ES2351804T3 - Tratamiento de esclerosis lateral amiotrófica. - Google Patents
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Abstract
VEGF165 neuronas motoras en el que dicho VEGF165 se administra continuamente durante al menos 4 semanas al sitio de aparición a un intervalo de dosis entre 0,01 µg/kg/día y 0,6 µg/kg/día.
Description
Campo de la invención
La presente invención se refiere a VEGF165 para uso en
el tratamiento de enfermedades de las neuronas motoras en
las que dicho VEGF165 se administra continuamente durante al
menos 4 semanas al sitio de aparición a una dosis en el
intervalo entre 0,01 µg/kg/día y 0,6 µg/kg/día. Más
particularmente, la invención se refiere al tratamiento de
esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Se encuentra que la
administración intracerebroventricular de bajas cantidades
de factor de crecimiento endotelial vascular a un modelo
animal de ELA preclínico induce una actividad motora
significativa y prolonga el tiempo de supervivencia de
dichos animales.
Introducción a la invención
La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es un trastorno
paralizante devastador que mata a los pacientes en el plazo
de 3 a 5 años después de la aparición 1-4 . Los síntomas
clínicos resultan principalmente de la degeneración
progresiva de neuronas motoras en la médula espinal y el
tronco encefálico, prescindiendo en buena parte de la
actividad cognitiva. La enfermedad afecta a individuos sanos
en medio de su vida, esporádicamente en >90% de los casos
sin ninguna historia familiar. Aunque se ven afectados más
hombres que mujeres antes de la edad de 60 años, ambos sexos
están similarmente afectados a edad mayor 5. Con la
población en envejecimiento, cada vez más individuos sufren
ELA -el tercer trastorno neurodegenerativo más común 6.
Muchos pacientes con ELA notan primero debilidad muscular en
sus miembros (ELA de "aparición en los miembros"). En -25%
de pacientes con ELA, las neuronas motoras se degeneran
primero en los núcleos motores del tronco encefálico (ELA de
"aparición bulbar"), causando disartria, disfagia y
problemas respiratorios. Los pacientes con ELA de aparición
bulbar generalmente presentan una progresión de la
enfermedad más rápida y más agresiva que los pacientes con
aparición en los miembros, pero estos últimos eventualmente
también desarrollan síntomas bulbares. La causa exacta de la
degeneración de neuronas motoras en la mayoría de los casos
permanece en buena parte enigmática 2,4,7. Las mutaciones
SOD-1 producen degeneración de neuronas motoras en seres
humanos y, cuando se sobreexpresan, también en ratones
transgénicos. En realidad, los ratones SOD-1G93A se han
convertido en el modelo animal de referencia para evaluar el
potencial terapéutico de novedosos candidatos a fármacos 8.
Las ratas SOD-1G93A desarrollan una forma agresiva de ELA,
pero todavía no se han usado para la evaluación de
tratamientos novedosos 9,10. Una cura eficaz no autorizada
está disponible ahora para ELA. Riluzol es el único fármaco
autorizado en algunos países, pero no en todos, pero tiene
un mínimo beneficio en la supervivencia, es costoso, no está
exento de efectos secundarios y, lo que es más importante,
es ineficaz en síntomas bulbares 16. Como la ELA resulta de
la degeneración de neuronas motoras, desde hace mucho tiempo
se han considerado factores de crecimiento neurotróficos
tales como factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF),
factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor de crecimiento
similar a la insulina (IGF)-1, factor inhibidor de leucemia
(LIF), cardiotrofina (CT)-1 y factor de crecimiento de
hepatocitos (HGF) como candidatos terapéuticos para ELA. Se
ha mostrado que la transferencia de genes de GDNF, pero
especialmente de IGF-1 usando un vector viral
retrógradamente transportado por axones, prolonga la
17,18
supervivencia de ratones SOD-1G93A . Aunque están en
proceso ensayos clínicos, queda por establecer la
aplicabilidad clínica de la terapia génica para ELA y
cuestiones sobre su naturaleza irreversible, riesgo de
efectos cromosómicos adversos, escaso control de la
expresión transgénica y todavía quedan por vencer grandes
necesidades de producción. Por tanto, en su lugar, la
administración de factores de crecimiento neurotróficos
recombinantes es una estrategia terapéutica atractiva ya que
ofrece un control flexible de la dosis y la duración de la
proteína administrada. Sin embargo, la infusión intratecal
de BDNF 19, la administración intracerebroventricular de
GDNF o la administración sistémica de BDNF o CNTF 20 no ha
dado resultado hasta la fecha en la mejora clínica
sustancial en pacientes con ELA, excepto una reducción del
26% de progresión de la enfermedad después de la
administración de IGF-1 en un estudio, pero no en el otro
21,22. Al menos parte del fracaso puede atribuirse a la corta
semivida, inmunogenicidad, efecto dual dependiente de la
dosis sobre la supervivencia neuronal frente a apoptosis,
toxicidad no deseada y capacidad limitada para cruzar la
barrera hematoencefálica después de la administración
sistémica de estas proteínas 23-25. Otro motivo posible puede
referirse al hecho de que varios de estos factores, incluso
a la vez que promueven la supervivencia de neuronas motoras
agudamente dañadas cuando se suministran exógenamente,
pueden no desempeñar una función crítica tal en el control
endógeno de la supervivencia de neuronas motoras en adultos
en una enfermedad crónica tal como ELA. Los inventores
descubrieron recientemente que bajos niveles de VEGF son
superfluos para el desarrollo de neuronas motoras que
producen degeneración de neuronas motoras similar a ELA de
aparición en adultos en ratones genéticamente modificados
(documento WO0176620) y también aumentan el riesgo de ELA
esporádica y familiar en seres humanos 13-15. El VEGF es un
factor angiogénico prototipo que participa en el crecimiento
de vasos en individuos sanos y con enfermedad 11,12. Para
evitar problemas inmunitarios y efectos secundarios
sistémicos, para vencer la capacidad limitada de VEGF para
cruzar la barrera hematoencefálica y para lograr los máximos
niveles de proteína VEGF en el parénquima de la médula
espinal, los inventores desarrollaron una estrategia nunca
previamente usada para examinar el potencial terapéutico de
una proteína recombinante en estudios de ELA preclínicos, es
decir, para administrar, intracerebroventricularmente, VEGF
recombinante durante periodos prolongados usando un modelo
de rata SOD-1G93A transgénica de ELA. Sorprendentemente, los
inventores han encontrado que niveles extremadamente bajos
de VEGF165 no sólo mejoran significativamente la actividad
motora, sino que también prolongan el tiempo de
supervivencia en un modelo de ELA preclínico de rata con un
tiempo inesperadamente largo. Los resultados muestran que
bajos niveles de VEGF165 pueden ralentizar la progresión de
la enfermedad de pacientes que padecen ELA cuando se
administra intracerebroventricularmente.
