JPH07508646A

JPH07508646A - 網膜の色素沈着された上皮由来の神経栄養性因子

Info

Publication number: JPH07508646A
Application number: JP6500883A
Authority: JP
Inventors: ジョンソン，リンカーン　ブイ．; トンブラン−ティンク，ジョイス
Original assignee: ユニバーシティオブサザンカリフォルニア
Priority date: 1992-06-04
Filing date: 1993-06-04
Publication date: 1995-09-28
Also published as: EP0662087B1; DE69333229D1; EP0662087A4; AU4406993A; EP1415994A1; JP2004262947A; JP2005112863A; CA2137377A1; WO1993024529A1; EP0662087A1; CA2137377C; DE69333229T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】網膜の色素沈着された上皮由来の神経栄養性因子本発明は、米国国立衛生研究所から授与された助成金ＥＹＯ４７４１号に基づいて米国政府の援助によってなされたものである。米国政府は本発明に所定の権利をもっている。発明の技術分野本発明は網膜色素上皮由来の神経栄養性因子（ＰＥＤＮＦ）の精製と用途に関する。発明の背景多くの種類のニューロン類は、生存して良好な状態にあるには神経栄養性因子として知られている特定の調節分子の利用度に依存している。神経栄養性因子の中で最も特徴的なものは神経成長因子（ＮＧＦ）である。ＮＧＦは、末梢神経系の交惑神経二ニーロンおよびを髄後根神経節ニューロンおよび中枢神経系のいくつかのコリン性ニューロンの生存と特殊機能を調節する。また栄養性因子類は、他のニューロンに作用しまた同定もなされており、そして２種の栄養性因子すなわち毛様体神経栄養性因子（ＣＮＴＦ）と脳由来の神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）が精製されている。さらに、線維芽細胞増殖因子（ＰＧＦ）および上皮増殖因子（ＥＧＦ）のようないくつかの成長因子が、最初に、細胞に対するこれら因子の有糸分裂誘発作用に基づいて同定されたが、いくつかのニューロンに対して生存促進剤としても機能することが最近報告されている。シナプス後の標的細胞およびダリア細胞のごとき外套細胞は神経栄養性因子の王な起源のようである。網膜の光受容体細胞の生存も特定の神経栄養性因子によって調節されていると提言されている。この概念を裏付けている証拠としては、光受容体はいくつかの種で発生ニューロンの死に耐えるという観察結果であり、これは神経栄養性因子の制限された利用度を反映していると一般に考えられている現象である。光受容体が発育しかつ正常な機能を維持するには網膜色素上皮（ＲＰＥ）との相互作用が必要であることも報告されているが、このことはＲＰＥ由来の分子または因子が光受容体の機能と生存のために必要であろうということを示唆している。ＲＰＥは神経網膜（ｎｅｕｒａｌ　ｒｅｔｉｎａ）より先に発生し神経網膜の隣接している。これら二つの細胞層間の閉鎖区画には光受容体間マトリ　−ックスが入っており、そしてＲＰＥの多数の可溶性分泌産物と神経網膜細胞がこの光受容体間マトリックス中に含有されている。　ＲＰＥと神経網膜間で交換される栄養素、代謝産物または栄養性因子は光受容体間マトリックスを通過しなければならない０例えばＲＰＥ細胞は、光受容体の生存促進因子（ＰＳＰＡ）を合成し分泌していると考えられる。培養されたＲＰＥ細胞は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）　、　ＦＧＦ　、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）およびトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）を含むいくつもの公知の栄養性因子を合成する。ＲＰＥ由来のこれらの因子または他の未知因子は神経網膜の発育に影響する可能性がある。神経由来のＲＰＥ　（ｎｅｕｒａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ＲＰＥ）は、神経網膜と、脈絡膜内の循環血液との間に介在する細胞単層を形成している。この重要な位置に、ＲＰＥは血液−網膜のバリヤーの一部を形成し、網膜の統合性と機能に不可欠の機能を実行し、網膜と脈絡膜の脈管疾患、炎症疾患、退行性疾患およびジストロフィー疾患で重要な役割を演している、視覚プロセス（ｖｉｓｕａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓ）に関連するＲＰＥの機能としてはいくつかあり、明暗順応、シェッドロッドの外側セグメント膜（ｓｈｅｄｒｏｄ　ｏｕｔｅｒ　ｓｅｇｍｅｎｔ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）の食作用および栄養補給である。一方正常な発育中、ＲＰＥと神経網膜が相互に密接に依存していることは長い間知られているにもがかわらず機能は充分に理解されていないが、ＲＰＥは網膜の再生には重要であることは知られている。多くのを椎動物のの神経網膜とＲＰＨの接触が失われると（網膜側Ｍ）網膜が退化するということは常に観察されている。網膜剥離の副作用として、剥離のスポットの下側にあるＲＰＥに由来する強力な細胞増殖が観察されることが多い。したがって、光受容体の細胞の推定上の生存促進因子を同定することは、未知の病因による光受容体の退化のために失明に至る病状を治療するのに非常に重要になるであろう、この種の選択的先受容体退化は各種の異なる機構が原因であるが、神経系の他の領域でのニューロンの退化と類領していることは、網膜の神経栄養性活性が関与している可能性があることを示唆している。又凱東翌り本発明は、精製された網膜色素上皮由来の神経栄養性因子組成物およびこのような網膜色素上皮神経栄養性因子の精製方法に関する。本発明の精製手順は、網膜色素上皮由来の神経栄養性因子を含有する不純なタンパク質両分を提供し、次いで網膜色素上皮由来の神経栄養性因子を含有する不純なタンパク’ｉｉｉ分をカチオン交換クロマトグラフィーの媒体に加えることからなる方法である０次にそのカチオン交換クロマトグラフィー媒体を洗浄して未結合のタンパク質を溶出させ、次に網膜色素上皮由来の神経栄養性因子をカチオン交換クロマトグラフィーの媒体から溶出させて集める。また本発明は、ＳＥＱ　Ｉｎ　ＮＯ：　１に示すＤＮＡ配列もしくはアミノ酸配列を有し、ｗ４１１１色素上皮由来神経栄養性因子をコードする遺伝子からなる組換えＤＮＡ分子、およびＳＥＱ　１０　ＮＯ：　ｌで特定されるＤＮＡ配列を有する、網膜色素上皮由来神経栄養性因子の遺伝子からなる組換えＤＮＡ分子で形質転換された生物に関する。また本発明は、ＰＥ［ｌＮＦを投与することからなる、ｔｗｉ、ｉの疾患およびセリンプロテアーゼ類の活性が原因の症状の治療方法に間する。辺！疲労本発明の特徴と利点は、本発明の特許請求の範囲と詳細の説明を下記の図面を参照して読めばより一層明らかになるであろう。図１はＲＰＥならし培地（ＲＰＥ−Ｃ？Ｉ）に特有のＰＥ［ｌＮＦ’タンパク質ダブシダブレット位置クーマシーブルーで染色したＳＯＳポリアクリルアミドゲルである。図２は、付着させて８日後、電気溶出されたＰＥＤＮＦ　２μｇ／ｄｉを含有する血清なしの培地（パネルＡ）中または血清なしの対照培地（パネルＢ）中で、７日間刺激した細胞培養物を示す微分干渉コントラスト顕微鏡の写真である。図３は銀で染色した二次元のゲルである。分子量を左側に示しｐＨを上部に示しである。用１星に所網膜色素上皮の細胞は、生体内で分化する網膜芽細胞と密接に関連し、生体内と生体外の両方におけるその発育と正常な機能に不可欠の環境に寄与している０ｗ４膜芽細胞腫細胞は、ラミニン、醋酸ナトリウムおよびジブチリルｃＡＭＰのような薬剤が、生体外でニューロン、ダリアおよび色素上皮の特性の発現を誘発できるということで立証されているように、該細胞の前駆体すなわち原始網膜芽細胞に匹敵する多能分化性を示す。ヒト網膜芽細胞腫の培養細胞系すなわちＹ７９細胞は、ＲＰＥならし培地（ＲＰＥ−ＣＭ）に暴露されると、高度のニューロン様分化を示す。この分化は、細胞の形態学的および生化学的特性の両者にみられる。上記の被暴露細胞は、その細胞体から分枝する神経突起を伸ばし、高レベルのニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）および神経フィラメントタンパク質を発現する。ＲＰＥが分泌したタンパク質をＲＰＥ−Ｃ−から分画して、ＲＰＥ−ＣＭに独得の見掛けの分子量が約５０，０００〜約５５，０００であるタンパク質ダブレットを同定した。この色素上皮由来神経栄養性因子（ＰＥＤＮＦ）は、ヒト胎児ＲＰＥ細胞の主な分泌産物であるが、単離され、Ｙ７９網膜芽細胞腫の細胞に対して神経栄養性作用を有することが分かった。ＰＥＤＮＦには、特に限定はされないが次のようなｗｉ膜疾患を治療する用途がある。すなわち網膜芽細胞腫などの眼の腫瘍、色素性網膜炎（ｒｅｔｉｎｉｔｓ　ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）、種々の形態の網膜剥離、黄斑変性、糖尿病網膜症などの網膜細胞の遺伝性および年齢に関連する病状を治療する用途がある。網膜腫瘍の場合、ＰＥＤＮＦはこの腫瘍細胞を誘発して成熟ニューロン細胞の生化学的特性と表現型特性を示させる。このような変化は、細胞分裂の中止もしくは細胞分裂速度の低下で確認され、この現象によって膿瘍の退行が起こるかまたは腫瘍の増殖速度が低下する。腫瘍でない網膜の疾病の場合、ＰＥＤＮＦの神経栄養性特性によって、光受容体などの網膜細胞の生存と良好な状態が向上し、その機能寿命を延長しかつ視覚の悪化が始まり失明に至る速度が低下する。網膜剥離の場合、ＰＥＤＮＦによって、標準の再付着法で有効に網膜−１１１ＰＥ界面を再建して正常な視覚を回復できるよう充分に光受容体細胞の寿命が延長される。 ■、　′　た　ムタンパク　Ｉの　゛を網膜色素沈着された上皮由来神経栄養性因子（ＰＥＤＮＦ）はＰＥＤＮＰを産生ずるいかなる組織または細胞からでも単離することができる。ＰＥＤＮＦを産生ずる天然の細胞はｙ４１１Ｉ色素沈着された上皮細胞である。かような細胞は培養によって増殖しそれらが増殖している培地中にＰＥＤＮＦを分泌する。その培地を定期的に収穫し、次いでＰＥＤＮＰをその培地から単離する。適切な細胞培養物は、ヒト、サルなどの霊長類、またはニワトリ、マウス、ネズミ、ウシおよびブタのような他の動物由来のｍ膜色素沈着された上皮細胞から樹立することができる。またＰｌｉｌ）ＮＦは、光受容体間マトリックス（ＩＰＦＩ）の抽出によって、またはヒト、サルなどの霊長類またはニワトリ、マウス、ネズミ、ウシおよびブタのことき他の動物の網膜から単離することができる。あるいは、ＰＥＤＮＦは、天然産でない起源、例えば遺伝子を発現させるために選択された宿主細胞中にＰＥＤＮＦを発現させるように構築された組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた生物がら誘導することができる。Ａ、ヒト　色、゛　れた上　ＲＰＥ）　の立ＲＰ２の培養物は、死後の眼を収穫し、無菌状態で切開して硝子体と網膜を取出すことによって樹立される。ｎ出したＲＰＥを、改変アール平衡塩類溶液（ＭＥＢＳ　：　１１５．５ｍＭ　ＮａＣ１，３，５ｍＭ　ＭＣＩ、１ｍＭ　ＮａＨｚＰＯ，。０．５ｍＭ　ＣａＣ１，０，２７ｍＭ　ＭｇＣＩｇ、０．３７５Ｍ　Ｍｇ５Ｏ，、１５＋ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１＋ｂＭＮａＨＣＱ、、　１２ｍＭグルコース、ｐＨ７，２）のような緩衝溶液で洗浄する。１７ＰＥ細胞をＢｒｕｃｈの膜からかき取るか、またはバスツールピペットまたは類似のピペットを用いて加えられるＭＥＢＳもしくは細胞培養培地のような流体の流れで取りはずす。このステップの前に、タンパク質分解酵素などの酵素例えばＤｉｓｐａｓｅ（米国、インディアナ州、インディアナポリスに所在のＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、カタログ番号＃　２９５８２５）に暴露させてもよい。あるいはＲＰＥ細胞は、無傷の眼がら強膜の部分を外して脈絡膜の組織を露出させ、この脈絡膜の表面を、Ｄｉｓｐａｓｅのごときタンパク質分解酵素などの酵素で処理してから硝子体と網膜を取出し、次にＰｆｅｔｆｅｒが報告しているように細胞培養培地をスプレーしてＲＰＥ細胞を取り外すことによって、単離してもよい１組織フラグメントを組織培養皿に移して、Ｐｆｅｆｆｅｒが報告しているような“低Ｃａ””もしはく″゛高Ｃａ″＋”の完全ＲＰＥ −４７培地、または約０．５〜約２０容量％のウシ胎児血清を補充したイーグルの最少必須培地（米国、ニューヨーク州、グランド・アイランド所在のＧＩＢＣＯ社かが市販しているＨＥＭ）の中に入れる。ウシ胎児血清の濃度が約０．５％より低いと、該血清の濃度が低すぎて上記細胞の増殖を４効に保持できない、また血清の濃度が約２０％を越えても、細胞の増殖については、細胞に対し追加の利益を全く与えない。また培地は、培養物中に細菌および／または真菌が増殖するのを防止するため抗生物質および／または殺真菌剤を補充してもよい。本発明に用いるのに適切な抗生物質と殺真菌剤は、約１ｏｏｏ単位／Ｉｄのペニシリン、約１００　μｇ／ｄのストレプトマイシン、約０．２５μｇのアムホテリンンおよび約５０μｇ／ｄのゲンタマイシンなどの当該技術分野で公知の適切な薬剤である。これらの抗生物質は、所望により、個々にもしくは混合して用いてもよい。該細胞を、約５％二酸化炭素の雰囲気下約３７°Ｃでインキュベートする。網膜色素沈着された上皮（ＲＰＥ）細胞が皿の表面に付着し、増殖し、最終的に集密的細胞単層を形成する。細胞の培養を開始してから約３〜７日後に、細胞が集密的に増殖したとき、例えば細胞単層をトリプシンで処理するがまたは当該技術分野の当業者にとって公知の他の方法によって細胞を収穫し、次に、約５％〜約２０％のウシ胎児血清を補充した、Ｇ　Ｉ　ＢＣＯ社市販のＭＥＭのごとき培地に細胞を再び浮遊させる。その細胞の一部を滅菌組織培養フラスコ中に再接触し、次いで、細胞を約５％ＣＯアの雰囲気下約３７°Ｃで再び増殖させる。あるいはＲＰＥ細胞は、角膜、２−一の強膜輪および硝子体と神経網膜を眼から取り出すことによって単離することができる。Ｉ］！を、カルシウムとマグネシウムを含有していないハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ　：　１．３ｍＭ　ＣａＣ１ｚ＋　５ｍＭ　ＫＣＩ、０．３ｍＭ　Ｋ）ｌＺＰＯ４，０，５１１Ｍ　ＭｇＣＩｇ。０．４ｍＭ　ＭｇＳＯ４＋　１３８ｍＭ　ＮａＣ１，４ｍＭ　ＮａＨＣＯｓ、０．３ｍＭ　ＮａｇＩＰＯｎ＋　５．６ｍＭ　Ｄ−グルコースおよび０．０３ｍＭフェノールレッド）（米国、メリーランド州、ゲイサーズバーグに所在のＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社市販）で洗浄する。そのアイカップ（ｅｙｅ　ｃｕｐ）に、約０．１重量％のトリプシン、約０．１重量％のヒアルロニダーゼを含有する、カルシウムとマグネシウムなしのハンクス平衡塩溶液による溶液で満たし、次いでその眼を約３７°Ｃで約１５分〜約３０分インキュベートする。疎性ＲＰＥ細胞をゆるやかに吸引することによって集め、次いでＲＰＥ細胞がはずれるまで上記の手順を繰返す、細胞試料に約５％〜約２０％のウシ胎児血清を添加することによってトリプシンを失活させる。約１２０Ｏｒｐｍで約７分間遠心分離にかけて細胞を集める。次にそのＲＰＥ細胞を、３５−プレートに対し約ｌＸｌ０’細胞の密度で滅菌＆Ｉ織培養プレートにプレートする（比較的大きいかまたは小さいプレートもしくは容器を用いる場合は比例して細胞を増やすかまたは減らしてプレートする。この細胞を、ＧｒＢＣＯ社が供給しているダルベツコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ　）または他の適切な培地で増殖させる。この培地は等しい容積の以下のもので補充してもよい。すなわちハムのＦ１２培地（ＧＩＢＣＯ社が供給）、約ＩＢＭのピルビン酸ナトリウム、約０．６２５　ｍＭのＨｅｐｅｓ　、約６ｍＭのし一グルタミン、約１％の非必須アミノ酸類、約５μｇ／ｄのインシュリン、約５μｇ／ｄのトランスフェリン、約５ｇ／ｄのセレン、上記のような抗生物質、および約０．５％〜約２０％の上記のようなウシ胎児血清で補充してもよい。