ES2295027T3 - Factores neurotroficos en el tratamiento de disfunciones de los nervios perifericos del area pelvica. - Google Patents
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Abstract
Utilización de un factor neurotrófico, que es una neurturina (NTN), un factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), o variantes de los mismos sustituidas de forma conservadora, solos o en cualquier combinación, o secuencias de nucleótidos que codifican dichos factores neurotróficos para la fabricación de un producto médico para el tratamiento de disfunciones eréctiles del pene.
Description
Factores neurotróficos en el tratamiento de
disfunciones de los nervios periféricos del área pélvica.
La presente invención se refiere a la
utilización de factores neurotróficos para la fabricación de
productos médicos para el tratamiento de disfunciones eréctiles del
pene.
La erección es predominantemente un fenómeno
vascular mediado por nervios. Los nervios pélvicos parasimpáticos
tienen una importancia primordial en la relajación del músculo liso
requerida para la tumescencia del pene, aunque los nervios
hipogástricos simpáticos también pueden desempeñar algún papel. En
el hombre, los nervios parasimpáticos que inervan el pene salen de
la médula espinal sacra y aportan la entrada a células ganglionares
en el plexo pélvico. El plexo pélvico es una asociación de neuronas
simpáticas y parasimpáticas implicadas en funciones eliminatorias y
reproductivas (Dail, 1996). Las neuronas inductoras de la erección
del ganglio pélvico mayor (MPG) envían axones a través de los
nervios cavernosos para inervar los vasos sanguíneos y el tejido
eréctil del pene (Dail, 1996; Quinlan, 1989). Recientemente, en
varios mamíferos se ha establecido bien el papel fundamental del
óxido nítrico (NO), que actúa como neurotransmisor en los nervios
que inervan las arterias del pene y el músculo liso cavernoso
(Andersson, 1995). Se difunde dentro del músculo liso, aumenta la
síntesis de GMPc y disminuye el Ca^{2+} citosólico, induciendo de
este modo la relajación (Buj-Bello, 1995). La
erección del pene normal en el hombre depende de una inervación
intacta, del suministro adecuado de sangre y de un tejido eréctil
sano (Andersson, 1995). Por consiguiente, la interrupción de las
vías neuronales o los trastornos que afectan la unión neuromuscular
es probable que produzca la disfunción eréctil (Batra, 1991).
A pesar del progreso en las técnicas quirúrgicas
la impotencia neurogénica todavía es un efecto secundario no
deseado pero que a menudo se encuentra en la cirugía prostática,
vesical o rectal (Walsh, 1982). También es un síntoma común en
neuropatías autónomas y sensoriales, por ejemplo, en hombres
diabéticos (Eardley, 1991). Clínicamente, existe una necesidad de
descubrir moléculas que mantengan la supervivencia y aumenten la
regeneración de los nervios del pene.
Recientemente se describió que la hormona del
crecimiento mejora la regeneración de ciertos nervios del pene en
ratas (Jung, 1998). Se sugiere que el efecto está mediado por el
factor del crecimiento I similar a la insulina
(IGF-I), que es un factor neurotrófico potente para
muchas poblaciones neuronales en el sistema nervioso central y
periférico (Ishii, 1993). También se ha pensado que el factor del
crecimiento del fibroblasto básico (FGF-2)
desempeña un papel en la fisiología de la erección del pene (Te,
1994). Se ha sugerido la utilización terapéutica de proteínas
neurotróficas o sus miméticas de molécula pequeña como remedios
potenciales en diversas enfermedades y agresiones del sistema
nervioso central (Hefti, 1997, Skaper, 1998). Sin embargo, para
hacer posible una utilización exitosa de las mencionadas moléculas
en la impotencia neurogénica, se requiere más conocimiento sobre
los factores fisiológicos que regulan el mantenimiento y la
regeneración de las neuronas del pene.
Mientras estudiaban el GDNF y la expresión del
ARNm de sus receptores en ratas, los presentes inventores obtuvieron
resultados que indicaban que GDNF y sus receptores pueden
desempeñar un papel en la inervación del pene de rata. Alentados
por estas observaciones, los presentes inventores continuaron sus
programas de investigación y fueron capaces de encontrar una
utilidad mucho más amplia de los factores neurotróficos. De hecho,
se dio a conocer una solución para algunos de los problemas
discutidos anteriormente, es decir, un tratamiento para las
disfunciones de los nervios periféricos del área pélvica, entre las
que se incluyen las disfunciones eréctiles, aunque no quedan
restringidas a las mismas, en base a las mencionadas observaciones
preliminares.
Los aspectos característicos de la presente
invención son tal como que se definen en las reivindicaciones.
La figura 1 representa la expresión del ARNm de
NTN en el cuerpo esponjoso del pene.
La figura 2 representa la expresión de los ARNm
para los componentes del receptor de NTN en el MPG.
La figura 3 representa el análisis por
transferencia Northern de la expresión del ARNm de NTN en órganos
pélvicos de rata adulta.
La figura 4 representa el transporte axonal
retrógrado de ^{125}I-NTN desde el cuerpo
esponjoso del pene hasta el MPG y el DRG.
La figura 5 representa los niveles de ARNm de
NTN en pene de rata adulta después de la axotomía del nervio
cavernoso bilateral (ax) o en una operación simulada.
La figura 6 representa la histoquímica de la
NADPH diaforasa en penes de ratones GFR\alpha2^{-/-} y de tipo
salvaje.
La figura 7 representa la expresión del ARNm de
GDNF en el cuerpo esponjoso del pene.
La figura 8 representa el análisis por
transferencia Northern de la expresión del ARNm de GDNF en órganos
pélvicos de rata adulta.
La figura 9 representa la cuantificación y
especificidad del transporte retrógrado de
^{125}I-GDNF dentro del MPG y de diferentes DRGs
de rata adulta.
La figura 10 representa el transporte axonal
retrógrado de ^{125}I-GDNF desde el cuerpo
esponjoso del pene hasta el MPG y el DRG.
La figura 11 representa el crecimiento de
neuritas en un ganglio trigeminal de ratón en el día 13 embrionario,
después de 3 días en gel de colágeno.
La figura 12 representa la expresión de los ARNm
de GFR\alpha3 y Ret en el MPG de rata adulta y del ARNm de
GFR\alpha3 en el DRG S1.
La figura 13 representa la preparación de ARN y
la hibridación Northern de la expresión del ARNm de NGF, BDNF y
NT-3 en órganos pélvicos de rata adulta.
La figura 14 representa la cuantificación y
especificidad del transporte retrógrado de
^{125}I-NGF, ^{125}I-BDNF,
^{125}I-NT-3 dentro del MPG de
rata adulta y de diferentes DRGs.
Los dibujos se analizan con detalle al final de
la Descripción General de la presente Invención.
A lo largo de la presente solicitud se hace
referencia a varias publicaciones, muchas en paréntesis incluyen el
apellido del primer autor con el año de la publicación. Las citas
completas de estas publicaciones se facilitan al final de la
Descripción General de la Invención.
En la presente invención los términos utilizados
tienen el significado que generalmente tienen en los campos de la
bioquímica, farmacología, tecnología del ADN recombinante, que
incluye la producción de animales transgénicos, pero algunos
términos se utilizan con un significado más amplio o que de algún
modo se desvía del contexto normal. Por consiguiente, a efectos de
evitar la incertidumbre provocada por términos con un significado
poco claro, algunos de los términos utilizados en la presente
descripción y en las reivindicaciones se definen con más detalle a
continuación.
El término "factores neurotróficos"
comprende el factor neurotrófico derivado de la línea celular glial
(GDNF), compuestos relacionados con la familia o neurotrofinas
(NTFs), sus receptores, así como sus sustancias de unión. También
se incluyen en la definición las secuencias de nucleótidos que
codifican dichos factores. Los compuestos relacionados con la
familia del GDNF comprenden la neurturina (NTN), el factor
neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), la artemina (ARTN)
y/o la persefina (PSPN). Las neurotrofinas (NTFs) comprenden el
factor nervioso (NGF), el factor neurotrófico derivado del cerebro
(BDNF), la neurotrofina-3 (NT-3) y/o
la neurotrofina 4/5 (NT-4/5).
Los "factores neurotróficos" también
incluyen las variantes sustituidas de forma conservadora o los
derivados que tienen sustancialmente el mismo efecto que dichos
factores neurotróficos sobre sus receptores o correceptores. Los
receptores o correceptores comprenden la tirosina quinasa Ret y el
receptor de la familia del GDNF \alpha:s (GFR\alphas) y los
receptores proteína tirosina quinasa trk (trkA-C)
así como el receptor p75.
Las "neurotrofinas (NTFs)" son proteínas
que regulan la diferenciación neuronal, la maduración y la
supervivencia. Las NTFs son el factor nervioso (NGF), el factor
neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), la
neurotrofina-3 (NT-3), la
neurotrofina 4/5 (NT-4/5) (Davies, 1994; Sariola y
otros, 1994). Las NTFs se unen específicamente a receptores
proteína tirosina quinasa trk y los activan (Barbacid, 1995). De
este modo, el NGF activa trkA, el BDNF y la NT-4/5
activan trkB, y la NT-3 es un ligando de trkC, pero
también de trkA y trkB, aunque menos eficazmente. Además de las
formas catalíticas de longitud completa de los receptores trk,
también existen algunas isoformas de trk obtenidas alternativamente
por corte y empalme ("spliced"). El ARNm de la trkB catalítica
de longitud completa (trkB.TK+) se corta y empalma alternativamente
en dos isoformas truncadas (trkB.T1 y trkB.TS). También se
describen cuatro formas truncadas de la trkC, además de otras
isoformas con insertos en el dominio tirosina quinasa.
El término "derivados o variantes"
significa compuestos que actúan como los dos grupos principales de
"factores neurotróficos" de la presente invención sobre las
señales de transmisión de sus respectivos receptores. Entre los
"derivados o variantes" se incluyen polipéptidos
"sustancialmente homólogos" a nivel de aminoácido que tienen
una semejanza o identidad significativa, como mínimo, del 80%,
preferentemente del 85%, la más preferente superior al 90%, con
formas humanas de dichos factores neurotróficos.
El término "factores neurotróficos y variantes
de los mismos sustituidas de forma conservadora" comprende
polipéptidos que tienen la estructura, propiedades y funciones
características de los "factores neurotróficos" definidos
anteriormente. De este modo, el término "factores neurotróficos y
variantes de los mismos sustituidas de forma conservadora"
incluye los factores neurotróficos mencionados anteriormente, en los
que se sustituyen uno o más residuos de aminoácidos por otro
residuo de aminoácido. También se incluyen en el término las formas
truncadas, complejadas o sustituidas químicamente de dichos factores
neurotróficos. Entre las formas sustituidas químicamente se
incluyen, por ejemplo, las formas alquiladas, esterificadas,
eterificadas o amidizadas con un grado de sustitución bajo,
especialmente utilizando moléculas pequeñas como sustituyentes,
tales como metilo o etilo, siempre que las sustituciones no alteren
las propiedades y funciones de los factores neurotróficos. Las
variantes truncadas, complejadas y/o sustituidas de dichos
polipéptidos se pueden producir mediante técnicas sintéticas o
semisintéticas, que incluyen las enzimáticas y del ADN recombinante.