Descripción detallada de la invención
La presente invención muestra que la administración
intracerebroventricular (ICV) de bajas cantidades de VEGF
retrasa la aparición, mejora la actividad motora y prolonga
la supervivencia de una estirpe de rata que padece una forma
agresiva de ELA. Este es el primer estudio que muestra un
efecto terapéutico significativo de un factor de crecimiento
recombinante sobre las características de enfermedad en un
modelo de ELA preclínico. Se han evaluado varios factores de
crecimiento recombinantes con actividad neurotrófica
conocida que incluyen BDNF, IGF-1, CNTF, LIF y GDNF en
pacientes con ELA o ratones SOD1G93A, pero ningún factor de
crecimiento recombinante individual proporcionó
consistentemente un beneficio sustancial 19-22,35, por tanto,
19-22
desde el fracaso de los ensayos clínicos previos la
administración de factores de crecimiento recombinantes ha
perdido mucho de su atractivo. Como muestran aquí los
inventores, el VEGF165 tiene efectos directos sobre las
neuronas motoras in vivo. Aunque se sabe que el VEGF afecta
diversos procedimientos neuronales in vivo 15, nunca se ha
establecido si el VEGF ejerció sus efectos directamente
sobre las neuronas o indirectamente por otros tipos de
células o mediante otros productos intermedios moleculares.
Por tanto, el VEGF165 tiene un espectro pleótropo de
actividades que puede haber contribuido a su notable
beneficio terapéutico en esta invención.
La presente invención proporciona la isoforma de VEGF165
para uso para el tratamiento de trastornos de neuronas
motoras y más específicamente para el tratamiento de
esclerosis lateral amiotrófica y enfermedades similares a la
esclerosis lateral amiotrófica, en el que dicho VEGF se
administra continuamente próximo al sitio de aparición
durante al menos 4 semanas a una dosis en el intervalo entre
0,01 µg/kg/día y 0,6 µg/kg/día. El VEGF165 es una proteína de
165 aminoácidos que se denomina normalmente VEGF humano
(hVEGF). El VEGF se expresa en una variedad de tejidos como
múltiples formas homo-diméricas (121, 145, 165, 189 y 206
aminoácidos por monómero) resultantes de corte y empalme de
ARN alternativo. El VEGF121 es un mitógeno soluble que no se
une a heparina; las formas más largas de VEGF se unen a la
heparina con afinidad progresivamente mayor. Las formas de
unión a heparina de VEGF pueden ser escindidas en el extremo
carboxi por plasmina para liberar una forma(s) difusible(s)
de VEGF. Además, recientemente también se han identificado
varias moléculas estructuralmente relacionadas con VEGF que
incluyen factor de crecimiento placentario (PIGF), VEGF-B,
VEGF-C, VEGF-D y VEGF-E. Ferrara y Davis-Smyth (1997)
Endocr. Rev., Ogawa y col. (1998) J. Biological Chem.
273:31273-31281; Meyer y col. (1999) EMBO J., 18:363-374. En
un caso, la presente divulgación se refiere a los términos
'composición farmacéutica' o 'medicamento' o 'uso para la
preparación de un medicamento para tratar' se refiere a una
composición que comprende VEGF165 como se describe
anteriormente y un vehículo o excipiente farmacéuticamente
aceptable (ambos términos pueden usarse indistintamente)
para tratar enfermedades de neuronas motoras como se indica
anteriormente. Los vehículos o excipientes adecuados
conocidos para el experto son solución salina, disolución de
Ringer, disolución de dextrosa, disolución de Hank, aceites
no volátiles, oleato de etilo, dextrosa al 5% en solución
salina, sustancias que potencian la isotonicidad y la
estabilidad química, tampones y conservantes. Otros
vehículos adecuados incluyen cualquier vehículo que por sí
mismo no induce la producción de anticuerpos nocivos para el
individuo que recibe la composición tales como proteínas,
polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos,
aminoácidos poliméricos y copolímeros de aminoácidos. En una
realización particular, el 'medicamento' puede administrarse
mediante un procedimiento próximo al sitio de aparición. De
hecho, el gradiente espacial de los niveles de VEGF165 y el
beneficio terapéutico indica que, a pesar del significativo
movimiento de LCR, el VEGF165 se deposita en estrecha
proximidad a su sitio de inyección. Esto puede ofrecer
novedosas oportunidades para adaptar la terapia con VEGF a
las necesidades de los pacientes. De hecho, los individuos
que padecen ELA con aparición bulbar pueden beneficiarse más
de la administración ICV o intratecal de VEGF a nivel
cervical, mientras que los pacientes con ELA con aparición
lumbar pueden beneficiarse más de una infusión intratecal de
VEGF a nivel lumbar. En un caso particular, el VEGF165 se
administra a una dosis entre 0,01 µg/kg/día y 1,5 µg/kg/día,
más preferentemente entre 0,05 µg/kg/día y 1 µg/kg/día, lo
más preferentemente entre 0,2 µg/kg/día y 0,8 µg/kg/día.
Preferentemente se usa una infusión continua e incluye la
administración subcutánea continua mediante una minibomba
osmótica. En otro caso, el VEGF165 se administra
continuamente próximo al sitio de aparición a una dosis
dentro de un intervalo entre 0,05 µg/kg/día y 1 µg/kg/día.
En otro caso, el VEGF165 se administra continuamente
próximo al sitio de aparición a una dosis dentro de un
intervalo entre 0,2 µg/kg/día y 0,8 µg/kg/día. En una
realización, dicha administración próxima a la aparición es
una administración intratecal. En otra realización, dicha
administración próxima a la aparición es una administración
intracerebroventricular. También debe ser evidente que en un
caso, la administración de VEGF165 se administra
continuamente próxima al sitio de aparición a una dosis
dentro de un intervalo entre 0,01 µg/kg/día -1,4 µg/kg/día
o 0,01 µg/kg/día -1,3 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -1,2
µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -1,1 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día
– 1 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,9 µg/kg/día o 0,01
µg/kg/día -0,8 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,7 µg/kg/día o
0,01 µg/kg/día -0,6 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,5
µg/kg/día o 0,01 -0,4 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,3
µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,2 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día
-0,1 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,09 µg/kg/día o 0,01
µg/kg/día -0,08 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,07 µg/kg/día
o 0,01 µg/kg/día -0,06 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,05
µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,04 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día
-0,03 µg/kg/día. En otro caso, la administración de VEGF165
se administra continuamente próxima al sitio de aparición a
una dosis dentro de un intervalo entre 0,02 µg/kg/día -1,5
µg/kg/día o 0,03 µg/kg/día -µg/kg/día o 0,04 µg/kg/día
/kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,05 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o
0,06 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,07 µg/kg/día -1,5
µg/kg/día o 0,08 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,09 µg/kg/día
-1,5 µg/kg/día o 0,1 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,2
µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,3 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o
0,4 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,5 µg/kg/día -1,5
µg/kg/día o 0,6 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,7 µg/kg/día µg/kg/día o 0,8 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,9 µg/kg/día 1,5 µg/kg/día o 1 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 1,1 µg/kg/día,
1,5 µg/kg/día o 1,2 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 1,3
µg/kg/día -1,5 µg/kg/día.