インシュリン、トランスフェリンおよびセレンは米国、マサチューセノツ州、レキシントンに所在するＣｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ社が供給している。本発明に用いるのに適切な他の薬剤は、特にことわらない限り米国、ミズーリ州、セントルイス所在のＳｉｇｍａＣｈｅ＋＊１ｃａｌ　Ｃｏ、社が供給している。細胞が集密状態まで増殖したとき（細胞の培養を開始してから約３〜７日後）、例えば細胞単層をトリプシンで処理するかまたは当該技術分野の当業者にとって公知の他の方法で細胞を収穫し、次いで約０．５％〜約２０％のウソ胎児血清で補充したＭＥＨのような培地に、細胞を再度浮遊させる。その細胞の一部を滅菌組織培養フラスコ中に再接種し、次いで約５％ＣＯ□の雰囲気下約３７°Ｃで再び増殖させる。ＲＰＥ細胞の培養法は二つしか述べていないが、他の適切なＲＰＥ培養法が当該技術分野で知られている。このような方法も本発明を実施する再に用いるのに適している。Ｂ、色、された上　のならし坪１ＲＰＥ−ＣＩ′ｌ　の１゛１ＰＥＤＮＦは分泌されるタンパク質であり、そしてＲＰＥ細胞は、それが増殖している培地中にＰＥＤＮＦを分泌する。それ故に便利なＰＥＤＮＦの製造法は、ＲＰＥ細胞を培養で増殖させ次に培地を培養物から定期的に収穫する方法である。ＰＥＤＮＦを培地から単離するため本発明で使用するのに適切な方法は、約１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、約０．６２５　ＭＭのＨｅｐｅｓ　、約６１のＬ− グルタミン、約１％の非必須アミノ酸類、約５μｇ／ｄのインシュリン、約５μ ｇ／ｉｄのトランスフェリン、約５ｎｇ／ｄのセレン、上記のような抗生物質および／または殺真菌剤、および上記のような約０．５％〜約２０％のウシ胎児血清で補充されたＤＭＥＦＩのごとき培地中でＲＰＥ細胞を集密状態になるまで増殖させる方法である。　ＲＰＥ細胞の集密培養物を、ハングの平衡塩溶液または他の適切な洗浄溶液で充分に洗浄して、ＲＰＥ細胞を培養するために使用する培地中に存在しているウシ胎児血清由来の血清タンパク質を除去する。約１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、約０．６２５　ｍＨのＨｅｐｅｓ　、約６ｓＨのし一グルタミン、約１％の非必須アミノ酸類、約５μｇ／ａ１のインシュリン、約５μ ｇ／ｄのトランスフェリン、約５ｎｇ／Ｉ１１のセレン、および上記のような抗生物質および／または殺真菌剤で補充したＤ？ＩＥ？ｌのような血清なしの培地を細胞表面積１ｃｍ”当り約１ｄ、培養物に添加し、その培養物を、約５％ＣＯ！の雰囲気下、約３７°Ｃで約１日〜約１０日間インキュベートする。あるいは、ＰＥＤＮＦは、約１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、約０．６２５　ｍＭのＨｅｐｅｓ　、、約６ｍＨのし一グルタミン、約１％の非必須アミノ酸類、約５μｇ／ａｆのインシュリン、約５μｇ／ｄのトランスフェリン、約５ｎｇ／ｄのセレン、上記のような抗生物質および／または殺真菌剤、および上記のような約０．５％〜約２０％のウソ胎児血清を補充されたＤＭＥＭのような血清含有培地から単離することができる。次に培地をプラスチック製の遠心分離管に注入して集め、約３．００Ｏｒｐｍで約１０分間遠心分離にかけて、培地から遊離の細胞と他の粒状物質を除き次いで濾過して不純なＰＥＤＮＦタンパク！溶液を得る。得られた培地はＰＥＤＮＦの精製もしくは試験に直接使用するか、または必要になるまで一２０°Ｃで貯蔵する。Ｃ６−・　１°のＰＥＤＮＰのＰＥＤＮＦは、眼を切開し次に硝子体と網膜を取り出すことによって眼から直接単離することができる。網膜色素沈着された上皮は使い捨て細胞スクレーバーを用いてＢｒｕｃｈの膜からかきとる０組織フラグメントをテフロン製またはガラス製のホモジナイザーに移して１０ｍＭリン酸緩衝食塩水（Ｐｕｓ）中に入れ、ホモジナイズして細胞を破壊する０次いでその溶液を約１０．００Ｏｒｐｍで約１０分間遠心分離にかけ次に濾過して細胞の破片を除去する。得られた上澄み液は、ＰＥＤＮＦを含有しているが、これを集めて不純なＰＥＤＮＦタンパク質溶液を得る。その培地は、ＰＥＤＮＦの精製もしくは試験に直接用いるか、または必要になるまで一２０℃で貯蔵する。Ｄ、　え　からのＰＥＤＮＦのまたＰＥＤＮＦは、ＰＥＤＮＦ遺伝子を発現するよう構築された組換え細胞からも単離することができる。　ＰＥＤＮＦは細胞内もしくは細胞外のタンパク質として発現させることができる。細胞内ＰＥＤＮＦは、Ｄｏｕｎｃｅなどの適切なホモジナイザーを用い、界面活性剤または他の可溶化剤例えば尿素もしくは塩酸グアニジンを含有していてもよいＰＢＳのような緩衝液中で細胞をホモジナイズし、次に約１０．００Ｏｒｐｍで約２０分間遠心分離にかけて細胞の破片を除くことによって単離し、不純なＰＥＤＮＦタンパク質の両分が得られる。細胞外のＰＥＤＮＦは、ＰＥＤＮＦを発現する細胞が増殖している培地を集めることによって単離する。この単離は、例えば５ｈａｒｐｌｅｓ遠心分離器を用い、連続遠心分離法で最も便利に実施される。そして上澄み液を集めて不純なＰＥＤＮＦタンパク質画分が得られる。得られた培地は、ＰＥＤＮＦの精製または試験に直接使用するか、または必要になるまで一２０°Ｃで貯蔵する。２、町μ促ｎ製不純なＰＥＤＮＦタンパク質の画分を硫酸アンモニウム沈澱法で部分的に精製して、硫酸アンモニウムで精製したＰＥＤＮＦタンパク質画分を得る。硫酸アンモニウムの％値は、２０℃における硫酸アンモニウムの飽和度の％値を示し、７６７ｇ／ｌの１００％飽和度に基づいた値である。不純なＰＥＤＮＦタンパク質両分１１当り固体の硫酸アンモニウム約３１３ｇを約２０°Ｃで添加することによって、不純なＰＥＤＮＦタンパク質画分を、硫酸アンモニウムで約５０％の飽和度にする。硫酸アンモニウムは、溶液を例えば機械撹拌器の撹拌棒で撹拌しながら、不純なタンパク質画分にゆっくり添加することが好ましい、硫酸アンモニウムはゆっくり添加して硫酸アンモニウムの濃度が局部的に高くなるの防止し、不純なタンパク質画分中に存在するタンパク質が急速に沈澱して変性することがないようにする。全硫酸アンモニウムを添加した後、得られた５０％硫酸アンモニウム溶液を約２０℃で約３０分間撹拌する０次にこの約５０％の硫酸アンモニウム溶液を約１０．０００　ｇで約２０°Ｃにて約２０分間遠心分離にかける。その上澄み液を集めてその後の処理に用いる。あるいは、その約５０％の硫酸アンモニウム溶液を−ｈａｔｍａｎ　１１のような濾紙で濾過して沈澱を除いてもよい。この場合、濾液を集めてその後の処理に使用する。得られた約５０％の硫酸アンモニウム溶液に約１３７ｇ／ｊ！の硫酸アンモニウムを添加して約７０％飽和度にする。その硫酸アンモニウムはゆっくり添加し、硫酸アンモニウムを全部添加した後、得られた約７０％の硫酸アンモニウム溶液を約２０℃で約３０分間撹拌する。その約７０％の硫酸アンモニウム溶液を上記のようにして遠心分離にかけるかまたは濾過し、沈澱を集める。次にその硫酸アンモニウムの沈澱を、約１０ｗ＋Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７のような緩衝液に再溶解して、５０〜７０％硫酸アンモニウム画分をイ乍る。得られた溶液を八−４ｃｏｎ　Ｄｉａｆｌｏ限外濾過装置を用し１てダイアフィルトレージョン（ｄｉａｆ　１ｌｔｙａｔｉｏｎ）を行うかまたは約１０＋＊Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７のような緩衝液に対して透析して、残留硫酸アンモニウムを再溶解した５０％〜７０％硫酸アンモニウム画分から除去する。ｉｉ、ＳＤＳ゛ル　０　法によるＰＥＤＮＦの　１ＰＥＤＮＦの小規模の単離は５Ｏ５−ポリアクリルアミドのスラブゲル中によって実施する。このようなポリアクリルアミトゲｌし番よ当該技１付分野では公知であり、そしてこのようなゲルの製造法番よ（よ、１ｌｅｂｅｒおよび０ｓｂｏｒｎ＋　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、＋　２４４巻、４４０６頁、１９６９年に報告されておりまたＬａｅ＋＊ｎｉ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７７巻、６８０頁、１９７０年によって改変されている。不純なＰＥＤＮＦタンパク質両分または硫酸アンモニウムで精製したＰＥＤＮＦタンパク質両分の試料を、約１０＃Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液２７．５のような緩衝液に対して透析し、凍結乾燥し、次し１で、６２．５蒙−トリスｐＨ６，８、２％ＳＯ３，１０％グリセリン、０．００１％ブロモフェノールブルーおよび０．１Ｍ２−メルカプトエタノ−Ｊし中に再度ｔ＄遊させる。なおこのなかのプロモフェノールブＪレーは泳動マーカーである。上記ゲルに加える追加の試料は、ホスホリラーゼＢ、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、カルボニックアンヒドラーゼ、大豆トリプシン阻害剤およびリゾチーム（例えばＢｉｏ−Ｒａｄ社力（（共給している。カタログ番号＃　１６１−０３０４）のような分子量標準、ならびに必要な場合は対照を含有している。ならし培地を試料として用し）る場合、ＲＰＥ細胞に暴露されなかった培地（非ならし１合ゝ）Ｇよ対照として含められる。次に、試料を清水浴中で約５分間インキュベートし、次いで５ＯＳ−ポリアクリルアミドのスラブゲル中に負荷する。マーカーと非ならし培地をゲルの外側のウェル中に入れ、そして不純なＰＥＤＮＦタンパク質両分または硫酸アンモニウムで精製したＰεＤＮＦタンパク質画分は残りの内側のウェルに入れる。次いで試料を電気泳動にかける。この電気泳動は、ブロムフェノールブルーのマーカーがゲルの底部に到達するまで続けるｅ、Ｗ気泳動を終って、ゲルの各外側の端縁からのストリップ（マーカーおよび不純なＰＥＤＮＦタンパク質両分と非ならし培地の対照の各々レーン含有している）をクーマシーブルーで染色した。染色されたストリンプ上に展開する染色タンパク質のハンドは、ゲルの未染色部分と並び、不純なＰＥＤＮＦのタンパク質両分または硫酸アンモニウムで精製されたＰＥＤＮＦのタンパク質画分には存在しているが対照の培地には存在していないタンパク質の位置を示す。不純なＰＥＤＮＦタンパク質の両分に特有の見掛けの分子量が約ｓｏ　、　ｏｏ。〜約５５．０００のＰＥＤＮＦタンパク譬ダブレシダブレットり、そのタンパク質を、当該技術分野で公知の方法によって、ゲルの未染色の部分から電気溶出させた。溶出液を遠心分離にかけてゲルのフラグメントを除き、次いで上澄み液をｌＯ−一リン酸緩衝食塩水（１４５ｍＭ　ＮａＣｌ。８．１　＋Ｍ　ＮａｔＨＰＯａおよび１．９　ｍＭ　ＮａＨｚＰＯａ　’　ＨｚＯ）に対して透析して５Ｏ５−ポリアクリルアミドで精製したＰＥＤＮＦタンパク質画分を得る。ｊｉ、カチオン六　ｌ（Ｐ［、ＣによるＰＥＤＮＦの　ｌｌ不純なＰＥＤＮＦタンパク質画分または硫酸アンモニウムで精製したＰＥＤＮＰタンパク質両分を、水または約１０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７，２もしくは他の適切な緩衝液のような緩衝液に対して透析して不純なタンパク質の試料から培地と塩を除＜　、　ＰＥＤＮＦは、４．３　Ｘ３０ｍ−のカラムのようなカラムに充填され、米国、カリフォルニア州、テメクラ所在の−ｅｓｔｅｒｎ　Ａｎａｌｙｔｉｃａ１社が商品名“Ｂｒｏｗｎｌｃｅ　Ａｑｕａｐｏｒｅ　ＣＸ−３００”で市販しているクロマトグラフィーの媒体もしくは他の適切なカチオン交換ＨＰＬＣクロマトグラフィーの媒体のようなカラムクロマトグラフィーの媒体を用いるカチオン交換ＨＰＬＣで精製することができる。上記のクロマトグラフィーの媒体は約１０−Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ７，２のような緩衝液を平衡状態にする。上記の透析された不純ＰＥＤＮＦタンパク質両分または硫酸アンモニウムで精製したＰＥＤＮＦタンパク質両分を上記のクロマトグラフィーの媒体に加え、次にＰＥＤＮＦが結合したクロマトグラフィーの媒体を、約１０ＭＭのリン酸緩衝液ＰＩ（７，２のような緩衝液で洗浄して、未結合のタンパク質をすべて該クロマトグラフィー媒体から洗い流す。約０．０〜約０．５　Ｍ　ＮａＣ１の線形塩勾配液を用いてＰＥＤＮＦをクロマトグラフィー媒体から溶出させる。ＰＥＤＮＦは、約０．２５Ｍの濃度のＮａＣ１によって単一ピークとして溶出する。溶出されたＰＥＤＮＦを凍結乾燥によってｉｌｌ縮し、水または約１０５Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ７，２のような緩衝液もしくは他の適切な緩衝液に再び溶解可能にしてカチオン交換ＨＰＬＣで精製されたＰＥＤＮＦタンパク質両分を製造する。ｉｖ、ＨＰＬＣによるＰＥＤＮＦの　１不純ＰＥＤＮＦタンパク質画分または硫酸アンモニウム精製ＰＥＤＮＦタンパク質画分を、約１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，２もしくは他の適切な緩衝液のような緩衝液に対して透析して不純タンパク質の試料から培地と塩を除く。ＰＥＤＮＦは、４．６　Ｘ２５０　＋＊ｍのカラムのようなカラムに充填され、米国、カリフォルニア州、ヘスベリア所在のＴｈｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎＧｒｏｕｌ＋が商品名”Ｖｙｄａｃ　Ｃ８”で市販しているクロマトグラフィーの媒体もしくは他の適切な逆相１１ＰＬｃクロマトグラフイーの媒体のごときクロマトグラフィーの媒体を用いる逆相ＨＰＬＣで精製することができる。上記のクロマトグラフィーの媒体を、約０．１容量％のトリフルオロ酢酸（ＴＰＡ）のような溶液と平衡状態にする。上記の透析された不純ＰＥＤＮＦタンパク譬両分または硫酸アンモニウム精製ＰＥＤＮＦタンパク質両分を上記クロマトグラフィーの媒体に加え、次にＰＥＤＮＦが結合したクロマトグラフィーの媒体を例えば０．１容量％のＴＰＡのような溶離液で洗浄して、すべての未結合タンパク質をクロマトグラフィーの媒体から洗い流す、　ＰＥＤＮＦは、約０．１％ＴＦＡ水溶液〜約９５％アセトニトリル（ＣＨｊＣＮ）、　０．１％ＴＦ＾および水５％の線形勾配液でクロマトグラフィー媒体から溶出される。　ＰＥＤＮＰは約７０％の濃度のＣ）ＩｊＣＮによって単一のピークとして溶出する。溶出されたＰＥＤＮＦを凍結乾燥によってｉ＊ｍし、水または約１０５Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ７，２のような緩衝液もしくは他の適切な緩衝液に再び溶解可能にして逆相ＨＰＬＣで精製されたＰＥＤＮＦタンパク質両分を製不純ＰＥＤＮＦタンパク質画分、硫酸アンモニウム精製ＰＥＤＮＦタンパク質画分、カチオン交換ＨＰＬＣ精製ＰＥＤＮＦタンパク質百分、または逆相ＨＰＬＣ精製ＰＥＤＮＦタンパク質両分は、７．５　Ｘ３００　ｍ−のカラムのようなカラムに充填され、米国、カリフォルニア州、リッチセントに所在のＢｉｏ−Ｒａｄ社が商品名″Ｂｉｏ−Ｒａｄ　ＴＳＫ−２５０”で市販しているようなりロマトグラフィー媒体を用いるサイズ排除クロマトグラフで精製することができる。不純ＰＨ１１ＮＦタンパク質両分、硫酸アンモニウム精製ＰＥＤＮＦタンパク質画分、カチオン交換ＨＰＬＣ精製ＰＥＤＮＦタンパク質両分または逆相ＨＰＬＣ精製ＰＩ！ＤＮＦタンパク質画分をサイズ排除クロマトグラフィーの媒体に加える。なおこの媒体は０．０２Ｍ　）リス−１（Ｃ１ｐ）１７．０．０．６Ｍ　ＮａＣｌのような緩衝液を予め平衡させた。　ＰＥ［ｌＮＦを含有する両分を集めて、約１０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７，２のような緩衝液に対して透析してサイズ排除法で精製したＰＥＤＮＦタンパク質百分が得られる。 ■、ヘパＩンクロマ　グーフィーまた、不純ＰＥＤＮＦタンパク質両分または硫酸アンモニウム精製ＰＥＤＮＦタンパク質画分はヘパリンクロマトグラフィーでも精製することができる。米国、ミズーリ州、セントルイスに所在のＳｉｇ剛ａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、社が市販しているヘパリンアガロース（カタログＮｏ。Ｈ−５３８０）のようなヘパリンクロマトグラフィーの媒体を、約１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，５のような緩衝液と平衡させる。不純ＰＥＤＮＦタンパク譬百分または硫酸アンモニウム精製ＰＥＤＮＦタンパク質画分を、約１０ｍＭのトリスｐＨ７，５のような緩衝液に対して透析して試料から塩もしくは培地を除去し、次いでこの透析されたＰＥＤＮＦ溶液を平衡させた上記のヘパリンアガロースに加える。