SK7193A3 - Chimeric neurotrofic factor - Google Patents

Description

1.Oblasť techniky

Vynález sa týka chimérnych neurotrofnych faktorov, molekúl, ktoré obsahujú časť prirodzene sa vyskytujúceho faktora a časť aspoň jednej ďalšej molekuly, pričom výsledná chimérna molekula má neurotrófny účinok. Vynález je z časti založený na zistení, že chimérne molekuly obsahujúce časti dvoch odlišných neurotrofných faktorov si udržujú v podstate plnú biologickú účinnosť a aspoň v niektorých prípadoch môžu mať veľmi dobrý rozsah neurotrofného účinku, pri ktorom má jediná molekula účinnosť oboch molekúl.

2.Súčasný stav techniky

2.1. Chimérne cytokiny

Niektoré bunky ľudského tela sú schopné produkovať faktory, nazývané cytokiny, ktoré pôsobia ako prenášače pri styku s ďalšími bunkami a tak koordinujú biologické funkcie. Napríklad lymfocyty môžu produkovať lymfokiny, ide o faktory, ktoré reagujú s rôznymi zložkami imunologického systému tak, aby došlo k účinnej imunologickej odpovedi. Neurotrofné faktory sú cytokiny, ktoré môžu priaznivo ovplyvniť prežívanie a/alebo diferenciáciu jednotlivých zložiek nervového systému.

Ako látky, vytvárajúce spojenie medzi bunkami pôsobia cytokiny typicky v špecifických populáciách buniek cez molekuly, ktoré sú receptormi cytokínov. Cytokin je napríklad cielený na určité bunky, nesúce receptor. Môžu byť použité napríklad na prenos toxických látok k určitým bunkám tak, že dochádza k ich väzbe na túto látku.

Napríklad v publikácii Siegala ďalší, 1989, Fed.Am. Soc.Exp. Biol., 3: 2647- 2652 sa opisuje spojenie cDNA, ktoré je kódom pre modifikovanú formu exotoxínu A z Pseudomonas a je prostý oblasti, ktorú môže bunka rozoznať. Výsledná chimérna molekula bola uložená do Escherichia coli, kde došlo k jej expresii, bola izolovaná a bolo dokázané, že je veľmi cytotoxická pre bunky, špecificky také, ktoré nesú receptor epidermálneho rastového faktora. V publikácii Ogata a ďalší, 1989, Proc. Natl, Acad. Sci., USA 86:4215- 4219 sa opisuje rekombinantný chimérny toxín, v ktorom bola nahradená oblasť pre väzbu na bunkuz exotoxínu Pseudomonas PE myšiam lymfokínom interleukínom 4, IL-4. Chimérna bielkovina, 11-4- PE40, bola cytotoxická pre myši bunečnej línie, nesúcej receptor IL-4. Banker a ďalší, 1989, J. Celí. Physiol., 139:51-57 opisujú chimérnu molekulu, obsahujúcu epidermálny rastový faktor a reťazec A ricínu. Villiams a ďalší, 1987, ProteinEng., 1: 493-498 nahradili v záškrtovom toxíneoblasť pre väzbu na receptorsynetetickým génom, ktorý je kódom pre interleukin 2, IL-2 a stop signálom pre transláciu. Výsledná bielkovina pôsobila selektívnu inhibíciu syntézy bielkovín v bunkách, nesúcich receptor pre IL-2, zatiaľ čo bunečné línie, pri ktorých nedochádzalo k expresiireceptoru pre IL-2 boli na pôsobenie toxínu celkom odolné.

Ďalší autori skonštruovali rekombinantné molekuly DNA, ktoré obsahovali gén pre cytokín a súčasne aspoň časť bakteriálneho génu. Dicou a ďalší, 1989, J. Neurosci. Res., 22:13-19 spojili DNA pre úplný preprofaktor nervového rastu myší na karboxylové zakončenie génu pre beta-galaktozidázu z E. coli a okrem toho tiež spojili fragment genomu DNA, odpovedajúci kodónom 11 až 106 génu pre ľudský faktor nervového rastu a piatym kodónom aminoterminálneho zakončenia beta-galaktozidázy. Pri použití obidvoch bakteriálnych vektorov došlo k expresii veľkého množstva chimérnej bielkoviny.

Aj keď po rozrušení bakteriálnej bunky bola väčšina chimérnych molekúl nerozpustná, bolo možné dokázať v supernatante chimérne molekuly s obsahom faktoru nervového rastu.Ukázalo sa, že rozpustným faktorom bola molekula s obsahom ľudského faktora, nerozpustný podiel tvorili chimérne molekuly s obsahom myšieho faktora. Nie je uvedená neurotrófna účinnosť.

V súčasnej dobe opísali Ibanez a ďalší, 1990, EMBO J. 9: 1477-1483 štúdie na nervovom rastovom faktore, ktorý bol pozmenený cielenou mutagenézou. Xie a ďalší, 1990, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 87:3180- 3184 opisujú použitie chimérnych opioidných peptidov pri štúdiáchopiátových receptorov. Ray a ďalší, 1990, Mol. Endocrinol., 102:101 diskutujú zmenu v špecifičnosti väzby rastového hormónu na receptor v dôsledku zmeny exonu genomu. Cunningham a ďalší 1990, Science 247:1330 systematicky nahradzovali časti rastového hormónu tak, aby bolo možné identifikovať mutanty hormónu schopné a neschopné sa viazať na receptor rastového hormónu. Cunningham a ďalší, 1990, Science 247:1461 popisujúcielenú mutagenézu prolaktínu za vzniku variantu prolaktinu, schopného viazať sa na receptorrastového hormónu.

t

2.2. Neurotrófne faktory

Vývoj a udržiavanie nervového systému závisí na bielkovinách, známych ako neutrófne faktory. Pri normálnom vývoji centrálnej a periférnej nervovej sústavy dochádza k veľkému úhynu nervovýchbuniek a tieto fázy zdá sa hrajú základnú úlohu pri riadení počtu nervových buniek, ktoré zásobujú určitú cieľovú oblasť, ako bolo opísané v Berg D. K., 1982, Neurnal Development 297-331). Pri štúdiách, pri ktorých bol v priebehu vývoja periférne cieľové tkanivá odstránené alebo transplantované, sa ukázalo, že k uhynutiu nervových buniek dochádza pri ich kompetícii o obmedzenom množstve faktorov, produkovaných v príslušných cieľových tkanivách a umožňujúcich prežitie, t.j. neurotrófnych faktorov. K dnešnému dňu boli identifikované štyri dôležité neurotrófne faktory, a to NGF: Levi - Montancini a Angeletti, 1968, PHYS.REV., 48:534, neurotrofin-3, NT-3:, Hohn a ďalší, 1990, Naturé 344.339, Maisonpierre a ďalší, 1990, science 247:1446, neurotrófny faktor z mozgového tkaniva, BDNF: Barde a ďalší 1982, EMBO J., 1:549 a ciliárny neurotrófny faktor CNTF: Lin a ďalší, 1979, Science 246:1023.

2.2.1 Faktor nervového rastu

Faktor nervového rastu NGF je až doteraz naj úplnejšie charakterizovanou neurotrófnou molekulou ako in vitro, tak in vivo bolo dokázané, že tento faktor je podstatný pre prežitie sympatických neurónov a senzorických neurónov, odvodených od nervovej ryhy v skorých štádiách Levi-Montalcini vývoja kurčaťa a potkana, Develop. Biol., 7:653-659, Physiol. Rev., 48:524-569. do vyvíjajúcich sa kuracích a Angeletti, 1963, a ďalší , 1968, čisteného NGF

Levi-Montalcini

Pri vstreknutí zárodkov bolo zistené, že dochádza k zvýšenému prežitiu a k hypertrofii miechových senzorických neurónov sympatiku, ako bolo opísané v publikáciách Levi-MOntalcini a Booker, 1960, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 46:373-348, Hamburger a ďalší, 1981,· J. Neurosci. 1:60-71. Na druhej strane odstránenie endogénneho NGF každodenným vstrikovanim protilátok proti NGF novorodeným potkanom bolo spojené s témer úplnou deštrukciou sympatického nervového systému podľa publikácií Levi-Montalcini a Booker, 1960, Proc. Natl. Acad. Sci., 46: 384-391, Levi-Montalcini a Angeletti, 1966, Pharmacol, Rev.,

18:619-628. Ukázalo sa , že v dôsledku pôsobenia protilátok proti NGF buď vstrekovaním do maternice alebo prenosom materských protilátok placentou do plodu dochádza k veľkej strate senzorických neurónov, odvodených od nervovej rýhy, napríklad spinálnych dorzomediálnych senzorických neurónov trojklanného nervu, ako bolo opísané v publikáciách Goedert a ďalší, 1984, Proc Natl. Acad. Sci. USA, 81:1580-1584, Gorin a Johnson, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76: 5382-5386. Až doteraz sa takmer všetky štúdie, týkajúce sa NGF sústredili na úlohu tohto faktoru v periférnom nervovom systéme, v súčasnej dobe sa však ukazuje, že NGF môže rovnako ovplyvniť vývoj a udržiavanie špecifických skupín nervových buniek v centrálnom nervovom systéme, ako bolo opísané v Thoenen a ďalší, 1987, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacil., 109:145-178, Vhittermore and Seiger, 1987, Brain Res.Rev., 12:439-464.

Značné množstvo NGF v podčeľustnej žľazemyší dovolila analyzovať primárny reťazec bežnými postupmiv chémii bielkovín, Angeletti a Bradshaw, 1971, Pro. Natl.Acad. SCI., 68:2417-2420. NGF bol klonovaný z celého radu druhov včetne myší (Scott a ďalší, 1983, Náture, 302:538-540), človeka (Uilrich a ďalší, 1983, Náture 303:821-825), Kravy a kurčaťa (Meier a ďalší, 1986, EMBO J., 5:1489-1493) ako aj potkana (Vhittemore a ďalší, 1988, J. Neurosci. Res., 20:402-410). Bolo možné použiť bežných postupov molekulárnej biológie vzhľadom k dostupnosti reťazca NGF a bolo možné konštruovať vhodné oligonukleotidové sondy. Dostupnosť väčšieho množstva NGF, tiež veľmi uľahčila štúdium receptoru NGF, ktoré nakoniec viedli k molekulárnemu klonovaniu jednej zložky receptora NGF u človeka a potkana (Johnson a ďalší, 1986, Celí, 47:545-554, Radeke a ďalší, 1987, Náture 325:593-597.

Teraz je už dokázané, že NGF nie je všadeprítomný neurotrófny faktor. Pokiaľ ide o periférny nervový systém, nemôže NGF ovplyvniť prežitie parasympatických neurónov, niektorých senzorických neurónov ani enterických neurónov, ako bolo dokázané na základe štúdií in vitro aj in vivo. Okrem toho NGF pravdepodobne nie je faktorom pre prežitie vyvýjajúcich sa motorických neurónov (Oppenheim, 1982, J. Comp. NEUROL: 210:174-189) aj keď v týchto neurónoch dochádza k expresii

Z aspoň formy receptoru NGF s nízkou afinitou v priebehu vývoja (Raivich a ďalší, 1985, EMBO J., 4:637-644). Chýbajúci účinok NGF na tieto typy nervových buniek uržchlil snahy nájsť ďalšie neurotrófne faktory zvlášť také, ktoréby podporovali pržívanie motorických miechových neurpnov a/alebo parasympatických neurónov ciliárneho ganglia.

2.2.2 Nervový faktor, odvodený z mozgového tkaniva

Neurotrófna účinnosť, schopná udržať prežitie neurónov zadných koreňov u kuracieho zárodku in vitro bola identifikovaná v živnom prostredí, v ktorom sa pestovali bunky gliomu C-6 potkana (Barde a ďalší 1978, Natural, 274:818). Tento účinok nebol neutralizovaný protilátkami proti NGF myší, takže bolo možné predpokladať prítomnosť iného neurotrófneho faktoru v živnom prostredí. Podobný typ účinku ktorý rovnako nebolo možno blokovať protilátkami proti NGF bolo neskôr možné preukázať v kultúrach astrogliálnych buniek z mozgu normálneho dospelého potkana (Lindsay, 1979, Natural 282:80-82, Lindsay a ďalší, 1982, Brein Res., 243/329-343), ďalej v extraktoch vyvýjajúceho sa i dospelého mozgu potkanov (Barde a ďalší, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:1199, 1203) a tiež vo vyvýjajúcej sa a zrelej mieche kurčiat (Lindsay a Peters, 1984, Neurosci.,12:45-51). Avšak v žiadnom z uvedených prípadov nebol účinný faktor izolovaný ani identifikovaný a zostáva otázkou, či pozorované účinky boli dôsledkom pôsobenia jedného faktoru alebo rôznych faktorov.

Pri použití mozgu prasaťaako východiskovej látky bolo možné preukázať faktor teraz nazývaný neurotrófnym faktorom, odvodeným z mozgového tkaniva, tj. BDNF (Barde a ďalší, 1982, EMBO J., 1:549-564), tento faktor podporoval prežívanie nervových buniek ganglii dorzálnych koreňov z kuracích embrií E 10/E 11. Preukázalo sa, že faktorom je vysokobázická bielkovina s izoelektrickým bodom pi 10,1, ktorá migrovala pri elektroforéze na géle s dodecylsulfátom sodným SDS ako jediný pás s molekulovou hmotnosťou 12,3 kJ. Vysokobázická povaha zlúčeniny a jej molekulová hmotnosť je teda veľmi podobná vlastnostiam monoméru NGF.

Klonovanie génu pre BDNF bolo prvýkrát opísané v US patentovej prihláške č. 07/400 591, podanej 30. augusta 1989. Postup spočíval v tom, že boli vyčistené malé množstvá BDNF vo forme bielkoviny z mozgu prasaťa, takže bolo možné určiť fragmenty reťazca aminokyselín, a tieto fragmenty potom boli použité na určenie zodpovedajúcich oligonukleotidov. Tieto syntetické oligonukleotidypotom boli použité ako primery pri PCR-reakcii pri použití templátu cDNA, pripraveného z buniek, produkujúcich BDNF. Produkty PCR boli použité ako sondy, čím bolo nakoniec možné klonovať úplnú cDNA a/alebo gény genomu pre BDNF z celého radu živočíšnych druhov včetne človeka, prasaťa, potkana a myši a boli tiež stanovené reťazce týchto génov. Expresie rekombimantného BDNF sa dosiahlo v bunkách COS.

Prvé preukázanie špecifičnosti BDNF pre určité neuróny a jeho odlišnosti od NGF bolo uskutočnené in vitro. Bolo dokázané, že čistený BDNF podporuje prežívanie 40 až 50 % senzorických neurónov, uvoľnených z ganglión nodosum kuracieho embria v dňoch E6, E9 alebo E12 (Lindsay a ďalší, 1985, J. Celí. Sci. Supp., 3:115-129). Na tieto neuróny nemal NGF žiaden zjavný účinok ani sám ako taký, ani v spojení s BĎNF. Neskôr bolo ukázané, že v kultúrach explantátov podporoval BDNF prežívanie a rast nervových buniek a iných senzorických ganglií, napríklad ganglión petrósum geniculátum a tiež explantát ventrolaterálneho ganglia trojklanného nervu (Davies a ďalší, 1986, J.Neurosci., 6:1897-1904). Žiadne z týchto tkanív neboli citlivé na NGF.. Vo všetkých horeuvedených štúdiách nemali neutralizačné protilátky proti NGF žiadny účinok na pozorovanú účinnosť BDNF. Okrem tohto účinku na kultúry nervových buniek z periférnych ganglií bolo preukázané, že BDNF podporuje prežívanie a diferenciáciu nervových buniek nervovej rýhy prepelice (Kalcheim a Gendreau, 1988, Develop. Brain Res., 41:79-86).

Súčasné štúdie s BDNF, uvedené v publikáciách (Kalcheim a ďalší, 1987, EMBO J., 6:2871-2873, Hofer a Barde, 1988, Náture 331:261-262) však preukázali fyziologickú úlohu BDNF vo vývoji periférneho nervového systému vtákov PNS. V prípade, že boli uložené mechanické prekážky do vajcia v embrionálnom dni 3 alebo 4, E3/E4 medzi vyvíjajúcim sa gangliom dorsálnych koreňov DRG a ich cieľovým tkanivom v nervovej trubici pre vznik centrálneho nervového systému CNS, bolo pozorované, že veľký počet nervových buniek uhynul, ako bolo opísané najmä v Kalcheim a Le Dourari, 1986, Develop. Biol. 116:451-46. Predpokladalo sa, že toto uhynutie nervových buniek bolo dôsledkom nedostatku neurotrofného faktoru z nervovej trubice pre CNS. Ďalej bolo pozorované, že BDNF, viazaný na membránu, povlečenú laminínorn mohol zabrániť tomuto uhynutiu, ako bolo popísané v Kalcheim a ďalší, 1987, EMBO J., 6:2871-2783. Bolo tiež preukázané, že vstrieknutím

BDNF do vyvíjajúcich sa prepeličích vajec bolo možné znížiť prirodzene sa vyskytujúce uhynutie buniek ganglion nodosum, čo je účinok, ktorý podľa publikácie Hofer a Barde, 1988, Náture, 331:261-262 nie je možné pozorovať po pôsobení NGF. Okrem tohoto účinku na periférne senzorické neuróny z nervovej rýhy aj základu pre CNS bolo preukázané, že BDNF podporuje prežívanie všetkých vyvíjajúcich sa nervových buniek CNS. V publikácii Johnson a ďalší, 1986, J. Neurosci. 6:3031-3938 sa uvádzajú údaje, ktoré preukazujú, že BDNF podporuje prežívanie buniek sietnicových ganglií, pestovaných v kultúre a odobraných z potkaních embrií E 17. Týrn sú doplnené predchádzajúce pokusy, ktoré preukázali, že supernatanty kultúr mozgového tkaniva a extrakty tohto tkaniva z cieľových oblastí sietnicových ganglií podporovali prežívanie týchto nervových buniek ako bolo napríklad opísané v McCaffery a ďalší, 1982, Ex. Brain Res. , 48:37-386, Sarthy a ďalší, 1983, J. Neurosci, 3:2532-2544, Turner a ďalší,1983, Dev. Brain Res., 6:77-83.

Okrem týchto účinkov na prežívanie vyvíjajúcich sa nervových buniek v kultúre bolo preukázané, že BDNF rovnako ako NGF stimuluje regeneráciu axónov nervových buniek DRG dospelých potkanov v kultúre podľa Lindsay, 1988, J. Neurosci., 8:2394-2405, napriek tomu, že senzorické neutróny dospelých nevyžadovali k svojmu udržiavaniu v priebehu 3 alebo 4 týždňov neurotrófne faktory. Okrem toho bolo v kultúrach buniek sietnice dospelých potkanov pozorované, že BDNF podporuje prežívanie a predlžovanie axónov z buniek sietnicových ganglií podľa Thanos a ďalší, 1989, Eur. J. Neurosci., 1:19-26. Okrem toho bolo tiež preukázané, že BDNF predlžuje prežívanie buniek ventrálneho mesencephala v kultúre, ako bolo merané počtom buniek pozitívnych na tyrozínhydroxylázu pri imunocytochemických skúškach. Okrem toho podporuje BDNF tiež prežívanie polynergných neurónov v kultúrach disociovaných buniek, odvodených z oblasti potkanieho septa, ako bolo opísané v US patentovej prihláške č. 07/400 591, podanej 30. augusta 1989. Porovnanie biologických účinkov NGF a BDNF je zhrnuté v následujúcej tabuľke I.

