CN1893821A - 受体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及已知受体的新功能。具体地，本发明涉及鞘氨醇磷脂酰胆碱受体和/和其配体在神经元和边缘系统的操作以及疼痛的诊断和治疗中的用途。

Description

受体

本发明涉及已知受体的新功能。具体地，本发明涉及鞘氨醇磷脂酰胆碱(sphingosylphosphorylcholine)受体和/或其配体在操纵边缘系统中的用途。

编码GPR12的Annie位于人染色体13q12上。GPR12cDNA长度为1005bp。其首先由Song et al(Genomics，1995，28，347-349)公开。最初，认为它是鞘氨醇1-磷酸的受体(Uhlenbrock，K.et al.Cellular Signalling 2002，14：941-953)。最近，其被去-孤化(de-orphanised)并显示为鞘氨醇磷脂酰胆碱(sphingosylphosphorylcholine)(SPC)的受体(Ignatov，.et al.2003，J.Neurosci.23，(2)：907-914)。

SPC的多种细胞效应可通过与S1P-EDG受体的低亲和力结合以及活化来解释。然而，SPC的一些细胞和亚细胞作用是S1P不具有的，其也在正常血浆、腹水、各种组织中鉴定，是脂质介导物。现在认识到鞘磷脂分解产物在细胞信号中显示双重作用，作为细胞内以及细胞外信号分子起作用。已经显示G蛋白偶联的受体对鞘氨醇1-磷酸和鞘氨醇磷脂酰胆碱具有高亲和力，鞘磷脂具有多种功能，包括调节心率，氧化爆发(oxidative burst)，神经突缩回(neurite retraction)，伤口愈合(有丝分裂发生效应(mitogenic effect))和血小板活化。

鞘氨醇-1磷酸(S1P)是有效的细胞外溶血磷脂磷酸介导物，其在例如血小板聚集过程中释放。S1P通过多种刺激诱导，例如生长因子，细胞因子，GPCR激动剂，抗原等。S1P受体信号途径与转录因子活化、细胞骨架蛋白，粘附分子表达等有关。因此，S1P可影响多种生物反应，包括有丝分裂发生，分化，增殖，迁移和凋亡等。此外，S1P在钙动员中起作用。

Edg 1，3和5与细胞增殖，血管生成和细胞迁移相关。(Edg8最接近Edg5，序列同源性为40％)。Edg4是卵巢癌细胞的标记物。

S1P与乳腺癌有关。S1P抑制雌激素依赖性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中的化学侵入性(chemo-invasiveness)。白细胞迁移受S1P影响，因此S1P可能在炎症中有作用。肥大细胞中S1P水平可决定它们的过敏反应。Edg受体中的改变在控制S1P的细胞内/细胞外浓度中起关键作用，并且这可能对多种疾病有影响。

Edg受体在与失调的凋亡有关的神经疾病诸如阿尔茨海默氏病和帕金森氏症(Alzheimer’s and Parkinson’s disease)中起作用。通过抑制PKC局部治疗疤痕是另一种有效的应用，对于白血病而言也如此。

利用Edg1空小鼠，Liu，et al.(2000)证实了经由Edg1的S1P信号对于血管形成必不可少。显示胚胎出血的Edg1空小鼠导致在胚胎日龄12.5-14.5之间的子宫内死亡。脉管形成和血管生成在突变胚胎中表现正常。然而，血管成熟由于血管平滑肌细胞/周细胞缺陷而不完整。所述缺陷在平滑肌中不是普遍的缺陷，这是由于胃肠道和支气管树的肌肉层发育良好。利用野生型和Edge1空纤维母细胞培养物，发明人显示Edg1介导S1P诱导的迁移反应，其在突变细胞中缺陷。突变细胞也不能应答于S1P刺激而活化Rac。

Ishii，et al.(2001)破坏了小鼠中的Edg3基因，导致该基因、转录物以及蛋白质的完全缺乏。Edg3空小鼠可存活、可生育、可正常发育而没有明显表型异常。野生型小鼠胚胎纤维母细胞表达Edg1，Edg5，和Edg3，并对磷酸酶C(PLC；见600810)活化、腺苷酸环化酶抑制，以及Rho(见602732)活化中的S1P高反应。Edg3空纤维母细胞显示PLC活化明显减少，腺苷酸环化酶抑制稍有减少，Rho活化没有改变。Ishii，et al.(2001)的结论是Edg3对正常小鼠发育具有非必要的作用，但显示应答于S1P的非多余的细胞信号。

Ishii，et al.(2002)开发了Edg3和Edg5空小鼠。单独的Edg5缺陷的小鼠可存活、生育并正常发育。Edg5-Edg3双空杂交的同窝幼鼠的大小明显减小，并且这些幼鼠通常不能存活至超过幼年，但是双空存活小鼠显示没有明显的表型。Ishii，et al.(2002)的结论是任何一种受体亚型都支持了胚胎发育，但是缺乏任何一种受体亚型都导致明显的围产期死亡。他们检验了小鼠胚胎纤维母细胞中受体缺失对S1P信号的影响。Edg5空纤维母细胞显示，暴露于S1P时，Rho活化明显降低，双空纤维母细胞显示Rho活化完全丧失，PLC活化和钙动员明显降低，而对腺苷酸环化酶抑制没有影响。他们的结论是，在小鼠中Edg5和Edg3分别优选与Rho和PLC/Ca(2+)途径偶联。

最近，在胚胎发育过程中，GPR12表达在脑内显示，提示其在神经元分化，成熟和增殖中的作用。实际上，河马细胞HT22应答于SPC导致细胞数目增加，用SPC处理的原代大鼠皮质培养物显示突触接触增加。

在小鼠中，GPR12已经在以下组织中用northern印迹检出：脑，具体在前脑和后脑，和肝。更具体地，在脑的海马，杏仁核，梨状皮质以及嗅皮质(边缘系统)中原位检出(Saeki，Y.，et al FEBS letters 1993 336：317-322)。

更接近现在，GPR12已经被去孤化(deorphanised)作为鞘氨醇磷脂酰胆碱(SPC)受体。GPR12是仅有的SPC受体，其主要在胚胎和成年小鼠脑内表达。在胚胎发育过程中，GPR12mRNA在皮质和海马内强表达，尽管该表达仍存在成年小鼠中，其较在发育过程中的表达更弱。发育过程中的表达也存在梨状皮质(piriform cortex)，尾状核(caudate)，壳核(putamen)，中间背侧核(dorsomedial)和弓状核(arcuate nuclei)，乳头体(mammillary body)，后脑的运动和感觉核，脑干和脊髓。在成年小鼠中，GPR12在皮质(躯体感觉和retrosplenial皮质)，海马(CA2区的锥状细胞层中的标记最强)，伏核(nucleusaccumbens)，梨状皮质，中隔(septum)，嗅球(僧帽瓣状细胞层(mitral)和小球细胞层(glomerular cell layers))，杏仁核和膝状核中强表达。在后脑，GPR12表达弱，仅有小脑的一些细胞(小叶9和10)显示表达。

在大鼠中，Northern显示GPR12在脑内以及睾丸内的表达。通过RT-PCR显示，GPR12存在于垂体，脑和睾丸。原位杂交显示GPR12在垂体前叶和后叶，梨状皮质，以及外侧隔核中的表达(Eidne，K.A.，et al.FEBSletters.1991.292.243-248)。

然而，对GPR12在哺乳动物总体以及具体在脑中的作用的理解在现有技术中没有报道。WO 01/48483描述了提供食欲控制剂的方法，包括利用GPR12受体的一或多种激动剂或拮抗剂作为受试化合物，用作食欲控制剂。然而，cDNA序列和氨基酸序列的分析显示许多错误，其不能从本说明书测定。由此这些研究不能得以重复。

发明内容

本发明人首次制备了GPR12敲除小鼠以研究GPR12的体内作用。发明人显示所述敲除小鼠与非突变体的运动(包括步态)不同，学习能力也不同，提示GPR12在控制神经元发育以及突触形成以及神经内分泌行为调节中的作用。此外，所述小鼠显示对疼痛的敏感性差异，它们是痛觉超敏的(hyperanalgesic)，即对疼痛刺激敏感。此外，所述突变体的生理和形态学提示GPR12在一些神经疾病以及其它疾病例如阿尔茨海默病和相关疾病(Alzheimer’s and related diseases)，帕金森氏症(Parkinson’s disease)，癫痫(epilepsy)以及致癫痫疾病(epileptogenic)，眩晕(dizziness)和晕动病(motionsickness)，运动神经元疾病(motor neuron disease)，以及神经元功能障碍疾病(diseases of neuronal dysfunctions)，以及疼痛包括感受伤害性疼痛(nociceptive pain)中的作用。生物化学分子显示所述敲除小鼠显示肝和肾疾病(包括肝炎)，肌肉降解(muscle degradation)，甲状腺机能低下(hypothyroidism)，胰腺炎或MI，多发性骨髓瘤，和糖尿病的病症。

GPR12敲除小鼠可用作疾病模型以及鉴定用于治疗用途的GPR12的拮抗剂或激动剂。

因此，在第一方面，本发明提供了GPR12敲除哺乳动物，所述哺乳动物包含其中的GPR12多肽是功能失活的一或多种细胞。

本发明人发现本发明上述方面的GPR12敲除小鼠显示多种确定性特征，所述特征包括选自下组的特征：运动和平衡功能差(如通过抓握倒置栅格(inverted grid)的能力较低所证实的)，rotarod成绩差，步态异常、步距宽以及对疼痛的敏感性增加。

敲除哺乳动物的产生对于本领域技术人员而言是熟悉的，并且可利用标准实验室技术，其包括如本文所述的同源重组。

优选，所述转基因哺乳动物是选自下组的以下哺乳动物之一：小鼠，大鼠，地鼠，沙鼠，豚鼠，猴，仓鼠，猫和狗。本领域技术人员将理解该列表并非意图穷举。最优选，所述哺乳动物是小鼠。

如本文所述，术语“功能失活的”(GPR12，通过同源重组)表示与其中GPR12没有被功能失活的对照相比，GPR12多肽在其天然环境(在体内环境中)起作用时，所述多肽正常执行的一或多种功能明显受抑制。优选，术语“功能失活的”指与其中GPR12没有被功能灭活的对照相比，当GPR12在其天然环境中(即在体内环境中)起作用时，一种以上由GPR12正常执行的功能显著受到抑制。更优选，本文术语“功能失活的”指与其中GPR12没有被功能灭活的对照相比，当GPR12在其天然环境中(即在体内环境中)起作用时，所有由GPR12正常执行的功能显著受到抑制。

同样，本文术语“功能灭活的”GPR12核酸编码本文定义的功能失活的GPR12。

如上所述，术语“明显受抑制的”(GPR12功能)指抑制(如上所述，通过的同源重组抑制至少一种GPR12功能)是与适宜的对照相比被抑制至少20％。适宜对照的实例是在相同或相似体内环境中的相同或相似细胞，其中GPR12没有通过如上所述的同源重组而被功能灭活。优选，术语“明显抑制的”(如上所述，通过同源重组抑制哺乳动物细胞中的GPR12功能)指与适宜对照相比，至少一种GPR12功能被抑制至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％。更优选，术语“明显受抑制的”(如上所述，通过同源重组抑制哺乳动物细胞中的GPR12功能)指与适宜对照相比，至少一种GPR12功能被抑制100％。

另一方面，本发明提供产生包含一或多种功能失活的GPR12基因的一或多种哺乳动物细胞的方法，包括以下步骤：

(a)选择一或多种细胞，其包含一或多种功能活性内源GPR12基因；

(b)用功能失活的GPR12核酸转染根据步骤(a)的一或多种细胞，所述核酸能够通过同源重组与一或多种内源GPR12基因重组；

(c)选择其中的一或多种内源GPR12基因已经与功能失活的GPR12核酸发生同源重组的一或多种细胞。

有利地，本发明的哺乳动物细胞根据本发明上文详述的方法产生。在本发明该方面优选的实施方案中，所述哺乳动物细胞包含在哺乳动物中。即本发明上述方面的细胞优选组成“敲除”哺乳动物。有利地，本发明的敲除哺乳动物是小鼠。

用功能失活的GPR12转染所述一或多种细胞的方法涉及标准分子生物学技术的使用，并在本发明描述。同样地，用于选择其中的一或多种内源GPR12基因已经与功能失活的GPR12核酸发生同源重组的一或多种细胞的方法利用标准实验室技术进行，其在本文描述。

另一方面，本发明提供适于功能灭活宿主细胞中的功能失活的GPR12核酸的核酸构建体，包含：

(a)非同源取代区；

(b)位于所述非同源取代区上游的第一同源区；

(c)突变的GPR12基因，其表达时不编码功能活性GPR12；

(d)位于非同源取代部分的下游的第二同源区，所述第二同源区位于所述非同源取代区下游，其核苷酸序列与第二GPR基因具有至少90％的同一性。

本发明人鉴定了与GPR12相关的数种功能，由此他们认为GPR12多肽，或其一或多种结合蛋白或编码它们的核酸可具有治疗意义。

因此，另一方面，本发明提供了组合物，其包含GPR12多肽，或其一或多种结合蛋白或编码它们的核酸，以及可药用载体、稀释剂或赋形剂。

根据本发明的上述方面，所述组合物有利地包含一或多种GPR12多肽结合蛋白。优选所述一或多种GPR12结合蛋白是GPR12的拮抗剂或激动剂。

GPR12结合蛋白可为天然存在的或合成的。天然存在的结合蛋白可为多肽，诸如本文所述的抗体或核酸。合成GPR12结合蛋白有利地是小分子，并可通过本领域技术人员熟悉的并在本文描述的筛选方法来选出。

