HU211318A9 - Multitróf és multifunkcionális kiméra neurotróf faktorok és a kimérákát kódoló nukleinsavak és plazmidok Az átmeneti oltalom a(z) 1-34. igénypontra vonatkozik. - Google Patents

Multitróf és multifunkcionális kiméra neurotróf faktorok és a kimérákát kódoló nukleinsavak és plazmidok Az átmeneti oltalom a(z) 1-34. igénypontra vonatkozik. Download PDF

Info

Publication number
HU211318A9
HU211318A9 HU9500735P HU9500735P HU211318A9 HU 211318 A9 HU211318 A9 HU 211318A9 HU 9500735 P HU9500735 P HU 9500735P HU 9500735 P HU9500735 P HU 9500735P HU 211318 A9 HU211318 A9 HU 211318A9
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
chimeric protein
nucleic acid
chimeric
amino acid
ngf
Prior art date
Application number
HU9500735P
Other languages
English (en)
Inventor
Stephen P Squinto
Mark E Furth
Ulrich Suter
Ronald M Lindsay
Nancy Ip
George D Yancopoulos
Eric M Shooter
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Priority to HU9500735P priority Critical patent/HU211318A9/hu
Publication of HU211318A9 publication Critical patent/HU211318A9/hu

Links

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

1. BEVEZETÉS
A találmány tárgyát kiméra neurotróf faktorok képezik, azaz olyan molekulák, amelyek egy természetes faktor egy részét tartalmazzák, valamint legalább egy másik molekulát, oly módon, hogy a keletkező kiméra molekula neurotróf aktivitással rendelkezik. Ez részben azon a felfedezésen alapul, hogy azok a kiméra molekulák, amelyek két különböző neurotróf faktor részeit tartalmazzák, megtartják lényegében a teljes biológiai aktivitásukat, és legalábbis néhány esetben egy teljesen különleges neurotróf aktivitással rendelkeznek, amennyiben egyetlen molekula tartalmazza mindkét kiindulási molekula aktivitását.
2. A TALÁLMÁNY HÁTTERE
2.1. Kiméra citokinek
A test bizonyos sejtjei képesek bizonyos, citokineknek nevezett faktorok előállítására, amelyek hírvivőként működnek, és más sejtekkel kommunikálnak, ezzel biológiai funkciókat koordinálnak. Például, a limfociták termelhetnek limfokineket, olyan faktorokat, amelyek az immunrendszer különböző komponenseivel lépnek kölcsönhatásba, abból a célból, hogy az immunválaszt hatékonyan összehangolják. A neurotróf faktorok citokinek, amelyek elősegíthetik az idegrendszer komponenseinek túlélését és/vagy differenciálódását.
Sejtközötti hírvivőkként a citokinek tipikusan kölcsönhatásba lépnek specifikus sejtpopulációkkal, a citokinreceptor molekulákon keresztül. Ennek megfelelően egy citokin egy bizonyos receptor-hordozó sejt felé irányul. Kimutatták, hogy a citokinek használhatók toxikus anyagoknak egy bizonyos sejtpopulációhoz való juttatására, oly módon, hogy a citokint a toxikus anyaghoz kapcsolják. Siegall és munkatársai például [Fed. Am. Soc. Exp. Bioi., 3. 2647-2652 (1989)] fuzionáltattak egy alfa citokint transzformáló növekedési faktort kódoló cDNS-t egy olyan gén 5'-végéhez, amely a Pseudomonas A exotoxin módosított formáját kódolja, és amely endotoxin nem rendelkezik a sejt-felismerő doménnel. A kapott kiméra molekulát Escherichia coli-ban expresszálták, izolálták, és úgy találták, hogy rendkívül toxikus azokra a sejtekre, amelyek az epidermális növekedési faktor receptorát hordozzák. Ogata és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86. 4215-4219 (1989)] előállítottak egy rekombináns kiméra toxint, amelyben a Pseudomonas exotoxin (PE) sejt-kötő doménjét az interleukin-4 rágcsáló limfokinnel (IL—4) helyettesítették; a kapott kiméra fehérjéről, az IL-4-PE40-ről kiderült, hogy citotoxikus hatással rendelkezik a rágcsáló, IL-4 receptort tartalmazó sejtekre. Banker és munkatársai [J. Cell. Physiol. 139, 51-57 (1989)] leírtak egy epidermális növekedési faktor-ricin A lánc kimérát. Williams és munkatársai [Protein Eng., /, 493-498 (1987)] a diftéria-toxin receptorkötő doménjét helyettesítették egy olyan szintetikus génnel, amely az interleukin-2-t és egy transzlációs stop-szignált kódolt. A diftéria-toxin/IL-2 fúziós fehérjéről kiderült, hogy szelektíven gátolja a fehérjeszintézist az IL-2 receptorokat tartalmazó sejtekben, miközben azok a sejtek, amelyek nem expresszálnak IL-2 receptorokat, rezisztensek a toxin hatására.
Más kutatók olyan rekombináns DNS molekulákat készítettek, amelyek egy citokin gént, valamint egy bakteriális génnek legalább egy részét tartalmazzák. Dicou és munkatársai [J. Neurosci. Rés., 22, 13-19 (1989)] a teljes egér prepro-idegnövekedési faktor DNS-t fuzionáltatták az Escherichia coli béta-galaktozidáz génje karboxi-terminálisához, valamint a humán idegnövekedési faktor, 11-106-os kodonjait tartalmazó DNS fragmentet a béta-galaktozidáz amino-terminálisának ötödik kodonjához fuzionáltatták. Mindkét bakteriális vektor nagy mennyiségben termelte a kiméra fehérjéket. Jóllehet a baktériumsejtek lízise után a legtöbb kiméra egér prepro-idegnövekedési faktor oldhatatlannak bizonyult, a humán kiméra béta-idegnövekedési faktor legnagyobb része a felülúszóban volt található. A neurotróf aktivitásról semmit nem közöltek.
Egy újabb vizsgálatban [Ibanez et al., EMBO J., 9, 1477-1483 (1990)] az ideg-növekedési faktor helyspecifikus mutagenezissel való megváltoztatását írták le. Xie és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3180— 3184 (1990)] kiméra opioid peptidek alkalmazását írták le az opiát receptorok vizsgálatában. Ray és munkatársai [Mól. Endocrinol., 102, 101 (1990)] a növekedési hormon receptor-kötési specifitásának a genomiális exon cseréje következtében beállt változását vizsgálták. Cunningham és munkatársai [Science, 247, 1330 (1990)] szisztematikusan helyettesítették a növekedési hormon különböző részeit, azzal a céllal, hogy olyan mutáns hormonokat azonosítsanak, amelyek nem képesek a növekedési hormon receptorához kötődni. Cunningham és munkatársai [Science, 247, 1461 (1990)] a prolakün olyan helyspecifikus mutagenezisét figyelték meg, amely segítségével a keletkező prolaktin variáns képes a növekedési hormon receptorához kötődni.
2.1. Neurotróf faktorok
Az idegrendszer kifejlődése és fennmaradása a neurotróf faktorokként ismert fehérjéktől függ. Nagyon sokféle neuronális sejtpusztulás kíséri a közponú és a perifériális idegrendszer normális fejlődését, és láthatóan fontos szerepet játszik a neuronok számának szabályozásában, amelyek egy adott célterületre irányulnak [Berg, D. K., Neuronal Development, 297-331 (1982)]. A perifériális célszöveteknek a fejlődés során végzett ablációjának és transzplantációjának vizsgálata azt mutatta, hogy a neuronális sejtpusztulás abból ered, hogy a neuronok versengenek a korlátozott számban rendelkezésre álló túlélési faktorokért (azaz a „neurotróf faktorokért”), amelyek a projekciós területeiken keletkeznek. A mai napig négy fontos neurotróf faktort azonosítottak ideg-növekedési faktorként [NGF: LeviMontalcini and Angeletti, Phys. Rév., 48, 534 (1968); Neurotrophin-3, NT-3: Hohn et al., Natúré, 334, 339 (1990); Masonpierre et al., Science, 247, 1446 (1990); agyi eredetű neurotróf faktor, BDNF: Barde et al., EMBO J.. 1. 549 (1982), és a ciliáris neurotróf faktor (CNTF; Lin et al. Science 246. 1023 (1979)].
HU 211 318 A9
2.2.1. IDEG-NÖVEKEDÉSI FAKTOR
Az ideg-növekedési faktor (NGF) ezek között a neurotróf molekulák között messze a legjobban jellemzett, és igazolták, mind in vitro mind in vivő körülmények között, hogy lényeges a szimpatikus és neurális taréj-eredetű érzékelő neuronok túlélése szempontjából mind a csirkék mind a patkányok korai fejlődési szakaszában [LeviMontalcini and Angeletti, Develop. Bioi., 7, 653-659 (1963); Levi-Montalcini et al., Physiol. Rév. 48, 524-569 (1968)]. A tisztított. NGF fejlődő csirke-embrióba való injekciózásával azt figyelték meg, hogy fokozza a gerinc érzékelő neuronjainak és szimpatikus neuronjainak túlélését és hipertrófiáját [Levi-Montalcini and Booker, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 46, 373-384 (1960); Hamburger et al., J. Neurosci., 1,60-71 (1981)]. Ezzel szemben, ha az endogén NGF-et eltávolítjuk, vagy mennyiségét lecsökkentjük újszülött patkányokban, oly módon, hogy naponta anti-NGF antitesteket injekciózunk beléjük, ez azzal jár, hogy virtuálisan leromboljuk a szimpatikus idegrendszert bennük [Levi-Montalcini and Booker, Proc. Natl. Acad Sci., 46, 384-391; Levi-Montalcini and Angeletti, Pharmacol. Rév., 18,619-628 (1966)]. A fejlődés még korábbi stádiumában végrehajtott NGF antitest kezelés, például az in ütem antitest injekciókkal vagy anyai antitestek passzív transzplacentális transzferével azt eredményezi, hogy lényeges veszteség áll be a neurális taraj neuronokbán eredetű érzékelő neuronokbán pl. a spinális és dorzomediális trigeminális érzékelő [Godért et al.. Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 1580-1584 (1984); Gorin and Johnson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76, 5382-5386 (1979)]. Egész mostanáig, az NGF-fel végzett majdnem mindegyik vizsgálat a perifériális idegrendszerben játszott szerepét kutatta, de az most már látszik, hogy az NGF befolyásolja a központi idegrendszerben levő specifikus neuron-populációk fejlődését és fenntartását is [Thoenen et al., Rév. Physiol. Biochem. Pharmacol., 109, 145-178 (1987); Whittemore and Seiger, Brain Rés. Rév.. 72, 439-464(1987)].
Az NGF fehérjék bősége az egér szubmaxilláris (felső állcsont alatti) mirigyében lehetővé tette, hogy ennek a fehérjének a primer szekvenciáját viszonylag általános fehérjekémiával meghatározzák [Angeletti and Bradshaw, Proc. Natl. Acad. Sci., 68, 2417-2420 (1971)]. Az NGF gént mára már klónozták számos fajból, beleértve az egeret [Scott et al., Natúré, 302, 538-540 (1983)], az embert [Ullrich et al., Natúré, 303, 821-825 (1983)], a szarvasmarhát és a csirkét [Meier et al., EMBO J„ 5, 1489-1493 (1986)] valamint a patkányt [Whittemore et al., J. Neurosci. Rés., 20, 402-410 (1988)], lényegében konvencionális molekuláris biológiai módszerek alkalmazásával, az egér NGF ismert fehérje szekvenciája alapján tervezve meg az alkalmas oligonukleotid próbákat. Az. hogy az NGF nagy mennyiségben hozzáférhető, nagymértékben megkönnyítette az NGF receptor vizsgálatait, amelyek végül az NGF receptor egyik komponensének a klónozásához vezettek emberből és patkányból [Johnson el al., Cell, 47, 545-554 (1986); Radeke et al., Natúré, 325, 594-597 (1987)].
Azt mára már megállapították, hogy az NGF nem egy egyedülálló neurotróf faktor. A perifériális idegrendszerben az NGF egy túlélési faktornak látszik a paraszimpatikus neuronok, a neurális placode-eredetű érzékelő neuronok vagy enterikus neuronok számára, amint az mind az in vitro, mind az in vivő vizsgálatokból megállapítható. Emellett, az NGF nem valószínű hogy túlélési faktora a motoros neuronoknak [Oppenheim, J. Comp. Neurol., 270,174-189 (1982)], jóllehet ezek a neuronok expresszálják az NGF receptornak legalább egy kis affinitású formáját a fejlődés során [Raivich et al., EMBO J., 4, 637-644 (1985)]. Az, hogy az NGF nem hat ezekre a neurontípusokra, más neurotróf faktorok keresésére serkentette a kutatókat, főleg olyan faktorokat kerestek, amelyek a gerincvelő motoros neuronok és/vagy a ciliáris ganglionok paraszimpatikus neuronjainak a túlélőképességét fenntartják.
2.2.2. AGYI EREDETŰ NEUROTRÓF FAKTOROK
Az úgynevezett „kondicionált táptalajban”, amelyben patkány C-6 glióma sejteket növesztettek [Barde et al., Natúré, 274, 818 (1978)], egy neurotróf aktivitást azonosítottak, amely képes biztosítani a túlélést embrionális csirke dorzális gyök ganglion neuronok számára in vitro körülmények között. Ezt az aktivitást nem semlegesítette az egér NGF elleni antitest, jelezve ezzel, hogy más neurotróf faktor van jelen a kondicionált táptalajban. Ezután leírtak hasonló aktivitásokat, amelyek nem blokkolhatók az NGF antitestekkel, például normál felnőtt patkány agy asztrogliális sejtjeinek tenyészetében [Lindsay, Natúré, 282, 80-83 (1979); Lindsay et al., Brain Rés., 243, 329-343 (1982)], valamint fejlődő és felnőtt patkányagy kivonatból [Barde et al., Poc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1199-1203 (1980)] és fejlődő illetve érett csirke gerincvelőből [Lindsay and Peters, Neurosci., 72, 45-51 (1984)]. Egyik esetben sem izolálták vagy azonosították az aktív faktor(oka)t, és kérdéses maradt, hogy a megfigyelt aktivitások ugyanannak vagy eltérő faktoroknak voltak-e köszönhetők.
Kiindulási anyagként sertésagyat használva, Barde és munkatársai [EMBO J., 7, 549-553 (1982)] leírtak egy faktort, amelyet ma agyi eredetű neurotróf faktornak hívnak (BDNF), és amelyről kiderült, hogy láthatóan elősegíti az E10/E11 csirkeembriókból származó dorzális gyökér ganglion neuronok túlélését. A neurotróf aktivitásról kiderítették, hogy egy erősen bázikus fehérjéhez kötődik (az izoelektromos pontja, pl = 10,1), amely a nátrium-dodecil-szulfát (SDS) gélelektroforézis során egyetlen, 12,3 kDa méretű csík formájában vándorol. Megjegyezték, hogy a BDNF erősen bázikus természete és a molekulamérete nagyon hasonló az NGF monomeréhez.
A BDNF gén klónozását először az 1989. augusztus 30-án benyújtott 07/400 591 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölték, amelyre a továbbiakban teljes terjedelmében hivatkozunk. Röviden, a BDNF fehérje igen kis mennyiségeit tisztították sertésagyból, ezzel lehetővé téve a fragmentek aminosav-sorrendjének meghatározását, ami a későbbiekben
HU 211 318 A9 a megfelelő oligonukleotidok tervezéséhez használható. Ezeket a szintetikus oligonukleotidokat használták azután indító molekulaként a polimeráz láncreakcióban (PCR), a BDNF-et termelő sejtekből izolált cDNS templáton. A PCR termékeit használták próbaként a komplett cDNS és/vagy genomiális BDNF gének klónozására számos különböző fajból, beleértve az embert, sertést, patkányt és egeret, majd ezeknek a géneknek a szekvenciáját meghatározták. A rekombináns BDNF expresszióját COS-sejtekben végezték.
A BDNF-nek az NGF-étől eltérő neuronális specifitását először in vitro igazolták, oly módon, hogy a BDNF az E6, E9 vagy E12 csirke embrió neurális piacodé eredetű csomós ganglionjáról disszociált érzékelő neuronok 40-50%-nak túlélését támogatta [Lindsay et al., J. Cell. Sci. Supp., 3, 115-129 (1985)]. Az NGF nem gyakorolt látható hatást ezekre a neuronokra sem önmagában, sem a BDNF-fel együtt. Később kimutatták explantációs tenyészetek vizsgálatával, hogy a BDNF láthatóan támogatja és elősegíti a túlélést és a neurit kinövést az egyéb neurális piacodé eredetű érzékelő ganglionokról, beleértve a sziklacsonti, térdhajlati és elülső-oldalsó trigeminális ganglionokat [Davies et al., J. Neurosci., 6, 18971904 (1986)], amelyek közül egyiket sem találták az NGF-re érzékenynek. Mindegyik fenti vizsgálatban az NGF-et neutralizáló antitestek hatástalanok voltak aBDNF megfigyelt aktivitására. A perifériális ganglionokból származó tenyésztett neuronokra gyakorolt hatása mellett a BDNF-ről kimutatták, hogy serkenti a fürj neurális tarajából kitenyésztett sejtek túlélését és neuronális differenciálódását [Kalcheim and Gendreau, Develop. Brain Rés.. 41, 79-86 (1988)].
A BDNF-fel végzett két friss vizsgálat azonban [Kalcheim et al., EMBO J„ 6, 2871-2873 (1987); Hofer and Barde, Natúré, 331. 261-262 (1988)] jelezte, hogy a BDNF-nek fiziológiai szerepe van a szárnyasok PNS fejlődésében. Ha mechanikai korlátot helyeztünk el in ovo az E3/E4 (3. és 4. embrionális nap) pontban a fejlődő dorzális gyökér-ganglionok és CNS célpontjuk közé a neurális csőben, akkor számos DRG neuron pusztulását figyelték meg C Kalcheim and Le Dourarin, Develop. Bioi., 116. 451-46 (1986)]. Azt feltételezték, hogy ez a neuronális pusztulás egy CNS (neurális cső) eredetű neurotróf faktor megvonásának következménye. Ezt követően megfigyelték, hogy egy lamininnal borított szialasztikus membránhoz kötött BDNF képes megakadályozni ezt a sejtpusztulást [Kalcheim et al., EMBO J., 6, 2871 2873 (1987)]. Ha BDNF-et injekcióznak fejlődésben levő fürjtojásokba, akkor azt találják, hogy csökkentik a természetes sejtpusztulást a csomós ganglionban, amely hatás az NGF-fel kapcsolatban nem figyelhető meg [Hofer and Barde, Natúré, 331, 261-262 (1988)]. Amellett, hogy hatása van mind a neurális taréj és neurális piacodé eredetű perifériális érzékelő neuronokra, a BDNF-ről kiderült, hogy támogatja a fejlődő CNS neuronok túlélését. Johnson és munkatársai [J. Neurosci., 6, 3031-3938 (1986)] olyan adatokat mutattak be, amelyek azt mutatták, hogy a BDNF támogatja az E17 patkány embriókból tenyésztett retinális ganglion sejtek túlélését. Ezek a kiterjesztett korábbi vizsgálatok, amelyek azt mutatták.
hogy retinális ganglion sejtek megcélzott területeiről készített kondicionált táptalajok és agykivonatok láthatóan támogatták ezeknek a neuronoknak a túlélését [McCaffery et al., Ex. Brain. Rés., 48, 37-386 (1982); Sarthy et al., J. Neurosci., 3, 2532-2544 (1983); Tumer et al., Dev. Brain Rés., 6, 77-83 (1983)].
