぞれ可能な方法にて、アミノ酸と呼ばれるケミカルビルディングブロックのセットを組み合わせることにより作製する。数百万の化学化合物を、ケミカルビルディングブロックのそのようなコンビナトリアル混合により合成することができる。好ましくは、ライブラリーを、候補の小分子に関してスクリーニングする。そのようなライブラリーの例には、空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー、またはデコンボリューション、「1−ビーズ1−化合物」法から、またはアフィニティクトマトグラフィー選択により作製される合成ライブラリーが含まれる。
【0085】
コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、周知である。例には、制限されるものではないが、ペプチドライブラリー(例えば、米国特許第5,010,175号を参照されたい。)が、含まれる。ペプチド合成は、本発明に関して用いることが想定され、および意図される唯一の手段である。ケミカルディバーシティライブラリーを作製するための他の化学物質を用いることもできる。そのような化学物質には、制限されるものではないが、ペプチド(PCT公開第91/19735号)、コードされるペプチド(PCT公開第93/20242号)、ランダムバイオ−オリゴマー(PCT公開第92/00091号)、ベンゾジアゼピン(米国特許第5,288,514号)、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー(Hobbs et al. (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913)、ビニロガスポリペプチド(Hagihara et al. (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568)、β−D−グルコーススキャホールディングを有する非ペプチダルペプチドミメティクス(Hirschmann et al. (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218)、小化合物ライブラリーの相同有機合成(Chen et al. (1994) J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661)、オリゴカルバメート(Cho et al. (1993) Science 261: 1303)、および/またはペプチジルホスホネート(Campbell et al. (1994) J. Org. Chem. 59: 658)が含まれる。一般には、Gordon et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1385)、核酸ライブラリー(例えば、Strategene Corp.を参照されたい)、ペプチド核酸ライブラリー(例えば、米国特許第5,539,083号を参照されたい)、抗体ライブラリー(例えば、Vaughn et al. (1996) Nature Biotechnology, 14(3): 309-314、およびPCT/US96/10287を参照されたい)、カルボヒドレートライブラリー(例えば、米国特許5,593,853号を参照されたい)、および小有機分子ライブラリー(例えば、ベンゾジアゼピン、Baum (1993) C&EN, Jan 18, page 33; イソプレノイド、米国特許第5,569,588号;チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第5,549,974号、ピロリジン、米国特許第5,525,735号および5,519,134号;モルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号;ベンゾジアゼピン、米国特許第5,288,514号など)が含まれる。
【0086】
コンビナトリアルライブラリーの調製のための装置は、市場入手可能である(例えば、357 MPS, 390 MPS, Advancet Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MAを参照されたい。)。
【0087】
多くの周知のロボットシステムが、液相ケミストリーのために開発されている。これらのシステムには、Takeda Chemical Industries, LTD (Osaka, Japan)により開発された自動合成装置などの自動ワークステーション、および化学者によりなされる手動合成操作を真似るロボットアームを用いる多くのロボットソシステム(Zymate II, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.; Orca, Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.)が含まれる。前記装置のいずれも、本発明を用いる使用に適する。前記のように作動することができる、これらの装置に対する変更物(存在する場合)の性質および器具は、関連する分野の当業者には、明らであろう。
【0088】
加えて、多くのコンビナトリアルライブラリー自体が市場入手可能である(例えば、ComGenex, Princeton, N. Y.; Asinex, Moscow, RU; Tripos, Inc., St. Louis, MO; ChemStar, Ltd., Moscow, RU; 3D Pharmaceuticals, Exton, PA; Martek Biosciences, Columbia, MD, etcを参照されたい。)。
【0089】
2.ケミカルライブラリーの高処理量アッセイ
前記のように、Kvβ1.1ポリペプチドの結合特異性および/または活性を調節する試験化合物に関する前スクリーニングアッセイを、好ましくは高処理量スクリーニングに用いる。より好ましくは、前−スクリーニングアッセイは、KvB1.1ポリペプチドの特徴的な活性の阻害を検出することができる。特定の核酸またはタンパク質産物の存在、不在、または定量に関する高処理量アッセイは、当業者に周知である。
【0090】
結合アッセイは同様に周知である。つまり、例えば、米国特許第5,559,410号は、タンパク質に関する高処理量スクリーニング法を開示し、米国特許第5,585,639号は、核酸の結合に関する高処理量スクリーニング法を開示するが、米国特許第5,576,220号および5,541,061号は、リガンド/抗体結合に関する高処理量のスクリーニング法を開示する。
【0091】
前-スクリーニングアッセイに用いるための高処理量スクリーニングシステムはすべて、市場入手可能である(例えば、Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc.Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA, etc.を参照されたい)。これらのシステムは、典型的には、全サンプルおよび試薬のピペッティング、液体ディスペンシング、時期を設定したインキュベーション、およびアッセイに適したディテクターにおけるマイクロプレートの最終的な記録を含む全操作を自動化する。これらの遠心分離システムにより、高処理量および迅速スタートアップ、ならびに高程度の融通性およびカストマイゼーションが提供される。それぞれの高処理量システムに関する詳細なプロトコルは、そのようなシステムの製造業者により提供される。つまり、例えば、Zymark Corpは、遺伝子の転写、リガンドの結合などの調節を検出するためのスクリーニングシステムを開示する技術的公報を提供する。
【0092】
C.試験化合物の効力を評価するためのアッセイ
一度、多くの試験化合物が同定されたら、インビトロ結合アッセイおよび機能アッセイを用いて、Kvβ1.1の活性を調節するためのそのような試験化合物の効力をさらに評価してよい。
インビトロ結合アッセイを用いて、比較評価のための試験化合物の結合能力を定量および測定してよい。Kvβ1.1サブユニットの会合における試験化合物の効力を評価することを指向する具体例において、第1の結合混合物を、ノック-インKvβ1.1サブユニット、またはそのフラグメント、およびKv1αサブユニットを合わせることにより形成し、次いで第1結合混合物における結合の量を測定する。第2の結合混合物を、ノック−インKvβ1.1サブユニット、Kv1αサブユニット、および試験化合物を合わせることにより作製してよく、次いで、第2の結合混合物中の結合の量を測定する。第1および第2の結合混合物中の結合の量を比較する。試験化合物は、第2の結合混合物との結合において、第1の結合混合物と比較して低下が認められる場合に、Kv1αサブユニットとKvβ1.1の会合を防ぐことができると考えられる。より好ましくは、アッセイにより、試験化合物がノック−インKvβ1サブユニットまたはそのフラグメントの結合活性を、好ましくは10%以上まで、より好ましくは約50%またはそれ以上まで低下させる程度を定量する。任意に、添加剤を添加して、そのβ1およびKv1αサブユニット、すなわち、β2サブユニットとの相互作用を試験してよい。結合混合物の形成および最適化は、当業者の水準内にある。そのような結合混合物を、結合を高めるまたは最適化させるのに必要なバッファーおよび塩と接触させてよく、さらなる対照アッセイを、本発明のスクリーニングアッセイに含めてよい。
【0093】
他方、野生型Kvβ1.1サブユニットおよびノック−インKvβ1.1サブユニットと試験化合物を接触させ、次いで野生型Kvβ1.1サブユニットにおいて変化を、およびノック−インKvβ1.1サブユニットの活性に変化のないことを検出することより、カリウムチャネルの不活性化を阻害するための試験化合物の能力を評価してよい。この後者の具体例において、有効な試験化合物により、WTKvβ1.1活性が、好ましくは10%以上、より好ましくは約50%以上まで低下する(一方で、KI活性およびKO活性は低下しない)。この後者の具体例において、野生型Kvβ1.1活性を、サブユニット結合能のファンクションとして測定し、一方、以下に記載する他の機能アッセイを、チャネルの不活性化を阻害することにおける試験化合物の効力を特異的に評価するのに用いてよい。これらの方法により、治療薬として適し得るKvβ1サブユニットに関して阻害活性を有する試験化合物を同定することができる。野生型およびノック−インKvβ1.1サブユニットを1の試験サンプル中に合わせてよく、または別法として、野生型Kvβ1.1が第1試験サンプル中に存在し、ノック−インKvβ1.1が第2試験サンプル中に存在するように提供してよい。さらに、試験サンプルは、細胞、組織、またはトランスジェニック哺乳動物を含んでよい。
【0094】
ウェスタンブロットおよび免疫アッセイなどの結合アッセイを用いて、存在するKvβ1ポリポリペプチドの量を決定してよい。Kvβ1サブユニットの検出および/または定量のための標準的な分析法には、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、高分散クロマトグラフィーなど、または種々の免疫学的方法、液体またはゲル沈降反応、免疫分散(シングルまたはダブル)、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、免疫蛍光アッセイ、ウェスタンブロッティングなどが含まれる。一つの好ましい具体例では、サブユニットKvβ1.1ポリペプチドは、当該分野で周知の電気泳動タンパク質分離(例えば、1−または2−次元電気泳動)において検出/定量される。ウェスタンブロット(免疫ブロット)分析を用いてKvβ1ポリペプチドの存在を検出および定量する場合、試験サンプル中のポリペプチドを分子量に基づくゲル電気泳動により分離し、適当な支持体(例えば、ニトロセルロースまたはナイロンフィルター)に移し、ポリペプチドをターゲットするのに特異的な抗体とサンプル中でインキュベートする。当該分野でよく知られるように、ターゲットポリペプチド(β1.1またはKv1αサブユニット)を、直接それ自体を標識するか、または標識された抗体(例えば、標識されたウサギの抗−マウス抗体)を用いて、その後、検出してよい。