Por tanto, en una realización particular, la infusión
con una composición que comprende VEGF165 es intratecal. La
administración intratecal puede realizarse, por ejemplo, por
medio del implante quirúrgico de una bomba y llevando un
catéter a la columna vertebral.
Para aclarar la invención, el término 'enfermedad de
las neuronas motoras' se explica a continuación. La
enfermedad de las neuronas motoras es un grupo de
enfermedades que implica la degeneración de las células del
asta anterior, los nervios en el sistema nervioso central
que controlan la actividad muscular. Esto conduce a un
debilitamiento gradual y eventualmente al deterioro
progresivo de la musculatura (atrofia). Las enfermedades de
las neuronas motoras se clasifican según la participación de
neuronas motoras superiores (UMN) y/o neuronas motoras
inferiores (LMN). Las neuronas motoras superiores se
originan en el cerebro, en particular, la corteza motora, y
forman sinapsis bien directamente o indirectamente sobre las
neuronas motoras inferiores. Las neuronas motoras superiores
se denominan con más exactitud en lo sucesivo pre-neuronas
motoras y son las responsables de transportar órdenes
descendentes para el movimiento. Las neuronas motoras
inferiores pueden idearse en dos categorías: neuronas
motoras viscerales y somáticas. Las neuronas motoras
viscerales son neuronas pre-gangliónicas autonómicas que
regulan la actividad de las neuronas gangliónicas que
inervan glándulas, vasos sanguíneos y músculo liso. Las
neuronas motoras somáticas inervan músculo esquelético e
incluyen primero células del asta anterior que, como implica
el nombre, se localizan en el asta anterior de la médula
espinal, y segundo, neuronas motoras inferiores localizadas
en los núcleos de nervios craneales. La esclerosis lateral
amiotrófica o ELA es la forma más frecuente (representa
aproximadamente el 80% de todos los casos) de trastornos de
las neuronas motoras. La ELA se conoce como enfermedad de
Lou Gehrig, que lleva el nombre del famoso jugador de
beisbol yanqui. Los síntomas iniciales de la ELA son
debilidad en las manos y las piernas y frecuentemente
fasciculación de los músculos afectados. Sea cuales sean los
primeros miembros afectados, los cuatro miembros se afectan
eventualmente. La lesión a las neuronas motoras superiores
produce debilidad muscular, espasticidad y reflejos
tendinosos profundos hiperactivos. La lesión de las neuronas
motoras inferiores produce debilidad muscular con atrofia,
fasciculaciones, flacidez y reflejos tendinosos profundos
disminuidos. La ELA tiene características de las neuronas
motoras tanto superiores como inferiores de los nervios
craneales, por tanto, los síntomas se aíslan a la cabeza y
el cuello. Algunos pacientes también mostrarán implicación
de UMN de los nervios craneales y, si esta es la única
manifestación, se denomina en lo sucesivo parálisis
seudobulbar. La atrofia muscular espinal o la atrofia
muscular progresiva es una enfermedad de la neurona motora
que no implica los nervios craneales y es debida a una menor
degeneración de neuronas motoras. El síndrome de Shy-Drager
se caracteriza por hipotensión postural, incontinencia,
sudoración, rigidez y temblor muscular, y por la pérdida de
neuronas de los núcleos torácicos en la médula espinal a
partir de la cuales se originan las fibras simpáticas. Las
lesiones destructivas de la médula espinal dan como
resultado la pérdida de células del asta anterior. Esto se
observa en mielomeningocele y en siringomielia, en los que
se forma un gran quiste lleno de fluido en el centro de la
médula espinal cervical.
El efecto beneficioso con VEGF165 se refiere al hecho
que en la presente invención este factor de crecimiento
recombinante se administró continuamente y directamente al
líquido cefalorraquídeo (LCR) -la disponibilidad de los
grandes modelos de rata SOD1G93A de ELA era por tanto
instrumental. Los datos de biodistribución muestran que el
VEGF165 después de la administración ICV difunde rápidamente
desde el LCR al parénquima de la médula espinal y, por
tanto, puede alcanzar las neuronas motoras espinales
inferiores por lo que los inventores no pueden excluir que
algo del beneficio pueda haber procedido de un efecto sobre
las neuronas motoras superiores. La estrecha correlación
entre la biodistribución de VEGF165 (mayor en el tronco
encefálico que en la médula espinal lumbar) y su efecto
terapéutico muestra que el VEGF indujo su mayor efecto en
sitios en los que sus niveles eran los mayores. Como el
VEGF165 se elimina del sistema nervioso central pasadas las 3
horas (similar a otras neurotrofinas 38), la administración
continua de VEGF165 contribuyó probablemente al efecto
beneficioso. Otros motivos pueden referirse al perfil de
seguridad general de VEGF165 administrado ICV (los inventores
no pudieron observar ningún efecto adverso prominente cuando
se usó una dosis terapéutica que era 10 veces inferior al
umbral de toxicidad) y la falta de una respuesta inmunitaria
(que podría haberse producido de otra forma neutralizando
anticuerpos). Se produjo una reacción inmunitaria tras la
administración sistémica de VEGF165 y, probablemente, la
insignificante penetración de VEGF a través de la barrera
hematoencefálica sólo se vencería administrando
sistémicamente cantidades masivas -probablemente tóxicas de VEGF165.