Amellett, hogy hatással van a fejlődő neuronok tenyészetben való túlélésére, a BDNF-ről kimutatták, hogy hatással van a tenyésztett felnőtt perifériális és centrális idegrendszer neuronjaira is. A BDNF-ről, valamint az NGF-ről kimutatták, hogy serkenti a felnőtt patkány DRG neuronjaiból tenyészetben való axon-regenerálódást [Lindsay, J. Neurosci., 8, 2394-2405 (1988)], jóllehet a felnőtt érzékelő neuronok látszólag nem igénylik a neurotróf faktorokat az in vitro fennmaradáshoz 3-4 hét során. Továbbá, a felnőtt patkány retinájának tenyészeteiben a BDNF-ről megfigyelték, hogy elősegíti a retinális ganglion sejteknek mind a túlélését, mind az axonális elongációját a retinális ganglion sejtekből [Thanos et al., Eur. J. Neurosci., 1, 19-26 (1989)]. Emellett a BDNF-ről kimutatták, hogy meghosszabbítja az elülső középagyi tenyészetekben levő sejtek túlélését, amit az immuncitokémiával láthatóvá tett tirozin-hidroxiláz pozitív sejtek számával mérhetünk. Emellett a BDNF megnöveli a kolinerg neuronok túlélését disszociált sejttenyészetben, ami a patkány szeptális régiójából származik [USA szabadalmi bejelentés, 07/400 591, bejelentve 1989 augusztus 30-án]. Az NGF és a BDF biológiai hatásainak összehasonlítása az I. táblázatban látható.
/. táblázat
A BDNF és az NGF biológiai aktivitásainak összehasonlítása *
Perifériális idegrendszer Túlélés**
BDNF NGF
(i) E6 csirke DRG - +
El0 csirke DRG + +
El 2 csirke Symp - +
[Barde et al (1980) supra]
(ii) E6-E12 csirke DRG ++ ++
E6-E12 csirke göbös ++ -
El 2-csirke szimpatikus - ++
E12-csirke ciliáris - -
[Lindsay et al. (1980) supra]
(iii) E3-E14 Csirke: Nyaki +/++ ++
DM-trigeminális +/++ ++
Sziklacsonti +/++ -
Térdhajlati +/++ -
VL-trigeminális ++ -
Vesztibuláris - -
Középagyi trigerminális ++ -
[Davies el al.. (1986), supra] [Barde et al., Prog. Brain Rés. 71. 195-189 (1987)]
HU 211 318 A9
I. táblázat (folyt)
A BDNF és az NGF biológiai aktivitásainak összehasonlítása *
Központi idegrendszer Túlélés**
BDNF NGF
(i) E17 Patkány retinális ganglion sejtek [Johnson et al. J. Neurosci. 63031 — 3038 (1986)] ++ -
(ii) Hasi középagyi dopaminerg neuronok ++ -
(iii) Bazális előagyi kolinerg neuronok (1989. augusztus 30-án benyújtott 07/400 sorozatszámú USA bejelentés) ++ ++
* a publikálás időpontja szerinti kronológiai sorrendben; A hatásokat in vitro tesztelve ** nincs túlélés: (-); közepes túlélés (+); jó túlélés (++)
Az érett BDNF megjósolt primer szerkezetének elemzése az NGF szerkezetével meglepő azonosságot fedett fel; csak három megszakítást kellett bevinni az NGF szekvenciába, hogy az illeszkedést optimalizáljuk, és így a különböző NGF-ek (kígyótól az emberig) és a BDNF között 51 azonosság figyelhető meg. Fontos, hogy ezek közé az azonosságok közé tartozik hat cisztein-csoport.
2.2.3. NEUTR0F1N-3
Az NGF és a BDNF közötti jelentős hasonlóságok azt sugallták, hogy mindkettő egy nagyobb, egymással szoros rokonságban álló neurotróf molekulacsalád tagja. Ha a homológia régióit használtuk a BDNF/NGF géncsalád új tagjainak azonosítására végzett polimeráz láncreakció oligonukleotid indító molekuláinak megtervezésére, akkor a család egy új tagját, neve neurotrofin-3, fedeztük fel, és az NT-3 gént egérből, patkányból és emberből klónoztuk (az 1990. március 7-én benyújtott 07/490 004 sorozatszámú USA szabadalmi bejelentés, amelynek teljes szövegét a továbbiakban referenciaként használjuk). Az érett egér NT-3 fehérje teljes szerkezetét, amely 119 aminosavat tartalmaz, számított pl értéke körülbelül 9,5, hasonlónak találtuk mint az NGF és a BDNF megfelelő adatait; egy 18 aminosavból álló feltételezett szignál-szekvenciát (amely a BDNF-fel, illetve az NGF-fel 5 illetve 9 aminosavban azonosságot mutat) láthatóan egy 121 aminosavból álló pro-szekvencia követi (viszonyítható az egér NGF 103 aminosavból álló pro-szekvenciájával és az egér BDNF 112 aminosavból álló pro-szekvenciájával). Az érett egér NGF, BDNF és NT-3 összehasonlítása 54 aminosav azonosságot mutatott (1. ábra). Mind a 6 cisztein-csoport, amelyekről mind az NGF-ben mind a BDNF-ben ismert, hogy a diszulfidhidak képződésében részt vesz, [Leibrock et al., Biochem., 12. 100-115 (1973)], a konzervált csoportok között található. Hasonlóképpen, az érett patkány NT3 57%-os aminosav-homológiát mutat a patkány NGFfel és 58% aminosav-homológiát mutat a patkány BDNF-fel; a 120 csoportból 57 (48%) azonos mind a három fehérjében (1D ábra). Ismét megfigyelhető volt, hogy a patkány NGF és BDNF hat cisztein csoportja teljesen megőrződött a patkány ΝΤ-3-ban, és a három fehéije közötti legnagyobb homológia láthatóan ezen cisztein csoportok körül tömörül.
Az NT-3, NGF és a BDNF közötti homológia mellett egy fajon belül a nukleinsav szekvencia nagyfokú megőrződése is megfigyelhető a patkány és a humán NT-3 között az érett polipeptidet kódoló régióban (119 aminosav). A humán és a patkány gének DNS szekvencia szinten 92%-ban homológoknak bizonyultak. Az emberi és a patkány nukleotid szekvenciák közötti különbségek egyike sem vezetett aminosav változáshoz; az érett patkány és emberi (valamint egér NT-3) levezetett aminosav szekvenciája teljesen azonosnak bizonyult, emlékeztetett a BDNF nagyfokú konzerválódására, ami teljes azonosságot mutat az érett polipeptid aminosav szekvenciájában patkányban, egérben, emberben és sertésben. Ezzel szemben, az érett emberi NGF és a rágcsáló NGF (egér vagy patkány) körülbelül 10%-ban eltér egymástól.
Az NT-3 neurotróf aktivitásának tanulmányozása azt mutatja, hogy az NT-3 képes elősegíteni a túlélést és a neurit kinövést a tenyészetben levő disszociált háti gyökér ganglionokból. Továbbá, az ΝΤ-3-ról megfigyeltük, hogy elősegíti a neurit kinövést mind a göbös ganglion mind a szimpatikus ganglion explantumokból, míg a BDNF elősegíti a kinövést a göbös ganglionból de a szimpatikus ganglionból nem, és az NGF elősegíti a kinövést a szimpatikus ganglionból, de nem segíti elő a kinövést a göbös ganglionból. Ennélfogva, az ΝΤ-3-nak láthatóan szélesebb a specifitása, mint akár a BDNF-nek, akár az NGF-nek.
Az NT-3 fontos lehet az idegrendszer fejlődésében. Ha az NGF, a BDNF és az NT-3 transzkriptumok relatív bőségét összehasonlítjuk az újszülött és a felnőtt egerek agyában, akkor azt láthatjuk, hogy az NT-3 szintje az újszülött egerek agyában magasabb, mint a felnőtt egerek agyában. Az NT-3 RNS szintje a központi idegrendszerben a megfigyelések szerint sokkal magasabb a magzati fejlődés során, és ezt követően a felnőtt egyedekben megfigyelt szintre csökken.
2.2.4. CILIÁRIS NEUROTRÓF FAKTOR
A ciliáris neurotróf faktorok (CNTFs) olyan fehérjék, amelyek specifikusan elősegítik az embrionális csirke ciliáris ganglion neuronok túlélését [Manthorpe et al., J. Neurochem., 34, 69-75 (1980)]. A ciliáris ganglion anatómiailag az orbitális üregben található, a laterális rektusz és az optikai ideg tokja között; paraszimpatikus idegszálakat kap az okulomotoros idegből, amely beidegzi a ciliáris izmot és a pupilla záróizmot.
A ciliáris ganglion neuronokról kiderült, hogy azokhoz a neuronális populációkhoz tartoznak, amelyek meghatározott periódusú sejtpusztulással rendelkeznek. A csirke ciliáris ganglionban a 8. embrionális
HU 211 318 A9 napon (E8) jelenlevő neuronok fele a megfigyelések szerint elpusztul El4 előtt [Landmesser and Pilar, J. Physiol., 24], 737-749 (1974)]. Ugyanezen periódus alatt a ciliáris ganglion neuronok kapcsolatokat hoznak létre a célszöveteikkel, nevezetesen a ciliáris testtel és a szem érhártya burkával. Landmesser és Pilar megfigyelték [J. Physiol., 241, 751-736 (1974)], hogy ha az egyik szemet eltávolítják a sejtpusztulás periódusa előtt, akkor ez a ciliáris ganglion neuronjainak teljes pusztulását eredményezi az ipszilaterális (a test ugyanazon oldalára tartozó, vonatkozó) ganglionban. Ezzel szemben Narayanan és Narayanan publikációja szerint [J. Embryol. Ex. Morphol., 44, 53-70 (1978)] megfigyelték, hogy ha egy további szem primordiumot (szemkezdeményt) ültetnek be, és ezzel megnövelik a hozzáférhető célszövet mennyiségét, akkor a ganglion neuronális sejtpusztulása csökkenthető, Ezek az eredmények konzisztensek egy olyan neurotróf faktor létezésével, amely a ciliáris ganglion neuronokra hat.
Tenyészetben a ciliáris ganglion (CG) neuronokról felfedezték, hogy a túléléshez egy faktorra vagy faktorokra van szükségük. A ciliáris neurotróf faktor(ok) (CNTF) aktivitását csirke izomsejt kondicionált táptalajban azonosították [Helfand et al., Dev. Bioi., 50, 541-547 (1976); Helfand et al., Exp. Cell Es, 113, 39-45 (1978); Bennett and Nurcombe. Brain Rés., 773,543-548 (1979); Nishi and Berg, Natúré, 277, 232-234 (1979); Varon et al., Brain Rés., 173, 29—45 (1979)], valamint izomkivonatokban [McLennan and Hendry, Neurosci. Lett., 10, 269-273 (1978); Bonahandy et al.. Neurosci. Lett., 18, 197-201 (1980)]; csirkeembrió kivonatban [Varon et al., Brain Rés., 173, 29-45 (1979); Tuttle et al., Brain Rés.. 183, 161-180 (1980)]. valamint szívsejtekkel kondicionált táptalajban [lásd Adleret al. Science, 204, 1434-1436 (1979); Barbin et al., J. Neurochem., 43, 1468-1478 (1984)].
A CNTF-et patkány ülőidegből tisztították, és a különböző fragmensek aminosav szekvenciáját gázfázisú mikroszekvenálással határozták meg; a kapott aminosav-szekvenciát használták egy patkány CNTF gén klónozására, polimeráz láncreakció alapú klónozási technika segítségével [1989. szeptember 15-én benyújtott 07/408 sorozatszámú US szabadalmi bejelentés, és az 1989. október 31-én benyújtott 07/429 517 számú US szabadalmi bejelentés, amelyekre az alábbiakban referenciaként hivatkozunk). Egy patkány CNTF próba felhasználásával ezt követően klónozták a humán CNTF gént. A humán és a patkány CNTF gének nukleinsav szekvenciájának összehasonlítása azt mutatja, hogy a humán gén ugyanabban a pozícióban tartalmazza a génben levő egyetlen intront, mint a patkány CNTF gén. Az intronon belül a humán szekvencia jelentősen eltér a patkány szekvenciától, és ez ellentétben van a kódoló régióban megfigyelt lényeges konzerválódással.
A nukleotid szekvencia alapján a CNTF-ről megjósolható. hogy molekula tömege körülbelül 22,8 kD (a körülbelül 200 aminosavra becsült méretből számítva), ami jó egyezésben van azzal, amit a természetes CNTF poliakrilamid gélelektroforézises elemzése alapján lehet megbecsülni [22,5 kD; Saadat et al., J. Cell Bio., 108, 1807-1816 (1989)]. Tehát a CNTF aminosavszekvenciája egy citoszol fehérje tulajdonságaira enged következtetni, azaz nincs rajta szignál-peptid, nincs konszenzus szekvencia a glikozilezéshez és csak egyetlen cisztein-csoport található benne a 17-es pozícióban. Nincs megfigyelhető szekvencia-homológia a CNTF és az NGF, BDNF illetve a fibroblaSzt növekedési faktor (FGF) és a purpurin között; ezek mindegyike a CNTF-hez hasonló túlélési aktivitással rendelkezik [Unsicker et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 5459-5463 (1987); Schubert et al., J. Cell Bioi., 102, 2295-2301 (1986)].
Számos biológiai hatás tulajdonítható a CNTF-nek. A CNTF-et eredetileg olyan aktivitásként írták le, amely támogatta az E8 csirke ciliáris ganglion neuronjainak túlélését, ami egy komponense a paraszimpatikus idegrendszernek. Saadat és munkatársai [J. Cell Bioi., 108, 1807-1816 (1989)] megfigyelték, hogy a patkány ülőidegből készített legtisztább CNTF preparátumok indukálták a patkány szimpatikus neuronok kolinerg differenciálódását tenyészetben. Emellett Hoffman [J. Neurochem., 51, 109-113 (1988)] felfedezte, hogy a csirke szeméből származó CNTF aktivitás megnöveli a kolin-O-acetiltranszferáz aktivitást a retinális egy sejtréteges tenyészetekben.
Hughes és munkatársai [Natúré, 335, 7073 (1988)] tanulmányozták a bipotenciális glia őssejtek populációját perinatális patkány optikai idegében és agyában; ez a sejtpopuláció vélhetően először oligodendrocitákat, majd 2-es típusú asztrocitákat eredményez. A vizsgálatok azt sugallták, hogy az oligodendrocita differenciálódás egy oligodendrocita típusú 2-es asztrocita (O-2A) őssejtről történik minden növekedési faktor távollétében, míg a 2-es típusú asztrocita differenciálódáshoz egy specifikus indukáló fehérjére van szükség. Hughes és munkatársai megfigyelték, hogy a 2-es típusú asztrocitát indukáló fehérje hasonlít, illetve azonos a CNTF-fel [Lásd még Anderson, Trends Neurosci., 12, 83-85 (1989)].
Emellett, a rekombináns CNTF-ről kimutatták, hogy elősegíti a mediodorzális gerincvelői neuronok túlélését tenyészetben, és a tisztított patkány ülőideg CNTF-ről megfigyelték, hogy megakadályozza a motoros neuronok lézió-indukált sejtpusztulását újszülött patkány léziós arcidegében [1989. október 31-én benyújtott 07/429 517 sorozatszámú US szabadalmi bejelentés, amelyre a továbbiakban is hivatkozunk],
AII. táblázatban az NGF-fel, BDNF-fel, ΝΤ-3-mal és CNTF-fel kapcsolatos aktivitások listája látható; további, még azonosítatlan aktivitások is valószínűleg dokumentálva lesznek.
//. táblázat
A neurotróf faktorokra reagáló sejtek
I. NGF-re reagáló sejtek
A. Szimpatikus neuronok
B. Neurális taraj-eredetű érzékelő neuronok
C. E6-E12 háti gyökér ganglion
D. Bazális előagy kolinerg neuronok
HU 211 318 A9
II. BDNF-re reagáló sejtek
A. Neurális taraj-eredetű érzékelő neuronok (i) háti gyökér ganglion (E10/E11) (ii) nyaki ganglion (iii) dorzomediális trigeminális ganglion (iv) trigeminális középagy nukleusz
B. Ektodermális piacodé eredetű érzékelő neuronok (i) csomós ganglion (ii) vesztibuláris ganglion (iii) sziklacsont ganglion (iv) térdhajlati ganglion (v) ventrolaterális (elülső-oldalsó) trigeminális ganglion
C. Retinális ganglion
D. Ventrális középagyi dopaminerg neuronok
E. Bazális előagyi kolinerg neuronok
III. Az ΝΤ-3-ra reagáló sejtek
A. Dorzális gyökér ganglion
B. Szimpatikus ganglion
C. Csomós ganglion
IV. A CNTF-re reagáló sejtek
A. E8 ciliáris ganglion
B. Szimpatikus kolinerg neuron
C. 2-es típusú asztrociták
D. Mediodorzális gerincvelő neuronok
E. Motoros neuronok (például arcideg motoros neuronok)
Ε E10 DRG neuronok
3. A TALÁLMÁNY ÖSSZEFOGLALÁSA
A jelen találmány tárgyát kiméra neurotróf faktorok képezik, amelyek egy természetes celluláris faktornak legalább egy részét, valamint egy másik molekulának is legalább egy részét tartalmazzák, oly módon, hogy a kapott kiméra molekulának neurotróf aktivitása van. Ez részben azon a felfedezésen alapul, hogy mind NGF, mind BDNF részeket tartalmazó kiméra molekulák valószínűleg tartalmaznak neurotróf aktivitást, és néhány esetben szélesebb aktivitásspektrumot mutatnak, mint bármelyik kiindulási molekula. Továbbá azon a felfedezésen is alapul, hogy neurotróf faktor szekvenciákat és további peptid szekvenciákat tartalmazó kiméra molekulák megtarthatják a neurotróf aktivitásukat, és néhány esetben a kiindulási faktorénál jobb aktivitással rendelkeznek.
A jelen találmány tárgyát kiméra neurotróf faktorokat kódoló nukleinsavak, eljárások ezeknek a kiméra faktoroknak, kiméra neurotróf faktor fehérje és peptidfragmenseknek és származékaiknak expresszálására, a determinánsok specifitásának meghatározására alkalmas, a kiméra neurotróf faktorok ellen készített antitestek képezik, valamint eljárások neurológiai rendellenességek vizsgálatára, amely eljárások a találmány szerinti kiméra neurotróf faktorokat alkalmazzák. A jelen találmány tárgyát képezi még számos, biológiailag aktív neutrofineket kódoló rekombináns plazmid.
A találmány szerinti kiméra neurotróf faktorok számos előnnyel rendelkeznek a természetben előforduló neurotróf faktorokkal szemben. A kiméra neurotróf faktorok kínálhatják például két neurotróf faktor aktivitását egyetlen molekulában, vagy egy endogén neurotróf faktor szuperagonistájaként működhetnek, ezzel lehetővé téve megnövekedett biológiai választ alacsony dózisban. Emellett a találmány szerinti kiméra neurotróf faktorok hasznosak lehetnek egy aktív vegyületnek neurotróf faktorokra reagáló sejtekhez irányításában. Emellett, olyan kiméra neurotróf faktorok tervezése, amelyek megtartják a specifikus biológiai aktivitásukat, de amelyek egy faktorra reagáló sejt alcsoport ellen vannak irányítva, lehetővé teszik a neurológiai rendellenesség kezelését, de elkerülik a kiindulási molekula(k) sokkal szélesebb körű aktivitása által okozott komplikációkat,.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat. Az
1. ábra a BDNF-NGF kimérák készítésében használt stratégia sematikus diagramja, három oligonukleotid indító molekula felhasználásával egylépéses polimeráz láncreakcióban. Az indító molekulákat úgy terveztük, hogy a reakciótermék tartalmazzon Narl és Notl restrikciós enzim hasítási helyeket, amelyek megkönnyítik a terméknek a BDNF prepro-régiója szekvenciája után való illesztését a pC8hB (Pl) expressziós plazmidban. A vonalkázott területek NGF szekvenciát jelentenek, az üres területek BDNF szekvenciákat jelentenek. A
2. ábra a BDNF-NGF kimérák készítésében használt stratégia sematikus diagramja, négy oligonukleotid indító molekula felhasználásával egy háromlépéses polimeráz láncreakcióban. A vonalkázott területek NGF szekvenciát jelölnek, a kitöltött területek a vektor szekvenciákat mutatják, és az üres területek a BDNF szekvenciákat mutatják. A
3. ábrán a myc-hez kötött neurotróf faktor kimérák készítésének stratégiája látható.