【0095】
好ましい具体例において、免疫アッセイを用いてKvβ1サブユニットの存在を検出する。本明細書中に用いるように、免疫アッセイは、分析物(例えば、ターゲットポリペプチド)に特異的に結合する抗体を用いるアッセイである。免疫アッセイは、対象のKvβ1分析物を単離、標的、および定量するための他の物理学的または化学的特性の使用とは異なり、本発明のポリペプチドの抗体に対する特異的結合の検出により特徴付けられる。周知の多くの免疫学的結合アッセイのいずれか(例えば、米国特許第4,366,241号;4,376,110号;4,517,288号;および4,837,168号を参照されたい)が、本明細書中に記載するポリペプチドの検出または定量に十分に適する。免疫学的結合アッセイ(またはイムノアッセイ)は、分析物(対象WT、KI、またはKOKvβ1.1ポリペプチド)に特異的に結合し、またはしばしば分析物を固定する「捕捉剤」を、典型的に用いる。好ましい具体例において、捕捉剤は抗体である。最も好ましい具体例において、免疫アッセイを用いて、対象のKvβ1.1サブユニット(WT、KI、またはKO)がKv1αサブユニットと会合するかどうかを、以下の実施例1に記載するように決定する。
【0096】
該して、ターゲットサブユニット(WT、KI、KO、またはKv1α-)は、単離されたサンプル受容領域を有する不溶性支持体(例えば、マイクロタイタープレート、アレイ、ビーズ、膜など)に固定してよい。別法として、Kvβ1タンパク質を含んでいる細胞をアッセイに用いることができる。不溶性の支持体は、ターゲットサブユニットを結合し、次いで溶解性の物質から容易に分離できる、および他の点では、スクリーニングの全方法と適合し得る、いずれかの物質から作製されてよい。そのような支持体の表面は、固体、多孔性、またはいずれかの簡便な形であってよく、典型的には、ガラス、プラスチック(例えば、ポリスチレン)、ポリサッカライド、ナイロン、またはニトロセルロース、テフロン(登録商標)などであってよい。マイクロタイタープレートおよびアレイは、多数のアッセイを少量の試薬およびサンプルを用いて同時に行うことができるので、特に簡便である。ターゲットサブユニットを結合する特定の様式は、それが、本発明の試薬および全方法と適合可能であり、ターゲットサブユニットの活性を維持し、非拡散性である限り重要ではない。結合の好ましい方法には、抗体(タンパク質を支持体に結合する場合、リガンド結合部位または活性化配列のいずれかを配置的にはブロックしない)、「スティック」またはイオン性支持体への直接結合、化学的架橋、表面におけるタンパク質の合成または試薬などが含まれる。タンパク質または試薬の結合の後、過剰な非結合性物質を洗浄により除去する。サンプル受容領域を次いで、ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン、または他の無害のタンパク質または他の部分とのインキュベーションによりブロックしてよい。
【0097】
前記のように、好ましい具体例においては、ターゲットKvβ1(WT、KI、またはKO)タンパク質を支持体に結合し、次いで試験化合物をアッセイに添加する。別法として、試験化合物を支持体に結合し、Kvβ1タンパク質を添加する。治療剤として潜在的に重要な新規試験化合物には、ケミカルライブライリー、ペプチド類似物などのスクリーンにおいて同定される特異的抗体および非天然の結合試薬が含まれる。ヒトの細胞に対して低毒性を有する試薬に関するスクリーニングアッセイが、特に重要である。標識インビトロタンパク質−タンパク質結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合に関する免疫アッセイ、リン酸化アッセイなどを含む広範な種々のアッセイを用いて、試験化合物の効能を同定および評価してよい。
【0098】
Kvβ1タンパク質に対する試験化合物の結合の測定は、多くの方法により行ってよい。特定の具体例において、試験化合物を標識し、次いで結合を直接測定する。例えば、これは、Kvβ1タンパク質の全部または部分を支持体に結合させ、標識された候補試薬(例えば、蛍光標識)を添加し、過剰の試薬を洗浄し、次いで標識が固体支持体に存在するかどうかを測定することにより行ってよい。種々のブロッキングおよび洗浄ステップを、当該分野で公知のごとく、用いてよい。
【0099】
「標識された」は、本明細書中、化合物を、検出可能なシグナルを提供する分子または化合物、例えば、ラジオアイソトープ、蛍光剤、酵素、抗体、磁気粒子などの粒子、化学蛍光剤、ビオチンおよびストレプトアビジンなど、ディゴキシンおよび抗ディゴキシンなどで直接または間接的に標識することを意味する。特異的結合メンバーに関しては、相補的メンバーを、検出を提供する分子で、通常通り、公知の方法に従い標識する。標識は、直接または間接的に、検出可能なシグナルを提供することができる。最も好ましい具体例では、標識は、前記のような免疫反応性のエピトープタグである。
【0100】
いくつかの具体例においては、成分の1つのみを標識する。例えば、タンパク質(またはタンパク質性候補物質)を、チロシン部位にて、125Iまたはフルオロフォアを用いて標識してよい。別法として、1以上の成分を、異なる標識で、例えば、タンパク質のために125Iおよび候補物質のためにフルオロフォアを用いて標識してよい。
【0101】
好ましい具体例において、試験化合物の結合を、比較結合アッセイの使用により測定する。この具体例では、競争物質は、ターゲットKvβ1サブユニットに結合することが公知の結合部分であり、即ち、競争物質は、Kvα1.1サブユニットである。1の具体例において、試験化合物は標識する。試験化合物または競争物質のいずれかまたはその両方を、結合を可能とするのに十分な時間、タンパク質へまず添加する。インキュベーションは、β1およびα1.1の結合のために、最適の活性を促進するあらゆる温度、典型的には、4および37℃の間で行ってよい。インキュベーション期間は、最適の活性に関して選択するが、迅速な高処理量スクリーニングを促進するために最適化してよい。典型的には、10分〜1時間が十分である。過剰の試薬を一般に除去し、または洗浄する。第2の成分を次いで添加し、標識された成分の存在または不在を検出し、結合を示す。好ましい具体例では、競争物質(即ち、Kvα1.1)をまず添加し、次いで試験化合物を添加する。競争物質の置換が、試験化合物が対象のKvβ1タンパク質に結合していること、それゆえ、それに対して結合できること、および典型的には、対象のKvβ1タンパク質の活性を潜在的に調節していることの指標である。この具体例において、成分のいずれかを標識することができる。つまり、例えば、競争物質を標識する場合、洗浄溶液中の標識の存在は、試薬による置換を示す。別法として、試験化合物を標識する場合、支持体における標識の存在は置換を示す。
【0102】
別の具体例において、試験化合物をまず、インキュベーションおよび洗浄しながら添加し、次いで競争物質(即ち、Kvα1.1サブユニット)を添加する。競争物質による結合の不在は、試験化合物が高アフィニティでKvβ1タンパク質に結合することを示し得る。つまり、試験化合物を標識した場合、支持体植えの標識の存在は、競争物質の結合の欠如と合わせて、試験化合物がKvβタンパク質に結合できることを示す。
【0103】
1つの好ましい具体例において、方法は、対象Kvβ1サブユニットの活性を調節することができる試験化合物を評価するためのディファレンシャルスクリーニングを含む。この具体例において、方法は、試験化合物、Kvβ1タンパク質、および競争物質を含む。競争物質の結合を両サンプルに関して測定し、2つのサンプル間の結合の変化または違いが、Kvβ1タンパク質に結合することができる、および潜在的にその活性を調節することができる試験化合物の存在を示す。つまり、競争物質の結合が第1サンプルに対して第2サンプルにおいて異なる場合、試験化合物はKvβ1タンパク質に結合することができる。
【0104】
別法として、好ましい具体例は、WT Kvβ1タンパク質に結合するが、KIまたはKOKvβ1サブユニットには結合することができない、またはKIには結合することができるが、KOには結合することができない試験化合物の能力を評価するためのディファレンシャルスクリーニングを用いる。Kvβ1タンパク質の構造をモデル化してよく、合理的薬物設計に用いて、その部位と相互作用する試薬を合成する。Kvβ1活性に影響を及ぼす試験化合物を、タンパク質の活性を高めるか、または減じるかいずれかの能力に関して化合物をスクリーニングすることにより同定してもよい。
【0105】
完全に非機能性のKvβ1.1サブユニット(KO)などのポジティブ対照およびネガティブ対照を、アッセイに用いてよい。好ましくは、全対照および試験サンプルは少なくとも3組にて行い、統計学的に有意な結果を得る。全サンプルのインキュベーションは、タンパク質に対する試薬の結合に十分な時間である。インキュベーション後、全サンプルを、非特異的結合物質から洗浄除去し、結合した、一般に標識した試験化合物の量を測定する。例えば、放射能標識を用いる場合、サンプルを、シンチレーションカウンターにてカウントして、結合した化合物の量を決定してよい。
【0106】
種々の他の試薬をスクリーニングアッセイに含めてよい。これらには、最適のタンパク質‐タンパク質結合を促進し、および/または非特異的またはバックグラウンドの相互作用を低下させるのに用いられてよい塩、中性のタンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤などが含まれる。これ以外に、アッセイの効能を改善する試薬、例えば、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗‐微生物物質などを用いてよい。成分の混合物は、必要な結合を提供するあらゆる順序で添加してよい。
【0107】
本発明の所定の態様においては、方法は、疾患におけるKvβ1.1および/またはA型K+チャネルの活性を変化させる試験化合物をデータベースに入力すること/記録することをさらに含んでよい。
【0108】
前記免疫アッセイにおける使用のための抗体は、市場入手可能であり、または用意に調製することができる。抗‐Kvβ1.1抗体は、Veh et al. (1995) Eur. J. Neurosci. 7: 2189-2205によりすでに記載されている。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体(抗‐Kvβ1.1抗体)のいずれかを、本発明の免疫アッセイに用いてよい。当業者には、ポリクローナル抗体ならびにモノクローナル抗体の精製および/または濃縮のための免疫学の分野で一般的な種々の方法が理解されるであろう。例えば、Coligan, et al.(1991) Unit 9, 免疫学における現在のプロトコル(Current Protocols in Immunology), Wiley Interscienceを参照されたい。
【0109】