在本发明另一实施方案中，优选所述组合物包含编码GPR12结合蛋白或GPR12多肽的核酸。

本发明人吃惊地发现GPR12敲除小鼠与正常对照小鼠相比具有改变的神经元功能。此外，GPR12敲除小鼠具有其它形态学和解剖异常。由此，本发明人认为GPR12的激动剂和/或拮抗剂或包含它们的组合物具体可用于治疗神经疾病。所述神经疾病包括但不限于以下任意一或多种疾病：阿尔茨海默氏症以及相关疾病，帕金森氏症，癫痫和致癫痫疾病，眩晕和晕动症，运动神经元疾病，以及神经元功能障碍疾病，以及疼痛包括感受伤害性疼痛以及痛觉过敏，肝炎，肌肉降解，甲状腺功能减退，胰腺炎或MI，多发性骨髓瘤和糖尿病。

因此，另一方面本发明提供鉴定激动GPR12多肽的功能活性的一或多种分子的方法，包括以下步骤：

(a)选择一或多种哺乳动物，其包含功能失活的GPR12多肽；

(b)用一或多种可能的GPR12类似物处理所述一或多种哺乳动物，所述GPR12类似物可能激动GPR12活性的至少一个方面；

(c)检测根据步骤(b)处理的一或多种哺乳动物，确定所述经处理的哺乳动物与根据步骤(a)选出的哺乳动物相比是否具有一或多种恢复的性质；和

(d)选择所述一或多种GPR12-配体类似物，其使得根据步骤(a)选出的那些哺乳动物恢复野生型哺乳动物的一或多种特征。

本发明提供鉴定拮抗GPR12多肽的功能活性的一或多种分子的方法，包括以下步骤：

(a)选择一或多种哺乳动物，包含功能活性GPR12多肽；

(b)用一或多种可能的GPR12类似物处理所述一或多种哺乳动物，所述GPR12类似物可能拮抗GPR12活性的至少一个方面；

(c)检测根据步骤(b)处理的一或多种哺乳动物，确定所述经处理的哺乳动物与根据步骤(a)选出的哺乳动物相比是否具有一或多种经调节的性质。

此外，本发明提供了转基因GPR12敲除哺乳动物在一或多种化合物的生物效应的测定法中的用途。

根据本发明的上述方面，术语“拮抗剂”指与适宜对照相比如本文定义那样明显抑制GPR12的一或多种功能的分子。

本发明利用GPR12本身，其激动剂和拮抗剂，以及GPR12活性的调节物。本领域技术人员将认识到各种试剂将作用以增加和降低GPR12的效果，并且实现所述效应的途径各异；因此激动剂可模拟活化的GPR12，或结合GPR12并增加其活性；GPR12活性的激动型调节物也如此，并且可增加GPR12的内源激动剂或内源GPR12本身的生成。拮抗剂和拮抗型调节物可起类似作用，但是降低GPR12的生物效应。

根据本发明，术语‘哺乳动物’可以是任何哺乳动物。有利地，所述哺乳动物是非人哺乳动物。优选，所述哺乳动物是任何选自下组的哺乳动物：小鼠，大鼠，豚鼠，兔，仓鼠，沙鼠，猫，狗和猴。本领域技术人员将理解所述列表并非意图穷举。

根据本发明的该方面，术语“治疗”(利用GPR12的有效拮抗剂治疗哺乳动物)指将所述哺乳动物的一或多种细胞(与GPR12的一或多种有效的拮抗剂)接触。

根据本发明上述方面，异常神经特征的指征包括选自下组的任何一种：阿尔茨海默氏症以及相关疾病，帕金森氏症，癫痫和致癫痫疾病，眩晕和晕动症，运动神经元疾病，以及神经元功能障碍疾病，以及疼痛包括感受伤害性疼痛以及痛觉过敏，肝炎，肌肉降解，甲状腺功能减退，胰腺炎或MI，多发性骨髓瘤和糖尿病。

用于检测异常神经元功能的试验利用标准实验室技术，并且是本领域技术人员熟悉的。

有利地，本发明以上方面的步骤(c)包括检测所述一或多种哺乳动物以确定所述哺乳动物是否显示GPR12敲除小鼠显示的一或多种特征。

根据本发明的上述方面，根据步骤(a)选出的一或多种哺乳动物优选是GPR12敲除小鼠。优选它们根据本文所述的方法产生。

如本文所述，术语“功能失活的”(GPR12，通过同源重组)表示与其中GPR12没有被功能失活的对照相比，GPR12多肽在其天然环境(在体内环境中)起作用时，所述多肽正常执行的一或多种功能明显受抑制。优选，术语“功能失活的”指与其中GPR12没有被功能灭活的对照相比，当GPR12在其天然环境中(即在体内环境中)起作用时，一种以上由GPR12正常执行的功能显著受到抑制。更优选，本文术语“功能失活的”指与其中GPR12没有被功能灭活的对照相比，当GPR12在其天然环境中(即在体内环境中)起作用时，所有由GPR12正常执行的功能显著受到抑制。

同样，本文术语“功能灭活的”GPR12核酸编码本文定义的功能失活的GPR12。

如上所述，术语“明显受抑制的”(GPR12功能)指抑制(如上所述，通过的同源重组抑制至少一种GPR12功能)是与适宜的对照相比被抑制至少20％。适宜对照的实例是在相同或相似体内环境中的相同或相似细胞，其中GPR12没有通过如上所述的同源重组而被功能灭活。优选，术语“明显抑制的”(如上所述，通过同源重组抑制哺乳动物细胞中的GPR12功能)指与适宜对照相比，至少一种GPR12功能被抑制至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％。更优选，术语“明显受抑制的”(如上所述，通过同源重组抑制哺乳动物细胞中的GPR12功能)指与适宜对照相比，至少一种GPR12功能被抑制100％。

根据本发明的该方面，术语“治疗”(利用GPR12的有效拮抗剂治疗哺乳动物)指将所述哺乳动物的一或多种细胞(与GPR12的一或多种有效的拮抗剂)接触。

根据本发明的上述方面，术语“野生型哺乳动物的一或多种经调节的特征”指与包含本文所述的功能失活的GPR12多肽的哺乳动物相比，对野生型哺乳动物显示的一或多种特征的调节。优选，所述调节是对丧失的功能的恢复。

如本文所述GPR12类似物，与野生型GPR12的至少一种活性和功能相同。所述类似物可模拟活化的GPR12和可模拟失活的GPR12，使得它们进一步抑制功能，所述功能本身在缺乏天然失活的GPR12时受到抑制。

本发明人考虑GPR12核酸或编码GPR12的一或多种激动剂或拮抗剂的核酸可插入哺乳动物，以产生一或多种治疗效果。

因此另一方面，本发明提供转基因动物，其中的至少部分细胞包含编码一或多种选自下组的物质的外源核酸：GPR12多肽，GPR12多肽的一或多种激动剂和GPR12多肽的一或多种拮抗剂。

有利地，所述转基因动物选自下组：小鼠，人，猪，山羊，鹿，猴和母牛。本领域熟练技术人员将理解所述列表并非意图穷举。

根据本发明的上述方面，术语“外源核酸”指并非源自特定哺乳动物的核酸。然而，其可源自同样的动物类型和品种。例如，转基因小鼠可包含细菌来源的GPR激动核酸。

优选，转基因动物的部分细胞中包含编码GPR12的一或多种激动剂或一或多种拮抗剂的外源DNA。

如本文所述，非人转基因动物可为选自下组的任意一或多种：小鼠，大鼠，猴，狗，猫和猪。本领域技术人员将理解该列表并非意图穷举。

利用根据本发明制备的GPR12敲除小鼠的研究显示，GPR12多肽与神经元功能以及其它疾病相关。所述神经疾病包括但不限于以下疾病中的一或多种：阿尔茨海默氏症以及相关疾病，帕金森氏症，癫痫和致癫痫疾病，眩晕和晕动症，运动神经元疾病，以及神经元功能障碍疾病，以及疼痛包括感受伤害性疼痛以及痛觉过敏，肝炎，肌肉降解，甲状腺功能减退，胰腺炎或MI，多发性骨髓瘤和糖尿病。

因此，另一方面，本发明提供诊断选自下组的疾病或病症的方法：阿尔茨海默氏症以及相关疾病，帕金森氏症，癫痫和致癫痫疾病，眩晕和晕动症，运动神经元疾病，以及神经元功能障碍疾病，以及疼痛包括感受伤害性疼痛以及痛觉过敏，肝炎，肌肉降解，甲状腺功能减退，胰腺炎或MI，多发性骨髓瘤和糖尿病，包括以下步骤：

(a)选择来自待诊断患者的细胞样品；和

(b)比较细胞样品与一或多种来自健康个体的对照样品中的GPR12多肽的表达水平和/或功能活性。

另一实施方案中，GPR12及其天然配体中的多态性可用于诊断疾病。因此，本发明提供用于诊断选自下组的疾病或病症：阿尔茨海默氏症以及相关疾病，帕金森氏症，癫痫和致癫痫疾病，眩晕和晕动症，运动神经元疾病，以及神经元功能障碍疾病，以及疼痛包括感受伤害性疼痛以及痛觉过敏，肝炎，肌肉降解，甲状腺功能减退，胰腺炎或MI，多发性骨髓瘤和糖尿病，包括以下步骤：

(a)选择来自待诊断患者的细胞样品；和

(b)分析所述细胞中的内源基因以检测所述内源GPR12基因或GPR12的一或多种天然配体中的多态性。

根据本发明上述方面，其中GPR12的表达水平或功能活性增加，降低或改变，或其中GPR12核酸或编码GPR12配体的核酸与一或多种来自健康个体的对照样品相比包含一或多种多态性，表明自其获得样品的个体患有上述疾病中的任何一或多种。

根据本发明上述方面，利用标准实验室技术的获自患者的细胞样品，所述技术是本领域技术人员熟悉的。

如上所述，GPR12多肽的“功能活性”指GPR12在其天然环境即在其细胞中通常发挥的功能。

另一方面，本发明提供了GPR12的一或多种激动剂或拮抗剂在制备用于预防或治疗患者中选自下组的疾病或病症的药物中的用途：阿尔茨海默氏症以及相关疾病，帕金森氏症，癫痫和致癫痫疾病，眩晕和晕动症，运动神经元疾病，以及神经元功能障碍疾病，以及疼痛包括感受伤害性疼痛以及痛觉过敏，肝炎，肌肉降解，甲状腺功能减退，胰腺炎或MI，多发性骨髓瘤和糖尿病。

附图简述

图1显示GPR12敲除以前小鼠GPR12的基因组基因座结构。

图2显示GPR12敲除以后小鼠GPR12的基因组基因座结构。

图3显示用于GPR12的同源重组的靶向型载体的结构，包括相关限制位点。

图4显示利用PCR以及电子Northern的GPCR12的基因表达模式。

图5显示雄性敲除小鼠在rotarod测验中的表现。

图6显示步态评估的结果；突变体在左道，野生型在右道。

图7从5’探针FII-3’探针R1的基因组基因座。

图8显示雄性敲除小鼠在摆尾(tail flick)试验中的评估结果(-/-敲除，+/+野生型对照)。

图9显示雄性敲除小鼠在热板试验(hot plate test)中的评估结果。

图10显示水迷宫试验(watermaze test)中的评估结果(野生型空心方块；敲除小鼠实心圆圈)。

图11a显示小鼠攀爬过夜持续时间(climbing duration overnight)的Laboras评估(野生型用X表示；敲除小鼠用实心三角表示)；图11b显示小鼠攀爬过夜频率的Laboras评估(野生型用X表示；敲除小鼠用实心三角表示)。

图12显示敲除小鼠中肌酐激酶的评估结果(1.野生型雌性3月龄；2.敲除(KO)雌性3月龄；3.野生型雌性9月龄；4.敲除(KO)雌性9月龄；5.野生型雄性3月龄；6.敲除(KO)雄性3月龄；7.野生型雄性9月龄；8.敲除(KO)雌性9月龄。

发明详述

常规技术

本发明的实施将采用，除非另有说明，常规化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的技术，其是本领域技术人员能力范围之内的。所述技术的解释见文献。参见例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Books 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.et al.(1995 and periodicsupplements；Current Protocols in Molecular Biology，ch.9，13，and 16，JohnWiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，and A.Kahn，1996，DNAIsolation and Sequencing：Essential Techniques，John Wiley & Sons；J.M.Polak and James O’D.McGee，1990，In Situ Hybridization：Principles andPractice；Oxford University Press；M.J.Gait(Editor)，1984，OligonucleotideSynthesis：A Practical Approach，Irl Press；D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis and PhysicalAnalysis of DNA Methods in Enzymology，Academic Press；Using Antibodies：A Laboratory Manual：Portable Protocol NO.I by Edward Harlow，David Lane，Ed Harlow(1999，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies：A Laboratory Manual by Ed Harlow(Editor)，David Lane(Editor)(1988，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-314-2)，1855，Lars-Inge Larsson“Immunocytochemistry：Theory and Practice”，CRC Pressinc.，Baca raton，Florida，1988，ISBN 0-8493-6078-1，John D.Pound(ed)；“Immunochemical Protocols，vol 80”，in the series：“Methods in MolecularBiology”，Humana Press，Totowa，New Jersey，1998，ISBN 0-89603-493-3，Handbook of Drug Screening，edited by Ramakrishna Seethala，Prabhavathi B.Femandes(2001，New York，NY，Marcel Dekker，ISBN 0-8247-0562-9)；LabRef：A Handbook of Recipes，Reagents，and Other Reference Tools for Use atthe Bench，Edited Jane Roskams and Linda Rodgers，2002，Cold Spring HarborLaboratory，ISBN 0-87969-630-3；and The Merck Manual of Diagnosis andTherapy(17th Edition，Beers，M.H.，and Berkow，R，Eds，ISBN：0911910107，John Wiley & Sons)。每篇文献都包含在本文作为参考。