El único prerrequisito adicional es que las variantes sean todavía
sustancialmente homólogas a los factores neurotróficos mencionados,
y tengan las propiedades y/o expresen las funciones características
de los mismos.
El término "factores neurotróficos y variantes
de los mismos sustituidas de forma conservadora" abarca todas
las variantes posibles obtenidas por corte y empalme de los
"factores neurotróficos" definidos anteriormente. Los
"factores neurotróficos" pueden existir en diferentes
isoformas. El término "isoforma" se refiere a las diferentes
formas de la misma proteína, que se originan a partir de diferentes
procedencias, por ejemplo, tejidos. Las isoformas de una proteína o
un polipéptido se pueden expresar mediante genes alélicos presentes
en diferentes tejidos en diferentes especies, por ejemplo, en
especies de mamíferos de origen humano o murino. En la presente
invención, el término incluye fragmentos, complejos y sus variantes.
Las isoformas de los factores neurotróficos se pueden generar
mediante la escisión de la proproteína. Existen diferentes
reacciones, entre las que se incluyen diferentes reacciones
enzimáticas y no enzimáticas, proteolíticas y no proteolíticas, que
son capaces de crear formas truncadas, derivadas y complejadas de
los factores neurotróficos y sus variantes conservadas.
Preferentemente, todos los "factores
neurotróficos y sus variantes conservadas" deberían ser
reconocibles cuando se utilizan sustancias de unión capaces de
reconocer y de unirse específicamente a factores neurotróficos
naturales de mamífero, entre los que se incluyen los humanos y
murinos, o como mínimo a una parte específica de dichos factores.
Tales sustancias de unión son, por ejemplo, anticuerpos o ligandos
que reconocen o se unen específicamente a los factores
neurotróficos, receptores de los factores neurotróficos entre los
que se incluyen los GFR\alpha:s (GFR\alpha1-4),
los receptores proteína tirosina quinasa trk (trkA, trkB, trkC) u
otras proteínas o péptidos de unión, que comprenden partes
específicas de los mencionados GFR\alpha:s, pero sobre todo se
hace referencia a anticuerpos capaces de reconocer específicamente,
como mínimo, un factor neurotrófico solo o en cualquier
combinación. Entre los anticuerpos se incluyen anticuerpos
policlonales y/o monoclonales, así como fragmentos o derivados de
los mismos. Preferentemente, las mencionadas sustancias de unión
deberían reconocer y unirse a epítopos o sitios activos específicos
de los factores neurotróficos.
Las sustancias de unión también comprenden
moléculas pequeñas capaces de unirse específicamente a los
"factores neurotróficos" o a sus respectivos
"receptores". Las "sustancias de unión" se pueden producir
mediante dominios específicos de dichos "factores
neurotróficos", sus isómeros, y sus fragmentos, receptores,
derivados, variantes y complejos, así como receptores con el
prerrequisito de que sean capaces de funcionar en las respectivas
vías de señalización.
Los "factores neurotróficos" actúan como
antígenos y se encuentran como tales o como composiciones capaces
de provocar una respuesta de anticuerpos específica al "factor
neurotrófico o variante conservada del mismo" respectivo. Dichos
anticuerpos se pueden producir mediante técnicas convencionales para
la producción de anticuerpos policlonales, así como de anticuerpos
monoclonales. Entre los métodos para la preparación de anticuerpos
monoclonales se incluyen las técnicas de hibridoma. Se pueden
desarrollar fragmentos de anticuerpos o de otras proteínas de unión
como péptidos de unión específicos mediante técnicas de expresión en
fagos ("phage display") y se pueden producir mediante técnicas
del ADN recombinante. Todos los métodos son bien conocidos por los
especialistas de la técnica y se describen en manuales de
laboratorio.
En la presente invención el término "secuencia
de ácidos nucleicos" significa cualquier secuencia de nucleótidos
aislada y purificada o fragmento de la misma que codifica
"factores neurotróficos" o "secuencias de ácidos
nucleicos" con semejanza sustancial, preferentemente a las de
mamífero, especialmente de origen humano, cuyas secuencias de
nucleótidos son capaces de codificar los factores neurotróficos de
la presente invención. Las "secuencias de ácidos nucleicos" de
la presente invención codifican los "factores neurotróficos" de
las reivindicaciones y se pueden utilizar como tales que se pueden
introducir en células huésped adecuadas u organismos huésped para
proporcionar métodos in vitro para la producción de proteínas
de factores neurotróficos o para la utilización in vivo en
el tratamiento de disfunciones eréctiles del pene.
Las "secuencias de ácidos nucleicos" de la
presente invención no se encuentran en su estado natural pero se
aíslan y purifican, preferentemente, a partir de su entorno natural
como los ARNm expresados de forma transitoria a partir de tejidos
adecuados. Posteriormente, los ARNm se purifican y multiplican in
vitro a efectos de proporcionar nuevas copias por medios
técnicos, las cuales son capaces de codificar dichos factores
neurotróficos, derivados o variantes de los mismos.
\newpage
En el presente contexto el término "ADNc"
significa una secuencia de ADN que se puede obtener mediante
traducción inversa de ARNm traducido a partir de la secuencia de
ADN genómico. También son útiles secuencias de nucleótidos
antisentido en algunas aplicaciones de la presente invención.
El término "tecnología antisentido"
significa lo contrario al hecho de que el mensaje de ARN esté en el
sentido correcto. "En sentido" significa que cuando una copia
de la cadena a del ADN se transcribe, se conserva la secuencia de
bases en el ADN, con la excepción de que la secuencia es exactamente
complementaria al código original. El ARNm, que ahora contiene
instrucciones del ADN en su propio lenguaje, se traduce, a
continuación, a un polipéptido. Si se realiza correctamente, el
mensaje se dice que se encuentra en el sentido correcto. Sin
embargo, si se encuentra presente un ARN exactamente complementario
(es decir, antisentido) para combinarse con el ARN sentido, el
mensaje del ARN sentido se anula.
Para hacer un complemento de ARN, se puede
producir un mensaje antisentido a partir de la "otra cadena del
ADN" e introducir en una célula o se puede transcribir por la
célula después de la introducción de un gen antisentido. Cuando el
ARN sentido se empareja o hibrida con su ARN antisentido no se puede
combinar con un ribosoma y se inactiva. De este modo, el gen
original se bloquea por su propio ARN antisentido sin que otros
genes queden afectados. La tecnología antisentido se incluye como
medio para la modulación y modificación del soporte trófico de los
nervios.
El término "secuencia de ácidos nucleicos que
codifica factores neurotróficos" significa secuencias de ácidos
nucleicos que codifican el factor neurotrófico derivado de la línea
celular glial (GDNF), compuestos relacionados con la familia o
neurotrofinas (NTFs), sus receptores, así como sus sustancias de
unión. También se incluyen en la definición las secuencias de
nucleótidos que codifican dichos factores. Los compuestos
relacionados con la familia del GDNF comprenden la neurturina
(NTN), el factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF),
la artemina (ARTN) y/o la persefina (PSPN). Las neurotrofinas (NTFs)
comprenden el factor nervioso (NGF), el factor neurotrófico
derivado del cerebro (BDNF), la neurotrofina-3
(NT-3) y/o la neurotrofina 4/5
(NT-4/5), así como "secuencias de ácidos nucleicos
sustancialmente idénticas o similares". Dichas "secuencias de
nucleótidos" o sus secuencias complementarias o secuencias que
comprenden partes de las mismas, por ejemplo, fragmentos truncados
en el extremo 3'-terminal o
5'-terminal, así como aquellas secuencias de
nucleótidos que contienen mutaciones puntuales, son especialmente
útiles como sondas o cebadores para la preparación de
construcciones de ADN para la fabricación de células o líneas
celulares que contengan dichas secuencias de ácidos nucleicos.
Sin embargo, para los expertos en la técnica
está claro que se pueden preparar otras secuencias de ácidos
nucleicos capaces de codificar factores neurotróficos y útiles para
su producción. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican
factores neurotróficos deberían ser capaces de hibridarse en
condiciones astringentes (Sambrook, J. y otros, "Clonación
Molecular: Un Manual de Laboratorio" ("Molecular Cloning: A
Laboratory Manual"), Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor
Laboratory, 1989).
Las "secuencias de ácidos nucleicos" de la
presente invención deberían tener una "semejanza sustancial"
con las secuencias que codifican los factores neurotróficos
definidos anteriormente. "Semejanza sustancial" en este
contexto significa que las secuencias de nucleótidos cumplen los
prerrequisitos definidos anteriormente y tienen una semejanza
significativa, es decir, una identidad de secuencia, como mínimo del
60%, preferentemente del 70%, la más preferente, superior al 80%,
con dichas secuencias. Este es también un criterio adecuado para la
definición de variantes sustituidas de forma conservadora. Debería
tenerse en cuenta la degeneración del codón.
El término "secuencias de ácidos nucleicos que
codifican factores neurotróficos" incluye sus formas truncadas o
complejadas, así como mutaciones puntuales de dichas secuencias de
ácidos nucleicos siempre que sean capaces de codificar secuencias
de aminoácidos que tengan las características estructurales
esenciales, así como las propiedades y/o funciones de dichos
factores neurotróficos. Los ácidos nucleicos son útiles como tales o
insertados en vectores de transformación o expresión o huéspedes,
siendo dichas "secuencias de ácidos nucleicos" capaces de
codificar y expresar dichos "factores neurotróficos", los
cuales son reconocibles por "sustancias de unión" que
reconocen específicamente dichos "factores neurotróficos".
El término "factores neurotróficos" incluye
también, además de los polipéptidos o proteínas, "secuencias de
ácidos nucleicos" que codifican "factores neurotróficos y
variantes de los mismos sustituidas de forma conservadora".
El término "composición" o "producto
médico" significa los ingredientes activos combinados, como
mínimo, con un agente auxiliar farmacéuticamente aceptable, que es
compatible con el ingrediente activo y la vía de administración.
Entre los agentes auxiliares se incluyen transportadores líquidos o
sólidos, así como otros aditivos líquidos o sólidos. Las
composiciones se pueden incluir en un recipiente, envase o
dispensador junto con una aguja de inyección e instrucciones para
la utilización. Las secuencias de ácidos nucleicos de la presente
invención son administrables en terapia génica mediante la
introducción de secuencias de nucleótidos con células, vectores
adecuados o mediante otros sistemas de liberación conocidos per
se.
La respuesta provocada por los factores
neurotróficos puede variar. La expresión del receptor y el
transporte retrógrado de neurturina, GDNF, persefina artemina y/o
neurotrofinas en nervios sensoriales que inervan el pene sugiere
que estos factores del crecimiento se pueden utilizar para producir
un producto médico para el tratamiento de disfunciones eréctiles
del pene.