本発明の好ましい具体例において、免疫アッセイは、モノクローナル抗体(「mAb’s」)を用いる。モノクローナル抗体の調製に関しては、マウスまたはラットの免疫化が好ましい。本明細書中に用いる「抗体」なる用語は、完全な分子、ならびにエピトープ決定因子に結合することができるFabおよびF(ab’)2’、および/または一本鎖抗体(例えば、scFv)などのそのフラグメントが含まれる。mAbsを分泌しているハイブリドーマの産生のために用いられる一般的な方法は、周知である。mAb’sの間の特異性の確認は、比較的通常のスクリーニング法(酵素結合免疫吸着アッセイ、または「ELISA」、BiaCoreなど)を用いて行い、目的のmAbの結合特異性および/または親和性を測定することができる。
【0110】
加えて、抗体フラグメントおよびヒト抗体を産生することができる。一本鎖抗体(scFvまたは他)などの抗体フラグメントは、ファージディスプレイ法を用いて産生/選択することができる。ヒト抗体を、事前の免疫化を用いずに、ファージ上に巨大および種々のV−遺伝子レパートリーを示すことにより産生し、ハプテン、ポリサッカライド、セルフタンパク質、細胞表面抗原などに対する無数の抗体を含むライブラリーを作製することができる。
【0111】
III.機能アッセイ
1つの具体例では、本発明により、Kvβ1.1の活性およびそれゆえ、不安に関連するタスクにおけるパーフォーマンスを調節する物質をスクリーニングする方法が提供される。方法は、当該化合物の存在下でのKvβ1.1遺伝子産物(例えば、Kvβ1.1サブユニットタンパク質)の活性レベルを検出すること、および/またはKIまたはKO遺伝子産物などの対照に対する活性レベルを比較することを含む。特に、KIトランスジェニック哺乳動物をポジティブ対照として用いて、潜在的な不安緩解化合物を同定してよい。そのようなアプローチの例は、以下に記載する。
【0112】
A.行動アッセイ
1の具体例において、Kvβ1.1活性のモジュレーターを、試験認識能力、不安またはストレス反応に対する種々の行動アッセイを用いて、アッセイすることができる。そのようなアッセイには、試験化合物をWT、KI、またはKO哺乳動物に投与し、次いで哺乳動物の行動における試験化合物の効力を評価することが含まれる。好ましい行動アッセイは、認識、海馬関連タスクを測定する。そのようなアッセイには、制限されるものではないが、コンテクスチュアル条件付け(Kim and Fanselow (1992) Science, 256: 675; および Phillips and LeDoux Behav. Neurosci., 106: 274を参照されたい)、空間的学習(Morris et al. (1982) Nature, 297: 681を参照されたい)、ローターロッドアッセイ、条件付け味覚嫌悪、社会的認識、および食品の好みの社会伝達(Bunsey and Eichenbaum (1995), 海馬(Hippocampus), 5: 546)が含まれ、そのいくつかを以下の実施例に示す。不安を測定する好ましい行動アッセイには、高架ゼロ迷路、衝突アッセイ、および恐れを増す刺激アッセイが含まれる。
【0113】
特定の時点での行動は、哺乳動物の特定の生理学的状態(例えば、摂食管理、生殖情況、睡眠の量など)に依存し得るので、そのようなアッセイは、ポジティブおよびネガティブコントロールの両方を用いて好ましくは行う。ネガティブコントロールは、「試験」哺乳動物と同じ方法だが、試験化合物の投与を用いずに(または有意に低投与量の投与を用いて)処理された哺乳動物である。好ましい具体例において、ポジティブコントロールには、Kvβ1.1ノック‐イン変異を有する哺乳動物、最も好ましくはマウスが含まれる。KI Kvβ1.1哺乳動物の特徴的な行動に類似する不安の低下を誘導する試験化合物、または試験化合物の組み合わせが、Kvβ1.1活性を調節することができる物質である。
【0114】
B.生理学的アッセイ
1.ホルモンアッセイ
本発明の他の具体例では、ホルモンアッセイを用いて、ストレスに対する動物の反応を評価してよく、またはストレスを低下させることにおける試験化合物の効力を評価してよい。この具体例では、試験化合物を、コルチコステロンまたはc−fos活性化などのストレス関連性のホルモンインジケーターの呈示を試験することにより、効能に関してアッセイする。マウスの副腎からのコルチコステロンの分泌は、一般に、信頼できるストレスの内分泌ホールマークと考えられる。動物は、ストレスに対してこのホルモンを分泌し、血漿におけるコルチコステロン反応を、ストレスの発生後5分以内に検出することができる。この反応は、しばしば、低下した不安レベルを示す動物において、分泌の大きさまたは時間のいずれかが変化することが多い。動物は、典型的には、環境刺激により誘発される穏やかな形態のストレスに供する。足のショック、水泳の強制、および抑制が、齧歯動物において実施されている一般的な環境ストレスのいくつかである。
【0115】
このアッセイの1つの好ましい具体例において、KI、KO、およびWT哺乳動物を、環境ストレスに供し、そのストレス関連性のホルモンのレベルを、ストレス後の異なる時間間隔にて測定する。最も好ましくは、ホルモンは、血漿コルチコステロンであり、測定は、ストレス発生後、0、30、60、および90分の時間間隔にて行う。他の好ましい具体例では、c−fosの活性化は、インサイチュハイブリダイゼーションにより測定してよく、そのレベルを、以下の実施例8に示すように、ディジタル化および定量してよい。
【0116】
前記ホルモンアッセイをさらに、試験化合物を含めるべく変更してよい。最も好ましい具体例において、対象動物に試験化合物を投与し、試験化合物を代謝するのに十分な時間後、動物を環境ストレスに供する。ホルモンレベルの測定を次いで行い、動物が、WT、KI、またはKOKvβ1.1哺乳動物の特徴的な態様と一致するホルモンパターンを有するかどうかを測定する。最も好ましくは、WT哺乳動物における投与により、非処置のKI哺乳動物と一致するホルモンパターンを生じる試験化合物を探索する。以下の実施例5に記載するように、トランスジェニックKIマウスは、低下した不安パターンを示唆するコルチコステロンレベルを有する。
【0117】
2.高体温アッセイ
他のアッセイを用いて、ストレスに対する動物の反応を評価、およびストレスを低下させる試験化合物の能力を評価してよい。Borsini et al. (1989)およびVan der Heyden et al. (1997)のごとく、ストレス誘導性の高体温をWT、KI、およびKOマウスと合わせて用いて、その不安態様を評価することができる。Borsini et al. 精神薬理学(Psycholopharmacology) (1989) 98: 207-211およびVan Der Heyden. (1997) 生理学および行動(Physiology and Behavior) 62 : 463-470。動物を典型的に、穏やかな形態の環境ストレスに供し、典型的には、特徴のプローブを動物の温度を測定するために用いる。前記のホルモンレベルに関して同様、環境ストレスに対する動物の高体温の程度は、動物の不安の指標である。
【0118】
前記実施例6に示すように、KI、KO、およびWTトランスジェニック哺乳動物を環境ストレスに供し、高体温の程度を測定する。クロロジアゼポキシドのような不安緩解剤を、動物の反応が実際に、不安緩解反応に一致するかどうかを確認するための比較実験にさらに用いてよい。高体温アッセイをさらに、試験化合物の効力を評価するために変更してもよく、この場合、対象動物に試験化合物を投与し、試験化合物を代謝するのに十分な時間後、環境ストレスへと次いで供する。高体温の程度を次いで測定して、動物が、WT、KI、またはKOKvβ1.1哺乳動物の特徴的な特徴と一致する高体温のパターンを有するかどうかを決定する。最も好ましくは、試験化合物のWT哺乳動物への投与により、非処置のKI哺乳動物と一致する高体温のパターンが生じる。以下の実施例6に記載するように、ストレス誘導性の高体温は、クロロジアゼポキシドを用いて投与したWTマウスにおける同様の程度へとKIマウスにおいて平坦化され、それゆえ、低下した不安パターンおよび従って、不安緩解特性がさらに示唆される。
【0119】
3.電気‐生理学的アッセイ
Kvβ1.1活性は、当該分野で公知の種々の電気生理学的方法により容易に測定することができる。Gieseおよびその同業者による研究により説明されるように、Kvβ1.1活性のノックアウトにより、反復性の発火中のスパイクの拡張と海馬CA1ニューロンの緩慢な後過分極(sAHP)の低下の両方が生じる。つまり、WT、KI、またはKO動物に試験化合物を投与し、次いで、試験するか、またはその組織を試験して、その電気生理学的反応を比較することができる。最も好ましくは、海馬の電気生理学的記録をなし、より好ましくは海馬CA1ニューロンの記録をなす。そのような記録は、インビボで行うことができるが、好ましい具体例では、そのような記録は、海馬薄片調製物からなす。そのような調製物を作製する、またはそれらから記録する方法は、本明細書中に出典明示により組み込むPCT公開第WO00/24871号に示されるように、当業者に周知である。好ましくは、WT哺乳動物におけるその投与により、KI哺乳動物のものと一致する電気生理学的パターンを生じる試験化合物を探索する。
【0120】
加えて、異種A型K+チャネルは、異種発現系において発現させることができ、ノック‐インKvβ1.1および対応するKv1ファミリーαサブユニットを発現している細胞を、電気生理学的に測定することができる。好ましくは、細胞は、ノック−インKvβ1.1およびKv1αまたはそのそれぞれのRNAを含んでいるベクターで形質転換したツメガエル属卵母細胞またはHEK細胞である。これらの細胞を試験化合物と接触させ、次いで試験化合物のA型チャネル伝導における効果を、全細胞電圧クランプ、電流クランプにより、および/またはパッチクランプを用いて、測定および比較することができる。タンパク質発現および電気生理学的記録に関するこれらの方法は、当業者に全て周知である。
【0121】
4.ポジティブコントロールとしてのノック−インKvβ1.1哺乳動物
前記のごとく、本発明のKvβ1.1ノック−イン哺乳動物は、広範な種々のコンテクストにおいて、特にポジティブ不安コントロールとして有用である。不安などの高レベルの機能は、突発的な神経ネットワークの特性であり、それ自体、高度復元(例えば、シングルシナプス)モデルにおいて、アッセイすることができない。行動試験には、例えば、無傷の生きている哺乳動物が必要である。同様に、ネットワークに関連する特性(例えば、CA1活性パターン)には、機能性の神経ネットワークが必要である。
【0122】
つまり、潜在的なモジュレーター(例えば、試験化合物)のそのようなシステムにおける効果の評価が、ポジティブコントロールの使用により、大いに促進される。本文脈において、Kvβ1.1ノック−イン哺乳動物の行動により、試験化合物を用いて処置した「正常な」哺乳動物の行動を評価するための良好な参照物が提供される。ホルモンレベルまたは高体温などの他の生理学的な指標も、KI動物との比較により評価されてよい。同様に、試験化合物で処置した神経学的調製物のパーフォーマンス(例えば、海馬切片調製物の電気生理学的反応)を、Kvβ1.1ノック−イン哺乳動物から得た神経学的調製物のパーフォーマンスと比較して、試験化合物が、Kvβ1.1ダウン−レギュレーション擬似様式で電気生理学的反応を変化させる能力を評価することができる。
【0123】