A. Myc-hez kötött NGF készítése; a myc szekvenciák be vannak vonalkázva, az üres területek az NGF szekvenciákat jelölik.
B. Myc-hez kötött BDNF készítése; a myc szekvenciák be vannak vonalkázva, az üres részek BDNF szekvenciákat mutatnak.
4. ábra 50 μΐ 35S-sel jelzett COS-sejt felülúszót választunk el 15%-os SDS PAGE-val és a jelzett fehérjéket elektroforetikusan nylon -membránra visszük át. A membránt egy filmre exponáljuk éjszakán át, majd a kapott autoradiogramot lefényképezzük. 1-es sáv: COS MOCK; 2-es sáv: humán BDNF; 3-as sáv: hBDNF/3'myc (BM1); 4-es sáv: mNGF; 5-ös sáv; mNGF/3' myc (NM1 ). A molekulatömeg standardokat jelezzük.
5. A, B, C, D ábra Az R1-R10, BM1 és NM1 kiméra neurotróf faktorok levezetett aminosav-szekvenciája.
6. A, B, C ábra Az MTT kolorimetriás eredmények, amelyek a dorzális gyökér ganglionokból (DRG) vagy szimpatikus ganglionokból (SG) származnak, a kezelés az alábbi: (A) BDNF; (B) NGF vagy (C) BMZ, myc-hez kötött
HU 211 318 A9
BDNF. Az 570-650 nm-en mért abszorbanciát a neurotróf aktivitást tartalmazó COS-sejt felülúszó növekvő hígításának függvényében ábrázoljuk.
7. ábra Az NGF-BDNF kimérák készítésében használt stratégia leírása négy oligonukleotid indító molekula alkalmazásával egy háromlépéses polimeráz láncreakcióban. Az A indító molekula a T7 indító molekula, a B és C indító molekulák különböznek egymástól a tizenkét előállított kimérában, és a lO.táblázatban mutatjuk be őket, a D indító molekula pedig a T3 indító molekula. A vonalkázott területek vektor-szekvenciákat mutatnak, az üres területek prepro-szekvenciákat mutatnak, a pontozott területek érett NGF szekvenciákat, a kitöltött területek BDNF szekvenciákat jelentenek. A
8. A, B, C ábraA. Az NGF-BDNF kiméra neurotróf faktorok expresszálására használt módosított PBJ-5 vektor. A vektor tartalmaz egy ampicillin-rezisztencia gént (sötét nyíl), egy pBR322 replikációs origót (üres nyíl), egy SR promotert [pontozott nyíl, Takebe et al.. Mól. Cell. Bioi., 8, 446-472 (1988)], és egy klónozó helyet (vonalkázott nyíl), amelyben van egy illesztési pont, poli-A hely és Noti, SacII valamint EcoRl; restrikciós endonukleáz hasítási helyek.
B. A vad típusú NGF-fel. a vektorral (kontroll) és az SÍ-SÍ 2 NGF-BDNF kimérákkal transzfektált COS-sejtek metabolikus jelzésének eredményei. 40 μΐ COS-sejt felülúszót viszünk közvetlenül a gélre és elektroforetizáljuk 12,5%-os SDS-poliakrilamid gélen.
C. Vad típusú NGF-fel, a vektorral (kontroll) és az SÍ-SÍ 2 kimérákkal fertőzött COS-sejt felülúszókból izolált és anti-NGF antitesttel immunprecipitált. metabolikusan jelzett fehérjék SDS-poliakrilamid gélelektroforézise. Az immunprecipitációt 400 μΐ felülúszóval hajtjuk végre. Az elektroforézist 12,5%-os SDS-poliakrilamid gélen végeztük.
9. ábra Az S1-S12 kimérák diagramja, amelyben az üres régiók NGF szekvenciát, a kitöltött régiók BDNF szekvenciát jelentenek:
A) Felső panel: Aminosav-szekvencia összehasonlítás a különböző fajokból izolált NGF molekulák között
B) Alsó panel: Aminosav-szekvencia összehasonlítás az NGF- és BDNF-szekvenciák között. Felső vonalak: Nagymértékben változó aminosavak lehetnek ebben a pozícióban.
Alsó csíkok: Csak konzervatív aminosav-változások lehetségesek ebben a pozícióban. Nincs csík: Az ebben a pozícióban levő aminosavak minden ismert NGF-ben és BDNFben azonosak.
10. A, B. C. D, E, F ábra Az S1-S12 kiméra neurotróf faktorok levezetett aminosav-szekvenciája.
11. ábra Az NGF, BDNF és az NT-3 aminosav szekvenciája. A nyilak a cisztein-csoportokat jelölik. A VI-V4 változékony régiókat felső vonalak jelzik.
5. A TALÁLMÁNY RÉSZLETES LEÍRÁSA
A leírás érthetősége érdekében, semmiesetre sem korlátozási célzattal, a találmány részletes leírása során az alábbi alszekciókat tartjuk be:
(i) a találmány szerinti kiméra neurotróf faktorok;
(ii) a kiméra neurotróf faktorok készítése (iii) a kiméra neurotróf faktorok expressziója;
(iv) a neurotróf faktorok vizsgálata a kiméra neurotróf faktorok aktivitásának és neuronális specifitásának meghatározásához;
(v) a kiméra neurotróf faktorok ellen készített antitestek; és (vi) a találmány alkalmazása.
5.7. A találmány szerinti kiméra neurotróf faktorok A jelen találmány tárgyát kiméra neurotróf faktorok képezik, amelyek (i) egy sejtes faktornak legalább egy részét valamint legalább egy másik fehérjének egy részét tartalmazzák, és (ii) neurotróf aktivitással rendelkeznek. A találmány szerinti kiméra neurotróf faktorok tartalmazhatnak sejtes faktorokat, illetve azoknak egy részét, amelyek önmagukban vagy tartalmaznak neurotróf aktivitást vagy nem, beleértve - anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat - az idegnövekedési faktort, az agyi eredetű növekedési faktort, a neurotrofin-3-mat, a ciliáris neurotróf faktort, a fibroblaszt növekedési faktort (savas vagy bázikus és rokon családtagok), az epidermális növekedési faktort, a bétatumor-növekedési faktort, az alfa-tumornövekedési faktort, az interleukin-l-et, az interleukin-2-1, az alfa-interferont, a béta -interferont, a gamma-interferont, a növekedési hormont, a vazoaktív intesztinális pepiidet, a vazopresszint és az inzulint, csak hogy néhányat megnevezzünk
A találmány szerinti kiméra molekulák egy sejtes faktornak legalább egy részét tartalmazzák, valamint egy másik fehérjének vagy pepiidnek legalább egy részét, amely peptid vagy fehérje vagy egy neurotróf aktivitással rendelkező vegyületből származik, vagy nem. Ez a peptid vagy fehérje tartalmazhat például egy neurotróf faktort, sejtes faktort, toxint, enzimet, immunglobulint vagy bármely más peptid-szekvenciát illetve annak egy részét, amely vagy kapcsolódik a funkcionális aktivitással, illetve vagy antigén-hatású, vagy nem.
Például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a jelen találmány az alábbi kiméra molekulákat szolgáltatja, amelyek neurotróf aktivitással rendelkeznek, a későbbiekben ismertetett módon:
(i) egy kiméra molekula, amely két komplett, egymáshoz kapcsolt neurotróf faktort tartalmaz;
(ii) egy kiméra molekula, amely egy komplett neurotróf faktort és egy komplett nem-neurotróf sejtes faktort tartalmaz;
(iii) egy kiméra molekula, amely két neurotróf sejtes faktor részeit tartalmazza;
(iv) egy kiméra molekula, amely egy neurotróf faktor
HU 211 318 A9 egy részét tartalmazza, valamint egy nem-neurotróf sejtes faktor egy részét;
(v) egy kiméra molekula, amely egy neurotróf molekulának legalább egy részét tartalmazza, valamint egy olyan peptid szekvenciát, amely vagy antigén hatású, vagy nem; és (vi) egy kiméra molekula, amely két neurotróf faktornak legalább egy részét tartalmazza, valamint egy peptid-szekvenciát, amely vagy antigén tulajdonságú, vagy nem.
A találmány szerinti kiméra neurotróf faktorok egy nem peptid vegyülethez is kapcsolódhatnak. Például, előnyös lehet, ha egy szénhidráthoz, lipidhez, vagy más szerves vegyülethez kapcsoljuk a kiméra neurotróf faktort. Ilyen anyag lehet toxikus ágens, szaporodást gátló ágens, nagyon immunogén ágens, angiogén ágens, antiangiogén ágens, koaguláns, antikoaguláns, fluoreszcens vegyület, radioaktív vegyület, és hasonlók.
Ha egy neurotróf faktor vagy más sejtes faktor és egy másik neurotróf faktor vagy más sejtes faktor részeit kombináljuk, akkor kívánatos lehet úgy megtervezni a kiméra molekulát, hogy az egyik faktornak az egyik részét kivágjuk, és a másik faktor egy részével helyettesítjük, ezzel megtartva a kiindulási faktorok hozzávetőleges méretét, bár a találmány nem korlátozott ezen a területen. Továbbá, ha a két faktor homológ régiókat tartalmaz, akkor előnyös, ha a homológ régiókat cseréljük ki, egyiket a másikra, ezzel olyan kiméra molekulát hozva létre, amely homológ a kiindulási faktorokkal, azoktól mégis távoli. Egy másik megvalósítási mód szerint egy faktornak azt a részét, amely a feltételezések szerint minimális funkciókkal rendelkezik, helyettesíthetjük egy másik faktornak vagy másik pepiidnek egy olyan régiójával, amelyről feltételezhető, hogy biológiai aktivitással rendelkezik; egy ilyen kiméra megnövekedett biológiai aktivitással rendelkezhet a kiindulási faktorokhoz viszonyítva. Egy másik módszer szerint, egy faktornak azt a régióját, amely feltételezhetően egy nem-kívánatos biológiai aktivitást hordoz, helyettesíthetjük egy másik faktornak vagy egy másik peptidnek egy részével, így a nem-kívánatos aktivitás eliminálható vagy csökkenthető; az ilyen megvalósítási mód hasznos lehet minimális nem-kívánatos hatással vagy toxicitással rendelkező kiméra neurotróf faktorok kifejlesztésében.
Egy másik módszer szerint a találmány szerinti kiméra molekulákat nukleinsav szekvenciák kódolhatják, amelyekben egy sejtes faktort kódoló szekvenciát egy másik fehérjét vagy pepiidet kódoló szekvencia szakít meg, oly módon, hogy az ilyen molekula által kódolt kiméra molekulát a faktorfehéijében levő inszerció jellemez. Emellett, a találmány amino-terminális és C-terminális fúziókat is kínál, egy faktornak legalább egy része és egy másik peptid között.
Néhány esetben, ahol két faktor homológ részeinek kicserélése történik meg, a kiméra molekula hatékonyan különbözhet az egyik kiindulási vegyülettől, egyetlen aminosavban; az ilyen kiméra neurotróf faktorok is a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak, és példaként megemlíthetjük az S-6 illetve S—11 kimérákat, amelyeket a későbbiekben tárgyalunk.
A találmány néhány előnyös megvalósítási módja szerint kiméra neurotróf faktorokat hozunk létre, oly módon, hogy a rokon neurotróf faktorok megfelelő részeit kicseréljük. A találmány specifikus előnyös megvalósítási módjai szerint a kiméra neurotróf faktor molekulák a nemrég felfedezett neurotrofin család tagjai közül kettőt vagy többet tartalmaznak, beleértve az NGF-et, a BDNF-et és az ΝΤ-3-mat, és bármely más tag is azonosítható még. Ezek szerint a specifikus megvalósítási módok szerint a neurotrofin család tagjainak részeit át lehet rendezni, hogymegőrizzük a molekula szekunder és/vagy tercier szerkezetét. A találmány egyéb megvalósítási módjai szerint egy nem-neurotrofin családba tartozó peptid-szekvencia beépítése, vagy egy neurotrofin családba tartozó kódoló szekvencia egy részének helyettesítése egy nem-neurotrofin családba tartozó peptid szekvenciát kódoló szekvenciával, végrehajtható úgy, hogy a neurotrofin családhoz tartozó szekunder és/vagytercier struktúrát és konformációt megőrizzük. A továbbiakban a szekunder és/vagy tercier struktúra és konformáció szakkifejezés a neurotrofin családba tartozó tagokra jellemző szekvenciákra, szerkezeti és kémiai tulajdonságokra alkalmazható, nevezetesen, legalább 120 aminosav hosszúság, a pl érték 9 és 10 között van, 6 cisztein -csoport hozzávetőlegesen (körülbelül öt aminosav eltéréssel) a 14-es, 57-es, 67es, 79-es, 108-as és 110-es pozíciókban, vagy hasonló pozíciókban található, a neurotrofin család tagjaira jellemző homológ szekvenciákbanelőforduló inszercióknak vagy delécióknak megfelelően; például, a kifejlett hal NGF szekvencia egy 22 bp hosszúságú inszertet tartalmaz a 65-ös aminosavnál, amely feltételezhetően kihurkolódik, és ezzel lehetővé teszi, hogy a molekula megmaradó része az emlős GF-hez hasonlító konformációt vegyen fel. A találmány előnyös specifikus megvalósítási módjai szerint azok a kiméra neurotróf faktorok, amelyek a neutrofincsalád legalább egyik tagjának egy részét tartalmazzák, legalább négy cisztein-csoportot tartalmaznak az előzőkben említett pozíciókban. Egy még előnyösebb megvalósítási mód szerint a találmány szerinti kiméra neurotróf faktorok legalább öt cisztein-csoportot tartalmaznak az előzőkben említett pozíciókban. A találmány legelőnyösebb megvalósítási módjai szerint a kiméra molekulák hat ciszteincsoportot tartalmaznak az előzőkben említett pozíciókban. A találmány további előnyös megvalósítási módjai szerint a kiméra neurotróf faktorok legalább négy cisztein-csoportot tartalmaznak körülbelül az előzőkben említett pozíciókban és pl-értékük 9 és 10 között van. A találmánynak még előnyösebb megvalósítási módja szerint a kiméra neurotróf faktorok legalább öt cisztein-csoportot tartalmaznak és pl értékük 9 és 10 között van. A találmány legelőnyösebb specifikus megvalósítási módja szerint a kiméra molekulák hat cisztein-csoportot tartalmaznak körülbelül az előzőkben említett pozíciókban és pl értékük 9 és 10 között van.
A jelen találmány tárgyait képezik a kiméra neurotróf faktorokat kódoló nukleinsavak, valamint a kiméra neurotróf faktor fehérjék és peptid ffagmensek, valamint ezek származékai. A találmány előnyös megvalósítási
HU 211 318 A9 módjai szerint egy kiméra neurotróf faktor legalább egy neutrofin családba tartozó faktornak egy részét tartalmazza (lásd az előzőkben), beleértve, de nem korlátozva sr az NGF-et, BDNF-et és az ΝΤ-3-mat, amelyeknek a szekvenciája all. ábrán látható. A találmány előnyös specifikus megvalósítási módjai szerint a kiméra neurotróf faktorok aminosav szekvenciája megegyezik azzal, ami az 5. és 10. ábrán látható az R1-R10, BM1, NMI és SÍ-512 kiméra molekulákra vonatkoztatva. A találmány szerinti kiméra neurotróf faktor molekulák közé tartoznak - anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat azok, amelyek primer aminosav szekvenciaként az 5. és
10. ábrán leírt aminosav szekvenciákat tartalmazzák, illetve azok egy részét, beleértve a megváltoztatott aminosav szekvenciákat is, amelyekben a funkcionálisan ekvivalens aminosav-csoportokkal helyettesítik az aminosavakat, és így csöndes mutációkat hoznak létre. Például, a szekvencián belül egy vagy több aminosav szekvencia helyettesíthető egy másik aminosavval, amelynek hasonló a polaritása, amely funkcionális ekvivalensként működik, azaz csendes változtatást eredményez. A szekvenciánbelüli aminosavakat helyettesítő aminosavak abból az osztályból választhatók, amelybe az aminosav tartozik. Például, az apoláris (hidrofób) aminosavak közé tartozik az alanin. leucin. izoleucin, valin, prolin, fenilalanin triptofán és a metionin. A poláros semleges aminosavak közé tartozik például a glicin, szerin, treonin, cisztein, tirozin, aszparagin, és a glutamin. A pozitív töltésű (bázikus) aminosavak közé tartozik például az arginin, lizin és a hisztidin. A negatívan töltött (savas) aminosavak közé tartozik például az aszparaginsav és a glutaminsav. A találmány oltalmi körébe tartoznak még a neurotróf faktor fehérjék vagy azok fragmentjei illetve származékai, amelyek differenciáltan módosulnak a transzláció alatt vagy után, például glikozileződnek, proteolitikusan hasadnak, kötődnek egy antitest molekulához vagy más celluláris ligandumhoz stb. A jelen találmány tárgyát képezik olyan nukleinsav molekulák, amelyek az 5. és 10 ábrán közölt aminosav szekvenciákat kódolják, illetve azok részeit vagy funkcionális ekvivalenseit. Emellett a jelen találmány tárgyát képezik a pBJ51tmN/hB-Sl-tőlS 12-ig terjedő sorszámúra pC8hB/hN-Rl-től 10-ig teijedő sorszámú, a pC81mN/myc-NMl és pC8hB/myc-BM 1 plazmidok, a későbbiekben ismertetjük ezeket, valamint a kiméra neurotróf faktort kódoló nukleinsav szekvenciák.
A jelen találmány tárgyát képezik azok a kiméra neurotróf faktorok, amelyek bármely élő szervezetből származó sejtes faktorok, beleértve, de nem korlátozva magunkat ezekre, a humán, majom, sertés, szarvasmarha, ló, kutya, macska, rágcsáló vagy szárnyas celluláris faktorokat.