ＰＥＤＮＦ溶液をヘパリンアガロースに加えた後、ヘパリンアガロースを約１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，５のような緩衝液で洗浄してすべての未結合タンパク質をヘパリンアガロースから溶出させる０次に約１０ａ＋Ｈのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，５，０，５Ｍ　ＮａＣ１のような緩衝液でＰＥＤＮＦをヘパリンアガロースからン容出させる。ＰＥＤＮＦを含有する溶出液を、次に、Ａｍ１ｃｏｎ　Ｄｉａｆｌｏ限外濾過装置でダイアフィルトレージョンを行うか、または約１０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ１，５のような緩衝液に対して透析し、溶出液中に存在するＮａＣｌを除去して、ヘパリンで精製されたＰＥＤＮＦタンパク質画分が得られる。上記の精製法は、不純ＰＥＩ）ＮＦタンパク質画分または硫酸アンモニウム精製ＰＥＤＮＦタンパク質画分を出発物質として用いて行い、次いでカラム精製法を実施することができる。あるいは、上記クロマトグラフィーステップの一つ以上ですでに精製したタンノ々り譬画分も使用することができるであろう、それ故に、この精製法は、単独で用いるか、または互いにもしくは当該技術分野で公知の他の精製法と組合わせて用いて所望の純度のＰＥＤＮＰタンパク質画分を製造できる。ＰＥＤＮＦの大規模精製は硫酸アンモニウム沈澱法によって行われ、硫酸アンモニウム精製ＰＥＤＮＦタンパク質両分が得られる。不純ＰＥＤＮＦタンパク質両分にＩＬ当たり約３１３　ｇの固体硫酸アンモニウムを添加することによって、硫酸アンモニウムで約５０％飽和度にする。硫酸アンモニウムは、溶液を例えば機械式撹拌機の撹拌バーで撹拌しながら不純タンパク質画分にゆっくり添加することが好ましい。硫酸アンモニウムは、その濃度が局部的に高くなって、不純タンパク質両分中に存在するタンパク質が急速に沈澱し変性するのを防止するためゆっくり添加する。硫酸アンモニウムを全部添加してから、その５０％硫酸アンモニウム溶液を、２０°Ｃで約３０分間撹拌する。得られた５０％硫酸アンモニウム溶液を約１０．０００ｇで２０°Ｃにて約２０分間遠心分離する。生成した上澄み液を集めてさらに処理を行う。あるいは該５０％硫酸アンモニウム溶液を、Ｗｈａｔｍａｎ　１１のような濾紙で濾過して沈澱を除いてもよい。そしてその濾液を集めてさらに処理を行う。得られた５０％硫酸アンモニウム溶液に約１３７ｇ／ｆｆｉの硫酸アンモニウムを添加することによって約７０％の飽和度にする。硫酸アンモニウムはゆっくり添加し、全硫酸アンモニウムを添加し終わってから、その７０％硫酸アンモニウム溶液を２０°Ｃで約３０分間撹拌する。そしてその７０％硫酸アンモニウム溶液を前記のように遠心分離にかけるかまたは濾過し、次いでその沈澱を集める。得られた硫酸アンモニウムの沈澱を約１（１＋＋Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ７のような緩衝液に再溶解して５５〜７０％ｆＬ酸アンモニウム画分を製造し、次にＡｍ１ｃｏｎ　Ｄｉａｆｌｏ限外濾過装置を用いてダイアフィルトレージョンを行うかまたは約１０ｍＭのリン酸アンモニウム緩衝液ｐＨ７に対して透析して再溶解された５５〜７０％画分から硫酸アンモニウムを除いて硫酸アンモニウムで精製したＰＥＤＮＦタンパク質画分が質成分る。ｉｉ、アニオン六　クロマトブーツ４−ＰＥＤＮＦタンパク質のｐｒは約３．９〜約７．２である。したがって、約７．５のｐＨ下で、このタンパク質は正味の負の電荷を有し、ＤＥＡＥ　（ジエチルアミノエチル）セルロースのようなアニオン交換クロマトグラフィーの媒体に結合する。使用するため、ｔｌＥＡＥセルロースのようなアニオン交換クロマトグラフィーの媒体を約ｔｏｅ−〇トリスｐ８７．５の緩衝液のような緩衝液と平衡させる。　ＰＥＤＮＦをアニオン交換カラムダラフイーの媒体に加え、その媒体を約１０ｍＭ　）リスｐＨ７，５のような緩衝液で洗浄して、すべての未結合タンパク質をカラムから溶出させる。未結合タン）＜り質をすべて溶離した後、約１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，５１１衝液のような緩衝液中、約０〜約Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１の線形塩勾配液でＰＥＤＮＦを溶出させる。ＰＥＤＮＦを含有する画分を集めてプールする。これらの画分を次にダイアフィルトレージョンにかけるかまたは約１０−Ｍのトリス−）１ｃＩ　ｐＨ７，５ＩＩ街液のような緩衝液に対して透析してＮａＣｌを除去し、その結果アニオン交換クロマトグラフィーで精製されたＰＥＤＮＦタン／ぐり賞画分が得られる。アニオン交換クロマトグラフィーは、７１′・ンチもしはくカラムのクロマトグラフィーによって実施することができる。ｉｉｉ　、ヘパリンクロマトグラフィーヘパリンクロマトグラフィーもＰＥＤＮＦの大規模精製に用０ることができる。　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、社が供給しているヘパリンアガロース（カタログＮｏ、　Ｈ−５３８０）のようなヘパリンクロマトグラフィーの媒体を、約１０−Ｍのトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５のような緩衝液と平衡させる。不純ＰＥＤＮＦタンパク質画分または硫酸アンモニウム精製ＰＥＤＮＦタンパク質画分を、約１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５の緩衝液のような緩衝液に対して透析し、次いでヘパリンアガロースに加える。ＰＥＤＮＦ溶液をヘパリンアガロースに加えた後、そのヘパリンアガロースを約１１０ｌ１１トリス−）ＩＣＩ、　ｐＨ７，５の緩衝液のような緩衝液で洗浄して、未結合のタンパク質をすべてヘパリンアガロースから溶出させる１次に、約１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ１，５，０，５Ｍ　ＮａＣｌ　のような緩衝液を用いて、ＰＥＤＮＦをヘパリンアガロースから溶出させる。ＰＥ［ｌＮＦを含有する溶出液を集め、次にＡｍ１ｃｏｎ　Ｄｉａｆｌｏ　ｉｌｌｌｌ外装過装置イアフィルトレージョンを行うかまたは約１（１ｗＨのトリス −ＨＣｌ。ｐｌ（７，５の緩衝液のような緩衝液に対して透析して溶出液中に存在するＮａＣ１を除去し、ヘパリンで精製されたＰＥＤＮＦタンパク質画分を質成分上記精製法は、不純ＰＥＤＮＦタンパク質画分または硫酸アンモニウム精製ＰＥＤＮＦタンパク質両分を出発物質として用いて行い、次いでカラム精製法を実施することができる。あるいは、上記クロマトグラフィーのステップの一つ以上によってすでに精製したタンパク質両分も使用できる。したがうてこの精製法は、単独かまたは互いにもしくは当該技術分野で公知の他の精製法と組合わせて用いて、所望の純度のＰＥＤＮＦタンパク質画分を質成分る。３、匹肋り辺検定Ａ、剣とｙ上！λ床勉広ＰＥＤＮＦは、例えば７．５％、１０％、　１２．５％の５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル上のＳ［ＩＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって同定することができる。このようなゲルの製造については−ｅｈｅｒと０ｓｂｏｒｎが報告し、Ｌａｅｓ＊Ｉ　ｉがそれを改変しているが、このようなゲルの製造と使用は当該技術分野で公知である。ＰＥＤＮＦタンパク質の試料に、約５μｌの６２．５ｓＭ　ｌ−リスｐＨ６，８、１２％ＳＯ５，０，００１％ブロモフェノールブルー、１０％グリセリンおよび０．１Ｍ２−メルカプトエタノールを混合する。なおブロモフェノールブルーはマーカーである。ホスホリラーゼＢ、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、カルボニックアンヒドラーゼ、大豆トリプシンインヒビターおよびリゾチーム〔例えばＢｉｏ−Ｒａｄ社が供給している（カタログ番号＃１６１−０３０４）　］のような分子量標準を含有する分子量マーカーを対照として含有させる。ＰＥＤＮＦタンパク賃の試料と分子量標準を約５分間沸騰させ、次いで５ＯＳ−ポリアクリルアミドスラブゲルに加える。次にブロモフェノールブルーがゲルの底部に泳動するまで試料を電気泳動にかける。を気泳動を終って、ゲルを、眼で染色するか、クーマシーブルーで染色するか、または他の適切なタンパク質染色法で染色する。次に、ＰＢＤＮＦ試料中のタンノくり質の分子量を分子量標準と比較する。ＰＥＤＮＦは、ｓｏｓポリアクリルアミドゲル上約５０，０００〜約５５．０００の見掛けの分子量のタンパク質ダブレットとして泳動する。Ｂ、三去ニュ１Ｍ盪作タンパク質試料のＰＥＤＮＦ活性はニューロン誘導性で検定することができる。各種の濃度のＰＥＤＮＦをＹ７９綱膜芽腫（ＲＢ）細胞の培養物に添加する。なおこのＲＢ細胞は米国、メリーランド州、ロンクビル所在のｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　丁ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎが供給してし）る（受託番号ＨＴ８１Ｂ）。このＹ７９　ＲＢ細胞を浮遊培養法で増殖させる。該細胞と、室ｉ４こおいて、約９００　ｒｐ−で約５分間遠心分離にかけることによって収穫し、５Ｍｇ／ｍｌインシュリン、５Ｍｇ　／　ｄ　）ランスフェリン、５Ｍｇ／ｄ亜セレン酸および８７６．６　μｇ／ｄＬ−グルタミンを補充したダルベンコ変性イーグル培地（血清なし培地）のような血清なし培地に再び浮遊させる。なおこの血清なし培地は約３７°Ｃまで予め加温しておく。集めた細胞を、約１０６細胞／ｄの濃度で血清なし培地に再度浮遊させる。この細胞浮遊液の約２５′ｌＩｌ中に約５０〜約５００　ｎｇ／ＪｌｉのＰＥＤＮＦを添加する。その細胞を約３７°Ｃで約７日間インキヱベートし、次いでポリーＤ−リジンでコートしたフラスコもしくはガラス製カバースリップに付着させる。このポリー〇−リジンでコートされたフラスコは、約２００μｇ　／　ｍｌのポリーＤ−シリン〔例えばＳｉｇｍａ社が供給しているもの〔カタログ＃Ｐ７４０５）がある〕を含有する溶液を用いて約１〜２４時間コーティングを行い次いで水と血清なしの培地ですすぐことによって製造する。１、鞭胆勿立捉付着した細菌の形態は、日本国、東京、所在のニコン社が供給しているＤｉａｐｈｏｔ　ＴＭＤ倒立顕微鏡のような顕微鏡を用いて生細菌の位相差顕微鏡検査を行うか、または日本国、東京所在のオリンパス社が供給しているＢＨＳ−ＢＨ２顕微鏡のごとき顕微鏡を用いて、０．Ｉ　Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液に溶解して作製した約４％のパラホルムアルデヒドの溶液ような固定液で固定した細胞の微分干渉コントラスト顕微鏡検査を行うことによって毎日監視する。分化は、細胞集合体の百分率を計算することによって評価する（浮遊培養物からプレートされたＹ７９細胞の９０％以上は５個以上の細胞を含有する集合体としてポリーＤ−リシンでコートされたフラスコに付着する）。この分化中、細胞は、付着させてから１．３゜７および１１日日日突起（ｐｒｏｃｅｓｓ）を伸ばす。実験は３回づつ行い、２回繰返した。ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）とニューロフィラメント２００，０００分子量タンパク質サブすニント（ＮＦ２００）の発現を免疫蛍光で監視し、エピフルオレッセンス顕微鏡検査（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ＋＊１ｃｒｏｓｃｏｐｙ）　（オリンパスＢｉａｓ−ＢＨ２ｉ！Ｊ微鏡）または顕微蛍光分光分析法（＋５ｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏ＋＊ｃｔｒｙ）　（ＭＳＡ＋　Ｆａｒｒａｎｄ　ＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅＳｐｅｃｔｒｕ−＾ｎａｌｙｚｅｒ）で監視する。定量化は次のようにして行う、すなわちｌ　）　４８５　ｎ−励起時の蛍光強度の目視得点：十−弱；＋＋＝中程度；＋＋十−強；　＋＋＋＋−非常に強いおよび２）顕微蛍光分光分析（ＭＳ＾）の読取り（μＡＸ１００．約０．３秒の時定数；試料の大きさは約２ｎｓ＋もしくは約１００個の細胞／集合体；標的の大きさは約１５μｍもしくは１細胞の大きさにほぼ等しい）によって行う。タンパク質の試料中にＰＥＤＮＦが存在すると、Ｙ７９１１Ｂ細胞が神経突起様の突起を伸ばす。約５００　ｎｇ／　ａｆの濃度で約７０％の細胞が神経突細胞を上記のようにして培養した０次にその細胞を、生菌の位相差顕微鏡検査（オリンパスＩＭＴ−２）および約４％のパラホルムアルデヒドのような固定液で固定された細胞の微分干渉コントラスト顕微鏡検査（オリンパスＢＨ５）によって毎日監視する１分化している細胞の百分率を、ポリーＤ−リジン基底上で８〜１０日間培養して神経突起様成長を示す細胞を５個以上含有する細胞集合体の数を数えることによって推定する。約５０〜約５００ｎｇ／ｄのＰＥＤＮＦによって、約８０％の細胞が約３日以内に形態分化を行う。精製ＰＥＤＮＦ約５００μｇをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　１０マイクロコンセントレータ−（米国、メリーランド州、ダンバース所在のＡｍｌｃｏｎ社）を用いて濃縮し、次いで約２５１０トリス、ｐ）ＩＢ、５　、　１　ｍＭ　ｌ１ＤＴＡのような適切な消化緩衝液で希釈する。得られたタンパク質試料に、例えば米国、インディアナ州、インディアナポリス所在のＢｏｃｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｓ社が供給しているエンドブロティナーゼＬｙｓ−Ｃのようなタンパク質分解酵素を添加する。得られたＰＥＤＮＦ／プロティナーゼ混合物を約３゜°Ｃで約１８時間インキュベートするか、または反応が完了するまですなわち全ＰＥＤＮＦが該プロティナーゼによって完全に消化されるまでインキュベートする。あるいは、該タンパク質は、約１０ｍＭのＰＢＳを含有する緩衝液中トリプシンで消化するか、または当該技術分野で公知の他のプロティナーゼを用いて消化してもよい。得られたＰＥＤＮＦポリペプチドフラグメントを例えばＶｙｄａｃ　Ｃ８逆相カラムによるＨＰＬＣのごとき分離システムを使って分離する。　４．６　Ｘ２５０　＋＊ｍのカラムが本発明で使用するのに適している。このカラムは約０．１％ＴＦＡの水溶液と平衡させる。ポリペプチド類は、約９０％ＣＨｆｆＣＮ、　０．１％ＴＦ＾および５％の水によって溶出される。カラムから溶出されて他のポリペプチドから良好に分離されたポリペプチド類を集めて、タンパク質の配列決定分析にかける。Ｂ、ンパク　の　１精製されたポリペプチドフラグメントを、当該技術分野で公知の方法によってアミノ酸配列分析に付する。あるいは、アミノ酸配列分析は、アミノ酸の配列を決定する機関、例えば米国、カリフォルニア化、ｔｈｅ　Ｃ１ｔｙ　ｏｆ　Ｈｏｐｅ　ｉｎ　Ｄｕａｒｔｅ所在のｔｈｅ　ＭｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＦａｃｉｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｂｅｃｋ＊ａｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅと契約して行うのが便利である。５、ＰεＤＮＦ′−のオリゴヌクレオチドを、ＰＥＤＮＦの単離されたポリペプチドに対応する配列から、八Ｂｌ　３９２　ＤＮ＾／ＲＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒもしくは当該技術分野で公知の方法によって構築した。このオリゴヌクレオチドを、米国、カリフォルニア化、エメリーピルに所在のＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社が商品名“Ｇｅｎｅ　ＡＭＰ″で市販している、Ｔｅｃｈｎｅ　ｔｈｅｒｖａｌ　ｃｙｃｌｅｒ　、標準試薬および手順を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＧＩ１）のプライマーとして使用する。ヒト胎児の眼のＣｈａｒｏｎ　ＢＳ　ｃＤＮＡライブラリーを、Ｔｅｃｈｎｅ　ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ、標準試薬および手順を用いるＰＣＲ法で選別する。核反応で生成した。