GPR12多肽

本文术语“多肽”指任何肽或部分，其包含两或多个氨基酸，它们通过肽键或修饰的肽键即肽等排体互相连接。“多肽”指短链，通常指肽，寡肽或寡聚体，通常指蛋白质。多肽可包含除所述20种基因编码的氨基酸以外的氨基酸。

“多肽”包括通过天然过程诸如翻译后加工或通过本领域已知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。所述修饰在基础教科书种较好地描述，并在专论中更为详细地描述，以及在大量研究文献中也有描述。修饰可出现在多肽中的任何位置，包括肽主链，氨基酸侧链，以及氨基或羧基末端。将理解同种类型的修饰可以相同或不同程度存在给定多肽中的数个位点。同样，给定的多肽也含有许多类型的修饰。

作为泛化的结果，多肽可以是分支状的(遍在蛋白化的结果)，可以是环形的，有或无分支。环形、分支状及分支环形多肽可以得自翻译后的天然加工或者可用合成方法来制备。所述修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、生物素化、共价连接黄素、共价连接亚铁血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂类或脂类衍生物、共价连接磷脂酸肌醇(phosphotidylinositol)、交联、环化、形成二硫键、去甲基化、生成共价交联、生成胱氨酸、生成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚定形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白酶处理、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒代化(selenoylation)、磺化、转运-RNA介导的蛋白添加氨基酸如精氨酸化，以及遍在蛋白化。见例如，Proteins-Structure andMolecular Properties，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993 and Wold，F.，Posttranslational Protein Modifications：Perspectives and Prospects，pgs.1-12 in Posttranslational CovalentModification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，1983；Seifter，et al.，“Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors”，Meth Enzymol(1990)182：626-646 and Rattan，et al.，“Protein Synthesis：Posttranslational Modifications and Aging”，Ann NY Acad Sci(1992)663：48-62。

本发明术语“变体”，“同源物”，“衍生物”或“片段”指来自序列或对序列的任何一或多个氨基酸取代，改变，修饰，置换，缺失或添加。除非另有说明，参见“GPR12”以及GPR12的变体，同源物，衍生物和片段。

当参照受体诸如GPR12的“受体活性”或受体的“生物活性”时，这些术语意图指GPR12受体的代谢或生理功能，包括相似的活性或改良的活性或与降低的不良副作用相关的活性。还包括GPR12受体的抗原或免疫原活性。GPCR活性的实例以及检测和定量这些活性的方法是本领域已知的，并在本发明其它部分详述。

术语“缺失”定义为核苷酸和氨基酸序列的改变，其中一或多个核苷酸和氨基酸残基分别缺失。本文术语“插入”和“添加”指核苷酸和氨基酸序列的改变，其导致与天然存在的物质相比，一或多个核苷酸或氨基酸残基的添加。本文术语“取代”是一或多种核苷酸或氨基酸分别被不同的核苷酸或氨基酸取代的结果。

本发明的GPR12多肽也可具有氨基酸的缺失，插入或取代，其在功能等同的氨基酸序列中产生沉默改变并导致功能对等的氨基酸序列。有意的氨基酸可基于残基的极性，电荷，溶解性，疏水性，亲水性和/和两亲性的相似性进行。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸残基包括赖氨酸和精氨酸，以及具有非带电急性头基团的氨基酸具有相似的疏水值包括亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，甘氨酸，丙氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苯丙氨酸以及酪氨酸。

GPR12核苷酸和多核苷酸

“多核苷酸”通常是指任意多核糖核酸(RNA)或多脱氧核糖核酸(DNA)，可以是未经修饰的或者修饰后的RNA或DNA。“多核苷酸”包括，但不限于，单链及双链DNA，DNA为单链和双链区的混合体，单链及双链RNA，以及由单链和双链区形成的RNA混合体，包含DNA和RNA的杂合分子，所述DNA和RNA可以是单链或更通常为双链或者单链及双链区的混合体。此外，“多核苷酸”是指三链区，包含RNA或DNA或者同时包含二者。术语“多核苷酸”还包括含1个或多个经修饰的碱基的DNA或RNA以及为稳定或其他原因对骨架修饰后的DNAs或RNA。“经修饰的”碱基包括，例如三苯甲基化的(tritylated)碱基以及肌苷(inosine)等非常见碱基。可对DNA及RNA作多种修饰；因此“多核苷酸”包括自然界中常见的多核苷酸的化学、酶促或代谢方式修饰的形式，以及以病毒及细胞为特征的化学形式DNA及RNA。“多核苷酸″还包括相对短的多核苷酸，通常称为寡核苷酸。

本领域技术人员应理解多种核苷酸序列可编码相同的多肽，这是遗传密码简并性的结果。

本文术语“核苷酸序列”指核苷酸序列，寡核苷酸序列，多核苷酸序列以及其变体，同源物，片段和衍生物(诸如其部分)。核苷酸序列可以是基因组或合成或重组来源的DNA或RNA，其可为双链和单链的，而无论其代表有义或是反义链或其组合。术语核苷酸序列可通过利用重组DNA技术制备(例如重组DNA)。

优选，术语“核苷酸序列”指DNA。

本发明术语“变体”，“同源物”，“衍生物”或“片段”包括来自或对GPR12核苷酸序列的一(或多个)核酸的任何取代，改变，修饰，置换，缺失或添加。除非另有说明，参照“GPR12”和“GPR12”包括参照GPR12的所述变体，同源物，衍生物和片段。

GPR12的表达测定法

为了设计用于治疗GPR12相关疾病的有用治疗剂，确定GPR12(无论是野生型和特定的突变体)的表达图谱是有用的。因此，本领域已知的方法可用于确定器官，组织和细胞类型(以及发育阶段)，其中表达有GPR12。例如，可进行常规和“电子”Northern。反转录酶PCR(RT-PCR)也可用于检测GPR12基因或突变体的表达。测定GPR12的表达图谱的更为敏感的方法包括RNAse保护试验，如本领域已知那样。

Northern分析是实验室技术，用于检测基因转录物的存在，涉及使标记的核苷酸序列与膜的杂交，所述膜上结合有来自具体细胞类型和组织的RNA。(Sambrook，supra，ch.7 and Ausubel，F.M.，et al.supra，ch.4 and 16.)利用BLAST的类似计算机技术(“电子Northern”)可用于在核苷酸数据库诸如GenBank和LIFESEQ数据库(Incyte Pharmaceuticals)中搜索相同和相关的分子。这种类型的分析的优势在于它们比基于膜的多重杂交更快。此外，计算机搜索的敏感性可被修饰以确定是否任何具体的匹配被分类为准确或同源。

本发明的多核苷酸和多肽，包括上述探针，可用作研究试剂以及物质，用于发现对动物和人疾病的治疗和诊断，如本发明文件中其它部分详述的。

GPR12多肽的表达

GPR12多肽的表达是GPR12抗体的产生所需的，所述抗体可作为本文所述的GPR12的激动剂和拮抗剂其作用。

为了表达生物活性GPR12多肽，编码GPR12的核苷酸序列或其类似物，变体或衍生物可被插入适宜的表达载体，即含有所插入的编码序列的转录和翻译所需的必要元件。

本领域技术人员已知的方法被用于构建含有编码GPR12和适宜转录以及翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术，以及体内基因重组。所述技术描述于Sambrook，J.，et al.，(1989；MolecularCloning，A Laboratory Manual，ch.4，8，and 16-17，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.)and Ausubel，F.M.，et al.，(1995 and periodic supplements；Current Protocols in Molecular Biology，ch.9，13，and 16，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)。

各种表达载体/宿主系统可用于含有并表达编码GPR12的序列。这些包括，但不限于，微生物，诸如用重组噬菌体，质粒和粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体转化的植物细胞系统(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)或烟草花叶病毒(TMV))或利用细菌表达载体(例如TiorpBR322质粒)；或动物细胞系统。本发明不受所用宿主细胞的限制。

“控制元件”或“调控序列”是载体的未翻译的区域(即增强子，启动子，5’和3’未翻译区)，其与宿主细胞蛋白作用以执行转录和翻译。所述元件的长度和特异性不同。根据所用的载体系统和宿主，任何数目的适宜转录和翻译元件，包括组成型和可诱导型转录和翻译启动子，可以使用。例如，当在细菌系统中克隆时，诱导型启动子诸如BLUESCRIPT噬粒(Stratagene，La Jolla，Calif.)或PSPorT1质粒(GIBCO/BRL)的杂合lacZ启动子等可以使用。杆状病毒多角体蛋白启动子可用于昆虫细胞。源自植物细胞基因组的启动子或增强子(例如热休克，RUBISCO，和储藏蛋白基因)或来自植物病毒的(例如病毒启动子或前导序列)可克隆入所述载体。在哺乳动物细胞系统中，来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子是优选的。如果需要产生含有多个拷贝的GPR12多肽编码序列的细胞系，基于SV40或EBV的载体可与适当的选择标记一起使用。

在细菌系统中，多种表达载体可根据对于GPR12多肽的目的用途来选择。例如，当需要大量GPR12多肽以诱导抗体时，可以使用指导可轻易纯化的融合蛋白的高水平表达的载体。所述载体包括，但不限于，多功能大肠杆菌克隆和表达载体诸如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中编码GPR12多肽的序列被连入载体，与氨基末端Met序列以及随后的β-半乳糖苷酶的7个残基相连，使得产生杂合蛋白，pIN载体(Van Heeke，G.and S.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.264：5503-5509)等。pGEX载体(Promega，Madison，Wis.)也可用于表达异源多肽作为与谷胱苷肽S转移酶(GST)的融合蛋白。通常，所述融合蛋白可溶并可通过吸附于谷胱苷肽-琼脂糖珠从裂解的细胞轻易纯化，然后在游离谷胱苷肽存在下洗脱。在所述系统中制备的蛋白可设计成包含肝素，凝血酶，或因子XA蛋白酶裂解位点，使得目的克隆的多肽可从GST部分随意释放。

在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，多种含有构成型或诱导型启动子的载体，诸如alpha因子，乙醇氧化酶，和PGH可以使用。综述参见Ausubel(supra)和Grant et al.(1987；Methods Enzymol.153：516-544)。

使用植物表达载体的情况下，GPR12多肽编码序列的表达可通过多种启动子中的任何启动子驱动。例如，病毒启动子诸如CaMV 35S和19S启动子可单独使用或与来自TMV的omega前导序列联用。(Takamatsu，N.(1987)EMBO J.6：307-311.)可选，可以使用植物启动子诸如RUBISCO小亚基或热休克启动子。(Coruzzi，G.et al.(1984)EMBO J.3：1671-1680；Broglie，R.，et al.，(1984)Science 224：838-843；and Winter，J.，et al.，(1991)ResultsProbl.Cell Differ.17：85-105.)这些构建体可通过直接DNA转化或病原介导的转染而被导入植物细胞。所述技术在多种常规可得的综述中描述。(See，forexample，Hobbs，S.or Murry，L E.in McGraw Hill Yearbook of Science andTechnology(1992)McGraw Hill，New York，N.Y.；pp.191-196.)。

昆虫系统也可用于表达GPR12多肽。例如，一种所述系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa califomica nuclear polyhedrosisvirus)(AcNPV)用作载体在秋粘虫(Spodoptera frugiperd)细胞或拟尺蠖幼虫(Trichoplusia larvae)中表达外来基因。编码GPR12的序列可被克隆入病毒的非必需区域，诸如多角体蛋白基因，并置于多角体蛋白启动子的控制之下。将GPR12多肽成功插入将使得多角体蛋白基因失活，并产生缺乏包膜蛋白的重组病毒。所述重组病毒随后可用于感染例如秋粘虫细胞或拟尺蠖幼虫，其中表达有GPR12多肽。(Engelhard，E.K.，et al.，(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.91：3224-3227.)