5.2. A kiméra neurotróf faktorok megszerkesztése
A kiméra neurotróf faktorokat kódoló nukleinsavak standard rekombináns DNS technológiával állíthatók elő, például a sejtes faktorokat és/vagy egyéb peptideket kódoló nukleinsavak hasításával és illesztésével, restrikciós enzimek és DNS ligáz felhasználásával. Egy másik módszer szerint a nukleinsav szekvenciák előállíthatok kémiai szintézissel, például a szilárd fázisú foszforamidit-technológiával. A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a polimeráz láncreakció (PCR; Saiki et al., Science, 230, 1350-1354 (1985)] használható a nukleinsav szekvenciák egymáshoz illesztésére az átfedő kiterjesztést alkalmazva [Honon et al., Gene, 77, 61-68 (1989)], és így állítva elő a találmány szerinti kiméra neurotróf faktorokat. Amint azt a későbbiekben részletesen tárgyaljuk, a kiméra neurotróf faktorok előállíthatok egy egylépéses PCR-rel, három indító oligonukleotid alkalmazásával, illetve egy háromlépéses PCR eljárással, négy oligonukleotid indító molekulát alkalmazva. Az 1. és 2. ábra ezeknek a technikáknak a részletes leírása. Például, egy nukleinsavat, amely egy celluláris faktornak (X) legalább egy részét kódolja, egy olyan nukleinsav molekula szekvenciához illeszthetjük, amely egy eukarióta peptidet (Y) kódol, oly módon, hogy három oligonukleotid indító molekulát hozunk létre, amelyek közül az egyik megfelel az X szekvencia egy részének (az ,X indító molekula”), a másik az Y szekvencia egy részének (az „Y indító molekula), és a harmadik tartalmazza mind az X mind az Y szekvenciák egy részét (az ,XY indító molekula). Az is kívánatos, hogy hasznos restrikciós hasítási szekvenciákat építsünk be az indító molekulákba. A 3. táblázatban példákat mutatunk be arra, hogy milyen indító molekulák használhatók a BDNF-NGF kimérák előállítására. Ez a három oligonukleotid (az 1. ábrán a jelölésük A, C és B) kombinálható egy egylépéses PCR-ben, amihez arra lehet szükség, hogy az X és az Y indító molekulák nagyobb mennyiségben legyenek jelen, mint az XY indító, molekula, így például az X.XY.Y aránya körülbelül 100:1:100. A PCR-ben használt PCR lehet olyan nukleinsavak elegye, amelyek sejtes faktorokat kódolnak, és a fehérjét vagy peptidet illeszteni kell. Az illesztési hely pozícióját az áthidaló molekulák határozzák meg (például az XY indító molekula). A szakterületen rutinszerűen használt sokszorozási állapotok alkalmazhatók, például 1 perc körülbelül 94 °C-on, 2 perc körülbelül 43 “C-on és 3 perc körülbelül 72 °C-on, 35 ciklusban, standard PCR reakció-oldatokat és módszereket használva. A kapott PCR-fragmenst azután gélen tisztíthatjuk elektroforézissel, a megfelelő restrikciós endonukleázzal hasíthatjuk, majd egy megfelelő vektorba építhetjük be a klónozáshoz.
Egy másik módszer szerint, amint az a 2. ábrán látható, a kiméra neurotróf faktorok háromlépéses PCR-rel állíthatók elő, négy oligonukleotidot alkalmazva. Azokat az oligonukleotidokat, amelyek használhatók például a BDNF-NGF vagy NGF-BDNF kimérák előállítására, a 4. illetve a 10. táblázatban mutatjuk be. Hogy végrehajtsuk az illesztést az X és az Y nukleotid szekvenciák között, az alábbi indító molekulák használhatók: (i) az X indító molekula, amely megfelel az X szekvenciának (az A indító molekula a 2. ábrán); az Y indító molekula, amely megfelel az Y szekvenciának (a D indító molekula a 2. ábrán); az XY indító molekula, amely megfelel mind az X mind az Y alszekvenciáinak (a B indító molekula a 2. ábrán); és az XY' indító molekula, amely szintén megfelel mind
HU 211 318 A9 az X mind az Y alszekvenciáinak, de emellett homológ az XY indító molekulával (a C indító molekula a 2. ábrán). Egy PCR reakcióban az X és az XY indító molekulák az X templát szekvenciájáról sokszorozódik, és így olyan nukleinsav szekvenciák jönnek létre, amelyek mind az X mind az Y szekvencia egy részét tartalmazzák. Egy másik PCR reakcióban az Y és az XY' indító molekulák sokszorozódnak az X templátról, így olyan nukleinsav molekulák jönnek létre, amelyek az X és az Y szekvencia egy-egy részét:tartalmazzák, és átlapolnak a másik PCR reakcióban keletkezett nukleinsav molekula Y részével. Ha a két PCR termékeit kombináljuk és PCR-rel sokszorozzuk, akkor egy olyan nukleinsav molekula állítható elő, amely amely egy, az X szekvenciába inszertált Y szekvenciát tartalmaz. A találmány szerint ennek a módszernek a módosításai használhatók két különböző templát felhasználásával. A PCR, a PCR termékek tisztítása, valamint a restrikciós enzimekkel való hasítás használható a leírt módon arTa, hogy a keletkező kiméra neurotróf faktor gént klónozzuk.
A DNS reakciótermékek ezután bármely a szakterületen használt módszerrel klónozhatók. Nagyszámú gazda-vektor rendszer használható. A lehetséges vektorok közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a kozmidok, a plazmidok vagy a módosított vírusok, de a vektor-rendszernek kompatíbilisnek kell lennie a használt gazdasejttel. Az ilyen vektorok lehetnek, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a lambda származékok, vagy plazmidok, például a pBR322, a pUC vagy Bluescript (Stratagene) plazmid származékok. A rekombináns molekulákat transzformációval. transzfekcióval, infekcióval, elektroporációval stb. juttathatjuk be a gazdasejtekbe.
5.3. A kiméra neurotróf faktorok expressziója
A kiméra neurotróf faktor fehérjét kódoló nukleotid szekvencia, illetve annak egy része, beépíthető egy megfelelő expressziós vektorba, például egy vektor, amely a beépített fehérjét-kódoló szekvencia transzkripciójához és a transzlációjához szükséges elemeket tartalmazza. A szükséges transzkripciós és transzlációs szignálokat szolgáltathatja a natív kiméra neurotróf faktor gén és/vagy annak a határoló régiói. Számos különböző gazda-vektor rendszer használható a fehérjét kódoló szekvencia expresszálására. Ezek közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, egy vírussal fertőzött emlős sejtrendszer (például a vakcinia vírus, adenovírus stb.); egy vírussal fertőzött rovar sejtrendszer (például a baculovírus); a mikroorganizmusok, például az élesztő vektort tartalmazó élesztő, illetve a bakteriofág DNS-sel, plazmid DNS-sel vagy kozmid DNS-sel transzformált baktériumok. Ezeknek a vektoroknak az expressziós elemei változnak erősségük és specifitásuk szempontjából. A használt gazdavektor rendszertől függően számos megfelelő transzkripciós és transzlációs elem használható.
A DNS fragmenseknek egy vektorba való illesztésére az előzőkben leírt bármelyik módszer használható olyan expressziós vektorok készítésére, amelyek egy kiméra neurotróf faktor gént tartalmaznak, amelyben benne vannak a megfelelő transzkripciós transzlációs kontroll szignálok és a fehérjét kódoló szekvenciák. Ezek közé a módszerek közé tartoznak az in vitro rekombináns DNS és a szintetikus technikák, valamint az in vivő rekombinációk (genetikai rekombinációk). A kiméra neurotróf faktor fehérjét vagy peptid-fragmen kódoló nukleinsav szekvencia expresszióját egy második nukleinsav szekvenciával lehet szabályozni, oly módon hogy a kiméra neurotróf faktort vagy peptidet egy, a rekombináns DNS molekulával transzformált gazdasejtben expresszáljuk. Például a kiméra neurotróf faktor expresszióját bármely, a szakterületen ismert promoter/enhanszerelemmellehet szabályozni. A kiméra neurotróf faktorexpressziójának szabályozására használható promoterek közé tartoznak, anélkül hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az alábbiak: a citomegalovírus (CMV) promoter, az SV40 korai promoter régió [Bemoist and Chambon, Natúré, 290, 304-310 (1981)], a Rous-szarkóma vírus 3' hosszú terminális ismétlődő szakaszában levő promoter [Yamamoto et al., Cell, 22, 787-797 (1980)], a herpesz timidin-kináz promoter [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 144-1445 (1981)], a metallotion in gén szabályozó szekvenciái [Brinster et al., Natúré, 296, 39-42 (1982)], prokarióta expressziós vektorok, például a βlaktamáz promoter [Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 3727-3731 (1978)], vagy a tac promoter [De Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 21-25 (1983)], lásd még: „Useful proteins írom recombinant bacteria” in Scientific American, 242, 7494 (1980); a nopalin szintetáz promoter régiót tartalmazó növényi expressziós vektorok [Herrera-Estrella et al., Natúré, 303, 209-213), vagy a karfiol mozaikvírus 35S RNS promoter [Gardner et al., Nuc. Acids. Rés., 9, 2871 (1981)], és a ribulóz biszfoszfát karboxiláz fotoszintetikus enzim promotere [Herrera-Estrella et al., Natúré, 310, 115-120 (1984)], élesztőből és egyéb gombákból származó promoter elemek, például a Gal4 promoter, az ADC (alkoholdehidrogenáz) promoter, a PGK (foszfoglicerokináz) promoter, az alkálikus foszfatáz promoter és az alábbi állati eredetű transzkripciós kontroll, régiók, amelyek szövetspecifitást mutatnak, és a transzgenikus állatokban használják őket: Az elasztáz I gént szabályozó régió, amely a hasnyálmirigy acináris sejtjeiben aktív [Swift et al., Cell., 38, 639-646 (1984); Omitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bioi., 50, 399—409 (1984); Mac Donald, Hepatology, 7, 425-515 (1987)], az inzulin gént szabályozó régió, amely a hasnyálmirigy bétasejtjeiben aktív [Hanahan, Natúré, 315, 115-122 (1985)], az immunoglobulin gént szabályozó régió, amely a limfoid sejtekben aktív [Grosschedl et al., Cell, 38, 647-658 (1984); Adames et al., Natúré, 318, 533-538 (1985); Alexander et al., Mól. Cell. Bioi., 7, 14361444 (1987)], egér emlőtumor vírus szabályozó régiója, amely a tesztikuláris, emlő és limfoid sejtekben aktív [Leder et al., Cell, 45, 485-495 (1986)], az albumin gént szabályozó régió, amely a májban aktív [Pinkert et al., Genes and Devel., 1, 268-276 (1987)], az
HU 211 318 A9 alfa-fetoprotein gént szabályozó régió, amely a májban aktív [Krumlauf et al., Mól. Cell. Bioi., 5, 1639-1648 (1985); Hammer et al., Science, 235, 53-58 (1987)], az alfa-1- antitripszin gént szabályozó régió, amely a májban aktív [Kelsey et al., Genes and Devel., 7, 161-171 (1987)]. a béta-globin gént szabályozó régió, amely a mieloid sejtekben aktív [Mogram et al., Natúré, 3/5, 338-340 (1985); Kollias et al., Cell, 46, 89-94 (1986)], a mielin bázikus fehérje génjének szabályozó régiója, amely az agy oligodendrocita sejtjeiben aktív [Readhead et al., Cell, 48, 703-712 (1987)], a miozin könnyű lánc-2 gént szabályozó régió, amely a vázizmokban aktív [Sani, Natúré, 374, 283-286 (1985)], és a gonadotróp felszabadító hormon génjének szabályozó régiója, amely a hipotalamuszban aktív [Mason et al., Science, 234, 1372-1378 (1986)].
A kiméra neurotróf faktor gén inszerteket tartalmazó expressziós vektorok három általános megközelítési mód szerint azonosíthatók: (a) DNS-DNS hibridizálással, (b) úgynevezett „marker” gén funkciók megléte vagy hiánya alapján, és (c) az inszertált szekvencia expressziója alapján. Az első megközelítés szerint egy expressziós vektorba beépített idegen gén jelenlétét DNS-DNS hibridizálással lehet kimutatni, olyan próbák felhasználásával, amelyek homológok a beépített kiméra neurotróf faktor génnel. A második megközelítés szerint a rekombináns gazda/vektor rendszert bizonyos „marker” funkciók megléte vagy hiánya alapján lehet azonosítani (azaz például a timidinkináz-aktivitás, antibiotikumokra való rezisztencia, transzformációs fenotípus, zárványtest képződés baculovírusban stb.). amelyet az idegen génnek a vektorba való illesztése okoz. Például, ha a kiméra neurotróf faktor génjét a vektor marker génjének szekvenciájába illesztjük be, akkor a kiméra inszertet tartalmazó rekombinánsokat a marker gén funkciói alapján lehet azonosítani. A harmadik megközelítési mód szerint, a rekombináns expressziós vektorok úgy azonosíthatók, hogy a rekombináns által termelt idegen génterméket mérjük. Az ilyen vizsgálatok például a kiméra neurotróf faktor géntermék fizikai vagy funkcionális tulajdonságain alapulnak a biológiai vizsgáló rendszerekben, amint azt az alábbiakban, az 5.4. fejezetben ismertetjük.
Ha egyszer egy adott rekombináns DNS molekulát azonosítottunk és izoláltunk, akkor a szakterületen számos módszer ismert a sokszorozására. Ha egyszer megállapítottunk egy alkalmas gazda rendszert és növesztést körülményeket, akkor a rekombináns expressziós vektorok nagy mennyiségben szaporíthatok és előállíthatók. Amint azt már elmagyaráztuk, a használható expressziós vektorok közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat az alábbi vírusok vagy származékaik: humán vagy állati vírusok, úgymint a vakcinia vagy adenovírus; a rovarvírusok, úgymint a baculovírus; az élesztő vektorok; a bakteriofág vektorok (például a lambda) és a plazmid valamint kozmid DNS vektorok, csak hogy néhányat említsünk.
Emellett egy olyan gazdasejt törzs választható, amely modulálja az inszertált szekvenciák expresszióját, vagy módosítja illetve processzálja a génlerméket, a kívánt specifikus módon. A bizonyos promoterekről való expressziót bizonyos indukálószerek jelenlétével lehet megnövelni; így, a génsebészeti úton előállított kiméra neurotróf faktor expressziója szabályozható. Továbbá, a különböző gazdasejtekben jellemző és specifikus mechanizmusok működnek a transzlációs és poszt-transzlációs processzálásra és módosításra (például a fehérjék glikozilezésére és hasítására). A megfelelő sejtvonalak vagy gazdarendszerek választható azzal a céllal, hogy biztosítsuk az expresszált idegen fehérje kívánt módosítását és processzálását. Például, egy baktérium-rendszerben végzett expresszióval glikozilezetlen fehérje-terméket állíthatunk elő. Az élesztőben való expresszióval glikozilezett terméket kapunk. Az emlős sejtekben való expresszióval a heterológ kiméra neurotróf faktor fehéije „natív” glikozilezését biztosíthatjuk. Továbbá, a különböző vaktor/gazda expressziós rendszerek különböző mértékben befolyásolhatják a processzálási reakciókat, például a proteolitikus hasítást.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a kiméra neurotróf faktorokat kódoló DNS egy COS sejtrendszerben expresszálható, a későbbiekben ismertetett módszerek alkalmazásával. HA egyszer azonosítottuk azt a rekombinánst, amely a kiméra neurotróf gént expresszálja, akkor a géntermék azonosítható. Ezt a termék fizikai és funkcionális tulajdonságai alapján végezhetjük el, lásd az alábbiakban.
Ha egyszer a kiméra neurotróf faktor fehérjét azonosítottuk, akkor az standard módszerekkel izolálható és tisztítható, beleértve a kromatográfiát (például az ioncserélő, affinitás, molekulaszűrő kromatográfia), a centrifugál ást, differenciális oldhatóságot, vagy bármely más standard technikát, amelyet a fehérjék tisztítására használunk.
Emellett a találmány szerinti kiméra neurotróffaktor fehérjéket és peptideket a szakterületen jól ismert standard szintetikus peptidkémiai módszerekkel is előállíthatjuk.
5.4. Neurotróf faktor vizsgálatok kiméra neurotróf faktorokhoz
A találmány szerint kiméra neurotróf faktorok neurotróf aktivitással rendelkeznek. A „neurotróf aktivitás” szakkifejezés alatt azt értjük, hogy az idegrendszer sejtjeire gyakorol hatást, beleértve, de nem korlátozva magunkat csak ezekre, a neuronokat, asztrocitákat, gliasejteket, oligodenárocitákat, mikrogliákat és a Schwann-sejteket. A biológiai hatás abban áll, hogy az idegrendszer sejtjeinek szerkezete és/vagy fiziológiája megváltozik, ami nem fordul elő, ha a sejteket nem tesszük ki a kiméra neurotróf faktorok hatásának. A biológiai hatás lehet például a túlélés meghosszabbodása, a neurit bimbózása, a differenciálódott funkciók (például egy enzim expressziója, úgymint a kolin-acetiltranszferázé vagy a tirozin-hidroxilázé), fenntartása vagy fejlődése, vagy ezzel szemben, a sejtek pusztulása vagy elsorvadása illetve dedifferenciálódása.
A neurotróf aktivitás jelenlétét az ilyen aktivitások mérésére használt ismert módszerekkel vagy a jövőben
HU 211 318 A9 kifejlesztendő rendszerekkel lehet meghatározni. A vizsgáló rendszerek lehet in vitro vizsgáló rendszerek, például a szövettenyészet bioesszé rendszerek, kiültetett szövetek felhasználásával, szövetből izolált sejtek, vagy halhatatlanná tett sejtvonalak, amelyek például az agyból, a gerincvelőből vagy a perifériális idegrendszerből származnak, valamint az in vivő vizsgálati módszerek, amelyekben a kiméra neurotróf faktorokat állatoknak lehet beadni; a neurotróf hatásokat egy ilyen állatban kémiai, hisztológiai vagy viselkedési vizsgálatok végzésével lehet kimutatni. Emellett, egy kiméra neurotróf faktort transzgén formájában bejuttathatunk egy transzgenikus állatba, és a biológiai hatásai az említett állatban mérhetők.
Például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a neurotróf aktivitást bármely alábbi, jól ismert módszerrel mérhetjük.
(i) dorzális gyökér-ganglionok vizsgáló rendszere [Barde et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 1199—
1203 (1980)], amelynek teljes szövegét referenciának tekintjük a továbbiakban;
(ii) csomós ganglionok vizsgáló rendszere [Lindsay et al., Dev. Bioi., 7/2, 319-328 (1985)], amelynek teljes szövegét referenciának tekintjük a továbbiakban;
(iii) szimpatikus ganglionok vizsgáló rendszere [Barde et ai., EMBO J„ /, 549-553 (1982)], amelynek teljes szövegét referenciának tekintjük a továbbiakban;
(iv) ciliáris ganglionok vizsgáló rendszere [Adler et al., Science, 204, 1434-1436 (1979)], amelynek teljes szövegét referenciának tekintjük a továbbiakban;
(v) gerincvelő neuronok. Röviden, a gerincvelő neuronok aszeptikusán eltávolíthatók a vizsgált állatból, a nyúltagyhoz viszonyítva kaudálisan rögzíthetők, majd eltávolíthatók az érzékelő ganglionok és az agyhártya. A gerincvelőt azután ventrális és mediodorzális szegmentekre lehet osztani a különböző tenyészetekhez, majd a szövetet apró darabokra szabdaljuk és Pasteur-pipettán keresztül történő triturálással szétfoszlatjuk egy olyan oldatban, amelynek az összetétele az alábbi: 50 százalék DMEM (Gibco) és 50 százalék Ham féle FI2 tápkeverék (Gibco),amit 33 mmol/1 glükózzal,2 mmol/1 glutaminnal, 15 mmol/1 NaHCO3-mal, 10 mmol/1 HEPES-sel, 2,5 pg/ml inzulinnal, 100 pg/ml transzferrinnel, 60 pmol/1 putreszcinnel, 20 nmol/1 progeszteronnal, 30 nmol/1 Na-szelenittel és 2,5 pg/ml szarvasmarha szérum-albuminnal egészítünk ki. A triturálást kétszer megismételhetjük, majd a felülúszókat egyesíthetjük és egy 40 pm-es Tetko szűrőlapon szűrhetjük át. A disszociált ventrális sejteket ezután poli-D-lizinnel borított (10 pg/ml) tenyésztő edénybe tesszük, 0,5 millió sejt per egy 35 mm-es edény koncentrációban. A disszciált mediodorzális sejteket 1,5 millió sejt per egy 35 mm-es edény koncentrációban széleszthetjük egy poli-D-lizinnel (10 pg/ml), poli-L-ornitinnel (10 pg/ml) vagy poliL-omitin plusz lamininnel (5 pg/ml) borított edényben.
(vi) bazális előagy kolinerg neuronok [07/400 591 számú US szabadalmi bejelentés];
(vii) ventrális középagyi dopaminerg neuronok [07/400 591 számú US szabadalmi bejelentés és (viii) PC 12 sejtek.