ｃＤＮＡフラグメントを、米国、ニューヨーク州、コールドスプリングハーバ−所在のＣｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ社発行の”Ｍｏ１ｅｃｕｔａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｙ　Ｍａｎｕａｌ”第２版にＳａｍｂｒｏｏｋらが報告しているように（１９８９年）　、ＮＡ−４５０ＥＡＥセルロ一ス紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕ１１社）を用いて３％Ｎｕｓｉｅｖｅ３　：　１ゲル（ＦＭＣＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）上に単離する。なお上記文献は本願に援用する。この選別法を要約すれば次のとおりである。すなわち、前記ライブラリーの約１．５および５０μｉを採取し、６００ｐＮのシリコン処理反応管に入れ、次いで２回蒸留した滅菌水を用いて最終容積を約７４μｌにする。ファージの粒子を約７０℃で約５分間インキエヘートすることによって破壊し次いで氷水上で冷却する。ＰＣＲのマスターミックス（ｖｌａｓｔｅｒ　５ｉｘ）を、６００ｔＩｊ！反応管を使ヮて次のようにして３つの反応管に作製する。１０χＴａｑポリメラーゼ緩衝液３０μｌ；ｄＮＴＰミ、クス２４μｌ；および適当な容積の二回蒸留の芸留水を加えてマスターミックスを最終容積的７８μｌにする。したがって最終溶液は、約１９２１のＭＣＩ　、　３８．５ｍＭのトリス−）１ｃＩ。ｐＨ８，５、５１，８＋ｗＭのＭｇＣＩｔ　、　０．０３８％（Ｗ／Ｖ）のゼラチン、０．７７ｍＭの各ｄＮＴＰ、および３．８ｔｔｌの各ヌクレオチドプライマーで構成されている。約２６μ２のマスターミックスを各反応管に添加する。ライブラリーの一部分とマスターミックス溶液を約１００　μｌの鉱油で覆い、約９４℃で約５分間加熱する。得られた溶液を所望のプライマーのアニーリング温度に平衡させる。該溶液を所望のブライマーアニーリング温度に平衡させてから、約１．５μｔのＴａｑポリメラーゼを該溶液に加え約２０分間インキュベートする。熱サイクリングを約７２°Ｃで約３分間インキュベートすることによって続けてプライマーを伸長させる。しかしこのプライマーの伸長時間は所望によづて変えることができる。すなわち約９４°Ｃで約１分間約２０秒間にて鋳型から伸長生成物を変性し；および約３７℃で約２分間にてプライマーを鋳型にアニールし；および７２℃で約３分間にてプライマーを伸長させる。この“サイクル”は合計約２５〜約３０サイクル繰返す。最後のサイクルが終ってから、７２°Ｃで約７分の最終のプライマー伸長ステップを加える。フラグメントは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社が商品名“Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ　Ｒａｎｄｏｍ　ＰｒｉｓｅｒＬａｂｅｌｉｎｇ　ＫｉＬ”で市販しているキットを用いてランダムプライミングを行うことによって０ｐで標識を付ける。その標識をつけたプローブは、Ｃｈａｒｏ　ＢＳ　ｃＤＮ＾ライブラリーの約２００．０００のプラーク形成単位を当該技術分野で公知の方法によって選別するのに用いる。陽性のクローンを単離し、次に米国、カリフォルニア化、５ｔｕｄｉ。Ｃ１ｔｙ所在のＱｉａｇｅｎ　Ｉｎｃ、社が商品名“Ｑｉａｇｅｎ　Ｍａｘｉ″ で供給している試薬でＤＮＡを精製する。ファージヘクター内の挿入断片を適切な制限酵素で切り取り、米国、マサチューセッツ州、ビバリーに所在のＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社が供給しているＴ４　ＯＮ＾リガーゼを用いて円形にし、次いでこれを用いて、米国、カリフォルニア州、う・ホーヤに所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ。Ｉｎｃ、社が供給しているコンピテント　イー・コリ５ｕｒｅ細胞を形質転換する１次にこの細胞をアンピリジン／Ｘ−ガルプレート上にプレートする。白色コロニーを選別し、Ｑｉａｇｅｎ社が供給している。ｉａｇｅｎプラスミド・ミニブレンプ試薬を使ってミニブレツブ（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ）を行う。精製されたプラスミドを消化して挿入断片を切り取り、フラグメントをゲル電気泳動で分離して挿入断片の大きさを測定する。次いで適正な大きさの挿入断片を有するクローンを選択してその後の試験に用いる。Ｂ−賭１死■分析配列の分析は自動シークエンサーまたは当該技術分野で公知の他の方法で行う。６、　え　のｐＢ　云　のＰＥＤＮＦの商業的なすなわち大量生産は、遺伝子を適切なベクター中にクローン化した後、適切な宿主細胞内で発現させることによって達成することができる。このような適切なベクター／宿主系はバキュロウィルス／昆虫細胞系である。本発明の一つの実施態様では、ＰＥＤＮＦ遺伝子は、Ｌｉ　ｔｈｇｏｗらがＤＮＡ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　１０４！、４４３〜４４９頁、１９９１年に報告しているｐＡｃ３７３　；　Ｇｈｉａｓｉ　ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１８５巻、１８７〜１９４頁、１９９１年に記載されているｐＶＬ９４１　；または当該技術分野の当業者にとって公知の他のバキュロウィルス・トランスファーベクターのようなバキュロウィルス・トランスファーベクター中にクローン化される。一般に、このようなベクターは、ＳｕｍｍｅｒｓとＳｍ１ｔｈが報告してぃＰＥＤＮＦ　Ｊ枡竿は一鮪檜箕を瑠宿キを増殖させる培抽から蛍凹ネｈ。るｐＡｃ３７３のようなトランスファーベクター（バキュロウィルスベクターと昆虫細胞培養法のマニュアル、Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｊｃ、　Ｅｘｐ、　５ｔａｔｉｏｎＢｕ１１．１５５５号、この文献は本願に援用する）に挿入されている、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）のポリへドリンプロモーターを含有している。組換えプラスミドは、当該技術分野で公知の方法例えば、米国、ニューヨーク州、コールドスプリングハーバ−所在のＣｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｙ発行のＭａｎｉａｔｉｓら、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　’に記載の方法で製造される。なおこの文献は本願に引用する。ニス・フルギベルダ（Ｓ、　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）　（ＳＦ３）のような宿主細胞を、ｌＯ％ウシ胎児血清で補充した。　ＧＩＢＣＯ社市販のＴＣ１００培地で増殖させる。　、：、（７）Ｓｆ９細胞を、精製感染性ＡｃＮＰＶ　［ｌＮＡ　ｖ３１　ｕ　ｇおよび組換えＤＮＡ約５０ｕｇでコトランスフェクトさせさせる（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）　＊トランスフェクションを終ってから約４日後に、培養物の上澄み液を収穫する０組換えウィルスをプラークハイブリッド形成法または産生されるタンパク質の放射能標識法によって同定する。上記説明は、ベクター／宿主の発現系におけるＰＥＤＮＦ遺伝子の発現の一例を示す、当該技術分野では他の発現系が知られている０例えばサツカロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｓｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が、Ｓｉ　ｊａｒら、Ｇｅｎｅ、　１０４巻、９９〜１０２頁、１９９１年、Ｄｉｅｔｒｉｃｈら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋＊、、　２０１巻、３９９〜４０７頁；　１９９１年もしくはＡｋｉｙｏｓｈｉ−３ｈｉｂａｔａら、ＩＩＮＡ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｊｏｌｏｇｙ＋　１０巻、６１３〜６１２頁、１９９１年に記載されているようないくつかのベクターＨＮａｋａｎｏらＧｅｎｅ、　１０５巻、１７３〜１７８頁、１９９１年に記載されているようなＨｅＬａ宿主細胞の組換えワタシニアウイルスベクターとともに用いられている。このような方法または当該技術分野で公知の他の方法は、ＰＥＤＮＦ遺伝子を発現させるのに本発明で用いるのに遺している。Ｊ−１す、　′量↓六＆ｊｌｌｌｌｒ山ｌＩ　えゲ冑百　ノマシニシ　フ　Ｌ　ユ　１！−−ツ　！ｔ　言ｔ　−工に＾　ｌ−警ｊ噌る場合は輸送されるタンパク質として発現されるか、またはリーダーペプチドを欠失していることによって細胞内タンパク質とて発現され、この場合ＰＥＤＮＦには宿主細胞から単離される。このように単離されたＰＥＤＮＦは次に前記の方法で精製する。７、ハ賎り尺走王墳里Ａ、■婆皿■血沫ＰＥＤＮＦは単独かまたは他の臨床の（例えば外科の）処置とあいまって投与する。　ＰＥＤＮＦは、硝子体内、網膜下、静脈内もしくは筋肉内の注射または腫瘍増殖部位への注射もしくは塗布によって投与する。ＰＥＤＮＦは、単独で投与するかまたはポリ乳酸のようなＰＥＤＮＦのゆっくりとした“持効性放出”を容易に行えるようにする化合物とともに投与することができる。一般に、生理的食塩水または他の緩衝溶液中約１〜約１１００ｕ／Ｉｄの濃度で約０．０１〜約１０μｇのＰＥ［ＩＮＦが１回服用量として投与され、そして１日当り約０〜約１０回投与される。持効性放出化合物は、組成物に含有されている場合、約１〜約１００μｇ／ｄの濃度で使用される。治療は、腫瘍増殖の停止および／またはｌＩ瘍の退行が観察されるまで続ける。ＰＥＤＮＦによる治療は、網膜芽腫のような網膜の腫瘍、神経芽細胞１瘍のような他のニューロンの腫瘍、または非ニューロン起源の腫瘍に対して有効である。この治療によって、細胞分裂が停止するかまたはその速度が低下し同時に腫瘍の増殖速度が低下し、その結果腫瘍が退行する。Ｂ、Ｊの　声の　・ｆｊｉ、ＰＥＩＩＮＦは単独で投与するか、または他の臨床の（例えば外科の）処置とあいまって投与する。ＰＥＤＮＦは硝子体内もしくは網膜下に投与される。　ＰＥＤＮＦは、単独で投与するか、またはＰＥＤＮＰのゆっくり化合物とともに投与してもよい、一般に、生理的食塩水または他の緩衝溶液中、約１〜約１００μｇ／ｄの濃度で約０．０１〜約１０ＩＩｇ（７１ＰＥＤＮＦが１回服用量として投与され、そして１日当り約０〜約１ｏ回投与される。持効性放出化合物は、組成物に含有されている場合、約１〜約１００μｇ／ｄの濃度で使用される。治療は病状の進行が停止するかおよび／または快方に向かうまで続ける。ＰＥＤＮＦによる治療は、神経網膜、網膜色素上皮および他の眼の組織の疾患に対して行われる。治療の結果、光受容体および他の眼細胞の生存と良好な状態が高まり、それらが機能する寿命が延長され、視覚の悪化が始まり失明に至ることが遅くなる。Ｃ１した　の　よ　・汁、ＰＥＤＮＦは単独で投与するか、または他の臨床の（例えば外科の）処置とあいまって投与する。ＰＥＤＮＦは、静脈内もしくは筋肉内の注射または神経の損傷部位への塗布もしくは注射によって投与する。ＰＥＤＮＦは、単独で投与するか、またはＰＥＤＮＦのゆっくりとした“持効性放出”を容易に行えるようにするポリ乳酸のような化合物とともに投与してもよい、一般に、生理食塩水または他の緩衝溶液中、約１〜約１００　ｉｔ　ｇ／ｄ（Ｄ濃度で約０．０１〜１０ＩＩｇ　（７）ＰＥＤＮＦを１回服用量として投与し、そして１日当り０〜約１０回投与される。持効性放出化合物は、組成物中に含有されている場合、約１〜約１１００ｔＩ／ｄの濃度で使用される。治療は神経の再生が完了するまで続ける。ＰＥＤＮＦによる治療は神経の損傷部に行われる。治療によって、神経突起の生成と神経の再生が促進される。。Ｄ、セリンブロティナーゼに　゛　るｒ　のＭｉＪＰＥＤＮＦはセリンブロティナーゼの阻害剤である。したがってセリンプロティナーゼによって起こる症状を治療する場合、またはセリンブロティナーゼの阻害剤が有利な場合に有効である。セリンブロティナーゼとしては、限定はないが、キモトリプシン、トリプシン、ズブチリシン、エラスチン、トロンビンおよびプラスミンがある。したがって、ＰＥＤＮＰは、抗凝血剤、抗血栓剤、抗菌剤、抗寄生生物剤および避妊剤として；プロティナーゼ阻害剤として化粧用製剤に用いる場合；体重増加促進剤として；弾性線維症、フィブリノイド生成を含む脈管疾患、凝血障害、動脈硬化症、虚血、関節糖尿病、気腫、関節炎、敗血症性ショック、肺疾患、過剰補体活性化、潰瘍類、潰瘍性大腸炎、膵炎、乾瘤、線維素溶解性疾患、関節症、骨吸収、高血圧症、うつ血性心不全、硬変症またはタンパク質分解酵素類によって起こるアレルギーを治療する場合に有用である。抗凝血剤、抗血栓剤、抗菌剤、抗寄生生物剤または避妊剤として用いる場合；または弾性線維症、フィブリノイド生成を含む脈管疾患、凝血障害、動脈硬化症、虚血、関節糖尿病、気腫、関節炎、敗血症性ジグツク、肺疾患、過剰補体活性化、肝臓炎、乾磨、線維素溶解性疾患、関節症、骨吸収、高血圧症、うつ血性心不全、硬変症、またはプロテアーゼで起こるアレルギーを治療する際に、ＰＥＤＮＦは、静脈内もしくは筋肉的注射または部位特異的注射もしくは塗布によって投与される。　ＰＥＤＮＦは、単独で投与するか、またはＰＥＤＮＦのゆっくりした“特効性放出”を容易に行えるようにするポリ乳酸のような化合物とともに投与してもよい、一般に、生理食塩水または他の緩衝溶液中、約１〜約１１００ｔＩ／ｄの濃度で約０．０１〜約１０μｇのＰＥＤＮＦを１回服用量として投与し、そして１回当り約Ｏ〜約１０回投与される。特効性放出化合物は、組成物に含有されている場合、約１〜約１００μｇ／ｄの濃度で用いられる。治療は病状の進行が停止するかおよび／または快方に向かうまで続ける。ＰＥＤＮＦによる治療は神経の損傷部に行う。治療の結果神経突起の生成と神経の再生が促進される。プロティナーゼ阻害剤として化粧用製剤として用いる場合、または関節炎もしくは弾性線維症の治療に用いる場合、ＰＥＤＮＰは約０．０１〜約１００μｇ／ｄの濃度で製剤に添加する。体重増加促進剤としてまたは潰瘍類、潰瘍性大腸炎もしくは膵炎の治療ニ用イル場合、ＰＥＤＮＦ　ハ、約ｏ、０１〜約１０ｔＩｇ／ｋｇ体重／日の濃度で経口投与される。乾廁のような症状の治療に用いる場合、ＰＥＤＮＦは、適切な担体に配合し約０．０１〜約１００μｇ／ａｌ！の濃度で局所投与を行う。鼾ＲＰＥ細胞立　のＰｆｅｆｆｅｒ　（１９９１）により記述されているように死後のヒトの眼がらＲＰＥ細胞を収穫した。この細胞を、３７°Ｃで１５％のウシ胎児血清及び５％の二酸化炭素で補足されたイーグル最少必須培地を用いて７５ｃｍのフラスコ内で成長させた。細胞を集密性に至るまで成長させ、細胞単層をトリプシン処理することによって収穫し、１５％の胎児ウシ血清で補足されたＭＥＭ中で再懸濁された。細胞の一部分（約５％）を新しい７５ｃｍ　（のフラスコ？）に再度播種し、この中で再び細胞を５％のＣＯ，内３７℃で成長させた。班ＩＲＰ［！−晋　立ｌ　の量ＲＰＥ細胞の集密的培養を、調整に先立ちＨＢＳＳで大量洗浄して血清タンパク質を除去した。血清を含まないＭＥＭを２５１ｄ付加し、培養を約４８時間３７ °Ｃで５％のＣＯアでインキュベートした０次に調整培養を収集し、室温、１０００ｒｐ＋ｗで遠心分離に付して遊離細胞及びその他の粒状物質を全て除去して不純ＰＥＤＮＦタンパク質分画を得た。 ■ユＳＤＳ°ルー′　によるＰＥＤＮＦの例２に記されているとおりに調製したヒト胎児ＲＰＥ−調整培地内に含まれたタンパク質及び対照の非調整培地内のタンパク質を５ＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲル上で分析した。電気泳動標本緩衝液（６２，５ｓＭ　ｌ−リス、　ｐＨ６，８、２％ｓｏｓ、　ｉｏ％グリセロール、０．００１％のプロモーフエノールブルー及び０．１Ｍの２−メルカプトエタノール）と調整培地及び非調整培地の標本と混合した。ホスフォリラーゼＢ、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、炭酸脱水酵素、ダイズトリプシンインヒビター及びリゾチーム（例えばＢｉｏ−Ｒａｄが供給しているもの）などの分子量マーカーも同様に電気泳動標本緩衝液と混合した。全ての標本を、５分間溝とう水浴の中で１００℃で変性させ、７．５％のポリアクリルアミドゲルを含むＳＤＳ上に装てんした。ブロモフェノールブルーマーカー染料がゲル底面まで移動するまで２０ｍＭで電気泳動を行なった。