Tabuľka I

Porovnanie biologických účinkov BDNF a NGF^X

Periférny nervový systém prežívanie^xx

	BDNF	NGF
i)	DRG kurčaťa E6	-	++
	DRG kurčaťa E10	+	++
	sympatikus kurčaťa E12 (Barde a ďalší, 1980 zhora)		++
ii)	DRG kurčaťa E6 - E12	++	++
	g.nodosum kurčaťa E6-E12	++	-
	simpatikus kurčaťa E12	-	++
	g. ciliare kurčaťa E12 (Lindsay a ďalší, 1985, zhora)
iii)	kurča E3-E14:	+/++	++
	g.jugulare	4- /++	++
	DM-trigeminus	+/++	-
	g.petrosum	4-/+4-	-
	g.geniculatum	++	-
	VL-trigeminus	-	-
	g.vestibulare g.trigerminale v mesencephale (Davies a ďalší, 1986, zhora Barde a ďalší, 1987, Prog,Brain Res., 71:185-189)	++

Tabuľka I - pokračovanie

Centrálny nervový systém prežívanie

BDNF NGF

i)	bunky sietnicových ganglií potkany E17 (Johnson a ďalší, 1986, J. Neurosci. 63031-3038)	++
ii)	dopaminergné neuróny ventrálneho mesencephala	++	-
iii)	cholinergné neuróny bazálnej časti predného mozgu (US prihláška pat.č. 07/499 591, podaná 30.8.1989)	++

^x V chronologickom poradí podľa vydania publikácií, účinky boli stanovené in vitro.

^xx Hodnotenie podľa stupnice: - bez prežitia, + stredne dobré prežitie ++ dobré prežívanie.

Analýzou predpovedanej primárnej štruktúry BDNF bola preukázaná veľká podobnosť so štruktúrou NGF. Existujú len tri miesta, ktoré je nutné v reťazci NGF vynechať, aby si reťazce zodpovedali, pričom 51 zvyškov je v rôznych typoch NGF od hada až k človeku i v BDNF je totožných. Dôležité je, že v týchto zvyškoch je zahrnutých šesť cysteinových zvyškov.

2.2.3 Neurotrofín-3

Výrazná podobnosť medzi štruktúrou NGF a BDNF vzbudila domienku, že obe tieto látky by mohli byť členmi väčšej skupiny blizko príbuzných neurotrófnych molekúl. V prípade, že boli oblasti homológie použité ku konštrukcii oligonukleotidových primerov pre PCR-reaciu na identifikáciu nových členov tejto skupiny látok, bol objavený ďalší člen tejto skupiny, ktorý bol nazvaný neurotrofin-3, NT-3, a gén pre úto látku bol klonovaný z myši, potkana a človeka, ako bolo opísané v US patentovej prihláške

1990. Celková štruktúra NT-3 aminokyselinami, teda o podobnú hodnotu ako pre NGF signálnym reťazcom, obsahujúci 18 aminokyselín, vyrátaná hodnota

č. 07/490 004 z 7. marca myši je tvorená 119 pi je približne 9,5 ide a BDNF, reťazec je tvorený z ktorých päť je totožných s BDNF a deväť s NGF, za týmto reťazcom následuje predbežný reťazec, obsahujúci 121 aminokyselín, predbežný reťazec myšieho NGF obsahuje 103 a myšieho BDNF 112 aminokyselín. Pri porovnaní úplného NGF, BDNF a NT-3 je možné preukázať 54 totožných aminokyselín ako je zrejmé z obr 1. Medzi konzervované zvyšky patrí všetkých šesť cysteinových zvyško, ktoré sa v NGF a BDNF zúčastňujú tvorby disulfidových môstikov ako bolo opísané v Leibrock a ďalší, 1989, Náture, 341:149-152 a Angeletti, 1973, Biochem., 12:100-115. Úplný NT-3 potkana má 57 % homológie aminokyselín s NGF potkana a 58 % homológie aminokyselín s BDNF potkana. 57 z 120 zvyškov, tj. 48 % zvyškov je spoločných pre všetky tri bielkoviny, ako je zrejmé z obr. 1D. Opäť bolo preukázané, že šesť cysteinových zvyškov NGF a BDNF potkana je zachované celkom bezo zmeny i v NT-3 potkana, pričom oblasti s najväčšou homológiou vo všetkých troch bielkovinách sa nachádzajú práve okolo týchto cysteinových zvyškov.

Okrem homológie medzi NT-3, NGF a BDNF vo vnútri jedného živočíšneho druhu je možné preukázať i vysoký stupeň konzervácie reťazca nukleových kyseelín medzi NT-3 potkana a človeka v oblasti, ktorá je kódom pre úplný polypeptid o 119 aminokyselinách. Gény človeka reťazca DNA približne 92 %.

nukleotidovom reťazci v géne a potkana majú homológiu Avšak žiaden z rozdielov v človeka a potkana v tejto oblasti nevedie k substitúcii aminokyselín a reťazec aminokyselín, odvodený od reťazca nukleotidov pre NT-3 potkana a človeka ako aj myši je celkom totožný, čo pripomína vysoký stupeň konzervácie v prípade BDNF, v ktorom sú reťazce aminokyselín úplného polypeptidu celkom totožné pre potkana, myš, človeka a prasa. Na rozdiel od tejto konzervácie sa reťazce aminokyselín úplného NGF človeka a NGF hlodavcov, napríklad myši alebo potkana od seba líšia približne v 10 %.

Štúdie neurotrófneho účinku NT-3 ukázali, že NT-3 môže podporovať prežívanie a rast nervových buniek v kultúrach disociovaných neurónov ganglií dorzálnych koreňov. Mimo toho, táto látka podporuje rast nervových látok v bunkách g, nodosum a v explantátoch ganglií sympatiku, zatiaľ čo BDNF podporuje rast buniek g. nodosum, avšak nie rast ganglií sympatiku a NGF podporuje rast buniek ganglií sympatiku, avšak nie rast emplantátov g. nodosum. Je teda zrejmé, že NT-3 má vyššiu špecifičnosť účinku ako BDNF alebo NGF.

NT-3 môže byť dôležitou látkou pri vývoji nervového systému. Pri porovnaní pomerne veľkého výskytu transkryptov NGF, BDNF a NT-3 v mozgu novorodených a dospelých potkanov bolo preukázané, že množstvo NT-3 v mozgu novorodených potkanov je vyššie než u dospelých potkanov. Množstvo RNA pre

NT-3 v centrálnom embryonálneho vývoja postupne znižuje až nervovom systéme ďaleko vyššia a bolo na úroveň, ktorú je je v priebehu pozorované, že sa možné pozorovať v mozgovom tkanive dospelých jedincov.

2.2.4 Ciliárny neurotrófny faktor

Ciliárne neurotrófne faktory CNTF sú bielkoviny, ktoré špecificky podporujú prežívanie buniek g. ciliáre v embriách kurčiat in vitro podľa publikácie Manthorpe a. ďalší 1980, J. Neurochem. 34:69-75. G. ciliáre je anatomicky uložené v očnej dutine medzi m. rektus a obalom očného nervu. Je zásobované vláknami parasympatiku z okulomotorického nervu, ktorý inervuje ciliárny sval a zvierač zornice.

Neuróny g. ciliáre sú medzi tými skupinami nervových buniek, pri ktorých dochádza k definovaným obdobiam uhynutia buniek. V g. ciliára kurčaťa bolo preukázané, že polovica nervových buniek, prítomných v embryonálnom dni 8, E8 uhynie pred E14, ako bolo opísané v Landmesser a Pilar, 1974 J. Physiol. 241:737-749. V priebehu tohto časového obdobia vytvárajú neuróny tohto ganglia spojenie medzi cieľovým tkanivom, a to c. ciliáre a choroidným obalom oka. Landmesser a Pilar, 1974, J. Physiol., 241:751-756 pozorovali ,že odstránenie oka pred obdobím hynutia buniek má za následok úplnú stratu nervových buniek ganglia na tej istej strane. Na druhej strane Narayanan a Narayanan, 1978, J. Embryol. Ex. Morphol., 44:53-70 pozorovali, že v prípade implantácie prídavného základu pre oko a tým zvýšením množstva dostupnej cieľového tkaniva je možné znížiť počet uhynutých buniek tohto ganglia. Tieto výsledky sú v súlade s existenciou neurotrófneho faktoru, ktorý pôsobí na nervové bunky g. ciliáre.

Bolo preukázané, že neuróny g. ciliáre CG v kultúre vyžadujú pre svoje prežitie faktor alebo faktory. Účinnosť ciliarneho neurotrófneho prostredí so svalovými

Helfant a ďalší, 1976, faktoru CNTF bola identifikovaná v bunkami kurčaťa podľa publikácií

Def. Biol., 50:541-547, Helfant a ďalší, 1978, Exp. Celí. Es., 113-39-45,

Bennett a Nurcombe,

1979, Brain Res., 173:543-548, Nishi a Berg , 1979, Náture,

277:232-234, Varon a ďalší 1979, Brain Res., 173: 29-45, v extraktoch svalového tkaniva podľa McLennan a Hendry, 1978, Neurosci. Lett., 10:269-273, Bonahandy a ďalší, 1980, Neurosci. Lett., 18:197-201 v extraktoch z kuracieho embrya podľa Varon a ďalší, 1979, Brain Res., 173:29-45, Tuttle a ďalší, 1980, Brain Res., 183:161-180, a v prostredí s bunkami srdcového svalu podľa Adler a ďalší, 1979, Science 204: 1434 -1436 a Barbin a ďalší, 1984, J. Neurochem., 43:1468-1478.

CNTF bol čistený zn. ischiadicus potkana a reťazce aminokyselín z rôznych fragmentov boli stanovené mikroanalýzou v plynnej fáze, výsledný reťazec bol použitý ku klonovaniu génu pre CNTF potkana pri použití PCR-reacie podľa US patentovej prihlášky č. 07/408 172 podanej 15.septembra 1989 a 07/429 517, podanej 31. októbra 1989. Potom bola sonda získaná z CNTF potkana použitá pri klonovaní génu pre CNTF človeka. Poravnanie reťazca nukleových kyselín v génoch pre CNTF človeka a potkana ukázalo, že gén človeka má jediný intrón v tej istej polohe ako gén pre CNTF potkana. Inak sa vnútri intrónu ľudský reťazec podstatne líši od reťazca potkana, čo je v naprostom kontraste s kódovou oblasťou, ktorá je vpodstate konzervovaná.

Podľa nukleotidového reťazca bola pre CNTF predpovedaná molekulová hmotnosť približne 22,8 kJ podľa obsahu približne 200 aminokyselín, tento výpočet je v súlade s prírodné sa vyskytujúcim CNTF, ako bolo preukázané elektroforézou na polyakrylamidovom géle, pri ktorej bola preukázaná molekulová hmotnosť 22,5 kJ podľa Saadat a ďalší, 1989, J. Celí. Biol., 108:1807-1816. Reťazec aminokyselín pre CNTF má teda vlastnosti cytosolickej bielkoviny, to znamená, že nemá žiaden signálny peptid, žiaden odpovedajúci reťazec pre glykosiláciu a len jediný cysteínový zvyšok v polohe 17. Nebolo možné preukázať žiadnú homológiu medzi CNTF a NGF, BDNF alebo rastovým faktorom fibroblastov FGF a purpurínom, pričom všetky tieto látky majú podobný účinok na prežívanie ako CNTF podlá Unsicker a ďalší, 1987 Proc. Natl. Acad.Sci., USA, 84:5459-5463, Schubert a ďalší , 1986, J.Celí. Biol., 102:2295-2301.

Pre CNTF bol opísaný rad biologických účinkov. Ide najmä o prežívanie neurónov g. ciliare u kurčaťa E8, toto ganglion je súčasťou parasympatického nervového systému. Saadat a ďalší, 1989, J. Celí. Biol., 108:1807-1816 pozorovali, že ich najčistší preparát CNTF s ischiadického nervu potkana vyvoláva diferenciáciu neurónov potkanieho sympatika v kultúre. Tiež Hoffman , 1988, J. Nerochem., 51:109-113 preukázal, že účinnosť CNTF, získaného z očného tkaniva kurčaťa zvyšovalo účinnosť cholin-O-acetyltransferázy v kultúrach sietnicových buniek v súvislej vrstve.

Hughes a ďalší, 1988, Náture, 335:70-73 študovali skupinu bipotenciálnych vývojových buniek gliev perinatálnom očnom nerve a v mozgu potkana. Táto skupina buniek zrejme umožňuje vzniknúť oligodendrocytom a neskôr astrocytom typu

2. Podľa uvedených štúdií dochádza k diferenciácii oligodendrocytov z vývojovej bunky oligodendrocyt-astrocyt typu 2 (0-2A) v neprítomnosti rastového faktoru, avšak k diferenciácii sa astrocyty typu 2 dochádza až v prítomnosti špecifickej bielkoviny, ktorá tento vývoj indukuje. Autori pozorovali, že táto bielkovina je podobná alebo totožná s CNTF, ako opísal tiež Anderson, 1989, Trends Neurosci., 12:83-85.

Okrem toho bolo preukázané, že rekombinantný CNTF podporuje prežívanie neurónov mediodorsálnej časti miechy v kultúre že CNTF z potkanieho ischiadického nervu zabraňuje uhynutiu motorických neurónov v poškodenom lícnom nerve novorodených potkanov podľa US prihlášky č. 07/429 517, z 31.

10. 1989.

V tabuľke II sú zhrnuté účinky, vyvolané u rôznych buniek pôsobením NGF, BDNF, NT-3 a CNTF.

Tabuľka II

Bunky, ktoré odpovedajú na jednotlivé neurotrófne faktory

I. Bunky, odpovedajúce na NGF

A. neuróny sympatiku

B. senzorické neuróny odvodené z nervovej ryhy

C. ganglia dorzálnych koreňov E6 až E12

D. cholinergné neuróny bazálnej časti predného mozgu

II. Bunky odpovedajúce na BDNF

A. senzorické bunky, odvodené z nervovej rýhy

i) ganglia dorzálnych koreňov E10/E11 ii) g.jugulare iii) dorsomediálny g. trojklanného nervu iv) jadro pre trojklanný nerv v mesencephale

B. senzorické neuróny z prednej časti nervovej trubice

i) g. nodosum ii) g. vestibuláre iii) g.petrosum iv) g.geniculatum

v) ventrolaterálny g. troklanného nervu

C. sietnicová ganglia

D. ventrálne dopaminergné neuróny mesencephala

E. cholinergné neuróny bazálnej časti predného mozgu.

Tabuľka II- okračovanie

III. Bunky, odpovedajúce na NT-3

A. ganglia dorzálnych koreňov

B. ganglia sympatiku

C. g. nodosum

IV. Bunky, odpovedajúce na CNTF

A. g, ciliare E8

B. cholinergné neuróny sympatiku

C. astrocyty typu 2

D. neuróny mediodorzálnej časti miechy

E. motorické neuróny, napríklad motorické nervové bunky lícneho nervu

F. neuróny DRG E10.

3. Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu tvorí chimérny neurotropný faktor, ktorý je tvorený i) aspoň časťou bunečného faktoru a ii) aspoň časťou iného peptidu. Takto vytvorená chimérna molekula má neurotrófnú účinnosť. Konštrukcia tejto chiméry je založená čiastočne na objave, že chimérne molekuly, obsahujúcečasti NGF BDNF majú neurotrofnú účinnosť a v niektorých prípadoch väčšie spektrum tejto účinnosti než ktorákoľvek z pôvodných molekúl. Ďalej je konštrukcia tejto chiméry založená na zistení, že chimérne molekuly, obsahujúce reťazec neurotrófneho faktorua reťazec ďalšieho peptidu si môžu uchovať neurotrófnu účinnosť a v niektorých prípadoch majú vyššiu účinnosť než pôvodný faktor.

Podľa vynálezu je možné získať kódové nukleové kyseliny pre chimérne neurotrofné faktory. Vynález sa tiež týka spôsobu, pri ktrom je možné dosiahnúť expresie týchto chimérnych neurotrófnych faktorov, bielkovín a peptidových fragmentov pre chimérne neurotrofné faktory á ich deriváty, ďalej protilátok proti chimérnym neurotrófnym faktorom, s ktorých pomocou je možné definovať determinanty určujúce špecifičnosť týchto látok. Uvedené látky je možné použiť na diagnodtiku a na liečenie neurologických porúch. Vynález sa tiež týka radu špecifických rekombinantných plazmidov, v ktorých je uložený kód pre biologicky aktívne neurotrofíny.

Chimérne neurotrófne faktory podľa vynálezumajú rad výhod v porovnaní s prírodné sa vyskytujúcimi sa neurotrófnymi faktormi. Tieto chimérne faktory môžu napríklad mať v jedinej molekule účinnosť dvoch neurotrófnych faktorov alebo môžu slúžiť ako superagonitrické látky endogénneho neurotrófneho faktoru, čím je umožnená zvýšená biologická odpoveď pri nižšej dávke. Okrem toho môžu byť tieto chimérne faktory podľa vynálezu vynálezu využité k zacieleniu účinnej látky na bunky, ovplyvnené neurotrófnym faktorom.Okrem toho bude pravdepodobne možné konštruovať chimérne; faktory, ktoré si udržia špecifický biologický účinok, avšak ovplyvnia len určitú skupinu buniek, tak, že liečivý účinok bude.zachovaný, avšak súčasne dôjde k odstráneniu vedľajších účinkov alebo komplikácií, spôsobených príliš širokou účinnosťou pôvodnej látky.

4.Popis výkresov

Na obr. 1 je schématicky znázornený postup, ktorý sa používa pri konštrukcii chimérneho BDNF-NGF pri použití troch oligonukleotidových primérov a jednostupňovej PCR-reakcie . Primery boli vybrané tak, aby reakčný produkt obsahoval miesto pôsobenia reštrikčných enzýmov Nar 1 a Not 1, čo uľahčí uloženie tohto produktu za preprooblasť pre BDNF v plazmide pC8hB(Pl) pre expresiu. Šrafované oblasti znamenajú reťazec pre NGF, prázdne oblasti reťazec pre BDNF.

Na obr. 2 je schematicky znázornená konštrukcia chimérneho BDNF-NGF pri použití štyroch oligonukleotidových primérov a trojstupňovej PCR-reakcie. Šrafované úseky znamenajú reťazce pre NGF a prázdne reťazce pre BDNF.

Na obr. 3 je znázornený diagram postupu, použitého pri konštrukcii chimérneho neurotrofného faktoru, značeného myc.

A. Konštrukcia NGF, označovaného reťazcom myc, ktorý je šrafovaný, prázdne oblasti znamenajú reťazec NGF.

B. Konštrukcia BDNF, označovaného reťazcom myc, ktorý je opäť šrafovaný, prázdne oblasti znamenajú reťazec BDNF.

Na obr. 4 je znázornený výsledok elektroforézy. 50 mikrolitrov supernatantu S-značených buniek COS bolo delené na 15 % SDS PAGE a značené bielkoviny boli elektroforeticky prenesené na nylonovú membránu. Táto membrána bola exponovaná cez noc a výsledný autorádiograf bol vyfotografovaný. V dráhe 1 je kontrola, tj. bunky COS po zdanlivej transformácii.V dráhe 2 je BDNF človeka. Vdráhe 3 je hBDNF/3 myc (BM1), v dráhe 4 je mHGF a v dráhe 5 mNGF/3 myc (NM1). Sú uvedené štandardy pre molekulovú hmotnosť.

Na obr. 5 sú odvodené reťazce aminokyselín pre chymérne neurotrófne faktory R1 až RIO, BM1 a NM1.