La administración ICV puede parecer incómoda a primera
vista, pero es técnicamente viable y ya está en
funcionamiento para otras indicaciones neurológicas crónicas
43. En realidad, la incomodidad de una sencilla intervención
quirúrgica para colocar la bomba supera enormemente a los
beneficios de esta vía de administración (ausencia de
efectos secundarios sistémicos y respuesta inmunitaria;
administración controlable). Los datos genéticos previos de
los inventores indican que el VEGF afecta a la ELA tanto
esporádica como familiar 14. Mientras que los inventores
sólo pudieron usar en la presente invención un modelo animal
de ELA familiar, hay muchas posibilidades de que el VEGF
también sea eficaz en casos esporádicos de ELA. Después de
todo, el VEGF tiene efectos de supervivencia para diversos
tipos de neuronas, independientemente del tipo de estrés
(hipoxia, excitotoxicidad, deprivación de suero, toxicidad
relacionada con SOD1 mutantes, etc.) y, por tanto, es un
candidato atractivo 15. Parece que la terapia con VEGF va a
ser segura y bien tolerada durante periodos de tiempo
prolongados sin causar efectos secundarios vasculares. Los
hallazgos de los inventores se extienden a las observaciones
previas de que el VEGF es conocido por tener actividades
biológicas cualitativamente distintas (permeabilidad
vascular, angiogénesis) a diferentes concentraciones 57 .
Además, bajos niveles de VEGF sólo estimulan la angiogénesis
en cerebro isquémico/lesionado cuando se administran
directamente al parénquima del cerebro, pero no al LCR 48,58.
Ejemplos de la presente divulgación que incluye la
invención.
1. Administración sistémica frente a intracerebroventricular
de VEGF recombinante
Los inventores evaluaron primero por qué vía, es decir,
sistémica o intracerebroventricular, se administraría mejor
el VEGF. La terapia de ELA segura y eficaz con factor de
crecimiento requiere que la administración de la proteína no
eleve una respuesta inmunitaria o induzca efectos adversos
sistémicos, pero dé como resultado niveles suficientemente
altos, es decir, terapéuticos, en el parénquima de la médula
espinal. Estudios iniciales indicaron que todas las
preparaciones de VEGF humano, de rata o murino recombinantes
comercialmente disponibles, cuando se administran
intraperitonealmente a ratones a 1 µg cada dos días (una
dosis terapéutica para estimular la angiogénesis 37),
produjeron una fuerte respuesta inmunitaria en el plazo de 2
semanas. Los mejores resultados se obtuvieron cuando se usó
VEGF de murino producido en E. coli en casa, pero incluso
esta preparación produjo una respuesta inmunitaria en el
plazo de 4 semanas, excluyéndose así la administración
sistémica crónica de VEGF. Además, el VEGF es hidrófilo y
tiene un peso molecular de 44 kDa y es, por tanto, poco
probable que cruce la barrera hematoencefálica o sangre-
líquido cefalorraquídeo (LCR) con una eficiencia superior al
1% de la dosis inyectada 38. Por tanto, para obtener niveles
de VEGF suficientes en el parénquima de la médula espinal
tendrían que administrarse cantidades excesivas de VEGF,
induciendo probablemente efectos secundarios sistémicos
tóxicos. Además, el VEGF es atrapado no sólo por la matriz
extracelular rica en sulfato de heparán en tejidos, sino
también en el plasma, por Flt1 soluble (sFlt1), es decir, el
dominio de unión al ligando extracelular del receptor 1 de
VEGF (también llamado Flt1) 39, 40. Sin embargo, los
inventores detectaron niveles de Flt1 soluble 5 veces
mayores en el suero que en el líquido cefalorraquídeo en
ratones (3.800 ± 594 pg/ml frente a 810 ± 66 pg/ml; N=3;
P<0,05). Por tanto, quedaría atrapada una mayor fracción de
VEGF por sFlt1 y la matriz rica en sulfato de heparano
cuando se administra sistémicamente en vez de
intracerebroventricularmente. Finalmente, aunque los niveles
de VEGF son indetectables en el LCR 41, el plexo coroideo es
uno de los pocos sitios en el cuerpo en los que el VEGF
permanece constitutivamente expresado en el adulto 42 .
Debido a todos estos motivos, los inventores evaluaron si la
administración intracerebroventricular (ICV) de VEGF
ofrecería una solución alternativa y se optimizaron las
técnicas necesarias para una administración ICV a largo
plazo de factores de crecimiento. Como los inventores
determinaron previamente que la isoforma de VEGF164 (el
equivalente humano es VEGF165) presenta las propiedades
biológicas óptimas para estimular la supervivencia de las
neuronas motoras 13 (documento WO0176620), los inventores
usaron esta isoforma en el resto de su estudio. Como se
usaron ratas para todos los experimentos de administración
(véase más adelante), los inventores clonaron y expresaron
una preparación de proteína VEGF164 de rata, que tenía >99%
de pureza y estaba libre de endotoxinas.
2. Biodistribución de VEGF después de administración
intracerebroventricular
No se sabe nada sobre la farmacocinética de VEGF en el
sistema nervioso central después de la administración ICV
38. Incluso se desconoce si el VEGF administrado al LCR
podría difundir en el parénquima de la médula espinal a
través de la barrera ependimaria. Por tanto, los inventores
determinaron primero el patrón de distribución de 125I-VEGF
después de la administración ICV a ratas sanas. Una hora
después de una inyección ICV en bolo, sólo el 12% de la
cantidad inyectada de 125I-VEGF estaba todavía presente en el
LCR, mientras que el 70% y el 12% se recuperaron en el
parénquima del cerebro y la médula espinal, respectivamente,
que indica que el 125I-VEGF difundió fácilmente del LCR al
parénquima. Por tanto, similar a como para NGF, pero a
diferencia de BDNF, la capa ependimaria no representa una
barrera para que el VEGF difunda al parénquima 38. Cuando se
expresaron los niveles de 125I-VEGF por gramo de tejido, los
niveles de 125I-VEGF fueron los mayores en la proximidad del
sitio de inyección y disminuyeron progresivamente en un
gradiente rostro-caudal a lo largo de la médula espinal: los
niveles de 125I-VEGF en la médula espinal bulbar/cervical,
torácica y lumbar fueron el 80%, 50% y 16%, respectivamente,
de aquellos en el cerebro. 3 horas después de la inyección,
sólo el 30% del 125I-VEGF inyectado estaba presente en el
cerebro y la médula espinal, mientras que cantidades
insignificativas fueron detectables después de 24 horas
cuando el 125I-VEGF se recuperó en las excreciones,
sugiriendo que el VEGF se eliminó en los sistemas venoso y
linfático, como se documentó para otros factores de
crecimiento 38. De estos experimentos pueden sacarse dos
conclusiones. Primera, el VEGF administrado ICV difunde
rápidamente del LCR a las neuronas en el parénquima, pero
luego se elimina en el plazo de 24 horas del LCR. Como las
neuronas motoras en ELA requieren crónicamente señales de
supervivencia, el VEGF debe administrarse continuamente.