電気泳動が完了した時点で、マーカー及び各々ｌレーンの調整培地及び非調整培地を含むゲルの各外縁部からのストリップをクーマンシーブルーで染色した。染色したストリップ上に発達した染色タンパク質ハンドは、調整培地には存在するものの非調整培地には存在しないタンパク質を位置設定するため、ゲルの未染色部分と整列させるのに用いられた。ＲＰＥ−口に独自の約５ｏｏｏｏ〜約５５０００の分子量のＰＥＤＮＦタンパク質ダブレットを切除し、ゲルの未染色部分からタンパク質を電気溶離させた。対照として使用するため、ウシ血清アルブミンを含む領域から切除された同じゲルのストリップを同様に処理した。溶離液を遠心分離してゲルフラグメントを除去し、上清を透析しゲル電気泳動によって分析してその純度を評価した。ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動の電気泳動パターンは、図１に示されている。ヒト胎児ＲＰＥ−口及び非調整対照培地の電気泳動パターンは、調整培地に独自の顕著な約５ｏｏｏｏ〜約５５０００の分子量の存在を示している。側〕ユバ　な　アンモニウム′ 例２中に記述されているとおりに調製した不純ＰＥＤＮＦタンパク質分画を６つの１０ｔｅアリコートに分割した。そのうちの１つのアリコートを、硫酸アンモニウム２．４２ｇを付加することによって２０℃で４０％の飽和まで導き、もう１つのアリコートを、硫酸アンモニウム３．１４ｇを付加することによって２０ ℃で５０％の飽和まで導き、もう１つのアリコートを、硫酸アンモニウム３．９０　ｇの付加によって２０℃で６０％の飽和まで導き、もう１つのアリコートを硫酸アンモニウム４．７２ｇの付加によって２０℃で７０％の飽和まで導き、もう１つのアリコートを硫酸アンモニウム５．６１　ｇの付加によって２０℃で８０％の飽和まで導き、最後のアリコートは、硫酸アンモニウム６．５７ｇの付加によって２０°Ｃで９０％の飽和まで導いた。硫酸アンモニウムが完全に溶解してしまうまで、アリコートを混合した。各試験管内に形成した沈殿物を２０分間１００００　ｒｐ−での遠心分離により収集した。沈殿物を各々、ｐＨ７，５の１０−Ｈのリン酸ナトリウム緩衝液中で再懸濁させ、２４時間ｐＨ７，５の１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液２２に対し透析した。次に標本を収集し、例３で記述したとおり１０％のＳＯＳポリアクリルアミドゲル上のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。その結果は次の表１にまとめられている。 −表一」− これらの結果は、ＰＥＤＮＦが約６０％〜７０％の硫酸アンモニウム飽和で沈殿することを示している。５０％〜６０％の標本中のＰＥＤＮＦの量が少ないことは、いく分かのＰＥＤＮＦが存在し、適切な硫酸アンモニウムの「カット」が５０％〜７０％の飽和であることを示している。標本は、例３に記述されているとおり、５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付された。６０％〜７０％の硫酸アンモニウム分画内のＰＥＤＮＦの純度は約５０％であると見積られた。鮭石カ　アンモニウム′ 例２で記述されたとおりに調製された不純タンパク質分画を、３１３　ｇ／ｌの固体硫酸アンモニウムを付加することにより、硫酸アンモニウムでの５０％飽和まで導いた０機械的撹拌器上で撹拌棒により溶液を撹拌しながら、硫酸アンモニウムを不純タンパク質分画にゆっくりと付加した６ｇ酸アンモニウムを全て付加した後、２０°Ｃで３０分間５０％の硫酸アンモニウム溶液を撹拌した０次に５０％の硫酸アンモニウム溶液を、２０分間２０°Ｃで１００００　ｇで遠心分離した。上清を収集した。次に５０％の硫酸アンモニウム溶液を、硫酸アンモニウム１３７ｇ／ｌの付加により７０％飽和まで導いた。ＶＡ酸アンモニウムをゆっくりと付加し、全ての硫酸アンモニウムを付加した後、２０”Ｃで３０分間７０％の硫酸アンモニウム溶液を撹拌した。上述のとおり７０％の硫酸アンモニウム溶液を遠心分離するか又はろ過し、沈殿物を収集した。次に、ｐＨ７の１０ｍＭのリン酸ナトリウム中で硫酸アンモニウム沈殿物を再度溶解させて５５％〜７０％の硫酸アンモニウム分画を形成し、その後Ａｍ１ｃｏｎ　Ｄｉａｆｌｏ限外ろ過ユニットを用いてダイヤフィルタ処理するか又はｐＨ７で１０＋＊Ｍのリン酸ナトリウムに対して透析させて、再溶解させた５５〜７０％分画から硫酸アンモニウムを除去した。例３に記述されているように、標本を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。５５％〜７０％の硫酸アンモニウム分画中のＰＥＤＮＦの純度は約５０％であると見積られた。貫エイオン六　ＨＰＬＣによるＰＥＤＮＦの例２に記されているとおりに調製したＰＲＥ−ＣＭをｐＨ６，５の１０−Ｈのリン酸ナトリウム緩衝液に対して透析させ、不純タンパク質試料から培地及び塩を除去した０次に透析したＰＥＤＮＦ試料を、４．６　Ｘ３０ｍ−のカラム内に充てんしたＢｒｏｗｎｌｅｅ　Ａｑｕａｐｏｒｅ　ＣＸ−３００ＨＰＬＣクロマトグラフィ培地上に装てんした。　ｐｎｓ、ｓの１０ｍＭのリン酸塩を用いてクロマトグラフィ培地を予め平衡化した。クロマトグラフィ培地に透析されたＰＲＥ−ＣＭを装てんし、ＰＥＤＮＦと共にクロマトグラフィ培地を、全ての未結合タンパク質がクロマトグラフィ培地から洗浄されるまで、ＰＨ６，５の１０ｍＭのリン酸塩で洗浄した。　ＰＥ［ｌＮＦを、ｐＨ６，５の１０ｍＭのリン酸塩中で０．０〜約０．５ＭのＮａＣｌの線状塩勾配でクロマトグラフィ培地から溶離させた。　ＰＥＤＮＦは、約０．２５ＭのＮａＣｌ濃度で溶離した。溶離したＰＥ［ｌＮＦを凍結乾燥により濃縮し、ｐＨ６，５の１０＋ｗＭのリン酸塩中で再度可溶化させた。溶離したＰＥＤＮＦを例３に記されているとおりにＳＯＳゲル電気泳動により分析した。溶離したＰＩ！［ｌＮＦは約り０％純粋であると見積られた。鼾れたＲＰＥ−ＣＭを、ｐＨ６，５の１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液に対して透析させ、硫酸アンモニウムを除去した。　４．６　Ｘ３０ｍ−カラム内に充てんされたＢｒｏｗｎｌｅｅ　Ａｑｕａｐｏｒｅ　Ｃに一３００クロマトグラフィ培地上に、透析された硫酸アンモニウムで精製されたＰＥＤＮＦタンＸり質分画の８０ａｆｆｉ標本を装てんした。クロマトグラフィ培地をｐＨ７，２の１０＋＊ＭのＩノン酸塩で予め平衡化した。クロマトグラフィ培地から全ての未結合タンパク質が洗浄されるまで、ｐ）１７．２の１０ｍＭのリン酸ナト１Ｊウム緩衝液でＰＥＤＮＰ／クロマトグラフィ培地を洗浄した。　ｐＨ７，２の１０ｍＭのＩＪン酸ナナトリウム緩衝液内０．０〜約０．５ＭのＮａＣ１の線形塩勾配でクロマトグラフィ培地からＰＥＤＮＦを溶離した。　ＰＥ［ｌＮＦ　ｌよ、約０．２５ＭのＮａＣｌ濃度で単一ピークとして溶離した。溶離したＰＥＤＮＦを、ｐＨ７，２の１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液に対し透析させ、凍結乾燥させて、水中で再可溶化させた０次に標本を、例３に記されているとおりに、ＳＯＳポリアクリＪレアミドゲル電気泳動に付した。溶離したＰＥ’（ＩＮＦは、約７０％純粋であると見積られた。氾ＨＰＬＣによるＰＥＤＮＦの　１＋例５に記述されている通りに調製した、硫酸アンモニウムで沈殿させたＲＰＦ、 −ＣＭをｐＨ６，５の１０ｗＭのリン酸ナトリウム緩衝液に対し透析内に充てんされたＶｙｄａｃ　Ｃ８クロマトグラフィ培地上に、８０μｌのＰＥＤＮＦ含有標本を装てんした。クロマトグラフィ培地【よ予め水中の０．１％ＴＦＡで平衡化させた。　ＰＥＤＮＦ／クロマトグラフィ培地を、全ての未結合タンパク質がクロマトグラフィ培地から洗浄されてしまうまで、水中の０．１％ＴＦＡを用いて洗浄した。水中０．１％のＴＦＡ及び５％のＨ２Ｏの中で０．０〜約９５％のＣｌ５Ｃ１１の線状勾配でクロマトグラフィ培地からＰＥＤＮＦを溶離した。ｐＨ７，２の１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液に対し、溶離したＰＥ［ｌＮＦを透析させ、凍結乾燥させ、水中で再度可溶化させた０次に試料を、例３に記されている通りに、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。カラムから溶離されたＰＥＤＮＦは、約８０％純粋であると見積られた。ＨＰＬＣによるＰＥＤＮＦの例２に記されている逼りに部分的に精製したＰＥ［ｌＮＦ含有標本を、次に、４．６　ｘ２５０１Ｕのカラム内に充てんされたＶｙｄａｃ　Ｃ８クロマトグラフィ培地上に装てんした。クロマトグラフィ培地を予め水中の０．１％ＴＦ＾を用いて平衡化した。　ＰＥＤＮＰ／クロマトグラフィ培地を、全ての未結合タンパク質がクロマトグラフィ培地から洗浄されてしまうまで、水中の０．１％のＴＦ＾で洗浄した。　ＰＥＤＮＦを、０．１％のＴＦＡ及び５％のＨ２Ｏ中の０．０〜約９５％のＣ１３ＣＨの線状勾配でクロマトグラフィ培地から溶離させた。溶離したＰＥＤＮＦを、ｐＨ７，２の１０１のリン酸ナトリウム緩衝液に対し透析させ、凍結乾燥させ、水中で再可溶化させた。標本を、例３に記されている通りに、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。カラムから溶離したＰＥＤＮＰは、約６０％純粋であると見積られた。 ■刊［によるＰＥ［ｌＮＦの例６に記述されているとおりに部分的に精製されたＰＥＤＮＦ含有標本を、次に、４．６　Ｘ２５０　ｍ−のカラムに充てんされたＶｙｄａｃ　Ｃ８クロマトグラフィ培地上に装てんした。クロマトグラフィ培地は、予め水中の０．１％汗＾を用いて平衡化させた。全ての未結合タンパク質がクロマトグラフィ培地から洗浄されてしまうまで、水中の０．１％ＴＰＡでＰＥＤＮＦ／クロマトグラフィ培地を洗浄した。　ＰＥ［ｌＮＦを、０．１％のＴＦＡ及び５％の８．０中で０．０〜約９５％のＣＨ，ＣＮの線状勾配でクロマトグラフィ培地からＰＥＤＮＦを溶離させた。ｐＨ７，２の１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液に対して溶離したＰＥ［ｌＮＦを透析させ、凍結乾燥させ、水中で再可溶化させた０次に標本を、例３に記述したとおりに、ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。カラムからＲＨされたＰＥＤＮＦは、約８０％純粋であると見積られた。 ■旦１（ＰＬＣによるＰＥＤＮＦの　１例６に記されている通りに調製したＰＥＤＮＦ含有標本を、４．６×２５０　ｗｌ−のカラムに充てんされたＢｒｏｗｎｌｅｅ　ＲＰ−３００クロマトグラフイ培地上に装てんした。水中の０．１％のＴＦＡで、クロマトグラフィ培地を予め平衡化した。未結合のタンパク質がクロマトグラフィ培地から洗浄されてしまうまで、水中の０．１％のＴＦＡで、ＰＥＤＮＦ／クロマトグラフィ培地を予め平衡化させた。クロマトグラフィ培地から全ての未結合タンパク質が洗浄されてしまうまで、ＰＥＤＮＦ／クロマトグラフィ培地を、水中の０．１％ＴＦＡで洗浄した。０．１％のＴＦＡ及び５％のＨ，Ｏ中０．０〜約９５％のＣＩ（、ＣＮの線状勾配でクロマトグラフィ培地からＰＥＤＮＦをｔ容離させた。溶離したＰＥＤＮＦをｐＨ１，２の１０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液に対し透析させ、凍結乾燥させ、水中で再可溶化させた。その後、標本を、例３に記述されているとおりに５Ｄｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。カラムから溶離したＰＥＤＮＦは、約９０％純粋であると見積られた。則サイズ　、クロマトグーフィによるＰＥＤＮＦの例５又は例６に記述されているとおりに調製した部分的に精製されたＰＥＤＮＦを、７．５　Ｘ３００　ｍ−のカラム内に充てんされたＢｉｏ−ＲａｄのＴＳＫ−２５０クロマトグラフイ培地上のクロマトグラフィによってさらに精製した。４０ｕｌの再可溶化されたＰＥＤＮＦの標本を、予め２０ｍＭのトリス、ｐＨ７，０、０，６ＭのＮａＣｌで平衡化させたサイズ排除クロマトグラフィ培地上に装てんした。ＰＥＤＮＦを、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７，０。０．６ＭのＮａＣｌで溶離させた。溶離したＰＥＤＮＦを、ｐＨ７，２の１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液に対して透析させ、凍結乾燥させ、水中で再可溶化させた０次に、例３に記述されている通り、標本を５Ｄｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。カラムから溶離したＰＥＤＮＦは、約７５％純粋であることが見積られた。撚Ｕイオン六　クロマトグーフィＤＥＡＥセルロースを、ｐＨ７，５の１０ｍＭのトリスで平衡化する０例５で記述されている通りに調製したＰＥＤＮＦをカラムに適用し、全ての未結合タンパク質がカラムから溶離してしまうまでカラムをｐＨ７，５の１０ｍＭのトリスで洗浄する。全ての未結合タンパク質が溶離した後、ｐＨ７，５（７）１０ｍＭ（７）　）　’Ｊ　スーＨＣｌ中θ〜約Ｉ　Ｍ　ノＮａｃｌ（７）線状勾配で、ＰＥＤＮＦを溶離させる。ＰＥ［ｌＮＦを含む分画を収集しプールする。これらの分画を次にｐＨ７，５の１０ｍＭのトリス−１１ｃＩに対してダイアフィルター処理してＮａＣｌを除去する。仙イオン六　クロマトグーフィＤＥＡＥセルロースを、ｐＨ７，５のｌｏｍＭのトリスで平衡化する０例２で記述されている通り、Ｃ，＠製したＰＥＤＮＦをカラムに適用し、全ての未結合タンパク質、がカラムからｆ４１１１してしまうまで、Ｐ）１７．５の１０ｍＭのトリスでカラムを洗浄する。全ての未結合タンパク質が溶離した後、１０ｍＭのトリス−）１ｃ１．　ｐ）１７．５中でＯ〜約ＩＭのＮａＣｌの線状勾配でＰＥＤＮＦを溶離させる。　ＰＥＤＮＦを含む分画を収集しプールする。これらの分画を次にｐＨ７，５のｌＯｓ＋Ｈのトリス−１１ｃＩに対してダイアフィルター処理してＮａＣ１を除去する。奥側イオン六　クロマトグーフィｐＨ１，２の１０ｍＭのＰＢＳで、Ｂｉｏ−Ｒｅｘ　７０樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）セルロースを平衡化する６例２に記述されている通りに調製したＰＥＤＮＦをカラムに通用し、全ての未結合タンパク質がカラムがら溶離してしまうまで、ｐＨ７，２の１０ｍＭ　ＰＢＳでカラムを洗浄する。全ての未結合タンパク質が溶離した後、ｐＨ７，２の１０５Ｍ　ＰＢＳ中でＯ〜約ＩＭのＮａＣ１の線状勾配でＰＥＤＮＦを溶離させる。ＰＥＤＮＦを含む分画を収集しプールする。これらの分画を次にｐＨ７，５の１０５Ｍのトリス−ＨＣｌに対してダイアフィルター処理してＮａＣｌを除去する。耶イオン六　クロマトグラフィｐＨ７，２の１０ｍＭのＰＢＳで、Ｂｉｏ−Ｒｅ＋＜　７０樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）セルロースを平衡化する６例５に記述されている通りに調製したＰＥＤＮＦをカラムに適用し、全ての未結合タンパク質がカラムがら溶離してしまうまで、ｐ）１７．２の１０ｉ＋Ｍ　ＰＢＳでカラムを洗浄する。全ての未結合タンパク質が溶Ｉｌｌ、た後、ｐＨ１，２（７）１０ｍＭ　ＰＢＳ中でｏ〜約ＩＭ（７）ＮａＣＩ＋７１線状勾配でＰＥＤＮＦを溶離させる。ＰＥＤＮＦを含む分画を収集しプールする。これらの分画を次にｐ）１７．５の１０ｓ＋Ｍのトリス−ＨＣｌに対してダイアフィルター処理してＮａＣｌを除去する。炭Ｈヘパリンクロマトグラフィヘパリンアガロースを２７．０．７　ｍＸ１０ｃ■のカラムに充てんし、２０Ｒ１の１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５、３Ｍ　ＮａＣｌで洗浄し、次にｐＨ７，５の１０ｍＭ　）リス−１１ｃＩ　２０ｄで平衡化する。１７オの人間のドナーがら例２に記された通りに調製した１２ａｆのＰＥＤＮＦ溶液を、４１の１０５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐｔ（７，５に対し、１９時間４℃で透析させた。透析後の体積は１９１ｄであった。透析物を０．４　ｍ／分の流量でヘパリンアガロースに適用した。　ＰＥＤＮＦ溶液をヘパリンアガロースに適用させた後、このヘパリンアガロースを２０ｄの１０ｍＭ　ｔ−リス−ＨＣｌ。ｐｌ（７，５で洗浄して、未結合タンパク質をヘパリンアガロースから除去した１次に、１２ｄ（７１１０ｓＭ（７）　ト！Ｊ　ス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５、３Ｍ＋７）ＮａＣｌテ、ヘパリンアガロースからＰＥＤＮＦを溶離させた。