Na obr.6 je znázornený výsledok kolorimetrického stanovenia MTT pre gangliá zadných koreňov DRF alebo gangliá sympatiku SG po pôsobení A) BDNF, B) NGF alebo C) BM1, tj. BDNF, značený myc. Absorbcia pri 570 až 650 nm je znázornená ako funkcia riedenia supernatantu buniek COS s neurotrófnym účinkom.

Na obr. 7 je schématicky znázornená konštrukcia chimérneho NGF-BDNF pri použití štyroch oligonukleotidových primerov á trojstupňovej PCR reakcie. Primer A je primer T7, primery Ba C sú uvedené v tabuľke 10 a líšia sa od seba v rôznych chimérnych produktoch, primer D je primer T3. Vyšrafované oblasti sú reťazce vektoru, prázdne oblasti znamenajú preproreťazec, riedko vybodkované oblasti sú

reťazce	NGF a	husto vybodkované oblasti sú reťazce BDNF	•
Na	obr .	8 A. je zznázornený	modifikovaný vektor	pBJ-5,
použitý	pri	expresii chimérneho	faktoru NGF-BDNF.	Tento

vektor označuje gén pre odolnosť proti ampicilínu, ktorý je označený ako plná šípka, začiatok replikácie z plazmidu pBR322 je označený prázdnou šípkou, promotor SR bodkovanou šípkou podľa Takebe a ďalší, 1988, Mol, Celí. Biol.,8, 466 až 472 a miesto pre klonovanie , znázornené šrafovanou šípkou a obsahujúce spojenie zostrihu,miesto pre póly A a miesta štiepenia reštrikčných endonukleáz Not 1, Sac II a Eco R1.

B. sú znázornené výsledky

COS po transfekcii divým

Na obr.

nia buniek kontroly a chimérami SI až S12 40 mikro litrov supernatantu elektroforéza bola robená na géle.

metabolického značetypom NGF, vektorom ako NGF-BDNF. Nanesené bolo vždy buniek COS priamo na gél,

12,5 % SDS-polyakrylamidovom

Na obr. 8 C. je znázornený výsledok metabolický značených bielkovín v supernatantoch buniek COS po transfekcii divým typom NGF, len vektorom ako kontrola a chimérami SI až S12 na SDS polyakrylamidovom géle, chimériy boli imunologický zrážané protilátkou proti NGF. Imunologické zrážanie bolo vykonané v 400 mikrolitroch supernatantu, na elektroforézu bol použitý 12,5 % SDS-polyakrylamidový gél.

Na obr. 9 je znázornený diagram chimérnych produktov SI až S12, v ktorých prázdné časti znamenajú reťazce NGF a vybodkované časti znamenajú reťazce BDNF.

A. Horná časť : porovnanie reťazcov aminokýselín molekúl NGF, izolovaných z rôznych živočíšnych druhov.

B. Spodná časť : porovnanie reťazcov aminokyselín medzi reťazcami NGF a BDNF.

Vysoké stĺpce : vysokovariabilné aminokyseliny sa v tejto polohe môžu vyskytovať.

Nízke stĺpce : v tejto polohe sa môžu vyskytovať len konzervatívne kmene aminokyselín.

Úseky bez stĺpca : aminokyseliny v tejto polohe su konzervované vo všetkých známych typoch NGF a BDNF.

Na obr. 10 je znázornený odvodený reťazec aminokyselín pre chimérne neurotrofné faktory SI až S12.

Na obr. 11 je znázornený reťazec aminokyselín NGF, BDNF a NT-3. Šípky ukazujú polohy cysteinových zvyškov. Nad reťazcom sú znázornené polohy variabilných oblastí VI až V4.

5.Podrobný opis vynálezu

Pre väčšiu jasnosť avšak nie pre obmedzenie rozsiahleho vynálezu bude podrobný opis vynálezu rozdelený do následujúcich odstavcov:

i) chimérne neurotrófne faktory podľa vynálezu, ii) konštrukcia chimérnych neurotrófnych faktorov, iii) expresia chimérnych neurotrófnych faktorov, iv) skúšky na účinnosť a špecifičnosť neurotrófnych chimérnych faktorov pre určité neuróny,

v) protilátky proti chimérnym neurotrófnym faktorom, vi) využitie vynálezu.

5.1. Chimérne neurotrófne faktory podľa vynálezu

Vynález sa týka chimérnych neurotrófnych faktorov, ktoré

i) obsahujú aspoň časf bunečného faktora a aspoň časf aspoň jednej ďalšej bielkoviny a ii) majú neurotrófnu účinnosť. Tietochimérne potreby podľa vynálezu môžu obsahovať bunečné faktory, alebo časti faktorov, ktoré môžu alebo nemusia mať neurotrofný účinok, napríklad NGF, BDNF, NT-3, CNTF, rastový faktorfibroblastov a to faktory kyslej i bázickej povahy, epidermálny rastový faktor, faktor beta rastu nádorov, faktor alfa rastu nádorov, interleukin 1, interleukin 2, alfa-interferon, beta-interferon, gamma-interferon, rastový hormón, vazoaktivny črevný peptid vazopresín a inzulín.

Chimérne molekuly podľa vynálezu obsahujú aspoň časť bunečného faktoru a časť aspoň jedného peptidu alebo bielkoviny, táto zložka môže alebo nemusí byť odvodená od zlúčeniny s neurotrofným účinkom. Môže ísť napríklad o celé molekuly alebo časti molekúl neurotrofného faktoru, bunečného faktoru, toxínu, enzýmu, imunoglobulínu alebo akéhokoľvek iného peptidového reťazca, ktorý môže alebo nemusí mať funkčné účinky a môže alebo nemusí mať antigenné vlastnosti.

Podľa vynálezu je napríklad možno získať následujúce chimérne molekuly, ktoré majú neurotrofný účinok, ako bude ďalej preukázané v odstavci 5.4.

i) chimérnu molekulu, obsahujúcu dva na seba viazané úplné neurotrófne fakktory, ii) chimérnu molekulu, obsahujúcu úplný neurotrofný faktor, viazaný na úplný bunečný faktor bez neurotrófneho účinku, iii) chimérnu molekulu, ktorá obsahuje dve časti, zktorých každá je časťou neurotrófneho faktoru, iv) chimérnu molekulu, ktorá obsahuje časť neurotrofneho faktoru a časť bunečného faktoru bez neurotrofneho účinku,

v) chimérnu molekulu, ktorá obsahuje aspoň časť neurotrofného faktoru a peptidový reťazec, ktorý môže alebo nemusí mať antigénne vlastnosti a vi) chimérnu molekulu, ktorá obsahuje aspoň časti dvoch neurotrofnych faktorov a peptidový reťazec, ktorý môže alebo nemusí mať antigénne vlastnosti.

Chimérne neurotrofné faktory podľa vynálezu môžu byť viazané tiež na nepeptidové zlúčeniny. Môže byť napríklad žiadúce naviazať na chimérny neurotrofný faktor uhľohydrát, lipidovú skupinu alebo inú organickú zlúčeninu. Také zlúčeniny zahrnujú toxické látky, antiproliferatívne látky, vysokoimunogénne látky, angiogénne látky, antiangiogénne látky, koagulačné látky, antikoagulačné látky, fluorescenčné zlúčeniny, rádioaktívne látky a podobne.

V prípade, že sa kombinujú časti neurotrofneho faktoru alebo iného bunečného faktoru a ďalšieho neurotrofneho alebo bunečného faktoru, môže byť žiadúce konštruovať chimérnu molekulu tak, aby časť jedného faktoru bola vypustená a potom nahradená časťou iného faktoru, čo znamená, že by bola udržaná približná veľkosť molekuly jedného z pôvodných faktorov. Okrem toho v prípade, že oba faktory obsahujú homologné oblasti, je výhodné tieto oblasti vymeniť, čím vznikne chimérna molekula, ktorá je homológna s oboma pôvodnými faktormi, je však od nich odlišná. V ďalšom prevedení je možnosť nahradiť určitú oblasť vo faktore, ktorá má malú funkciu oblasti z iného faktoru alebo iného peptidu, ktorá je pravdepodobne biologicky účinnejšia. Taký chimérny produkt potom môže mať vyššiu biologickú účinnosť v porovnaní s pôvodnými faktormi. Je tiež možné určitú oblasť vo faktore, pravdepodobne spojenú s nežiadúcim biologickým účinkom nahradiť časťou iného faktoru alebo iného peptidu tak, aby bolo možné túto nežiadúcu účinnosť znížiť alebo celkom odstrániť. Prevedenie tohto typu možno použiť najmä pri príprave chimérnych neurotrófnych faktorov s čo najmenšími nežiadúcimi vedľajšími účinkami alebo toxicitou.

Pre chimérne molekuly podľa vynálezu môžu byť kódom reťazca nukleových kyselín, v ktorých je reťazec kódujúci určitý bunečný faktor prerušený kódovým reťazcom pre peptid alebo bielkovinu, takže chimérny neurotrofný faktor pre ktorý je kódom taká molekula, bude charakterizovaný vloženým reťazcom vnútri svojho vlastného reťazca. Okrem toho podľa vynálezu možno vykonávať spojenie medzi aspoň časťou faktoru a ďalšieho peptidu na aminoterminálnom i na karboxyterminálnom zakončení.

V niektorých prípadoch sa po výmene homológnych úsekov v dvoch faktoroch môže chimérna molekula líšiť od jedného z pôvodných faktorov jedinou aminokyselinou. Také chimérne neurotrófne faktory podľa vynálezu môžu byť veľmi užitočné, ich príkladom môžu byť napríklad chiméry S-6 a S-ll, ktoré budú podrobnejšie opísané v odstavci 8.

Vo výhodnom prevedení vynálezu je možné vytvoriť chimérne neurotrófne faktory tak, že sa zamenia odpovedajúce časti príbuzných neurotrófnych faktorov. V špecifickom výhodnom prevedení vynálezu obsahuje chimérna molekula neurotrófneho faktoru časti dvoch alebo väčšieho počtu členov až dosiaľ identifikovanej skupiny neurotrofinov vrátane NGF, BDNF, NT-3, je veľmi pravdepodobné, že budú identifikované ešte ďalšie látky z tejto skupiny. Podľa špecifického prevedenia možno usporiadať časti molekúl týchto látok tak, aby sekundárny a/alebo terciálna štruktúra , molekuly bola zachovaná. V ďalšom prevedení je možné do týchto látok uložiť peptidové reťazce látok, odlišných od neurotrofinov, alebo je možné v géne pre tieto látky nahradiť kódový reťazec alebo časť kódového reťazca pre tieto látky kódovým reťazcom pre peptid, odlišný od neurotrofinov tak, že sekundárna a/alebo terciálna štruktúra neurotrofínu bude zachovaná. Pod pojmom sekundárna a/alebo terciálna štruktúra sa v tomto zmysle rozumejú reťazce a štruktúrne a chemické vlastnosti, ktoré sú spoločné všetkým zlúčeninám zo skupiny neurotrofinov, najmä ide o dĺžku reťazca približne 120 zvyškov aminokyselín, hodnotu pív rozmedzí približne 9 a 10 a o šesť cysteinových zvyškov, uložených (v rozmädzí približne piatich aminokyselín ) v polohách 14,57,67,79,108 A 110 v rozmädzí možných vypustených alebo vložených reťazcov v homológnom reťazci, ktorý je spoločný zlúčeninám z tejto skupiny. Napríklad v reťazci NGF rýb sa nachádza v mieste aminokyseliny č . 65 vložený reťazec s 22 pármi báz, ktorý pravdepodobne vytvára slučku zvonku reťazca, takže ináč zodpovedá štruktúra zvyšku molekuly štruktúre NGD cicavcov. Vo výhodnom špecifickom neurotrofné zlúččeniny cysteinovými výhodnej šom neurotrofné zvyškov vo špecifických molekula uvedených prevedení podľa vynálezu možno faktory, ktoré obsahujú aspoň i zo skupiny zvyškami vo špecifickom faktory podľa vyššie uvedených polohách, uskutočneniach vynálezu všetkých šesť cysteinových polohách. V ďalšom výhodnom > získať chimérne časť aspoň neurotrofínovs aspoň vyššie uvedených polohách.

prevedení obsahujú chimérne vynálezu aspoň päť cysteinových V najvýhodnejších obsahuje chimérna zvyškov vo vyššie uskutočnení vynálezu jednej štyrmi V ešte obsahujú chimérne neurotrofné faktory aspoň štyri cysteinové

2Ί zvyšky v horeuvedených polohácha ich pi je v rozmedzí 9 až 10. V ešte výhodnejšom uskutočnení vynálezu obsahujú chimérne neurotrofné faktory aspoň päť cysteinových zvyškov v horeuvedených polohách a ich pi je v rozmedzí 9 až 10. V najvýhodnejšom špecifickom uskutočnení vynálezu obsahujú chimérne molekuly všetkých šesť cysteinových zvyškov v horeuvedených polohách a ich pi sa pohybuje v rozmedzí 9 až 10.

Vynález sa týka tiež nukleových kyselín s kódovými reťazcami pre chimérne neurotrofné faktory vo forme bielkovín a ich peptidových fragmentov a derivátov. Vo výhodných uskutočneniach vynálezu obsahuje chimérny neurotrfný faktor časť aspoň jednej zlúčeniny z tejto skupiny, vyššie uvedené, ide napríklad o časť reťazca ako už bolo

NGF, BDNF a

NT-3', tieto reťazce sú znázornené na obr. 11. Vo výhodných špecifických uskutočneniach vynálezu majú chimérne neurotrofné faktory reťazec aminokyselín, ktorý je uvedený na obr. 5 a 10 pre chimérne molekuly R1 až RIO, BM1, NM1 a SI až S12. Molekuly chimérnych neurotrófnych faktorov podľa vynálezu zahrnujú, avšak nie sú obmedzené na tieto látky, ktoré obsahujú vo svojom primárnom reťazci aminokyselín celý reťazec alebo časť reťazca podľa obr. 5 a 10, včetne pozmenených reťazcov, v ktorých sú použité funkčne ekvivalentné aminokyseliny namiesto niektorých aminokyselín v reťazci, takže vzniká tichá mutácia. Je možné napríklad nahradiť jednu alebo väčší počet aminokyselín v reťazci iným zvyškom aminokyseliny s podobnou polaritou, ktorý je funkčným ekvivalentom, čím vzniká tichá zmena. Náhrady pre zvyšok aminokyseliny v reťazcimožno voliť z ďalších členov skupiny aminokysalín, do ktorých nahradená aminokýselina patrí. Napríklad do skupiny nepolárnych, to znamená hydrofóbnych aminokyselín možno zaradiť alanín, leucin, izoleucin, valin, /

prolin, fenylalanin, tryptofan a metionin. Medzi polárne neutrálne aminokyseliny patrí glycín, serín, threonín, cysteín,tyrozín, asparagin a glutamín. Kladne nabité bázické aminokyseliny sú arginín, lyzín a histidín. Aminokyseliny s negatívnym nábojom, tj. kyslé aminokyseliny sú kyselina asparagová a kyselina glutámová. Vynález zahŕňa tiež chimérne neurotrofné faktory voforme bielkovín alebo ich peptidových fragmrntov alebo derivátov, ktoré sú modifikované v priebehu translácie alebo po translácii napríklad glykosilaciou, proteolytičkým štiepením väzbou na molekulu protilátky alebo na iný väzbový reťazec bunečného pôvodu a podobne. Vynález sa r týka tiež molekúl nukleových kyselín, ktoré su kódovými reťazcami pre reťazec aminokyselín z obr. 5až 10 alebo pre časť tohto reťazca alebo pre jeho funkčné ekvivalenty. Okrem toho sa vynález týka tiež plazmidov pBJ51inN/hB-Sl až S12, pC8hB/hN-Rl až 10, pC81mN/myc-NMl a pC8hB/myc-BMl, tak ako budú podrobnejšie opísané v odstavci 10, ako aj reťazcov nukleových kyselín, ktoré tieto plazmidy obsahujúa ktoré a ktoré sú kódovými reťazcami pre chimérne neurotrofné faktory.

Vynález sa rovnako týka chimérnych neurotrofných faktorov, ktoré obsahujú bunečné faktory, odvodené od akéhokoľvek živého organizmu včetne človeka, opice, prasaťa, ovce, dobytka, koňa, psa, mačky, hlodavcov alebo vtákov.

5.2 Konštrukcia chimérnych neurotrofných faktorov

Nukleové kyseliny, ktoré sú kódom pre chimérne neurotrofné faktory je možné skonštruovať pouitím štandardnej technológie pre tvorbu rekombinantnej DNA, napríklad tak, že sa nukleová kyselina, ktorá je kódom pre bunečné faktory a/aleboiné peptidy, rozštiepi pôsobením reštrikčných enzýmov a upraví sa zostrihom pôsobením DNA-ligázy. Reťazce nukleových kyselín je možné skonštruovať tiež pomocou chemickej syntézy, napríklad syntézou na tuhom nosiči použitím fosfoamidátu. Vo výhodných uskutočneniach vynálezu je možné použiť polymerázové reakcie PCR podľa publikácie Saiki a ďalší, 1985, SCIENCE 230:1350-1354 na úpravu reťazca nukleových kyselín reťazcami, ktoré sa prekrývajú (Horton a ďalší, 1989, Gene, 77:61-68 a tak získať chimérne neurotrofné fakktory podľa vynálezu. Ako bude ďalej uvedené v odstavci 6, je možné neurotrofné faktory získať jednostupňovou reakciou PCR použitím troch oligonukleotidových primérov alebo v troch stupňoch , použitím štyroch oligonukleotidových primérov. Obr. 1 a 2 sú schématickými diagramami týchto dvoch postupov. NNapríklad možno postupovať tak, že sa kódový reťazec nukleovej kyseliny,kódujúci eukaryotický peptid Y, vytvorením troch oligonukleotidových primérov, z ktorých jeden zodpovedá časti reťazca X (X-primer), druhý obsahuje časť reťazca Y (Y-primer) a tertí obsahuje časť reťazca X a časť reťazca Y (Χ,Υ-primer). Môže ďalej byť žiadúce do primérov zaradiť miesta pôsobenia reštrikčných andonukleáz pre lahkú možnosť ďalšieho spracovania. V tabuľke 3 budú uvedené príklady primérov, ktoré je možné použiť pri konštrukcii chimérnej molekuly BDNF-NGF. Uvedené tri oligonukleotidy, ktoré sú na obr. 1 označené ako priméry A, C a B, je možné spolu spojiť pri prevádzaní PCR-reakcie v jednom stupni, pričom je žiadúce, aby v priebehu reakcie boli priméry X a Y prítmné vo väčšom množstve ako primér XY, pomer X : XY : Y môže byť napríklad 100 : 1 : 100. Matricou, použitou pri tejto

PCR-reakcii môže byť zmes nukleových kyselín, ktorá je kódom pre bunečný faktor a bielkovinu alebo peptid, ktoré majú byť naviazané. Poloha miesta väzby sa určuje polohou premosťujúceho nukleotidu, napríklad polohou priméru XY. Je možné použiť podmienky, aké sa v obore bežne používajú pre amplifikáciu, napríklad 1 minúta pri teplote 94 ®C, 2 minúty pri teplote 43 ®C a 3 minúty pri teplote 72 ®C, prevádza sa cyklov pri použití štandardných roztokov.

a postupov pre PCR reakciu. Výsledný PCR-fragment je potom možné čistiť elektroforézou na géle, rozštiepiť príslušnými reštrikčnými endonukleázami a potom uložiť do vhodného vektoru pre klonovanie.