KI変異体をさらに、早老または促進された脳の退化(アルツハイマー病に伴うことが見出されているものなど)を示す他のマウスモデルと交雑させて、Kvβ1.1ノック−インが、これらの哺乳動物モデルにおける関連する行動疾患を変更するかどうかを決定してもよい。
【0124】
IV.スクリーニングキット
1態様において、本発明により、本明細書中に記載するアッセイを行うためのキットが提供される。キットは、好ましくは、Kvβ1.1ノック−イン哺乳動物またはKvβ1.1ノック−イン哺乳動物由来の細胞または組織を含む。キットはさらに、本明細書中に記載するアッセイ法における使用のための適当なバッファーおよび他の溶液およびスタンダードを含むことができる。
加えて、キットは、本発明の方法の実施のための指示(すなわち、プロトコル)を含んでいる説明資料を含んでよい。説明資料は、典型的には、記載または印刷されたものを含むが、それらはそのようなものに制限されない。そのような指示を保存することができ、最終の使用者にそれらを伝達することができるあらゆる媒体が、本発明により意図される。そのような媒体には、制限されるものではないが、電気的貯蔵媒体(例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光学媒体(例えば、CD ROM)などが含まれる。そのような媒体は、そのような説明資料を提供するインターネットのサイトへのアドレスを含んでよい。
【0125】
実施例
以下の実施例を、他を詳細に記載する場合を除いて当業者に周知かつ常套の標準的な方法を用いて行う。以下の実施例は例としてのみ示し、いずれにせよ、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきでない。
【0126】
実施例1
速不活性化に必要なN末端を欠くKvβ1.1ノック−インマウスの作製
Kv1−ファミリーK+チャネルを不活性化する能力を欠くが、Kv1ファミリーα−サブユニットと会合し、それによりチャネル表面発現を高める能力は保持する変異体Kvβ1.1遺伝子を有する遺伝子変更マウスを開発した。Kvβ1遺伝子ノックアウトと異なり、ノック−インマウスはN型不活性化を付与する能力を除いて、Kvβ1.1の全機能特性を保持する。
【0127】
A.Kvβ1.1−ターゲットES細胞の作製
図1Aは、免疫反応性エピトープタグの導入の前の内在マウスKvβ1遺伝子構造およびエキソン組成を示す。3つのKvβ遺伝子(Kvβ1.1、1.2、および1.3)それぞれは、C末端にエキソンドメイン3−15を共通して持つが、別に、5’末端にてスプライシングされて、ユニークなN−末端タンパク質配列(エキソン1.1、1.2、および1.2)をコードする。図1Bに示すようなKvβ1.1ターゲッティング構築物を設計するために、ゲノミックBacクローンを、Genban受託番号No. X70662によりコードされるラットのKvβ1.1タンパク質のN末端の90個のアミノ酸をコードしているDNAフラグメント(Research Genetics, Bethesda, MD)を用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、129/SvEvマウスから単離した。Bacクローンをマップし、次いで7.2KbのBamHIフラグメントを単離した。Kvβ1.1タンパク質の始めの35個のアミノ酸をコードしているエキソン1.1aを含んでいる1.2KbのEcoRIフラグメントを、血液凝集素エピトープタグ(配列番号2)、PCR法をオーバーラップさせることによる3×HAと置き換え、チャネル不活性化に関して機能的に無効なタンパク質を生じた。LoxP配列が隣接するネオマイシン耐性カセットを、エキソン1.1aの下流のイントロン100bp内に、EcoRI部位にて挿入した。この変更EcoRIフラグメントを配列決定し、1.5KbのEcoRIおよび4.2RI/BamHIフラグメントとライゲートバックし、ターゲッティングベクターを作製した。
【0128】
R1胎児幹(ES)細胞(Nagy et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8424-8428)をBamH1−鎖状Kvβ1.1ターゲッティングベクターで電気穿孔した。細胞をG418により選択し、次いで200個のコロニーをサザンブロット分析のために突いた。以下に記載するゲノミックサザン分析により、相同組換えを被って、neoFloxPと共に3×HAタグを組み込む3クローンを得た。
【0129】
キメラマウスを、C57BI6マウス胚盤胞への注入により3×HAおよびneoFloxP対立遺伝子を有するESクローン#145および#191から作製した。各クローンからの80−90%のオス着色毛皮キメラを選択し、129/SvEv野生型雌とさらに交配し、129/SvEv地のF1ヘテロ接合体を得た。これらの子孫を交雑して、分析のためのF2ホモ接合体を得た。neoFloxPの重要なイントロン内における挿入により、KvB1遺伝子による転写が偶然的に抑制され、こうしてこの対立遺伝子を、Kvb1に関するノックアウトとする。動物のサブセットを5世代C57/bI6にて異系勾配した後、ホモ接合体合成のために血縁交配(sib-mated)させた。全実験は、他を示さない限り129/SvEv地またはN5−C57/bI6地の両方で行った。
【0130】
B.Kvβ1.1に関するN末端ヌル変異−(Kvβo)を有するノック−インマウスの誘導
雌のヘテロ接合体Kvβo−neoFloxPマウスからの前核を回収し、Cre−リコンビナーゼをコードしているプラスミドでマイクロインジェクトした。子宮内組換えを、子孫においてNeo−Floxカセットを切り出し、イントロン内にKvβ1.1のN末端の3×HA変異(Kvβo)およびLox−P配列のシングルコピーを残すことを目的として行った。擬似妊娠させた雌へのマイクロインジェクトした前核の卵管輸送後、新生子犬を、Creにより媒介されるneoFloxPカセットの切り出しの証拠に関して分析した。ゲノミックDNAのPCR分析により、3×HAタグを有するほぼ100%の子孫がインビボでの切り出しを被ったことが明らかとなった。
【0131】
C.ゲノミックサザンブロット分析
ESクローンからのゲノムDNAを、3時間37℃にてのプロテイナーゼK消化により調製した。イソプロパノール中での沈殿後、DNAをTEに再懸濁し、BamHIにて制限消化した。DNAフラグメントを0.8%のアガロースゲル上に溶解し、次いでナイロン膜へと一晩移した。ターゲット構築物の上流の300bpのBamHI/EcoRIフラグメントをP32dCTPにて放射能標識し、プローブとして用いた。3×HA配列内の内部BamHIの存在により、野生型Kvβ1対立遺伝子由来の7.2Kbの代わりに1.2KbにハイブリダイズしているバンドとしてターゲットされるES細胞の同定が可能となる。neoFloxPの存在を次いで、neo選択カセットに対して指向されるプローブ(TK−ネオマイシンミニジーン)を用いて確認した。図1Cにより、BamHI/EcoRiプローブにより、野生型Kvβ1対立遺伝子に関する〜7.2Kbのバンド、および3つのターゲットされたES細胞(191、145、51)に関する〜1.0Kbの追加のバンドが同定されたことが示される。
【0132】
D.Kvβo(KI)およびKvβneo Flox(KO)のPCR分析
一対のプライマー(Kvβneoプライマー)を用いて、マウスゲノム内でのNeo−FloxP配列の存在を特異的に検出した。エキソン1.1の3’エキソンイントロン結合に対応するフォーワードプライマー1(配列番号3;5'TTGAAAGTGACTTAACTCAGCGC)およびNeo配列に特異的なリバースプライマー1(配列番号4;5'GCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTAC)を用いて、KvβNeo−Flox対立遺伝子を有する動物由来の400bpのフラグメントを増幅した。両ホモ接合体およびヘテロ接合体KO動物を、この分析により確認した。
【0133】
フォーワードプライマー1、およびneoFloxインサーションの30bp下流に対応しているリバースプライマー2(配列番号5;5'GGCCACATCTTAAAGATCGCAC)を用いる第2の対のプライマー(Kvβo KIプライマー)を用いて、WT、Kvβo KIまたはKvβo KO対立遺伝子を有する子孫の接合子の特徴を区別した。c−fosに特異的なさらなるプライマー対を内部ポジティブコントロール(配列番号6;fosFプライマー:5'AGGAGGGAGCTGACAGATACACTCCおよび配列番号7;fosRプライマー:5'CAAGGATGGCTTGGGCTCAGGGTCGT)として用いた。94℃、54℃、および72℃にてそれぞれ30、30、および60秒間の30サイクルのPCR増幅を、尾の生検からのゲノムDNA(プロテイナーゼKにて消化された尾の1:200希釈)を用いて行った。4%アガロースゲル(NuSieve 3:1, BMA, Rockland, ME)を用いて、生じたバンドを溶解した。図1Eに示すように、Kvβo KIプライマーは、野生型Kvβ1.1対立遺伝子から230bpのフラグメントを増幅したが、Lox−P配列の1コピーのために、Kvβo KI対立遺伝子からは260bpのフラグメントを増幅した。Kvβo KO対立遺伝子は、典型的には、2つのプライマー間に介入しているneo−FloxP配列のサイズ(1.4Kbのインサートサイズ)のために増幅しないが、Kvβneoプライマーを用いてポジティブにスコアする。
【0134】
E.RNase保護アッセイ
野生型Kvβエキソン1.1および3×HA−Ex1に相補的なRNAプローブを、T7 RNAポリメラーゼをP32CTPの存在下に用いるインビトロ転写により合成した。Kvβo(KI)、Kvβo Neo−Flox(KO)およびKvβ1.1野生型動物由来のトータルの海馬RNA(5μg)をハイブリダイズさせ、Rnase−抵抗性バンドを6%PAGE上に、製造業者の指示(RPAIIIキット、Ambion, Austin, TX)に従い溶解した。図1Dおよび1Eにより、変異Kvβo(図1D)対WT Kvβ1.1(図1E)に対して割り当てられる2つのプローブのエキソン構造、およびそれぞれのプローブに対するハイブリダイゼーションから生じるRPAゲルを示す。3×HAプローブにより、WTにおいて、正常なKvβ1.1mRNAのN末端の失われた3×HA配列から生じる220bpのより短い保護されたバンドが明らかとなった。同プローブは、ヘテロ接合体(WT/KI)およびホモ接合体(KI/KI)動物の両方に420bpのバンドを生じた。逆に、正常なKvβ1.1mRNAに対するプローブは、WTmRNAからの480bpの完全に保護されたフラグメントを示し、一方、3×HA配列に隣接している2つのフラグメント(210および140)が、KImRNAにおいて保護された。
【0135】
これらのデータ両方により、KI動物において3×HA変異(Kvβo)をコードしているmRNAの発現が確認された。重要なことに、Flox-neoカセット(n+/n+)を有する動物は、いずれのプローブからも特異的なバンドを示さなかった。つまり、Kvβ+Neo動物は、Kvβ1.1発現が完全に欠損しており、Kvβ1.1に関してKOであった。
【0136】
F.ウェスタンブロット分析