在哺乳动物宿主细胞中，多种基于病毒的表达系统可以使用。如果使用腺病毒作为表达载体，编码GPR12多肽的序列可连入腺病毒转录/翻译复合体，其由晚期启动子和三分前导序列组成。插入病毒基因组的非必需E1或E3区可用于获得能在感染的宿主细胞中表达GPR12多肽的存活病毒。(Logan，J.and T.Shenk(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81：3655-3659.)此外，转录增强子，诸如劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子，可用于增强在哺乳动物宿主细胞中的表达。

人类人工染色体(HAC)也可用于递送大于质粒中所包含并表达的DNA片段的较大DNA片段。约6kb-10Mb的HAC被构建并经由常规递送方法递送(脂质体，多聚阳离子氨基聚合物或小泡)用于治疗目的。

具体起始信号也可用于实现GPR12多肽编码序列的更为有效的翻译。所述信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在编码GPR12多肽的序列及其起始密码子以及上游序列被插入适宜表达载体中的情况下，无需其它转录和翻译对照信号。然而，在仅仅插入编码序列或其片段的情况下，外源翻译控制序列包括ATG起始密码子应被提供。此外，起始密码子应当位于正确的读框中以保证完整插入物的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以是各种来源的，包括天然和合成的。表达效率可通过包含适于所用具体细胞系统的增强子而得以增强，诸如文献中描述的那些。(Scharf，D.，et al.，(1994)Results Probl.Cell Differ.20：125-162.)。

此外，可根据宿主细胞株调节插入序列的表达或以所需方式加工所表达的蛋白的能力来选择。多肽的所述修饰包括，但不限于，乙酰化，羧化，糖基化，磷酸化，脂质化，和酰化。切割“前原”形式的蛋白质的翻译后加工也可用于促进正确的插入，折叠，和/或功能。具有特异性细胞机制和翻译后活性的特征机制的不同宿主细胞(例如CHO，HeLa，MDCK，HEK293，和WI38)，可得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Bethesda，Md.)并可被选择用于保证对外来蛋白的正确修饰和加工。

对于长期、高产量的重组蛋白制备，稳定的表达是优选的。例如，能够稳定表达GPR12 GPCR的细胞系可利用表达载体转化，其中含有病毒复制起点和/或内源表达元件以及选择标记基因，它们位于相同或分离的载体上。导入所述载体之后，允许细胞在富集的培养基中生长约1-2天，然后转移到选择培养基。可选择标记的目的是赋予对选择的抗性，其存在允许成功表达导入的序列的细胞的生长和回收。稳定转化的细胞的抗性克隆可利用适于该细胞类型的组织培养技术增殖。

任何数目的选择系统可用于回收转化的细胞系。这些包括，但不限于，单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因(Wigler，M.et al.(1977)Cell 11：223-32)和腺苷酸磷酸核糖基转移酶基因(Lowy，I.，et al.，(1980)Cell 22：817-23)，其可分别用于tk^-或apr^-细胞中。此外，抗代谢物，抗生素或除莠剂抗性可用作选择的基础。例如，dhfr赋予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler，M.，et al.，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.77：3567-70)；npt赋予对氨基糖苷类新霉素和G-418的抗性(Colbere-Garapin，F.，et al.，(1981)J.Mol.Biol.150：1-14)；和als和pat分别赋予对氯磺隆(chlorsulfuron)和草铵膦(phosphinotricin)乙酰转移酶的抗性(Murry，supra).也描述了其它选择性基因，例如，trpB，其允许细胞利用吲哚取代色氨酸，或hisD，其允许细胞利用组氨醇(histinol)取代组氨酸。(Hartman，S.C.and R.C.Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：8047-51.)最近，可见(visible)标记物的利用获得了普及，利用诸如花青苷，β-葡糖醛酸酶及其底物GUS，和萤光素酶及其底物虫萤光素。这些标记物不仅可用于鉴定转化物，也可用于定量由于具体载体系统导致的瞬时或稳定的蛋白表达(Rhodes，C.A.，et al.，(1995)Methods Mol.Biol.55：121-131.)。

尽管标记基因表达的存在/缺失提示目的基因也存在，所述基因的存在和表达可能需要被证实。例如，如果编码GPR12多肽的序列被插入标记基因序列中，含有GPR12多肽的编码序列的经转化的细胞可通过缺乏标记基因功能而得以鉴定。

可选，标记基因可与GPR12多肽编码序列串联，并在单个启动子的控制之下。标记基因应答于诱导和选择的表达通常也指示串联的基因的表达。

可选，含有编码GPR12多肽的核酸序列并表达GPR12的宿主细胞可通过本领域已知的多种方法鉴定。这些方法包括，但不限于，DNA-DNA或DNA-RNA杂交以及蛋白生物测定或免疫测定技术，其包括基于膜，溶液，或芯片的技术，用于检测和/和定量核酸和蛋白序列。

编码GPR12多肽的多核苷酸序列的存在可通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交检测或利用探针或编码GPR12 GPCR的多核苷酸的片段来扩增。基于核酸扩增的测定法涉及利用寡核苷酸或寡聚物，基于编码GPR12多肽的序列以检测含有编码GPR12的DNA或RNA的转化体。

多种用于检测和测定GPR12表达的方案，其利用蛋白特异性多克隆或单克隆抗体，是本领域已知的。所述技术的实例包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)，放射免疫测定法(RIA)，以及荧光活化的细胞分选(FACS)。利用对GPR12上的两个非干扰型表位反应的单克隆抗体的双位点型、基于单克隆的免疫测定法是优选的，但是也可采用竞争结合试验。这些和其它测定法在本领域较好地描述，例如在Hampton，R.et al.(1990；Serological Methods，aLaboratory Manual，Section IV，APS Press，St Paul，Minn.)和Maddox，D.E.，etal.，(1983；J.Exp.Med.158：1211-1216)中。

多种标记和偶联技术是本领域已知的，并可用于各种核酸和氨基酸测定法中。产生标记的杂交和PCR探针以检测与编码GPR12的多核苷酸相关的序列的手段包括寡标记(oligolabelling)，缺口翻译(nick translation)，末端标记(end-labelling)，或利用标记的核苷酸的PCR扩增。可选，编码GPR12的序列或其片段可克隆入载体用于产生mRNA探针。所述载体是本领域已知的，并且可购得，并通过加入适宜的RNA聚合酶诸如T7，T3，或SP6以及标记的核苷酸可用于在体外合成RNA探针。这些方法可利用多种可购得的试剂盒进行，诸如Pharmacia & Upjohn(Kalamazoo，Mich.)，Promega(Madison，Wis.)，and U.S.Biochemical Corp.(Cleveland，Ohio)提供的那些。可用于易化检测的适宜的报道分子或标记包括放射性核素，酶，荧光物质，化学荧光物质，或发色物质，以及底物，辅因子，抑制物，磁性颗粒等。

用编码GPR12的核苷酸序列转化的宿主细胞可在适于从细胞培养物表达并回收蛋白的条件下培养。经转化的细胞产生的蛋白可位于细胞膜内，被分泌或包含在细胞内，根据序列和/和所用载体而定。本领域技术人员理解，含有编码GPR12的多核苷酸的表达载体被设计为包含信号序列，其指导GPR12通过原核或真核细胞膜的分泌。其它结构可用于将GPR12的编码序列连接于编码促进可溶蛋白的纯化的多肽结构域的核苷酸序列。所述纯化促进结构域包括，但不限于，金属鳌合肽，诸如组氨酸-色氨酸模块，其允许在固定的金属上的纯化，以及允许在固定的免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域，以及用于FLAGS延伸/亲和纯化系统中的结构域(Immunex Corp.，Seattle，Wash.)。可裂解接头序列，诸如对因子XA和肠激酶特异的那些(Invitrogen，San Diego，Calif.)包含在纯化结构域和GPR12 GPCR编码序列之间可用于促进纯化。一种所述的表达载体提供含有GPR12以及编码硫氧还蛋白或肠激酶裂解位点前的6组氨酸残基的融合蛋白的表达。所述组氨酸残基促进在固定的金属离子亲和层析上的纯化(IMIAC；described in Po大鼠h，J.，et al.，(1992)Prot.Exp.Purif.3：263-281)，肠激酶裂解位点提供从融合蛋白纯化GPR12的方法。含有融合蛋白的载体的讨论见Kroll，D.J.，et al.，(1993；DNA Cell Biol.12：441-453)。

GPR12的片段不仅可以通过重组制备产生，也可以通过直接肽合成利用固相技术制备。(Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154.)蛋白合成可通过人工技术或自动化进行。自动化的合成可例如利用AppliedBiosystems 431A肽合成仪进行(Perkin Elmer)。GPR12的各种片段可分别合成，然后组合以产生全长分子。

转基因动物

(a)敲除

本发明的另一方面，提供了GPR12敲除哺乳动物，其包含一或多种细胞，其中GPR12多肽是功能失活的。

本发明的GPR12敲除动物可作为GPR12基因或该基因的任何部分的功能破坏的结果产生，包括GPR12基因的一或多种功能丧失型突变，包括GPR12基因的缺失或取代。所述突变包括单点突变，并可靶向GPR12的编码或非编码区。

优选，所述敲除动物是非人哺乳动物，诸如猪，绵羊或啮齿类动物。最优选所述敲除动物是小鼠或大鼠。所述敲除动物可用于筛选方法中以鉴定GPR12的激动剂和/或拮抗剂，以及检测它们作为体内疾病疗法的效力。

例如，经改造GPR12产生缺乏的敲除动物可用于试验中以鉴定GPR12的激动剂和/或拮抗剂。一种试验被设计为评估潜在的药物(候选配体或化合物)以确定其是否在缺乏GPR12受体的条件下产生生理反应。这可通过将药物给予上述敲除动物来实现，然后测定所述动物的特定反应。任何生理参数可以这种方式测定。

源自GPR12敲除动物的组织可用于受体结合实验中以测定潜在的药物(候选配体或化合物)是否与GPR12受体结合。所述试验可通过从经改造GPR12受体生成缺乏的敲除动物获得第一受体制备物以及从已知结合任何鉴定的GPR12配体或化合物获得第二受体制备物来进行。通常，所述第一和第二制备物在所有方面都类似除外它们的来源。例如，如果在实验中使用来自敲除动物(诸如上下文所述的)的脑组织，来自正常(野生型)动物的可比脑组织也可用作第二受体制备物的来源。每种受体制备物与已知结合GPR12受体的配体一起，在单独或存在候选配体或化合物的条件下保温。优选，所述候选配体或化合物将在多种浓度进行检测。

对于第一和第二受体制备物，测定已知配体的结合被受试化合物取代的程度。来自敲除动物的组织可直接用于试验或所述组织可被加工以分离膜或膜蛋白，其本身用于所述试验。优选的敲除动物是小鼠。所述配体可利用任何适于结合试验的手段标记。这将包括，但不限于，放射活性标记，酶促标记，荧光标记或化学发光标记(以及下文进一步详述的其它标记技术)。

此外，GPR12受体的拮抗剂可通过将候选化合物等给予表达有功能的GPR12的野生型动物以及被鉴定为显示任何与GPR12受体功能的表达的降低或消除相关的表型特征的动物来鉴定。

非人敲除动物的产生方法在下文更为详细的描述。转基因构建体可被导入动物的生殖细胞系以制备敲除哺乳动物。例如，所述构建体的一个或多个拷贝可通过标准转基因技术掺入哺乳动物胚胎的基因组。

在示例性实施方案中，本发明的敲除非人动物通过将转基因导入非人动物的生殖系来制备。各种发育阶段的胚胎靶细胞可用于导入转基因。根据胚胎靶细胞的发育阶段可采用不同方法。选择用于实施本发明的任何动物的具体细胞系根据该动物总体健康状况好，胚胎生长良好，胚胎内的原核(pronuclear)可见性好，以及生殖健康良好来选择。此外，单体型是明显的因素。

将转基因导入胚胎可通过本领域已知的任何方法实现，诸如显微注射，电穿孔或脂质转染。例如，GPR12受体转基因可通过以下方法导入哺乳动物：将所述构建体显微注射到受精的哺乳动物卵中导致所述构建体的一或多个拷贝被保持在发育中的哺乳动物细胞内。将转基因构建体导入受精卵之后，所述卵可在体外保温不同时间，和/或再植入代理宿主。体外保温到成熟是本领域范围之内的。一种常规方法是在体外保温所述胚胎约1-7天，根据物种而不同，然后将它们再植入代理宿主中。

可通过对组织片段的Southern印迹分析来检测转基因操作的胚胎的子代中所述构建体的存在。如果外源克隆的构建体的一或多个拷贝保持整合入所述敲除胚胎的基因组，可能确定携带转基因添加的构建体的永久敲除哺乳动物系。

敲除改变的哺乳动物的幼崽可在出生后检测所述构建体向后代基因组中的掺入。优选，该实验通过使对应编码所需重组蛋白产物或其片段的DNA序列的探针杂交到来自子代的染色体物质上来实现。发现基因组中含有至少一个拷贝的所述构建体的那些哺乳动物子代生长至成熟。

为了本发明的目的，受精卵主要是双倍体细胞的形成，其能够发育成完整的生物体。通常，受精卵由含有天然或人工形成的细胞核组成，通过将来自一或多个配子的两个单倍体细胞核进行融合。因此，配子细胞核必需是能天然相容的，即产生能够进行分化并发育成有功能的生物体的存活合子的那些。通常，整倍体合子是优选的。如果获得非整倍体合子，染色体的数目变化就配子来源的生物体的整倍体数目而言应不超过1个。

除了类似的生物考虑，物理因素也控制可加入合子细胞核或形成部分合子细胞核的遗传物质的外源遗传物质的量(例如体积)。如果没有去除遗传物质，可加入的外源遗传物质的量受到将被吸收而不被物理破坏的量的限制。通常，插入的外源遗传物质的体积将不超过约10皮升。加入的物理效应必需不大到物理破坏所述合子的生存力的程度。DNA序列的数量和品种的生物限制将根据具体的合子以及所述外源遗传物质的功能而不同，并且对于本领域技术人员而言是显而易见的，这是由于产生的合子的遗传物质，包括外源遗传物质，必需在生物上能够启动并保持合子分化并发育成功能生物体。