Je tiež možné postupovať tak, ako je znázornené na obr.

2. Vtomto prípade sa prevádza PCR-reakcia v troch stupňoch pri použití štyroch oligonukleotidov. Oligonukleotidy, ktoré je možné použiť napríklad na získanie chimérnych molekúl BDNF, NGF alebo NGF-BDNF, sú uvedené v tabuľkách 4 a 10. Aby bolo možné dosiahnuť spojenie nukleotidových reťazcov X a Y, je možné skonštruovať nasledujúce priméry : primér X, odpovedajúci reťazcu X, ide o primér A na obr. 2, primér Y, odpovedajúci reťazcu Y, ide o primér D na obr. 2, primér XY, obsahujúci časť reťazca X a Y, ide o primér B na obr. 2, a primér XY , tiež obsahujúci časť reťazca X a Y a naviac homológny k priméru XY, ide o primér C na obr. 2. Pri prvej PCR-reakcii sa priméry X a XY amplifikujú pri použití reťazca X ako matrice, čím vzniká nukleová kyselina, obsahujúca časti reťazca X a Y. Pri ďalšej PCR-reakcii sa amplifikujú priméry Y a XY pri použití reťazca X ako templátu čím sa získa reťazec nukleovej kyseliny obsahujúcej časti reťazca X a Y, prekrývajúci sa s časťou Y molekuly nukleovej kyseliny, získanej pri prvej PCR-reakcii. V prípade, že sa produkty oboch týchto reakcií spoja a ďalej amplifikujú pomocou PCR, je možné získať molekuly nukleovej kyseliny, obsahujúce vloženú časť Y v reťazci X. Je možné použiť tiež modifikáciu tohto postupu použitím dvoch od seba odlišných matríc. Potom je možné použiť PCR-reakciu, čistenie produktu tejto reakcie a štiepenie pôsobením reštrikčných endonukleáz tak, ako bolo popísané zhora za účelom klonovania génu pre výsledný chimérny neurotrofný faktor.

Reakčné produkty je možné klonovať použitím akéhokoľvek známeho postupu. Na klonovanie získanej DNA je možné použiť veľký počet systémov vektor-hostiteľ, tak ako sú v obore bežne používané. Použiteľnými vektormi môžu byť napríklad kozmidy, plazmidy alebo modifikované vírusy, jedinou požiadavkou je, aby systém vektoru bol kompatibilný so zvolenou hostiteľskou bunkou. Vhodnými vektormi môžu byť tiež bakteriofágy, napríklad ich deriváty lambda, a ďalej

R plazmidy, napríklad pBR322, pUC alebo plazmid Bluescript (Strategene) a jeho deriváty. Rekombinantné molekuly je možné zaviesť do hostiteľských buniek pomocou transformácie, transfekcie, infekcie, otvorením pórov pôsobením elektrického prúdu a podobne.

5.3. Expresia chimérnych neurotrofných faktorov

Nukleotidový reťazec, ktorý je kódom pre chimérny neurotrofný faktor vo forme bielkoviny alebo pre časť tohoto faktora je možno uložiť do vhodného vektoru pre expresiu, to znamená do takého vektoru, ktorý obsahuje všetky prvky, ktoré sú nevyhnutné pre transkripciu a transláciu kódového reťazca pre bielkovinu, uloženého do vektoru. Potrebné signály pre transkripciu a transláciu môžu byť uložené tiež súčastne s nativným génom pre chimérny neurotrofný faktor a/alebo súčastne s oblasťami, ktoré ležia za okrajom tohoto génu.

Na expresiu kódového reťazca pre bielkovinu je možné použiť celý rad systémov hostiteľ-vektor. Môže napríklad isť o systémy buniek cicavcov, ktoré boli infikované vírusom, napríklad vírusom čierných kiahní, adenovirusom a pod., ďalej o sytémy hmyzových buniek, ktoré boli infikované vírusum, napríklad bakulovírusom, ďalej o mikroorganizmy, napríklad kvasinky, obsahujúce kvasinkové vektory, alebo tiež o baktérie, transformovanej DNA bakteriofágu, DNA plazmidu alebo DNA kozmidu. Prvky týchto vektorov pre zaistenie expresie sa od seba líšia svojou účinnosťou a špecifičnosťou. V závislosti na použitom systéme je možné úžiť akéhokoľvek z veľkého počtu prvkov pre transkripciu a transláciu.

Pre konštrukciu vektorov pre expresiu s obsahom génu pre chimérny neurotrofný faktor a príslušných riadiacich signálov pre transkripciu a transláciu je možné použiť akýkoľvek postup, ktorý už bol popísaný pre uloženie fragmentov DNA do vektorov pri použití kódového reťazca , pre akúkoľvek bielkovinu. Medzi tieto známe postupy patrí konštrukcia rekombinantnej DNA a syntetické postupy, prevádzané in vitro a tiež genetická rekombinácia prevádzaná in vivo. Expresia reťazca nukleovej kyseliny, ktorý je kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor vo forme bielkoviny, alebo peptidového fragmentu je možné riadiť pomocou druhého reťazca nukleových kyselín, takže k expresii chimérneho neurotrofného faktoru vo forme bielkoviny, alebo peptidového fragmentu dochádza v bunke hostiteľa transformovaného rekombinantnou molekulou DNA. Napríklad expresiu chimérneho neurotrofného faktoru je možné riadiť akýmkoľvek známym prvkom, ktorý obsahuje promótor a zosilňovač transkripcie. Promótory, ktoré je možné použiť na riadenie expresívne chimérneho neurotrofného faktoru sú napríklad promótor cytomegalovírusu CMV časná oblasť promótoru SV40 podľa Bernoist a Chambon, 1981, Náture, 290:304-310, promótor obsiahnutý v 3 -dlhom terminálnom opakovaní vírusu Rousova sarkomu podľa Yamamoto a ďalší, 1980, Celí, 22:787-797, promotor pre tymidinkinázu z vírusu herpesu podľa Vagner a ďalší, 1081, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 78:144-1445, riadiaci reťazec génu pre matallotionin podľa Brinster a ďalší, 1982, Náture, 296:39-42, ďalej vektory vhodné pre expresiu prokaryotických bunkách, napríklad promótor génu pre beta laktamázu podľa Villa-Komaroff a ďalší, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75:3727-3731, alebo tac-promótor podľa DeBoer a ďalší, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80:21-25, odkázať je možno tiež na článok Useful proteins from recombinant bacteria, Scientific Američan, 1980, 242:74-94, ďalej je možno použiť rastlinné vektory na expresiu, obsahujúce oblasť promótoru pre nopalinsyntetázu podľa Herrera-Estrella a ďalších, Náture, 303:209-213, alebo RNA-promótor vírusu 35S mozaiky karfiolu podľa Gardner a ďalší, 1981, Nucl. Acids Res., 9:2871, a prmótor pre fotosyntetický enzým ribulosobifosfátkarboxylázu podľa Herrera-Estrella a ďalších, 1984, Náture 3010': 115-120 , ďalej je možné použiť prvky promótorov z kvasiniek, alebo iných húb, napríklad promótor Gal 4, promótor ADC pre alkoholdehyďrogenázu, promótor PGK pre fofsoglycerolkinázu, promótor pre alkalickú fosfonázu a tiež nasledujúce riadiace oblasti pre transkripciu u živočíchov, ktoré sú špecifické pre určité tkanivá a boli už použité pri transgenických živočíchoch, ide napríklad o riadiacu oblasť génu pre elastázu I, ktorá je účinná v bunkách pankreatických ostrovčekov podľa Swift a ďalší, 1984, Celí, 38:639-646, Ornitz a ďalší, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant.Biol.50: 399-409, McDonald, 1987, Hepatology, 7:425-515, riadiaca oblasť génu pre inzulín, ktorá je aktívna v pankreatických beta-bunkách podľa Hanahan, 1985, Náture, 315:115-12, riadiaca oblasť génu pre imunoglobulín, ktorá je účinná v lymfoidných bunkách podľa Grosschedl a ďalší, 1984, Celí, 38:647-658, Adames a ďalší, 1985, Náture, 318:533-538, Alexander a ďalší, 1987, Mol.Celí.Biol., 7:1436-1444, riadiaca oblasť z vírusu nádoru mliečnej žľazy u myší, ktorá je účinná v bunkách samčích pohlavých žliaz, mliečnej žľazy a v lymfoidných a tukových bunkách podľa Ledera a ďalších, 1986, Celí., 45:485-495, riadiaca oblasť génu pre albumín, ktorá je účinná v pečeni podľa Pinkert a ďalší, 1987, Genes and devel., 1:268-276, riadiaca oblasť génu pre alfa-fetoproteín, ktorá je účinná v pečeni, Krumlauf aďalší, 1985, Mol. Celí. Biol., 5:1639-1648, Hammer a ďalší 1987, Science, 235:53-58, riadiaca oblasť génu pre alfa-l-antitrypsín, ktorá je rovnako účinná v pečeni podľa Kelsey a ďalší, 1987, Genes and Devel., 1:161-171, riadiaca oblasť génu pre beta-globín, ktorá je účinná v myeloidných bunkách podľa Mogram a ďalší, 1985, Náture, 315:338-340, Kollias a ďalší, 1986, Cel, 46:89-94, riadiaca oblasť génu pre bázickú bielkovinu myelin, ktorá je účinná v oligodendrocytoch mozgu podľa Readhead a ďalší, 1987, Celí, 48:703-712, riadiaca oblasť génu pre ľahký reťazec myosínu, ktoráo je účinná v bunkách kostrových svalov podľa Sani, 1985, Náture,

314:283-286 a riadiaca oblasť génu pregonadotropný hormón, ktorá je účinná v hypotalame, podľa Mason a ďalší, 1986,Science, 234:1372-1378.

Vektory pre expresiu, obsahujúce vložené gény pre chimérne neurotrofné faktory možno identifikovať pomocou troch všeobecných postupov:

a) hybridizáciou DNA-DNA,

b) prítomnosťou alebo neprítomnosťou vlastností, ktoré sú dôsledkom prítomnosti značiacich génov a

c) podľa expresie uloženého reťazca.

Pri prvom postupe možno preukázať prítomnosť cudzorodého génu, uloženého do vektoru pre expresiu hybridizáciou DNA-DNA použitím sond s obsahom reťazcov, ktoré sú homológne vzhľadom k reťazcom génu pre chimérny neuroptrfný faktor. Pri druhom z uvedených postupov je možné identifikovať systém rekombinantný faktor a hostiteľ na základe prítomnosti alebo neprítomnosti určitej vlastnosti, ktorá vzniká zaradením značiaceho génu. Môže ísť o účinnosť tymidinkinázy, odolnosť voči antibiotikám, o fenotyl, ktorý je dôsledkom transformácie, o tvorbu oklúznych teliesok v prípade bakulovírusu a podobne. Napríklad v prípade, ak je gén pre chimérny neurotrofný faktor uložený v oblasti značiaceho génu vo vektore, je možné rekombinanty, ktoré obsahujú chimérny neurotrofný faktor identifikovať neprítomnosťou funkcie, vznikajúcej v dôsledku uloženia značiaceho génu. Pri treťom základnom postupe je možné vektory s obsahom rekombinantného génu pre expresiu identifikovať tak, že sa dokáže produkt expresie cudzorodého génu. Tieto skúšky môžu byť napríklad založené na fyzikálnych alebo funkčných vlastnostiach produktu génu pre chimérny neurotrofný faktor v systémoch pre vykonávanie biologických skúšok, ako bude ďalej podrobnejšie opísané v odstavci 5.4. ,

Akonáhle je identifikovaná a izolovaná určitá rekombinantná molekula DNA, je možné na jej množenie použiť rad známych postupov. Akonáhle je vytvorený vhodný hostiteľský systém a sú upravené vhodné rastové podmienky, je možné získať rekombinantné vektory pre expresiu vo veľkom množstve. Ako už bolo horeuvedené, je možné použiť rad vektorov pre expresiu napríklad vektory vírusov človeka alebo iných živočíchov, ako sú vírusy čiernych kiahní alebo adenovírus, ďalej hmyzie vírusy,napríklad bakulovírus, vektory z kvasiniek, bakteriofágy, napríklad lambda a vektory typu plazmidov alebo kozmidov.

Okrem toho je možné voliť taký kmeň hostiteľských buniek, ktorý môže meniť alebo upravovať expresiu uložených reťazcov alebo môže modifikovať a spracovávať produkt zvoleného génu špecifickým požadovaným spôsobom. Expresiu dôsledkom určitých promótorov je ešte možné zvýšiť v prítomnosti niektorých induktorov, teda je možné riadiť expresiu geneticky skonštruovaného chimérneho neurotrofneho faktoru. Okrem toho majú rôzne hostiteľské bunky určité vlastnosti a špecifické mechanizmy pre spracovanie a modifikáciu bielkovín v priebehu translácie a po translácii, ide napríklad o glykosyláciu alebo o štiepenie bielkovín. K zaisteniu požadovanej modifikácie alebo spracovania cudzorodej bielkoviny je možné voliť vhodné bunečné línie alebo hostiteľské systémy ku expresii ktorých .dochádza. Napríklad expresiu v bakteriálnom systéme možno použiť na získanie neglykosylovaného bielkovinného produktu. Pri expresii v kvasinkách sa naopak získa glykosylovaný produkt. Expresiu v bunkách cicavcov možno použiť na zaistenie natívnej glykosylácie heterológnej bielkoviny s obsahom chimérneho neurotrofneho faktoru. Okrem toho je možné rôznych napríklad prostredníctvom rôznych systémov expresie použitím vektorov a hostiteľov uskutočniť spracovanie, proteolytické štiepenie v rôznom rozsahu.

V špecifických uskutočneniach je možné expresiu. kódovej DNA pre chimérne neurotrofné bunkách COS, ako sa ďalej uvedie v častiach 6 a 8. identifikuje rekombinanta, neurotrofného produkt. Toto na fyzikálnych sa chimérneho dosiahnúť faktory v Akonáhle ktorá môže zaistiť expresiu faktoru, mal by sa analyzovať gén je možné dosiahnúť pomocou skúšok alebo funkčných vlastnostiach propre tento založených duktu ako sa uvádza v následujúcej časti 5.4.

Akonáhle sa identifikuje bielkovina s obsahom chimérneho neurotrofneho faktoru, je ju možné izolovať a čistiť bežnými postupmivrátane chromatografie, napríklad chromatografie na ionomeniči, afinitnej chromatografie a chromatografie pre delenie zložiek podľa molekulovej hmotnosti, ďalej odstredením, využitím rôznej rozpustnosti alebo akýmkoľvek iným bežným spôsobompre čistenie bielkovín.

Okrem toho sa bielkoviny a peptidy na báze chimérnych neurotrofných faktorov dajú získať bežne uskutočňovanými štandardnými postupmi pre chemickú syntézu peptidov.

5.4. Skúšky na účinok chimérnych neurotrofných faktorov

Chimérne neurotrofné faktory podľa vynálezu majú neurotrofnú účinnosť. To znamená, že majú biologický účinok na bunky nervového systému, napríklad na nervové bunky, astrocyty, bunky glie, oligodendrocyty, bunky mikroglie a Schwannove bunky. Biologický účinok spočíva v zmene štruktúry a/alebo fyziológie buniek nervového systému, ku ktorému nedochádza bez priameho alebo nepriameho vystavenia účinkom neurotrofného faktoru. Ide napríklad o predlženú dobu prežívania, o rast nervových vlákien,udržanie alebo vznik diferencovaných funkcií, napríklad expresie enzýmu, ako je cholinacetyltransferáza alebo tyrozínhydroxyláza alebo naopak môže ísť o uhynutie alebo stárnutie buniek alebo o ich dediferenciáciu.

Prítomnosť neurotrofnej účinnosti je možné stanoviť použitím akýchkoľvek známych skúšok na túto účinnosť aj systémov, ktoré budú v budúcnosti vyvinuté. Môže sa jednať o skúšky in vitro, napríklad v kultúrach tkanivových explantátov, buniek z týchto tkanív alebo imortalizovaných bunečných línií, odvodených napríklad od tkaniva mozgu, tkaniva miechy alebo periférneho nervového systému alebo sa môže jednať o skúšky in vivo, pri ktorých sa chimérny neurotrofný faktor podáva pokusným zvieratám, neurotrofne účinky je potom možné dokázať chemickými alebo histologickými skúškami alebo dôkazom zmeny chovania. Okrem toho je chimérny neurotrofný faktor možné uložiť do transgénu živočícha, odlišného od človeka a potom zistiť dosiahnuté biologické účinky.

Neurotrofnú účinnosť možno merať napríklad akýmkoľvek z následujúcich známych systémov vykonávania biologických skúšok:

i) systém s využitím ganglií dorzálnych koreňov podľa publikácie Barde a ďalší, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:1199-1203, ii) systém s využitím nodosných ganglií podľa publikácie Lindsay a ďalší, 1985, Dev. Biol., 112:319-328 iii) iv)

v) vi) vii) viii) skúška s využitím ganglií sympatiku, ktorá bola opísaná v publikácii Barde a ďalší, 1982, EMBO J., 1:549-553, skúška s využitím buniek ganglionciliare opísaná v pulikácii Adler a ďalší, 1979 Science,204:1434-1436, skúška s využitím buniek miechy, ktoré je možné z pokusného zvieraťa aseptický vyňať kaudálne oddeliťod predĺženej miechy a uvoľniť od senzorických ganglií a miechových blán. Miechu je možné pre tvorbu oddelených kultúr rozdeliť na ventrálne a mediodorzálne segmenty, tkanivo sa rozdelí na malé kúsky a rozotrie sa Pasteurovou pipetou v 50 % prostredí DMEM (Gibco) a 50 % Hamovej živnej zmesi F12 (Gibco), doplnenej 33 mM glukózy, 2 mM glutamínu, 15 mM hydrogénuhličitanu sodného, 10 mM HEPES, 25 yug/ml inzulínu, 100 yug/ml transferínu, 60 /Ug putrescínu, 20 nM progesteronu, 30 nM selenidu sodného, 0,5 yug/ml penicilínu G, 0,5 /ug/ ml streptomycínu a 2,5 yug/ml sérového albumínu dobytka. Rozotretie je potom možné 2 krát opakovať, supernatanty sa spoja a odfiltrujú cez filter s otvormi 40 mikrometrov Tetko. Oddelené ventrálne bunky je potom možné naniesť na platne s povlakom poly-D-lyzínu (10 /ug/ml) s hustotou 0,5 milióna buniek na jednu platŇu s priemerom 35 mm. Disociované mediodorzálne bunky možno naniesť na platne s hustotou

1,5 milióna buniek na jednu platňu s priemerom 35 mm, s povlakom poly-D-lyzínu 10 yug/ml, poly-L-ornitínu 10 yug/ml alebo poly-L-ornitínu s laminínom 5/ug/ml.

Skúška s využitím cholinergných neurónov predného mozgu podľa US patentovej prihlášky č. 07/400 591.

Skúška s využitím ventrálnych mesencefalických dopaminergných neurónov podľa tej istej prihlášky a bunky PC12.