Segundo, después de la administración ICV, el VEGF se
distribuye en un gradiente rostro-caudal – éste puede tener
consecuencias en la afectación de la supervivencia de las
neuronas motoras en un patrón espacial similar.
3. Administración intracerebroventricular a largo plazo de
VEGF recombinante
Aunque se ha conseguido la administración ICV
prolongada de GDNF durante 8 meses en seres humanos para
otros trastornos neurodegenerativos 43, esta vía no se ha
usado para evaluar el potencial terapéutico de factores de
crecimiento recombinantes en modelos de ELA preclínicos.
Para lograr la administración continua y constante a largo
plazo de VEGF recombinante, los inventores implantaron
minibombas osmóticas subcutáneamente en los lomos de los
animales y las conectaron a un catéter que los inventores
colocaron estereotácticamente en el ventrículo lateral del
cerebro. Aunque es técnicamente viable cateterizar el
ventrículo lateral en ratones, los catéteres dejaron de
quedarse fijados al cerebro y se desprendieron después de
varias semanas ya que los ratones intentaron quitárselos
rascándose su cabeza. Además, el gran tamaño de la bomba con
respecto al tamaño del cuerpo (casi el 30% del tamaño de su
cuerpo) excluyó mediciones fidedignas de la actividad
motora. Por tanto, los inventores eligieron implantar bombas
que administraban los compuestos durante 4 semanas en un
modelo de ELA de rata SOD1G93A para evaluar el potencial
terapéutico de la administración ICV de proteína VEGF
recombinante. Sustituyendo las bombas cada 4 semanas, los
inventores tuvieron éxito en la reproducibilidad de la
administración de proteína VEGF durante más de 100 días sin
ningún efecto adverso (véase más adelante). La correcta
posición y la permeabilidad de los catéteres se comprobaron
en cada rata en el momento de la disección. Y, lo que es más
importante, el VEGF todavía era biológicamente activo en la
unión a sus receptores, el receptor 1 de VEGF (también
llamado Flt1) y el receptor 2 de VEGF (Flk1), después de
incorporarse en la minibomba osmótica en los animales
durante varias semanas. De hecho, de las bombas se recuperó
después de tres semanas el 89% y el 68% del VEGF residual en
la bomba todavía unido a Flt1 y Flk1, respectivamente, que
indica que la mayoría del rVEGF164 almacenado en las bombas
todavía estaba activo. Como el VEGF nunca había sido
administrado al sistema nervioso central crónicamente (la
duración más larga fue una semana) y los efectos de la
administración aguda frente a la crónica de VEGF pueden ser
diferentes, los inventores evaluaron cuidadosamente si una
dosis particular de VEGF estimularía la supervivencia de las
neuronas motoras sin causar un crecimiento o escape excesivo
de vasos sanguíneos, ni siquiera después de administración
prolongada durante varios meses. Los experimentos iniciales
desvelaron que todas las ratas que recibieron
intracerebroventricularmente una alta dosis de VEGF (por
ejemplo, 20 µg/kg/día) murieron después de algunos días. A 2
µg/kg/día, el 66% de las ratas enfermaron después de 3 a 4
semanas. Mientras que no estuvieran paralizados (los
animales todavía podían andar normalmente cuando se
empujaban), estuvieron generalmente apáticos. La inspección
macroscópica y el análisis histológico del cerebro y la
médula espinal desvelaron un crecimiento de vasos adicional,
dilatación ventricular y enrojecimiento y edema del cerebro
y la médula espinal. Un intervalo de dosis entre 0,2
µg/kg/día y 0,6 µg/kg/día fue bien tolerado por las ratas
sin inducir edema, ausencia o exceso de crecimiento de vasos
– incluso cuando se administró crónicamente durante más de
100 días. A esta dosis, los niveles de VEGF en el LCR
permanecieron indetectables. Las ratas SOD1G93A/LSd (ratas
SOD1G93A con baja expresión de SOD1G93A en Sprague-Dawley;
véase el Ejemplo 4) se trataron con 0,6 µg de VEGF/kg/día. A
esta dosis, los niveles de VEGF en el LCR permanecieron
indetectables, supuestamente porque el VEGF infundido
difundió rápidamente al parénquima espinal. Esto es
importante ya que sólo niveles de VEGF detectables se han
asociado a patología 41. Por tanto, los inventores usaron
una dosis de 0,6 µg de VEGF/kg/día para tratar ratas
SOD1G93A. Esta dosis es, incluso después de la corrección
para el volumen de distribución relativo del cuerpo entero
frente al cerebro/médula espinal, todavía 5 veces inferior a
una dosis usada para la angiogénesis terapéutica 37. El
líquido cefalorraquídeo artificial (aLCR), infundido como
control, también fue bien tolerado durante periodos
prolongados, lo que indica que los procedimientos
quirúrgicos eran seguros. Otra ventaja de esta baja dosis de
VEGF era que no indujo una respuesta inmunitaria. De hecho,
no fueron detectables anticuerpos dirigidos contra VEGF en
la sangre periférica o LCR de ratas ni siquiera después de
100 días de administración de un intervalo de dosis de 0,2
µg/kg/día a 0,6 µg/kg/día de VEGF.
4. Efecto de VEGF en un modelo de rata de ELA
Las ratas SOD1G93A no se habían usado previamente para
evaluar novedosos paradigmas de tratamiento de ELA. Los
inventores usaron ratas SOD1G93A/LSd, generadas por Nagai y
col. 10 ("L" se refiere a los bajos niveles, por ejemplo
aumentados el doble, de SOD1G93A en este modelo) en Sprague-
Dawley (Sd). La progresión de la enfermedad es muy agresiva
en este modelo, matando los animales en el plazo de 10 días
después de la aparición de la enfermedad 10 . Las ratas
SOD1G93A/LSd presentaron una gran variabilidad entre camadas en
la aparición de la enfermedad que oscila de 95 a 145 días.
Para reducir esta variabilidad, los inventores usaron crías
de la misma camada SOD1G93A/LSd y analizaron el resultado de un
modo emparejado (N=17 ratas analizadas en 6 pares de
camadas; véanse los procedimientos para los detalles). En
comparación con el LCR artificial (aLCR) de control, el
tratamiento de ratas SOD1G93A/LSd con 0,6 µg de VEGF/kg/día a
60 días de edad retrasó significativamente la aparición de
la enfermedad y mejoró la actividad motora y el resultado
clínico global independientemente del procedimiento de
puntuación. Por ejemplo, las ratas SOD1G93A/LSd tratadas con
VEGF permanecieron generalmente activas, móviles, atentas y
se cepilló su pelo en un momento en el que los animales de
aLCR ya mostraban signos de parálisis, y progresivamente
iban volviéndose inmóviles y caquécticos. Los animales
control tenían más atrofia muscular grave que las ratas
tratadas con VEGF. La administración ICV de VEGF retrasó 10
días la aparición de parálisis de los miembros, puntuada
como arrastre de un miembro trasero o fallo al usar un
miembro delantero al caminar o al ponerse bien (P<0,05).