Tal como se ha descrito en los antecedentes de
la presente invención, la erección es predominantemente un fenómeno
vascular mediado por nervios. Los nervios pélvicos parasimpáticos
tienen una importancia primordial en la relajación del músculo liso
requerida para la tumescencia del pene aunque los nervios
hipogástricos simpáticos también pueden desempeñar cierto papel. En
el hombre los nervios parasimpáticos que inervan el pene salen de
la médula espinal sacra y aportan la entrada a células ganglionares
en el plexo pélvico. El plexo pélvico es una asociación de neuronas
simpáticas y parasimpáticas implicadas en funciones eliminatorias y
reproductivas (Dail, 1996). En la rata macho, el plexo pélvico se
marca bilateralmente por un único ganglio grande, el ganglio
pélvico mayor (MPG), el cual convierte a la rata en un excelente
modelo animal en el estudio de la erección (Quinlan, 1989). La
erección del pene normal en mamíferos depende de una inervación
intacta, de suministro de sangre adecuado y de un tejido eréctil
sano (Andersson, 1995). Por consiguiente, la interrupción de las
vías neuronales o trastornos que afectan la unión neuromuscular es
probable que produzca la disfunción eréctil (Batra, 1991).
Se sabe que la NTN tiene actividades promotoras
de la supervivencia sobre, por ejemplo, neuronas sensoriales,
simpáticas, entéricas, motoras y dopaminérgicas del cerebro medio
(Kotzbauer, 1996; Heuckeroth, 1999; Klein, 1997; Horger, 1998). Las
acciones biológicas de los miembros de la familia del GDNF están
mediadas a través de un complejo de receptor multicomponente que
consiste en un ligando unido a glicosilfosfatidilinositol (GPI) que
se une a componentes "a", denominados receptores de la familia
del GDNF, GFR\alpha:1-4, y se ha dado a conocer
el receptor de la transducción de señal tirosina quinasa Ret
(Airaksinen, 1999).
Los resultados de los ensayos in vitro
muestran un emparejamiento preferencial de NTN con GFR\alpha2 y
GDNF con GFR\alpha1, ARTN con GFR\alpha3 y PSPN con
GFR\alpha4. Aunque existe todavía algo de promiscuidad en lo
concerniente a las especificidades de ligando de los GFR\alpha:s,
recientes estudios de supresión de genes han sugerido especificidad
in vivo de las interacciones entre los correceptores unidos a
GPI y los miembros de la familia del GDNF (Airaksinen, 1999).
La sorprendente semejanza fenotípica entre
ratones con supresión de genes GFR\alpha2 o NTN apoya el concepto
de que GFR\alpha2 es un correceptor fisiológico de NTN (Rossi,
1999; Heuckeroth, 1999). Los ratones descritos tienen varios
defectos en el sistema nervioso parasimpático, lo que sugiere que la
NTN se requiere para el desarrollo y/o mantenimiento de ciertas
neuronas parasimpáticas postganglionares.
El GDNF puede interaccionar in vitro con
múltiples complejos GFR\alpha/Ret, (Baloh, 1997; Jing, 1997;
Sanicola, 1997; Suvanto, 1997), sin embargo, recientes estudios de
supresión de genes que muestran defectos similares en ratones
deficientes en GDNF o GFR\alpha1 (Cacalano, 1998; Enomoto, 1998;
Moore, 1996; Pichel, 1996; Sanchez, 1996) revelan que el GDNF in
vivo actúa principalmente a través de GFR\alpha1. Los ratones
descritos no desarrollan riñones ni el sistema nervioso entérico,
mueren pocos días después del nacimiento y muestran defectos
similares tanto en el sistema nervioso central como en el
periférico.
Se sabe que los nervios periféricos requieren
continuamente factores neurotróficos producidos en el órgano diana
de la inervación (Davies, 1994; Henderson, 1996). Los factores
neurotróficos se han propuesto como fármacos prometedores para el
tratamiento del sistema nervioso lesionado debido a sus potentes
efectos farmacológicos en modelos animales de enfermedades
neurodegenerativas (Hefti, 1997; Skaper, 1998). Los factores
neurotróficos tienen la capacidad de evitar la atrofia y muerte
durante el desarrollo y en el adulto. Aunque la impotencia
neurogénica es un problema grave, se sabe muy poco acerca de los
factores neurotróficos importantes para las neuronas que inducen la
erección del pene. La identificación de los agentes neurotróficos
del pene parece práctica ya que sus potenciales propiedades
protectoras podrían tener valor terapéutico. El GDNF se aisló
originariamente en base a su capacidad para la promoción de la
supervivencia y diferenciación de neuronas dopaminérgicas ventrales
del cerebro medio en ratas embrionarias (Lin, 1993). Es un miembro
relacionado de forma lejana con la superfamilia del
factor-b del crecimiento transformador
(TGF-b) y comprende la familia del GDNF junto con
neurturina (NTN), (Kotzbauer, 1996), persefina (PSPN), (Milbrandt,
1998) y artemina (ARTN) (Baloh, 1998). El GDNF mantiene las
neuronas dopaminérgicas, noradrenérgicas y motoras del sistema
nervioso central (Arenas, 1995; Henderson, 1995; Lin, 1993;
Oppenheim, 1995; Tomac, 1995; Yan, 1995), así como diversas
subpoblaciones de neuronas sensoriales periféricas y simpáticas
(Buj-Bello, 1995; Ebendal, 1995; Trupp, 1995).
Además, los defectos en el ganglio cervical
superior simpático en ratones que no tenían GDNF o GFR\alpha3
sugieren que algunos de los efectos biológicos del GDNF pueden estar
mediados a través del GFR\alpha3, el receptor de unión a ligante
preferente de la ARTN (Moore y otros, 1996; Sanchez y otros, 1996;
Baloh y otros, 1998; Nishino y otros, 1999).
La observación de que el ARNm de GFR\alpha3 se
expresa principalmente en las neuronas de tamaño grande del ganglio
pélvico mayor (MPG) se ajusta a la hipótesis de que en ratas adultas
la ARTN puede ser un factor de mantenimiento de ciertas neuronas
adrenérgicas de la pelvis. En el MPG una subpoblación de neuronas
que se proyectan al pene también expresaron ARNm de GFR\alpha3.
De forma interesante, la distribución de GFR\alpha3 en el MPG de
rata se parece a la descrita para el neuropéptido Y (NPY) (Keast y
de Groat, 1989). Sin embargo, todavía no se ha resuelto si el
correceptor GFR\alpha3 y NPY se expresan en las mismas neuronas.
También es digno de atención el hecho de que el ARNm de
GFR\alpha3 se exprese en casi la mitad de las neuronas sensoriales
del pene y preferentemente en células de tamaño pequeño e
intermedio. Esto sugiere que el GDNF y la ARTN, los ligandos
principales del GFR\alpha1 y GFR\alpha3, pueden influenciar,
como mínimo parcialmente, en distintas poblaciones de neuronas
sensoriales del pene. Además, la expresión del ARNm de GFR\alpha3
en el MPG y el ganglio de la raíz dorsal (DRG) S1 insinúa la
posibilidad de que la ARTN también puede servir como factor
neurotrófico para algunas subpoblaciones de neuronas autónomas y
sensoriales de la pelvis en rata adulta.
Dado que para la erección del pene se requiere
la inervación de los nervios parasimpáticos funcionales, se estudió
la esencialidad de la NTN como factor neurotrófico para las neuronas
parasimpáticas del pene. Se seleccionó la rata como animal
experimental ya que tiene un ganglio pélvico mayor (MPG) compacto,
que se localiza de forma bilateral respecto a la próstata y es la
fuente principal de nervios eferentes NOérgicos del pene (Quinlan,
1989; Ding, 1993). Este ganglio también contiene una mezcla de
neuronas simpáticas y parasimpáticas, que inervan los órganos
internos reproductivos, el intestino inferior y el tracto
urinario.
Se estudió la NTN como factor neurotrófico
derivado de diana para las neuronas parasimpáticas del pene. Los
datos dados a conocer sugieren que algunos miembros de la familia
del GDNF pueden actuar conjuntamente para regular la función de las
neuronas sensoriales y parasimpáticas del pene. Para evaluar el
papel del GDNF y de la NTN para los nervios del pene se estudió su
expresión en el cuerpo esponjoso del pene de rata adulta mediante
hibridación in situ e hibridación Northern. Para caracterizar
las células del pene que expresaban el ARNm de GDNF se utilizó
inmunocitoquímica. Se inyectó ^{125}I-GDNF o
^{125}I-NTN de forma intracavernosa y se estudió
su transporte retrógrado en nervios sensoriales y parasimpáticos del
pene. Para averiguar si la síntesis del ARNm de NTN en el pene se
encuentra bajo regulación hormonal, se estudió su expresión después
de la axotomía del nervio cavernoso. En ratones GFR\alpha2^{-/-}
se estudió la inervación del pene, a efectos de aclarar la
importancia fisiológica de la señalización mediada por GFR\alpha2
para las neuronas que se proyectan al pene. Los resultados sugieren
un papel para las neurotrofinas en la
inervación/mantenimiento/regeneración de las neuronas sensoriales y
las inductoras de la erección del pene.
La neurturina (NTN) y otros miembros de la
familia de del factor neurotrófico derivado de la línea celular
glial (GDNF) de los factores neurotróficos, entre los que se
incluyen la artemina y persefina, aunque no se limitan a las
mismas, promueven la supervivencia de varias poblaciones de neuronas
en el sistema nervioso central y periférico, entre las que se
incluyen neuronas dopaminérgicas del cerebro medio, sensoriales y
motoras, en roedores en desarrollo y maduros. La NTN se identificó
como un factor trófico endógeno para las neuronas parasimpáticas
que se proyectan al pene. El ARNm de NTN se expresó en el músculo
liso de los vasos sanguíneos del pene y el cuerpo cavernoso de pene
de rata adulta, así como en otros órganos pélvicos. Los ARNm de los
componentes del receptor de NTN GFR\alpha2 y Ret se expresaron de
forma ubicua en neuronas parasimpáticas del pene. El transporte
retrógrado de ^{125}I-NTN inyectado en pene en
neuronas parasimpáticas y sensoriales confirmó la funcionalidad de
la NTN en este sistema. Los niveles de ARNm de NTN en el pene
permanecieron inalterados después de la axotomía del nervio
cavernoso bilateral. La disminución significativa de fibras
nerviosas que contenían óxido nítrico sintasa (NOS), tanto en los
nervios dorsales del pene como en los cavernosos de ratones
GFR\alpha2^{-/-}, indicó la importancia fisiológica de
GFR\alpha2 en la inervación del pene.
Se mostró que los componentes de receptor de
GDNF de Ret, GFR\alpha1 y GFR\alpha2 se expresaban en neuronas
del pene del ganglio pélvico mayor (MPG) y del ganglio de la raíz
dorsal (DRG) de rata adulta. El transporte axonal retrógrado se
inhibió mediante un exceso de GDNF no marcado mientras que un exceso
de citocromo c no tuvo efecto sobre el transporte, lo cual sugiere
que el transporte está mediado por la unión a receptores
específicos localizados en los axones terminales. La hibridación
in situ mostró la producción de ARNm de GDNF en el cuerpo
esponjoso del pene. La expresión de ARNm de GDNF se observó en las
filas de células en el límite entre la túnica albugínea y el tejido
eréctil. Estas células se reconocieron por anticuerpos a la
vimentina y a S100beta, mientras que anticuerpos a la alfa actina
del músculo liso y a PGP 9,5 no mostraron inmunorreactividad. En
conjunto, estos datos sugieren que la NTN actúa como un factor de
supervivencia y/o neuritogénico derivado de diana para la erección
del pene que induce neuronas postganglionares. Los resultados
indicaron que el GDNF puede actuar como un factor neurotrófico
derivado de diana en pene de rata adulta.