5.5. Protilátky proti chimérnym neurotrofným faktorom

Podľa vynálezu možno chimérne neurotrofné faktory vo forme bielkovín, ich fragmentov alebo ich derivátov použiť ako imunogény pre tvorbu protilátok proti týmto chimérnym neurotrofným faktorom. Aby bolo možné zvýšiť pravdepodobnosť tvorby imunologickej odpovede na podanie týchto látok, je možné reťazce aminokyselín v chimérnom neurotrofnom faktore analyzovať za účelom identifikácie tých časti molekuly, ktoré môžu byť spojené so zvýšenou imunogenitou. Napríklad možno podrobiť reťazce aminokyselín anlýze pomocou počítača za účelom identifikácie povrchových epitopov podľa publikácie Hoppa Voods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78:3824-3828, tento postup bol úspešne využitý na identifikáciu antigénnych peptidov povrchového antigénu vírusu hepatitídy B. Okrem toho možno porovnať reťazce aminokyselín v chimérnych neurotrofnych faktoroch rôznych živočíšnych druhov a identifikovať nehomológne oblasti, ktoré budú pravdepodobne imunogénne pri rôznych druhoch.

Pri príprave monoklonálnych protilátok proti chimérným neurotrofným faktorom možno použiť akýkoľvek postup pre produkciu molekúl protilátky kontinuálnymi bunečnými líniami v kultúre. Napríklad možno použiť hybridom podľa publikácie Kohler a Milstein, 1975, Náture, 256:495-497, alebo triom, ľudský hybridom B-buniek podľa publikácie Rozbor a ďalší, 1983, Immunology Today, 4:72, a tiež EBV-hybridom na získanie ľudských monoklonálnych protilátok podľa publikácie Cóle a ďalší, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. str. 77-96 a podobne.

Monoklonálnymi protilátkami pre liečebné použitie môžu byť monoklonálne protilátky ľudského pôvodu alebo chimérne protilátky človeka a myši alebo akéhokoľvek iného druhu. Monoklonálne protilátky človeka možno získať radom postupov známych z publikácií Teng a ďalší, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80:7308-7312, Kozbor a ďalší, 1983, Immunology Ťoday, 4:72-79, Olsson a ďalší, 1982, Meth. Enzymol., 92:3-16. Chimérne molekuly protilátok možno pripraviť tak, aby protilátky obsahovali oblasť pre väzbu antigénu z myši a konštantné oblasti ľudskej protilátky, ako bolo opísané v publikáciách Morrison a ďalší, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851, Takeda a ďalší, 1985, Náture, 314:452.

Na produkciu polyklonálnych protilátok proti epitopom chimérneho neurotrofného faktora je rovnako možno použiť celý rad postupov. Napríklad možno imunizovať rôzne živočíchy injekciou chimérneho neurotrofného faktora vo forme bielkoviny, jej fragmentu, alebo jej derivátu, môže ísť napríklad o králiky, myši, potkany a podobne. Možno použiť rôzne pomocné prostridky pre zvýšenie imunologickej odpovede v závislosti na druhu hostiteľa, napríklad Freundovho úplného alebo neúplného pomocného činidla, ďalej je možno použiť minerálne gély, ako hydroxid hlinitý, povrchovoaktívne látky ako lyzolecitn, pluronové polyoly, polyanióny, peptidy, olejové emulzie, špecifické hemocyaníny, dinitrofenol a potenciálne použiteľné pomocné prostriedky pre človeka, ako je BCG, tj. bacil Calmette-Guerin a Corenybacterium parvum.

Molekulárny kloň protilátky proti epitopu chimérneho neurotrofného faktoru možno pripraviť známym spôsobom. Ku konštrukcii nukleových kyselín, ktoré sú kódom pre molekulu monoklonálnej protilátky alebo ku konštrukcii oblasti pre väzbu antigénu týchto protilátok možno využiť rekombinantnú proti DNA pdľa publikácie Maniatis a ďaľší; 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

Molekuly protilátok možno čistiť známym spôsobom, napríklad imunoabsorbciou alebo imunoafinitnou chromatografiou, pomocou HPLC alebo kombináciou týchto postupov.

Fragmenty protilátok obsahujúce idiotyp molekuly možno získať bežným spôsobom. Týmito fragmentárni sú napríklad fragment F(ab )2, ktorý možno získať štiepením molekuly protilátky pôsobením pepsínu, fragmenty Fab , ktoré vznikajú redukciou disulfidových môstikov v predchádzajúcich fragmentoch a fragmenty 2 Fab alebo Fab , ktoré sa môžu získať tak, že sa na molekulu protilátky pôsobí papainom a redukčným činidlom.

5.6. Využitie vynálezu

Vynález sa týka génov na chimérne neurotrofné faktory a odpovedajúcich bielkovín, ktoré je možné využiť na rôzne diagnostické a liečebné účely. Chimérne neurotrofné faktory podľa vynálezu zahrňujú molekuly, ktoré

i) spájajú účinnosť dvoch neurotrofných faktorov v jedinej molekule, ii) majú celkom zvláštne a špecifické spektrum účinnosti v porovnaní s prírodné sa vyskytujúcimi faktormi, iii) pôsobia superagonisticky s prírodnými faktormi alebo iv) účinkujú ako antagonistické látky alebo ako inhibítory prírodné sa vyskytujúcich faktorov.

Chimérne neurotrofné faktory podľa vynálezu možno využiť na diagnostické účely. Tieto faktory môžu napríklad obsahovať antigénny peptid tag, ako napríklad myc tag, ako sa ďalej opíše v časti 7. Tento peptid sa môže viazať na značenú protilátku. Takýto chimérny neurotrofný faktor môže byť naviazaný na svoje cieľové bunky a potom pomocou nepriamo viazanej značenej látky môže slúžiť ako indikátor týchto cieľových buniek, čo môže byť veľmi užitočné pri diagnóze alebo výskume porúch nervového systému.Môže byť tiež vhodné diagnosticky využiť faktory len s minimálnym neurotrofným účinkom.

Vynález rovnako umožňuje využitie chimérnych neurotrofných faktorov na rôzne liečebné účinky. Chimérne neurotrofné faktory poskytujú tú výhodu, že v určitých prípadoch majú účinky niekoľkých neurotrofných faktorov v jedinej molekule a/alebo rozšírené spektrum účinku v porovnaní s pôvodnou molekulou. Napríklad chimérna molekula NM1, obsahujúca NGF, viazaný na myc antigénny peptid na biologickú účinnosť na ganglia dorzálnych koreňov, nodosné gangliá a gangliá sympatiku, zatiaľ čo prírodné NGF má na nodosné gangliá malý alebo žiadny účinok. To znamená, že molekula NM1 má rozšírené spektrum v účinnosti vzhľadom k tomu, že pôsobí i na typy buniek, ktoré obyčajne nie sú nijako ovplyvnené pôvodnou molekulou NGF. Táto skutočnosť môže byť obzvlášť dôležitá v tých prípadoch, v ktorých by bolo žiadúce vyvolať súčasne odpoveď neurónov sympatiku, parasympatiku a senzorických neurónov, napríklad pri amyloidnej polyneuropatii, diabetickej neuropatii a dysautonómnej polyneuropatii. Napriek tomu, že odpovede ganglií dorzálnych koreňov, ganglií sympatiku a nodosných ganglií možno dosiahnuť kombináciou neurotrofných faktorov ako BDNF a NGF alebo faktorom NT-3, môže byť chimérna molekula s účinkom na všetky tri typy uvedených buniek výhodnejšia v tom zmysle, že má menej vedľajších účinkov ako podanie BDNF s NGF alebo NT-3. Navyše chimérne neurotrofné faktory môžu mať vyššiu účinnosť ako ich prírodné sa vyskytujúce molekuly ako napríklad BM1, na obr.6 , táto molekula je tvorená časťami BDNF a myc peptidu a má na prežívanie ganglií dorzálnych koreňov a ganglií sympatiku vyšší účinok ako BDNF. Preukázalo sa, že NGF a BDNF majú aditívny neurotrófny účinok. Podľa vynálezu možno použiť jediný chimérny neurotrofný faktor k dosiahnutiu väčšieho počtu prírodné sa vyskytujúcich faktorov.

V ďalších uskutočneniach môžu chimérne neurotrofné faktory obsahovať toxickú zložku a možno ich použiť na odstránenie buniek zasiahnutých chorobou, napríklad buniek, ktoré boli infikované vírusom alebo nádorových buniek nervového pôvodu.

V rôznych uskutočneniach vynálezu možno chimérne neurotrofné faktory podávať vo forme bielkoviny, peptidového fragmentu alebo derivátu nemocným, ktorých nervový systém bol poškodený úrazom, chirurgickým zákrokom, ischémiou, infekciou, napríklad detskou obrnou alebo AIDS, metabolickou chorobou, nedostatočnou výživou, zhubným bujnením alebo toxickými látkami. V ďalších uskutočneniach vynálezu možno použiť chimérne neurotrofné faktory vo forme bielkoviny, peptidového fragmentu alebo derivátu na liečenie vrodených stavov alebo neurodegeneratívnych porúch, akými sú Alzheimerova choroba, stárnutie, periférna neuropatia, Parkinsonova choroba, Hantingtonova chrea a nemocia poruchy motorických neurónov.

V špecifickom uskutočnení vynálezu možno použiť chimérny neurotrofný faktor vo forme bielkoviny, peptidového fragmentu alebo derivátu spolu s chirurgickou implantáciou tkaniva alebo prostriedku s pomalým uvoľňovaním pri liečbe ALzheimerovej choroby, amiotrofickej laterárnej sklerózy a ďalších ochorení motorických neurónov vrátane Verdnig-Hoffmanovej choroby a Parkinsanovej choroby. Preukázalo sa, že pri Alzheimerovej chorobe dochádza k selektívnej strate cholinergných neurónov v spodnej časti predného mozgu a tiež sa preukázalo, že približne 35 % nemocných s Parkinsonovou chorobou trpí tiež demenciou Alzheimerovho typu. Chimérny neurotrofný faktor podľa vynálezu by sa dal úspešne použiť ako jediný liek pre túto komplexnú chorobu. Podobne by sa dalo pri správnej voľbe chimérneho neurotrofného faktoru liečiť Alzheimerovu chorobu v spojení s Downovým syndrómom. Chimérny neurotrofný faktor podľa vynálezu možno použiť na liečenie rôznych demencií a tiež na liečenie vrodených porúch pamäte.

V ďalších uskutočneniach vynálezu možno chimérny neurotrofný faktor použiť vo forme bielkoviny, fragmentu alebo derivátu v spojení s inými citokínmi k dosiahnutiu požadovaného neurotrofného účinku. Účinná látka podlá vynálezu, ktorou môže byť chimérny neurotrofný faktor vo forme bielkoviny, peptidového fragmentu alebo derivátu alebo protilátka alebo fragment protilátky proti chimérnemu neurotrofnému faktoru vo forme bielkoviny, peptidového fragmentu alebo derivátu alebo prostriedok, ktorý môže byť kombináciou chimérneho neurotrofného faktoru a ďalšej látky, ako NGF, je možné podávať v akomkoľvek sterilnom biologicky kompatibilnom farmaceutickom nosiči, napríklad vo fyziologickom roztoku, poprípade s prísadou pufru, v roztoku dextrózy alebo vo vode

Množstvo chimérneho neurotrofneho faktoru vo forme bielkoviny, peptidového fragmentu alebo derivátu alebo množstvo protilátky, ktoré bude účinné pri liečení určitej poruchy alebo stavu, bude závisieť od povahy tejto poruchy alebo tohoto stavu a môže sa určiť štandardnými klinickými postupmi. Tam, kde je to možné, je žiadúce určiť najprv krivku závislosti odpovede na dávke najprv in vitro, napríklad v horeopísaných systémoch pre biologické skúšky s chimérnymi neurotrofnými faktormi, potom na použiteľnom živočíšnom modeli a až potom je možné pristúpiť ku klinickým skúškam na človeku.

Spôsoby podávania sú napríklad vnútrokožné, vnútrosvalové, intraperitoneálne, vnútrožilné, podkožné alebo perorálne podanie a podanie nosnou sliznicou. Okrem toho môže byť výhodné priviesť farmaceutický prostriedok až do nervového systému akýmkoľvek vhodným spôsobom, napríklad injekciou do mozgových komôr alebo do priestoru mozgových blán, injekcia do mozgovej komory môže byť uľahčená použitím katétru spojeného so zásobníkom napríklad Ommayovým zásobníkom. Tiež je možné využiť biologicky degradovateľne alebodoplniteľné prostriedky.

Okrem toho môže byť výhodné podať farmaceutický prostriedok podlá vynálezu miestne do poškodenej oblasti. Toto je možné dosiahnúť miestnou infúziou v priebehu chirurgického zákroku, injekčným podaním, podaním pomocou katétru alebo pomocou implantátu, pričom ako implantát možno použiť porézny, neporézny alebo želatínový materiál vrátane membrán napríklad možno použiť sialastickú membránu alebo vláknitý materiál.

Podstatu vynálezu tvoria tiež farmaceutické prostriedky obsahujúce chimérny neurotrofný faktor vo forme bielkoviny, peptidového fragmentu alebo derivátu, spracovaný na lipozomy, mikročastice alebo mikrokapsule. V rôznych uskutočneniach vynálezu môže byť vhodné použitie farmaceutických prostriedkov tohoto typu na dosiahnutie spomaleného uvoľňovania chimérneho neurotrofného faktoru príbuzných látok.

6. Príklad: Konštrukcia a expresia BDNF/NGF a myc-tag chimérnych neurotrofných faktorov

Skonštruoval sa väčší počet geneticky modifikovaných molekúl NGF a BDNF, aby bolo možné zistiť, či takéto modifikácie môžu meniť špecifičnosť účinku NGF alebo BDNF. Konštrukcia sa uskutočnila použitím PCR-reakcie k dosiahnutiu zostrihu génu pomocou predĺžených prekrývajúcich sa ukončení podľa publikácie Horton a ďalší, 1989, Gene 77:61-68.

6.1. Materiály a metódy

6.1.1. Konštrukcia chimérnych molekúl

Navrhli sa postupy, pri ktorých sa získali chimérne molekuly pri jednostupňovej PCR-reakcii použitím troch oligonukleotidových primérov alebo sa použilitrj stupňové PCR-reakcie použitím štyroch oligonukleotidových primérov.

Tieto postupy boli použité na získanie 9 chimérnych zlúčenín, označených R2 - 210, tieto látky obsahujú časti kódovaných reťazcov pre BDNF a NGF, ďalej boli získané dve chiméry, NM1 a BM1 s obsahom kódových nukleových kyselín pre časť bielkoviny myc, spojených s reťazcom pre NGF alebo BDNF, pričom reťazec tag je glu-lys-leu-ile-ser-glu-asp-leu, tento reťazec je použitý na spojenie bielkoviny myc s reťazcom NGF alebo BDNK.

V prípade chiméry R1 bol reťazec pre ľudský NGF, hNGF amplifikovaný pomocou 5'-oligonukleotidov, ktorý obsahoval miesto pôsobenia reštrikčného enzýmu Clal a pôsobením 3' -oligonukleotitov s obsahom miesto pôsobenia Notl.PCR-fragment bol potom subklonovaný v miestach pôsobenia Narl/Notl plazmidú pC8hB(Pl).

Na získanie chimérnej zlúčeniny R1 boli použité nasledujúce oligonukleotidy:

5' - oligo

5' - GCTTACCTGATCGATCATCATCCCATCCCATCTTC

3' - oligo

5' - GCTATGCGCCGCGGATCCTTATCATCTCACAGCC- 3'

6.1.1.1 Konštrukcia chimérnych molekúl pri použití jednostupňovej PCR-reakcie

Na obr.1 je schématicky znázornený diagram použitia troch oligonukleotitov, označených A, Ba pri jednostupňovej PCR-reakcii podľa publikácie Saiki a ďalší, 1985, Science 230:1350-1354, na zostrih génov pomocou prekrývajúcich sa predĺžených zakončení pri použití postupu podľa publikácie Horton a ďalší, 1989, Gene, 77:61-68. Tri oligonukleotidy A, B a C boli použité v pomere 100 : 1 : 100 pri jednostupňovej reakcii pri použití matríc hBDNF, plazmidom pre ľudský BDNF je plazmid pCDM8, označovaný tiež pC8-hB(Pl) a matrica pre hNGF, gén pre ľudský NGF bol získaný od British Biotechnology Ltd. V priebehu niekoľkých prvých cyklov viedla asymetrická amplifikácia prevažne k tvorbe produktu A-B s jednoduchým reťazcom. Tento produkt bol potom amplifikovaný pri použití oligonukleotidu C za vzniku zloženého produktu A-C. Pri použití tohoto postupu bolo možné nahradiť veľké časti molekuly BDNF tak, že bola spojená časť molekuly BDNF s časťou molekuly NGF. Miesto spojenia je definované uprostred uloženým oligonukleotidom B, ktorý je skonšruovaný z reťazca NGF na 5' -zakončení a reťazca BDNF na 3'zakončení. Podmienky pri amplifikácii boli 1 minúta pri teplote ®C, 2 minúty pri 43 a 3 minúty pri θϋ, bolo vykonaných 35 cyklov. PCR-fragment bol čistený na géle, rozštiepený kombináciou enzýmov Narl/Notl a subklokovaný v zodpovedajúcich miestach plazmidu pC8hB(Pl). Tento postup bol použitý na konštrukciu chimér R2-5, označených pC8hB/hN-Rl až R5. V tabuľke 3 sú uvedené tri oligonukleotidy, použité na získavanie chimérnych zlúčenín R2, R3, R4 a R5 vrátane 5'- oligonukleotidu, ktorý zodpovedá priméru A na obr.1, stredného oligonukleotidu, zodpovedajúceho priméru B na obr. la 3'- oligonukleotidu, ktorý zodpovedá priméru C na obr.1.

Tabuľka 3

Chiméra R2

5'- oligonukleotid

5' - GATGCTGAAACATGTCCATG stredný oligonukleotid

5' - CTTATCCCCAACCCACACGCTAATACTGTCACACACCGC

3' - oligonukleotid

5' - GCTATGCGGCCGCGGATCCTTATCATCTCACAGCC-3

Tie isté 5' - a 3' - oligonukleotidy boli použité pri získaní chimérnych produktov R3 až R5.

Chiméra R3 stredný oligonukleotid

5' - GACGGGATTTGGGTCCCGGCACTTGGTCTCGTAGAAG

Chiméra R4 stredný oligonukleotid

5' - GAGTTCCAGTGCTTTGAGTCTATGCCCCTGCAGCC

Chiméra R5 stredný oligonukleotid 5' - GACAAAGGTGTGAGTCGTTCGGCACTGGGAGTTCCAATG

6.1.1.2 Konštrukcia chimérnych molekúl pri použití trojstupňovej PCR-reakcie

Na obr.2 je znázornený schématický diagram použitia štyroch oligonukleotidov, označených A, B, C a D pri trojstupňovej PCR reakcii na dosiahnutie zostrihu génu pomocou prekrývajúcich sa predĺžených častí. Vzhľadom k tomu, že použité priméry B a C obsahovali časť kódového reťazca pre NGF, boli konečným reakčným produktom chimérne molekuly, v ktorých pomerne malá časť reťazca bola nahradená reťazcom NGF.