5.5. Kiméra neurotróf faktorok elleni antitestek
A találmány szerint kiméra neurotróf faktor fehérje, illetve annak fragmensei vagy származékai használhatók immunogénként anti-kiméra neurotróf antitestek előállítására. Hogy növeljük annak valószínűségét, hogy antikiméra neurotróf faktor immunválaszt kapunk, a kiméra neurotróf faktor aminosav szekvenciáját elemezhetjük, hogy meghatározzuk a molekulának azokat a részeit, amelyek nagyobb immunogenitással rendelkeznek. Például, az aminosav szekvenciát számítógéppel elemezve meghatározhatjuk a felszíni epitópokat, Hopp és Woods módszerével [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 3824-3828 (1981)], amely módszert sikeresen használtak a Hepatitisz B felszíni antigénjeinek meghatározására. Egy másik módszer szerint a különböző fajokból származó kiméra neurotróf faktorok levezetett aminosav szekvenciái öszszehasonlíthatók, és a viszonylag kevés homológiát mutató régiók azonosíthatók; ezek a nem-homológ régiók valószínűleg a leginkább immunogén tulajdonságúak a különböző fajok között.
A kiméra neurotróf faktorok elleni monoklonális antitestek előállítására bármely olyan technika alkalmazható, amellyel folyamatos sejtvonallal termelhetők az antitest molekulák. Például, az eredetileg Kohler és Milstein által kifejlesztett hibridóma technika [Natúré, 256, 495-497 (1975)], valamint a trióma technika, a humán B-sejt hibridóma technika [Kozbor et al., Immunology Today, 4, 72 (1983)], és az EBV-hibridóma technika humán monoklonális antitestek előállítására [Colé et al., in „Monoclpnal Antibodies and Cancer Therapy”, Alán R. Liss, Inc., 77-96 (1985)] és a hasonlók a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.
A terápiás célokra használt monoklonális antitestek lehetnek humán monoklonális antitestek vagy kiméra ember-egér (vagy más faj) monoklonális antitestek. A humán monoklonális antitesteket a számos ismert technika bármelyikével elő lehet állítani [például Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today, 4, 72-79 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 92, 3-16 (1982)]. Olyan kiméra antitest molekulák állíthatók elő, amelyekben egy egér antigén-kötő dómén és humán konstans régiók találhatók [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851 (1984); Takeda et al., Natúré, 314, 452 (1985)].
A szakterületen ismert számos eljárás használható a kiméra neurotróf faktor epitópjai elleni poliklonális antitestek előállítására. Az antitest előállításához különböző gazda-állatok immunizálhatók a kiméra neurotróf faktor fehérje, vagy annak fragmense illetve származéka injekciózásával, beleértve, anélkül, hogy erre korlátoznánk magunkat, a nyulakat, egereket, patkányokat stb. Különböző adjuvánsok használhatók az immunológiai válasz erősségének fokozására, a gazda13
HU 211 318 A9 szervezettől függően, beleértve, de anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a Freund-féle (komplett és inkomplett) adjuváns, az ásványi géleket, úgymint az alumínium-hidroxidot, a felületaktív anyagokat, például a lizolecitint, poliolokat, polianionokat, peptideket, olaj-emulziókat, fúrócsiga hemocianint, dinitrofenolt és a potenciálisan hasznos humán adjuvánsokat, például a BCG-t (Bacille Calmette-Guerin) és a Corynebacterium parvum-ot
Egy kiméra faktor epitóp elleni antitest molekuláris kiónja ismert módszerekkel előállítható. Rekombináns DNS módszer [Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)] használható a monoklonális antitest molekulát kódoló nukleinsav szekvencia, illetve annak antigén-kötő régiója előállítására.
Az antitest molekulákat ismert módszerekkel tisztíthatjuk, például immunabszorpcióval vagy immunaffinitás-kromatográfiával, kromatográfiás módszerekkel, például HPLC-vel (nagynyomású folyadék-kromatográfia). illetve ezek kombinációjával stb.
A molekula idiotípusát tartalmazó antitest-fragmentek ismert módszerekkel állíthatók elő. Például, az ilyen fragmensek közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat: az F(ab')2 fragmens, ami az antitest molekula pepszines emésztésével állítható elő; a Fab' fragmensek, amelyek a F(ab')2 diszulfid hídjainak redukálásával állíthatók elő, és a 2 Fab vagy Fab fragmensek-, amelyek az antitest molekula papainnal és redukálószerrel való kezelésével állíthatók elő.
5.6. A találmány hasznossága
A jelen találmány tárgyát képezik kiméra neurotróf gének és fehérjék, amelyek különböző diagnosztikai és terápiás alkalmazásokban használhatók. A találmány szerinti kiméra faktorok közé tartoznak azok a molekulák. amelyek (i) két neurotróf faktor aktivitását kombinálják egyetlen molekulában; (ii) a természetben előforduló faktorokhoz viszonyítva egyedi aktivitásspektrummal rendelkeznek; (iii) a természetben előforduló faktor szuperagonistájaként működnek; vagy (iv) a természetes faktor an tagon istájaként vagy inhibitoraként működnek.
A találmány szerinti kiméra neurotróf faktorok diagnosztikai alkalmazásokban használhatók. Például, a találmány szerinti kiméra neurotróf faktorok tartalmazhatnak egy antigén peptid jelölést, például egy myc jelölést (lásd az alábbiakban), amely a jelzett antitesthez kötődik. Egy ilyen kiméra neurotróf faktor kötődhet olyan sejtekhez, amelyek reagálnak a neurotróf faktorokra, és az indirekt módon kötődő jelzés révén a neurotróf faktorokra reagáló sejtek indikátoraként szolgálhatnak, ez egy olyan technika, amely hasznos lehet az idegrendszeri rendellenességek diagnosztizálásában vagy tanulmányozásában. Kívánatos lehet olyan kiméra neurotróf faktor tervezése diagnosztikai célokra, amelynek minimális neurotróf aktivitása van.
A jelen találmány tárgyát képezi továbbá a kiméra neurotróf faktorok felhasználása különböző terápiás alkalmazásokban. A kiméra neurotróf faktorok bizonyos esetekben olyan előnyökkel rendelkeznek, hogy tipikusan különböző neurotróf molekulákban található aktivitások egyetlen molekulában jelennek meg és/vagy az aktivitásuk a kiindulási molekulák aktivitásán túl is kiterjed. Például a kiméra NM1, amely egy myc antigén pepiidhez kötődő NGF-et tartalmaz, dorzális gyökér ganglionokban, csomós ganglionokban és szimpatikus ganglionokban végzett biológiai vizsgálatok során mutat aktivitást, ezzel szemben, a természetes NGF egyáltalán nem mutat aktivitást, vagy csak nagyon kis aktivitást mutat a csomós ganglion vizsgálatokban. Tehát az NM1 egy szélesebb aktivitáskört mutat, mivel a hatásait olyan sejttípusokra fejti ki, amelyek általában nem reagálnak a kiindulási molekulára az NGF-re. Ez különösen olyan szituációkban lehet érdekes, ahol kívánatos lenne választ indukálni szimpatikus, paraszimpatikus és érzékelő neuronokbán, például az amiloidpolineuropátia, a diabéteszes neuropátia és a diszautonómiás polineuropátia esetében. Jóllehet a dorzális gyökér ganglionok és a csomós ganglionok szintén reagálhatnak a neurotrofinek kombinációjára, például a BDNF és az NGF kombinációjára, vagy csak az NT-3 faktorra, egy kiméra molekula, amely mindhárom sejttípust érinti, viszonylag mentes lehet azoktól a mellékhatásoktól. amelyeket a BDF plusz NGF, illetve csak az NT-3 adagolása okoz. Továbbá, a kiméra neurotróf faktoroknak sokkal nagyobb lehet az aktivitásuk mint a természetes megfelelőiknek; például, amint az a 6. ábrán látható, a BM1. amely a BDNF és egy myc peptid részeit tartalmazza, a megfigyelések szerint nagyobb túlélést elősegítő aktivitással rendelkezik, mint a BDNF, a dorzális gyökér-ganglionok és a szimpatikus ganglionok vizsgálata során. Az NGF-ről és a BDNF-ről megfigyelték, hogy additív neurotróf aktivitással rendelkeznek; a találmány szerint, egyetlen kiméra neurotróf faktor használható több kiindulási molekula által hordozott aktivitás egyetlen molekulában való egyesítésére.
A további megvalósítási módok szerint a kiméra neurotróf faktorok tartalmazhatnak egy toxikus komponenst, és a megbetegedett, kiméra neurotróf faktorra reagáló sejtek eliminálására használhatók, például vírussal fertőzött sejtek, vagy idegrendszeri eredetű tumorok eltávolítására.
A találmány különböző megvalósítási módjai szerint a kiméra neurotróf faktor fehérje, annak peptid fragmensei vagy származékai olyan betegeknek adhatók be, akikben az idegrendszert trauma, sebészeti beavatkozás, iszkémia, fertőzés (például gyermekbénulás vagy AIDS), metabolikus rendellenesség, táplálékhiány, rosszindulatú daganat vagy toxikus anyagok következtében sérülés érte. A találmány további megvalósítási módjai szerint a kiméra neurotróf faktor fehérje illetve annak peptid fragmensei vagy származékai használhatók veleszületett rendellenességek vagy neurodegeneratív rendellenességek kezelésére. Ilyen például, anélkül hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az Alzheimer-betegség, az öregedés, a perifériális neuropátiák, a Parkinson-betegség, a Huntington-vitustánc, valamint a motoros neuronok megbetegedései és rendellenességei.
HU 211 318 A9
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a kiméra neurotróf fehérjének, annak peptid fragmenjeinek vagy származékainak adagolása az Alzheimer-betegség, az amiotrópiás laterális szklerózis és más motoros neuron megbetegedések (beleértve például a WerdnigHoffman betegséget) és a Parkinson kór gyógyításában kombinálva használható szövet, vagy egyéb szabályozott felszabadulású kompozíciók sebészeti beültetésével. Az Alzheimer-betegségről kimutatták, hogy a bazális előagyban a kolinerg neuronok szelektív elvesztését okozza, és kimutatták, hogy a Parkinson-kórban szenvedő betegeknek körülbelül 35 százaléka Alzheimer-típusú demenciában szenved; a találmány szerinti kiméra neurotróf faktorok hasznos hatóanyagok lehetnek ennek a betegség-komplexnek a terápiájában. Hasonlóképpen, a találmány szerint előállított kiméra neurotróf faktor használható az Alzheimer-betegség kezelésében, amely a Down-szindrómával áll kapcsolatban. A találmány szerint előállított kiméra neurotróf faktor használható számos különböző demencia kezelésében, valamint a veleszületett tanulási rendellenességek kezelésében.
A találmány egyéb megvalósítási módjai szerint a kiméra neurotróf faktor fehérje, illetve annak fragmensei vagy származéka használhatók más citokinekkel kombinálva, hogy a kívánt eredményt eléljük. A találmány szerinti aktív készítmény, amely tartalmazhat kiméra neurotróf faktort, beleértve az ebből készült fehérjét, peptid fragmenset vagy származékot vagy a kiméra neurotróf faktor fehérje, peptid fragmens, vagy származék, illetve a kiméra neurotróf faktor és egy második ágens, például az NGF elleni kombináció ellen készített antitestet (vagy antitest fragmenset), bármely steril biokompatíbilis gyógyászati hordozóval beadhatjuk, beleértve, anélkül, hogy erre korlátoznánk magunkat a sóoldatot, a puffereit sóoldatot, glükózt és a vizet.
A kiméra neurotróf faktor fehérje, peptid fragmens, származék, vagy antitest mennyisége, amely hatásos a különböző rendellenességek vagy állapotok kezelésében, a rendellenesség vagy állapot természetétől függ, és standard klinikai technikákkal határozható meg. Ahol lehetséges, ott kívánatos meghatározni a dózis-hatás görbét és a találmány szerinti gyógyászati készítményeke először in vitro, például az előzőkben leírt neurotróf faktor bioesszé rendszerekben, majd hasznos állati modellrendszerekben, mielőtt emberekben kipróbálnánk.
A bejuttatás módszerei közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az intradermális, intramuszkuláris, intraperitoneális, intravénás, szubkután, orális és intranazális módszer. Emellett kívánatos lehet a találmány szerinti gyógyászati készítmények bejuttatása a központi idegrendszerbe, bármely alkalmas módon, beleértve az intraventrikuláris és intratracheális injekciót; az intraventrikuláris injekciót megkönnyítheti egy intraventrikuláris katéter, például egy tartályhoz, egy Ommaya tartályhoz csatlakoztatva. A bejuttatás módszerei közé tartozhat például egy tölthető vagy biológiailag lebontható eszköz.
Emellett kívánatos lehet a találmány szerinti készítmények lokális adagolása a kezelést igénylő területekre, lokálisan; ezt például úgy érhetjük el, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, hogy a sebészeti beavatkozás során injekcióval, katéter segítségével lokális infúziót alkalmazunk, vagy egy beépített eszköz segítségével, amely beépített eszköz lehet porózus vagy nem porózus vagy géles anyag, beleértve a membránokat, például a szialisztikus membránokat vagy szálakat.
A találmány tárgyát képezik továbbá kiméra neurotróf faktor fehérjéket, peptid fragmenseket vagy származékokat tartalmazó készítmények, amelyeket liposzómákban, mikrorészecskékben vagy mikrokapszulákban adagolhatunk. A találmány különböző megvalósítási módjai szerint hasznos lehet ezeknek a készítményeknek az alkalmazása a kiméra neurotróf faktor és a kiméra neurotróf faktorral rokon termékek szabályozott felszabadulása céljából.
6. példa
BDNF/NGF és Myc-hez kötött kiméra neurotróf faktorok készítése és expressziója
Az NGF és a BDNF számos genetikailag módosított molekuláját állították elő, hogy megvizsgálják, vajon az ilyen módosítások megváltoztatják-e a BDNF vagy az NGF hatásának specifikusságát. A konstrukciókat polimeráz láncreakciókkal végezték, hogy végrehajtsák a gének illesztését az átfedő részek révén [Horton et al., Gene, 77, 61-68 (1989)].
6.1. Anyagok és módszerek
6.1.1. Kiméra molekulák készítése
Protokollokat terveztünk, amelyekben a kiméra molekulákat egylépéses polimeráz láncreakcióval állítottuk elő három oligonukleotid indító molekula felhasználásával, vagy, egy háromlépéses polimeráz láncreakcióval, négy oligonukleotid indító molekula felhasználásával. Ezeket a módszereket használtuk kilenc kiméra előállításában, jelük R2-R10, amelyek tartalmazzák a BDNF és NGF kódoló szekvenciák egy részét, valamint két másik kiméra előállításában, jelük NM1 és BM1, amelyek az NGF-hez illetve a BDNFhez kapcsolva a mycfehérje egy részét kódoló nukleinsavat tartalmaznak; a kapcsolódó szekvencia aminosav-sorrendje glu-lys-leu-ile-ser-glu-glu-asp-leu
Az R1 kiméránál a hNGF-et egy olyan 5'-oligóval sokszoroztuk meg, amely egy 5' Clal restrikciós helyet tartalmazott, valamint egy olyan 3'-oligóval, amely egy NotI hasítási helyet tartalmazott. A PCR fragmenst ezután a pC8hB(Pl) Narl/NotI helyére klónoztuk.
A kiméra RÍ előállításában az alábbi oligonukleotidokat használtuk 5'-oligo:
'-GCTTACCTGATCGATCATCATCCCATCCCATCTTC
3'-oligo:
3' -GCTATGCGCCGCGGATCCTTATCATCTCACAGCC
6.1.1.1. Kiméra molekulák előállítása egylépéses polimeráz reakcióban
Az 1. ábrán láthatjuk három oligonukleotid (jelük A, B és C) alkalmazásának sematikus ábráját egy egy15
HU 211 318 A9 lépéses polimeráz reakcióban [PCR; Saiki et al., Science, 230, 1350-1354 (1985)], amelynek az volt a célja, hogy a géneket egymáshoz illesszük az átfedések meghosszabbítása révén, a Horton és munkatársai által leírt módszer módosítását alkalmazva [Gene, 77, 61—68 (1989)]. A három, „A”, „B”, illetve „C” jelű oligonukleotidot 100:1:100 arányban használtuk egy egylépéses PCR reakcióban, a hBDNF két templátjának (a humán BDNF expressziós plazmidja a pCDM8-ban, jele pC8hB(Pl)] és az NGF-nek (humán szintetikus NGF gén, a British Biotechnology-tól) az alkalmazásával. Az első néhány ciklusban aszimmetrikus amplifikálódás játszódott le, ennek eredménye volt egy túlnyomó, részben egyszálú A-B termék. Azután ezt amplifikáltuk a C oligóval, az A-C fúziós termék létrehozása céljából. Ennek a módszernek a felhasználásával a BDNF molekula jelentős részét helyettesítettük, az érett BDNF molekulát az NGF molekula egy részével fuzionáltatva. A fúzió pozícióját a középső oligó („B”) határozta meg, amely NGF-szekvenciát tartalmaz az 5' végén, és BDNF-szekvenciát a 3' végén. A rutinszerűen használt amplifikációs körülmények az alábbiak: 1 perc 94 ’Con, 2 perc 43 ’C-on és 3 perc 72 ’C-on, 35 cikluson keresztül. A PCR fragmen; gélen úsztítottuk, Narl/Not restrikciós enzimekkel emésztettük, majd a pC8hB(Pl) megfelelő helyére szubklónoztuk. Ezt a módszert használtuk az R2-R5 kimérák előállítására (jelzésük pC8hB/hN-R 1-től pC8hB/hN-R5-ig terjedt). A 3. táblázatban látható az R2, R3, R4 és R5 kimérák előállításában használt három oligonukleotid, beleértve az 5'oligonukleotidot (az 1. ábrán az A jelű indító molekulának felel meg), a középső oligonukleotidot (az 1. ábrán a B jelű indító molekulának felel meg) és a 3'-oligonukleotidot (az I. ábrán a C jelű oligonukleotidnak felel meg).
3. táblázat
Az R2, R3, R4 és R5 kimérák készítésében használt oligonukleotid kimérák
R2-es kiméra
5'-oligo
5'-GATGCTGCAAACATGTCCATG
Középső oligo
5'-CTTATCCCCAACCCACACGCTAATACTGTCACACACGC
3'-oligo
5'-GCTATGCGGCCGCGGATCCTTATCATCTCACAGCC
Ugyanazt az 5'-oligót és 3'-oligót használtuk az R3 és R5 kimérákhoz R3-as kiméra Középső oligo
5'-GACGGGATTTGGGTCCCGGCACTTGGTCTCGTAGAAG
R4-es kiméra középső oligo
5'-GAGTTCCAGTGCTTTGAGTCTATGCCCCTGCAGCC
R-5-ös kiméra '-GACAAAGGTGTGAGTCGTTCGGCACTGGGAGTTCCAATG
6.1.1.2. Kiméra molekulák előállítása háromlépéses polimeráz láncreakcióban
A 2. ábrán négy oligonukleotid (jelük A, B, C, illetve D) alkalmazásának sematikus ábráját láthatjuk egy háromlépéses PCR reakcióban, amelynek célja a gének illesztése az átfedő túlnyúló részek segítségével. Mivel a B és a C indító molekulák az NGF szekvencia égy részét tartalmazzák, ezért a végső reakciótermékek kiméra molekulák, amelyekben viszonylag kis BDNF -alszekvenciákat NGF-szekvenciával helyettesítünk.