ＰＥＤＮＦを含む溶離物を１０＋ｗＭ　）リス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５に対して透析させて、溶離物中に存在するＮａＣｌを除去した０次に透析された溶離物を凍結乾燥させ、ｐＨ７，５の１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中で再度溶解させ、例３に記述されている通り、標本を１２．５％の５Ｄｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。ＰＥＤＮＦ溶離物は、約６０％純粋であると見積られた。罰ヘパ１ンクロマトグーフイヘパリンアガロースを２ｄ、　０．７　ｍＸ１０ｃ−〇カラムに充てんし、２０ｊｄの１０５Ｍ　トリス−ＨＣｌ、　ｐｉ（７，５、３Ｍ　ＮａＣｌ　で洗浄し、次にｐＨ７，５の１０−のトリス−ＩＣ１２０ｍで平衡化する０例５に記された通りに調製した１Ｍ１のＰＥＤＮＦ溶液を、４１の１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，５に対し１９時間４°Ｃで透析させた。透析物の体積は１．３　ｄであった。透析物を０．４　ｄ／分の流量でヘパリンアガロースに通用した。ＰＥＤＮＦ溶液をヘパリンアガロースに適用させた後、このヘノマリンアガロースを２０ｄの１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５で洗浄して、未結合タンパク質をヘパリンアガロースから除去した０次に、１２ｄの・１０−Ｍトリス− ＨＣｌ、　ｐＨ７，５、０，５Ｍ　ＮａＣ１；　１２−の１０ｍＭ　Ｆリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５。１ＭのＮａＣｌ　；　１２ｍの１０−Ｍのトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５、２ＭのＮａＣ１；及び１２Ｉ１１の１０ｗＭ　）リス−〇ＣＩ、　ｐＨ７，５、３Ｍ　ＮａＣｌを用いて連続的にへ／＜リンアガロースを）害菌させた。各々の溶離物を１抛ｉのトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５に対して透析させて、溶縮物中に存在するＮａＣｌを除去した。透析された溶離物を凍結乾燥させ、ｐＨ７，５の１０ｗ＋Ｈのリン酸ナトリウム緩衝液中で再度溶解させ、例３に記述されている通り、透析された各々の溶離物の標本を、１２．５％の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。ＰＥＤＮＦ溶離物は、約７０％純粋であると見積られた。炭■ されたＰＥＤＮＦの　、′ｉ禾　びノ　ヒ例３に記されているとおりに、電気溶離されたＰＥＤＮＦを調製した。分離されたＰＥＤＮＦの神経単位誘発活性を特徴づけするため、最適な濃度及び播種前の刺激期間を決定した。１１のピルビン酸ナトリウム、０．６２５　ｍＭのＨＥＰＥＳ　、６＋ＭのＬ−グルタミン、１％の可決アミノ酸、５μｇ／ａｄのインシュリン、５μｇ／ｄのトランスフェリン及び５Ｍｇ／ｉｄの亜セレン酸で補足した、血清を含まないＤ）’ＩＥ中の電気ン害菌されたＰＥＤＮＦを、１Ｍｇ／ＩＩｉ、２Ｍｇ／ｄ、４μｇ／７．６μｇ／７．８Ｍｇ／ｄ又は１１０１Ｉ／ｄテストした。対照として、等体積の非調整培地で希釈したＲＰＥ−ＣＭ　（５０％のＲＰＥ／ＣＭ　）も使用した。懸濁培養中でＹ７９　ＲＢ細胞を成長させた。室温で９０Ｏｒｐｍで５分間遠心分離により細胞を収穫し、予め３７°Ｃまで暖められた無血清のＤＭＥ培地中で再度懸濁させた。細胞を遠心分離により収集し、無血清のＤＭＥ培地内で１０６細胞／ｄの濃度で再懸濁させた。別々のＹ７９ＲＢ細胞培養中に１．２，４，６．８又はｌＯμｇ／ｄ、の電気溶離されたＰＥＤＮＦ又は５０％のＲＰＥ−ＣＭを導入した。３７℃で７日間細胞をイ、ンキュヘ一卜し、次にポリーＤ−リンンコーティングされたフラスコに付着させた６位相差顕微鏡により毎日、細胞を観察した。ポリーＤ−リジン下層上への播種よりも２日、４日、８日又は１６日前に２Ｍｇ／１１１の電気溶離されたＰＥＤＮＦでＹ７９　ＲＢ細胞培養を処理することにより、ＰＥＤＮＦの最大誘発活性に必要とされる最適な播種前期間を評価した。懸濁培養内で予め刺激されていない付着された細胞培養に対してｌｕｇ／ｄ又は２μｇ／ｓｆの電気溶離されたＰＥＤＮＦを付加した。２Ｍｇ／−の電気溶離されたＰＥＤＮＦで処理されたＹ７９細胞細胞体の８０％以上が、ポリーＤ−リシン下層に対する付着の後８〜ｌＯ日以内に分枝プロセスを拡張した；未処理の細胞は、神経単位分化の最小限の兆候を示したにすぎない（図２）。Ｙ７９細胞は、２Ｍｇ／ｄのタンパク質濃度で電気溶離されたＰＥＤＮＦに対し最大の分化応答を示した；この応答は、４μｇ／ｄを超える濃度で減少した。結果は表■に示されている。に−１１Ｍｇ／ｄのＢＳＡ　７　Ｂ±６（対照）愈標準誤差傘刺激を受けていない付着細胞に対して、播種より２４時間前にＰＥＤＮＦが付加された。この因子の存在下での８日の播種前刺激期間（懸濁培養中）は、付着後１０日日日Ｙ７９細胞の最大分化という結果をもたらす。より短かい及びより長い播種前誘発期間の両方で、分化頻度の減少（５０％未満）が見られる。さらに、付着前にＰＥＤＮＦで予め刺激を受けてし）ない細胞は、付着後に１〜２Ｍｇ／ｄの電気溶離されたタンノイク質が付加された場合、低い神経単位分化頻度（約２０％）を示す。しかしながら、この応答は相対的に緩慢であり、１５日未満である。対照のＢＳＡ処理を受けた培養は、非調整培地のみにさらされた細胞に匹敵する１０％未満の分化を示す。ヒトの網膜芽細胞内で高度の神経単位分化を誘発した。刺激を受けた細胞の集合体から拡張するべく長い分岐する神経突起プロセスが誘発された；神経単位マーカー分子、神経単位特異的エノラーゼ及び２０００００分子量の神経フィラメントタンパク質の発現における付随的増大も同様に観察された。Ｙ７９細胞内の神経単位表現型の発現には、１　）　ＰＥＤＮＦによる懸濁培養中の細胞の刺激；２）下層に対する刺激された細胞の付着、及びそれに続く３）付着し刺激を受けた細胞の神経突起外殖という３つの逐次的事象が関与すると思われる。刺激を受けていない付着した培養をＰＥＤＮＰで処理した場合２０％の分化しか観察されなかったことから、Ｙ７９細胞内の神経単位分化に対する掛わり合いが細胞付着及び神経突起外殖より前にくると思われ、これを刺激期間中に開始させることが可能である。炭銭なる　か゛のＲＰＥ−ＣＭのｔ　の　゛例１に記述されているとおりに細胞培養を作製したが、ただし、細胞の由来である眼はヒト胎児、ヒト成人、成体ラット、胎児ラット又はニワトリ胎芽であった。例２に記されている通り、細胞培養の各々からｌ？ＰＥ−側を調製した。新たに確立したヒト胎児細胞培養（短期培養）及び６力月間確立された培養（長期培養）が含まれていた。調整培地の分化活性は、例１９に記されているとおりに実行された。さまざまな種からのＲＰＥ−ＣＭの効果を監視する実験の結果は、表■に要約されている。、表−Ｊ− ヒト（胎児、短期培養）８８±３゜ヒト（胎児、長期培養）５０±８ヒト（成人）５５±９ラント（成体）２０±１１ラント（胎児）４２±７ニワトリ（胎芽）８６±７傘標準誤差この表は、Ｙ７９細胞上のさまざまなＲＰＥ調整培地の誘発活性を要約している。ここに記されているのは、さまざまな種からの５０％のＲＰＥ−ＣＭを用いて７日間刺激した後に神経突起の外殖を示す１０日間の付着集合体の割合である（１集合体あたり５個以上の細胞）。３回の反復実験で各標本から１００個の集合体が計数された。ヒト胎児ＲＰＥ−ＣＭ　（短期培養）及びニワトリ胎芽ＲＰＥ−Ｃ−により、Ｙ７９細胞内の最大の分化応答が誘発され、これらの両方共が、５０％の濃度で使用されたとき細胞集合体の８０％以上において神経単位の分化を誘発する。これとは対照的に、ヒト胎児ＲＰＥ及び成人のヒトＲＰＥの長期培養（１２〜１８力月）からの調整培地については、細胞分化の頻度の減少（５０％未満）が見られる。胎児ラントＲＰＥ−ＣＭによって誘発されるのはわずか４０％の神経単位様の分化であり、成体ラットＲＰＥ−ＣＭによっては２０％である。ヒト胎児及びニワトリ胎芽ＲＰＥ細胞からの調整培地は類似の神経栄養性活性を含んでいるが、一方成体培養にニワトリ及びラッ日からの調整培地及びヒト胎児ＲＰ［！−ＣＭの長期培養は、Ｙ７９細胞内の神経単位表現型を促進する上で比較的効果が低い、成熟したＲＰＥ細胞がこの神経栄養性因子をもはや分泌しないが又は、利用された培養条件では効力が低くなるような減少した量しが分泌しないという可能性がある。その他の種からのＲＰＥ　！Ｉｉ整培地の中には幾分かの栄養活性が見られるという事実は、ＰＥＤＮＦ又はそれに類似する因子がその他の種のＲＰＥ細胞によっても分泌され、一般に正常な網膜の発達及び機能にとって重要なものでありうるということを示唆している。監２゛−ゲル−′ ０°Ｆｒａｒｒｅｌｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２５０．４００７ −４０２１　（１９７５）及びＪｏｎｅｓ。Ｊ、、　Ｊ、　Ｅｘ　、　Ｍｅｄ、　１４ｂ、　１２５１〜１２７９　（１９７７）により記述された方法により２次元ゲル分析を行なった。Ｂｔｏ−Ｒａｄシルバースティンプラスキットを用いて、銀染色を行なった。陽イオン交換及びサイズ排除１１ＰＬＣにより精製された２０μｇのＰＩ！ＩＩＮＦをＩＥＦチューブゲル上に装てんした。１（ＰＬＣ精製されたＰＥＤＮＦの２次元電気泳動分析は、４つの密にまとまった分子種の存在を明らかにしている（図３）、４つの種は、見かけの分子量においてわずかに変動しているが、全てがゲルの５００００分子量領域内にあり、これは以前同定されけたＰＥＤＮＦの分子量と一貫したものである１分解された種は同様に等電点においてわずかに変動し、これは翻訳後の修正のわずかな変動を示唆している。しかしながらアミノ酸配列分析（例２２参照）は、単一のポリペプチドのみの存在を示している。髭ＰＥＤＮＦ　・ペプチドの　びアミノ　配積製されたＰＥＤＮＦ　Ｃ例２．６及び１２に記された通りに精製）１８０ｔＩｇを八ｍ１ｃｏｎ　ｏｆ　Ｄａｎｕｅｒｓ、　ＭＡ、により供給されたＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　１０マイクロｉＩｌｖＭ器を用いて濃縮し、次ニ２５５Ｍノ）　’Ｊ　ス、　ｐｉ（８，５、１ｍＭ（７）ＥＤＴＡ中で希釈した。タンパク質標本に対してエンドブロティナーゼＬｙｓ −Ｃを付加した。約１８時間ＰＥＤＮＰ／ブロティナーゼ混合物を３０′ＣでインキュベートしＰＥＤＮＦを消化した。結果として得られたＰＥＤＮＦポリペプチドフラグメントを、４．６×２５０　ｍｍのカラムの中に充てんされたＶｙｄａｃ　Ｃ８逆相）ＩＰＬｃ上での）ＩＰＬＣにより分離した。水中の０．１％ＴＦＡを用いてカラムを平衡化し、ポリペプチドを、水中の０．１％のＴＦ＾、　９０％のＣ）１３ｃＮで溶離させた。その他のポリペプチドから充分に分離されているカラムがら溶離されたポリペプチドを収集し、タンパク質配列決定分析に付した。Ｃ１ｔｙ　ｏｆ　ＨｏｐｅにあるＢｅｃｋｓ＋ａｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅのマイクロ配列決定施設において、請負でアミノ酸配列分析が行なわれた。分離されたポリペプチドについてのアミノ酸配列は、次のとおりであることが見極められた：ＰＥＤＮＦ−１３（配列番号ｌの残基２２６−２４４）Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ＾ｒｇ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　ＭｅｔＰＥＤＩＩＦ−１４（配列番号１の残基１６１−１８６）Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　ＡｒｇＶａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　ＡｒｇＬｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　ＡｌａＰＥＤＮＦ−１３の配列決定は、無条件（ｕｎｅｑｕｉｖｏｃａｌ）配列の１９個の残基を生み出した。ＰＥＤＮＦ−１４は２６の残基を生み出し、そのうち２５個は無条件であった。ＰＥＤＮＦ−１４の中の残基２３のトリプトファンとしての同定は、絶対確実なものではなかった。初ＰＥＤＮＦ特　・ペプチドの　びアミノ配置例２．６及び１２に記されている通りに精製したＰＥＤＮＦを還元しアルキル化した。標本を乾燥させ、ＣＲＡ緩衝液（８Ｍの尿素、０．４　Ｍの重炭酸アンモニウム、ｐＨ８，０）中で再度溶解させ、５μｉの４５＋＋ＭのＤＴＴ　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を付加した。　１５分間５０″Ｃでの加熱後、溶液を冷却し、５ｔｔ１．の１００　ｓＭのヨード酸ｆａ　（Ｓｉｇｓ＋ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）を付加した。１５分後、２Ｍの尿素の濃度まで溶液を希釈し、３７°Ｃで２２時間、１：２５（重量／重量）の酵素：基質比を用いて、Ｂｏｈｅｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｓが供給するトリプシン消化に付した。Ｖｙｄａｃ　２．１　＋ｕ＋Ｘ１５０　ｍ＋ｗ　ＣＩＯカラムを用いて、１０４０ダイオードアレイ検出器の備わったＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ　１０９０　ＩＰＬＣ上での小内径逆相ＨＰＬＣによりトリプシンペプチドを分離した。緩衝液Ａは０．０６％のトリフルオロ酸＃／８２０であり、緩衝液Ｂは０．０５５％のトリフルオロ酢酸／アセトニトリルであり、ｉｓｏ〃ｆｆｉ／分の流量で０分で５％Ｂ。６３分目で３３％Ｂ、９５分目で６０％Ｂ、１０５分目で８０％Ｂの勾配が用いられた。各ピークの２１Ｏｎ（２７７ｎ−でのクロマトグラフィデータ及び２０９〜３２１ｎ剛のＵｖスペクトルが得られた。アミノ末端配列分析のための標本をボリブレンプリサイクルドグラスファイハフィルタに適用し、プログラムＮＯＲＭ＾Ｌ１を用いてＡＢＩ　４７７＾型気相タンパク質シーケンサ−上でマサチューセッツ州ボストンにあるＨａｒｖａｒｄＭｉｃｒｏｃｈｅ甫１ｃａｌ　ＦａｃｉｌｉｔＶにおいて自動化されたＥｄｍａｎ分解に付した。結果として得たフェニルチオヒダントインアミノ酸分画を、オンラインＡＢＩ　１２０＾型ＨＰＬＣ及びシマズＣＲ４＾積分器を用いて、手動式に同定した。分離したペプチドの配列は、次のとおりであることが見極められた。ＰＥＤＮＦ　ｌ　（配列番号１の残基５４−６７）Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌｓ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　ＡｒｇＰＥＤＮＦ　２　（配列番号Ｉの残基１０７−１３５）Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　ＧｌｙＴｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ＾５ｎＰＥＤ）ＩＦ　５　（配列番号１の残基３０７−３１６）Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　ＬｙｓＰＥＤＮＦ　６　（配列番号１の残基３１７−３２７）Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　ＬｙｓＰＥＤＮＦ　７　（配列番号１の残基３６０−３８９）＾１ａ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｈｅ　Ｔｈｅ　Ｐｒ。Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｌａ旧ｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒ。Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　）ｌｉｓ ■ｕ −ットセリンプロティナーゼ　に・するＰＥＤＮＦペプチドの　ＰＥＤＮＦ−１３は、有意な配列を示す、相同な分子としては、ラットセリンプロテアーゼ阻害物質ｌ及び２、ラット肝細胞成長ホルモン調節タンパク質、ラット甲状腺ホルモン調節タンパク質及びマウスコントラプンンが含まれている。ヒト、サル、ヒツジ及びマウスアルファー１抗トリプシン及びブタアルファー１−抗キモトリブシンは、有意ではあるものの幾分か低い相同性をもつ。ＰＥＤＮＦ−１４は異なるプロテアーゼ阻害物質との相同性を示すが、相同度はＰＥＤＮＦ−１３について観察されたものよりも低い、これらにはヒト血漿プロテアーゼＣ１阻害物質及びヒトアルファー２−抗プラスミン阻害物質が含まれる。