ES2351804T3 - Tratamiento de esclerosis lateral amiotrófica. - Google Patents

Abstract

VEGF165 neuronas motoras en el que dicho VEGF165 se administra continuamente durante al menos 4 semanas al sitio de aparición a un intervalo de dosis entre 0,01 µg/kg/día y 0,6 µg/kg/día.

Description

Campo de la invención

La presente invención se refiere a VEGF165 para uso en el tratamiento de enfermedades de las neuronas motoras en las que dicho VEGF165 se administra continuamente durante al menos 4 semanas al sitio de aparición a una dosis en el intervalo entre 0,01 µg/kg/día y 0,6 µg/kg/día. Más particularmente, la invención se refiere al tratamiento de esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Se encuentra que la administración intracerebroventricular de bajas cantidades de factor de crecimiento endotelial vascular a un modelo animal de ELA preclínico induce una actividad motora significativa y prolonga el tiempo de supervivencia de dichos animales. Introducción a la invención

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es un trastorno paralizante devastador que mata a los pacientes en el plazo de 3 a 5 años después de la aparición 1-4 . Los síntomas clínicos resultan principalmente de la degeneración progresiva de neuronas motoras en la médula espinal y el tronco encefálico, prescindiendo en buena parte de la actividad cognitiva. La enfermedad afecta a individuos sanos en medio de su vida, esporádicamente en >90% de los casos sin ninguna historia familiar. Aunque se ven afectados más hombres que mujeres antes de la edad de 60 años, ambos sexos están similarmente afectados a edad mayor 5. Con la población en envejecimiento, cada vez más individuos sufren ELA -el tercer trastorno neurodegenerativo más común 6. Muchos pacientes con ELA notan primero debilidad muscular en sus miembros (ELA de "aparición en los miembros"). En -25% de pacientes con ELA, las neuronas motoras se degeneran primero en los núcleos motores del tronco encefálico (ELA de "aparición bulbar"), causando disartria, disfagia y problemas respiratorios. Los pacientes con ELA de aparición bulbar generalmente presentan una progresión de la

enfermedad más rápida y más agresiva que los pacientes con aparición en los miembros, pero estos últimos eventualmente también desarrollan síntomas bulbares. La causa exacta de la degeneración de neuronas motoras en la mayoría de los casos permanece en buena parte enigmática 2,4,7. Las mutaciones SOD-1 producen degeneración de neuronas motoras en seres humanos y, cuando se sobreexpresan, también en ratones transgénicos. En realidad, los ratones SOD-1G93A se han convertido en el modelo animal de referencia para evaluar el potencial terapéutico de novedosos candidatos a fármacos 8. Las ratas SOD-1G93A desarrollan una forma agresiva de ELA, pero todavía no se han usado para la evaluación de tratamientos novedosos 9,10. Una cura eficaz no autorizada está disponible ahora para ELA. Riluzol es el único fármaco autorizado en algunos países, pero no en todos, pero tiene un mínimo beneficio en la supervivencia, es costoso, no está exento de efectos secundarios y, lo que es más importante, es ineficaz en síntomas bulbares 16. Como la ELA resulta de la degeneración de neuronas motoras, desde hace mucho tiempo se han considerado factores de crecimiento neurotróficos tales como factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF)-1, factor inhibidor de leucemia (LIF), cardiotrofina (CT)-1 y factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) como candidatos terapéuticos para ELA. Se ha mostrado que la transferencia de genes de GDNF, pero especialmente de IGF-1 usando un vector viral retrógradamente transportado por axones, prolonga la

17,18

supervivencia de ratones SOD-1G93A . Aunque están en proceso ensayos clínicos, queda por establecer la aplicabilidad clínica de la terapia génica para ELA y cuestiones sobre su naturaleza irreversible, riesgo de efectos cromosómicos adversos, escaso control de la expresión transgénica y todavía quedan por vencer grandes necesidades de producción. Por tanto, en su lugar, la administración de factores de crecimiento neurotróficos recombinantes es una estrategia terapéutica atractiva ya que