Amint az a 2. ábrán látható, a BLUESCRIPT vektorban levő hBDNF-et (Stratagene) az A jelű 5'-oligóval és a B jelű középső oligóval sokszoroztuk, míg a pCDM8-ban levő hBDNF-et a C jelű középső oligóval és a D jelű 3'-oligóval sokszoroztuk. Ezt a két PCR fragmentet gélen tisztítottuk, majd az alikvot részeket egy következő reakcióban egyesítettük. Mivel a két középső oligonukleotid átlapoló NGF-szekvenciákat tartalmaz az 5 végén, ezért a két PCR-fragmens (A-B és C-D) képes volt egymáshoz egymáshoz hibridizálódni az átfedő régiókban, és ennélfogva sokszorozható volt az 5'- és 3'-oligonukleoidokkal, aminek az eredménye lett egy olyan PCR fragmens, amely egy kis NGF szubsztitúciót tartalmazott. Ezt a fragmenst Narl/Notl. restrikciós enzimekkel emésztettük, és a pC8-hP(Pl) megfelelő helyére klónoztuk. A más vektorokban kiindulási anyagként klónozott két BDNF templát felhasználásával (mindegyik egy egyedi végoligo, jelük A illetve D indító molekula) ki lehetett kerülni a fals negatív eredményeket. Ezt a módszert használtuk az R6-R10 kimérák előállítására (jelzésük pC8hB/hN-R6. pC8hB/mN-R7-től pC8hB/mN-R10ig terjed). Az R6 kimérához a pBS-hB-t használtuk templátként az A és B indító molekulával, míg a szintetikus hNGF-et használtuk templátként a C és D indító molekulához.
A 4. táblázatban láthatjuk az R6, R7, R8, R9 és RIO kimérák készítésében használt oligonukleotid indító molekulákat.
4. táblázat
Az R6, R7. RS, R9 és RIO NM1 és BM1 kimérák készítésében alkalmazott oligonukleotidok
R6-os kiméra
5'-oligo (A)
5'-GATGCTGCAAACATGTCCATG
Középső origo (B)
5'-GCCTTTCTAGAGAGCACACATACACAAGAAGTGTC
Középső origo (C)
5'-GTGCTCTCTAGAAAGGC
3'-oligo (D) '-GCTATGCGCCGCGGATCTTATCATCTCACAGCC- 3' R7-es kiméra 5'-oligo (A)
5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'
Középső origo (B)
5'-CAGCACTGTCACCTCCTTGCCCGACATGTCCACTGC
Középső origo ( C )
HU 211 318 A9
5'-AAGGAGGTGACAGTGCTGGCCGAGGTCCCTGTATCAAAAGGC-3'
3'-oligo (D)
5CAAAGATCCTCTAGAGTCGC-3'
Az R8-R10 kimérákhoz ugyanazt az 5'-és 3'-oligot használtuk R8-as kiméra Középső oligo (B)
5'-TCTGAATACACTGTTGTTAATAGGGACCTTTTCAAGGAC-3'
Középső oligo (C)
5'-ATTAACAACAGTGTATTCAGACAATACTTCTACGAGACC-3'
R9-es kiméra Középső oligo (B)
5'-AACAGGATTGGAGGCTCGGCACTTGGTCTCGTAGAA
Középső oligo (C)
5'-CGAGCCTCCAATCCTGTTGAGAGTGGCTGCAGGGGGCATAG
RIO-es kiméra
Középső oligo (B)
5'-GTATGAGTTCCAGTGTTTGGAGTCTATGCCCCTGCAGCC
Középső oligo (C)
5'-TCCAAACACTGGAACTCATACTGCCGAACTACCCAGTCG
NM1
5'-oligo '-CGGTACCCTCGAGCCACCATGCTGTGCCTCAAG-3' Középső oligo
5'-CAGATCCTCCTCAGTCAGCTTTTGCTCACCTCCTCTTGTAGCCTTCCTG
3'-oligo
5'-GCTATGCGGCCGCTACAGATCCTCCTCAGAAATC-3'
BM1
5'-oligo
5'-CGGTACCCTCGAGCCACCATGACCATCCTTTTCCTT
Középső oligo
5'-GCTATGCGGCCGCTACAGATCCTCCTCAGAAATCAGCTTTTGCTCACCTCCTTTAATGGTAATGTAC-3'
3'-oligo
5'-GCTATGCGGCCGCTACGAATCCTCCTCAGAAATC-3'
6.1.1.3. Myc „jelzést” tartalmazó kiméra molekulák előállítása
Az előzőkben ismertetett, három oligonukleotid indító molekulát alkalmazó egylépéses PCR reakciót használtuk a humán myc fehérje 10 aminosav-hosszúságú antigén tulajdonságú peptid fragmentjével jelzett NGF-et vagy BDNF-et kódoló expressziós plazmidok készítésére (1990. június 1-jén benyújtott 07/532 285 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, amelyre a továbbiakban hivatkozunk). Az egylépéses PCR technikát alkalmaztuk az egér NGF génjét tartalmazó PCR termék előállítására (a hosszú, pB 15— NGF NGF prekurzort kódoló plazmidból), amelyet egy két glicinből álló hídon keresztül egy 10 aminosavból álló myc epitópot kódoló szekvenciához kapcsolunk: a PCr, indító molekulákat úgy terveztük, hogy olyan PCR terméket eredményezzenek, amelyből a természetes NGF géneknek az utolsó két kodonja ki van hasítva, mert megvan annak a lehetősége, hogy az említett két kodon által kódolt aminosavak egy proteolitikus hasítási helyet eredményeznek, ami a myc epitóp elvesztését eredményezné. Ahhoz,hogy a 3'-végén myc-szekvenciával jelzett mNGF-et állítsunk elő (jele pC18mN/myc-NMl), 20 ng, hosszú prepro-résszel rendelkező egér NGF-et az 5'-oligonukleotiddal, a középső oligonukleotiddal és a 3'-oligonukleotiddal sokszorozzuk, az oligonukleotidok 100, 1,100 ng mennyiségét alkalmazva (lásd 3A ábra). Az alkalmazott sokszorozási körülmények az alábbiak: 1 perc 94 *C, 2 perc 43 ’C és 3 perc 72 ’C, 35 ciklusban. A keletkező PCR terméket azután Xhol/Not restrikciós enzimekkel emésztjük, és Xhol/Notl enzimekkel emésztett CDM8 vektorba klónozzuk. A 3-'- végén myc-epitóppal jelzett BDNF-et (jele pC8hB/myc-BMl) hasonló stratégia alkalmazásával készítettük (3B ábra).
Hasonló technikát alkalmaztunk olyan PCR-termék előállítására, amely egy két-glicines hídon keresztül egy 10 aminosavból álló myc-epitóphoz kötött humán BDNF-et kódol; csakúgy mint az NGF/myc kiméra esetében,a PCR indító molekulákat úgy terveztük meg, hogy olyan CR-termékek jöjjenek létre, amelyekből a BDNF utolsó három kodonja hiányzik, mert megvan a lehetősége annak, hogy az említett kodonok által kódolt aminosavak egy proteolitikus hasítási helyet eredményeznek, aminek a következménye lehet a myc-epitóp elvesztése. A PCR-terméket azután N,rí/Noti restrikciós enzimekkel emésztjük, és a kiindulási humán BDNG expressziós plazmidba, a pCBhB(Pl)-be szubklónozzuk, hogy a pC8hB/myc (BM1) expressziós plazmidot előállítsuk.
6.1.2. A kiméra neurotróf expressziós konstrukciók transzfekciója és expressziója COS sejtekben Az előzőkben ismertetett emlős expressziós konstrukciókból származó plazmid DNS-t céziumklorid gradiensen kétszer tisztítva állítjuk elő. A tisztított plazmid DNS-t ezután a kalcium-foszfát kopecipitációs módszerrel transzfektáljuk [Chen and Okayama, Moi. Cell. Bioi., 7, 2745 (1987)] COS-M5 sejtekbe. A COS-M5 sejteket 60 mm átmérőjű lemezekre oltjuk le 24 órával a transzfekció előtt SxlO5 sejt per lemez koncentrációban, 2,5 ml Dulbecco:féle módosított Eagle táptalajban, amely 4500 gg/ml glükózt és 10% borjúmagzat szérumot tartalmaz. A transzfektált sejtekből származó közeget a transzfekció után 48 órával eltávolítjuk biológiai vizsgálatok céljából. Ugyanebben az időpontban metabolikus jelzést is végzünk (lásd fent).
6.1.2. 1 Metabolikus jelzés
A transzfekció után 48 órával a COS-M5 sejteket 3 ml szérummentes DMEM-táptalajba tesszük, amely
HU 211 318 A9 nem tartalmaz sem metionint, sem ciszteint, viszonttartalmaz inzulint, transzferrint és szelént. A sejteket 1 óra hosszat tartó aminosavéhezésnek vetjük alá 37 ’C-on 5% CO2 -koncentráció mellett. A szérummentes DMEM-ből egy millilitert eltávolítunk, és a C0S-M5 sejteket 35S-metioninnal valamint 35S-ciszteinnel jelezzük (mindegyiket 100 gCi/ml mennyiségben) 4 óra hosszat. A jelzett COS-M5 felülúszót összegyűjtjük és SDS poliakrilamid gél elektroforézissel elemezzük. A
4. ábrán látható a metabolikusan jelzett hBDNF, mNGF, hBDNF/myc (BM1 kiméra) és az mNGF/myc (NM1 kiméra) feloldása.
Az NGF és BDNF gének részeit egymás mellé illesztettük, polimeráz reakcióban felhasználva az indító molekulák átlapoló kiterjesztését. Olyan kiméra molekulákat állítottunk elő, amelyekben viszonylag nagy (R1-R5 kimérák) vagy kis (R6-R10) régiókat helyettesítettünk NGF-szekvenciákkal. Az R1-R10 aminosavszekvenciákat az 5. ábrán mutatjuk be. Az R1-R6 kimérák a humán BDNF és a humán NGF részeit tartalmazzák, míg az R7-R10 kimérák a humán BDNF és az egér NGF részeit tartalmazzák. Az 5. táblázatban látható a BDNF és NGF szekvenciák közelítő hosszúsága az R1-R10 kimérákban.
5. táblázat
-, Kiméra BDNF szekvencia NGF szekvencia
Rl preproszekvencia teljes érett szekvencia
R2 preproszekvencia ] — 17-es csoportok 18-20-as csoportok
R3 preproszekvencia 1-58-as csoportok 59-120-as csoportok
R4 preproszekvencia 1-58-as csoportok 73-120-as csoportok
R5 preproszekvencia 1-81-es csoportok 82-120-as csoportok
R6 preproszekvencia 1-110-es csoportok 111-120-as csoportok
R7 preproszekvencia 1-33-as csoportok 42-118-as csoportok 34-41 -es csoportok
R8 preproszekvencia 1-43-as csoportok 51 -118-as csoportok 44-50-es csoportok
R9 preproszekvencia 158-as csoportok 67-118-as csoportok 59-66-os csoportok
RIO preproszekvencia 1-72-es csoportok 80-118-as csoportok 73-79-es csoportok
Emellett olyan kiméra molekulákat is előállítottunk, amelyek a myc fehérje 10 aminosavból álló antigén peptidjével jelzett NGF-et és BDF-et kódolják. Az NGF/myc (NM1 kiméra) és a BDNF/myc (BM1 kiméra) levezetett aminosav szekvenciáit az 5. ábrán mutatjuk be.
Mindegyik kiméra konstrukciót COS-M5 sejtekbe juttatjuk be kalcium-foszfát koprecipitációval. Az RlR10 kimérák expresszióját metabolikus jelzéssel és bioaktivitási méréssel igazoljuk. Abból a célból, hogy igazoljuk az NM1 és a BM1 expresszióját, az NM1gyel vagy BM 1-gyel transzfektált COS sejteket metabolikusan jelöljük [35S]-metioninnal, a felülúszót poliakrilamid gélelektroforézisnek vetjük alá, majd az elektroforetikusan elválasztott fehérjéket nylon membránra visszük át, és autoradiografáljuk (4. ábra). A BDNF és a BM1 kiméra esetében: a legnagyobb azonosított fehérje csík egy 31 kD méretű csík, ami megfelel ezeknek a fehérjéknek a prekurzor formájának. A prekurzor forma intenzitásának összehasonlításából nyilvánvaló, hogy ez a két fehérje közel egyformán expresszálődik. Ez a 31 kD méretű fehérje nincs jelen a COS-MOCK sávban (1. sáv). Az NGF és az NM1 kiméra esetében ezeknek a fehéijéknek az érett formájának az egyenlő expressziója (körülbelül 12,5 kD) figyelhető meg. Amint az várható volt, a myc-kel jelzett NGF (NM1) lassabban vándorol, mint az NGF. Mindegyik BDNF/NGF kiméra (R1-R10) túlnyomóan a 31 kD méretű prekurzor fehérjét expresszálja, a BDNF-éhez hasonló szinten.
7. példa
Az R1-R10 BM1 és NM1 kiméra neumtróffaktorok neurotróf aktivitása
7.1. Anyagok és módszerek 7.1.1 Biológiai vizsgálatok átültetett szöveteken Az összes kimérát (R1-R10, valamint a BM1 és az
NM1), valamint a természetes BDNF-et és NGF-et az előzőkben leírt módon COS-M5 sejtekben expresszáljuk. A transzfektált sejtekről gyűjtött felülúszókat használjuk átültetett szöveteken és disszociált sejttenyészeteken, hogy vizsgáljuk azt a képességüket, hogy mennyire tudják a specifikus ganglionok neurit kinövését indukálni.
A kimérák aktivitását oly módon határozzuk meg, hogy mérjük a dorzális gyökér ganglionból (DRG) disszociált, tenyésztett sejtek vagy a szimpatikus lánc ganglionok (SG) túlélését. Röviden, a ganglionokat kivágjuk E8-9 csirke embriókból, majd szérumtartalmú táptalajban gyűjtjük össze (DMEM, kiegészítve 10% FBS-sel, sztreptomicinnel, penicillinnel és glutaminnal). A tripszinizációt követően (0,5% Worthington tripszin) a sejteket óvatosan trituráljuk, majd 60 mm átmérőjű fedetlen műanyag lemezekre előszélesztjük. Az előszélesztési lépés (2-3h) lehetővé tette, hogy a nem-neuronális sejtek megtapadjanak. A le nem tapadt neuronális sejteket összegyűjtjük, lecentrifugáljuk, szérum-tartalmú táptalajban újra szuszpendáljuk, majd hemocitométerrel megszámláljuk. A neuronok túlélését vagy úgy becsüljük meg, hogy meghatározzuk a sejtszámot, vagy pedig kolorimetriás módszerrel, amely az MTT-nek [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólium-bromid] az élő sejtek által egy bíborszínű termékké való alakulásán alapul. A sejtszámlálási módszer esetében a sejteket 24 000 sejt/35 mm-es átmérőjű lemez koncentrációban szélesztjük, majd a sejtszám
HU 211 318 A9 meghatározása előtt 48 óra hosszat tenyésztjük COS felülúszó jelenlétében vagy anélkül, amely az expresszált kiméra fehérjét tartalmazza. Az MTT módszer esetében a sejteket 1000 sejt/A2 luk sűrűségben szélesztjük. 40 órával a szélesztés után az MIT festéket 0,5 mg/ml koncentrációban hozzáadjuk a sejtekhez. Az élő sejtek által felvett festéket oldhatóvá tesszük, oly módon hogy 0,08 mol/1 izopropanolban oldott sósavat adunk hozzá 8 órával később, majd az abszorbanciát 570-650 nm-en mérjük. Az abszorbanciát a hozzáadott COS felülúszó különböző hígításainak függvényében ábrázoljuk.
7.1.2. PC 12 sejtek biológiai vizsgálata
A transzfektált sejtekből származó COS-M5 sejt felülúszót a transzfekció után kinyerjük, hogy a PC 12 sejtek differenciálódásán alapuló vizsgálatban elemezzük. A PC 12 sejteket RPMI 1640 táptalajban tenyésztjük, amely borjúmagzat szérummal és 6% lószérummal van kiegészítve. A COS felülúszókat a PC 12 sejttenyészetekhez adjuk (1 ml össztérfogat) 1:5 és 1:500 közötti különböző hígításokban. A neurit-kinövést vagy pozitívnak ítéljük meg (a legtöbb sejt neuritokat expresszál). vagy negatívnak (nagyon kevés sejt expreszszál neuritokat, vagy egy sem).
7.2. Eredmények és értékelés
7.2.1. Átültetett szövetek vizsgálata és a disszociált sejttenyészetek
A csirke perifériális ganglionjából származó átültetett szöveteket használtuk arra, hogy különbséget tegyünk az NGF és a BDNF biológiai aktivitása között. Jóllehet mindkét faktor hat a neurális taréjból származó dorzális gyökér ganglionokban (DRG) talált érzékelő neuronok populációira, csak a BDNF támogatja a neurális piacodé eredetű csomós ganglíon (NG) érzékelő neuronjait. Ezzel szemben az NGF (a BDNF nem) képes támogatni a paravertebrális lánc szimpatikus ganglionjainak (SG) túlélését és növekedését. Ezeket az in vitro ganglion vizsgálatokat használtuk annak meghatározására, hogy a specifikus kiméra konstrukciók expresszálnak-e BDNF, NGF vagy BDNF és NGF biológiai aktivitásokat
Az R7, R8, R9, RIO, BM1 és NM1 kiméráknak vizsgáltuk a neurotróf aktivitását a dorzális gyökér ganglionban, a csomós ganglionban vagy az átültetett szimpatikus ganglionokban. Amint azt korábban igazoltuk, mind az NGF mind a BDNF elősegíti a neurit növekedést az E8 csirke dorzális gyökér ganglionjaiból (DRG). Csak a BDNF expresszált neurit kinövési aktivitást ha a csomós ganglionokkal (NG) vizsgáltuk, és az NGF (a BDNF nem) expresszált aktivitást a szimpatikus ganglionokkal (SG; 6. táblázat) Az R8 BDNF/NGF kiméra elősegítette a neurit kinövést mind a DRG-kből, mind az NG-kből, ami az NGF-szerű aktivitás jellemzője.
A c-myc proto-onkogén 10 aminosavból álló epitópjával jelzett kimérák közül a BM1 expresszál SG aktivitást, ami egy NGF-szerű aktivitás jellemzője, míg az NM1 mutatott valami aktivitást az NG-n, ami a BDNF-szerű aktivitásra jellemző (6. táblázat).
6. táblázat
A BDNF, NGF, BDNF/NGF kimérák és a myc-kel jelzett neurotróf faktor összehasonlítása, kiültetett embrionális csirke dorzális gyökér ganglionokon (DRG), csomós ganglionokon (NG) és szimpatikus ganglionokon végzett vizsgálatokkal
Kimérák DRG NG SG
R7 (250 μΐ) 3 1 0
R8 (250 μΐ) 3-4 2 3
R9 (250 μΐ) 2-3 2 0
RIO (250 μΐ) 3-4 2 0
NGF 5 1 5
BDNF 3 2 0,5
pCDM8 kontroll (250 μΐ) 0-1 0.5 0,5
BMI (250μ1> 2-3 2 1-2
NM1 (100 μΙ) 5 3 5
A számok a megfigyelhető neurit-kinövést és az arborizációt (dendrit, fa alakú rajz) mutatják, mikor is a maximális érték S. a 0 pedig azt jelenti, hogy nincs neurit-kinövés. A számértékek három független kísérlet átlagát jelentik. A neurit-kinövést a neurotróf faktor hozzáadása után 24 illetve 48 órával végeztük.
A 8. táblázatban egy dózis-hatás vizsgálat eredményeit láthatjuk, amelyből kiderül, hogy a neurit-kinövés szempontjából az NM1 aktivitása összemérhető az NGF aktivitásával a dorzális gyökér ganglionokban és szimpatikus ganglionokban végzett vizsgálatokban, de sokkal aktívabb a csomós ganglion vizsgálatokban. A myc-kel jelzett NGF-ről pedig a 7. táblázatból kiderül, hogy az NM1 50 μΙ-ben a dorzális gyökérganglionoknak körülbelül 63%-át megmentette, míg az NGF-ről kiderült, hogy csak körülbelül 47%-ukat menti meg, jelezve ezzel, hogy az NM1 a neuron túlélés szempontjából az NGF agonistájaként működik.