Kvβ1およびKvβ2に関する抗体を、すでに記載されているように用いた(Phodes et al., 1997, J. 神経科学(Neuroscience) 17: 7084-9)。抗−HAポリクローナル抗体(BMB, Germany)を1:2000にて用いた。抗−シナプシンポリクローナル抗体(Chemicon, Temecula, CA)は、1:5000にて用いた。Kvβo(KI)、Kvβo Neo−flox(KO)または野生型Kbβ1.1に関するマウスのホモ接合体から脳領域を切り出し、トライトン×100および1×完全プロテアーゼインヒビターカクテル(BMB, Germany)を含んでいるトライトン溶解バッファー中でホモジェナイズした。タンパク質サンプルをSDS−PAGE上に溶解し、ニトロセルロース紙に移した。ウェスタンブロット上の免疫活性バンドを、フィルム(ハイパーフィルム、Amersham)上での化学蛍光暴露により検出した。
【0137】
ウェスタンブロット分析により、ホモ接合KI動物が、内在Kvβ1発現により予測される解剖領域において、野生型mRNAに匹敵するレベルで、KvβomRNAおよびタンパク質を発現することを示した。皮質、線条、海馬、小脳、中脳、および視床からの脳領域を切り出し、図1Gに示すように、特異的免疫反応に関して分析した。各組織からのタンパク質抽出物(〜20μg/レーン)を、ポジティブコントロールとしてのラットの脳の膜(RBM)と共に流した。正常な129/SvEvマウスからの野生型(WT)組織を、Kvβ1、Kvβ2、シナプシン1およびHAに関してアッセイした。Kvβo−neofloxP(KO)動物からの組織を、HAアッセイを行わないことを除いて、WTサンプルにおけると同様にアッセイした。Kvβo動物からの組織を、特にHA発現のみに関してアッセイした。内在Kvβ1タンパク質が、WTの全脳領域において同定され、より高レベルが海馬および線条において認められた。Kvβo変異体タンパク質発現は、Kvβo KI動物の海馬および線条における高まったHA免疫活性により示されるように、内在Kvβ1の発現パターンを密接に擬似した。
【0138】
ウェスタンブロット分析により、HAタグの存在が確認され、さらに、Kvβ1に対する抗体を用いる場合、KvβoKOマウスにおけるKvβ1の発現の欠損も立証された。これらのKOマウスにおいて、WT動物と比較した場合、Kvβ2発現において明らかな変化はなく、効果において代償的な変化がないことを示唆する。加えて、Nakahiraらは、Kvβ1N−末端の不在が、Kv1ファミリーαサブユニットとの会合に有害な影響を与えないことを示している(Nakahira et al., J Biol Chem (1996) 271: 7084-7089)。Rhodes et al, J. Neurosci. (1996) 16: 4846-4860にすでに開示されているような同時免疫沈降のための抗体の使用により、KIマウスにおいて、Kv1ファミリーαサブユニットとのHA−タグKbβoの正確な会合が明らかになった(データは示していない)。
【0139】
実施例2
遺伝変更マウスにおける空間学習におけるN末端を欠くKvβ1.1サブユニットの効果
Kvβ1.1サブユニットにおけるN末端の重要性を、トランスジェニックノック-インマウスの表現型を、ノック-アウトマウスおよび野生型マウス(129/SvEv)(「WT」)両方の表現型と比較することにより決定した。マウスを、前記実施例1に記載するように発生させ、ここで、ノック-インマウス(「KI」)のKvβ1.1は、機能性N末端を欠いたが、それ以外には、α-サブユニットと会合することができた。ノックアウトマウス(「KO」)は、Kvβ1.1が完全に不活性化され、したがってN末端およびα−サブユニットと会合する能力の両方を欠いた変異を有した。
【0140】
空間学習は、Y迷路パラダイムにて試験することができる、海馬に依存する認識能力である(Dellu et al., 「自動化された記録を用いる2つのトライアル記憶タスク:若いラットおよび年取ったラットにおける試験」Brain Res. (1992) 588: 132-139)。Y迷路ノベルティ法は、Y迷路における場所探査に基づく2つのトライアルの認識タスクである。各実験は、トライアル間間隔(ITI)により分けられる2つの5分間の探査期間からなる。最初の探査期間中、Y迷路の1つのアームを閉鎖し、対象を5分間、迷路の2つのアームを探索させる。迷路上にのせたカメラにより行動を記録し、データをコンピューターにより分析する。トライアル1を、30分から4時間にわたるITIにより行い、その間は、動物を飼育檻の中に入れる。第2の探索期間中は、Y迷路の全アームを開放し、齧歯動物を元の出発アームにおき、5分間迷路を探索させた。まず新しいアームにエンターしている対象の割合、新規なおよび新規でないアームへエントリーしたものの数、およびトライアルの最初の2分間の間に各アームにて費やされた時間を記録する。齧歯動物は、新規なアームにエンターし、そして探索する自然な傾向を有する(Dellu et al., Brain Res. (1992) 588: 132-139)。
【0141】
129/SvEv地の8−10週齢のWT、KI、およびKOマウス(n=28−30)を、異なるITIを用いるY迷路2トライアル位置認識法にて試験した。全3つのWT、KI、およびKO群は、記憶トライアル中、試験した全てのITI(30分、2時間、および4時間)にて、新規でないアームよりも新規なアームにおいて、有意に多くの時間を過ごした。しかし、図2Aに示すように、KOおよびWTマウスは、一貫して、30分のITIにて、KIマウスよりもより頻繁に新規なアームを最初に選択した。これに対して、WTマウスのみが、4時間のITIまでに、新規なアームを一貫して最初に選択した。このパターンにより、KIおよびKOマウスの間で、30分のITIにて認識における有意な差が示され、これは4時間のITIまでに消滅する。加えて、図2Bに示すように、KOおよびWTマウスは、30分のITIにおいてKIマウス(NA:13.9±3.4秒、p<0.05)よりも新規なアームにおいて有意に多くの時間(NA:25.4±3.5秒)を過ごした。逆に、KIおよびWTマウスは、4時間のITIにて、KOマウスよりも新規なアームにおいてより多くの時間(有意性、p=0・055に接近する)を過ごした。KIマウスは、30分のITIにて記憶の欠損を有したが、4時間のITIにてKOマウスよりも良好な記憶を有したことにより、記憶学習タスクにおけるKvβ1.1サブユニットの複雑な役割が示唆される。
【0142】
実施例3
遺伝的に変更されたマウスにおける侵害受容および生理学的反応性
129/SvEv地のWT、KI、およびKOマウスを、視覚および侵害受容刺激に対する感受性における差に関して、さらに評価した。WT、KI、およびKOマウスを、視覚に対する反応性、触覚、熱および化学的刺激に対する反応性に関して、遺伝子型当たり8−10匹の群にて試験した。
【0143】
1.視覚的断崖試験
KIおよびKOマウスを、視覚的断崖試験において、遺伝子型当たり8−10匹の群にて試験して、その視覚の深さの認識における差を分析した(キツネ、動物の行動(Fox, Animal Behavior) (1965) 13(2): 232-233)。装置は、天井が開いた大きい方の箱(2’×2’×2’8”)内に含まれる黒と白(1”×1”平方)の市松模様の箱(1’×2’×2’)であった。黒と白の市松模様の床を、内部の箱の天井を横切って、側面を下り、低い方の床に沿って伸ばした。透明のプレキシグラスシート(2’×2’)が市松模様の内部の箱の天井を覆い、そして、断崖を完全に覆った。箱の中央にて、4”×2.5”×1”のプラットホームで断崖を安全な側から分けた。
【0144】
マウスを実験の日まで群にて飼育した。マウスを中央のプラットフォームに置き、プラットフォームから降りる潜伏時間ならびにマウスが降りる側を記録した。マウスが3分以内にプラットホームを降りなかった場合、「選択なし」のスコアを記載し、3分間の最大潜伏時間を記録した。各動物は1のトライアルを受けた。
全KIおよびKOマウスは、視覚断崖タスクにおいて100%の精度を有し、群間の視覚における差はなかった。
【0145】
2.フォン フレイ フィラメント(von Frey Filaments)を用いる触角試験
WT、KI、およびKOマウスを、フォン フレイ モノフィラメントを用いて、触角反応性における差に関して、遺伝子型当たり8−10匹の群にて試験した(Chaplan et al., 「ラットの足における触覚異痛の定量評価」、J. Neurosci. Methods, (1994) 53: 55-63)。
動物を高架網格子に乗せ、足の裏の表面を、一連のフォン フレイ モノフィラメントで刺激した。フォン フレイ フィラメントを必要に応じて連続した上昇または下降順序にて後足の足の裏の中央に適用し、反応の閾値へとできるかぎり接近させた。閾値は、刺激に対して鋭敏な引っ込め反応を引き起こす最小の力により示した。つまり、引っ込め反応により、次の弱い刺激を与え、引っ込めの欠如により、次の強い刺激を与える。50%の閾値の内挿を、各遺伝子型に関して計測した。
【0146】
3.熱および化学試験
129/SvEv地のWT、KI、およびKOマウスを、アカゲザルにてすでに行われたこれまでの試験からの試験を用いることにより、熱および化学刺激に対する反応の差に関して、遺伝子型当たり8−10匹の群にて試験した(Negus et al., J Pharmacol Exp Ther 266: 1355-1363, 1993; Brandt et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 296(3): 939-946, 2001)。
温水を用いて、遺伝子型操作により生じる侵害受容反応における差を評価した。温水尾−引っ込め操作では、齧歯動物を穏やかに拘束し、尾の末(3cm)の末端を、42、46、50、54、または58℃へと温めた水を含んでいる熱ボトルに入れた。動物が水から尾を上げる潜伏時間を記録し、侵害受容の基準として用いた。動物が尾を20秒以内に上げなかった場合、実験者が尾を上げ、最大の潜伏時間を記録した。
【0147】
各実験セッションは、各温度における平均ベースライン尾-引っ込め潜伏時間を測定することにより開始した。これらの潜伏時間を用いて、熱刺激に対するその感受性における潜在的な差に関して遺伝子型を評価した。
ベースライン温度測定に従い、カプサイシンクリーム(0.075mg%濃度)を、全長の尾に塗った。10分後、尾を湿った布でぬぐいって過剰のクリームを除去し、温度効果曲線を、5分後に再度決定した。この方法により、マウスにおいて強い熱−過剰反応を生じることが示された。
【0148】
熱-効果曲線を、各実験条件に関して作製した。加えて、尾−引っ込め潜伏時間の半最大増加を生じる温度(すなわち、T10)を、各温度-効果曲線から算定した。T10は、温度−効果曲線において10秒を越す点と10秒未満の点の間に引かれた線からの内挿により決定した。熱感覚過敏性は、温度−効果曲線における左の方向のシフトおよびT10値の低下と定義された。データを、分散分析(ANOVA)により分析し、有意な主要効果をさらに、post-hoct対応t−試験により分析した。
KT、KI、およびKOマウスは、触覚(フォンフレイ フィラメント)、熱(温水尾引っ込め)、および化学(カプサイシン)刺激に対して同様の反応を有した。これらのデータにより、Kvβ1.1に関連するKv−チャネルが急性の侵害受容刺激に対する感受性に関与しないことがさらに示唆される。
【0149】
実施例4
N−末端を欠くKvβ1.1サブユニットを発現しているマウスは、損なわれたコンテクスチュアル恐れ条件付けを示す。