Ako je zrejmé z obr.2, bol amplifikovaný hBDNF vo vektore BLUESCRIPT (Stratagene) pri použití 5' - oligonukleotidov A a stredného nukleotidu B, hBDNF v pCDM8 bol amplifikovaný pomocou stredného oligonukleotidu C a 3' - oligonukleotidu. Tieto dva PCR fragmenty boli čistené na géle a v nasledujúcej reakcii boli zmiešané podiely týchto látok. Vzhľadom k tomu, že dva stredné oligonukleotidy obsahovali na svojich •5'-zakončeniach prekrývajúce sa reťazce NGF, boli dva PCR fragmenty A-B a C-D schopné vzájomnej hybridizácie v prekrývajúcej sa oblasti a bolo ich možné amplifikovať pri použití 5' - a 3' -oligonukleotidu za vzniku PCR fragmentu s obsahom malej časti fragmentu NGF namiesto časti BDNF. Fragment bol rozštiepený kombináciou enzýmov Narl/Notl a bol klonovaný v zodpovedajúcich miestach plazmidu pC8-hB(Pl). Pri použití dvoch matríc BDNF, klonovaných v rôznych vektoroch ako východzích materiálov, pričom každá z týchto matríc má na svojom zakončení primér A alebo primér D, bolo možné prekonať pravdepodobnosť získania falošných negatívov. Tento postup bol použitý pre konštrukciu chimér R6 až RIO, ktoré sú označené pC8hB/hN-R6 a pC8hB/mN-R7 až RIO. V prípade chiméry R6 bol ako templát pre priméry A a B použitý plazmid pBS-hB, ale pre priméry C a D bol ako matrica použitý syntetický hNGF.

V nasledujúcejm tabuľke 4 sú uvedené oligonukleotidové priméry, použité pri konštrukcii chimér R6, R7, R8, R9 a RIO.

Tabuľka 4

Chiméra R6

5'- oligonukleotid A

5' - GATGCTGCAAACATGTCCATG stredný oligonukleotid B

5' - GCCTTTCTAGAGAGCACCCCCAACCATTTACACAAGAAGTGTC stredný nukleotid C

5' - GTGGGCTCTCTAGAAAGGC

3' - oligonukleotid d

5' - GCTATGCGGCCGCGGATCTTATCATCTCACAGCC-3'

- 50 Chiméra R7

5'- oligonukleotid A

5' - GT A AA ACGACGGCCAGT - 3' stredný oligonukleotid B

5' - CAGCACTGTCACCTCCTTGCCCGACATGTCCACTGC stredný oligonukleotid C

5' - AAGGAGGTGACAGTGCTGGCCGAGGTCCCTGTATCAAAAGGC-3'

3' - oligonukleotid D

5' - CAAAGATCCTCTAGAGTCGC-3'

Tie isté 5' - a 3' -oligonukleotidy boli použité pri získavaní chimér R8 až RIO.

Chiméra R8 stredný oligonukleotid B

5' - TCTGAATACACTGTTGTTAATAGGGACCTTTTCAAGGAC-3' stredný oligonukleotid C

5' - ATTAACAACAGTGTATTCAGACAATACTTCTACGAGACC-3

Chiméra R9 stredný oligonukleotid B

5' - AACAGGATTGGAGGCTCGGCACTTGGTCTCGTAGAA stredný oligonukleotid C

5' - CGAGCCTCCAATCCTGTTGAGAGTGGCTGCAGGGGGCATAG

Chiméra RIO stredný oligonukleotid B

5' - GTATGAGTTCCAGTGTTTGGAGTCTATGCCCCTGCAGCC stredný oligonukleotid C

5' - TCCAAACACTGGAACTCATACTGCCGAACTACCCAGTCGC

Chiméra NM1

5'- oligonukleotid

5' - CGGTACCCTCGAGCCACCATGCTGTGCCTCAAG-3 stredný oligonukleotid

5' - CAGATCCTCCTCAGAAATCAGCTTTTGCTCACCTCCTCTTGTAGCCTTCCTG

3' - oligonukleotid

5' - GCTATGCGGCCGCTACAGATCCTCCTCCTCAGAAAGC-3'

Chiméra BM1

5’- oligonukleotid

5' - CGGTACCCTCGAGCCACCATGACCATCCTTTTCCTT stredný oligonukleotid

5' - GCTATGCGGCCGCTACAGATCCTCCTCAGAAATCAGCTTTTGCTCACCTCCTTT

AATGGTAATGTAC- 3'

3'- oligonukleotid

5' - GCTATGCGGCCGCTACAGAATCCTCCTCAGAAATC-3'

6.1.1.3 Konštrukcia chimérnej molekuly obsahujúca úsek MYC-TAG

Vyššie uvedená jednostupňová PCR-reakcia s použitím troch oligonukleotidových primérov bola použitá pri konštrukcii plazmidu na expresiu s kódovým reťazcom pre NGF alebo BDNF, tieto reťazce sú spojené pomocou reťazca tag s fragmentom ludskej bielkoviny myc s 10 zvyškami aminokyselín s antigénnym účinkom, tento reťazec bol opísaný v patentovej prihláške US č. 07/532 285, podanej 1. júna 1990. Táto PCR-reakcia, vykonávaná v jednom stupni,bola použitá na získanie produktu, obsahujúceho myší gén pre NGF z plazmidu, obsahujúceho dlhý prekurzor pre NGF, pB15-NGF. Tento produkt s obsahom myšieho génu pre NGF bol viazaný cez mostík s kódovým reťazcom pre dva glycinové zvyšky na reťazec, ktorý je kódom pre epitop myc s 10 zvyškami aminokyselín. Priméry na vykonávanie PCR-reakcie boli volené tak, aby výsledný produkt neobsahoval dva kodony natívneho génu pre NGF vzhľadom k tomu, že aminokyseliny, pre ktoré sú tieto dva posledné kodony kódom by predstavovali miesto proteolytického štiepenia, v ktorom by mohlo dôjsť k strate epitotu myc. Pre konštrukciu mNGF, naviazaného na myc na 3' zakončenie (pC81mM/myc-NMl) bol amplifikovaný myší NGF s dlhým prepro reťazcom v množstve 20 ng pri použití 5' - oligonukleotidu, stredného oligonukleotidu a 3' - oligonukleotidu v množstvách 100, 1 a 100 ng, ako je zrejmé z obr.3A. Podmienky pri amplifikácii boli nasledujúce: 1 minúta pri 94, 2 minúty pri 43 a 3, minúty pri 72 °C, bolo vykonaných celkom 35 cyklov. Výsledný PCR-produkt bol potom rozštiepený kombináciou enzýmov Xhol/Notl a bol potom klonovaný vo vektore CDM8, rozštiepenej kombinácie tých enzýmov. BDNF, spojený s epitopom myc na 3'-zakončení (pC8hB/myc-BMl) bol skonštruovaný podobným spôsobom,, ako je zrejmé z obr. 3B.

Podobný postup bol použitý na získanie PCR-produktu, obsahujúceho ľudský BDNF, viazaný cez mostík, ktorý je kódovým reťazcom pre dva glycinové zvýšky s reťazcom, ktorý je kódovým reťazcom pre epitop myc s 10 zvyškami aminokyselín. Rovnako ako pri získavaní chiméry NGF/myc boli priméry pre PCR-reakciu volené tak, aby vznikol PCR-produkt bez posledných troch kodonov natívneho génu pre BDNF, pretože aminokyseliny, pre ktoré sú tieto kodony kódom, . sú miestom pre proteolytické štiepenie, v ktorom by mohlo dôjsť k strate epitopu myc. Produkt PCR bol potom rozštiepený kombináciou enzýmov Narl/Notl a subklokovaný v plazmide pre expresiu ľudského BDNF, pC8hB(Pl) za vzniku plazmidu pre expresiu získanej konštrukcie, pC8hB/myc(BM1).

6.1.2 Transfekcia konštrukciami na expresiu chimérneho neurotrofného faktora a expresia v bunkách COS

Plazmidová DNA pre každú hore uvedenú konštrukciu na expresiu v bunkách cicavcov bola pripravená použitím gradientu chloridu cézneho. čistená DNA bola potom použitá na transfekciu pri použití spôsobu so súčasným zrážaním fosfoerečnanom vápenatým podľa publikácie Chen a Oayama, Mol. Celí. Biol, 7:2745, 1987, na transfekciu boli použité bunky

COS-MS, ktoré boli naočkované na platne s priemerom s priemerom 610 mm 24 hodín pred transfekciou s hustotou 5 x 10$ buniek na jednu platňu v 2,5 ml Dulbeccovho modifikovaného Eanglovho prostredia s obsahom glukózy 4500 mikrogramov/ml a 10 % fetálneho séra dobytka. Živné prostredie buniek po transfekcii bolo odobrané 48 hodín po ^x transfekcii na biologické skúšky. V tomto čase bolo tiež vykonané metabolické značenie, ako bude ďalej podrobnejšie opísané.

6.1.2.1 Metabolické značenie hodín po transfekcii boli bunky COS-M5 uložené do 3 ml prostredia DMED, bez séra, bez metioninu a cysteínu, s obsahom inzulínu, transferedínu a selénu. Bunky boli ponechané 1 hodinu bez prítomnosti aminokyselín pri teplote 37 Oc v atmosfére obsahujúcej 5% oxidu uhličitého. Potom bol odobraný 1 ml prostredia DMEM, jednoduchého séra a bunky 3 5 · 3 5

COS-M5 boli označené pomocou S-metioninu a S-cysteinu, každá z týchto aminokyselín bola použitá , v množstve 100 mikroCi/ml, značenie bolo vykonávané 4 hodiny. Supernatant značených buniek COS-M5 bol odobraný a analyzovaný elektroforézou na SDS-polyakrylamidovom géle. Na obr. 4 je znázornené delenie metabolický značeného hBDNF, mNGF, hBDNF/myc (chiméra BM1) a mNGF/myc (chiméra NM1). ,

6.2 Výsledky a diskusia

Časti génov NGF a BDNF boli podrobené zostrihu používajúc primérov s prekrývajúcimi sa predĺženými koncami pri PCR-reakcii. Boli získané chimérne molekuly, pričom v chimérach R1 až R5 boli nahradené pomerne veľké časti reťazca BDNF reťazcom NGF, v chimérach R6 až RIO boli takto nahradené menšie časti reťazca. Reťazce aminokyselín pre chimérnu molekulu R1 až RIO sú znázornené na obr.5. Chiméry R1 až R6 obsahujú časti reťazca ľudského BDNF a ľudského NGF, chiméry R7 až RIO obsahujú časti reťazca ľudského BDNF a myšieho NGF. V tabuľke 5 sú uvedené približné rozsahy reťazcov BDNF a NGF v chimérnych molekulách R1 až RIO.

Tabuľka 5

chiméra	reťazec BDNF	reťazec	NGF
R1	preproreťazec	úplný reťazec
R2	preproreťazec zvyšky 1-17	zvyšok	18-120
R3	preproreťazec zvyšky 1-58	zvyšky	59-120
R4	preproreťazec zvyšky 1-72	zvyšky	73-120
R5	preproreťazec zvyšky 1-81	zvyšky	82-120
R6	preproreťazec zvyšky 1-110	zvyšky	111-12(
R7	preproreťazec zvyšky 1-33 zvyšky 42-118	zvyšky	34-41
R8	preproreťazec zvyšky 1-43 zvyšky 51-118	zvyšky	44-50
R9	preproreťazec zvyšky 1-58 zvyšky 67-118	zvyšky	59-66
RIO	preproreťazec zvyšky 1-72 zvyšky 80-118	zvyšky	73-79

Okrem toho boli tiež pripravené chimérne molekuly, obsahujúce kódové reťazce pre NGF alebo BDNF, spojené s antigénnym peptidom s 10 zvyškami aminokyseliny z bielkoviny myc. Odvodené reťazce aminokyselín pre NGF/myc, chiméra NM1 a pre BDNF/myc, chiméra BM1 sú znázornené na obr.5. >

Každá z uvedených chimérnych konštrukcií bola použitá k transfekcii buniek COD-M5 pri použití postupu súčasného zrážania fosforečnanom vápenatým. Expesiu chimérnych molekúl R1 až RIO je možné preukázať pomocou metabolického značenia alebo skúškami na biologickú účinnosť. Aby bolo možné dokázať, že došlo k expresii chimérnych molekúl NM1 a BM1, boli bunky COS po transfekcii NM1 alebo BM1 metabolický značené pomocou S-metioninu, supernatanty týchto buniek boli potom analyzované elektroforézou na polyakrylamidovom géle a élektroforeticky oddelené bielkoviny potom boli prenesené na nylonovú membránu a bola vykonaná aotoradiografia, jej výsledok je zrejmý z obr.4. V prípade BDNF a chimérnej molekuly BM1 bolo možné identifikovať hlavný pás pre bilelkovinu s molekulovou hmotnosťou 31 000, čo zodpovedá prekurzorovej forme týchto bielkovín. Pri porovnaní intenzity pásu pre prekurzor je zrejmé, že uvedené bielkoviny boli pri expresii produkované v približne rovnakom množstve. Pás pre bielkovinu s molekulovou hmotnosťou 31 000 nie je prítomný v dráhe 1, kde je analyzovaný materiál po zdanlivej transfekcii buniek COS. V prípade NGF a chiméry NM1 bolo možné pozorovať približne rovnakú expresiu zrelej formy týchto bielkovín s molekulovou hmotnosťou približne 12 500. Ako bolo očakávané, NGF/myc z .chiméry NM1 sa pohybuje trochu pomalšie ako samotný NGF. Všetky chiméry BDNF/NGF, to znamená R1 až RIO pri expresii produkovali prevažne prekurzor s molekulovou hmotnosťou 31 000 v množstve podobnom množstvu BDNF.

7. Príklad: Neurotrofná účinnosť chimérnych neurotrofných faktorov R1 až RIO, BM1 a NM1

7.1 Materiály a metódy

7.1.1 Biologické skúšky pri použití tkánivových explantátov

Všetky chimérne molekuly R1 až RIO a tiež BM1 a NM1 vrátane natívneho BDNF a NGF boli pri expresii produkované bunkami COS-M5, ako bolo hore uvedené. Supernatanty získané z buniek po transfekcii boli podrobené biologickým skúškam používajúc tkáčových explantátov a disociovaných bunečných kultúr, pokial ide o schopnosť indukovať rast neuritov v špecifických gangliách.

Účinnosť chimérnych molekúl bola pozorovaná tak, že bolo merané prežívanie disociovaných buniek v kultúre ganglií dorsalnych koreňov DRG alebo ganglií sympatiku SG. Ganglia bola odobraná z kuracích embryí v štádiu E8-9 a uložená do prostredia DNEM s obsahom séra, doplneného 10 % fetálneho séra dobytka FBS, streptomycínom, penicilínom a glutamínom. Po rozštiepení 0,5 % trypsinom (Vorthington), boli bunky jemne rozotreté a prenesené na platne s priemerom 60 mm z plastickej hmoty bez povlaku. Počas 2 až 3 hodín boli bunky ponechané na zachytenie na živné prostredie. Nezachytené bunky boli potom zliate, odstredené, znovu privedené do suspenzie v prostredí s obsahom séra a počítané hematocytometrom. Prežívanie neurónov je možné stanoviť spočítaním buniek kolorimetricky, podstatou skúšky je premena 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromidu, MTT, na purpurový produkt, k tejto premene dochádza iba v prítomnosti života schopných buniek. Z dôvodu počítania buniek boli bunky nanesené na platne s hustotou 24 000 buniek na jednu platňu s priemerom 35 mm a potom pestované 48 hodín v prítomnosti alebo neprítomnosti supernatantu buniek COS s obsahom produkovanej chimérnej bielkoviny, potom bol stanovený počet buniek. Pri metóde s použitím MTT boli bunky nanesené s hustotou 1000 buniek na jedno vyhĺbenie A2. 40 hodín po nanesení do vyhĺbenia bol pridaný MTT v koncentrácii 0,5 mg/ml. Farbivo prijaté životaschopnými bunkami bolo solubilizované pridaním 0,08 N kyseliny chlorovodíkovej v izopropanole, po ďalších 8 hodinách a bola meraná absorbancia pri 570 až 650 nm. Výsledky boli znázornené graficky ako funkcie riedenia pridaného supernatantu buniek COS.

7.1.2 Biologické skúšky na bunkách PC12

Supernatanty buniek COS-M5 po transfekcii boli 48 hodín po transfekcii odoberané na diferenciálmi skúšku s použitím buniek PC12. Tieto bunky boli naočkované na na platne s 24 vyhĺbeninami (Costar) s hustotou 1 x 10“ buniek v jednej vyhlbenine. Bunky PC12 boli pestované v živnom prostredí RPMI s prídavkom 6 % fetálneho teľacieho séra a 6 % konského séra. Supernatanty buniek COS boli pridané k bunečným kultúram buniek PC12 v celkovom objeme 1 ml v rôznom zriedení v rozsahu 1 : 5 až 1 : 500. Rast neuritov bol hodnotený ako + (väčšina buniek produkuje neurity) alebo - (velmi málo buniek produkuje neurity alebo k produkcii neuritov vôbec nedochádza).

7.2 Výsledky a diskusia

7.2.1 Skúška na explantátoch a disociovaných bunečných kultúrach

Skúšky in vitro používajúc explantátov kuracích periférnych ganglií boli použité na odlíšenie biologických účinkov NGF a BDNF navzájom. Oba uvedené faktory síce pôsobia na populáciu senzorických neurónov, nachádzajúcich sa v gangliách dorsálnych koreňov, odvodených od nervovej ryhy, avšak iba BDNF môže priaznivo ovplyvniť senzorické neuróny nodosného ganglia, odvodeného od predného základu nervovej sústavy. Okrem toho NGF, avšak nie BDNF podporuje prežívanie a rast neurónov paravertebrálnych ganglií sympatika. Tieto tkanivá boli použité pri skúškach in vivro, aby bolo možné stanoviť, či chimérne konštrukcie vedú k expresii látok s biologickou účinnosťou BDNF, NGF alebo BDNF a NGF.

Chimerné látky R7, R8, R9, RIO, BM1 a NM1 boli podrobené skúškam na neurotrofnú účinnosť na gangliách dorsálnych miechových koreňov, ganglion nodosun alebo na explantátoch ganglií sympatika.

Ako už bolo predtým dokázané, NGF a BDNF podporujú rast neuritov v gangliách dorsálnych miechových koreňov, DRG, u kuracích embryí E8. Iba BDNF podporuje rast neuritov ganglion nodosum NG a okrem toho NGF, avšak BDNF nepôsobí v tom istom zmysle na gangia sympatika, SG, ako je uvedené v nasledujúcej tabuľke 6. Chimérna konštrukcia BDNF/NGF, R8, podporuje rast neuritov ako v prípade DRG, tak aj v prípade SG, to znamená, že má tiež biologickú účinnosť NGF.

V prípade chimér, ktoré obsahujú ešte epitop po 10 aminokyselinách z c-myc-protopncogenu, v prípade BM1 docháda k expresii účinnosti typu NGF v prípade buniek SG, kým v prípade chiméry NM1 dochádza k expresii účinku na NG, čo je charakteristické pre účinnosť BDNF, ako je tiež zrejmé z nasledujúcej tabuľky 6.

Tabuľka 6

Porovnanie účinkov BDNF, NGF, chimér BDNF/NGF a neurotrófnych faktorov viazaných na reťazec myc na explantátoch embryonálnych kuracích ganglií dorsálnych koreňov D.RG, nodonosných ganglií NG a ganglií sympatika SG

chiméra	DRG	NG	SG
R7 (250 μΐ)	3	1	0
R8 (250 /11)	3-4	2	3
R9 (250 /11)	2-3	2	0
RIO (250 /11)	2-4	2	0
NGF	5	1	5
BDNF	3	2	0,5
pCDM8 (kontrola,
250 /11)	0-1	0,5	0,5
BM1 (250 /11)	2-3	2	1-2
NM1 (100 /11)	5	3	5

Uvedené hodnoty uvádzajú stupeň rastu neuritov a ich vetvenie. Maximálna hodnota je 5, pri hodnote 0 vôbec nedochádza k rastu neuritov. Uvedené hodnoty sú priemerom troch na sebe nezávislých pokusov. Rast neuritov bol odčítaný po 24 až 48 hodinách po pridaní jednotlivých neuŕotrofných faktorov.