Usando un sistema de detección mediante rayo láser 10 los
inventores identificaron la edad a la que las ratas ya no
podían cruzar haces láser igualmente separados en una "jaula
de actividad" al menos 1.000 veces por hora -una medida de
su comportamiento de caminar espontáneo. Después de la
administración de VEGF, las ratas permanecieron
espontáneamente activas a una edad mayor (135 ± 5 días, aLCR
frente a 146 ± 8 días, VEGF; P<0,05). Los inventores también
grabaron en vídeo a las ratas y determinaron el tiempo que
dedican las ratas a explorar su jaula y contaron la
frecuencia con la que las ratas se ponían sobre sus miembros
traseros como medida adicional de su actividad espontánea.
Antes de la aparición de la enfermedad, es decir, a los 110
días de edad, ambos grupos exploraron su jaula tan activa, y
se pusieron sobre sus patas, como frecuentemente (P=NS).
Cuatro días después, las ratas aLCR mostraron los primeros
signos de parálisis de los miembros, las ratas tratadas con
VEGF exploraron sus jaulas durante más tiempo y se pusieron
sobre sus patas más frecuentemente que los animales tratados
con aLCR (P<0,05). Finalmente, el VEGF prolongó la
supervivencia de estas ratas con ELA 10 días (P<0,01). Por
tanto, a pesar de la muy rápida progresión de la enfermedad
y la gran variabilidad entre camadas de la aparición de la
enfermedad en este modelo, el tratamiento con VEGF retrasó
la aparición, mejoró la actividad motora y prolongó la
supervivencia de ratas SOD1G93A/LSd sin causar efectos
adversos.
5. Mecanismo molecular del efecto neuroprotector de VEGF
Los inventores exploraron adicionalmente los mecanismos
por los que el VEGF prolongó la supervivencia de neuronas
motoras in vivo. Estudios in vitro indicaron que el VEGF
protege las neuronas motoras de muerte celular inducida por
estrés uniendo el receptor 2 VEGF (también llamado FIk1)13,
pero nunca se ha demostrado una actividad neurotrófica
directa de VEGF in vivo. Para tratar el asunto anterior, los
inventores generaron ratones transgénicos usando el casete
de expresión Thy1.2 para impulsar la expresión de Flk1 de
murino en neuronas posnatales 45. En comparación con
compañeros de camada no transgénicos, los ratones Thy-Flk1
expresaron más transcripciones de ARNm de Flk1 (copias
Flk1/103 copias de HPRT: 470 ± 45 frente a 50 ± 5; N=3;
P<0,05) y proteína. La expresión de Flk1 en compañeros de
camada no transgénicos fue detectable en vasos sanguíneos y,
a un nivel inferior, en neuronas motoras grandes. A
diferencia, en ratones Thy-Flk1, altos niveles de Flk1
estaban presentes en neuronas motoras grandes en el asta
ventral, además de su expresión inicial en células
endoteliales. Los ratones Thy-Flk1 parecían sanos y fértiles
y se entrecruzaron con ratones SOD1G93A . Notablemente, la
sobreexpresión neuronal de Flk1 en ratones SOD1G93A retasó la
aparición de la deficiencia motora 23 días (N=8; P<0,001) y
los ratones Thy1-Flk1:SOD1G93A respondieron mejor que los
ratones SOD1G93A durante 26 días (N=8; P<0,01). Además, los
ratones Thy1-Flk1:SOD1G93A sobrevivieron 10 días más que sus
compañeros de camada SOD1G93A (N=8, P<0,05). Por tanto, estos
hallazgos genéticos indican que Flk1 en neuronas motoras
transmite señales de supervivencia clave de VEGF endógeno,
retrasando así la degeneración prematura de las neuronas
motoras en ELA. Otra evidencia de un efecto neuroprotector
de Flk1 se proporcionó generando ratones transgénicos usando
el mismo casete de expresión Thy1.2 para impulsar la
expresión neuronal de un Flk1 dominante negativo que
confiere señalización de VEGF (Flk1DN). Los ratones ThyFlk1DN también expresaron niveles elevados del transgén
Flk1DN en neuronas motoras. A los 3 meses de edad, los
ratones Thy-Flk1DN estaban sanos y eran fértiles y tenían
fuerza muscular, actividad motora y números de neuronas
motoras normales (neuronas motoras SMI32+/asta ventral: 31 ±
4,4, ratones naturales frente a 29 ± 1,2, ratones ThyFlk1DN; N=4; P=NS). Para estresar las neuronas motoras, los
ratones se alojaron cada dos días durante 30 días en una
cámara con 10% de O2. La hipoxia intermitente crónica reguló
por incremento los niveles de VEGF en la médula espinal (pg
de VEGF/µg de proteína: 12 ± 0,5, normoxia frente a 22 ±
1,4, hipoxia; N=5; P<0,05). Los ratones naturales toleraron
la hipoxia sin ningún problema y su fuerza de prensión
incluso aumentó ligeramente. A diferencia, los ratones ThyFlk1DN perdieron el 25% de su fuerza de prensión en el plazo
de una semana después de exponerse a hipoxia y quedaron más
débiles durante el resto del experimento. El análisis
histológico desveló una gliosis marcada en la materia gris
de ratones Thy-Flk1DN, pero no en ratones naturales (área de
GFAP+/área de materia gris en el asta ventral: 0,13 ± 0,45%,
natural frente a 2,7 ± 0,45%, Thy-Flk1DN; N=3-5; P<0,05).
Además, las neuronas motoras en Thy-Flk1DN , pero no en
ratones naturales, acumularon neurofilamento fosforilado
(neuronas SMI31+/10 secciones del asta ventral: ninguno en
los naturales frente a 15,3 ± 7,2 en Thy-Flk1DN; N=3-5;
P<0,05). Por tanto, estos hallazgos ilustran que Flk1 tiene
una función protectora crítica en el mantenimiento de
neuronas motoras adultas en condiciones de estrés hipóxico.
Materiales y procedimientos
- 1.