これまでの研究により、完全に非-機能性のKvβ1.1ノックアウトマウスが低下したK−電流不活性化、およびいくつかの海馬−形成依存性認識タスクにおける損なわれたパーフォーマンスを示し、全体的な形態または行動に変化はなかった(Giese et al. (1998) 学習&記憶(Lerning & Memory) 5: 257-273)。つまり、KOマウスに関して認められる表現型は、1)速不活性化する、および/または2)適切にK−チャネルを発現する能力の欠損の結果である可能性がある。
群飼育した成体のオスのマウスを12時間光/暗サイクル下に、食餌および水に自由に摂取できるようにして維持した。129/SvEvおよびC57/BI6地両方の、8−16週齢のWT、KI、およびKOマウスを、遺伝子型当たり15−20匹の群へと分けた。
【0150】
A.コンテクスチュアル恐れ条件付け
マウスを、試験前30−60分間、実験室に慣れさせた。マウスを次いで、格子の床、白色ノイズ(64dB)、ハウスライト、およびトーン(75dB)またはクリックジェネレーターを備えた弱音化檻(Med. Associates)内に入れ、再び、短期間(2分間)チャンバーへと慣らせた。習慣化期間の後、トーンまたは一連のクリックの形態の条件付け刺激(CS)を、30秒間与え、次いで短いショック(2秒間)を与えた(格子の床を通して授与、1.0mAmp、非条件付け刺激、US)。2分間のITIの後、動物をUSおよびCSに再び曝した。2番目の対のショックの30秒後、マウスを操作チャンバーから取り出した。約18時間後、マウスを操作チャンバーに戻し、「コンテクスト」(すなわち、同じ環境、照射、CS以外の聴覚刺激)に対するフリージング行動に関して観察した。この観察期間後、動物をその檻に、30−60分間戻した。この猶予時間後、マウスを新たな操作チャンバーに入れ、再びフリージング行動に関して観察した。この観察期間の終わりに、CSを開始し、フリージング反応を記録した。これら3つの条件のそれぞれにおけるフリージングを、3分間、129/SvEv地の動物において、および5分間C57BI6においてモニターした。10分の間隔にて、観察者は、動物がフリージング(呼吸を除く全ての動きの欠如)するかしないかをスコアした。条件のそれぞれにおいてフリージングしている割合を各動物に関して記録した。データを、2−ウェイANOVA(処置×実験条件)を用いて分析し、post−hoc比較を、フィッシャーの最小有意差試験を用いてなした。
【0151】
すでに示した試験を繰り返して、高レベルのフリージング(より高いコンテクスチュアル条件づけ)を示したKOおよびWT動物の間で、差は認められなかった。しかし、図3Aおよび3Bに示されるように、KI動物は、両KOおよびWTコントロール動物と比較して、マウス系統の地とは無関係に、有意に損なわれたレベルのフリージング(損なわれたコンテクスチュアル条件付け)を示した。
【0152】
B.高架ゼロ迷路
マウスを少なくとも30分間、控室に慣れさせた。ゼロ迷路は、4つの等しいクアドラントに分けられた黒のPerspexサークルから成った(2つは閉まっており、2つは開いている)。閉まっているクアドラントは、迷路から伸びている白色のPerspex壁(内壁=20cm、外壁=30cm)を有する。開いているクアドラントは、迷路の縁から3mm上に伸びる透明のPerspexリップを有する。迷路は、60cmの外部直径および5cmの幅であり、床から55cm高架させた。個々の動物を、閉まったクアドラント中に頭と前足を入れて、ゼロ迷路に入れた。実験を、赤色光条件下、1つの白色光を迷路の上の天井に当てて行った(C57/BI6、15ワット、4lux、129SvEv 42ワット、20lux)。マウスの行動を次いで4分間、EthovisionPro ビデオトラッキングシステムを用いて記録した。
【0153】
開いているおよび閉まっているクアドラントにて過ごした時間の量、およびそれらへのエントリーの数、ならびに移動したトータルの距離を、EthovisionProソフトウェア(Noldus Information Technology, Inc.)により記録した。データを、1−ウェイANOVAにより分析し、post−hoc比較を、フィッシャーの最小有意差試験を用いてなした。
【0154】
コンテクスチュアル恐れ条件付け試験同様、KOおよびKI動物は、高架ゼロ迷路において異なるパターンの行動を示した。図4Aは特に、C57BI6地のKI変異に関してホモ接合のマウスが、KOまたはWTマウスと比較して、オープンゾーンおいて、有意に多くの時間(p<0.05)を過ごしたことを示し、低下した不安活性と一致する特性を示す。図4Bは、129/SvEv地マウスにおいて、KO動物が、両WTおよびKI動物に比べて、オープンゾーンにおいて増加した時間を過ごしたことを示す。C57BI6対129/SvEv地のマウス間の異なる特性は、129/SvEvマウスにおいては探索のレベルが一般的に低く、それらが最初に入れられたクアドラント(閉まったクアドラント)に留まる傾向があることによるものであり得る。比較により、図4Aおよび4Bに示すように、WTを含む全C57BI6マウスは、129/SvEvマウスよりもより多く、環境を探索し、オープンゾーンにおいて5−20%多くの時間過ごした。
これらのデータにより、実施例2のY迷路試験と合わせて、KOマウスにおいて観察される表現型が、単にK−チャネルの速不活性化の欠損によるものではなく、K−チャネル発現における変化または他のK−チャネルサブユニットが関与する代償メカニズムを反映している可能性があることを示唆する。
【0155】
実施例5
ストレス誘導性のコルチコステロンレベルにより示される、不安におけるノック-インKvβ1.1サブユニットの効果
KI遺伝子型が異なる不安特性を示すかどうかを確認するために、129/SvEv地のWT、KI、およびKOマウスを環境ストレスに供し、次いでKalman et al., 精神神経内分泌学(Psychoneuroendocrinology) (1994) 28 (5): 349-360のプロトコルに従い、コルチコステロンレベルにおける変化に関して測定した。この実験において、狭い、通気したチューブ内での拘束を、環境ストレスとして用いた。WT、KI、およびKOマウスを通気チューブ内に入れ、移動を1時間拘束した。血漿コルチコステロンレベルを、ストレス中0、30、60分間、およびさらに処置の開始後90分(拘束後30分)にて測定し、血漿におけるコルチコステロン反応の程度および持続を確認した。予備結果は、KI動物が、この処置中のコルチコステロンの有意に低下したレベルを示したことを示す(データは示していない)(p<0.05)。
【0156】
実施例6
ストレス誘導性の高体温を測定することにより示される、不安におけるノック-インKvβ1.1サブユニットの効果
Borsini et al (1989)およびVan der Heyden et al. (1997)の方法のごとく、ストレス誘導性の高体温をさらなる手段として用いて、KIマウスの不安特性を評価した(Borsini et al. 精神薬理学(Psycholopharmacology) (1989) 98: 207-211、およびVan Der Heyden, 生理学および行動(Physiology and Behavior) (1997) 62: 463-470)。このモデルは、ストレス誘導性の高体温を防ぐ不安緩解物質の効果に感受性があると報告されている。
【0157】
群飼育した成体の雄のマウスを12時間、光/暗サイクル下に、食餌および水を自由に摂取できるようにして維持した。129/SvEv地の8−11週齢のWT、KI、およびKOマウスを、遺伝子型当たり10匹の群に分けた。
マウスを試験室に、試験前少なくとも1時間慣れさせた。マウスをコントロールプラシーボビヒクル(プラシーボ)または不安緩解クロルジアゼポキシド(5または10mg/kg)にて腹腔内処理した。注射の60分後、最初の体の中心の温度基準(T1)を、潤滑剤を差したサーミスタープローブ2cmを、光抑制下に維持したマウスの直腸へ挿入することにより、測定した。この具体例において、直腸プローブを環境ストレスとして用いた。温度を、最も精密な0.1℃まで、ディジタル化サーモメーター(Yellow Springs Instruments YSI 2100 Tele-thermometer)を用いて記録した。第2の測定(T2)を、最初の直腸プローブの10分後になした。図5Aに示すように、ビヒクルを注入したコントロールマウスは、この操作において約0.7−0.8℃の体温の上昇を示した。データを1−ウェイANOVAにより分析した後、最小有意差試験(<0.05)により分析した。
【0158】
図5Aは、不安緩解性クロルジアゼポキシドにより、対照ビヒクルと比較して、ストレス誘導性の高体温が予防されたことを示す。特に、10mg/kgのクロルジアゼポキシドの投与レベルにより、記録される温度の低下が誘導された。さらに、図5Bに示すように、彼ら自身の飼育室にて行った以外は同じ操作に供した非処置のKIマウス(n=25)は、10mg/kgのクロルジアゼポキシドで処置したマウスに匹敵する不安緩解様反応を示した。これに対して、非処置のKO(n=16)およびWTマウス(n=20)は、対照マウスと同じ、または同様の期待される高体温を示した。ベースライン(T1)温度に関して、差は認められなかった。これらのデータにより、KI動物によりモデル化されるように、Kv1カリウムチャネルの不活性化の低下により不安緩解効果が生じるというさらなる証拠が提供される。
【0159】
実施例7
Kvβ1マウスにおける発作の閾値
マウスをハロタン麻酔下にて手術を行い、外頚静脈にカニューレ(PE 10チュービング)をインプラントした。動物に、発作閾値を伝導する前少なくとも48時間、回復させた。発作閾値を、0.34ml/分の流速で静脈内に送達したペンチレンテトラゾール(PTZ;へパリン処理した塩水中5mg/ml)の投与により決定した。マウスは拘束しなかったが、観察のための小さなチャンバーに閉じ込めた。最初の痙攣までの潜伏時間、慢性の発作(前足をパドリングさせて、後ろ足で立つことと定義される)、および緊張性の発作(完全な後足の伸張として定義される)を、各対象に関して記録した。発作の潜伏時間に関するデータを、図6に示すように行動エンドポイントのそれぞれに関して送達されたmg/kgPTXへと変換した。
PTZの静脈内での融解に対する感受性は、マウスの3つの遺伝子系統(n=10−12)の間で同一であった。それぞれの反応を誘発する最小の注入投与量を図6にプロットした。
【0160】
実施例8
c−fos活性化を測定するストレス評価
野生型、KI、およびKOマウスを、狭い檻(1つの末端に穴を開けた50mlチューブ)の中に入れ、移動を1時間拘束した。動物を、5連日間、1日1時間拘束し、その直後に屠殺し、新鮮な凍結脳をインサイチュハイブリダイゼーション組織化学のために加工した。c−fosのC末端領域をPCR−クローン化し、P33UTP(配列番号8、フォーワードプライマー5'AGGAGGGAGCTGACAGATCACTTC;配列番号9、リバースプライマーGTCTGCTGCATAGAAGGAACCGG)の存在下に、cDNAリボプローブを合成した。c−fos mRNAレベルは、非ストレスコントロールc−fosに対して全3群において増加した。頭頂皮質におけるmRNAシグナルを図7に示すごとくディジタル化し、次いで定量した。KI動物は、c−fos mRNAレベルにおいて27%の低下を示した(ANOVAによりp<.05;群当たりn=7)。
【0161】
本明細書中に記載する実施例および態様は、説明の目的のためにのみ本明細書に記載し、それに照らして種々の変更または変化が当業者には示唆され、本出願の意図および範囲および補正した請求項の範囲内に含まれるべきである。本明細書中に引用する全文献、特許、および特許出願は、本明細書中に、その全容をあらゆる目的のために組み込む。