加入合子的转基因构建体的拷贝数量有赖于加入的外源遗传物质的总量，并将是能够使得遗传转化发生的量。理论上，仅仅需要一个拷贝；然而，通常利用多个拷贝，例如1,000-20,000个拷贝的转基因构建体，以保证一个拷贝是有功能的。根据本发明，通常每种插入的外源DNA序列具有超过一个的功能拷贝对于增强外源DNA序列的表型表达是有利的。

允许加入外源遗传物质到细胞核遗传物质中的任何技术可被利用，只要其对细胞，细胞核膜和其它存在的细胞或遗传结构没有破坏性。所述外源遗传物质优选通过显微注射被插入核遗传物质。细胞和细胞结构的显微注射是已知的并可用于本领域。

再植入利用标准方法实施。通常，代理宿主被麻醉，将胚胎插入输卵管。插入具体宿主的胚胎的数量根据不同物种而不同，但通常与所述物种天然产生的后代数目相当。

可通过任何适宜方法筛选代理宿主的敲除后代中的转基因的存在和/或表达。筛选通常通过Southern和Nothern印迹分析，利用与该转基因的至少一部分互补的探针实施。利用针对所述转基因编码的蛋白的抗体的Western印迹分析可作为筛选所述转基因产物的存在的可选或其它方法。通常，DNA自尾组织制备，并通过Southern分析或PCR来分析所述转基因。可选，据信表达所述转基因水平最高的组织和细胞利用Southern分析和PCR检测所述转基因的存在或表达，但是任何组织或细胞类型可用于该分析。

用于评估所述转基因存在的可选或其它方法包括，但不限于，适宜的生物化学测定法诸如酶和/或免疫测定法，针对具体标记物或酶活性的组织学染色，流式细胞分析等。血液的分析也可用于检测转基因产物在血液中的存在，以及评估所述转基因对各种类型的血细胞以及其它血液成分的水平的影响。

逆转录病毒感染也可用于将转基因导入非人动物。发育中的非人胚胎可在体外培养到胚泡阶段。在该时期内，分裂球可用作逆转录病毒感染的靶(Jaenich，R.(1976)PNAS 73：1260-1264)。分裂球的有效感染通过酶处理去除透明带(zona pellucida)获得(Manipulating the Rat Embryo，Hogan eds.(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1986)。可用于将转基因导入的病毒感染系统通常是携带所述转基因的、复制缺陷型逆转录病毒(Jahner et al.(1985)PNAS 82：6927-6931；Van der Putten et al.(1985)PNAS82：6148-6152)。转染可通过在病毒生成细胞的单层上培养分裂球轻易且有效地获得(Van der Putten，supra；Stewart，et al.，(1987)EMBO J.6：383-388)。可选，感染可在以后的阶段进行。病毒或病毒生成细胞可被注入囊胚腔(Jahner.，et al.，(1982)Nature 298：623-628)。大多数初始动物对于转基因而言是嵌合的，这是由于掺入仅仅在形成转基因非人动物的细胞亚组中出现。此外，初始动物可含有多种在基因组不同位置的转基因逆转录病毒插入物，其通常将在子代中分离。此外，也可能通过子宫内逆转录感染孕中期胚胎而将转基因导入生殖细胞系(Jahner.，et al.，(1982)见上文)。

第三种类型的转基因导入用靶细胞是胚胎干细胞(ES)。ES细胞可获自培养在体外的植入前的胚胎并与胚胎融合(Evans.，et al.，(1981)Nature292：154-156；Bradley.，et al.，(1984)Nature 309：255-258；Gossler.，et al.，(1986)PNAS 83：9065-9069；and Robertson，.et al.，(1986)Nature 322：445-448)。转基因可通过DNA转染或逆转录病毒介导的转导有效导入ES细胞。所述转化的ES细胞此后可与来自非人动物的胚泡结合。随后，ES细胞定植在胚胎并对产生的嵌合动物的生殖系有贡献。综述参见Jaenisch，R.(1988)Science240：1468-1474。

本发明还涉及用于功能破坏宿主细胞中的GPR12基因的核酸构建体。所述核酸构建体包括：a)非同源取代部分；b)所述非同源取代部分上游的第一同源区，具有与第一GPR12基因序列基本相同一的核苷酸序列的第一同源区；和c)位于该非同源取代部分下游的第二同源区，具有与第二GPR12基因序列基本相同的核苷酸序列的第二同源区，所述第二GPR12基因序列具有位于天然存在的内源GPR12基因中的第一GPR12基因序列的下游的位置。此外，当核酸分子被导入宿主细胞时，所述第一和第二同源区长度足以使得在核酸构建体与该宿主细胞的内源GPR12基因之间进行同源重组。优选实施方案中，非同源取代部分包含表达报道物，优选包括lacZ和阳性选择表达盒，优选包括新霉素磷酸转移酶基因，其可操作连接于调节元件。

GPR12 GPCR缺陷转基因动物可通过以下方法产生：

(a)GPR12基因靶向型载体的构建

小鼠GPR12基因组克隆分离自获自HGMP(Hinxton，UK)的小鼠大插入物PAC文库，所述分离利用自部分预测的小鼠开放读框cDAN序列(SEQ IDNO：4)扩增的探针序列，利用标准技术进行。分离的小鼠GPR12基因组克隆随后利用小寡核苷酸探针和标准技术在GPR12基因的区域中限制作图。

对小鼠基因组基因座进行部分测序使得能够设计同源臂以克隆入靶向型载体。DNA的两个区域(通常大小为1-5kb，从待缺失开放读框的区域的任何一侧起)，称为5’和3’同源臂，通过PCR扩增并克隆入靶向型载体。这些臂的位置被选择为使得同源重组事件将通过缺失至少七个跨膜横跨(spanning)区域来功能破坏GPR12基因。制备靶向型载体，其中缺失的GPR12序列被非同源序列取代，所述非同源序列由选择盒上游的内源基因表达报道物(框-独立的LacZ基因)启动的新霉素磷酸转移酶(neo)基因组成，所述非同源序列以与GPR12基因相同的方向排列。

(b)胚胎干细胞的转染和分析

胚胎干细胞(Evans and Kaufman，1981)培养在新霉素抗性胚胎纤维母细胞培养层上，生长于Dulbecco’s改良的Eagles培养基中，所述培养基中补充有20％胎牛血清，10％新生牛血清，2mM谷氨酰胺，非必需氨基酸，100μM 2-巯基乙醇和500u/ml白血病抑制因子。培养基每天更换，ES细胞每三天传代一次。5×10⁶ES细胞用5μg线性化的质粒通过电穿孔(25μF电容(capacitance)和400伏特)转染。电穿孔24小时以后，转染的细胞在培养基中培养9天，所述培养基含有200μg/ml新霉素。将克隆挑入96孔板，用PCR筛选之前进行复制和扩增，以鉴定其中在内源GPR12基因和靶向型构建体之间发生了同源重组的克隆。所鉴定的阳性克隆比例通常为1-5％。扩增这些克隆以允许复制子被冷冻，制备足够高的量的DNA用于利用外部5’和3’探针通过Southern印迹证实靶向型事件，所有均利用标准方法(Russ，et al.，2000，Nature 2000 Mar 2；404(6773)：95-9)。

(c)GPR12缺陷小鼠的产生

使C57BL/6雌性和雄性小鼠交配并分离孕3.5天的胚泡。10-12个来自所选克隆的细胞被注入每个胚泡，7-8个胚泡被植入假孕F1雌性小鼠的子宫。出生的嵌合同窝幼仔含有多只高水平(达100％)的具深浅环纹的雄性(深浅环纹外皮颜色指示来自靶向的克隆的细胞后代的分布)。雄性嵌合体与雌性以及MF1和129小鼠交配，种系传播分别通过深浅环纹外皮颜色以及PCR基因分型来确定。

其它非人转基因动物

本发明还涉及非人转基因动物，其导致GPR12受体的过表达或低表达(与适宜对照相比)。

所述动物可用于鉴定受体功能的激动剂和拮抗剂，其也为治疗性的。

抗体

如本文所述的抗体可用作GPR12多肽的激动剂或拮抗剂。

为本发明的目的，除非具体指明为相反的含义，术语“抗体”包括但不限于，多克隆，单克隆，嵌合，单链，Fab片段以及Fab表达文库产生的片段。所述片段包括完整抗体的片段，其保持对靶物质的结合活性，Fv，F(ab’)和F(ab’)₂片段，以及单链抗体(scFv)，融合蛋白和其它合成蛋白，其包含抗体的抗原结合片段。抗体及其片段可为人源化的抗体，例如EP-A-239400所述。此外，具有完整人可变区(或其片段)的抗体(例如US专利5,545,807和6,075,181中所述)也可使用。中和型抗体，即抑制物质氨基酸序列的生物活性的那些，对于诊断和治疗而言尤其优选。

抗体也可利用标准技术制备，诸如免疫化和通过利用噬菌体展示文库。

本发明的多肽和肽可用于通过已知技术开发抗体。所述抗体可特异性结合GPR12蛋白和同源物，片段等。

如果需要多克隆抗体，选定的哺乳动物(例如小鼠，兔子，山羊，马等)可用免疫原组合物免疫，所述组合物包含本发明的多肽或肽。根据宿主的物种，各种佐剂可用于加强免疫反应。所述佐剂包括，但不限弗氏(Freund’s)佐剂，矿物凝胶诸如氢氧化铝，以及表面活性剂诸如溶血卵磷脂pluronic多元醇，多聚阴离子，肽，油乳剂，匙孔血蓝蛋白，以及二硝基酚。BCG(卡介苗(Bacilli Calmette-Guerin))和短小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)可用作人佐剂，如其是纯化的，可用于将物质氨基酸序列给予免疫受损的个体以刺激系统防御。

收集来自免疫的动物的血清并根据已知方法处理。如果含有可得自本发明多肽表位的多克隆抗体的血清含有针对其它抗原的抗体，所述多克隆抗体可通过免疫亲合层析纯化。用于制备并加工多克隆抗血清的技术是本领域已知的。为了制备所述的抗体，本发明还提供了本发明的氨基酸序列或其片段，其对其它氨基酸序列半抗原化，在动物或人类中用作免疫原。

针对可得自本发明的多肽或肽的表位的单克隆抗体也可通过本领域技术人员轻易制备。通过杂交瘤制备单克隆抗体的常用方法是已知的。永生化的抗体生成细胞系可通过细胞融合产生，并且也通过其它技术诸如利用原癌DNA直接转化B淋巴细胞，或用EB病毒转染来产生。可筛选产生的针对眶表位的单克隆抗体的图谱(panel)的各种性质；即筛选同种型和表位亲和力。

单克隆抗体可利用任何提供通过连续细胞系培养基中的产生抗体分子的技术来制备。这些包括，但不限于，杂交瘤技术，最初由Koehler andMilstein(1975 Nature 256：495-497)描述，三交瘤(trioma)技术，人B细胞杂交瘤技术(Kosbor.，et al.，(1983)Immunol Today 4：72；Cote.，et al.，(1983)ProcNatl Acad Sci 80：2026-2030)，EBV-杂交瘤技术(Cole.，et al.，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，pp.77-96，Alan R.Liss，Inc.，1985)。

此外，可采用被开发用于制备“嵌合抗体”的技术，即小鼠抗体基因与人抗体基因的拼接以获得具有适当抗原特异性以及生物活性的分子(Morrison.，et al.，(1984)Proc Natl Acad Sci 81：6851-6855；Neuberger.，et al.，(1984)Nature 312：604-608；Takeda.，et al.，(1985)Nature 314：452-454)。可选，被描述用于制备单链抗体的技术(美国专利4,946,779)可用于制备物质特异性单链抗体。

针对来自本发明的多肽和肽的表位的单克隆和多克隆抗体，具体用于诊断中，其中中和型的那些抗体可用于被动免疫。具体地，单克隆抗体可用于激发抗独特型抗体。抗独特型抗体是携带物质的“内部”图像的免疫球蛋白和/或需要针对其的保护的药剂。用于激发抗独特性抗体的技术是本领域已知的。这些抗独特型抗体也可用于治疗。

抗体也可通过诱导在淋巴细胞群体中的体内生成或通过筛选重组免疫球蛋白文库或高特异性结合药剂的图如Orlandi.，et al.，(1989，Proc Natl AcadSci 86：3833-3837)，以及Winter G和Milstein C(1991；Nature 349：293-299)公开的。

含有多肽或肽的特异性结合位点的抗体片段也可产生。例如，所述片段包括，但不限于F(ab’)₂片段，其可通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生，以及Fab片段，其可通过还原F(ab’)₂片段的二硫桥产生。可选，Fab表达文库可被构建以允许快速并容易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段(Huse WD.，et al.，(1989)Science 256：1275-1281)。

用于制备单链抗体的技术(美国专利4,946,778)也可用于制备本发明多肽的单链抗体。转基因小鼠或其它生物体包括其它哺乳动物也可用于表达人源化的抗体。

因此，本发明人考虑GPR12抗体或包含其的组合物，具体可用于治疗神经性、生殖激素相关的以及其它疾病。所述神经疾病包括但不限于以下疾病中的任何一或多种：阿尔茨海默氏症以及相关疾病，帕金森氏症，癫痫和致癫痫疾病，眩晕和晕动症，运动神经元疾病，以及神经元功能障碍疾病，以及疼痛包括感受伤害性疼痛以及痛觉过敏，肝炎，肌肉降解，甲状腺功能减退，胰腺炎或MI，多发性骨髓瘤和糖尿病。