La caracterización de las actividades
dopaminotróficas nigro-estriatales del GDNF creó un
interés y esfuerzo considerables para encontrar factores homólogos
con actividades promotoras de la supervivencia similares. El
descubrimiento de la NTN fue rápidamente seguido de la demostración
de su capacidad para promover la supervivencia de varias
poblaciones de neuronas en el sistema nervioso central y periférico.
Sin embargo, no se ha estudiado el papel de la NTN en órganos
pélvicos. En la presente descripción se demuestra que el ARNm de NTN
se expresa en el músculo liso del pene, así como en otros órganos
pélvicos, mientras que las neuronas del ganglio pélvico mayor (MPG)
que inervan el pene expresan los ARNm de Ret y GFR\alpha2, y son
capaces de capturar y transportar la NTN. De este modo, la NTN
parece que desempeña un papel en el sistema de circuitos tróficos
dentro del área pélvica. La coexpresión de GFR\alpha2 y
GFR\alpha1 en muchas neuronas del MPG suscita la posibilidad de
que también otros miembros de la familia del GDNF puedan regular la
función de estas neuronas. En el sistema nervioso central se
observa una expresión similar que coincide parcialmente de los ARNm
de GFR\alpha2 y GFR\alpha1 (Trupp; 1998; Sanicola, 1997;
Naveilhan, 1998; Widenfalk, 1997; Golden, 1998) y en ganglios
sensoriales y simpáticos periféricos (Yu, 1998; Bennet, 1998;
Baloh, 1997). Sin embargo, no se entiende bien el papel biológico
de dicha coexpresión.
El transporte retrógrado desde los axones
terminales distales hasta los cuerpos neuronales es un criterio
importante para la funcionalidad de un factor neurotrófico para unas
neuronas determinadas. La presente invención demuestra la unión,
captura y transporte axonal retrógrado de la NTN en neuronas del
ganglio pélvico mayor (MPG) que se proyectan al pene de rata
adulta. Este hecho muestra claramente un papel de la NTN como factor
trófico derivado de diana para estas neuronas. Se ha observado un
circuito trófico similar, por ejemplo, en el sistema
nigro-estriatal, en el que GDNF inyectado de forma
intraestriatal se transporta de forma retrógrada mediante neuronas
dopaminérgicas mesencefálicas (Tomac, 1995). El hecho de que
^{125}I-NTN, con una actividad de estimulación
del crecimiento de neuritas comparable a la de la proteína parental
no radioactiva, se transportara en presencia de un exceso de 100
veces de citocromo c pero no en presencia de un exceso similar de
NTN, sugiere que el transporte retrógrado estaba mediado por la
unión a receptores específicos en los terminales de los axones. La
autorradiografía mostró que, además de al MPG,
^{125}I-NTN se transportó en cierta medida al DRG
S1, el cual se sabe que proporciona nervios aferentes al pene
(Dailey, 1989). Los niveles bajos de radioactividad en el DRG S1 se
deben probablemente al hecho de que el ARNm de GFR\alpha2 se
expresara en sólo el 6% de las neuronas que se proyectan al pene,
mientras que GFR\alpha1 se expresó en el 57% de las mismas, dentro
del DRG S1 (datos no mostrados). De hecho, los resultados
preliminares con el transporte retrógrado de
^{125}I-GDNF en neuronas del pene sugiere que el
GDNF y la NTN se transportan en su mayor parte a diferentes
poblaciones de neuronas de DGR. Esto confirma la opinión de que la
señalización de la NTN in vivo está mediada por la unión a
GFR\alpha2.
La coincidencia entre el contacto
neurona-diana y la expresión del ARNm de NTN en el
músculo liso del pene indica la posibilidad de que la inervación
pueda regular la producción de NTN en la diana. Sin embargo, la
axotomía bilateral de los nervios cavernosos no alteró marcadamente
la cantidad de ARNm de NTN sugiriendo que la inervación
parasimpática no regula la expresión de NTN en el músculo liso del
pene. Esto es coherente con los resultados de diversos experimentos
de denervación de nervios autónomos en animales neonatales y
adultos. Por ejemplo, los niveles de ARNm de NGF permanecen
inalterados después de una simpatectomía, tanto en el corazón de
rata neonatal como en el iris de rata adulta (Shelton, 1986).
Aunque el ARNm de NTN no se incrementa como
respuesta a la axotomía, es posible que la proteína NTN se acumule
en el órgano diana debido a la falta de transporte retrógrado, tal
como se indica para el NGF en el corazón e iris después de una
simpatectomía o en la piel después de una axotomía de los nervios
sensoriales (Shelton, 1986; Harper, 1999). Hipotéticamente, el
incremento de la NTN local puede promover la reinervación del pene,
tal como se ha indicado que ocurre después de la axotomía del nervio
cavernoso unilateral, en la que se sugiere que los axones intactos
se expanden hacia el lado denervado contralateral (Jung, 1998;
Carrier, 1995). Sin embargo, la confirmación de esta hipótesis
requiere experimentos adicionales.
La reciente observación de que existen defectos
en algunas neuronas parasimpáticas, aunque no en todas, en ratones
GFR\alpha2^{-/-} (Rossi, 1996) dio lugar al estudio de si la
inervación NOenérgica del pene se altera por la supresión de este
gen. Se encontró que los ratones deficientes en GFR\alpha2 tenían
un número significativamente reducido de fibras que contenían NOS,
tanto en los nervios dorsales como en los pilares del pene.
Estudios futuros mostrarán si la densidad de fibras NOérgicas
disminuida en el pene se debe a la pérdida de neuronas o a la
arborización axonal reducida. Sea cual sea la razón o razones, los
presentes datos muestran evidencia de un papel funcional de la
señalización mediada por GFR\alpha2 para las neuronas
parasimpáticas del pene. A la vista de esto, podría parecer de
algún modo sorprendente que los ratones GFR\alpha2^{-/-} sean
fértiles (Rossi, 1999). Sin embargo, los presentes resultados no
excluyen deficiencias sutiles en su función reproductiva. Por otra
parte, es común que en ratones con supresión de genes asuman la
función mecanismos compensatorios, que se cree que dependen en gran
medida del gen suprimido. Por ejemplo, ratones con una supresión
dirigida del gen NOS neuronal muestran una expresión aumentada del
NOS endotelial del pene (Burnett, 1996). La acción compensatoria de
otros miembros de la familia del GDNF es otra posible explicación de
la presencia parcial de la inervación NOérgica del pene en ratones
GFR\alpha2^{-/-}. Los presentes resultados sugieren un papel
compensatorio especialmente para el GDNF, dado que su correceptor
preferente GFR\alpha1 se expresa en más de la mitad de las
neuronas del MPG del pene. La ayuda mediada por otros factores
neurotróficos también es una posibilidad razonable.
Mostrando la expresión del ARNm de NTN en el
músculo liso del pene y el transporte específico de
^{125}I-NTN desde los terminales nerviosos al
soma de las neuronas del ganglio pélvico mayor (MPG), se muestra un
papel para la NTN como factor trófico para las neuronas del pene
parasimpáticas. Además, los resultados muestran que la expresión
del ARNm de NTN en el pene no se altera después de la axotomía del
nervio cavernoso. La reducción de fibras nerviosas que contienen
NOS en ratones GFR\alpha2^{-/-} indica un papel fisiológico de
la señalización mediada por GFR\alpha2 para las neuronas del pene
parasimpáticas in vivo.
La expresión del ARNm de GDNF en pene de rata
adulta se confirmó mediante dos métodos independientes. La
hibridación in situ mostró la expresión marcada del ARNm de
GDNF en una capa celular subtunical y la hibridación Northern
detectó un transcrito cuyo tamaño se corresponde al indicado
previamente. En la hibridación Northern el ARNm de GDNF se observó
solamente en el cuerpo esponjoso del pene de rata adulta, mientras
que otros órganos pélvicos estudiados no mostraron hibridación.
Esto se opone a la amplia expresión de ARNm de NTN en órganos
pélvicos de rata adulta. Estos resultados sugieren que el papel del
GDNF como factor neurotrófico derivado de diana en el área pélvica
puede estar restringido solamente al pene. Sin embargo, debido a que
los factores neurotróficos habitualmente se producen en pequeñas
cantidades, no se puede excluir la posibilidad de que el ARNm de
GDNF se exprese en algunos órganos pélvicos en cantidades por
debajo del límite de detección para la sensibilidad. Esta
posibilidad se sustenta por la amplia expresión de los componentes
del receptor de GDNF en neuronas parasimpáticas y sensoriales que
inervan los órganos pélvicos.
Para aclarar la función de las células
subtunicales que expresan ARNm de GDNF se utilizaron varios
anticuerpos. No había inmunorreactividad en el área subtunical si
las secciones se teñían con anticuerpos a la alfa actina del
músculo liso o a PGP 9,5. El anticuerpo a la alfa actina del músculo
liso debería reconocer células del músculo liso (Skalli, 1986)
mientras que el anticuerpo a PGP 9,5 es un excelente marcador
paneuronal (Ermisch, 1995; Thompson, 1983). La ausencia de tinción
sugiere que las células que expresan el ARNm de GDNF no son ni del
músculo liso ni neuronas. Sin embargo, se obtuvo una señal clara con
anticuerpos vimentina y S100beta. El anticuerpo vimentina se
considera un marcador de células mesenquimales, (Leader, 1987)
mientras que los anticuerpos a S100beta se ha indicado que
reconocen células de varios tipos, por ejemplo, células gliales,
condrocitos y adipocitos (Griffin, 1995; Haimoto, 1987). La
inmunorreactividad a la vimentina sugiere que las células que
expresan el ARNm de GDNF son de origen mesenquimal. Previamente,
Dail y otros (1995) dieron a conocer que en el pene de rata el
límite entre la túnica albugínea y los tejidos eréctiles está
marcado por pequeñas células con un núcleo prominente, teñidas
moderadamente por la NADPH-diaforasa. (Dail, 1995).
En base a la localización y morfología similares de las células
observadas se sugiere que estas células son iguales que las que
expresan el ARNm de GDNF.
Queda por demostrar el papel fisiológico del
GDNF producido endógenamente en el cuerpo esponjoso de pene de rata
adulta. Sin embargo, la expresión de receptores funcionales en
subpoblaciones de nervios sensoriales y parasimpáticos favorece la
idea de que el GDNF es un factor neurotrófico derivado de diana para
estas neuronas del pene. Otra posibilidad es que el GDNF tenga un
papel local en el cuerpo esponjoso del pene. Sin embargo esta idea
es menos probable ya que la hibridación in situ no reveló
ARNm de Ret detectable en el cuerpo esponjoso del pene. No se puede
excluir la posibilidad de que existan otros receptores de
señalización desconocidos para el GDFN en el
pene.
pene.