ofrece un control flexible de la dosis y la duración de la proteína administrada. Sin embargo, la infusión intratecal de BDNF 19, la administración intracerebroventricular de GDNF o la administración sistémica de BDNF o CNTF 20 no ha dado resultado hasta la fecha en la mejora clínica sustancial en pacientes con ELA, excepto una reducción del 26% de progresión de la enfermedad después de la administración de IGF-1 en un estudio, pero no en el otro 21,22. Al menos parte del fracaso puede atribuirse a la corta semivida, inmunogenicidad, efecto dual dependiente de la dosis sobre la supervivencia neuronal frente a apoptosis, toxicidad no deseada y capacidad limitada para cruzar la barrera hematoencefálica después de la administración sistémica de estas proteínas 23-25. Otro motivo posible puede referirse al hecho de que varios de estos factores, incluso a la vez que promueven la supervivencia de neuronas motoras agudamente dañadas cuando se suministran exógenamente, pueden no desempeñar una función crítica tal en el control endógeno de la supervivencia de neuronas motoras en adultos en una enfermedad crónica tal como ELA. Los inventores descubrieron recientemente que bajos niveles de VEGF son superfluos para el desarrollo de neuronas motoras que producen degeneración de neuronas motoras similar a ELA de aparición en adultos en ratones genéticamente modificados (documento WO0176620) y también aumentan el riesgo de ELA esporádica y familiar en seres humanos 13-15. El VEGF es un factor angiogénico prototipo que participa en el crecimiento de vasos en individuos sanos y con enfermedad 11,12. Para evitar problemas inmunitarios y efectos secundarios sistémicos, para vencer la capacidad limitada de VEGF para cruzar la barrera hematoencefálica y para lograr los máximos niveles de proteína VEGF en el parénquima de la médula espinal, los inventores desarrollaron una estrategia nunca previamente usada para examinar el potencial terapéutico de una proteína recombinante en estudios de ELA preclínicos, es decir, para administrar, intracerebroventricularmente, VEGF recombinante durante periodos prolongados usando un modelo

de rata SOD-1G93A transgénica de ELA. Sorprendentemente, los inventores han encontrado que niveles extremadamente bajos de VEGF165 no sólo mejoran significativamente la actividad motora, sino que también prolongan el tiempo de supervivencia en un modelo de ELA preclínico de rata con un tiempo inesperadamente largo. Los resultados muestran que bajos niveles de VEGF165 pueden ralentizar la progresión de la enfermedad de pacientes que padecen ELA cuando se administra intracerebroventricularmente. Descripción detallada de la invención

La presente invención muestra que la administración intracerebroventricular (ICV) de bajas cantidades de VEGF retrasa la aparición, mejora la actividad motora y prolonga la supervivencia de una estirpe de rata que padece una forma agresiva de ELA. Este es el primer estudio que muestra un efecto terapéutico significativo de un factor de crecimiento recombinante sobre las características de enfermedad en un modelo de ELA preclínico. Se han evaluado varios factores de crecimiento recombinantes con actividad neurotrófica conocida que incluyen BDNF, IGF-1, CNTF, LIF y GDNF en pacientes con ELA o ratones SOD1G93A, pero ningún factor de crecimiento recombinante individual proporcionó consistentemente un beneficio sustancial 19-22,35, por tanto,

19-22

desde el fracaso de los ensayos clínicos previos la administración de factores de crecimiento recombinantes ha perdido mucho de su atractivo. Como muestran aquí los inventores, el VEGF165 tiene efectos directos sobre las neuronas motoras in vivo. Aunque se sabe que el VEGF afecta diversos procedimientos neuronales in vivo 15, nunca se ha establecido si el VEGF ejerció sus efectos directamente sobre las neuronas o indirectamente por otros tipos de células o mediante otros productos intermedios moleculares. Por tanto, el VEGF165 tiene un espectro pleótropo de actividades que puede haber contribuido a su notable beneficio terapéutico en esta invención.

La presente invención proporciona la isoforma de VEGF165 para uso para el tratamiento de trastornos de neuronas

motoras y más específicamente para el tratamiento de esclerosis lateral amiotrófica y enfermedades similares a la esclerosis lateral amiotrófica, en el que dicho VEGF se administra continuamente próximo al sitio de aparición durante al menos 4 semanas a una dosis en el intervalo entre 0,01 µg/kg/día y 0,6 µg/kg/día. El VEGF165 es una proteína de 165 aminoácidos que se denomina normalmente VEGF humano (hVEGF). El VEGF se expresa en una variedad de tejidos como múltiples formas homo-diméricas (121, 145, 165, 189 y 206 aminoácidos por monómero) resultantes de corte y empalme de ARN alternativo. El VEGF121 es un mitógeno soluble que no se une a heparina; las formas más largas de VEGF se unen a la heparina con afinidad progresivamente mayor. Las formas de unión a heparina de VEGF pueden ser escindidas en el extremo carboxi por plasmina para liberar una forma(s) difusible(s) de VEGF. Además, recientemente también se han identificado varias moléculas estructuralmente relacionadas con VEGF que incluyen factor de crecimiento placentario (PIGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y VEGF-E. Ferrara y Davis-Smyth (1997) Endocr. Rev., Ogawa y col. (1998) J. Biological Chem. 273:31273-31281; Meyer y col. (1999) EMBO J., 18:363-374. En un caso, la presente divulgación se refiere a los términos 'composición farmacéutica' o 'medicamento' o 'uso para la preparación de un medicamento para tratar' se refiere a una composición que comprende VEGF165 como se describe anteriormente y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable (ambos términos pueden usarse indistintamente) para tratar enfermedades de neuronas motoras como se indica anteriormente. Los vehículos o excipientes adecuados conocidos para el experto son solución salina, disolución de Ringer, disolución de dextrosa, disolución de Hank, aceites no volátiles, oleato de etilo, dextrosa al 5% en solución salina, sustancias que potencian la isotonicidad y la estabilidad química, tampones y conservantes. Otros vehículos adecuados incluyen cualquier vehículo que por sí mismo no induce la producción de anticuerpos nocivos para el individuo que recibe la composición tales como proteínas,

polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos y copolímeros de aminoácidos. En una realización particular, el 'medicamento' puede administrarse mediante un procedimiento próximo al sitio de aparición. De hecho, el gradiente espacial de los niveles de VEGF165 y el beneficio terapéutico indica que, a pesar del significativo movimiento de LCR, el VEGF165 se deposita en estrecha proximidad a su sitio de inyección. Esto puede ofrecer novedosas oportunidades para adaptar la terapia con VEGF a las necesidades de los pacientes. De hecho, los individuos que padecen ELA con aparición bulbar pueden beneficiarse más de la administración ICV o intratecal de VEGF a nivel cervical, mientras que los pacientes con ELA con aparición lumbar pueden beneficiarse más de una infusión intratecal de VEGF a nivel lumbar. En un caso particular, el VEGF165 se administra a una dosis entre 0,01 µg/kg/día y 1,5 µg/kg/día, más preferentemente entre 0,05 µg/kg/día y 1 µg/kg/día, lo más preferentemente entre 0,2 µg/kg/día y 0,8 µg/kg/día. Preferentemente se usa una infusión continua e incluye la administración subcutánea continua mediante una minibomba osmótica. En otro caso, el VEGF165 se administra continuamente próximo al sitio de aparición a una dosis dentro de un intervalo entre 0,05 µg/kg/día y 1 µg/kg/día.

En otro caso, el VEGF165 se administra continuamente próximo al sitio de aparición a una dosis dentro de un intervalo entre 0,2 µg/kg/día y 0,8 µg/kg/día. En una realización, dicha administración próxima a la aparición es una administración intratecal. En otra realización, dicha administración próxima a la aparición es una administración intracerebroventricular. También debe ser evidente que en un caso, la administración de VEGF165 se administra continuamente próxima al sitio de aparición a una dosis dentro de un intervalo entre 0,01 µg/kg/día -1,4 µg/kg/día

o 0,01 µg/kg/día -1,3 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -1,2 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -1,1 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día

– 1 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,9 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,8 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,7 µg/kg/día o

0,01 µg/kg/día -0,6 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,5 µg/kg/día o 0,01 -0,4 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,3 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,2 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,1 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,09 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,08 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,07 µg/kg/día

o 0,01 µg/kg/día -0,06 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,05 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,04 µg/kg/día o 0,01 µg/kg/día -0,03 µg/kg/día. En otro caso, la administración de VEGF165 se administra continuamente próxima al sitio de aparición a una dosis dentro de un intervalo entre 0,02 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,03 µg/kg/día -µg/kg/día o 0,04 µg/kg/día /kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,05 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,06 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,07 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,08 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,09 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,1 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,2 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,3 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,4 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,5 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,6 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,7 µg/kg/día µg/kg/día o 0,8 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 0,9 µg/kg/día 1,5 µg/kg/día o 1 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 1,1 µg/kg/día, 1,5 µg/kg/día o 1,2 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día o 1,3 µg/kg/día -1,5 µg/kg/día.

Por tanto, en una realización particular, la infusión con una composición que comprende VEGF165 es intratecal. La administración intratecal puede realizarse, por ejemplo, por medio del implante quirúrgico de una bomba y llevando un catéter a la columna vertebral.

Para aclarar la invención, el término 'enfermedad de las neuronas motoras' se explica a continuación. La enfermedad de las neuronas motoras es un grupo de enfermedades que implica la degeneración de las células del asta anterior, los nervios en el sistema nervioso central que controlan la actividad muscular. Esto conduce a un debilitamiento gradual y eventualmente al deterioro progresivo de la musculatura (atrofia). Las enfermedades de las neuronas motoras se clasifican según la participación de neuronas motoras superiores (UMN) y/o neuronas motoras