A 6. ábrán láthatjuk egy MTT-vel végzett kolorimetriás vizsgálat eredményeit BDNF, NG vagy BMI hatásának kitett DRG és SG neuronokon. Amint az a 6. ábráról kiderül, a BMI túlélést elősegítő aktivitása lényegesen magasabb mint a BDNF-aktivitása, mind a DRG-, mind az SG vizsgálatokban. Az NGF-hez hasonlóan, sem a DRG sem az SG-aktivitást nem titráltuk ki még a BMI COS-felülúszó l:1000-es hígításában sem. Azaz, a BDNF molekula 3'-myc jelölése SG-aktivitással ruházza fel a molekulát.
HU 211 318 A9
7. táblázat
Az NGF és NMI aktivitás összehasonlítása az E8 csirke embriókból származó disszociált DRG neuronok túlélése alapján vizsgálva
A DRG neuronok száma
NGF 5gl 336
20 μ] 440
50 μΐ 408
NMI 5 μΐ 334
20 μΐ 446
50 μΐ 542
A megszámlált DRG neuronok száma a teljes terület 3,6%-át jelenti, és két lemez átlagából származik. Az NGF COS-lé a DRG neuronoknak körülbelül 47%-át megmenti 50 μΐ mennyiséget alkalmazva belőle; azonos mennyiségben alkalmazva az NM] a neuronoknak körülbelül 63%-át menti meg.
8. táblázat
Az NGF és NMI aktivitás összehasonlítása, kiültetett E8 csirke DRG-n, NG-n és SCG-n vizsgálva
DRG NG SCG
5μ1 1 2 2
10 μΐ 4 0,5-1 2-3
NGF 20 μΐ 4-5 0,5-1 3-4
30 μΐ 5+ 1-2 4-5
40 μ) 5+ 0 5+
60 μΙ 5+2 0 5+2
NMI 5μΙ 1-2 1-2 0-0.5
10 μ! Ο 2-3 0,5-1
20 μΐ 3-4 3-4 2-3
30 μΐ 4-5 4-5 5
40 μΐ 5+ 5+ 5+
50 μΐ 5+2 5+3 5+2
A neurit-kinövést a neurotróf faktor hozzáadása után 24 órával mérjük.
7.2.2. PC12 biológiai vizsgálatok
Patkány PC 12 sejtekről kimutatták, hogy számos hatóanyagra, beleértve az ideg növekedési faktort is, adott válaszként differenciálódik. Az idegnövekedési faktor által indukált differenciálódási válasz a sejt szaporodásának megszakadásával, valamint hosszú neurit extenziók kinövésével jár együtt. Ennélfogva ez a differenciálódási vizsgálat hasznos volt olyan molekulák azonosításában.amelyek ideg növekedési faktor-szerű aktivitással rendelkeznek. Az összes kiméra konstrukciónkat ésa természetes BDNF-et valamint NGF-et is levizsgáltuk, hogy képesek-e neurit kinövést indukálni PC 12 sejtekben. Amint az a 9. táblázatból látható,az NGF jelentős neurit elősegítő aktivitással rendelkezik még l:25O-es hígításban is. Az NM 1 is aktív 1:250-es hígításban. Az R8 lóméra (amely a szimpatikus ganglionokra fejtett ki hatást - lásd az 1. táblázatot) képes volt a PC 12 sejt neurit-kinövését indukálni l:50-es hígításban. Meglepő módon hasonló eredményeket kaptunk a BMl-gyel is, jelezve,hogy a BM1 a kiindulási molekulából, a BDNF-ből hiányzó neutrófaktivitással rendelkezik. A BDNF csak gyenge neurit kinövési aktivitást mutatott PC 12 sejteken 1:5 hígításban. A COS-MOCK nem volt aktív. Az RlR5 és az R7, R9 valamint az RIO kimérák nem voltak aktívak.
Tehát, mind a kiültetett szöveteken,mind a PC 12 sejteken végzett vizsgálatok azt mutatták,hogy ha az NGF és a BDNF molekula C-terminálisára nem-rokon szekvenciát építünk be, akkor ez új, a kiindulási molekulából hiányzó biológiai aktivitást eredményez.
9. táblázat
Kimérák vizsgálata PCI 2 sejteken
Kimérák 1:5 1:25 1:50 1:100 1:250 1:500
COS-MOCK - - - - - -
BDNF +/- - - - - -
NGF + + + + + +
NMI + + + + + +
BM1 + + + - - -
R8 + + - - -
A PC 12 sejtek neurit-kinövését a neurotróf faktor hozzáadása után 24-48 órával értékeltük.
8. példa: NGF/BDNF kiméra neurotróf faktorok készítése és expressziója
Olyan kiméra neurotróf faktorokat készítettünk, amelyekben az NGF megfelelő régióit a BDNF megfelelő régióival helyettesítettük.
8.1. Anyagok és módszerek
8.1.1. Kiméra molekulák készítése
Az NGF/BDNF kimérákat háromlépéses PCR reakcióval állítjuk elő, négy oligonukleotid alkalmazásával, amint azt a 6.1.1.2. példában ismertettük. Mindegyik esetben a legszélső indító molekulák (megfelelnek az A-nak és D-nek a 2. és 7. ábrán) a T7-es, illetve a T3-as jelzésű molekulák voltak (Stratagene). A 7. ábra a kimérák készítésében használt stratégia sematikus diagramját mutatja, a 10. táblázatban pedig a 7. ábrán látható B és C indító molekuláknak megfelelő olignukleotidok szekvenciáját mutatjuk be. A T3 indító molekula szekvenciája: 5'-ATTAACCCTCA CTAAAG-3', a T7 indító molekula szekvenciája pedig: 5'-AATACGAC TCACTATAG-3'. Röviden, az egér béta NGF-et kódoló cDNS-t az eredeti Smal és PstI hasítási helyeinél emésztjük [Scott et al., Natúré, 302, 538 (1983)], majd a pKS (Stratagene) Smal/PstI restrikciós hasítási helyére klónozzuk. A keletkező KS-NGF plazmid szolgált templátként a további PCR sokszorozások során.
HU 211 318 A9
A kiméra molekulákat úgy állítjuk elő, hogy az ő'-fragmenst sokszorozzuk a T7 indító molekula és egy olyan oligonukleotid indító molekula segítségével, amely az NGF és a BDNF kívánt részeire terjed ki. Egy 3'-fragmenst azután a T3 indító molekula és egy második, tervezett NGF/BDNF indítómolekula felhasználásával. A kapott két fragmens izoláljuk és gélen tisztítjuk. Egy második PCR sokszorozási lépésben ez egyes fragmensekből 100-300 ng-ot elegyítünk, fuzionáltatjuk őket, majd T7 és T3 indító molekulák felhasználásával sokszorozzuk őket. Az összes PCR reakciót az alábbi körülmények között hajtjuk végre.
A denaturálást 3 percig végezzük 94 °C-on, ezt követi 25 cikluson keresztül a denaturálás/renaturálás, ami abból áll, hogy 1 percig 94 *C-on tartjuk, 2 percig 50 °C-on tartjuk, majd 3 percig 72 *C-on tartjuk a reakcióelegyet. A hosszabbodást hagyjuk 10 percig lejátszódni 72 °C-on. Egy PCR Gene-Amp Kit-et (Cetus) használunk, a gyártó előírásai szerint.
A sokszorozott fragmensket azután EcoRI és SacII restrikciós enzimekkel hasítjuk, majd az SR alfa -promotert tartalmazó módosított pBJ-5 expressziós vektor megfelelő restrikciós helyeire szubklónozzuk [8. ábra; Takebe et al., Mól. Cell. Bioi., 8, 466 (1988)]. Az I-es kiméra esetében azonban a Sac II helyett Notl enzimet használunk, mivel egy belső SacII hasítási hely is keletkezik. Mindegyik kimérát a teljes sokszorozott régióra kiterjedően szekvenáljuk, a Sequenase kísérleti leírás (Stratagene) alapján.
10. táblázat
A CH1-CH12 kimérák készítésében használt oligonukleotid indító molekulák
S-l KIMÉRA
1(B) indító molekula NGF(delta3-9)—>BDNF 1-7 (33 tagú)
5'-CGGGCGGGGTCCGAGTGGGATGAGCGCTT
GCTC
2(C) indító molekula (33 tagú)
5'-CG GAC CCC GCC CGC CGC GGG GAG TTC TCA GTG T-3'
S-2 KIMÉRA
3(B) indító molekula NGF(deltal0-22)—>BDNF 8-20 (37 tagú)
5’-AAT GCT CTC GCA CAC GCT CAG CTC CCC CAT GTG GAA G-3'
4(C) indító molekula (39 tagú)
5'-C GTG TGC GAC AGC ATT AGC GAG TGG GTT GGA GAT AAG AC-3'
S-3 KIMÉRA
5(B) indító molekula NGF(delta23-33)-+BDNF 21-33 (45 tagú)
5'-C CAC TGC CGT CTTTTT ATC CGC CGC CGT AAC CCA CAC ACT GAC AC-3'
6(C) indító molekula (44 tagú)
5-T AAA AAG ACG GCA GTG GAC ATG TCG GGT AAG GAG GTG ACA GTG C-3'
S-J KIMÉRA
7(B) indító molekula NGF(delta34—42)—>BDNF 3442 (38 tagú)
5'-T TTC GAG GAC CGT GAC CGT GCC GCC CTT GAT GTC TGT G-3' 8(C) indító molekula (41 tagú)
5'-GTC ACG GTC CTC GAA AAA GTC AAC ATT AAC AAC AGT GTA TT-3'
S-5 KIMÉRA
9(B) indító molekula NGF(delta43-50)—»BDNF 4350 (30 tagú) 5'-GCC TTT CGA GAC GGG CAC CTC GGC CAG CAC-3'
10(C) indító molekula (42 tagú)
5'-CCC GTC TCG AAA GGC CAA CTG AAG CAG TAC TTT TTT GAG ACC-3'
S-6 KIMÉRA (21 tagú)
B indító molekula NGFTYR-54A: 5'-CAG TAC TTT TAT GAG ACC AAG-3'
C indító molekula NGFTYR-54-B: 5'-CTT GGT
CTC ATA AAA GTA
CTG-3'
S-7 KIMÉRA (B) indító molekula (38 tagú)
5'-TT TGT GTA CCC CAT AGG ATT GCA CTT GGT CTC AAA AAA-3' 12(C) indító molekula (35 tagú)
5-CCT ATG GGG TAC ACA AAG GAG GGG TGC CGG GGC AT-3'
S-8 KIMÉ&4
13(B) indító molekula (32 tagú)
5-GGA GTT CCA GTG CCT CTT GTC GAT GCC CCG GC-3'
14(C) indító molekula (35 tagú)
5'-AGG CAC TGG AAC TCC CAG TGC ACC ACT ACTCACA-3'
S-9 KIMÉRA
15(B) indító molekula (37 tagú)
5'-AC ATA CGA CTG GGT AGT TCG GCA GTA T Gf GTT CCA GT-3' 16(C) indító molekula (37 tagú)
5-ACT ACC CAG TCG TAT GTG CGG GCG TTG ACA ACA GAT G-3'
S-10KWÉR4
17(B) indító molekula (36 tagú)
5'-AT TCG TTT TTT GCT ATC CAT TGT CAA CGC CTT GAC G-3'
18(C) indító molekula (38 tagú)
5'-TG GAT AGC AAA AAA CGA ATT GGC TGG AGG TTC CGG-3'
S-ll KIMÉRA (21 tagú) (B) NGFSER-108A:
5'-G ATA GAC ACT TCC TGT GTG TG-3' (C) NGFSER-108B: 5'-CA CAC ACA GGA AGT GTC TAT C-3'
HU 211 318 A9
S-12 KIM ÉRA
19(B) indító molekula (37 tagú)
5-TCC CCT CTT AAT GGT CAA AGT ACA CAC ACAGGCTGT G-3'
20(C) indító molekula (36 tagú)
5-TG ACC ATT AAA AGG AGA TGA CTT GCC TGC AGG A-3'****
8.1.2 Kiméra neumtróffaktorok expressziója COS sejtekben
COS-7 sejteket transzfektálunk kiméra konstrukciókkal, a DEAE-Dextrán-Klorokin módszer alkalmazásával. Röviden, a sejttenyészeteket a transzfekció előtt szétosztjuk, úgy hogy körülbelül 750 000 sejt jusson egy 60 mm-es lemezre. Egy transzfekciós keveréket készítünk, amely 5 μΐ DNS-t (körülbelül 5 μg), 1 ml DMEM-et (szérummentes) és 25 μΐ 20 mg/ml DEAEDextránt tartalmaz. A tenyésztett COS-7 sejteket azután háromszor mossuk 5 ml szérummentes DMEMmel. A transzfekciós keveréket (lásd előbb) hozzáadjuk, majd 30 percig 37 ’C-on inkubáljuk. Ezután 2 ml szérummentes DMEM-et kombinálunk 20 μΐ 8 mmol/1 klorokinnel. és közvetlenül hozzáadjuk a COS-7 sejt/DNS/DEAE-Dextrán elegyhez, amit ezt követően 2 óra 30 percig inkubálunk 37 ’C-on. A felülúszót ezután leszívjuk a sejtekről és 2 ml szérummentes DMEM-mel helyettesítjük, amely 10% dimetilszulfoxidot (DMSO) tartalmaz. A sejteket azután szobahőmérsékleten inkubáljuk 2 perc 30 másodpercig, majd 5 ml DME-vel mossuk, ezt leszívjuk róla és körülbelül
2,5 ml friss DMEM-mel plusz 6% lószérummal és 6% vassal kiegészített borjúszérummal helyettesítjük. A sejtekei ezután megvizsgáljuk, hogy expresszálják-e a kiméra neurotróf faktorokat 48 illetve 72 óra elteltével, amint azt az alábbiakban ismertetjük.
8.2. Eredmények
Olyan kiméra nukleinsav molekulákat állítottunk elő, amelyekben az NGF-et kódoló DNS részt a BDNF megfelelő részével helyettesítettük szabályos intervallumokban. All. táblázatban láthatók az NGF deléciós régiók a megfelelő BDNF régió inszerttel az egyes kimérák esetében. Meg kell jegyezni, hogy az S-6 és az S—11 csak pontmutációkat tartalmaz, amelyeket szintén háromlépéses PCR-rel állítottunk elő.
//. táblázat
KIMÉRA NGF deléciós BDNF inszerciós
régió régió
S-l Thr Met His Arg
NGF (delta 3-9/BDNF 1-7)
S 2 Gly Val Gly Val
10-22/BDNF 8-20)
S 3 Gly Gly Thr Gly
NGF (delta 23-33/BDNF 21-33)
S-4 Lys Val Gly Val
NGF (delta 34-42/BDNF 34-42)
S-5 Asn Arg Pro Lys
NGF (delta 43-50/BDNF 43-50)
KIMÉRA NGF deléciós BDNF inszerciós
régió régió
S 6 Glu Cys Glu Cys
NGF (delta 51-58/BDNF 51-58)
S-7 Arg Cys Asn Cys
NGF (delta 59-68/BDNF 59-68)
S-8 Arg Cys Arg Cys
NGF (delta 69-80/BDNF 69-80)
S-9 Thr Thr Arg Thr
NGF (delta 81-91/BDNF 81-91)
S-10 Thr Phe Met Phe
NGF (delta 92.-101/BDNF 92-101)
S-ll lle Cys He Cys
NGF (delta 102-110/BDNF 103-111)
S-12 Val Gly Thr Arg
NGF (delta 111-120/BDNF 112-119)
A BDNF szekvencia helyettesítési régióit grafikusan mutatjuk be a 9. ábrán, majd az SÍ-SÍ 2 aminosav szekvenciákat a 10. ábrán mutatjuk be. Meg kell jegyezni, hogy az SÍ-SÍ 2 szekvenciák az egér NGF-et kódoló szekvencia részét és a humán BDNF kódoló szekvenciáját tartalmazzák.
Az SÍ-SÍ 2 kiméra neurotróf faktorokat egyenként transzfektáljuk COS-7 sejtekbe a DEAE-DextránKlorokin módszer alkalmazásával. A kiméra neurotróf faktorok expresszióját metabolikus jelzéssel mérjük [35S]-metionin alkalmazásával, majd a jelzett sejt felülúszó gélelektroforézisével és autoradiografálásával. Az adatokat a 12. táblázatban adjuk meg a vad típusú NGF százalékában. Az adatokat úgy kapjuk meg, hogy összehasonlítjuk az autoradiogramok jelzési intenzitását, főleg az érett NGF csíkra koncentrálva körülbelül 13 kD-nál (8B ábra), majd a vad típusú NGF és az NGF/BDNF kimérák immunprecipitációjával antiNGF antitestek alkalmazásával (8C ábra).
9. példa:
Az S1-S12 kiméra neurotróf faktorok neurotróf aktivitása
9.1. Anyagok és módszerek
A dorzális gyökér-ganglionokat (DRG), szimpatikus ganglionokat (SG), csomós ganglionokat (NG) és a PC 12 pheochromacytoma sejtvonalat alkalmazó biológiai vizsgálatokat lényegében az előzőkben (7. rész) leírt módon végeztük.
9.2. Eredmények
Az SÍ-SÍ 2 kimérák NGF-aktivitását először a PC 12 sejtek alkalmazásával becsültük meg. A PC 12 neurit-kinövést használtuk az NGF-aktivitás mércéjeként. Az egyes kimérák aktivitását a rekombináns vad típusú NGF (NGF-wt) aktivitásához viszonyítva határoztuk meg, amelyet transzfektált COS-7 sejtekben expresszáltunk. Ennek a vad típusnak a 100%-os értéket adtuk (12 táblázat). Az egyes kimérák specifikus aktivitását oly módon határoztuk meg, hogy SDS-PA22
HU 211 318 A9
GE módszerrel megbecsültük a kiméra neurotróf faktor koncentrációját a metabolikusan jelzett COS-7 sejt felülúszójában, és ismét önkényesen a 100%-os értéket adtuk az NGF-wt-vel transzfektált COS-7 sejtekhez kapcsolódó neurotróf aktivitáshoz.
Az E8 csirke embriókból nyert dorzális gyökér ganglionok (DRG), a csomós ganglionok (NG) és a szimpatikus ganglionok (SG) átültetett szöveteit azután azonos mennyiségű Sl-Sl 2-vel, NGD-wt-vel és a vektorral.(negatív kontroll) transzfektált COS-7 sejt felül úszók hatásának tettük ki. 24 órás tenyésztés után a rekombináns vad típusú NGF-re. a vektorra (negatív kontroll), illetve az S1—S12 kimérákra adott válaszként való fonalas növekedést határozzuk meg (12. táblázat) egy 0 és 5 közötti tetszőleges skálán, oly módon, hogy összehasonlítjuk E8 csirke DRG NGF-re adott standard dózis-hatás reakciójáról (a 0-20 ng/ml dózistartományban) készített standard fényképekkel. A 0 azt jelenti, hogy nincs reakció; az 1 azt jelenti, hogy kimutatható aktivitás van, körülbelül 10-50 szál kinövésének megfelelő módon (ez megfelel 20-100 pikogramm/ml NGF-re adott tipikus válasznak); a 2 jelentése közepes aktivitás, számos szál nő ki egy nyilvánvaló udvar formájában; a 3 jelentése jó aktivitás, számos hosszú szál kinövésével; a 4 jelentése erős aktivitás, bőséges szálas növekedéssel; az 5 jelentése pedig masszív szálas kinövés, ami megfelel az NGF telítési szintjére adott maximális válasznak (körülbelül 1-10 nanogramm/ml). A 12. táblázatban látható kiültetett szövet eredmények a maximális szálas kinövést mutatják, ami az egyes felülúszók telítési szintjénél látható egy dózishatás vizsgálatban. A felülúszókat 0,1-83 μΐ tartományban vizsgáltuk, 2 ml végtérfogatban. Egyéb kiültetett szövet vizsgálatokban az S4 nagyobb koncentrációjához nagyobb kinövési értékek tartoznak
12. táblázat
A vizsgált felülúszók listája
Kiónok Relatív exp- ressziós szint Specifikus aktivitás PC12 sejteken Kiültetett szövet adatok*
DRG NG S. C.