El transporte retrógrado es un mecanismo común
mediante el cual los factores neurotróficos derivados de diana
median sus efectos biológicos en el soma neuronal. Los presentes
descubrimientos demuestran que el GDNF recombinante de rata
biológicamente activo se transporta retrógradamente mediante
neuronas sensoriales y parasimpáticas después de la inyección
intracavernosa. El contaje-\gamma y la
autorradiografía mostraron radioactividad tanto en las neuronas del
DRG S1 como del MPG. El hecho de que el transporte de
^{125}I-GDNF se bloqueara por un exceso de GDNF
no marcado, pero no con exceso de citocromo c sugiere que el
transporte está mediado por la unión a receptores específicos
localizados en los axones terminales.
Se demostró que el ARNm de GFR\alpha1 se
expresaba en el 54% de las neuronas del MPG del pene, mientras que
GFR\alpha2 se expresaba en el 98% de las mismas. De forma
equivalente, GFR\alpha1 se expresaba en el 57% de las neuronas
sensoriales del pene dentro del DRG S1, mientras que GFR\alpha2 se
expresaba sólo en el 6% de las mismas. Los resultados referentes al
transporte retrógrado de ^{125}I-GDNF en nervios
del pene se correlacionan bien con la distribución del receptor. El
transporte de ^{125}I-GDNF en nervios sensoriales
parece ser más eficaz si se compara al de
^{125}I-NTN (perfiles de células más marcados
después de la autorradiografía), mientras que se detectó menos
radioactividad en el MPG después de la inyección de
^{125}I-GDNF. Estos resultados apoyan la idea de
que el transporte de ^{125}I-GDNF en neuronas del
pene está mediado por GFR\alpha1, y de este modo sugiere que sólo
una subpoblación de neuronas del pene puede ser responsable de las
influencias tróficas del DGNF.
El transporte retrógrado es significativo en la
administración farmacológica de factores neurotróficos. Estos
resultados sugieren que la inyección intracavernosa de GDNF en el
hombre puede conducir al transporte retrógrado y, de este modo,
ejercer una influencia trófica sobre las neuronas sensoriales y
parasimpáticas.
La presente invención muestra que el ARNm de
GDNF se expresa en el pene de rata adulta y los terminales nerviosos
sensoriales y parasimpáticos del pene son capaces de unir, capturar
y transportar ^{125}I-GDNF inyectado en el cuerpo
esponjoso del pene. De este modo, en base a los presentes
resultados, parece práctica la utilización de GDNF como terapia
para la impotencia neurogénica.
Los resultados sugieren que la NTN o el GDNF se
pueden utilizar para producir un producto médico para el tratamiento
de la impotencia debida a una disfunción de los nervios cavernosos.
El producto médico es administrable localmente a los órganos
pélvicos (por ejemplo, el pene), cuando se administra de forma
sistémica NTN o GDNF puede aumentar la regeneración y supervivencia
de las neuronas del plexo pélvico en humanos sanos y enfermos.
La NTN o el GDNF pueden aumentar la regeneración
y apoyo a la supervivencia de las neuronas del plexo pélvico y de
este modo pueden utilizarse para producir un producto médico para el
tratamiento de la disfunción eréctil en humanos.
La expresión del receptor y el transporte
retrógrado de NTN o GDNF hacia los nervios aferentes (sensoriales)
del pene sugiere que estos factores del crecimiento se pueden
utilizar para producir un producto médico para el tratamiento de
disfunciones eréctiles del pene.
Como consecuencia, se han acumulado muchas
pruebas en base a las cuales se puede concluir que la presente
invención se refiere al tratamiento de la disfunción de nervios
periféricos en el área pélvica. En base a dichas pruebas, se
desarrollaron métodos para el estudio, incluso en humanos, de la
disfunción eréctil, estos métodos a su vez facilitaron la
producción de productos médicos para el tratamiento de disfunciones
eréctiles del pene.
La presente invención se refiere a la
utilización de un factor neurotrófico, que es neurturina (NTN), un
factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), o variantes
sustituidas de forma conservadora de los mismos, solos o en
cualquier combinación, o secuencias de nucleótidos que codifican
dichos factores neurotróficos para la fabricación de un producto
médico para el tratamiento de las disfunciones eréctiles del pene.
La disfunción eréctil del pene está causada por traumatismo peneano
agudo, cirugía del pene, cirugía prostática, cirugía de la vejiga u
otras cirugías pélvicas. El producto médico de la presente invención
es administrable, preferentemente, de forma intracavernosa. El
producto médico de la presente invención comprende además del factor
neurotrófico, como mínimo un agente auxiliar opcional
farmacéuticamente aceptable que es compatible con la vía de
administración.
Las disfunciones, especialmente la disfunción en
el área pélvica asociada con la expresión del receptor y/o la
represión y el transporte retrógrado de NTN o GDNF a los nervios
(sensoriales) aferentes del pene sugirieron que estos factores del
crecimiento son útiles para el tratamiento de neuronas sensoriales
que inervan el pene y otros órganos pélvicos. La neuropatía
sensorial también se puede tratar según la presente invención
mediante la administración al individuo que tiene el trastorno de
una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un factor
neurotrófico o una parte del mismo, de modo que tiene lugar el
tratamiento, por ejemplo, mediante la estimulación de forma
funcional del correspondiente gen genómico.
Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica
un factor neurotrófico funcional, tal como NTN o GDNF o variantes
sustituidas de forma conservadora de los mismos, se puede utilizar
para preparar un producto médico que es capaz de integrarse en el
gen genómico que codifica un factor neurotrófico funcional, o
funcionalmente capaz de inactivarse o condicionalmente capaz de
inactivarse, y que se puede insertar en una construcción diana con
una secuencia de ácidos nucleicos adecuada, que se puede
seleccionar, y que actúa como marcador. La construcción o vector
diana se puede insertar y transformar dentro de un individuo que
sufre disfunciones eréctiles del pene.
Ejemplo
1
Se obtuvieron ratas macho Wistar (n=16, de diez
a doce semanas de edad), y ratones GFR\alpha2^{-/-} o de tipo
salvaje adultos del animalario del Biocentro de Viikki, Universidad
de Helsinki. Se mantuvieron en un ciclo normal de día y noche y se
les dio acceso libre a comida y bebida. Se hizo lo posible para
minimizar el sufrimiento de los animales y para reducir el número
de animales utilizado.
Ejemplo
2
Se anestesiaron las ratas con una combinación de
midazolam (0,8 mg/kg), citrato de fentanilo (0,25 mg/kg) y
fluanisona (8 mg/kg), a las que se inyectaron después 10 \mul de
una solución acuosa al 4% de Fluoro-Gold (FG;
Fluorocromo) en el cuerpo cavernoso. Después de 10 días las ratas se
sacrificaron con anestesia mediante perfusión transcardiaca con
tampón fosfato salino (PBS; fosfato sódico 0,1 M/NaCl 0,14 M/KCl 2,6
mM, pH 7,5) (50 ml) seguido de paraformaldehído fresco al 4% (PFA)
(200 ml) en PBS. El MPG y el ganglio de la raíz dorsal (DRG) del
nivel S1 se diseccionaron y posfijaron durante 1,5-2
horas a temperatura ambiente. Los cuerpos esponjosos de los penes
se extirparon de los animales no tratados, se fijaron con PFA al 4%
en PBS a 4ºC durante 18-36 horas. Después de la
fijación todas las muestras se lavaron en PBS y se procesaron para
la sección a 7 \mum en parafina sobre portaobjetos
silanizados.
Ejemplo
3
Se llevó a cabo la hibridación in situ de
las secciones de acuerdo con Wilkinson y Green (1990) con algunas
modificaciones. Brevemente, las secciones se desparafinizaron en
xileno, se rehidrataron, se fijaron en PFA al 4% in PBS
(peso/volumen), se lavaron en PBS y se trataron con proteinasa K (20
\mug/ml, Sigma) durante 5-15 minutos, se
posfijaron con PFA al 4% in PBS (peso/volumen), se acetilaron, se
deshidrataron, se secaron con aire y se hibridaron con una sonda de
ARNc durante toda la noche a 52ºC. Se llevó a cabo la prehibridación
(1-1,5 horas a 52ºC) con una mezcla de hibridación
que no contenía la sonda. Después de la hibridación, las secciones
se lavaron en condiciones de alta astringencia durante 30 minutos,
se trataron con ARNasa A (Boehringer Mannheim), se deshidrataron y
se secaron con aire. Las secciones se sumergieron en emulsión (Kodak
NTB-2), y se dejaron expuestas durante 5 semanas.
Posteriormente se revelaron los portaobjetos (revelador Kodak D19),
se contratiñeron con hematoxilina de Harris y se montaron en
Permount (Fisher Chemical). La hibridación de las secciones
adyacentes con sondas con orientación en sentido se utilizó como
control negativo.
Ejemplo
4
Se digitalizaron imágenes de campo oscuro y
brillante mediante un microscopio Olympus AX70 Provis (Olympus
Optical Co), equipado con una cámara Photometrics SenSys CCD
(Photometrics) y software Image ProPlus 3.0 (Media Cybernetics).
Las ilustraciones finales se prepararon con software Adobe Photoshop
4.0 (Adobe Systems).
\newpage
Ejemplo
5
Entre la hibridación in situ y la
autorradiografía en emulsión se visualizaron y digitalizaron bajo
iluminación UV neuronas marcadas con FG en el MPG y el DRG S1. El
marcado con FG se comparó con la señal de la hibridación in
situ mediante imágenes digitales. Sólo se contaron perfiles
neuronales con fluorescencia brillante que contenían un núcleo
claramente visible en cada cuarto de sección en todo un ganglio. La
señal de hibridación in situ se consideró positiva si la
densidad de grano en la proximidad del núcleo era dos veces más alta
que el nivel de base. Se cuantificó la expresión del ARNm de
receptor en neuronas marcadas con FG unilateralmente en cuatro
ratas.
Ejemplo
6
Se aisló el ARN total a partir de muestras
congeladas mediante el método de extracción del
tiocianato-fenolcloroformo guanidinio ácido.
(Chomczynski, 1987). Se purificó ARNm (Poli-A) con
el kit Oligotex mRNA Midi (Qiagen). Después de la purificación el
ARNm (poli-A) se fraccionó en un gel de
agarosa-formaldehído al 1,2% y se transfirió a una
membrana de nailon (Magna, MSI). Después de la transferencia las
membranas se fijaron mediante irradiación UV, se prehibridaron e
hibridaron con sondas de ADNc marcadas con ^{32}P a 65ºC en NaCl 1
M, sodio dodecil sulfato al 1%, sulfato de dextrano al 10% y 100
\mug/ml de ADN de esperma de arenque sonicado. Después de dos
lavados con elevada astringencia (0,1 x citrato sódico salino (SSC),
sodio dodecil sulfato al 0,5% a 55-60ºC, 15 min) se
analizó la membrana de transferencia mediante un fosfoimager (Fuji
BAS 1500) o a -70ºC se expuso a películas de rayos X durante de 1 a
7 días a -70ºC. Para comparar los niveles relativos de ARNm en
diferentes carriles, el filtro se rehibridó con una sonda de
gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).