これらの結果は、ＰＥＤＮＦがプロテアーゼ阻害物質として機能しうるものの、前述の阻害物質とは分子的に異なっていることを示唆している。ＰＥＤＮＦは、標的セリンプロテアーゼに対する餅として作用する露呈した結合部位として役立つ、Ｃ末端近くで共通の反応中心を共有するセリンプロテアーゼ阻害物質の一族であるセルピンと有意な相同性を示す。セルピン族の一定数の既知のメンバーがさまざまな神経単位細胞タイプに対して神経栄養性効果をもつことが示されてきたということは興味深いことである０例えば、神経膠由来ネクシン（ＧＤＮ）は、ヒルジン及びロイペプチドといったようなその他の一定数のプロテアーゼ阻害物質と同様に、神経芽細胞内での神経突起外端を促進する。プロテアーゼ阻害物質は同様に、後根神経節、交感神経単位及び海馬錘体状神経単位の細胞内の神経単位分化をも刺激する。いくつかの既知の成長因子によってブロティナーゼ及びプロテアーゼ阻害物質の産生が刺激されるということも興味深いことである。ＰＥ［ｌＮＰがプロテアーゼ阻害物質活性を有するか否かは今後見極めていくものとして残っているものの、神経膠由来不りシンの神経突起促進活性のためには阻害物質活性が必要であることが示されてきたため、その可能性は高い、安定したプロテアーゼ−ＧＯＮ−複合体の形成、及びその結果としてのＧＤＮ及び／又は付随するプロテアーゼ内のコンホーメーション変化は、ＧＤＨの神経突起促進活性にとって必要なものであることが示唆されてきた。光受容体内マトリクス内及び発達中の神経網膜内に既知のプロテアーゼが存在することから、ＰＥＤＮＦは、同様にうまく機能する可能性がある。罰ＰＥＤＮＦ゛　云　のクローニング例２２で決定された５“−ＡＧＹＡＡＹＴＴＹＴＡＹＧＡＹＣＴＳＴＡ　−３” というＰＥＤＮＦ　１３に対する及び例２３で決定された５’−ＣＴＹＴＣＹＴＣＹＴＣＲＴＣ５ＡＧＲＴＡＲＡＡ　−３’というＰＥＤＮＦ　２に対するオリゴヌクレオチドを構築した。これらのオリゴヌクレオチドをＡＢＩ　３９２　ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置上で調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）中でプライマーとして用いた。Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）分子クローニング：実験室マニュアル、第２版（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ）によって記述されている方法によって、Ａ、　Ｓｗａｒｏｏｐ博士から寄贈されたヒト胎児１１１ｉＩＣｈａｒｏｎ　ＢＳ　ｃＤＮＡライブラリーを一度増幅させ、Ｍｇ５Ｏａが３ｗＭで使用されたという点を除いて、Ｔｅｃｈｎｅサーマルサイクラ−及び標！１！試薬（Ｇｅｎｅ　ＡＭＰ　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｓｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を用いてＦｒ１ｅｄ＊ａｎ　ｅｔａｌ、　（１９９０，ＰＣＲプロトコル内のλｇｔｌｌライブラリのスクリーニング：方法及び応用の手引き・Ｉｎｎ１ｓ、　Ｇｅ１ｆａｎｄ、　５ｎｉｎｓｋｙ　ａｎｄ　Ｗｈｉｔｅ。ｅｄｓ、、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋　ｐ２５３　２６０）により記述されているとおりにＰＣＲによりスクリーニングした。回収したフラグメントを、ＮＡ−４５ＤＥＡＥ−セルロース紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄ　５ｃｈｕ１１）を用いて３％のＮｕＳｉｅｖｅ　３　：　１ゲル（ＦＭＣＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）上で分離し、ランダムプライミングにより３２Ｐで標識づけした（Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔシランムプライマー標識づけキント、Ｓ　ｔｒａ　ｔａｇｅｎｅ）。このプローブを同しライブラリ（１０）の２０００００ｐｆ　ｕｓをスクリーニングするのに用いた。Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ　（前出）により記述されているとおりに陽性クローンを分離し、Ｑｉａｇｅｎ　Ｍａｘｉ調製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ　！ｎｃ、）を用いてＤｌｉＡと精製した。ＴＡ　ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で環状化されたＮｏｔｌ　（ＢＲＬ。Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＯ）を用いて、インサートをカットアウトし、コンピテントＥ、　ｃｏｌｉ（大腸菌）　５ｕｒｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｉｎｃ、）に形質転換させ、１２．５ｕｇ／ａｆのアンピシリン／４０ｕｇ／ｌｄ　Ｘ−ｇａｌ寒天寒天上板上定した。白色コロニーを選択し、ミニプレノブ処理した（Ｑｉａｇｅｎプラスミドミニプレノブプロトコル）。精製されたプラスミドを［ｉ（０１１７１／Ｈｉｎｄｍ　（ＢＲＬ）で消化し、０．７％のアガロースゲル上を定らせてインサートのサイズを決定した。班筺用Ｌｆｆｉ舅光折ＰＥＤＮＦ遺伝子に対応するインサートを含む同定されたクローンの１つを、マツピング及びそれに続＜　ＵＳＢシーケナーゼ２．０プロトコル及び試薬を用いた配列決定のために選択した。罰舅鳳腹簾■度廉ＰＥＤＮＦを、単独で、又は臨床的（例えば外科的）手順と合わせて投与する。硝子体内又は網膜上注射によりＰＥＤＮＦを投与する。　ＰＥ［ｌＮＦは、単独で投与してもよいし或いはＰＥＤＮＦの緩慢な「経時放出」を容易にするポリ（乳酸）といった化合物と合わせて投与することもできる。１準的には、生理食塩液又はその他の緩衝溶液内で約１μｇ／ｄ〜約１００μｇ／ｉｄの濃度で約０．Ｏ１〜約１０μｇのＰＥ［ＩＮＦを一用量あたり投与し、−日につき約０〜約ｌＯ用量ずつ投与する０組成物中に経時放出化合物が内含される場合、これらは約１〜約１００μｇ／−の濃度で用いられる。腫瘍の進行が停止するか又は遂行するまで、治療は続けられる。ＰＥＤＮＦでの治療は、網膜芽細胞といった網膜腫瘍、神経芽細胞といったその他の神経単位腫瘍又は非神経単位由来の腫瘍用として有効である。この治療は、細胞分裂の停止又はその速度の低下及びそれに付随する腫瘍成長速度の低下という結果をもたらし、ひいてはｍｉの退行という結果にもなる。鯵の　土　１１　、ＰＥＤＮＦを単独で、又は臨床的（例えば外科的）手順を合わせて投与する。硝子体内又は網膜上注射によりＰＥＤＮＦを投与する。　ＰＥＤＮＦは、単独で投与してもよいし或いは又ＰＥＤＮＦの緩慢な「経時放出」を容易にするポリ（乳酸）といった化合物と合わせて投与することもできる。標準的には、生理食塩液又はその他の緩衝溶液内で約ｌｔｔｇ／ｄｌ〜約１００μｇ／ａｆの濃度で約０．０１〜約１０μｇのＰＥＤＮＦを一用量あたり投与し、−日につき約Ｏ〜約１０用量ずつ投与する０組成物中に経時放出化合物が内含される場合、これらは約１〜約１１００ｔｔ／ｄの濃度で用いられる。病状が止むか遂行するまで、治療を続ける。ＰＥＤＮＦでの治療は、神経網膜、網膜色素上及びその他の眼組織の疾患に向けられている。治療の結果、光受容体及びその他の眼細胞の存続及び安泰が強化され、その機能的寿命は延び、視覚機能障害や究極的失明の開始が遅延されることになる。初の　ンム　、ＰＥＤＮＦを単独で、又は臨床的（例えば外科的）手順と合わせて投与する。硝子体内又は網膜上注射によりＰＥＤＮＦを投与する。　ＰＥ［ｌＮＦは、単独で投与してもよいし或いは又ＰＥＤＮＦの緩慢な「経時放出」を容易にするポリ（乳酸）といった化合物と合わせて投与することもできる。標準的には、生理食塩液又はその他の緩衝溶液内で約１ｐｇ／ｄ〜約１００μｇ／ｄｉの濃度で約０．０１〜約１０／ｊｇのＰＥＤＮＦを一用量あたり投与し、−日につき約θ〜約１０用量ずつ投与する。＆Ｉｌ成物中に経時放出化合物が内含される場合、これらは約１〜約１００μｇ／ｄの濃度で用いられる。神経再生が完了するまで、治療を続ける。ＰＥＤＮＦでの治療は、神経に対する損傷に向けられる。治療の結果、神経突起の外端及び神経再生が促進されることに電る。網膜色素沈着された上皮神経栄養性因子のための方法の実施例に関する上述の説明は、例示を目的としたものである。当業者にとっては変形態様が明白であることから、本発明は、上述の特定の実施態様に制限されるものではない０本発明は同様に、特定的に開示されていないいずれかの要素の無い状態でも実施できる０本発明の範囲は、以下のクレームにより規定されている。阻のトランスフェクションコンビテントＥ、　ｃｏｌｉ　５ｕｒｅ細胞を、連結混合物と混合し、６０分間氷上でインキュベートする。混合物を次に２分間４２゛Ｃでインキュベートし、次に８００　μｌの２％ＢＡＣＴＯｌ−リブトン、２％のＢＡＣＴＯ酵母エキス（両方共、［１ＩＦＣＯＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳにより供給されている）、１〇−阿のＮａＣ１，１０ｍＭのＭｇ５Ｏ，、２０ｍＭのグルコースを付加し、混合物を３７°Ｃで６０分間インキュベートし、その後５０〜５００μｌのＤＮＡ混合物を１２．５μｇ／ｄ−のインピシリンを含む選択プレート上に延展させる。分離したＤＮＡのミニブレツブ処理と消化により組換え型コロニーをスクリーニングする０次に、３７℃で一晩撹拌しながら１２．５μｇ／ｄのアンピシリンを加えたルリア肉汁２００ｄの中で適切なコロニーを成長させることによって、適切なインキュベートを含む陽性コロニーを調製する。−晩のインキュベーションの後、培養を遠心分離ボトルに移し、１０分間２５００ｒｐ−で遠心分離する。上清を除去し、細胞を室温で３０ｄの５ＴＥＴＩＩ衝液（（１，２３Ｍのスクロース、５％のトリトン−Ｘ−１００、２０５ＭのＥＤＴＡ、　５０ｍＭのトリス −１（Ｃ１，ρ８Ｂ）の中で再懸濁させる。１抛ｇ／ＩＩｌのリゾチーム５μｌを付加し、混合物を渦巻に付し約５分間室温でインキュベートする０次に、細胞が凝結し始め白色に変わるまで、各々のフラスコを直火で穏やかに渦巻に付す。その後、混合物を、約４５秒間溝とう水浴へと移す。次に溶液を、２分間氷水浴の中で冷却し、混合物を遠心分離管に移し１６０００　ｒｐｍで１５分間遠心分離する。次に上清を゛洗浄な容器に移す。１００％エタノールを２体積付加し、混合し、２０分間−７０°ＣでＤＮＡを沈殿させる。１５分間２５００　ｇの遠心分離により沈殿物を収集する。エタノール上清を除去し、約１０＋ｄの低温（−２０° Ｃ）９０％エタノールでベレ・ノドを洗浄する。２．５−の抽出緩衝液（０，２Ｍ）リス、ρ１１７．５　、０．０８Ｍ　ＥＤＴＡ　、及び０．２　Ｍ　ＫＣＩ）をペレットに付加し、４°Ｃで１００μｇの１０ｍｇ／ｄ　ＲＮＡ５ｅＯ中でこれを再懸濁させ、０．Ｉ　ＸＴＥ　（１＋ｎＭ　）リス−〇ＣＩ、　０．１　ｍＭのＥＤＴＡ、　ｐＨ７，６）の中で溶解させ、１０分間沸とうさせることによって予備処理する。 ■皿葺１Ｊｌｖ１ｉＩＸＩＯ’細胞／ｄの初期密度に至るまでＧｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹのＧＩＢＣＯが供給しているブレースのＡｎ　ｔｈｅｒａｅａ培地が入ったスピナーフラスコの中にＳｆ９細胞を播種し、５０μｉｍで常に撹拌しなから２７°Ｃでインキュベートする。２．５　ＸＩＯ’細胞／ｌｄの密度に達した時点で細胞を一週間に約２〜３回の割合で継代培養し、約５分の１に希釈する。猶」。ＡＣ３７３への゛　云　クローニング体積を２５０μｌにするよう２５μｌの１０　Ｘ　Ｂａｓ旧制比制限酵素緩衝液０単位のＢａ−旧及び集菌精製水と２μｌのｐＡＣ３７３を組み合わせ、最低３時間３７°Ｃでインキュベートする。ＤＮＡ　ＬμＧあたり１単位の仔ウソ腸内アルカリ性ホスファターゼ（ＣＡＰ）を付加することによって、これを脱リンし、３７°Ｃで３０分間インキュベートする。次に、２５−ＭまでＥｔｌＴＡを又０．５％までＳＯ８を付加することによってＣＡＰを不活性イヒし、１５分間６５°Ｃでインキュベートする０次に、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：ｌ）を等量ずつ用いて溶液を抽出する。水相を収集し、１２５μｔの７．５Ｍ酢酸アンモニウム及び８００μＰの９５％エタノールを付加し、混合する。１０分間−７０°ＣでＤＮＡを沈殿させる。次に沈殿物を、１０分間１２０００　ｒｐ＋＊での遠心分離により収集する。（− ２０°Ｃ）９０％のエタノールでペレットをすすぐ０次にエタノールを除去し、５０μｉの１０μｌＭトリスー）１（：Ｉ、１　ｗＨのＥＤＴＡ、　ｐＨ７，６（ＩＸＴＥ）内でＤＮＡを再懸濁させる。 ■井＾Ｃ３７３に・するＰＥＤＮＦの゛ＰＥＤＮＦ遺伝子を含む精製ＤＮＡフラグメントをトランスファベクターに連結させる。約２００　ｎｇの消化済みｐＡＣ３７３を、等モル濃度のＰＥＤＮＦ含有フラグメントと混合させる。連結緩衝液（５０論−のトリス−）１ｃｌ。ｐＨ７，４、１０＋ｗＭのＭｇＣｈ　、　１０ｍＭジチオトレイトール、０．５１１Ｍのスペルミジン、：２＋Ｍ　ＡＴＰ、　２．５霞ｉヘキサミン塩化コバルト及び２０Ｍｇ／ａｆのＢＳＡ）及び１０単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼを付加する０合計体積１０μｌになるまで水を付加する。混合物を３時間１４℃でインキュベートする。汎η ＾ｃＭＮＰｖ゛ツム　への゛　云ブレースのＡｎｔｈｅｒａｅａ培地内でフラスコ１本あたり２．ＯＸＩＯ’個の細胞という密度でＳｆ９細胞を’２５ｃｍのフラスコの中に播種する。細胞を少なくとも１時間付着させる。　ＰＥＤＮＦ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ　２μ ｇにｌｕｇの？１ＮＰＶ　ＤＮＡを付加する。培地をフラスコから除去し０．７５ｍのブレース培地と１０％のウシ胎児血清及び抗生物質（５０Ｍｇ／ｄの硫酸ゲンタマイシン、２．５μｇ／ｄのアンピシリン）で置換する。　７．５　ｍのトランスフェクション緩衝液（２５ｓ＋ＭのＨＥＰＥＳ　。ｐＨ７，１、１４０ｓ＋ＭのＮａＣｌ、　１２５　ｍＭのＣａＣＩｚ）を１）ＮＡ溶液に加え混合する。すでに細胞培養フラスコ内にあるブレース培地にＤＮＡ溶液を付加する。トランスフェクション緩衝液中の塩化カルシウム及び培地中のリン酸塩のため、リン酸カルシウム沈殿物が形成される。４時間２７°Ｃでフラスコをインキュベートし、その後培地をフラスコから除去し、新鮮なＴＮＭ−ＰＨ（ブレース培地及び共にＤＩＦＣＯＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳから得られる３、３ｇ／ｌのＹＥＡＳＴＯＬＡＴＥ及び３．３ｇ／ｌのラクトアルブミン加水分解産物）及び１０％のウシ胎児血清及び前述のとおりの抗生物質で細胞をすすぎ、前述のとおりの５ｄのＴＮＭ−ＦＨと１０％のウシ胎児血清及び抗生物質を細胞に加える。４〜６日間、細胞をインキュベートする。感染が進行した段階にある場合、新鮮な単層上にウィルスを平板固定し、組換え型ウィルスをプラーク精製する。 ■旦え　ンパク　の６プラーク精製したウィルスを、放射線標識付けによりスクリーニングする。Ａｌ１換え型タンパク質を５Ｏ５−ＰＡＧＥゲル上で同定する。１時間、細胞を付着させる０次に培地を除去し、ウィルス系統を含む培地をかぶせ、２７°Ｃで１時間インキュベートさせ、その後ウィルレス接種物を除去し、５００μｉの完全培地で置換する。２７°Ｃで４８時間細胞をインキュベートする。このインキュベーションの終りで、培地を除去する。　２００　ｄのメチオニンを含まないブレース培地を細胞に付加し、６０分間細胞をインキュベートし、その後２００μｌの新鮮なメチオニンを含まないブレース培地とこの培地を置換し、これに対し１０μＣｉの３５５−メチオニンを付加する。６時間２７°Ｃで細胞をインキュベートし、次に遠心分離によりこれを収穫する。上滑を収集し、６２．５＋ｓＭのトリス、　ｐｌ＋６．８　、　２％のＳＯ５、１０％のグリセロール、０．００１％のブロモフェノールブルー、及び０．１Ｍの２−メルカプトエタノールス、　ｐＨ６．８　、４％（７）ＳＯＳ　、　２０％のグリセロール、０．００２％のブロモフェノールブルー及び０．２Ｍの２−メルカプトエタノールを付加する．次に３分間、標本を沸とうさせ、次に電気泳動及びゲルのオートラジオグラフィに付して培地内に分泌されたタンパク質及び分泌されていないタンパク質を同定する．