- Producción de VEGF164 de rata recombinante (VEGF164)
Se clonó ADNc de VEGF164 amplificado a partir de una
biblioteca de ADNc de rata en el vector de secreción pPICZαA
y se expresó usando el sistema de expresión en levadura
Pichia pastoris según las instrucciones del fabricante
(Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de la diálisis durante
la noche del medio acondicionado con levadura contra ácido
acético 10 mM (pH 5,5), el VEGF se purificó mediante
cromatografía secuencial en columnas de Phenyl Sepharose 6
Phast Flow y de heparina-agarosa (ambas de Amersham
Pharmacia Biotech). La concentración de VEGF se determinó
usando el ELISA Duoset de rata (R&D Systems, Abingdon, RU).
Entonces, el VEGF164 purificado se sometió a electroforesis y
se visualizaron bandas individuales teñidas de 45 kDa o 22
kDa bajo condiciones no reductoras y reductoras,
respectivamente, mediante tinción con azul de Coommassie y
con plata de los geles. Se confirmó que la banda era VEGF164
de rata recombinante mediante inmunotransferencia con un
anticuerpo monoclonal específico para rVEGF164 (R&D Systems)
y la secuenciación del extremo N después del protocolo de
degradación de Edman. Después de la digestión con tripsina
de la banda de 45 kDa importante, que fue seguida por la
separación de los péptidos escindidos sobre dHPLC, se
seleccionaron 3 péptidos internos y se secuenciaron en el
extremo N según el protocolo de degradación de Edman. Los
tres péptidos eran un apareamiento perfecto a la secuencia
de aminoácidos de VEGF164 publicada.
- 2.
- Caracterización funcional de VEGF164
La unión de la preparación de VEGF164 de los inventores
a receptores rhFc-FLT1 y rhFc-FLK1 inmovilizados (R&D
Systems) se comparó con la de VEGF164 de rata comercialmente
disponible. El VEGF164 unido se detectó usando anticuerpos
dirigidos contra VEGF de rata biotinilados (R&D Systems; 200
ng/ml), el kit de tinción de vectores ABC y lectura
fotoespectrométrica. El VEGF164 preparado en casa presentó
una mayor afinidad hacia rhFc-FLK1 y una afinidad de unión
similar hacia rhFc-FLT1. Los niveles de endotoxinas se
determinaron usando el kit de lisado de amebocito de Limulus
(LAL) (Bio-Whittaker, Walkersville, EE.UU.) y desveló la
presencia de 1 unidad de endotoxina por 350 µg de VEGF164 (o
3 E10-3 unidades de endotoxina por µg de VEGF164).
- 3.
- Experimentos radiomarcados
El 125I-VEGF humano radiomarcado se compró de Amersham
Pharmacia con una actividad específica de 25 µCi/µg de
VEGF165. 100 ng de esta preparación se disolvieron en 10 µl y
se inyectaron estereotácticamente en el ventrículo lateral
izquierdo de ratas Wistar hembra sanas usando un aguja
Hamilton de 0,2 mm de diámetro – las coordenadas
estereotácticas fueron las mismas que para la implantación
de la bomba osmótica (véase más adelante). Tras la inyección
ICV, las ratas se diseccionaron después de 1, 3 y 24 horas y
el cerebro, la médula espinal (dividida en médula espinal
cervical, torácica y lumbar), la sangre y otros órganos
(hígado, intestino, corazón, etc.) se pesaron y los
recuentos totales por minuto (cpm) se midieron usando un
contador gamma. La distribución de 125I-hVEGF165 en el
parénquima del cerebro se evaluó por microautorradiografía.
Primero, las criosecciones del cerebro y la médula espinal
que contenían VEGF165 marcado con 125I se sumergieron en
emulsión fotográfica (Kodak, Cedex, Francia). Después de dos
días de exposición, las secciones emulsionadas se revelaron
y la localización de granos de plata, como se detectan por
microscopía óptica, se usó para determinar la distribución
de tejido del VEGF165 marcado con 125I.
- 4.
- Generación y caracterización de ratones transgénicos
Los ratones transgénicos que expresaban Flk-1
específicamente en neuronas adultas se generaron usando el
casete de expresión Thy1.2 de ratón como se describe
previamente 59. Se clonó ADNc de Flk-1 de murino en el
casete de expresión Thy-1.2 y la contrucción linealizada se
microinyectó en embriones de ratón FvB usando técnicas de
microinyección convencionales. Se identificaron los
fundadores usando la PCR y se determinó la expresión del
transgén mediante RT-PCR, transferencia Western e
inmunotinción, como se describe previamente 13,37.
- 5.
- Animales
El Dr. Itoyama proporcionó amablemente ratas Sprague-
Dawley que expresaban el transgén SOD1G93A humano (SOD1G93A-L)
10, mientras que los ratones que expresaban el transgén
SOD1G93A humano se retrocruzaron durante más de 10
generaciones en FvB y fueron amablemente proporcionados por
el Dr. C. Kunst 60. Todos los experimentos en animales
fueron autorizados por el comité de ética animal local.
- 6.
- Procedimientos quirúrgicos
Para infundir VEGF164 de rata recombinante en el
ventrículo cerebral de las ratas se usaron bombas osmóticas
Alzet (modelo 2004) conectadas con un catéter a un cánula de
infusión cerebral. La unidad de infusión cerebral se llenó
con 200 µl de una disolución de VEGF164 de rata recombinante
5 µg/ml o con LCR artificial y se sensibilizó durante 48 h
en solución salina. La composición del LCR artificial era
Na+ 150 mM, K+ 3 mM, Ca2+ 1,4 mM, Mg2+ 0,8 mM, PO43-1 mM, Cl155 mM. Para la implantación de las bombas, las ratas se
anestesiaron con halotano, se hizo una incisión mediosagital
empezando ligeramente por detrás de los ojos y se expuso el
cráneo. Se preparó una bolsa subcutánea en el área
medioescapular del lomo de la rata y la bomba osmótica se
insertó en la bolsa. Se perforó un orificio por el cráneo y
la cánula se colocó usando las siguientes coordenadas
estereotáxicas: 0,8 mm posterior al bregma, 1,6 mm lateral y
4,5 mm ventral desde la superficie del cráneo. Cuando se
completó el procedimiento de implantación, la incisión de la
piel se suturó y se dejó que la rata se recuperara. Después
de 28 días, las bombas osmóticas vaciadas se sustituyeron
por una bomba osmótica nueva completamente cargada y
preparada. Para esto, la rata se anestesió de nuevo y se
hizo una pequeña incisión en la piel en la región
medioescapular del lomo. El catéter se cortó 5 mm anterior a
la bomba gastada y una bomba nueva se unió a la tubería del
catéter. Este procedimiento da como resultado una infusión
continua de VEGF164 a una tasa de 0,25 µl/h (correspondiente
a 1,25 ng de VEGF/hora) en el LCR. En un ensayo de
prevención, las bombas se implantaron a la edad de 60 días y
en un ensayo de regresión las bombas se implantaron a 80
días (edad de aparición de la enfermedad). Los ratones se
expusieron a hipoxia intermitente crónica transfiriéndolos
cada dos días durante 30 días a una cámara de oxígeno que
contenía 12% de oxígeno.