Ejemplo
7
Para la hibridación in situ se generaron
sondas de ARNc de cadena simple antisentido y sentido y se marcaron
con ^{35}S-UTP (Amersham) utilizando ARN
polimerasas adecuadas (SP6, T7, Promega). Los patrones de ADN fueron
GFR\alpha1 de rata (nucleótidos 294-1039 de
U59486) GFR\alpha2 de rata (nucleótidos 85-257 de
AF003825) NTN de ratón (nucleótidos 349-936 de
U78109), un obsequio del Dr. Carlos F. Ibáñez, y Ret de rata
(nucleótidos 21-200 de U22514). Para la hibridación
Northern se marcaron sondas de ADNc con
^{32}P-dCTP mediante el Sistema de Marcaje
Prime-a-Gene (Promega). Los patrones
de ADN para la preparación de sondas de ADNc marcadas con
^{32}P-dCTP fueron NTN de ratón (los mismos
nucleótidos que para la hibridación in situ), y GAPDH de rata
(nucleótidos 137-949 de X02231). Se clonaron los
ADNc de GFR\alpha2, Ret y GAPDH de rata mediante PCR. La
identidad de los fragmentos clonados se verificó mediante
secuenciación directa utilizando un secuenciador automático de ADN
Pharmacia A.L.F.
Ejemplo
8
Se radioyodó NTN recombinante humana producida
en E. coli (PeproTech) mediante el método de la
lactoperoxidasa (Marchalonis, 1969). Se mezclaron los siguientes
ingredientes y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 18
minutos en un volumen final de 50 \mul: Na^{125}I de 1 mCi
(1Ci=37GBq), 10 \mug de proteína NTN, 0,5 U de lactoperoxidasa, 2
\mul de H_{2}O_{2} al 0,03% y tampón fosfato sódico 0,1 M, pH
6,0. Después de los primeros 9 minutos de incubación, se añadieron
2 \mul adicionales de H_{2}O_{2}. La reacción se terminó
mediante la adición de 3 volúmenes de tampón que contenía NaCl 0,42
M, NaI 0,1 M y tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 7,5, y 22 \mul de
BSA al 2,5% en tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 7,5. Se calcularon
las actividades específicas y las eficiencias de marcaje después de
la precipitación con ácido tricloroacético de una solución alícuota
de la mezcla de reacción. Se separó el yodo libre y se concentró la
^{125}I-NTN mediante la utilización de columnas
NanoSpin Plus (4000 MWCO, Gelman Sciences). La radioactividad se
midió con un contador 1271 Riagamma (Wallac). La
^{125}I-NTN tuvo una actividad específica de 44,7
\muCi/\mug. Se bioensayó la estimulación por la NTN marcada del
crecimiento de neuritas de ganglios trigeminales de ratón
explantados el día 13,5 embrionario en una matriz de colágeno y
teñidos con anticuerpos de neurofilamento (Arumae, 1993; Ebendahl,
1989).
Ejemplo
9
Las ratas se anestesiaron tal como se ha
descrito en el Ejemplo 2, a las cuales después se inyectaron en los
dos cuerpos cavernosos soluciones que contenían 200 ng de
^{125}I-NTN sola o combinada con 20 \mug de NTN
no marcada o citocromo c en un volumen de 5 \mul mediante una
jeringa Hamilton de 10 \mul (1701N). Las ratas se sacrificaron 24
horas más tarde bajo una anestesia profunda mediante perfusión
transcardiaca con PBS (50 ml) seguido de PFA en PBS al 4% (250 ml).
Después de la perfusión los MPG y DRG (niveles
L4-S2) se diseccionaron y se posfijaron durante
1,5-2 horas. La radioactividad de los ganglios se
midió mediante contaje-\gamma. Después de la
fijación se prepararon secciones de criostato (10 \mum), se
deshidrataron, se sumergieron en emulsión, y se dejaron expuestas
durante 2-3 semanas. A continuación los portaobjetos
se revelaron, se contratiñeron con hematoxilina y se montaron.
Ejemplo
10
Se anestesiaron ratas adultas con una
combinación de quetamina (105 mg/kg) y xilacina (6 mg/kg). Los
nervios cavernosos se expusieron y cortaron bilateralmente justo en
la zona distal del MPG. Para minimizar la reunión de los segmentos
del nervio, se desviaron los dos extremos transectados. En las ratas
intervenidas de forma simulada se identificaron los nervios
cavernosos pero no se cortaron. Las ratas se sacrificaron en los
días 1, 3, 7 y 14 después de la axotomía. Los cuerpos esponjosos de
los penes se diseccionaron, se congelaron en nitrógeno líquido y se
almacenaron a -70ºC. Se aisló el ARNm y se preparó la transferencia
Northern, tal como se ha descrito en el Ejemplo 6.
Ejemplo
11
Los cuerpos esponjosos de los penes de ratones
se fijaron durante 5 horas en PFA al 4% en PBS frío. Los tejidos se
criptoprotegieron toda la noche en sacarosa al 30% en PBS. Se
embebieron en compuesto O.C.T. para Tissue-Tek
(Sakura), se congelaron en hielo seco y se almacenaron a -70ºC. Se
prepararon las secciones de criostato (10 \mum) y se adhirieron
en portaobjetos Super Frost Plus (Menzel-Gläser).
Después de un secado breve con aire se incubaron con NADPH 0,1 mM,
nitroazul de tetrazolio 0,2 mM, y Tritón X-100 al
0,2% en tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 8,0, durante 90 minutos a
temperatura ambiente. La reacción se terminó mediante un lavado con
agua. Las secciones se cubrieron con un medio de montaje basado en
Mowiol. Se evaluó el patrón de tinción mediante el contaje
unilateral del número de fibras nerviosas positivas a NADPH
presentes en 3 campos aleatorios (400x) de cuerpo cavernoso y en el
nervio dorsal entero.
Ejemplo
12
Para la hibridación in situ se generaron
sondas de ARNc antisentido y sentido de cadena simple y se marcaron
con ^{35}S-UTP (Amersham) mediante ARN polimerasas
adecuadas (SP6, T7, Promega). El patrón de ADN utilizado fue GDNF
de rata (nucleótidos 52-688 de L15305). Para la
hibridación Northern las sondas de ADNc se marcaron con
^{32}P-dCTP utilizando el Sistema de Marcaje
Prime-a-Gene (Promega). Los patrones
de ADN utilizados para la preparación de sondas de ADNc marcadas
con ^{32}P-dCTP fueron GDNF de rata (los mismos
nucleótidos que para la hibridación in situ), y GAPDH de
rata (nucleótidos 137-949 de X02231).
Ejemplo
13
Se radioyodó GDNF recombinante de rata producido
mediante la expresión del gen en células de insecto infectadas con
rbaculovirus con reactivo de Bolton & Hunter. (Bolton, 1973). La
proteína GDNF (10 \mug) en 20 \mul de tampón borato 0,1 M, pH
8,5 se colocó en 2 mCi (1Ci=37GBq) de reactivo
Bolton-Hunter seco marcado con ^{125}I, y la
mezcla de reacción se incubó a 4ºC durante 15 minutos. La reacción
se paró mediante la adición de 0,5 ml de una solución que contenía
glicina 0,2 M en tampón borato 0,1 M, pH 8,5. Se separaron el yodo
libre y el conjugado de glicina y se concentró el
^{125}I-GDNF mediante columnas NanoSpin Plus (4000
MWCO, Gelman Sciences). Se midió la radioactividad con un contador
gamma Wallac 1271 Riagamma (Wallac). El
^{125}I-GDNF marcado obtuvo una actividad
específica de 61,3 \muCi/\mug. Se bioensayó la estimulación por
el GDNF marcado del crecimiento de neuritas de ganglios
trigeminales de ratón explantados el E13-E13,5 en
una matriz de colágeno, tal como se ha descrito. (Arumäe, 1993;
Ebendal, 1989).
Ejemplo
14
Las ratas se anestesiaron tal como se ha
descrito en el Ejemplo 2 y se inyectaron en los dos cuerpos
cavernosos del pene las soluciones que contenían 200 ng de
^{125}I-GDNF solo o combinado con 20 \mug de
GDNF no marcado o citocromo c en un volumen de 5 \mul mediante
una jeringa Hamilton equipada con una aguja 26G. Los animales se
sacrificaron 24 horas más tarde mediante perfusión transcardiaca
bajo anestesia profunda con PBS (50 ml) seguido de PFA al 4% en PBS
(250 ml). Después de la perfusión se recolectaron el ganglio pélvico
mayor y el ganglio de la raíz dorsal (niveles
L4-S2) y se posfijaron durante 1,5-2
horas. Durante el periodo de posfijación los ganglios se utilizaron
para el contaje-\gamma. Después de la fijación se
prepararon las secciones de criostato (10 \mum), se
deshidrataron, se sumergieron en emulsión (Kodak
NTB-2), y se dejaron expuestas durante
2-3 semanas. A continuación, los portaobjetos se
revelaron (revelador Kodak D19), se contratiñeron con hematoxilina
de Harris y se montaron en Permount (Fischer Chemical).
\newpage
Ejemplo
15
Los cuerpos esponjosos de los penes de rata
estuvieron fijados en inmersión durante 17-18 horas
en PFA frío al 4% en PBS (peso/volumen), acabado de preparar.