未感染細胞と野生型ウィルスの感染を受けた細胞の対照が含まれる。網膜色素沈着された上皮由来神経栄養性因子の実施例についての以上の記述は、例示を目的とするものである．当業者にとっては変形態様は明白なものであることから、本発明は、上述の特定の実施Ｂ様に制限されるものではない．本発明は、特定的に開示されていないいずれかの要素が無い状態でも実施することができる．本発明の範囲は、以下のクレームによって規定されている。配列リスト（１）一般情報（１）出願人：Ｊｏｈｎｓｏｎ＋　Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｖ。Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｄ，　Ｊｏｙｃｅ（１、発明の名称：網膜色素沈着された上皮由来の神経栄養性因子（ｉｊ）配列数：ｌ（　ｉｖ　）通信用住所：（Ａ）宛て先：　Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，　Ｐａｒｋｅｒ　＆　Ｈａｌｅ（Ｂ）通り名：　Ｐ．　０．ＢＯＸ　７０５８（Ｃ）都市名：パサザイナＣＤ）州　名：カリフォルニア（Ｅ）国　名：アメリカ合衆国（Ｆ）＠便番号：　９１１０９−７０６１１１（ｖ）コンピュータ読取可能形Ｂ：（Ａ）媒体タイプ；フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＭ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）オベレーティングンステム：　ＰＣ−００５／ＭＳ−００３（Ｄ）ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎｔｉｎ　Ｒｅｌｅａｓｅ　１１１．０　。バージコン１１．２５（ｖｉ）現行出願データ：（Ａ）出願番号：ＵＳ（Ｂ）出願提出日：（Ｃ）分類：（ｖｉ）先行出願データ：無　しくｖｉ）弁理士／代理人情報（Ａ）氏　名：　Ｓｈａｒｐ　Ｅｓｑ，　Ｊａｍｉｃｅ　Ａ。（Ｂ）登録番号：　３４．０５１（Ｃ）参照／事件整理番号：　０６６　：　２３８６０（ｉｘ）電気通信情報：（Ａ）電話：　（８１Ｂ）　７９５−５８４３（Ｂ）ファクシミリ：　（８１８）　５７７−１７６９（２）配列番号１についての情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長　さ：　１５０３塩基対（Ｂ）タイプ：核　酸（Ｃ）鎖形態：２本鎖（Ｄ）トポロジー：線　形（１１）分子タイプ：　ｃＤＮ＾（ｉｊ）仮説：無　しく１ｖ）アンチセンス：無　しくｖｉ）供給源：（Ａ）生　体：ホモサピエンス（Ｄ）発達段階：胎　児（Ｆ）組織タイプ−眼（ｖｉ）直接的供給源：（Ａ）ライブラリ：　Ａ．５＠ａｒｏｏｐのＣｈａｒｏｎ　ＢＳ　ライブラリ（Ｂ）クローン：　ＰＥＤＮＦ（　ｉｘ　）特ｗ１．：（Ａ）名称／キー：　ｐｒｉｍ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（Ｂ）場所：　１１７．、１３７０（ＩＸ）特徴：（Ａ）名称／キー：　ＣＤＳ（Ｂ）場所：　１１７．、１３７０（ｘ）出版物情報：（Ａ）著者：　５ｔｅｅｌｅ、　Ｆｉｎｔａｎ　Ｒ。Ｃｈａｄｅｒ、　Ｇｅｒａｌｄ　Ｊ。Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｖ。Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｋ、　Ｊｏｙｃｅ（Ｂ）題　名：色素上皮沈着された由来因子（ＰＥ［１ＮＦ）　：セリンプロテアーゼ阻再物資（ＳＥＲＰＩＮ）遺伝子族の単一部材としての神経栄養性活性及び同定（Ｃ）雑誌色：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳ＾。（Ｇ）日　付４１９９２年（Ｋ）配列番号１内の関連残基：　１−１５０２（χＩ）配列内容：配列番号ｌ：ＡＴＣＧＡＧ　ＧＣＣＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴｌｌ；ＣＡＴＴ　ＧＧＡ　ＧＣＣＣＴＣＣＴＣＧＧＧ　ＣＡＣ１６４Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　ｖａｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌ、ｅｕ　ＣｙＳ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　八ｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｈｉ■ ｌ　Ｓ　１０　１５ＡＧＯＡＧＣＴＧＣＣＡＧ　ＭＣＣＣＴ　ＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＧＣＴＣＣＣＣＡ　ＧＡＣ２１２Ｓｅｒ　Ｓｅｔ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｇｎ　Ｐｒｏ　ＡＬａ　５ｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ｃｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ＡｓｐＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＡ　ＧＧＧ　ＧＣＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＴＴＣＴＴＣＡＡＡ　２６０Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　ＬｙｉＧＴＣＣＣＣＧＴＧ　ＡＡＣＡＡＧ　ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＧＣＧ　ＧＣＴ　ＧＴＣＴＣＣｌｋｃ　ＴＴＣＧＧＣτＡＴＧ八Ｃへ　３０８Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｇｎ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｉｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　ＡｓｐＳｏ　５５　６０ＣτＧ　ＴＡＣＣＧＧ　ＧＴＧ　ＣＧＡ　ＴＣＣＡＧＣＡＴＧ　ＡＧＣＣＣＣＡＣＧ　ＡＣＣＡＡＣＧＴＧ　ＣＴＣＣＴＧ　３５６Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　ｋｒｑ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ：　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　丁ｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅ■ 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ＡＮτＴ　ＣＣＣＧＡＴ　ＧＡＧ　ＡＴＣＡＧＣＡＴＴ　ＣＴＣＣＴＴ　ＣＴＣ７４０ＡＬａ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｐ【ｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　工１ｅ　Ｓｅｒ　工↓ｅ　Ｌｅｕ　Ｌ＠ｕ　Ｌ＠ｕＣＧＴ　ＧＴＧ　ＧＣＧ　ＣＡＣＴＴＣＡＭ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＴＧＧ　ＧＴＡ　ＡＣＡ　ＡＡＧ　ＴＴＴ　ＧＡＣＴＣＣＡＧＡ　７８ＢＧｌｙ　Ｖａｌ　八ｌａ　）ｌｉｓ　Ｐｈ＠Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　Ｌ、ｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｒ■ 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Claims

【特許請求の範囲】

１．配列番号１に識別されているアミノ酸配列をもつ精製された綱膜色素沈着された上皮由来の神経栄養性因子（ＰＥＤＮＦ）組成物。
２．合計タンパク質との関係において少なくとも５０重量％のＰＥＤＮＦを含んで成る、請求の範囲第１項に記載の組成物。
３．ＰＥＤＮＦが５００００〜５５０００の分子量（原文のｍｏｌｅｅｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ不要）及び３．９〜７．２のｐｌを有する糖タンパク質である、請求の範囲第１項に記載の組成物。
４．ＰＥＤＮＦが分岐プロセス及び神経単位の分化の拡張を誘発することができる、請求の範囲第１項に記載の組成物。
５．ＰＥＤＮＦがセリンプロティナーゼ阻害物質である。請求の範囲第１項に記載の担成物。
６．ポリペプチドが、胎芽細胞又は不死化された細胞に適用された場合神経単位の分化を誘発する、請求の範囲第１項に記載の組成物。
７．網膜色素沈着された上皮から誘導された精製セリンプロティナーゼ阻害物質。
８．セリンプロティナーゼが神経栄養性活性を示す。請求の範囲第７項に記載の精製セリンプロティナーゼ阻害物質。
９．セリンプロティナーゼのアミノ酸組成がＡＳＰ　２５Ａｓｎ　１１Ｔｈｒ　２８Ｓｅｒ　３８Ｇｌｕ　２６Ｇｌｎ　１５Ｐｒｏ　２９ＧＩｙ　２３Ａｌａ　２５Ｖａｌ　２５Ｍｅｒ　７Ｉｌｅ　２２Ｌｅｕ　５７Ｔｙｒ　１０Ｐｈｅ　１８Ｈｉｓ　８Ｌｙｓ　２７ＴｒＰ　３Ａｒｇ　１８である、請求の範囲第７項に記載の精製セリンプロティナーゼ阻害物質。
１０．配列番号１に識別されているアミノ酸配列をもつ、請求の範囲第７項に記載の組成物。
１１．タンパク質が５００００〜５５０００の分子量と３．９〜７．２のｐＩを有する糖タンパク質を含んで成る、請求の範囲第７項に記載の精製セリンプロティナーゼ阻害物質。
１２．−ＰＥＤＮＦを含む不純タンパク質分画を提供すること；−陽イオン交換クロマトグラフィ培地に対してＰＥＤＮＦを含む不純タンパク質分画を適用すること； −あらゆる未結合タンパク質を溶離するべく陽イオン交換クロマトグラフィ培地を洗浄すること； −陽イオン交換クロマトグラフィ培地からＰＥＤＮＦを溶離すること、−分画を内含するＰＥＤＮＦを収集して陽イオン交換クロマトグラフィで精製された網膜色素ＰＥＤＮＦを提供すること。を含んで成る、網膜色素沈着された上皮神経栄養性因子（ＰＥＤＮＦ）を精製する方法。
１３．ＰＥＤＮＦを含む不純タンパク質分画が網膜色素沈着された上皮調整培地を含んで成る、請求の範囲第１２項に記載の方法。
１４．ＰＥＤＨＦを含む不純タンパク質分画が、ＰＥＤＨＦ遺伝子の発現が可能な形態でＰＥＤＮＦ遺伝子を含む組換え型ＤＮＡ分子を用いて形質転換された生体の抽出物を含んで成る、請求の範囲第１２項に記載の方法。
１５．ＰＥＤＮＦを含む不純タンパク質分画には、ＰＥＤＨＦ遺伝子の発現が可能な形態でＰＥＤＮＦ遺伝子を含む組換え型ＤＮＡ分子で形質転換された生体が中で成長させられる培地が含まれている、請求の範囲第１２項に記載の方法。
１６．ＰＥＤＮＦを内含する不純タンパク質分画の硫酸アンモニウムによる沈殿をさらに含んで成る、請求の範囲第１２項に記載の方法。
１７．５０％〜６０％の硫酸アンモニウムタンパク質分画を提供するべく硫酸アンモニウムを用いてＰＥＤＮＦを含む不純タンパク質分画を５０〜６０％の飽和まで導くことにより、ＰＥＤＮＦを含む不純タンパク質分画から汚染性タンパク質が沈殿させられる、請求の範囲第１６項に記載の方法。
１８．７０％〜８０％の硫酸アンモニウムタンパク質分画を提供するべく硫酸アンモニウムを用いてＰＥＤＮＦを含む不純タンパク質分画を７０％〜８０％の飽和まで導くことにより、ＰＥＤＮＦを含む不純タンパク質分画からＰＥＤＮＦが沈殿させられる、請求の範囲第１６項に記載の方法。
１９．５０％〜８０％の硫酸アンモニウムタンパク質分画を提供するべく硫酸アンモニウムを用いて５０％〜６０％の硫酸アンモニウムタンパク質分画を７０％〜８０％の飽和まで導くことにより５０〜６０％の硫酸アンモニウム分画からＰＥＤＮＦが沈殿させられる、請求の範囲第１６項に記載の方法。
２０．−サイズ排除クロマトグラフィ培地に対し陽イオン交換クロマトグラフィで精製されたＰＥＤＮＦタンパク質分画を適用すること、−サイズ排除クロマトグラフィ培地からタンパク質を溶離すること；及び −ＰＥＤＮＦ含有分画を収集すること、をさらに含んで成る、請求の範囲第１２項に記載の方法。
２１．・・・を内含する不純タンパク質分画を提供すること、及び−硫酸アンモニウム沈殿、陽イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、及びこれらの組合せから成るグループの中から選択された方法によってさらにＰＥＤＮＦを精製すること、を含んで成る、網膜色素沈着された上皮神経栄養性因子（ＰＥＤＮＦ）を精製する方法。
２２．精製ポリペプチドが単一のポリペプチド種を合計タンパク質との関係において少なくとも５０重量％含んで成る、請求の範囲第２１項に記載の方法。
２３．精製ポリペプチドが、胎芽細胞又は不死化細胞に適用された場合に神経単位分化を誘発する、請求の範囲第２１項に記載の方法。
２４．配列番号１内のＤＮＡ配列をもつ網膜色素沈着された上皮由来神経栄養性因子（ＰＥＤＮＦ）をコードする遺伝子を含んで成る組換え型ＤＮＡ。
２５．ＰＥＤＮＦのｍＲＮＡを形成するべくＰＥＤＮＦの転写を導くためプロモーター領域をさらに含んで成る、請求の範囲第２４項に記載の組換え型ＤＮＡ分子。
２６．ＰＥＤＮＦ　ｍＲＮＡの処理を導くためポリアデニル化領域をさらに含んで成る、請求の範囲第２４項に記載の組換え型ＤＮＡ分子。
２７．ＰＥＤＮＦ　ｍＲＮＡの翻訳を導くためのリボソーム結合部位をさらに含んで成る、請求の範囲第２４項に記載の組換え型ＤＮＡ分子。
２８．配列番号１内のアミノ酸配列を有するＰＥＤＮＦをコードする遺伝子を含んで成る組換え型ＤＨＡ分子。
２９．配列番号１内に識別されたＤＮＡ配列を有する網膜色素上皮沈着された由来神経栄養性因子（ＰＥＤＮＦ）遺伝子を含む組換え型ＤＨＡ分子を用いて形質転換された生体。
３０．組換え型ＤＮＡ分子が、ＰＥＤＮＦ　ｍＲＮＡを形成するべくＰＥＤＮＦ遺伝子の転写を誘導するため組換え型ＤＮＡ分子で形質転換された生体による認識に適しているプロモータ領域をさらに含んで成る、請求の範囲第２９項に記載の生体。
３１．組換え型ＤＮＡ分子が、ＰＥＤＮＦ　ｍＲＮＡを形成するべくＰＥＤＮＦ遺伝子の処理を誘導するため組換え型ＤＮＡで形質転換された生体による認識に適しているポリアデニル化領域をさらに含んで成る、請求の範囲第２９項に記載の生体。
３２．組換え型ＤＮＡ分子が、ＰＥＤＮＦ　ｍＲＮＡの翻訳を導くべく、組換え型ＤＮＡ分子で形質転換された生体による認識に適しているリボソーム結合部位をさらに含んで成る、請求の範囲第２９項に記載の生体。
３３．網膜上皮由来神経栄養性因子（ＰＥＤＮＦ）を含んで成る、腫瘍治療方法。
３４．ＰＥＤＮＦが一日あたり１回〜１０回、１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で糖される、請求の範囲第３３項に記載の方法。
３５．網膜上皮由来神経栄養性因子（ＰＥＤＮＦ）を投与することを含んで成る眼科疾病の治療方法。
３６．ＰＥＤＮＦが一日あたり１回〜１０回、１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で投与される、請求の範囲第３５項に記載の方法。
３７．網膜上皮由来神経栄養性因子（ＰＥＤＮＦ）を投与することを含んで成る、神経損傷の治療方法。
３８．ＰＥＤＮＦが１日あたり１回〜１０回、１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で投与される、請求の範囲第３７項に記載の方法。
３９．網膜上皮由来神経栄養性因子（ＰＥＤＮＦ）を投与することを含んで成るセリンプロテアーゼの活性の結果としてもたらされる条件を治療する方法において、これらの条件が、過剰の望ましくない血液凝固、血栓症、細菌感染、寄生虫感染、線維素様形成が関与する血管障害、凝固障害、動脈硬化、虚血、関節症糖尿病、気腫、関節炎、敗血症性ショック、肺疾患、過剰補体活性化、潰瘍、潰瘍性大腸炎、膵炎、乾癬、線維素溶解性疾患、関節症、骨吸収、高血圧、うつ血性心不全、肝硬変又はプロテアーゼによりひき起こされるアレルギーから成るグループの中から選定される、治療方法。
４０．ＰＥＤＮＦが、一日あたり１〜１０回、１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で投与される、請求の範囲第３９項に記載の方法。