V nasledujúcej tabuľke 8 je uvedený výsledok skúšok na závislosť odpovede na dávke pri indukcii rastu neuritov. Bolo dokázané, že chiméra NM1 má porovnateľný účinok ako NGF u ganglií dorsálnych koreňov a u ganglií sympatika, avšak v prípade ganglion nodosum má trochu vyšší účinok.

Pokiaľ teda ide o NGF, viazaný na reťazec myc, je z tabuľky 7 zrejmé, že v koncentrácii 50 mikrolitrov môže NM1 zabezpečiť prežitie približne 63 % neurónov ganglii dorsálnych koreňov, kým NGF môže zabezpečiť prežitie len 47 % týchto buniek, NM1 môže teda byť použité ako agonistická látka pre NGF, pokiaľ ide o prežívanie neurónov.

Na ôbr. 6 je znázornený výsledok kolorimetrickej skúšky s použitím MTT na neurónoch DRG a SG, ktoré boli vystavené účinku BDNF, NGF alebo BM1. Ako je z obr. 6 zrejmé, prežívanie po pôsobenmí BM1 bolo podstatne vyššie ako pri použití BDNF, a to ako pri neurónoch DRG, tak v prípade SG. Podobne ako v prípade NGF nebolo možné vyčerpať účinnosť pri DRG a SG ani pri riedení supernatantu buniek COS 1 : 1000. To znamená, že naviazaním reťazca 3 -myc na molekulu BDNF podporuje účinnosť na SG.

Tabuľka 7

Porovnanie	účinnosti	NGF a NM1	na prežívanie disociovaných
neurónov DRG	kuracieho	embrya E8	počet neurónov DRG
NGF	5	M	336
	20	/11	440
	50	/11	408
NM1	5	/11	334
	20	/ii	446
	50	/11	542

Počet neurónov DRG bol počítaný na 3,6 % celkovej plochy, ide o priemer z dvoch platní. Supernatant NGF zabezpečí prežitie 47 % neurónov pri 50 mikrolitroch, NM1 približne 63 % neurónov

Tabuľka 8

Porovnanie účinnosti NGF a NM1 na explantátoch DRG, NG a SG kuracieho embrya E8

		DRG	NG	SG
5	pl	1	2	2
10	pl	4	0,5-1	2-3
20	pl	4-5	0,5-1	3-4
30	pl	5+	1-2	4-5
40	/11	5 +	0	5+
60	pl	5+2	0	5+2
5	pl	1-2	1-2	0,05
10	/11	2	2-3	0,5-1
20	pl	3-4	3-4	2-3
30	/11	4-5	4-5	5
40	/11	5+	5+	5 +
60	/11	5+2	5+3	5+2

Rast neiritov bol odpočítaný 24 hodín po pridaní neourotrof ného faktora.

7.2.2 Biologické skúšky na bunkách PC12

Bolo dokázané, že potkanie bunky kmeňa PC12 sa diferencujú pôsobením celého radu účinných látok vrátane faktorov podporujúcich rast nervových buniek. Diferenciácia, ktorá bola vyvolaná pôsobením faktorov pre rast nervových buniek je spojená s ukončením bunečnej proliferácie a s rastom dlhých nervových látok. Táto skúška na diferenciáciu je vhodná na identifikáciu molekúl, ktoré majú podobnú účinnosť ako faktory rastu nervových buniek. Pri tejto skúške boli teda skúmané všetky hore uvedené chimérne molekuly a súčasne natívne BDNF a NGF na schopnosť vyvolať rast neuritov a buniek PC12.

Ako je uvedené v nasledujúcej tabuľke 9 vyvoláva NGF rast neuritov, a to už pri riedení 1 : 250. Chimérna molekula NM1 je rovnako účinná pri riedení 1 : 250. Chimérna molekula R8, ktorá má účinnosť na gangliá symptatika, ako už bolo uvedené v tabuľke 1, je schopná vyvolať rast neuritov pri bunkách PC12 pri riedení 1 : 50. Je prekvapujúce, že podobné výsledky boli dosiahnuté tiež pri použití chimérnej molekuly BM1, čo dokazuje, že táto molekula má neurotrofnú účinnosť, ktorá chýba pôvodnej molekule BDNF. V prípade BDNF ide len o slabú účinnosť na rast nervových látok v bunkách PC12 pri riedení 1 : 5. Materiál získaný z buniek COS po zdanlivej transfekcii bol neúčinný. Chimérne molekuly R1 až R5, R7, R9 a RIO boli tiež neúčinné.

Z výsledkov skúšok na explantátoch tkanív a na bunkách PC12 je zrejmé, že pridaním reťazcov na C-zakončeniach molekúl BDNF a NGF je možné získať molekuly s novou biologickou účinnosťou, ktorá nie je prítomná v pôvodných molekulách látok, použitých na tvorbu týchto chimérnych molekúl.

Tabulka 9

Biologická molekúl chiméra	skúška na bunkách PC12	pri použití chimérnych
1:5	1:25	1:50
1:100 1:250	1:500
COS-MOCKX	-	-	-		-	-
BDNF	+/-	-	-	-	-	-
NGF	+	+	+	+	+	+
NM1	+	+	+	+	+	+
BM1	+	+	+	-	-	-
R8	+	+	+	-	-	-
Hodnotenie	rastu	neuritov	a buniek	PC12	bolo vykonané	medzi

a 48 hodinami po pridaní neurotrofného faktora.

^xzdanlivá transfekcia

8. Príklad: Konštrukcia a expresia chimérnych neurotrofných faktorov NGF/BDNF

Boli skonštruované chimérne neurotrofné faktory, v ktorých bola určitá časť reťazca NGF nahradená odpovedajúcou časťou reťazca DBNF.

8.1 Materiály a metódy

8.1.1 Konštrukcia chimérnych molekúl

Chimérne molekuly NGF/BDNF boli pripravené pomocou trojstupňovej PCR-reakcie používajúc štyri oligonukleotidy, ako bolo opísané vyššie v časti 6.1.1.2. V každom z týchto prípadov boli vonkajšími primérmi, odpovedajúcimi primérom A a D na obr.2 a na obr.7 oligonukleotidy T7 a T3 (Stratagene). Na obr. 7 je znázornený schématický diagram postupu, ktorý bol použitý pri konštrukcii chimér a v nasledujúcej tabuľke 10 sú uvedené reťazce oligonukleotidových primérov,zodpovedajúce primérom D a C na obr. 7. Reťazec priméru T7 je 5' -ATTAACCCTCA CTAAAG-3' , reťazec priméru T7 je 5 -AATACGAC TCACTATAG-3' . Postup bol uskutočnený tak, že kódovaná cDNA myši pre beta-NGF bola rozštiepená v svojich pôvodných miestach pôsobením enzýmov Smal a PstI podľa publikácie Scott a ďalší, 1983, Náture 302 : 538 a potom subklokovaná v miestach pôsobenia reštrikčných enzýmov Smal/PstI v plazmide pKS (Stratagene). Výsledný plazmid KS-NGF slúžil ako matrica pre všetky nasledujúce PCR-amplifikácie.

.Chimérne molekuly boli skunštruované amplifikáciou 5^Z -fragmentu používajúc primér T7 spoločne s oligonukleotidovým primérom, zodpovedajúcim požadovaným častiam NGF a BDNF. Potom bol amplifikovaný 3' -fragment používajúc primér T3 a druhý skonštruovaného priméru NGF/BDNF. Oba výsledné fragmenty boli izolované a čistené na géle. Pri druhej PCR-amplifikácii bolo spojených 100 až 300 ng každého fragmentu, po naviazaní bola uskutočnená amplifikácia používajúc primérov T7 a T3. Všetky PCR-reakcie boli uskutočňované v nasledujúcich podmienkach.

Denaturácia bola vykonávaná 3 minúty pri teplote 94 ®C, potom bolo vykonaných 25 cyklov denaturácie/renaturácie, a to 1 minúta pri 94, 2 minúty pri 72 ®C. Potom bolo uskutočnené predĺženie reťazca 10 minút pri teplote 72 θϋ. Na uskutočnenie bol použitý balíček PCR Gene-Amp Kit (Cetus) a postup bol uskutočnený podľa návodu výrobcu.

Amplifikované fragmenty boli potom rozštiepené pôsobením enzýmov Eco a Sac II a subklonované v zodpovedajúcich miestach pôsobenia reštrikčných enzýmov v modifikovanom vektore na expresiu pBJ-5, obsahujúcom promotor SR-alfa, ako je znázornené na obr.8, vektor bol opísaný v publikácii Takebe a ďalší, 1988, Mol. Celí. Biol., 8 : 466. Avšak v prípade chiméry I, bol použitý na subklonovanie enzým No 1 namiesto Sac II vzhľadom k tomu, že bolo vytvorené vnútorné miesto pôsobenia enzýmov Sac II. Reťazec všetkých chimérnych molekúl bol analyzovaný v priebehu celej amplifikovanej oblasti používajúc enzým Sequenase (Stratagene).

Tabuľka 10

Oligonukleotidové priméry, ktoré boli použité pri konštrukcii chimérnych molekúl CH1-12

Chiméra S-l primér 1(B) NGF(^ 3-9)-->BDNF 1-7 (33-mer)

GA TGA

5' - CGGGCGGGGTCCGAGTGGGATGAGCGCTTGCTC

Primér 2(C) (33-mer)

5' - CG GAC CCC GCC CGC CGC GGG GAG TTC TCA GTA T - 3'

Chiméra S-2 primér 3 (B) NGF (/) 10-22)-->BDNF 8-20 (37-mer)

5' - AAT GCT CTC GCA CAC GCT CAG CTC CCC CAT GTC GAA G-3' primér 4(C) (39-mer)

5' - C GTG TGC GAC AGC ATT AGC GAG TGG GTT GGA GAT AAG AC- 3'

Chiméra S-3

Primér 5(B) NGF(4 23-33) ---. BDNF 21-33 (45 mer)

5' - C CAC TGC CGT CTT TTT ATC CGC CGC CGT AAC .CCA CAC ACT GAC AC - 3'

Primér 6(C) (44 mer)

5' - T AAA AAG ACG GCA GTG GAC ATG TCG GGT AAG GAG

GTG ACA GTG C - 3'

Chiméra S-4

Primér 7 (B) NGF (/1 34-22) ----. BDNF (34-42) (38 mer)

5' - T TTC GAG GAC CGT GAC CGT GCC GCC CTT GAT GTC TGT G - 3'

Primér 8(C) (41 mer)

5'- GTC ACG

GTC

CTC GAA AAA GTA AAC

ATT AAC AAC AGT GTA TT-3'

Chiméra S-5

Primér 9(B)

NGF (21 43-50) . BDNF (43-50) (30 mer)

5'- GCC TTT

CGA

GAC GGG CAC CTC GGC

CAG CAC - 3'

Primér 10(C) (42 mer)

5'- CC GTC TCG AAA GGC

CAA CTG AAG CAG TAC TTT TTT

GAG ACC - 3'

Chiméra S-6 (21-mers)

Primér B NGFTYR-54A: 5

-CAG TAC TTT TAT GAG ACC AAG - 3'

Primér C NGFTYR-54B: 5

Chiméra S-7

Primér 11(B) (38-mer)

5' - TT TGT GTA CCC CAT AGG ATT GCA CTT GGT CTC, AAA AAA - 3'

Primér 12(C) (35-mer)

5' - CCT ATG GGG TAC ACA AAG GAG GGG TGC CGG GGC AT - 3'

Chiméra S-8

Primér 13(B) (32-mer) ŕ

5' - GGA GTT CCA GTG CCT CTT GTC GAT GCC CCG GC - 3'

Primér 14(C) (35-mer)

5' - AGG CAC TGG AAC TCC CAG TGC ACC ACT ACT CAC A - 3'

Chiméra S-9

Primér 15(B) (37-mer)

5' - AC	ATA CGA CTG GGT	AGT	TCG	GCA	GTA	TGA	GTT	CCA	GT - 3
Chiméra S-10
Primér	17(B) (36-mer)
5' - AT	TCG TTT TTT GCT	ATC	CAT	TGT	CAA	CGC	CTT	GAC	G - 3'
Primér	18(C) (38-mer)
5' - TG	GAT AGC AAA AAA	CGA	ATT	GGC	TGG	AGG	TTC	CGG	- 3'

Chiméra S-ll (21-mers) (B) NGFSER-108A: 5' - G ATA GAC ACT TCC TGT GTG TG - 3' (C) NGFSER-108B: 5'- CA CAC ACA GGA AGT GTC T AT C - 3'

Chiméra S-12

Primér 19(B) (37-mer)

5' - TCC CCT CTT AAT GGT CAA AGT ACA CAC ACA GGC TGT G - 3'

Primér 20(C) (36-mer)

5' - TG ACC ATT AAA AGG GGA AGA TGA CTT GCC TGC AGG A - 3' ^xxxx

8.1.2 Expresia chimérnych neurotrófnych faktorov v bunkách COS

Bunky COS-7 boli podrobené transfekcii pomocou chimérnych molekúl používajúc DEAE-dextran-chlórchinové metódy. Postup sa uskutočňuje tak, že sa bunky jeden deň pred transfekciou rozdelia tak, že na jednu misku s priemerom 60 mm sa uloží približne 750 000 buniek. Zmes na transfekciu sa pripraví tak, že obsahuje 5 mikrolitrov, približne 5 mikrogramov DNA, 1 ml prostredia DMEM bez séra a 25 mikrolitrov DEAD dextranu s obsahom 20 mg tejto látky v 1 ml. Pestované bunky COS-.7 sa potom trikrát premyjú 5 ml prostredia DMEM bez séra. Pridá sa hore uvedená zmes na trasfekciu a bunky sa inkubujú 30 minút pri ®C. Potom sa 2 ml prostredia DMEM, bez séra, zmiešajú s 20 mikrolitrami chlórochinu a zmes sa pridá k zmesi buniek, DNA a DEAE-dextranu a výsledná zmes sa inkubuje 2 hodiny a 30 minút pri teplote 37 ®C. Supernatant sa potom odsaje a nahradí 2 ml prostredia DMEM, bez séra a obsahujúceho 10 % dimetylsulfoxidu DMSO. Potom sa bunky inkubujú 2 minúty a 30 sekúnd pri teplote miestnosti, následne sa bunky premyjú 5 ml prostredia DMEM, ktoré sa znovu odsaje a nahradí 2,5 ml čerstvého DMEM s 6 % konského séra a 6 % teľacieho séra doplneného železom. Potom boli bunky pozorované na preukázanie expresie chimérneho neurotrofneho faktora po 48 až 72 hodunách, ako bude ďalej uvedené.

8.2 Výsledky a diskusia

Molekuly chimérnych nukleových kyselín, v ktorých časť kódového reťazca pre NGF bola nahradená zodpovedajúcou oblasťou BDNF boli produkované pri expresii kódových reťazcov pre chimérne faktory. V nasledujúcej tabuľke 11 sú uvedené oblasti NGF, ktoré boli nahradené a tiež zodpovedajúce oblasti BDNF, ktoré boli zaradené ako náhrada reťazca NGF v každej z chimérnych molekúl. Je zaujímavé, že S-6 a S-ll obsahujú iba bodové mutácie, ktoré boli tiež vytvorené v priebehu trojstupňovej PCR-reakcie.

Oblasti substitúcie reťazca BDNF sú graficky znázornené na obr.9 a reťazce aminokyselín zlúčenín S-l až S-12 sú znázornené na obr.10. Chimérne molekuly S-l až S-12 obsahujú vždy časť kódového reťazca pre NGF myši a časť kódového reťazca pre BDNF človeka.

Tabuľka 11

Chiméra nahradená časť NGF/časť reťazca BDNF

			Thr Met		His Arg
S-l	NGF	(/	3-9	/	BDNF 1-7)
			Gly Val		Gly Val
S-2	NGF	(/	10-22	/	BDNF 8-20)
			Gly Gly		Thr Gly
S-3	NGF	(/	23-33	/	BDNF 21-33)
			Lys Val		Gly Val
S-4	NGF	(/	34-42	/	BDNF 34-42)
			Asn Arg		Pro Lys
S-5	NGF	(/	43-60	/	BDNF 43-50)
			Glu Cys		Glu Cys
S-6	NGF	(/	51-58	/	BDNF 51-58)
			Arg Cys		Asn Cys
S-7	NGF	(/	59-68	/	BDNF 59-68)
			Arg Cys		Arg Cys
S-8	NGF	(/	69-80	/	BDNF 69-80)
			Thr Thr		Arg Thr
S-9	NGF	(/	81-91	/	BDNF 81-91)
			Thr Phe		Met Phe
S-10	NGF	(/	92-101	/	BDNF 92-101)
			íle Cys		íle Cys
S-ll	NGF	(/	102-110	/	BDNF 103-111)
			Val-Gly		Thr-Arg
S-12	NGF	(/	111-120	/	BDNF 112-119)

Chimérne neurotrofné faktory S-l až S-12 boli jednotlivo použité na transfekciu buniek COS-7 pomocou DEAE-dextranchlórochinovej metódy. Expresia chimérneho neurotrofného faktora bola dokazovaná metabolickým značením 35s-metioninom s následnou elektroforézou supernatantu značených buniek na polyakrylamidovom géle a autoradiografiou.Údaje sú uvedené v tabuľke 12 ako percentuálna relatívna zmena k NGF divokého typu.Údaj e boli získamé porovnaním intenzity značenia autoradiografov pri zameraní na pás pre úplný NGF s približnou molekulovou hmotnosťou 13 000, ako je uvedené na obr.8B a po imunoprecipitácii NGF divokého typu a chiméry NGF/BDNF pri použití protilátok proti NGF, ako je uvedené na obr. 8C.

9. Príklad: Neurotrofná účinnosť chimérnych neurotrofných faktorov S-l až-S-12

9.1 Materiály

Biologické skúšky s použitím ganglií dorsálnych miechových koreňov DRG, ganglií sympatika SG, ganglion nodosum NG a bunky PC12 bunečnej línie feochromocytomu v podstate tak, ako bolo hore uvedené v časti 7.

9.2. Výsledky

Účinnosť typu NGF pre chiméry S-l až S-12 bola najskôr stanovená pomocou použitia buniek PC-12. Ako miera účinnosti typu NGF bol sledovaný rast neuritov u buniek PC-12. účinnosť každej z chimérnych molekúl bola stanovená relatívne vzhľadom k účinnosti rekombinantného NGF divokého typu, NGF-wt, k jeho expresii dochádzalo bunkami COS-7 a hodnota tejto expresie bola pre tieto účely stanovená ako 100 %, ako je uvedené v tabuľke 12. Špecifická účinnosť pre každú chimérnu molekulu stanovená určením koncentrácie chimérneho neurotrófneho faktora pri použití analýzy SDS-PAGE supernatantu metabolický značených buniek COS-7 po transfekcii a opäť bola účinnosť neurotrófneho faktora, produkovaného bunkami COS-7 po transfekcii stanovená ako 100 %.