Después de la fijación las muestras se lavaron con PBS y se
procesaron para el seccionado en parafina a 10 \mum sobre
portaobjetos Super Frost Plus (Menzel-Gläser). Las
secciones se desparafinaron en xileno, se rehidrataron y se
incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en PBS al 4% con
BSA y Tritón-X 100 al 0,4%, a continuación durante
18 horas con anticuerpos policlonales primarios contra S100beta
(1:5000, Swant), PGP 9,5 (1:2000, Affinity) o anticuerpos
monoclonales de ratón contra Vimentina (1:20, Amersham) o alfa
actina de músculo liso (1:200, Progen). La tinción se visualizó con
un sistema
avidina-biotina-peroxidasa (Vector
Laboratories) con diaminobencidina como cromogen. Finalmente las
secciones se deshidrataron y montaron en Permount (Fischer
Chemical).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
16
Para la hibridación in situ se generaron
sondas de ARNc antisentido y sentido de cadena simple y se marcaron
con ^{35}S-UTP (Amersham Pharmacia Biotech)
mediante ARN polimerasas adecuadas (SP6, T7, Promega, Madison, WI,
USA). El patrón de ADN fue GFR\alpha3 (nucleótidos
81-489 de AF184920).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
17
Para la hibridación in situ se generaron
sondas de ARNc antisentido y sentido de cadena simple y se marcaron
con ^{35}S-UTP (Amersham) mediante ARN polimerasas
adecuadas (SP6, T7, Promega). Las sondas para NGF, BDNF,
NT-3, trkA, trkB.TK+, trkC.TK+ y p75 de rata se han
descrito previamente. (Arumae y otros, 1993; Pirvola y otros, 1992:
Pirvola y otros, 1994; Ylikoski y otros, 1993; Hiltunen y otros,
1996). La sonda trk.TK+ reconoce todas las isoformas que contienen
los 4 dominios TK y corresponde a la secuencia de nucleótidos
2308-2552 del ADNc de trkC de rata. (Merlio y
otros, 1992). El fragmento BDNF atraviesa los nucleótidos
517-882 de la secuencia de ADNc de BDNF de rata
(Maisonpierre y otros, 1991) y se localiza en el ARNm de BDNF maduro
excepto en los dos primeros nucleótidos que pertenecen al ARNm de
proBDNF. Los patrones de ADN para la preparación de sondas de ADNc
marcadas con ^{32}Pd-dCTP fueron los mismos que
para la hibridación in situ, y para GAPDH de rata
(nucleótidos 137-949 de X02231).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
18
Se radioyodaron proteínas recombinantes con el
método de la lactoperoxidasa (Marchalonis, 1969). Se calcularon las
actividades específicas y las eficiencias de marcaje después de la
precipitación con ácido tricloroacético de una alícuota de la
mezcla de reacción. Se separó yodo libre y se concentraron los
^{125}I-NTFs mediante columnas NanoSpin Plus
(4000 MWCO, Gelman Sciences). Se midió la radioactividad con un
contador 1271 Riagramma (Wallac). Los
^{125}I-NTFs (NGF, NT-3 y BDNF)
tuvieron una actividad específica de 30-100
\muCi/\mug. Se bioensayó la estimulación por los NTFs marcados
del crecimiento de neuritas de los DRGs de polluelo explantados en
los días embrionarios 9-10 en una matriz de colágeno
tal como se ha descrito (Arumäe, 1993; Ebendal, 1989).
Ejemplo
19
Las ratas se anestesiaron tal como se ha
descrito en el Ejemplo 2, a las cuales se les inyectaron soluciones
que contenían 200 ng de ^{125}I-NTFs (NGF,
NT-3 o BDNF) solos o combinados con 20 \mug de
NTFs no marcados o citocromo c en un volumen de 5 \mul en los
cuerpos cavernosos mediante una jeringa Hamilton (1701N). Las ratas
se sacrificaron 24 horas más tarde bajo anestesia profunda mediante
perfusión transcardiaca con PBS (50 ml) seguido de PFA al 4% en PBS
(250 ml). Después de la perfusión el ganglio pélvico mayor y el
ganglio de la raíz dorsal (niveles L4-S2) se
diseccionaron y se posfijaron durante 1,5-2 horas.
La radioactividad de los ganglios se midió mediante
contaje-\gamma. Después de la fijación se
prepararon las secciones de criostato (10 \mum), se
deshidrataron, se sumergieron en emulsión y se dejaron expuestas
durante 2-3 semanas. A continuación, se revelaron
los portaobjetos, se contratiñeron con hematoxilina y se
montaron.
\newpage
Resultados
1
Los resultados presentados en la figura 1
muestran que el ARNm de NTN se expresa ampliamente en el músculo
liso de los vasos sanguíneos y el cuerpo cavernoso del pene. Se
observó hibridación en arterias y en venas y hasta cierto punto en
el epitelio de la uretra. La hibridación in situ no mostró
expresión detectable de Ret o GFR\alpha2 en el cuerpo esponjoso
del pene y sólo se observó una expresión débil y difusa de
GFR\alpha1 en el cuerpo cavernoso. Sin embargo, la hibridación
Northern mostró una expresión débil de todos los ARNm de receptores
en el cuerpo esponjoso del pene (datos no mostrados).
Los ARNm de Ret y GFR\alpha2 se expresaron en
la mayor parte de las neuronas del MPG (figuras 2A y B). La
expresión en neuronas del MPG que se proyectan al pene, es decir,
positivas a FG, se observó en todas y en el 98%, respectivamente
(figuras 2D y E). El ARNm de GFR\alpha1 se expresó en el 54% de
las neuronas del MPG del pene. En el área de neuronas marcadas con
FG había neuronas pequeñas que no expresaron el ARNm de
GFR\alpha1. Por otra parte, GFR\alpha1 pareció expresarse de
forma igual en todo el MPG (figura 2C). Dentro del DRG S1 de rata
adulta, los ARNm de Ret, GFR\alpha1 y GFR\alpha2 se expresaron
en el 62%, el 57% y el 6% de las neuronas del pene, respectivamente
(datos no mostrados). La expresión del ARNm de Ret dentro del DRG
S1 se observó en células de todos los tamaños, mientras que el ARNm
de GFR\alpha1 se expresó preferentemente en células de tamaño
intermedio y grande, y el ARNm de GFR\alpha2 en células de tamaño
pequeño e intermedio. En el MPG o el DRG S1 no hubo expresión
detectable de ARNm de NTN.
Resultados
2
Se detectó un solo transcrito de NTN de 0,9 kb
en todos los órganos pélvicos estudiados (figura 3). La expresión
más alta se observó en el pene, la vejiga urinaria y los vasos
deferentes, mientras que la señal en el colon, la próstata y las
vesículas seminales fue más débil.
Resultados
3
La ^{125}I-NTN (20 ng/ml)
indujo un crecimiento de neuritas fuerte en ganglios trigeminales
embrionarios de ratón (figura 4E), mientras que no hubieron
neuritas en los ganglios de control cultivados en ausencia de
factores neurotróficos (figura 4F). La ^{125}I-NTN
y la NTN no radioactiva mostraron una eficacia neuritogénica
similar a todas las concentraciones ensayadas (5-20
ng/ml, datos no mostrados). 24 horas después de la inyección de 200
ng de ^{125}I-NTN en los dos cuerpos cavernosos,
la autorradiografía mostró marcaje en el MPG y el DRG S1 (figuras
4A y C). Aunque la resolución de la autorradiografía es limitada los
granos de plata agrupados sugieren que el marcador está presente
exclusivamente en los cuerpos de las células nerviosas. Para mostrar
la especificidad del transporte se inyectó la misma cantidad de
^{125}I-NTN junto con un exceso de NTN no
marcada. Esto bloqueó el transporte retrógrado dado que la
radioactividad en el MPG y el DRG se volvió apenas detectable, si
es que la había (figuras 4B, D y G). La figura 4G muestra que
después de la inyección de ^{125}I-NTN se
detectaron cantidades significativas de radioactividad sólo en los
ganglios que inervan el pene, es decir, el MPG y el DRG S1. Para
excluir el efecto bloqueador del exceso de proteína, se inyectó
también ^{125}I-NTN con exceso de citocromo c.
Esto aumentó el transporte retrógrado de
^{125}I-NTN, indicando posiblemente que el exceso
de citocromo c puede inhibir la unión no específica de
^{125}I-NTN a la jeringa y
tejidos.
tejidos.
Resultados
4
La figura 5 muestra que la expresión del ARNm de
NTN en el pene permanece relativamente inalterada después de la
axotomía del nervio cavernoso bilateral.
Resultados
5
Durante el examen histoquímico de la parte
proximal del cuerpo esponjoso y de los pilares del pene ("crura
penis") de ratones de tipo salvaje y GFR\alpha2^{-/-}, se
notó un patrón claramente diferente de fibras nerviosas positivas a
NADPH. Los ratones GFR\alpha2^{-/-} presentaron muy pocas fibras
positivas a NADPH en los nervios dorsales, mientras que la densidad
de fibras en ratones de tipo salvaje fue similar a la descrita en
ratas (Jung, 1998) (figuras 6A, B y E). No hubo una clara diferencia
en el patrón de tinción de los nervios que inervan los vasos
cavernosos en los pilares del pene (figuras 6C y D). Sin embargo, en
los pilares del pene las fibras positivas a NADPH se redujeron
significativamente en la parte exterior del área perivascular
(figuras 6C, D y E).
\newpage
Resultados
6
En la figura 7A se observa el autorradiograma de
la sección de tejido obtenida después de la hibridación con una
ribosonda de GDNF marcada conS. Se observa una señal fuerte en la
capa de células localizada en el límite entre la túnica albugínea y
el tejido eréctil (figura 7A, C), mientras que no hubo señal
detectable en las secciones hibridadas con una sonda sentido
(figura 7B). Las células que expresan el ARNm de GDNF tienen núcleos
prominentes, tal como muestra la tinción con hematoxilina (figura
7C). La tinción de las secciones adyacentes con anticuerpos a la
vimentina o a S100beta mostraron inmunorreactividad en estas células
(figuras 7D, E). Por otra parte, la tinción con anticuerpos a PGP
9,5 y a la alfa actina del músculo liso no mostró inmunorreactividad
en estas células (datos no mostrados).
Resultados
7
Se observó un solo transcrito de GDNF de 4,4 kb
en el pene (figura 8). Por otra parte, no hubo ninguna señal
detectable en vejiga urinaria, vasos deferentes, colon, próstata o
vesículas seminales. Transporte retrógrado de
^{125}I-GDNF en las neuronas que se proyectan al
pene, 24 horas después de la inyección de 200 ng de
^{125}I-GDNF en los dos cuerpos cavernosos, la
autorradiografía mostró marcaje en el MPG y el DRG S1 (figura 10A,
C). En los ganglios sensoriales el marcaje se observó en una
proporción más elevada en neuronas de tamaño intermedio y grande. A
pesar de la resolución limitada de la autorradiografía, los granos
de plata agrupados sugieren que el marcador está presente
exclusivamente en los cuerpos de las células nerviosas. Para mostrar
la especificidad del transporte se inyectó la misma cantidad de
^{125}I-GDNF junto con un exceso de GDNF no
marcado. Esto bloqueó el transporte retrógrado al MPG y DRG (figuras
10B y D y figura 9). La figura 9 muestra que después de la
inyección intracavernosa de ^{125}I-GDNF se
detectaron cantidades significativas de radioactividad sólo en
neuronas que inervan el pene, es decir, en el MPG y el DRG S1. Para
excluir el efecto bloqueador del exceso de proteína, se inyectó
también ^{125}I-GDNF con un exceso de citocromo c.
Esto no afectó el transporte retrógrado de
^{125}I-GDNF.
Resultados
8
El ^{125}I-GDNF y el GDNF
parental (1 ng/ml) indujeron un crecimiento de neuritas comparable
en ganglios trigeminales embrionarios de ratón (figuras 11A y B),
mientras que no hubieron neuritas en los ganglios de control
cultivados en ausencia de GDNF (figura 11C). La actividad de
estimulación del crecimiento de neuritas fue similar entre el
^{125}I-GDNF y el GDNF no radioactivo a todas las
concentraciones ensayadas (1-20 ng/ml, datos no
mostrados).
Resultados
9
La expresión del ARNm de NT-3 y
NGF en el pene de rata adulta se observó en el cuerpo esponjoso del
pene de rata adulta mediante hibridación in situ (datos no
mostrados) y en la transferencia Northern (Fig. 13).
Resultados
10
Todas las proteínas estudiadas se transportaron
a los ganglios sensoriales que inervan el pene de rata adulta
después de la inyección al cuerpo esponjoso del pene, indicando la
existencia de receptores funcionales. Sólo el NT-3
se transportó al ganglio pélvico mayor (figuras
14A-C).