诊断实验

另一方面，本发明提供诊断选自下组的疾病或病症的方法：阿尔茨海默氏症以及相关疾病，帕金森氏症，癫痫和致癫痫疾病，眩晕和晕动症，运动神经元疾病，以及神经元功能障碍疾病，以及疼痛包括感受伤害性疼痛，肝炎，肌肉降解，甲状腺功能减退，胰腺炎或MI，多发性骨髓瘤和糖尿病，包括以下步骤：

选择来自待诊断患者的细胞样品；和

比较细胞样品与一或多种来自健康个体的对照样品中的GPR12多肽的表达水平和/或功能活性。

本发明还涉及利用GPR12多核苷酸，编码多核苷酸的GPR12肽配体的多核苷酸以及多肽(以及其同源物，变体或衍生物)，作为诊断剂用于诊断或用于基因分析的用途。互补于或能与GPR12核酸(包括同源物，变体和衍生物)杂交的核酸，以及针对GPR12多肽的抗体和GPR12配体多肽可用于所述测定法中。

检测GPR12基因或其它天然配体基因的与功能障碍相关的突变形式将提供诊断工具，其可添加或限定由于GPR12或其天然配体的表达低下，过表达或表达改变导致的疾病或对所述疾病的易感性的诊断。携带GPR12基因中的突变的个体(包括控制序列)可通过各种技术在DNA水平检测。

例如，DNA可分离自患者，切GPR12的DNA多态性模式可测定。鉴定的模式与已知患有与GPR12过表达、表达低下或表达异常相关的疾病的患者的对照比较。表达与GPR12相关疾病相关的遗传多态性模式的患者随后被鉴定。GPR12基因的遗传分析可通过本领域已知的任何技术进行。例如，个体可通过测定GPR12等位基因的DNA序列通过RFLP或SNP分析等来筛选。通过检测GPR12基因序列中的DNA或任何控制其表达的序列中多态性的存在，患者可被鉴定为具有对与GPR12过表达、表达低下或表达异常相关的疾病的遗传易感性。

如此鉴定的患者可随后被治疗以防止GPR12相关疾病的出现，或在GPR12或相关疾病的早期阶段更为积极进行以防止疾病的进一步出现或发展。GPR12相关疾病包括阿尔茨海默氏症以及相关疾病，帕金森氏症，癫痫和致癫痫疾病，眩晕和晕动症，运动神经元疾病，以及神经元功能障碍疾病，以及疼痛包括感受伤害性疼痛，肝炎，肌肉降解，甲状腺功能减退，胰腺炎或MI，多发性骨髓瘤和糖尿病。

优选的实施方案中，GPR12相关疾病包括阿尔茨海默氏症以及相关疾病，帕金森氏症，癫痫和致癫痫疾病，眩晕和晕动症，运动神经元疾病，以及神经元功能障碍疾病，以及疼痛包括感受伤害性疼痛，肝炎，肌肉降解，甲状腺功能减退，胰腺炎或MI，多发性骨髓瘤和糖尿病中的任意一种。

本发明进一步公开了试剂盒，其用于鉴定与GPR12相关疾病有关的患者遗传多态性模式。所述试剂盒包括DNA样品收集装置以及用于测定遗传多肽性模式的装置，其随后与对照样品比较以测定患者对GPR12相关疾病的易感性。也提供用于诊断GPR12相关疾病的试剂盒包含GPR12多肽和/或针对所述多肽(或其片段)的抗体。

用于诊断的核酸可获自受试者的细胞，诸如来自血液，尿液，唾液，组织活检或尸检物质。优选的实施方案中，所述DNA获自来自收集在吸收纸上的患者指血的血细胞。在优选实施方案中，所述血液收集在AmpliCard^TM(University of Sheffield，Department of Medicine andPharmacology，Royal Hallamshire Hospital，Sheffield，England S10 2JF)上。

所述DNA可直接用于检测或可利用PCR或其它扩增技术进行酶促扩增然后进行分析。可制备靶向目的基因中的特异性多态性DNA区域的寡核苷酸DNA引物使得实现靶序列扩增的PCR反应。RNA或cDNA也可以类似方式用作模板。自模板DNA扩增的DNA序列随后利用限制酶分析以确定存在扩增的序列中的遗传多态性，并由此提供患者中的遗传多态性图谱。限制片段长度可通过凝胶分析鉴定。可选或同时，也可采用诸如SNP(单核苷酸多态性)分析。

缺失和插入可通过扩增的产物与正常基因型相比的大小改变来检测。点突变可通过使扩增的DNA与标记的GPR12核苷酸序列杂交来鉴定。非常匹配的序列可通过RNase消化和通过融解温度的差异来与错配双链区分。DNA序列差异可通过DNA片段在凝胶中的电泳淌度(mobility)的改变(所述凝胶中含有和不含有变性剂)，或通过直接DNA测序来检测。见，例如，Myers.，et al.，Science(1985)230：1242。特定位点的序列改变也可通过核酸酶保护试验来显示，诸如RNase和S1保护或化学裂解方法。见Cotton.，et al.，Proc Natl Acad Sci USA(1985)85：4397-4401。其它实施方案中，可构建包含GPR12核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探针的阵列以有效筛选，例如基因突变。阵列技术方法是已知的并具有广泛的可用性，并可用于说明包括基因表达、遗传连锁以及遗传变异在内的多种分子遗传学问题。(见例如：M.Chee.，et al.，Science，Vol 274，pp 610-613(1996))。

单链构象多态性(SSCP)可用于检测突变体和野生型核酸之间的电泳淌度差异(Orita.，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA：86：2766，see alsoCotton(1993)Mutat.Res.285：125-144；and Hayashi(1992)Genet.Anal.Tech.Appl.9：73-79)。样品的单链DNA片段和对照GPR12核酸可被变性并允许复性。不同序列的单链核酸的二级结构不同，产生的电泳淌度改变使得能够检测甚至单个碱基的改变。DNA片段可被标记或用标记的探针检测。试验的敏感度可通过利用RNA(而不是DNA)来提高，其中所述二级结构对序列中的改变更为敏感。优选的实施方案中，受试方法利用基于电泳淌度的改变对分离的双链异二聚体分子的异源双链分析(Keen.，et al.，(1991)Trends Genet 7:5)。

通过用所述方法检测GPR12基因中的突变，诊断试验提供诊断和测定对感染诸如细菌、真菌、原生动物和病毒感染的易感性，具体是HIV-1或HIV-2导致的感染；疼痛；癌症；糖尿病，肥胖；食欲减退；贪食症；哮喘；帕金森氏症；血栓形成；急性心衰；低血压；高血压；勃起功能障碍；尿潴留；代谢性骨病诸如骨质疏松和大理石样骨病；心绞痛；心肌梗死；溃疡；哮喘；过敏；类风湿性关节炎；炎性肠病；肠易激综合征；良性前列腺肥大；以及精神和神经疾病，包括焦虑，精神分裂症，燥狂型抑郁症，谵妄，痴呆，严重智力落后和运动功能障碍，诸如亨廷顿氏症或Gilles delaTourett′s综合征。

具体优选的实施方案中，所述诊断试验用于诊断或测定对阿尔茨海默氏症以及相关疾病，帕金森氏症，癫痫和致癫痫疾病，眩晕和晕动症，运动神经元疾病，以及神经元功能障碍疾病，以及疼痛包括感受伤害性疼痛，肝炎，肌肉降解，甲状腺功能减退，胰腺炎或MI，多发性骨髓瘤和糖尿病的易感性。

GPR12多肽和核酸的存在可在样品中检测。因此，上述的感染和疾病可通过这样的方法诊断，其中包含测定源自受试者的样品中GPR12多肽或GPR12mRNA的水平的异常降低或增加。所述样品可包含来自患有或可疑患有与GPR12表达的增加，降低或其它异常相关的疾病的生物体的细胞或组织样品，包括表达水平或模式的空间或时间改变。患有或可疑患有所述疾病的生物体中的GPR12表达的水平或模式可与正常生物体中的表达水平或模式相比较作为诊断疾病的手段。

因此通常，本发明包括检测样品中包含GPR12核酸的核酸的存在，通过将样品与至少一种特异于所述核酸的核酸探针接触，并监测所述样品中核酸的存在来进行。例如，所述核酸探针可特异性结合GPR12核酸或其一部分，并检测二者之间的结合；所述复合体本身的存在也可被检测。

此外，本发明包括检测GPR12多肽的存在的方法，通过将细胞样品与能够结合多肽的抗体接触，以及监测所述样品中该多肽的存在来进行。这可通过监测抗体和多肽之间形成的复合体的存在来实现，或检测所述多肽与抗体之间的结合。检测两种实体之间的结合的方法是本领域已知的，并包括FRET(荧光共振能量转移)，表面胞质团共振等。

降低或增加的表达可利用本领域已知用于定量多核苷酸的任何方法诸如PCR，RT-PCR，RNase保护，Northern印迹和其它杂交方法在RNA水平测定。可用于检测源自宿主的样品中的蛋白质诸如GPR12的水平的实验技术是本领域已知的。所述实验方法包括免疫测定法，竞争结合测定法，Western印迹分析以及ELISA实验。

本发明涉及诊断疾病或疾病易感性的试剂盒，所述疾病包括阿尔茨海默氏症以及相关疾病，帕金森氏症，癫痫和致癫痫疾病，眩晕和晕动症，运动神经元疾病，以及神经元功能障碍疾病，以及疼痛包括感受伤害性疼痛以及痛觉过敏，肝炎，肌肉降解，甲状腺功能减退，胰腺炎或MI，多发性骨髓瘤和糖尿病中的任何一种。

具体优选的诊断试剂盒用于检测或诊断疾病或对以下疾病中任意一种的易感性：阿尔茨海默氏症以及相关疾病，帕金森氏症，癫痫和致癫痫疾病，眩晕和晕动症，运动神经元疾病，以及神经元功能障碍疾病，以及疼痛包括感受伤害性疼痛以及痛觉过敏，肝炎，肌肉降解，甲状腺功能减退，胰腺炎或MI，多发性骨髓瘤和糖尿病。

所述诊断试剂盒包含GPR12多核苷酸或其片段；互补核苷酸序列；GPR12多肽或其片段，或抗GPR12多肽抗体。

预防和治疗方法

本发明提供了治疗与GPR12多肽活性的量过剩或不足相关的异常疾病的方法，并且考虑到GPR12多肽，其结合蛋白和/或编码它们的核酸可具体用于治疗神经性，生殖激素相关的，以及其它一些疾病。所述神经疾病包括但不限于以下疾病中的任何一或多种：阿尔茨海默氏症以及相关疾病，帕金森氏症，癫痫和致癫痫疾病，眩晕和晕动症，运动神经元疾病，以及神经元功能障碍疾病，以及疼痛包括感受伤害性疼痛以及痛觉过敏，肝炎，肌肉降解，甲状腺功能减退，胰腺炎或MI，多发性骨髓瘤和糖尿病。

如果GPR12活性过量，可采用多种方法。一种方法包括给予受试者本文所述的抑制性化合物(拮抗剂)以及可药用的载体，其量可通过阻断配体与GPR12的结合，或通过抑制第二信号有效抑制活化，并由此缓解异常疾病。

其它方法中，可给药仍能与内源GPR12竞争结合配体的GPR12多肽的可溶形式。这种竞争物的常见实施方案包括GPR12多肽的片段。

其它方法中，编码内源GPR12多肽的基因的表达可利用表达阻断技术来抑制。已知的所述技术包括反义序列的使用，而无论其是内部生成的或是分别给药的。见，例如，O’Connor，J Neurochem(1991)56：560 inOligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca raton，Fla.(1988)。可选，可采用与该基因形成三螺旋的寡核苷酸。见，例如，Lee.，et al.，Nucleic acids Res(1979)6：3073；Cooney.，et al.，Science(1988)241：456；Dervan.，et al.，Science(1991)251：1360。这些寡聚物自身可给药或相关寡聚物可在体内表达。

为治疗与GPR12表达低下及其活性相关的异常疾病，也可采用多种方法。一种方法包括给予受试者治疗有效量的化合物，其模拟配体结合的GPR12，即上述激动剂，与可药用的载体联合，由此缓解所述异常疾病。可选，基因治疗可用于实现通过受试者中相关细胞的GPR12的内源性产生。例如，本发明的多核苷酸可被改造用于在复制缺陷型逆转录病毒载体中表达，如上所述。所述逆转录病毒表达构建体可随后被分离，并导入用逆转录病毒质粒载体转导的包装细胞，所述载体含有编码本发明多肽的RNA，使得所述包装细胞现在产生含有目的基因的感染性病毒颗粒。这些产生者细胞可给予受试者用于在体内改造细胞并在体内表达所述多肽。对于基因治疗的综述，参见Human Molecular Genetics，T Strachan and A P Read，BIOSScientific Publishers Ltd(1996)中的Chapter 20，Gene Therapy and OtherMolecular Genetic-based Therapeutic Approaches。

配制和给药

肽，诸如GPR12多肽的可溶形式，以及激动剂和拮抗剂肽或小分子，可与适宜的可药用载体配制在一起。所述配制剂包含治疗有效量的多肽或化合物，以及可药用载体或赋形剂。所述载体包括但不限于，盐水，缓冲的盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇及其组合。配制应当适合给药方式，并且是本领域技术人员已知的。本发明还涉及药物包以及试剂盒，其含有一或多个充满了本发明前述组合物的一或多种成分的容器。