Kultúry explantátov ganglií dorsálnych koreňov, nodosných ganglií sympatika z kuracieho embrya E-8 potom boli vystavené pôsobeniu chimérnych molekúl S-l až S-12, NGF-wt, alebo len vektorom ako negatívna kontrola. Bol použitý supernatant z buniek COS-7 po transfekcii. Po 24 hodinách pestovania bol stanovený rast vlákien ako odpoveď na rekombinantnú NGF divokého typu, samotný vektor alebo chimérne molekuly S-l až S-12. V nasledujúcej tabuľke 12 je uvedené hodnotenie stupňom 0 až 5 pri porovnaní so skupinou štandardných fotografií, získaných pri štandardnej krivke závislosti odpovede na dávke pri pôsobení NGF na DRG kurčaťa E8 v dávkach 0 až 20 ng/ml. Hodnotenie 0 neznamená žiadnu odpoveď, hodnotenie 1 znamená zistiteľnú účinnosť a rast 10 až 50 vlákien, čo je ekvivalentom 20 až 100 pg/ml NGF, hodnotenie 2 znamená strednú účinnosť s rastom veľkého počtu vlákien s priemernou dĺžkou týchto vlákiem, hodnotenie 3 znamená dobrý účinnok s rastom veľkého počtu dlhých vlákien, hodnotenie 4 znamená silný účinok s bohatým rastom vlákien a hodnotenie 5 znamená masívny rast vlákien, ide o maximálnu odpoveď zodpovedajúcu nasýteným hodnotám pre NGF, približne 1 až 10 ng/ml. Výsledky v tabuľke 12 sú hodnoty pre maximálny rast vlákien, ktoré bolo možné pozorovať pri hodnote nasýtenia pre každý zo supernatantov pri pozorovaní závislosti odpovede na dávke. Supernatanty boli pozorované v množstve 0,1 až 83 mikrolitrov v konečnom objeme 2 ml. V iných štúdiách bolo možné pozorovať pri vyšších koncentráciách S-4 ešte vyšší rast.

Tabuľka 12

Hodnotenie ucínku supernatantov

kloň	relatívna expresia
NGF-wt	100	%
vektor	-
S-l	200	%
S-2	100	%
S-3	100	%
S-4	20	%
S-5	5	%
S-6	100	%
S-7	50	%
S-8	100	%
S-9	100	%
S-10	100	%
S-ll	50	%
S-12	100	%

špecifická účinnosť bunky PC12	, explantáty x
DRG	NG	SG
100 %	5	1	5
-	0	0	0
25 %	5	1	5
100 %	5	2	5
100 %	5	3	5
100 %	1	1	1
100 %	1	1	1
100 %	5	3	5
100 %	5	2	5
100 %	5	2	5
100 %	5	4	5
100 %	5	4	' 5
50 %	5	1	5
50 %	5	3	5

Rast vlákien bol hodnotený po 24 hodinách

9.3 Diskusia

Je prekvapujúce, napriek tomu, že boli celé oblasti NGF nahradené oblasťami BDNF, väčšina chimérnych molekúl NGF/BDNF si zachováva plný účinok NGF pri bunkách, ktoré na tento faktor reagujú. Rovnaké množstvá väčšiny chimérnych neurotrofných faktorov vyvolali veľký účinok na rast neuritov pri bunkách PC12, porovnateľný s účinnosťou divokého typu NGF. Prejavili sa len niektoré výnimky. Chimérna molekula S-l bola podstatne menej účinná ako NGF divokého typu a chimérne molekuly S-ll a S-12 mali len 50 % špecifickej účinnosti NGF. Avšak na udržanie účinnosti NGF u väčšiny chimérnych molekúl je neočakávané vzhľadom k tomu, že sa predpokladalo, že aj malé zmeny v kritickej oblasti reťazca NGF by mohli viesť k podstatnej strate účinnosti.

Okrem iného bolo dokázané, že väčšina chimérnych neurotrofných faktorov indukuje presne ako NGF maximálnu odpoveď pri explantáte ganglii dorsálnych koreňov a ganglii sympatika. Ako je zrejmé z tabuľky 12, v podstate všetky chimérne molekuly mali na explantáty ganglii dorsálnych koreňov a ganglii sympatika maximálnu účinnosť. Bolo dokázané, že chimérna molekula S-12 má špecifickú účinnosť na explantáty dorsálnych koreňov 3 až 5x vyššiu ako NGF, ide teda o superagonictický účinok¹’ typu NGF na aspoň niektoré cieľové bunky. Tento superagonictický účinok molekuly S-12 by bolo možné vysvetliť tak, že zaradenie časti reťazca BDNF namiesto časti reťazca NGF došlo pri štruktúre NGF k výhodnej zmene, ktorej dôsledkom je zvýšená afinita molekuly S-12 pre receptor NGF alebo môže isť o«zvýšenú stálosť molekuly S-12 oproti degradativnym pochodom.

Okrem iného bolo pozorované, že celý rad chimérnych molekúl má ešte prídavný účinok u ganglii, ktoré obyčajne reagujú skôr na BDNF ako na NGF. NGF podporuje prežívanie a a rast neuritov v kultúrach explantátu ganglií versálnych miechových koreňov, to znamená senzorických neurónov kuracieho embrya a taktiež pri explantáte ganglii paravertebrálneho reťazca sympatika, nemá však žiadny účinok na explantáty senzorických neurónov zo základu pre hlavovú časť nervovej sústavy, hlavne na ganglion nodosum, ako bolo uvedené v publikácii Lindsay a ďalší, 1985, Dev. Biol., 112:319. Naproti tomu BDNF podporuje prežívanie a rast nervových vlákien z explantátov ganglií dorsálnych miechových koreňov a explantátov ganglion nodosum, avšak nemá žiadny účinok na gangliá sympatika. Ako je uvedené v tabulke 12 rad chimérnych neurotrofných faktorov obsahujúcich časť NGF a BDNF vyvoláva priemerný až silný rast vlákien pri explantátoch ganglion nodosum, čo ukazuje na účinok typu BDNF. Bolo pozorované, že chimérne molekuly 3, 4, 6, 9, 10 a 12 majú na ganglion nodosum účinok vyšší ako bolo možné pozorovať pre NGF. Je preto veľmi pravdepodobné, že rad modifikácií reťazca od aminoterminálneho až ku karboxyterminálnemu zakončeniu NGF môže vyvalať účinnosť, podobnú BDNF alebo účinnosť akéjkoľvek ďalšej látky zo skupiny neurotrofných faktorov.

Ďalej budú uvedené údaje o uložení vzoriek cDNA vo verejnej zbierke kultúr.

10. Uloženie mikroorganizmov

Nasledujúce vzorky cDNA boli uložené vo verejnej zbierke kultúr Američan Type Culture Collection v Rockvile, M.D., USA.

Chimérna molekula	skratka	č. v zbierke
pBJ51mN/hB-S4	S4	40859
pBJ51mN/hB-S9	S9	40861
pBJ51mN/hB-S10	S10	40858
pBJ51mN/hB-S12	S12	40860
pC8hB/mN-R8	R8	40862
pC8hMN/myc-NMl	NM1	40864
pC8hB/myc-BMl	BM1	40863

Je zrejmé,	že vynález nemôže	byť	obmedzený na
jednotlivé výhodné	uskutočnenia, ktoré	boli	v prihláške
uvedené vzhľadom k	tomu, že by bolo možné	vykonať ešte celý

rad bežných modifikácií spadajúcich do rozsahu vynálezu.

Or. ZDENKA KORCOVÁ

Claims (67)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Chimérne biekoviny s neurotrofnou v podstate tvorené prvým neurotrofnym faktorom, účinnosťou, v ktorom je

   3 až 13 po sebe nasledujúcich aminokyselín nahradených reťaz com aminokyselín podobných veľkostí z druhého neurotrofného faktora, výsledná bielkovina sa od prvého neurotrofného faktora rozlišuje reťazcom aspoň troch aminokyselín.
2. 2. Chimérna bielkovina podľa nároku 1, v ktorej sa prvý a druhý neurotrofný faktor volí zo skupiny neurotrofný faktor, odvodený od mozgového tkaniva, ciliárny neurotrofný faktor, neurotrofný-3- a faktor rastu nervových buniek.
3. 3. Chimérna bielkovina podľa nároku 2, v ktorej prvým neurotrofným faktorom je faktor rastu nervových buniek a druhým neurotrofným faktorom je neurotrofný faktor, odvodený od mozgového tkaniva.
4. 4. Chimérna bielkovina podľa nároku 3, pre ktorú je kódom plazmid pBJ51mN/hB-Sl alebo jeho funkčný ekvivalent, chimérna bielkovina má reťazec aminokyselín zodpovedajúci chimérnej molekule SI na obr.10.
5. 5. Chimérna bielkovina podľa nároku 3, pre ktorú je kódom plazmid pBJ51mN/hB-S2 alebo jeho funkčný ekvivalent, chimérna bielkovina má reťazec aminokyselín zodpovedajúci chimérnej molekule S2 na obr. 10.
6. 6. Chimérna bielkovina podľa nároku 3, pre ktorú je kódom plazmid pBJ51mN/hB-S3 alebo jeho funkčný ekvivalent, chimérna bielkovina má reťazec aminokyselín zodpovedajúci chimérnej molekule S3 na obr. 10.
7. 7. Chimérna bielkovina podľa nároku 3, pre ktorú je kódom plazmid pBJ51nM/hB-S4, uložený v zbierke ATCC pod číslom 40859 alebo jeho funkčný ekvivalent, chimérna bielkovina má reťazec aminokyselín, zodpovedajúci chimérnej molekule S4 na obr. 10.
8. 8. Chimérna bielkovina podľa nároku 3, pre ktorú je kódom plazmid pBJ51mN/hB-S5 alebo jeho funkčný ekvivalent, chimérna bielkovina má reťazec aminokyselín zodpovedajúci chimérnej molekule S5 na obr. 10.
9. 9. Chimérna bielkovina podľa nároku 3, pre ktorú je kódom plazmid pBJ51mN/hB-S7 alebo jeho funkčný ekvivalent, chimérna bielkovina má reťazec aminokyselín zodpovedajúci chimérnej molelule S7 na obr. 10.
10. 10. Chimérna bielkovina podľa nároku 3, pre ktorú je kódom plazmid pBJ51mN/hB-S8 alebo jeho funkčný ekvivalent, chimérna bielkovina má reťazec aminokyselín zodpovedajúci chimérnej molekule S8 na obr. 10.
11. 11. Chimérna bielkovina podľa nároku 3, pre ktorú je kódom plazmid pBJ51mN/hB-S9, uložený v zbierke ATCC pod číslom 40861 alebo jeho funkčný ekvivalent chimérna bielkovina má reťazec aminokyselín zodpovedajúci chimérnej molekule S9 na obr. 10.
12. 12. Chimérna bielkovina podľa nároku 3 pre ktorú je kódom plazmid pBJ51mN/hB-S10, uložený v zbierke ATCC pod číslom 49858 alebo jeho funkčný ekvivalent, chimérna bielkovina má reťazec aminokyselín zodpovedajúci chimérnej molekule S10 na obr. 10.
13. 13. Chimérna bielkovina podľa nároku 3, pre ktorú je kódom plazmid pBJ51mN/hB-S12, uložený v zbierke ATCC pod číslom 40860 alebo jeho funkčný ekvivalent, chimérna bielkovina má reťazec aminokyselín zodpovedajúci chimérnej molekule S12 na obr. 10.
14. 14. Chimérna bielkovina podľa nároku .2, v ktorej je prvým neurotrofnym faktorom BDNF a druhým neurotrofnym faktorom NGF.
15. 15. Chimérna bielkovina podľa nároku 14, pre ktorú je kódom plazmid pC8hB/hN-R7 alebo jeho funkčný ekvivalent, chimérna bielkovina má reťazec aminokyselín zodpovedajúci chimérnej molekule R7 na obr. 5.
16. 16. Chimérna bielkovina podľa nároku 14,pre ktorú je kódom plazmid pC8hB/hN-R8, uložený v zbierke ATCC pod číslom 49862 alebo jeho funkčný ekvivalent, chimérna bielkovina má reťazec aminokyselín zodpovedajúci reťazcu chimérnej molekule S8 na obr. 5.
17. 17. Chimérna bielkovina podľa nároku 14, pre ktorú je kódom plazmid pC8hB/hN-R9 alebo jeho fukčný ekvivalent, chimérna bielkovina má reťazec aminokyselín zodpovedajúci reťazcu chimérnej molekuly R2 na obr. 5.
18. 18. Chimérna bielkovina podľa nároku 14, pre ktorú je kódom plazmid pC8hB/hN-R10 alebo jeho funkčný ekvivalent, chimérna bielkovina má reťazec aminokyselín zodpovedajúci reťazcu chimérnej molekuly RIO na obr. 5.
19. 19. Chimérna bielkovina podľa nároku 1, v ktorej sú prvým a druhým neurotrofnym faktorom molekuly zo skupiny neurotrofínov.
20. 20. Chimérna bielkovina podľa nároku 19, obsahujúca štyri cysteínové zvyšky, uložené v štyroch nasledujúcich polohách reťazca aminokyselín chimérnej bielkoviny:»

    aminokyselina aminokyselina aminokyselina aminokyselina aminokyselina aminokyselina 14 57 67 79 108 a 110 ,

    alebo v podobnej polohe vzhľadom k vloženým alebo vypusteným častiam v homológnom reťazci, ktorý je spoločný zlúčeninám zo skupiny neurotrofínov.
21. 21. Chimérna bielkovina podľa nároku 19, obsahujúca päť cysteínových zvyškov uložených v piatich z nasledujúcich polôh reťazca aminokyselín chimérnej bielkoviny: aminokyselina 14 aminokyselina 57 aminokyselina 67 aminokyselina 79 aminokyselina 108 a aminokyselina 110, alebo v podobnej polohe vzhľadom k vloženým alebo vypusteným častiam v homológnom reťazci,ktorý je spoločný zlúčeninám zo skupiny neurotrofínov.
22. 22. Chimérna bielkovina podľa nároku 19, obsahujúca šesť cysteínových zvyškov, uložených v nasledujúcich polohách reťazca aminokyselín chimérnej bielkoviny: aminokyselina 14 aminokyselina 57 aminokyselina 67 aminokyselina 79 aminokyselina 108 a aminokyselina 110 alebo v podobnej polohe vzhľadom k vloženým alebo vypusteným častiam v homologickom reťazci, ktorý je spoločný zlúčeninám zo skupiny neurotrofinov.
23. 23. Chimérna bielkovina podľa nároku 19, v ktorej je pi bielkoviny v rozsahu 9 a 10.
24. 24. Chimérna bielkovina podľa nároku 23, obsahujúca štyri cysteinové zvyšky, uložené v štyroch z nasledujúcich polôh v reťazci aminokyselín chimérnej bielkoviny: aminokyselina 14 aminokyselina 57 aminokyselina 67 aminokyselina 79 aminokyselina 108 a aminokyselina 110, alebo v podobnej polohe vzhľadom k vloženým alebo vypusteným častiam v homologickom reťazci, ktorý je spoločný zlúčeninám zo skupiny neurotrofinov.
25. 25. Chimérna bielkovina pódia nároku 23, obsahujúca päť cysteínových zvyškov, uložených v piatich z nasledujúcich polôh v reťazci aminokyselín chimérnej bielkoviny: aminokyselina 14 aminokyselina 57 aminokyselina 67 aminokyselina 79 aminokyselina 108 a aminokyselina 110 , alebo v podobnej polohe vzhľadom k vloženým alebo vypusteným častiam v homologickom reťazci, ktorý je spoločný zlúčeninám zo skupiny neurotrofinov.
26. 26. Chimérna bielkovina podlá nároku 23, obsahujúca šesť cysteinových zvyškov, uložených v nasledujúcich polohách reťazca aminokyselín chimérnej bielkoviny: aminokyselina aminokyselina aminokyselina aminokyselina aminokyselina aminokyselina

    108 a

    110, alebo v podobnej polohe vzhľadom k vloženým alebo vypusteným častiam v homologickom reťazci, ktorý je spoločný zlúčeninám zo skupiny neurotrofínov.
27. 27. Chimérna bielkovina s neurotrofnym účinkom, tvorená časťou neurotrofného faktora a časťou, obsahujúcou 8 až 13 po sebe nasledujúcich aminokyselín z druhého peptidu, pri čom táto časť peptidu poskytuje chimérnu bielkovinu neurot rof nu účinnosť odlišnú od účinnosti neurotrofneho faktora.

    28. Chimérna bielkovina podľa nároku 27, v ktorej peptidovou časťou je bielkovina myc. 29. Chimérna bielkovina podľa nároku 28, v ktorej

    reťazcom bielkoviny myc je reťazec Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu.
28. 30. Chimérna bielkovina podľa nároku 27, v ktorej neurotrofnym faktorom je BDNF.
29. 31. Chimérna bielkovina podľa nároku 30, pre ktorú je kódom plazmid pC8hB/myc-BMl, uložený v zbierke ATCC pod číslom 40863 alebo jeho funkčný ekvivalent, chimérna bielkovina má reťazec aminokyselín zodpovedajúci reťazcu chimérnej molekuly BM1 na obr. 5.
30. 32. Chimérna bielkovina podľa nároku 27, v ktorej neurotrófnym faktorom je NGF.
31. 33. Chimérna bielkovina podľa nároku 32, pre ktorú je kódonm plazmid pC8hmN/myc-NMl, uložený v zbierke ATCC pod číslom 40864 alebo jeho funkčný ekvivalent, chimérna bielkovina má reťazec aminokyselín, zodpovedajúci chimérnej molekule NM1 na obr. 5.
32. 34. Chimérna bielkovina s reťazcom aminokyselín, zodpovedajúcim reťazcu chimérnej molekule S6 na obr.10.
33. 35. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre bielkovinu podľa nároku 1.
34. 36. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérnu bielkovinu podľa nároku 2.
35. 37. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérnu bielkovinu podľa ná roku 3.
36. 38. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérnu bielkovinu podľa nároku 4.
37. 39. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérnu bielkovinu podľa nároku 5.
38. 40. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérnu bielkovinu podľa nároku 6.
39. 41. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérnu bielkovinu podlá nároku 7.
40. 42. Molekula nukleovej kyseliny ale^o jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérnu bielkovinu podľa nároku 8.
41. 43. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérnu bielkovinu podľa nároku 9.
42. 44. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérnu bielkovinu podľa nároku 10.
43. 45. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podľa nároku 11.
44. 46. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podľa nároku 12.
45. 47. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podľa nároku 13.
46. 48.Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podľa nároku 14.
47. 49.Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podľa nároku 15.

    ι
48. 50. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podlá nároku 16.
49. 51. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podlá nároku 17.
50. 52. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podľa nároku 18.
51. 53. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podľa nároku 19.
52. 54. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podľa nároku 20.
53. 55. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podľa nároku 21.
54. 56. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podľa nároku 22.
55. 57. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podľa nároku 23.
56. 58. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podľa nároku 24.

    L.

    «
57. 59. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podlá nároku 25.
58. 60. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podlá nároku 26.
59. 61. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podlá nároku 27.
60. 62. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podľa nároku 28.
61. 63. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podľa nároku 29.
62. 64. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podľa nároku 30.
63. 65. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podľa nároku 31.
64. 66. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podľa nároku 32.
65. 67. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podľa nároku 33.
66. 68. Molekula nukleovej kyseliny alebo jej funkčný ekvivalent s kódovým reťazcom pre chimérny neurotrofný faktor podlá nároku 34.
67. 69. Farmaceutický prostriedok, vyznačuj úci satým, že ako účinnú zložku obsahuje chimérnu bielkovinu s neurotrofnou účinnosťou, tvorenú prvým neurotrofným faktorom, v ktorom je 3 až 13 po sebe nasledujúcich aminokyselín nahradených reťazcom aminokyselín druhého neurotrofného faktora s podobnou dĺžkou, pričom sa výsledná chimérna bielkovina líši v svojom reťazci o aspoň 3 aminokyseliny od prvého neurotrofného faktora.