7. Análisis conductual
La actividad motora de las ratas se probó tres veces a
la semana usando mediciones en cilindro giratorio,
dinamómetro y de actividad espontánea. Se usó un cilindro
giratorio para ratas (Ugo Basile, Comerio VA, Italia) con
una velocidad de rotación constante (15 rotaciones por
minuto). El promedio de 5 ensayos de cómo máximo 180
segundos se determinó en un día dado. Cuando el tiempo
promedio que una rata podía estar en el cilindro giratorio
era inferior a 120 segundos, esto se consideró un fracaso.
Para la prueba del dinamómetro se hizo un promedio de 5
ensayos para cada rata, y cuando la rata no pudo tirar en
promedio de 800 mg, esto se consideró un fracaso. Para
cuantificar la actividad espontánea, las ratas se colocaron
durante 3 horas en una jaula de actividad (Ugo Basile) y se
calculó la actividad promedio por hora, es decir, el número
de veces que la rata cruzó un haz infrarrojo colocado 10 cm
por encima del suelo de la jaula. Como criterio para puntuar
la edad de aparición de la enfermedad de las ratas se usó el
arrastre de un miembro al andar. En estudios previos, el
fracaso del animal para ponerse bien por sí mismo después de
girarse sobre un lado durante un máximo de 30 segundos se
puntuó como "muerte clínica" 9. Sin embargo, los
experimentos iniciales desvelaron que ratas SOD1G93A que no
pueden ponerse bien por sí mismas todavía podrían sobrevivir
durante varios días – esto era particularmente el caso de
ratas con enfermedad de los miembros delanteros. Por tanto,
los inventores puntuaron el momento de la muerte como el día
en el que las ratas habían perdido el 40% de su peso
corporal original a la última edad presintomática, como
indicaron los experimentos en los animales dentro de las 2436 horas a partir de entonces. Los datos generados por los
ensayos clínicos descritos y los datos de supervivencia se
analizaron usando el análisis estadístico de Kaplan Meyer o
usando ANOVA de medidas repetidas (cilindro giratorio,
dinamómetro y actividad).
- 8.
- Histología, inmunohistoquímica y ELISA
Los animales se perfundieron transcárdicamente bajo
anestesia profunda con Nembutal con disolución de NaCl al
0,9% seguido por paraformaldehído tamponado con fosfato al
1%. Se diseccionaron la médula espinal y el cerebro, se
fijaron posteriormente en el mismo fijador durante la noche,
se deshidrataron y se incluyeron en parafina. Las secciones
seriadas se cortaron a 20 µm de espesor para el cerebro y a
7 µm para la médula espinal. Para la inmunohistoquímica, los
anticuerpos primarios se usaron del siguiente modo: SMI-32
dirigido contra ratón y SMI-31 dirigido contra ratón (ambos
1:500, Sternberger Monoclonals); GFAP dirigido contra ratón
(1:400, Sigma); Glut-1 dirigido contra cabra (1:20, Santa
Cruz Biotechnology); ubiquitina dirigida contra conejo
(1/100, Dako) y albúmina dirigida contra conejo (1:250,
ICN/Cappel). Para los recuentos de neuronas motoras en la
médula espinal, las neuronas positivas SMI-32 en el asta
ventral se contaron bilateralmente en 5 secciones igualmente
separadas durante una distancia de 350 µm. Para determinar
el número de neuronas motoras en el núcleo facial, cada 10ª
sección de tronco encefálico se tiñó, y se contaron todas
las neuronas positivas SMI-32 en la región del núcleo
facial. Este número se multiplicó por diez para estimar el
número total de neuronas motoras en el núcleo facial.
- 9.
- Respuesta inmunitaria
Los niveles de VEGF164 en la médula espinal y en el
plasma fueron inferiores al límite de detección de ELISA
(32,5 pg/ml; R&D Systems) en ratones tratados tanto con aLCR
como con VEGF (n=7 para cada grupo). Para detectar si había
anticuerpos dirigidos contra VEGF en circulación presentes
en ratas tratadas con VEGF, las placas de microvaloración de
96 pocillos se recubrieron durante la noche con 100 µl de
una disolución 1 µg/ml de proteína VEGF164. Después de la
incubación con plasma o LCR de ratas tratadas con aLCR y
VEGF, los anticuerpos dirigidos contra VEGF164 unidos se
detectaron usando inmunoglobulinas dirigidas contra rata
marcadas con HRP (DAKO; 200 ng/ml), el kit de tinción de
vectores ABC y lectura fotoespectrométrica.
10. Estadística
Los inventores usaron la versión 10 de SPSS para todos
los cálculos estadísticos. Las estadísticas de la
supervivencia acumulada se calcularon usando estadística de
Kaplan-Meier. Los datos de actividad espontánea, el cilindro
giratorio y de pérdida de peso se analizaron usando ANOVA de
medidas repetidas. Las pruebas de la t de Student se usaron
para calcular diferencias significativas entre los estudios
histológicos.
Referencias
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Claims (9)
- para uso para tratar una enfermedad de las
1. VEGF165 neuronas motoras en el que dicho VEGF165 se administra continuamente durante al menos 4 semanas al sitio de aparición a un intervalo de dosis entre 0,01 µg/kg/día y 0,6 µg/kg/día.
-
- 2.
- VEG165 para uso según la reivindicación 1, en el que dicho intervalo está entre 0,01 µg/kg/día y 0,2 µg/kg/día.
-
- 3.
- VEGF165 para uso según la reivindicación 1, en el que dicho intervalo está entre 0,01 µg/kg/día y 0,1 µg/kg/día.
-
- 4.
- VEGF165 para uso según la reivindicación 1, en el que dicho intervalo está entre 0,01 µg/kg/día y 0,08 µg/kg/día.
-
- 5.
- VEGF165 para uso según la reivindicación 1, en el que dicho intervalo está entre 0,01 µg/kg/día y 0,06 µg/kg/día.
-
- 6.
- VEGF165 para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha administración es intratecal.
-
- 7.
- VEGF165 para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha administración es intracerebroventricular.
-
- 8.
- VEGF165 para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha administración continua de VEGF165 se produce por una minibomba osmótica implantada.
-
- 9.
- VEGF165 para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha enfermedad de las neuronas motoras es esclerosis lateral amiotrófica.
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