本发明的多肽和其它化合物可单独使用或与其它化合物联用，诸如治疗性化合物。

系统给药所述药物组合物的优选形式包括注射，通常通过静脉内注射。其它注射途径，诸如经皮下，经肌内或经腹腔内，也可使用。可选用于系统给药的方式包括利用穿透剂诸如胆盐或梭链孢酸(fusidic acid)或其它清洁剂的透粘膜和透皮给药。此外，如果适当配制在肠溶或包被的制剂中，口服给药也是可能的。这些化合物的给药也可是局部的和/或局限化的，采用软膏，糊剂，凝胶等的形式。

所述剂量范围需要依赖于所选的肽，给药途径，配制剂的形式，受试者疾病的性质，以及临床医师的判断。但适宜的剂量的范围是0.1-100μg/kg受试者。然而，所需剂量中的较大变化可预期根据可得化合物的种类以及各种给药途径的效率不同而异。例如，预期口服给药需要高于通过静脉给药的剂量。这些剂量水平的不同可利用经验优化途径调整，这也是本领域技术人员所理解的。

用于治疗的多肽也可是在受试者中内源产生，在治疗模式中通常称为如上所述“基因治疗”。因此，例如来自受试者的细胞可用多核苷酸改造，诸如DNA或RNA，以离体编码多肽，并例如利用逆转录质粒载体。所述细胞随后被导入受试者。

药物组合物

本发明还提供了药物组合物，包括给药治疗有效量的根据本发明的GPR12多肽，其结合分子或编码它们的核酸，以及可选的可药用载体，稀释剂或赋形剂(包括其组合)。

所述药物组合物可在人和动物药物中用于人或动物，并将通常包含一或多种可药用稀释剂，载体或赋形剂。用于治疗用途的可接受载体或稀释剂是制药领域已知的，并在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中描述。药物载体，赋形剂或稀释剂的选择可根据意图给药途径以及标准制药实践来选出。所述药物组合物可包含作为或作为除载体，赋形剂或稀释剂以外的任何适宜的粘合剂，润滑剂，悬浮剂，包被剂，助溶剂。

防腐剂，稳定剂，染料以及甚至调味剂可在药物组合物中提供。防腐剂的实例包括苯甲酸钠，山梨酸和p-羟基苯甲酸的酯。也可使用抗氧化剂和悬浮剂。

根据不同递送系统，存在不同组合物/配制剂的要求。通过举例，本发明的药物组合物可配制成利用微型泵或经粘膜途径递送，例如作为鼻喷雾或气溶胶用于吸入或内服溶液，或经胃肠外递送，其中所述组合物配制成可注射的形式，用于通过例如经静脉内、经肌内或经皮下途径递送。可选，所述配制剂可被设计为经两种途径递送。

所述药剂经胃肠道粘膜递送，其将能够在通过胃肠道运送的过程中保持稳定；例如，其应抵抗蛋白水解降解，在酸性pH稳定并对胆汁的清洁效应抵抗。

适宜的情况下，所述药物组合物可通过吸入给药，以栓剂或阴道栓的形式给药，以洗液、溶液、乳膏、油膏或粉末的形式经局部给药，通过使用皮肤贴剂给药，以含有赋形剂诸如淀粉或乳糖的片剂的形式口服给药，或单独或与赋形剂混合在胶囊或扁囊中给药，或以酏剂、含有调味剂或着色剂的溶液或悬液的形式给药，或它们可经胃肠外诸如，例如经静脉内，经肌内或经皮下给药。对于经胃肠外给药，所述组合物最好以无菌含水溶液的形式使用，其中包含其它物质，例如足够的盐或单糖以制备与血液等张的溶液。对于经颊或舌下给药，所述组合物可以片剂或锭剂的形式给药，其可以常规方式配制。

给药

通常，医师将确定最适合个体受试者的实际剂量，其随具体患者的年龄，体重和反应而不同。以下剂量是平均情况的示例。当然可以存在个别情况，其中较高或较低的剂量范围有利。

本发明的药物组合物可通过直接注射给药。所述组合物可配制用于经胃肠外，经粘膜，经肌内，经静脉内，经皮下，经眼内或透皮给药。通常，每种蛋白可以0.01-30mg/kg体重的剂量给药，优选0.1-10mg/kg，更优选0.1-1mg/kg体重。

术语“给药”包括通过病毒或非病毒技术递送。病毒递送机制包括但不限于腺病毒载体，腺伴随病毒(GPR12V)载体，疱疹病毒载体，逆转录病毒载体，慢病毒载体，和杆状病毒载体。非病毒递送机制包括脂质介导的转染，脂质体，免疫脂质体，脂质转染，阳离子表面两性分子(CFAs)及其组合。所述递送机制的途径包括但不限于，经粘膜，经鼻，经胃肠外，经胃肠道，经局部或经舌下途径。

术语“给药”包括但不限于，通过粘膜途径，例如作为鼻喷雾或气溶胶用于吸入或作为可摄入的溶液递送；经胃肠外途径递送，其中递送通过可注射的形式，诸如经静脉内，经肌内或经皮下途径进行。

术语“共给药的”指例如本发明的多肽和其它实体诸如佐剂的每一种的给药位点和时间，使得实现免疫系统的必要调节。因此，虽然所述多肽和佐剂可同时给药同一位点，在不同于佐剂的时间和给药位点给药多肽可以是有利的。所述多肽和佐剂甚至可在相同的递送载体中递送，并且所述多肽和抗原可偶联和/或非偶联和/或基因偶联和/或非偶联的。

所述多肽，多核苷酸，肽，核苷酸，以及可选的佐剂可作为单个剂量或在多个剂量中分别给药或共同给药宿主受体。

本发明的药物组合物可通过多种给药途径给药，诸如注射(其包括胃肠外，经皮下和经肌内注射)，经鼻内，经粘膜，口服，经阴道内，经尿道或经眼给药。

本发明的药物组合物可常规经胃肠外给药，其通过注射，例如经皮下或经肌内进行。其它适于其它给药模式的配制剂包括栓剂，并且在一些情况中，口服制剂。对于栓剂，常规粘合剂和载体可包括，例如聚烷撑二醇或甘油三酯；所述栓剂可从含有活性成分的混合物形成，所述活性成分的范围为0.5％-10％，可为1％-2％。口服制剂包括所述常规应用的赋形剂，诸如药物级别的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等。这些组合物为溶液，悬液，片剂，丸剂，胶囊，持续释放配制剂或粉末的形式，并含有10％-95％的活性成分，优选25％-70％。如果所述疫苗组合物是冻干的，所述冻干的物质可被溶解然后给药，例如作为悬液给药。溶解优选在缓冲液中进行。

本发明现在参照具体实施例描述，其不应被认为是对本发明的限制。

实施例1.转基因GPR12敲除小鼠

构建GPR12基因靶向型载体

含有PAC的小鼠GPR12基因利用放射活性标记的PCR片段鉴定，所述片段含有部分编码序列。其它侧接编码序列的基因组序列可利用限制位点锚定的PCR技术由内部获得。组装8kb带缺口的片段组(contig)，提供足够的序列信息以允许设计靶向型载体。随后的生物信息工作将该片段组延伸到14kb，并填充了缺失的序列。该片段组提供了足够的侧接序列信息，使得能够设计同源臂以克隆入靶向型载体(所用靶向型载体的结构，包括相关限制位点，显示于图3)。

小鼠GPR12基因具有单个编码型外显子。靶向型策略设计为去除部分编码外显子，然后是7tm编码结构域的开始，并包括整个7tm结构域。侧接待缺失含7tm的区域的3.7kb 5’同源臂和1.1kb 3’同源臂通过PCR扩增并且将所述片段克隆入靶向型载体。用于扩增所述臂的每个寡核苷酸引物的5’末端被合成为含有罕见切割型(rare-cutting)限制酶的不同识别位点，与载体多聚接头的克隆位点相容，并且其本身自臂缺乏。在GPR12的情况下，所述引物被设计为下表所列的序列，具有NotI/SpeI的5’臂克隆酶以及AscI/FseI的3’臂克隆酶。

除了臂引物对(5’臂F/5’臂R)和(3’臂F/3’臂R)，设计其它GPR12基因座特异性引物用于以下目的：5’和3’探针引物对(5’prF/5’prR和3’prF/3’prR)以扩增每个臂的外部以及延伸超过每条臂的非重复性基因组DNA的两个短的150-300bp片段，以允许对分离的推定靶向的克隆中被靶向的基因座进行Southern分析；小鼠基因分型引物对(hetF和hetR)，其允许野生型，杂合子和纯合子小鼠之间的区分，当其用于利用载体特异性引物的多聚体PCR中，在本发明情况中为Asc403；最后是靶筛选引物(3’scr)，其在3’臂区的末端的下游退火，并且其与特异于载体(neo36)3’末端的引物配对时产生靶事件特异性1.5kb扩增物。所述扩增物可仅仅源自来自细胞的模板DNA，其中所需的基因组改变已经出现并允许从含有随机整合的拷贝的载体的克隆的背景鉴定正确靶向的细胞。这些引物的位置以及用于靶向策略中的GPR12基因座基因组结构显示于SEQ ID NO：14(图7)。

musGPR125’prF  GPR12actcatggctgcctagagcGPR12cttg-SeqID 1

musGPR125’prR  TggtgtgcttGPR12gacttttgttaccac-SeqID 2

                GPR12GPR12GPR12gcggccgcGPR12cagtcattcGPR12ggagcGPR12gG

musGPR125’臂F  PR12gtc-SeqID 3

musGPR125’臂R  Ttttttactagtgggaggggacagcggctgagatgttc-SeqID 4

musGPR123’臂F  GPR12GPR12GPR12ggcgcgccagGPR12agccctctgcctcatttgctg-SeqID 5

musGPR123’臂R  TttttggccggccgcttcagatgcGPR12tttgccctaccGPR12c-SeqID 6

musGPR123’scr  TgtgccattcaggGPR12ttctttcacttc-SeqID 7

musGPR123’prF  ActaggtctgaggcacgcccagctGPR12c-SeqID 8

musGPR123’prR  AcagccatgagcccattgcGPR12actgag-SeqID 9

musGPR12hetF    GPR12AGGGGTCTCGACCCTGGCTCTCATC-SeqID 10

musGPR12hetR    GATGCACCCACAGCGPR12ATGAGGCAGAG-SeqID 11

Asc403          CAGCCGGPR12CTGTTCGCCAGGCTCGPR12GG-SeqID 12

Neo36           CGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGAC-SeqID 13

表1.GPR12引物序列

选择同源臂的位置以通过缺失所有7个跨膜区功能破坏GPR12基因。制备靶向型载体，其中待缺失的GPR12序列被位于选择盒上游的内源基因表达报道物(框架非依赖性lacZ基因)组成的非同源序列取代，所述表达盒由与GPR12基因方向相同的启动的新霉素磷酸转移酶(neo)基因组成。

一旦5’和3’同源臂已经被克隆入靶向型载体pTK5IBLMNL(见图5)，较大的高纯度DNA制备物通过利用标准分子生物学技术制备。20μg新鲜制备的无内毒素DNA用其它罕见的切割限制酶PmeI限制切割，其存在于载体骨架中氨苄西林抗性基因和复制的细菌起点之间的独特位点。线性化的DNA随后被沉淀并重悬于100μl磷酸盐缓冲的盐水，备用于电穿孔。

电穿孔后24小时，经转染的细胞在含有200μg/ml新霉素的培养基中培养9天。克隆被挑入96孔板，复制并扩增，然后通过PCR筛选(利用引物3’scr和neo36，如上所述)以鉴定其中同源重组在内源GPR12基因和靶向型构建体之间发生的克隆。鉴定的阳性克隆比例为1-5％。这些克隆被扩增以允许复制物被冷冻，并且制备足够的高质量DNA用于利用如上制备的外部5’和3’探针通过Southern印迹证实靶向型事件，所有都利用标准方法(Russ，.et al.，Nature 2000 Mar 2；404(6773)：95-99)。当用诊断性限制酶消化的DNA的Southern印迹与外部探针杂交时，同源靶向的ES细胞克隆通过突变体带以及未改变的野生型带的存在证实。例如，利用5’探针，EcoRI消化的DNA将产生5.5kb野生型带，和4.0kb靶向的带。类似地，利用3’探针，BamHI将产生3.9kb野生型带，和1.5kb靶向的带。

敲除前小鼠GPR12的基因组基因座的结构在图1描述。敲除后小鼠GPR12的基因组基因座的结构在图2中显示。Southern证实相关酶的位点已经被标明。

GPR12GPCR缺陷小鼠的产生

使C57BL/6雌性和雄性小鼠交配并在孕3.5日分离胚泡。来自所选克隆的10-12个细胞被注入每个胚泡并将7-8个胚泡植入假孕F1雌性的子宫。嵌合小鼠同窝幼仔出生时含有数只高水平(达100％)带深浅环纹的雄性(所述深浅环纹外皮颜色表明靶向的克隆的后代的细胞的贡献)。这些雄性嵌合小鼠与雌性MF1和129小鼠交配，种系传递通过深浅环纹外皮颜色并通过PCR基因分型分别确定。