【図面の簡単な説明】
【0162】
【図1】図1Aは、内在Kvβ1遺伝子構造およびそのエキソン組成の図示である。図1Bは、内在Kvβ1.1遺伝子が変異に関してターゲットされた方法を示す。図1Cは、ES細胞をBamHIで消化したサザンブロットの図示である。図1Dおよび1Eは、RNaseタンパク質分析の結果を図示したものであり、ノック−インKvβ変異体(Kvβ0)mRNA(図1D)および野生型Kvβ(WT)の発現パターンを示す(図1E)。図1Fは、種々の遺伝子タイプからのサンプルを用いるPCR分析の結果を図示したものである。図1Gは、WTおよび変異体マウスからの皮質、線条、海馬、小脳、中脳、および視床におけるKvβ1、Kvβ2、シナプシン1(コントロール)またはHAの発現を分析するために行ったウェスタンブロットに関する図示である。
【図2】図2A−2Bは、Y迷路におけるWT129/SvEvマウス対KOおよびKIマウスの間の異なる学習および記憶パターンを示す。図2Aは、30分、2時間、および4時間の試験間の間隔(ITI)後の、迷路の新規なアームを最初に選択するマウスの割合を示す。図2Bは、30分、2時間、および4時間のITI後の新規なアームにおいて費やされた(2分間の)時間の割合を示す。
【図3】図3A−3Bは、両C57BI6(図3A)および129/SvEv(図3B)地におけるコンテクスチュアル恐れ条件付け試験におけるWT、KI、およびKOマウスの間の異なる学習パターンを示す。
【図4】図4A-4Bは、C57BI6(図4A)および129/SvEv(図4B)地の両方における、高架ゼロ迷路のオープンゾーン部分において3つの異なるゲノタイプ、WT、KI、およびKOが費やした時間の割合を示す。
【図5】図5Aは、雄のWT(129/SvEv)マウスにおけるストレス誘導性の高体温症におけるクロロジアセポキシドの種々の投与量の効果を示す。図5Bは、野生型(WT;129/SvEv)、Kvβノック−イン(KI)およびノックアウト(KO)マウスにおけるストレス誘導性の高体温症に対する反応を示す。挿入図は、初期測定における体温を示す。
【図6】図6は、Kvβノック−インマウスにおいて発作の閾値が変化していないことを示す。
【図7】図7は、KI、KO、および野生型マウスの頭頂皮質におけるc−fos mRNAのインサイチュハイブリダイゼーション定量を示す。
Claims (97)
- A型カリウムチャネルの変異Kvβ1.1サブユニットをコードしている内在遺伝子クラスターを含むトランスジェニック齧歯動物であって、変異Kvβ1.1サブユニットが、チャネルのN型不活性化は付与することができないが、Kv1ファミリーα-サブユニットと会合する能力は保持するノック-インサブユニットである、トランスジェニック齧歯動物。
- 齧歯動物がマウスである、請求項1記載のトランスジェニック齧歯動物。
- ノック-インサブユニットがホモ接合変異によりコードされている、請求項1記載のトランスジェニック齧歯動物。
- ノック-インサブユニットが、置換変異、挿入変異、フレームシフト変異、およびストップコドン変異から成る群から選択される変異によりコードされる、請求項1記載のトランスジェニック齧歯動物。
- Y迷路によりアッセイされるように、マウスが、完全に非機能性のノック-アウトKvβ1.1サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して有意に異なる学習または記憶パターンを有する、請求項2記載のトランスジェニックマウス。
- マウスが、ノック-アウトKvβ1.1サブユニットを有するマウスと比較して、4時間の試験間間隔後に、有意に改善された学習または記憶を有する、請求項5記載のトランスジェニックマウス。
- マウスが、ノック-アウトKvβ1.1サブユニットを有するマウスと比較して、30分の試験間間隔後に有意に損なわれた学習または記憶を有する、請求項5記載のトランスジェニックマウス。
- マウスが、コンテクスチュアル恐れ条件付けによりアッセイされるように、ノック-アウトKvβ1.1サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して、有意に損なわれた学習パターンを有する、請求項2記載のトランスジェニックマウス。
- マウスが、コンテクスチュアル恐れ条件付けによりアッセイされるように、野生型Kvβ1.1サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して、有意に損なわれた学習パターンを有する、請求項8記載のトランスジェニックマウス。
- マウスが、高架ゼロ迷路によりアッセイされるように、ノック-アウトKvβ1.1サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して、有意に低下した不安パターンを有する、請求項2記載のトランスジェニックマウス。
- マウスが、高架ゼロ迷路によりアッセイされるように、野生型Kvβ1.1サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して、有意に低下した不安パターンを有する、請求項10記載のトランスジェニックマウス。
- マウスが、ストレス誘導性のコルチコステロンレベルによりアッセイされるように、ノック-アウトKvβ1.1サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して、有意に低下した不安パターンを有する、請求項2記載のトランスジェニックマウス。
- マウスが、ストレス誘導性のコルチコステロンレベルによりアッセイされるように、野生型Kvβ1.1サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して、有意に低下した不安パターンを有する、請求項12記載のトランスジェニックマウス。
- マウスが、ストレス誘導性の高体温によりアッセイされるように、ノック-アウトKvβ1.1サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して、有意に低下した不安パターンを有する、請求項2記載のトランスジェニックマウス。
- マウスが、ストレス誘導性の高体温によりアッセイされるように、野生型Kvβ1.1サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して、有意に低下した不安パターンを有する、請求項14記載のトランスジェニックマウス。
- マウスが、ストレス誘導性のc−fosレベルによりアッセイされるように、ノック-アウトKvβ1.1サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して、有意に低下した不安パターンを有する、請求項2記載のトランスジェニックマウス。
- マウスが、ストレス誘導性のc−fosレベルによりアッセイされるように、野生型Kvβ1.1サブユニットを有する同じ系統のマウスと比較して、有意に低下した不安パターンを有する、請求項16記載のトランスジェニックマウス。
- ゲノムが内在Kvβ1.1サブユニット遺伝子のN末端のコドン1−70にホモ接合ノック-イン変異を含むトランスジェニック齧歯動物であって、ノック-イン変異が置換変異であり、齧歯動物が、そのゲノムが完全に非-機能性のKvβ1.1サブユニットをコードするホモ接合ノック-アウト変異を含む第2の齧歯動物とは有意に異なる認識パターンを示す、トランスジェニック齧歯動物。
- ホモ接合ノック-イン変異が、内在Kvβ1.1サブユニット遺伝子のN末端のコドン1-36にある、請求項18記載のトランスジェニック齧歯動物。
- 置換変異が、免疫抑制性のエピトープタグを含む、請求項19記載のトランスジェニック齧歯動物。
- エピトープタグが、血球凝集素エピトープタグである、請求項20記載のトランスジェニック齧歯動物。
- 齧歯動物がマウスである、請求項18記載のトランスジェニック齧歯動物。
- ゲノムが内在Kvβ1.1サブユニット遺伝子のN末端のコドン1-36にホモ接合ノック-イン変異を含むトランスジェニック齧歯動物であって、ノック-イン変異が、そのゲノムが完全に非-機能性のKvβ1.1サブユニットをコードするホモ接合ノック-アウト変異を含む第2の齧歯動物とは有意に異なる認識パターンを示す、トランスジェニック齧歯動物。
- 生殖細胞または体細胞が、齧歯動物または該齧歯動物の先祖に胎児段階で導入された組み換え活性化Kvβ1.1トランスジーン配列を含む、トランスジェニック齧歯動物であって、Kvβ1.1トランスジーンが、カリウムチャネルのN型の不活性化を付与することができないが、Kv1ファミリーα-サブユニットと会合する能力は保持するノック-インβサブユニットをコードする、トランスジェニック齧歯動物。
- 以下のステップを含む、単離ノック-イン哺乳動物を作製する方法:
(1)内在Kvβ1.1遺伝子とトランスジーンKvβ1.1の間の相同組み換えを達成すること、ここで、トランスジーンKvβ1.1は、
(a)Kvβ1.1サブユニットのコドン1-70の全部または部分を置換している免疫反応タグをコードしている配列、
(b)1対の繰り返し部位が隣接する選択可能なマーカー、および、
(c)タグおよび選択可能なマーカーの両方が隣接する内在Kvβ1.1遺伝子に相同な一対の配列
を含む、
(2)さらに組み換えをなして、選択可能なマーカーを除去すること、
ここで、トランスジーンKvβ1.1は、N型不活性化を付与することができないが、Kv1ファミリーα−サブユニットと会合する能力は保持する。 - 細胞が、トランスジーンに関してホモ接合である、請求項25記載のノック-イン哺乳動物細胞。
- 以下のステップを含む、単離ノック-イン哺乳動物を作製する方法:
(1)内在Kvβ1.1遺伝子およびトランスジーンKvβ1.1の間の相同組み換えを行うこと、ここで、該トランスジーンKvβ1.1は、
(a)Kvβ1.1サブユニットのコドン1-36の全部または部分を置換している免疫反応タグをコードしている配列、
(b)1対の繰り返し部位が隣接する選択可能なマーカー、および、
(c)タグおよび選択可能なマーカーの両方が隣接する内在Kvβ1.1遺伝子に相同な一対の配列
を含む、および、
(2)さらに組み換えをなして、選択可能なマーカーを除去すること、
ここで、トランスジーンKvβ1.1は、N型不活性化を付与することができないが、Kv1ファミリーα−サブユニットと会合する能力は保持する。 - A型カリウムチャネルの変異Kvβ1.1サブユニットを発現している哺乳動物細胞であって、変異Kvβ1.1サブユニットが、チャネルのN型不活性化は付与することができないが、Kv1α−サブユニットと会合する能力は保持するノック-インサブユニットであり、細胞が、変異Kvβ1.1サブユニットの発現をコントロールする内在核酸配列を含み、変異Kvβ1.1サブユニットが、置換変異、挿入変異、フレームシフト変異、およびストップコドン変異から成る群から選択される変異によりコードされる、哺乳動物細胞。
- ウマ、ウシ、齧歯動物、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、非−ヒト霊長類、ヒト、ウサギ、およびハムスターから成る群から選択される、請求項28記載の細胞。
- 細胞がネズミの細胞である、請求項28記載の細胞。
- 変異が、内在核酸配列のコドン1−70の全部または部分の置換である、請求項28記載の細胞。
- 置換が、内在核酸配列のコドン1−36の全部または部分の置換である、請求項28記載の細胞。
- 置換が、免疫反応性エピトープタグを含む、請求項32記載の細胞。
- 細胞が、変異に関してホモ接合である、請求項32記載の細胞。