Resultados
11
En el MPG de rata adulta se expresó el ARNm de
GFR\alpha3 en la mayor parte de las neuronas de tamaño grande, es
decir, las adrenérgicas cortas que no se proyectan al pene (Dail
1996), pero sólo en algunas de las neuronas de tamaño pequeño, es
decir, las colinérgicas (figura 12A), mientras que las expresión del
ARNm de Ret se observó en todo el ganglio (Fig. 12B). Por
consiguiente, el ARNm de GFR\alpha3 se expresó en el 5,3 \pm
2,6% de las neuronas del MPG que se proyectan al pene, es decir,
positivas a FG (media \pm S.D., las neuronas marcadas con FG se
cuantificaron unilateralmente en tres ratas, n = 414). Dentro del
DRG S1, la expresión de ARNm de GFR\alpha3 se observó
preferentemente en células de tamaño pequeño e intermedio (figura
12C) y se detectó en el 45,6 \pm 6,3% de las neuronas que se
proyectan al pene (figuras 12D, E) (media \pm S.D., las neuronas
marcadas con FG se cuantificaron unilateralmente en tres ratas, n =
505).
Figura 1. Expresión del ARNm de NTN en el cuerpo
esponjoso del pene. Se puede observar hibridación en las arterias
dorsales (flecha pequeña), vena dorsal (flecha grande) y en los
vasos sanguíneos y el músculo liso del cuerpo cavernoso (cc), tal
como ilustran las imágenes de campo oscuro de los autorradiogramas.
El asterisco indica la uretra, la punta de la flecha apunta al
nervio dorsal y el inserto representa la hibridación en los vasos
sanguíneos intracavernosales. [Barras de escala: 1 mm; inserto, 20
\mum].
Figura 2. Expresión de los ARNm de los
componentes del receptor de NTN en el MPG. (A-C) Las
imágenes de campo oscuro de secciones adyacentes muestran señales
casi ubicuas para los ARNm de Ret, GFR\alpha2 y GFR\alpha1. (C)
El círculo punteado indica un área rica en neuronas que se proyectan
al pene. En este área la señal de GFR\alpha1 es más débil. (D y
E) Las flechas apuntan las neuronas del MPG comarcadas con FG (D) y
sonda de GFR\alpha2 (E). [Barras de escala: A-C,
150 \mum; D y E, 50 \mum].
Figura 3. Análisis por transferencia Northern de
la expresión del ARNm de NTN en órganos pélvicos de rata adulta.
Una sonda de NTN marcada con ^{32}P se hibridó a la membrana de
transferencia con ARNm de los tejidos indicados (3 \mug/carril).
El cerebro sirvió de control positivo. La hibridación de la sonda de
GAPDH indica carga.
Figura 4. Transporte axonal retrógrado de
^{125}I-NTN desde el cuerpo esponjoso de pene al
MPG y al DRG. (A y C) La autorradiografía muestra señales punteadas
sobre los cuerpos de las células neuronales en el MPG (A) y el DRG
S1 (C) 24 horas después de la inyección de
^{125}I-NTN (400 ng) en el cuerpo cavernoso. (B y
D) El exceso de NTN no marcada suprimió el transporte retrógrado de
^{125}I-NTN al MPG (B) y al DRG S1 (D). (E y F)
Crecimiento de neuritas en el ganglio trigeminal de ratón en el día
embrionario 13, después de 3 días en gel de colágeno en presencia
de 20 ng/ml de ^{125}I-NTN (E) y en su ausencia
(F). Las neuritas se visualizaron mediante tinción con
antineurofilamento. (G) Cuantificación y especificidad del
transporte retrógrado de ^{125}I-NTN dentro del
MPG y diferentes DRGs de rata adulta. Se inyectó
^{125}I-NTN en el pene sola o con un exceso de
100 veces de NTN no marcada o de citocromo c. Los resultados se
expresan como media \pm SEM de 4 animales en cada grupo. *,
P<0,05; **, P<0,01 (ANOVA con corrección de Scheffe). [Barras
de escala: A-D, 100 \mum; E y F, 250 \mum].
Figura 5. Niveles de ARNm de NTN en pene de rata
adulta después de la axotomía del nervio cavernoso bilateral (ax) o
de la operación fingida. La hibridación Northern muestra que la
expresión del ARNm de NTN no se ve afectada significativamente. El
control representa el ARNm de ratas no tratadas. Cada carril
corresponde al ARNm agrupado de cinco ratas. Con la hibridación de
GAPDH se verifica una carga igual.
Figura 6. Histoquímica de la NADPH diaforasa en
penes de ratones GFR\alpha2^{-/-} y de tipo salvaje. Secciones
transversales de la parte proximal del cuerpo esponjoso del pene de
ratones de tipo salvaje (A) y de GFR\alpha2^{-/-} (B). La
tinción de los nervios del pene dorsales (flecha) disminuye
radicalmente en ratones GFR\alpha2^{-/-}. (C y D) En los
pilares del pene la tinción de las fibras nerviosas se reduce
claramente aunque la tinción perivascular parece que se ve menos
afectada. (E) Cuantificación de las fibras positivas a NADPH
diaforasa en nervios dorsales y en el cuerpo cavernoso de los
pilares del pene. Los resultados se expresan como media \pm SEM
de 4 ratones de tipo salvaje y 4 GFR\alpha2^{-/-}. **, P<0,01
(Prueba t-Student de dos colas suponiendo varianzas
diferentes). [Barras de escala: A-D, 100
\mum].
Figura 7. Expresión del ARNm de GDNF en el
cuerpo esponjoso del pene (A, C). Se puede observar hibridación en
el límite entre la túnica albugínea y el cuerpo cavernoso. (C) Un
aumento superior muestra que las células subtunicales que expresan
el ARNm de GDNF tienen núcleos prominentes, tal como muestra la
tinción con hematoxilina. (B) La imagen de campo oscuro de la
sección incubada con una sonda sentido no muestra hibridación. (D y
E) Las secciones adyacentes teñidas con anticuerpos a la vimentina
(D) o a S100beta (E) mostraron inmunorreactividad en células
subtunicales. El asterisco indica la uretra, la punta de la flecha
apunta al nervio dorsal. cc, cuerpo cavernoso; ta, túnica
albugínea. [Barras de escala: A y B, 1 mm; C-E, 50
\mum].
Figura 8. Análisis por transferencia Northern de
la expresión del ARNm de GDNF en órganos pélvicos de rata adulta.
La sonda de GDNF marcada con ^{32}P se hibridó a la membrana de
transferencia con ARNm de los tejidos indicados (3
\mug/carril).
Figura 9. Cuantificación y especificidad del
transporte retrógrado de ^{125}I-GDNF en el MPG y
diferentes DRGs de rata adulta. Se inyectó
^{125}I-GDNF en el pene solo o con un exceso de
100 veces de NTN no marcada o citocromo c. Los resultados se
expresan como media \pm SEM de 4 animales en cada grupo. *, P <
0,05; **, P < 0,01 (ANOVA con corrección de Scheffe).
Figura 10. Transporte axonal retrógrado de
^{125}I-GDNF desde el cuerpo esponjoso del pene al
MPG y al DRG. (A y C) La autorradiografía muestra señal puntuada
sobre los cuerpos de las células neuronales en el MPG (A) y el DRG
S1 (C) 24 horas después de la inyección de
^{125}I-GDNF (400 ng) en el cuerpo cavernoso. (B y
D) El exceso de GDNF no marcado suprimió el transporte retrógrado
de ^{125}I-GDNF hasta el MPG (B) y el DRG S1 (D).
[Barras de escala: A-D, 100 \mum].
Figura 11. (A y B) Crecimiento de neuritas en
ganglios trigeminales de ratón en el día embrionario 13 después de
3 días en gel de colágeno en presencia de 1 ng/ml de
^{125}I-GDNF (A), GDNF (B) o en ausencia de
factores neurotróficos (C). Las neuritas se visualizaron mediante
tinción con antineurofilamento. [Barras de escala:
A-C, 500 \mum].
Figura 12. Expresión de los ARNm de GFR\alpha3
y Ret en el MPG de rata adulta, y de ARNm de GFR\alpha3 en el DRG
S1. (A, B) Las imágenes de campo oscuro de secciones adyacentes
muestran señales prominentes para GFR\alpha3 y Ret en el MPG. La
señal de GFR\alpha3 se observa principalmente en neuronas de
tamaño grande (A), mientras que la señal de Ret se observa en todo
el ganglio (B). El inserto en A representa la imagen de campo
brillante de la sección del MPG hibridada con la sonda de
GFR\alpha3. Las puntas de las flechas apuntan a neuronas de
tamaño pequeño que no expresan el ARNm de GFR\alpha3. (C) Imagen
de campo oscuro que muestra la señal de GFR\alpha3 sobre neuronas
en el DRG S1. (D, E) Las flechas pequeñas indican las neuronas del
DRG S1 comarcadas con FG (D) y la sonda de GFR\alpha3 (E). La
punta de la flecha apunta a una neurona marcada con FG (D), que no
expresa ARNm de GFR\alpha3 (E). [Barras de escala,
(A-C) 250 \mum; (D, E) 50 \mum].
Figura 13. Análisis por transferencia Northern
de la expresión de los ARNm de NGF, BDNF y NT-3 en
órganos pélvicos de rata adulta. Las sondas marcadas con ^{32}P
se hibridaron a las membranas de transferencia con ARNm de los
tejidos indicados. (3 \mug/carril). El cerebro sirve de control
positivo. La hibridación de la sonda de GAPDH indica carga.
Figura 14. Cuantificación y especificidad del
transporte retrógrado de ^{125}I-NGF,
^{125}I-BDNF e
^{125}I-NT-3 dentro del MPG y
diferentes DRGs de rata adulta. Las neurotrofinas yodinadas se
inyectaron solas en el pene, con un exceso de 100 veces de
neurotrofina no marcada o citocromo.
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Claims (6)
1. Utilización de un factor neurotrófico, que es
una neurturina (NTN), un factor neurotrófico derivado de células
gliales (GDNF), o variantes de los mismos sustituidas de forma
conservadora, solos o en cualquier combinación, o secuencias de
nucleótidos que codifican dichos factores neurotróficos para la
fabricación de un producto médico para el tratamiento de
disfunciones eréctiles del pene.
2. Utilización, según la reivindicación 1,
caracterizada porque el factor neurotrófico es NTN.
3. Utilización, según la reivindicación 1,
caracterizada porque el factor neurotrófico es GDNF.
4. Utilización, según la reivindicación 1,
caracterizada porque la disfunción eréctil del pene está
causada por traumatismo peneano agudo, cirugía del pene, cirugía
prostática, cirugía de la vejiga u otras cirugías pélvicas.
5. Utilización, según la reivindicación 1,
caracterizada porque el producto médico se puede administrar
por vía intracavernosa.
6. Utilización, según la reivindicación 1,
caracterizada porque el producto médico, además del factor
neurotrófico, comprende, como mínimo, un agente auxiliar opcional
farmacéuticamente aceptable que es compatible con la vía de
administración.
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