PCR基因分型在裂解的尾片段(lysed tail clips)上，利用引物hetF和hetR以及第三种载体特异性引物(Asc403)进行。该多聚体PCR允许从野生型基因座(如果存在)自引物hetF和hetR扩增，产生219bp带。hetF的位点在敲除小鼠中缺失，使得从靶向的等位基因的扩增失败。然而，Asc403引物将从靶向的基因座扩增441bp带，其中联合hetR引物，其与3’臂内部的区域退火。因此，该复合体PCR解释同窝幼鼠的基因型如下：野生型样品将显示单个219bp带；杂合DNA样品产生两条位于219bp和441bp的带；纯合样品将仅仅显示靶特异性441bp带。

实施例2

B)结果

I)基因表达模式

1)电子Northern

利用电子Northern，所述基因显示在以下器官中表达：睾丸，小肠，肺，脑，心脏和脾(图4)。

2)Lac Z染色的结构列表

LacZ染色显示Annie在脑内的强表达以及具体在嗅球、梨状皮质(嗅觉)，纹状体(计划和调节运动途径，也参与多种其它认知过程包括执行功能)，丘脑(接受听觉，躯体感觉和视觉感觉信号)，海马(在学习和记忆巩固中重要)，膝状体核(外侧：视觉；中间：听觉)和皮质中表达。

II)解剖观察

一些雄性的背部具有白色成片的皮毛。敲除动物中没有观察到明显的解剖学缺陷。

III)行为

对所有动物进行圈养，可自由获取食物和水，在12小时光/12小时黑暗的光-黑暗周期中进行，在7am开始给光。在设定的时间检测动物以避免生理节奏效应。

试验显示突变体和野生型之间的差异。

a).Pop-Map

雄性敲除小鼠显示对于倒置栅格以及线操作的抓握表现差。

b).Rotarod

雄性敲除小鼠在加速rotarod上表现不佳。对于雌性突变体没有观察到差异。

这指示小脑学习和运动协调，以及运动疾病诸如帕金森氏症和亨廷顿舞蹈症(Huntington’s Chorea)。

c).足迹/步态试验

据观察突变体雄性步态异常，步距宽于野生型动物。

d).摆尾试验

突变体雄性利用摆尾试验检测，该实验室试验用于检测痛觉，是本领域技术人员已知的。该实验用作敲除小鼠对感受伤害性疼痛的反应的指征。观察到所述突变体对热诱导的疼痛显示痛觉过敏。所述突变体据观察摆动尾部的潜伏期较短(图8)。

e).热板试验

热板试验用于指示敲除小鼠对感受伤害性疼痛的反应。敲除小鼠对热诱导的疼痛更为敏感，这可通过热诱导的舔足潜伏期缩短证实。该试验证实了以前在GPR12敲除小鼠的摆尾(tail-flick)实验(图9)中见到的痛觉过敏表型.

f).水迷宫试验

水迷宫是广泛用于评估啮齿类空间学习能力的试验。学习是作为整个实验中达到隐藏的平台的时间减少来评估的。这些数据提示利用空间线索学习隐藏平台的位置的能力降低(图10)。该试验缺陷表示各种病理情况中的学习和记忆问题，诸如阿尔茨海默氏症，老年性痴呆，或总体学习和记忆困难。

g).Laboras

Laboras是长期监测系统，其使得啮齿类能够被长期检测并评估它们的运动。

过夜LABORAS监测Annie小鼠显示，与野生型小鼠相比它们具有降低的爬行倾向(持续时间(图11a)和频率(图11b))。这些数据支持了rotarod数据并提示运动协调或力量缺陷。

h).生化分析

完整生化分析在来自Annie敲除小鼠的样品上进行，包括血液生物化学和激素分析。

雄性Annie敲除小鼠具有升高的肌酸激酶(CK)水平(图12)。CK转化ATP和肌酐称为ADP和肌酸磷酸，并且在细胞损伤之后从心脏，骨骼肌以及脑释放。CK的增加指示神经肌肉疾病，例如心脏疾病，线粒体疾病，炎性肌病，肌无力，多发性肌炎，McArdle’s疾病，NMJ疾病，肌肉萎缩，ALS，甲状腺功能低下-&甲状腺功能亢进疾病，中央轴空病(central core disease)，酸性麦芽糖酶缺乏，肌球蛋白尿症，横纹肌溶解，MND和类风湿疾病。肌肉损伤也可通过行为研究中降低的运动协调/力量得到支持。

生化分子中见到的其它明显改变包括：

1.葡萄糖：在3和9月龄雄性和3月龄雌性中增加(～20％)。增加的葡萄糖水平指示疾病诸如糖尿病以及肝病。

2.肌酐(肌肉代谢废物)：在9月龄雄性中增加(增加的水平见于肾疾病和肌肉变性)。

3.甘油三酯：在3月龄雌性和9月龄雄性中增加(～25％)(指示肝病，甲状腺功能减退，胰腺炎和MI)。

4.尿酸(见于肝和肾中，是嘌呤代谢的终产物)：在3月龄雄性和(～15％)9月龄雄性中增加(～80％)(增加的水平见于痛风，感染，肾病，吸收障碍，肝损伤或过酸肾(over acid kidney))。

5.白蛋白：在9月龄雄性中增加(～25％)(增加的白蛋白见于肝病，多发性骨髓瘤)。

6.门冬氨酸氨基转移酶(～80％)在3 & 9月雄性中增加(指示急性肝细胞损伤或肝炎)。

总体结果提示肝或肾功能障碍。

本文件中涉及的申请和专利中的每一个，以及其中引用或参照的每篇文献，包括每篇申请和专利(“申请引用的文件”)，包括在每篇申请和专利的过程中以及任何申请引用的文献中引用或涉及的产品的生产商说明或分类，均包含在本文作为参考。此外，本文引用的所有文献，以及本文引用的文献中的所有引用或参考文献，以及本文引用或涉及的产品的任何生产商说明，包含在本文作为参考。

本发明所述方法和系统的各种修饰和改变对本领域技术人员而言是显而易见的，不偏离本发明的范围和精神。尽管本发明已经通过具体优选实施方案描述，应理解权利要求所述的发明不应不适当地显示到所述具体实施方案，对其进行的修饰和添加应在本发明范围内进行。实际上，实施本发明的所述模式的各种改变对于分子生物领域或相关领域的技术人员而言是显而易见的，意图包含在本发明权利要求范围内。此外，可针对独立权利要求的特征对从属权利要求的特征进行各种组合，并且不偏离本发明的范围。

Claims (17)

1.GPR12敲除哺乳动物，其包含一或多种细胞，所述细胞中的GPR12多肽在功能上无活性。

2.权利要求1的GPR12敲除小鼠，其与野生型对照相比具有任意一或多种以下特征：Rotarod测验、倒置栅格、酒操纵测验、步态试验的成绩降低。

3.权利要求2的GPR12敲除小鼠，其具有选自下组的特征：阿尔茨海默氏症以及相关疾病，帕金森氏症，癫痫和致癫痫疾病，眩晕和晕动症，运动神经元疾病，以及神经元功能障碍疾病，以及疼痛包括感受伤害性疼痛以及痛觉过敏，肝炎，肌肉降解，甲状腺功能减退，胰腺炎或MI，多发性骨髓瘤和糖尿病。

4.产生一或多个包含一或多个功能失活的GPR12基因的哺乳动物细胞的方法，包括以下步骤：

(a)选择一或多个包含一或多个功能活性内源GPR12基因的细胞；

(b)将步骤(a)的一或多个细胞用功能失活的GPR12核酸进行转染，所述核酸能够通过同源重组与一或多个内源GPR12基因进行重组；和

(c)选择一或多个其中的一或多个内源GPR12基因已经与功能失活的GPR12核酸发生同源重组的细胞。

5.适于功能灭活宿主细胞内的一或多个内源GPR12基因的核酸构建体，包括：

(a)非同源取代区；

(b)位于所述非同源取代区上游的第一同源区；

(c)突变的GPR12基因，其在表达时不编码功能活性GPR12；

(d)位于所述非同源取代部分的下游的第二同源区，所述第二同源区位于所述非同源取代区的下游，所述第二同源区具有与第二GPR基因有至少90％的同一性的核苷酸序列。

6.组合物，其包含GPR12多肽，或其一或多种结合蛋白，或编码它们的核酸，以及可药用载体、稀释剂或赋形剂。

7.鉴定GPR12多肽的功能活性的一或多种拮抗剂的方法，包括以下步骤：

(a)选择一或多种哺乳动物，其包含功能活性GPR12多肽；

(b)用GPR12多肽的一或多种可能的拮抗剂处理所述一或多种哺乳动物；

(c)检测所述一或多种哺乳动物以确定所述哺乳动物是否显示GPR12敲除小鼠的一或多种特征，所述特征选自以下特征组成的组：阿尔茨海默氏症以及相关疾病，帕金森氏症，癫痫和致癫痫疾病，眩晕和晕动症，运动神经元疾病，以及神经元功能障碍疾病，以及疼痛包括感受伤害性疼痛以及痛觉过敏，肝炎，肌肉降解，甲状腺功能减退，胰腺炎或MI，多发性骨髓瘤和糖尿病；和

(d)选择显示步骤(c)的一或多种特征的一或多种拮抗剂。

8.权利要求的7的方法，其中步骤(c)包括检测所述一或多种哺乳动物以确定那些哺乳动物是否显示所述的特征。

9.鉴定一或多种激动GPR12多肽的功能活性的分子的方法，包括以下步骤：

(a)选择一或多种哺乳动物，其中包含功能失活的GPR12多肽；

(b)用一或多种可能的GPR12类似物处理所述一或多种哺乳动物，所述GPR12类似物有效激动GPR12活性的至少一个方面；

(c)检测根据步骤(b)处理的一或多种哺乳动物，确定所述经处理的哺乳动物与根据步骤(a)选出的哺乳动物相比是否具有一或多种恢复的性质；和

(d)选择所述一或多种GPR12-配体类似物，其使得根据步骤(a)选出的那些哺乳动物恢复野生型哺乳动物的一或多种特征。

10.鉴定一或多种拮抗GPR12多肽的功能活性的分子的方法，包括以下步骤：

(a)选择一或多种哺乳动物，其中包含功能活性GPR12多肽；

(b)用一或多种可能的GPR12拮抗剂处理所述一或多种哺乳动物，所述GPR12拮抗剂有效拮抗GPR12活性的至少一个方面；和

(c)检测根据步骤(b)处理的一或多种哺乳动物，确定所述经处理的哺乳动物与根据步骤(a)选出的哺乳动物相比是否具有一或多种经调节的性质。

11.转基因GPR12敲除哺乳动物在一或多种化合物的生物效应测定法中的用途。

12.诊断选自以下疾病组成的组的疾病或病症的方法：阿尔茨海默氏症以及相关疾病，帕金森氏症，癫痫和致癫痫疾病，眩晕和晕动症，运动神经元疾病，以及神经元功能障碍疾病，以及疼痛包括感受伤害性疼痛以及痛觉过敏，肝炎，肌肉降解，甲状腺功能减退，胰腺炎或MI，多发性骨髓瘤和糖尿病，包括以下步骤：

(a)选择来自待诊断患者的细胞样品；和

(b)比较所述细胞样品与来自健康个体的一或多种对照样品中的GPR12多肽的表达水平和/或功能活性。

13.转基因动物，其中至少部分细胞中包含编码选自下组的一或多种物质的外源核酸：GPR12多肽，GPR12多肽的一或多种激动剂，GPR12多肽的一或多种拮抗剂和GPR12活性的一或多种调节物。

14.治疗患者中选自下组的疾病的方法：阿尔茨海默氏症以及相关疾病，帕金森氏症，癫痫和致癫痫疾病，眩晕和晕动症，运动神经元疾病，以及神经元功能障碍疾病，以及疼痛包括感受伤害性疼痛以及痛觉过敏，肝炎，肌肉降解，甲状腺功能减退，胰腺炎或MI，多发性骨髓瘤和糖尿病，包含用治疗有效量的选自下组的一或多种物质治疗所述患者的步骤：GPR12多肽，GPR12多肽的一或多种激动剂，GPR12多肽的一或多种拮抗剂和GPR12活性的一或多种调节物。

15.选自GPR12多肽，GPR12多肽的一或多种激动剂，GPR12多肽的一或多种拮抗剂和GPR12活性的一或多种调节剂组成的组的一或多种物质在制备用于预防或治疗患者中的疾病的药物中的用途，所述疾病选自以下疾病组成的组：阿尔茨海默氏症以及相关疾病，帕金森氏症，癫痫和致癫痫疾病，眩晕和晕动症，运动神经元疾病，以及神经元功能障碍疾病，以及疼痛包括感受伤害性疼痛以及痛觉过敏，肝炎，肌肉降解，甲状腺功能减退，胰腺炎或MI，多发性骨髓瘤和糖尿病。

16.操纵患者中的神经元增殖和突触形成的方法，包括用治疗有效量的选自下组的一或多种物质治疗患者的步骤：GPR12多肽，GPR12多肽的一或多种激动剂，GPR12多肽的一或多种拮抗剂以及GPR12活性的一或多种调节物。

17.选自下组的物质在制备用于操纵动物中的神经元增殖和突触形成的药物中的用途：GPR12多肽，GPR12多肽的一或多种激动剂，GPR12多肽的一或多种拮抗剂以及GPR12活性的一或多种调节物。

Images