- Kvβ1.1遺伝子のコドン1−70に変異をコードしている核酸を含んでいる核酸構築物であって、核酸がA型カリウムチャネルのノック-インサブユニットをコードし、およびノック-インサブユニットが、A型カリウムチャネルの不活性化を付与できないが、Kv1ファミリーα−サブユニットと会合する能力は保持する核酸構築物。
- 変異が、置換変異、挿入変異、フレームシフト変異、ストップコドン変異から成る群から選択される、請求項35記載の核酸構築物。
- 変異が置換変異である、請求項36記載の核酸構築物。
- 変異が、Kvβ1.1遺伝子のコドン1−70の全部を置換している免疫反応性のエピトープタグを含む、請求項37記載の核酸構築物。
- 核酸がデオキシリボ核酸(DNA)である、請求項35記載の核酸構築物。
- 核酸がリボ核酸(RNA)である、請求項35記載の核酸構築物。
- 核酸構築物が哺乳動物細胞中にある、請求項35記載の核酸構築物。
- 核酸がベクター中にある、請求項35記載の核酸構築物。
- Kvβ1.1遺伝子のコドン1−36に変異をコードしている核酸を含む核酸構築物であって、核酸がA型カリウムチャネルのノック-インサブユニットをコードし、ノック-インサブユニットがA型カリウムチャネルのN型不活性化を付与することができないが、Kv1ファミリーα−サブユニットと会合する能力は保持する、核酸構築物。
- 相同組み換えにより内在Kvβ1.1遺伝子の発現を破壊するための核酸構築物であって、Kvβ1.1遺伝子のコドン1−70の全部または部分を置換している免疫反応性のエピトープタグ、選択可能なマーカー、およびタグと選択可能なマーカーの両方が隣接している1対の核酸配列を含み、該対が内在Kvβ1.1遺伝子の部分に相同である、核酸構築物。
- 免疫反応性のエピトープタグが血球凝集素エピトープタグである、請求項44記載の核酸構築物。
- 選択可能なマーカーがneo遺伝子である、請求項44記載の核酸構築物。
- 構築物がベクター中に存在する、請求項44記載の核酸構築物。
- 選択可能なマーカーに、LoxP核酸配列がさらに隣接している、請求項44記載の核酸構築物。
- 内在Kvβ1.1遺伝子の発現を相同組み換えにより破壊するための核酸構築物であって、Kvβ1.1遺伝子のコドン1−36の全部または部分を置換している免疫反応性のエピトープタグ、選択可能なマーカー、およびタグと選択可能なマーカーの両方が隣接している一対の核酸配列を含み、該対が内在Kvβ1.1遺伝子の部分に相同である、核酸構築物。
- Kvβ1.1サブユニットの活性のモジュレーターに関して試験化合物を前−スクリーニングする方法であって、以下のステップから成る方法:
(a)試験化合物を変異Kvβ1.1サブユニットと接触させること;および、
(b)変異Kvβ1.1サブユニットの活性に検出可能な変化を提供する試験化合物の1つを選択すること;
ここで、変異Kvβ1.1サブユニットは、N型不活性化を付与することができないが、Kv1ファミリーα−サブユニットと会合する能力は保持するノック-インサブユニットである。 - 変異Kvβ1.1サブユニットが細胞中に存在する、請求項50記載の方法。
- 接触させることが細胞を試験化合物と接触させることを含む、請求項51記載の方法。
- 検出することが、変異Kvβ1.1サブユニットがKv1ファミリーα-サブユニットと会合するかどうかを決定するための免疫アッセイを含む、請求項50記載の方法。
- 選択される試験化合物が、変異Kvβ1.1サブユニットに結合する、請求項50記載の方法。
- 試験化合物が小分子である、請求項50記載の方法。
- 試験化合物が、空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー、またはデコンボリューション、「1-ビーズ1-化合物」法から、もしくはアフィニティクロマトグラフィー選択により作製される合成ライブラリーから成るライブラリーの群から選択されるライブラリー由来である、請求項55記載の方法。
- Kvβ1.1サブユニット活性のモジュレーターに関して試験化合物を前-スクリーニングする方法であって、次のステップを含む方法;
(a)試験化合物を野生型Kvβ1.1サブユニットおよび変異Kvβ1.1サブユニットと接触させること、および、
(b)野生型Kvβ1.1サブユニットの活性には検出可能な変化を提供するが、変異Kvβ1.1サブユニットの活性には検出可能な変化を提供しない試験化合物の1つを選択すること;
ここで、変異Kvβ1.1サブユニットは、N型不活性化を付与することができないが、Kv1ファミリーα-サブユニットと会合する能力は保持するノック-インサブユニットである。 - 野生型Kvβ1.1サブユニットおよび変異Kvβ1.1サブユニットが1つの試験サンプル中に存在する、請求項57記載の方法。
- 試験サンプルが細胞を含む、請求項58記載の方法。
- 野生型Kvβ1.1サブユニットが第1のサンプル中に存在し、変異Kvβ1.1サブユニットが第2の試験サンプル中に存在する、請求項57記載の方法。
- 試験サンプルが細胞を含む、請求項60記載の方法。
- 接触させることが、細胞を試験化合物と接触させることを含む、請求項58または60記載の方法。
- Kv1α-サブユニットも試験化合物と共に存在する、請求項57記載の方法。
- 免疫アッセイを、検出可能な変化がKv1ファミリーα-サブユニットとの会合の欠如によるかどうかを決定するために用いる、請求項63記載の方法。
- 選択される試験化合物がKvβ1.1サブユニットに結合する、請求項57記載の方法。
- 試験化合物が小分子である、請求項57記載の方法。
- 試験化合物が、空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー、またはデコンボリューション、「1−ビーズ1−化合物」法から、またはアフィニティクロマトグラフィー選択により作製される合成ライブラリーから成るライブラリーの群から選択されるライブラリー由来である、請求項66記載の方法。
- Kvβ1.1サブユニットの活性を調節する試験化合物の効力を評価する方法であって、以下を含む方法;
(a)試験化合物を野生型Kvβ1.1サブユニットおよび変異Kvβ1.1サブユニットと接触させること、および、
(b)野生型Kvβ1.1サブユニットの活性には変化を検出するが、変異Kvβ1.1サブユニットの活性には変化がないことを検出すること;
ここで、変異Kvβ1.1サブユニットは、カリウムチャネルのN型不活性化を付与することができないが、Kv1ファミリーα-サブユニットと会合するノック-インサブユニットである。 - 試験化合物が野生型Kvβ1.1サブユニットの活性を10%以上まで低下させる、請求項68記載の方法。
- 試験化合物が、野生型Kvβ1.1サブユニットの活性を50%以上まで低下させる、請求項69記載の方法。
- 野生型Kvβ1.1サブユニットが第1試験サンプル中に存在し、変異Kvβ1.1サブユニットが第2試験サンプル中に存在し、試験サンプルが細胞を含む、請求項69記載の方法。
- 野生型Kvβ1.1サブユニットが第1試験サンプル中に存在し、変異Kvβ1.1サブユニットが第2試験サンプル中に存在し、試験サンプルが組織を含む、請求項68記載の方法。
- 野生型Kvβ1.1サブユニットが第1試験サンプル中に存在し、変異Kvβ1.1サブユニットが第2試験サンプル中に存在し、試験サンプルが齧歯動物を含む、請求項68記載の方法。
- 接触させることが試験化合物を齧歯動物に投与することを含む、請求項73記載の方法。
- 齧歯動物がマウスである、請求項74記載の方法。
- 接触させることが、組織を試験化合物と接触させることを含む、請求項74記載の方法。
- 接触させることが細胞を試験化合物と接触させることを含む、請求項71記載の方法。
- 検出することが、野生型Kvβ1.1サブユニットがKv1ファミリーα-サブユニットと会合するかどうかを決定するための免疫アッセイを含む、請求項77記載の方法。
- (a)試験化合物を完全に非-機能性のノック-アウトKvβ1.1サブユニットと接触させること、および、
(b)第3の試験サンプルにおける完全に非機能性のノック-アウトKvβ1.1サブユニットの活性に変化がないことを検出すること
のステップをさらに含む、請求項68記載の方法。 - ノック-アウトKvβ1.1サブユニットが齧歯動物であり、検出することが行動試験を含む、請求項79記載の方法。
- 行動試験が、Y迷路、コンテクスチュアル恐れ条件付け、および高架ゼロ迷路から成る群から選択される、請求項78記載の方法。
- ノック-アウトKvβ1.1サブユニットが齧歯動物に存在し、検出することが生理学的アッセイを含む、請求項79記載の方法。
- 生理学的アッセイが、ホルモンアッセイ、高体温アッセイ、および電気生理学的アッセイから成る群から選択される、請求項82記載の方法。
- A型カリウムチャネルを不活性化させる試験化合物の効力を評価する方法であって、以下を含む方法;
(a)試験化合物を野生型Kvβ1.1サブユニットおよび変異Kvβ1.1サブユニットと接触させること、および、
(b)野生型Kvβ1.1サブユニットの活性において変化を検出するが、変異Kvβ1.1サブユニットの活性には変化がないことを検出すること、
ここで、変異Kvβ1.1サブユニットは、コドン1-70の全部または部分における変異を含むノック-インKvβ1.1遺伝子配列によりコードされる。 - 野生型Kvβ1.1サブユニットの活性における変化がカリウムチャネルのN型不活性化の阻害により引き起こされる、請求項84記載の方法。
- 野生型Kvβ1.1サブユニットの活性における変化により、野生型サブユニットが変異Kvβ1.1サブユニットと同じ活性を有するようになる、請求項84記載の方法。
- 活性を、齧歯動物を高架ゼロ迷路に供することにより測定する、請求項84記載の方法。
- 活性を、齧歯動物を環境刺激へと供し、次いで齧歯動物のコルチコステロンレベルを測定することにより測定する、請求項84記載の方法。
- 活性を、齧歯動物を環境刺激へと供し、次いで齧歯動物のc-fosレベルを測定することにより測定する、請求項84記載の方法。
- 齧歯動物がマウスである、請求項88記載の方法。
- 活性を、齧歯動物から組織を採取し、次いで組織を電気生理学的試験に供することにより測定する、請求項84記載の方法。
- 活性をインビトロ結合アッセイを用いることにより測定する、請求項84記載の方法。
- 試験化合物が野生型Kvβ1.1サブユニットに結合するが、変異Kvβ1.1サブユニットには結合しない、請求項84記載の方法。
- 試験化合物を完全に非機能性のノック-アウトKvβ1.1サブユニットと接触させること、次いで該ノック-アウトKvβ1.1サブユニットの活性に変化がないことを検出することのステップをさらに含む、請求項84記載の方法。
- 野生型Kvβ1.1サブユニットの活性が、10%以上まで低下する、請求項84記載の方法。
- 野生型Kvβ1.1サブユニットが、50%以上まで低下する、請求項95記載の方法。
- A型カリウムチャネルを不活性化させる試験化合物の効力を評価する方法であって、
(a)試験化合物を野生型Kvβ1.1サブユニットおよび変異Kvβ1.1サブユニットと接触させること、および、
(b)野生型Kvβ1.1サブユニットの活性における変化を検出するが、変異Kvβ1.1サブユニットの活性には変化がないことを検出すること、
ここで、変異Kvβ1.1サブユニットは、コドン1-36の全部または一部に変異を含むノック-インKvβ1.1遺伝子配列によりコードされる。
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