NGF-wt 100% 100% 5 1 5
Vektor - - 0 0 0
S-l 200% 25% 5 1 5
S-2 100% 100%, 5 2 5
S-3 100% 100% 5 3 5
S-4 20% 100%, 1 1 1
S-5 5% 100% 1 1 1
S-6 100% 100% 5 3 5
S-7 50% 100% 5 2 5
S-8 100% 100% 5 2 5
S-9 100% 100% 5 4 5
Kiónok Relatív exp- ressziós szint Specifikus aktivitás PCI 2 sejteken Kiültetett szövet adatok*
DRG NG S. C.
S-10 100% 100% 5 4 5
S-ll 50% 50% 5 1 5
S-12 100% 50% 5 3 5
* szálak kinövése 24 óra elteltével
9.3. Értékelés
Az adatok meglepő módon azt sugallják, hogy az NGF-régiók BDNF-szekvenciával való helyettesítése ellenére a legtöbb NGF-BDNF kiméra megtartja a teljes aktivitását az NGF-re reagáló sejteken. A legtöbb kiméra neurotróf faktor azonos mennyiségei magas szintű neurit kinövési aktivitást mutattak PC 12 sejteken, amely összemérhető volt a vad típusú NGF aktivitásával. Voltak kivételek; az S-l lényegesen kisebb aktivitással rendelkezett mint a vad típusú NGF, és az
S—11 valamint az S-l 2 kimérákról kiderült, hogy az NGF specifikus aktivitásának körülbelül 50%-val rendelkeznek. A teljes NGF -aktivitás megtartása a legtöbb kimérában váratlan volt, mivel korábban arra következtettek, hogy az NGF szekvencia kritikus régióiban a minimális változások az aktivitás jelentős részének elvesztését eredményezhetik.
Emellett, a legtöbb tárgyalt kiméra neurotróf faktorról, az NGF-hez hasonlóan kiderült, hogy az átültetett dorzális gyökér ganglionokon és a szimpatikus ganglionokon maximális választ indukáltak. Amint az a 12. táblázatból látható majdnem az összes vizsgált kiméra maximális aktivitást mutatott a dorzális gyökér ganglionokkal és a szimpatikus ganglionokkal szemben. Az S-l2 kiméráról kiderült, hogy 3-5-ször nagyobb specifikus aktivitással rendelkezik mint az NGF az átültetett dorzális gyökér ganglionokon, jelezve ezzel, hogy az S-l2 az NGF-aktivitásnak egy „szuperagonistája” lehet, legalább néhány célsejt esetében. Az
S-l2 szuperagonista aktivitásának egy lehetséges magyarázata lehet az, hogy a BDNF-szekvenciával helyettesítés konformációs változást okozhat az NGF szerkezetében, ami az S-l 2-nek egy megnövekedett affinitását eredményezi az NGF receptorhoz, illetve egy másik esetben az S-l2-nek nagyobb stabilitást biztosít a lebontási folyamatokkal szemben.
Továbbá, számos kiméráról figyelték meg, hogy további aktivitással rendelkeznek olyan ganglionokon, amelyek inkább a BDNF-re reagálnak mint az NGF-re. Az NGF támogatja a túlélést és a neurit-kinövést a csirke embrió dorzális gyökér ganglion érzékelő neuronok és a csirke embrió paravertebrális szimpatikus lánc ganglionok kiültetett szöveteiből, de nincs hatása a piacodé eredetű csomós ganglionok érzékelő neuronok kiültetett szöveteire [Lindsay et al., Dev. Bioi., 112, 319 (1985)]. Ezzel szemben a BDNF támogatja a túlélést és a neurit-kinövést a kiültetett dorzális gyökér ganglionokból, de nincs hatása a szimpatikus ganglio23
HU 211 318 A9 nokra. Amint az a 12. táblázatból látható, számos NGFBDNF kiméra neurotróf faktor indukált közepestől erősig terjedő szálas kinövést a kiültetett csomós ganglionokból, ami a BDNF-szerű aktivitásra jellemző. A
3-as, 4-es, 6-os, 9-es, 10-es és 12-es kimérákról mind megfigyeltük, hogy hatással vannak a csomós ganglionokra, ami sokkal nagyobb volt, mint amit az NGF-fel meg lehetett figyelni. Úgy tűnik tehát, hogy az NGF aminoterminálisától a karboxi-terminálisáig terjedő szekvenciamódosítások BDNF-szerű aktivitást vagy a neutrofin család más tagjainak aktivitását adhatják a módosított molekulának.
10. A mikroorganizmusok letétbe helyezése Az alábbi c DNS-eket helyeztük letétbe az American Type Culture Collection-nál (Rockville, M. D.):
A kiméra molekula jelölése Rövidítés Letéti szám
pBJ51mN/hB-S4 S4 40 859
pBJ5imN/hB-S9 S9 40 861
pBJ5lmN/hB-Sl0 SIO 40 858
pBJ5lmN/hB-S12 S12 40 860
pC8hB/mN-R8 R8 40 862
pC8hmN/myc-NMl NMl 40 864
pC8hB/myc-BMl BMl 40 863
A jelen találmány oltalmi körét a benne leírt specifikus megvalósítási módok nem korlátozzák. Ezzel szemben. a szabadalmi leírásban ismertetett különböző megvalósítási módok mellett számos módosítás képzelhető el a szakterületen jártas szakember számára, az említett leírás és a kísérő ábrák alapján. Ezek a módosítások is a mellékelt igénypontok oltalmi körébe tartoznak.

Claims (33)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Egy kiméra proteint kódoló nukleinsav molekula, amely neurotróf aktivitással rendelkezik és amely lényegében egy első neurotróf faktorból áll, ahol a nevezett első neurotróf faktor kb. 3 - kb. 13 egymást követő aminosavát egy második neurotróf faktor hasonló méretű aminosav-szekvenciájával helyettesítettük úgy, hogy a kapott kiméra protein szekvenciája legalább 3 aminosavban különbözik az első neurotróf faktortól.
  2. 2. Egy 1. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az első és második neurotróf faktorokat az agyi eredetű neurotróf faktor, a ciliáris neurotróf faktor, a neurotrofin-3 és az ideg növekedési faktorok csoportjából választjuk ki.
  3. 3. Egy 2. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett első neurotróf faktor az ideg növekedési faktor és az említett második neurotróf faktor az agyi eredetű neurotróf faktor.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett kiméra proteint a pBJ51mN/hB-Sl plazmid kódolja, vagy annak egy funkcionális ekvivalense, amely olyan kiméra proteint kódol, amely lényegében a 10. ábrán az SÍ kimérára megadott aminosavszekvenciával rendelkezik.
  5. 5. A 3. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett kiméra proteint a pBJ51mN/hB-S2 plazmid kódolja, vagy annak egy funkcionális ekvivalense, amely olyan kiméra proteint kódol, amely lényegében a 10. ábrán az S2 kimérára megadott aminosavszekvenciával rendelkezik.
    5. A 3. igénypont szerinti nukleinsav molekula; ahol az említett kiméra proteint a pBJ51mN/hB-S3 plazmid kódolja, vagy annak egy funkcionális ekvivalense, amely egy olyan kiméra proteint kódol, amely lényegében a 10. ábrán az S3 kimérára megadott aminosav-szekvenciával rendelkezik.
  6. 7. A 3. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett kiméra proteint a PBJ51mN/hB-S4 plazmid kódolja, melyet az RTCC-nél 40858 számon helyeztünk letétbe, vagy annak egy funkcionális ekvivalense, amely egy olyan kiméra proteint kódol, mely lényegében a 10. ábrán az S4 kimérára megadott aminosav-szekvenciával rendelkezik.
  7. 8. A 3, igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett kiméra proteint a pBJ51mN/hB-S5 plazmid kódolja, vagy annak egy funkcionális ekvivalense, amely egy olyan kiméra proteint kódol, mely lényegében a 10. ábrán az S5 kimérára megadott aminosav-szekvenciával rendelkezik.
  8. 9. A 3. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett kiméra proteint a PBJ51mN/hB-S7 plazmid kódolja, vagy annak egy funkcionális ekvivalense, amely egy olyan kiméra proteint kódol, amely lényegében a 10. ábrán az S7 kimérára megadott aminosav-szekvenciával rendelkezik.
  9. 10. A 3. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett kiméra proteint a PBJmN/hB-S8 plazmid kódolja, vagy annak egy funkcionális ekvivalense, amely egy, lényegében a 10. ábrán az S8 kimérára megadott aminosav-szekvenciával rendelkező kiméra proteint kódol.
  10. 11. A 3. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett kiméra proteint a pBJ51mN/hB-S9 plazmid kódolja, melyet az ATCC-nél 40 861 számon helyeztünk letétbe, vagy annak egy funkcionális ekvivalense, amely egy, lényegében a 10. ábrán az S9 kimérára megadott aminosav-szekvenciával rendelkező kiméra proteint kódol.
  11. 12. A 3. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett kiméra proteint a pBJ51mN/hH-S10 plazmid kódolja, melyet az ATCC-nél 40 860 számon helyeztünk letétbe, vagy annak egy funkcionális ekvivalense, amely egy, lényegében a 10. ábrán az S10 kimérára megadott aminosav-szekvenciával rendelkező kiméra proteint kódol.
  12. 13. A 3. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett kiméra proteint a PBJ51mN/hB-S12 plazmid kódolja, melyet az RTCC-nél 40860 számon helyeztünk letétbe, vagy annak egy funkcionális ekvivalense, amely egy, lényegében a 10. ábrán az S12
    HU 211 318 A9 kimérára megadott aminosav-szekvenciával rendelkező kiméra proteint kódol.
  13. 14. A 2. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett első neurotróf faktor a BDNF és a második neurotróf faktor az IGF.
  14. 15. A14. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett kiméra proteint a pC8hB/hN-R7 plazmid kódolja, vagy annak egy funkcionális ekvivalense, amely egy, lényegében az 5. ábrán az S7 kimérára megadott aminosav-szekvenciával rendelkező kiméra proteint kódol.
  15. 16. A 14. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett kiméra proteint a pC8hB/hN-R8 plazmid kódolja, melyet az ATCC-nél 40862 számon helyeztünk letétbe, vagy annak egy funkcionális ekvivalense, amely egy, lényegében az 5. ábrán az R8 kimérára megadott aminosav-szekvenciával rendelkező kiméra proteint kódol.
  16. 17. A 14. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett kiméra proteint a pC8hB/hN-R9 plazmid kódolja, vagy annak egy funkcionális ekvivalense, amely egy, lényegében az 5. ábrán az R9 kimérára megadott aminosav-szekvenciával rendelkező kiméra proteint kódol.
  17. 18. A 3. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett kiméra proteint a pC8hB/hN-R10 plazmid kódolja, vagy annak egy funkcionális ekvivalense, amely egy, lényegében az 5. ábrán az RIO kimérára megadott aminosav-szekvenciával rendelkező kiméra proteint kódol.
  18. 19. Az 1. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett első és második neurotróf faktorok a neurotrofin gén-család tagjai.
  19. 20. A 19. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett kiméra protein négy cisztein-maradékot tartalmaz a kiméra protein aminosav-szekvenciájában az alábbi pozíciók közül négyben:
    körülbelül a 14-es aminosavnál, körülbelül az 57-es aminosavnál, körülbelül a 67-es aminosavnál, körülbelül a 79-es aminosavnál, körülbelül a 108-as aminosavnál, körülbelül a 110-es aminosavnál, vagy hasonló pozíciókban, a neurotrofin család tagjaira jellemző homológ szekvenciában végzett inszerciókhoz vagy deléciókhoz viszonyítva.
  20. 21. A 19. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett kiméra protein öt cisztein-maradékot tartalmaz a kiméra protein aminosav-szekvenciájában az alábbi pozíciók közül ötben:
    körülbelül a 14-es aminosavnál, körülbelül az 57-es aminosavnál, körülbelül a 67-es aminosavnál, körülbelül a 79-es aminosavnál, körülbelül a,08-as aminosavnál, körülbelül a 110-es aminosavnál, vagy hasonló pozíciókban, a neurotrofin család tagjaira jellemző homológ szekvenciában végzett inszerciókhoz vagy deléciókhoz viszonyítva.
  21. 22. A 19. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett kiméra protein hat cisztein-maradékot tartalmaz a kiméra protein aminosav-szekvenciájában az alábbi pozíciókban körülbelül a 14-es aminosavnál, körülbelül az 57-es aminosavnál, körülbelül a 67-es aminosavnál körülbelül a 79-es aminosavnál, körülbelül a 108-as aminosavnál, körülbelül a 110-es aminosavnál, vagy hasonló pozíciókban, a neurotrofin család tagjaira jellemző homológ szekvenciában végzett inszerciókhoz vagy deléciókhoz viszonyítva.
  22. 23. A 19. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett kiméra protein pl-értéke körülbelül 9 és 10 közötti.
  23. 24. A 23. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett kiméra protein négy cisztein-maradékot tartalmaz a kiméra protein aminosav-szekvenciájában az alábbi pozíciók közül négyben:
    körülbelül a 14-es aminosavnál, körülbelül az 57-es aminosavnál, körülbelül a 67-es aminosavnál, körülbelül a 79-es aminosavnál, körülbelül a 108-as aminosavnál, körülbelül a 110-es aminosavnál, vagy hasonló pozíciókban, a neurotrofin család tagjaira jellemző homológ szekvenciában végzett inszerciókhoz vagy deléciókhoz viszonyítva.
  24. 25. A 19. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett kiméra protein öt cisztein-maradékot tartalmaz a kiméra protein aminosa.r-szekvenciájában az alábbi pozíciók közül ötben:
    körülbelül a 14-es aminosavnál, körülbelül az 57-es aminosavnál, körülbelül a 67-e S aminosavnál, körülbelül a 79-es aminosavnál, körülbelül a 108-as aminosavnál, körülbelül a 110-es aminosavnál, vagy hasonló pozíciókban, a neurotrofin család tagjaira jellemző homológ szekvenciában végzett inszerciókhoz vagy deléciókhoz viszonyítva.
  25. 26. A 19. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol az említett kiméra protein hat cisztein-maradékot tartalmaz a kiméra protein aminosav-szekvenciájában az alábbi pozíciókban körülbelül a 14-es aminosavnál, körülbelül az 57-es aminosavnál, körülbelül a 67-es aminosavnál, körülbelül a 79-es aminosavnál, körülbelül a 108-as aminosavnál, körülbelül a 110-es aminosavnál, vagy hasonló pozíciókban, a neurotrofin család tagjaira jellemző homológ szekvenciában végzett inszerciókhoz vagy deléciókhoz viszonyítva.
  26. 27. Egy kiméra proteint kódoló nukleinsav molekula, amely neurotróf aktivitással rendelkezik és amely lényegében egy neurotróf faktor egy részéből és második peptid körülbelül 3 - körülbelül 13 egymást követő aminosavat tartalmazó részéből áll, ahol a nevezett peptid rész átruházza az említett kiméra proteinre a neurotróf aktivitást, melyet a neurotróf faktor nem mutat.
    HU 211 318 A9
  27. 28. A 27. igénypont szerinti nukleinsav molekula, ahol a nevezett peptid a myc fehérje.
  28. 29. A 28. igénypont szerinti nukleinsav, ahol a nevezett peptid a myc fehérje GLU-GLN-LYS-LEU-ILESER-GLU-GLU-ASP-LEU szekvenciájú része. 5
  29. 30. A 28. igénypont szerinti nukleinsav, ahol az említett neurotróf faktor a BDNF.
  30. 31. A 30. igénypont szerinti nukleinsav, ahol az említett kiméra proteint a pC8hB/myc-BMI plazmid kódolja, melyet az ATCC-nél 40 863 számon helyeztünk letétbe, vagy ennek egy funkcionális ekvivalense, amely egy, lényegében az 5. ábrán a BM1 kimérára megadott aminosav-szekvenciával rendelkező proteint kódol.
  31. 32. A 28. igénypont szerinti nukleinsav, ahol az említett neurotróf faktor az NGF.
  32. 33. A 32. igénypont szerinti nukleinsav, ahol az említett kiméra proteint a pC81hB/myc-NMI plazmid kódolja, melyet az ATCC-nél 40 864 számon helyeztünk letétbe, vagy ennek egy funkcionális ekvivalense, amely egy, lényegében az 5. ábrán az NM1 kimérára megadott aminosav-szekvenciával rendelkező proteint kódol.
  33. 34. A pBJ51mN/hB-S6 plazmid, vagy ennek egy funkcionális ekvivalense, amely egy, lényegében a 10. ábrán az S6 kimérára megadott aminosav-szekvenciával rendelkező kiméra proteint kódol.
HU9500735P 1995-06-30 1995-06-30 Multitróf és multifunkcionális kiméra neurotróf faktorok és a kimérákát kódoló nukleinsavak és plazmidok Az átmeneti oltalom a(z) 1-34. igénypontra vonatkozik. HU211318A9 (hu)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU9500735P HU211318A9 (hu) 1995-06-30 1995-06-30 Multitróf és multifunkcionális kiméra neurotróf faktorok és a kimérákát kódoló nukleinsavak és plazmidok Az átmeneti oltalom a(z) 1-34. igénypontra vonatkozik.

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU9500735P HU211318A9 (hu) 1995-06-30 1995-06-30 Multitróf és multifunkcionális kiméra neurotróf faktorok és a kimérákát kódoló nukleinsavak és plazmidok Az átmeneti oltalom a(z) 1-34. igénypontra vonatkozik.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU211318A9 true HU211318A9 (hu) 1995-11-28

Family

ID=10986598

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9500735P HU211318A9 (hu) 1995-06-30 1995-06-30 Multitróf és multifunkcionális kiméra neurotróf faktorok és a kimérákát kódoló nukleinsavak és plazmidok Az átmeneti oltalom a(z) 1-34. igénypontra vonatkozik.

Country Status (1)

Country Link
HU (1) HU211318A9 (hu)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU664975B2 (en) Chimeric neurotrophic factors
AU705371B2 (en) Ciliary neurotrophic factor
CA2040437C (en) Neurotrophin-3, a novel neurotrophic factor related to nerve growth factor and brain derived neurotrophic factor
AU707528B2 (en) Truncated glial cell line-derived neurotrophic factor
CA2240516C (en) Novel tyrosine kinase receptors and ligands
US6413740B1 (en) Tyrosine kinase receptors and ligands
HU211318A9 (hu) Multitróf és multifunkcionális kiméra neurotróf faktorok és a kimérákát kódoló nukleinsavak és plazmidok Az átmeneti oltalom a(z) 1-34. igénypontra vonatkozik.
US6933276B1 (en) Methods of treating peripheral neuropathies using neurotrophin-3
PT101064A (pt) Proteinas e peptidos prepro quimericos, moleculas de acido nucleico que os codificam, e processo de producao de uma neurotrofina
CZ15293A3 (en) Chimeric neurotrophilic factors
WO1996034619A1 (en) Methods of preventing neuron degeneration and promoting neuron regeneration
DE69632064T2 (de) Neue tyrosinkinase-rezeptoren und liganden