inferiores (LMN). Las neuronas motoras superiores se originan en el cerebro, en particular, la corteza motora, y forman sinapsis bien directamente o indirectamente sobre las neuronas motoras inferiores. Las neuronas motoras superiores se denominan con más exactitud en lo sucesivo pre-neuronas motoras y son las responsables de transportar órdenes descendentes para el movimiento. Las neuronas motoras inferiores pueden idearse en dos categorías: neuronas motoras viscerales y somáticas. Las neuronas motoras viscerales son neuronas pre-gangliónicas autonómicas que regulan la actividad de las neuronas gangliónicas que inervan glándulas, vasos sanguíneos y músculo liso. Las neuronas motoras somáticas inervan músculo esquelético e incluyen primero células del asta anterior que, como implica el nombre, se localizan en el asta anterior de la médula espinal, y segundo, neuronas motoras inferiores localizadas en los núcleos de nervios craneales. La esclerosis lateral amiotrófica o ELA es la forma más frecuente (representa aproximadamente el 80% de todos los casos) de trastornos de las neuronas motoras. La ELA se conoce como enfermedad de Lou Gehrig, que lleva el nombre del famoso jugador de beisbol yanqui. Los síntomas iniciales de la ELA son debilidad en las manos y las piernas y frecuentemente fasciculación de los músculos afectados. Sea cuales sean los primeros miembros afectados, los cuatro miembros se afectan eventualmente. La lesión a las neuronas motoras superiores produce debilidad muscular, espasticidad y reflejos tendinosos profundos hiperactivos. La lesión de las neuronas motoras inferiores produce debilidad muscular con atrofia, fasciculaciones, flacidez y reflejos tendinosos profundos disminuidos. La ELA tiene características de las neuronas motoras tanto superiores como inferiores de los nervios craneales, por tanto, los síntomas se aíslan a la cabeza y el cuello. Algunos pacientes también mostrarán implicación de UMN de los nervios craneales y, si esta es la única manifestación, se denomina en lo sucesivo parálisis seudobulbar. La atrofia muscular espinal o la atrofia

muscular progresiva es una enfermedad de la neurona motora que no implica los nervios craneales y es debida a una menor degeneración de neuronas motoras. El síndrome de Shy-Drager se caracteriza por hipotensión postural, incontinencia, sudoración, rigidez y temblor muscular, y por la pérdida de neuronas de los núcleos torácicos en la médula espinal a partir de la cuales se originan las fibras simpáticas. Las lesiones destructivas de la médula espinal dan como resultado la pérdida de células del asta anterior. Esto se observa en mielomeningocele y en siringomielia, en los que se forma un gran quiste lleno de fluido en el centro de la médula espinal cervical.

El efecto beneficioso con VEGF165 se refiere al hecho que en la presente invención este factor de crecimiento recombinante se administró continuamente y directamente al líquido cefalorraquídeo (LCR) -la disponibilidad de los grandes modelos de rata SOD1G93A de ELA era por tanto instrumental. Los datos de biodistribución muestran que el VEGF165 después de la administración ICV difunde rápidamente desde el LCR al parénquima de la médula espinal y, por tanto, puede alcanzar las neuronas motoras espinales inferiores por lo que los inventores no pueden excluir que algo del beneficio pueda haber procedido de un efecto sobre las neuronas motoras superiores. La estrecha correlación entre la biodistribución de VEGF165 (mayor en el tronco encefálico que en la médula espinal lumbar) y su efecto terapéutico muestra que el VEGF indujo su mayor efecto en sitios en los que sus niveles eran los mayores. Como el VEGF165 se elimina del sistema nervioso central pasadas las 3 horas (similar a otras neurotrofinas 38), la administración continua de VEGF165 contribuyó probablemente al efecto beneficioso. Otros motivos pueden referirse al perfil de seguridad general de VEGF165 administrado ICV (los inventores no pudieron observar ningún efecto adverso prominente cuando se usó una dosis terapéutica que era 10 veces inferior al umbral de toxicidad) y la falta de una respuesta inmunitaria (que podría haberse producido de otra forma neutralizando

anticuerpos). Se produjo una reacción inmunitaria tras la administración sistémica de VEGF165 y, probablemente, la insignificante penetración de VEGF a través de la barrera hematoencefálica sólo se vencería administrando sistémicamente cantidades masivas -probablemente tóxicas de VEGF165.

La administración ICV puede parecer incómoda a primera vista, pero es técnicamente viable y ya está en funcionamiento para otras indicaciones neurológicas crónicas

43. En realidad, la incomodidad de una sencilla intervención quirúrgica para colocar la bomba supera enormemente a los beneficios de esta vía de administración (ausencia de efectos secundarios sistémicos y respuesta inmunitaria; administración controlable). Los datos genéticos previos de los inventores indican que el VEGF afecta a la ELA tanto esporádica como familiar 14. Mientras que los inventores sólo pudieron usar en la presente invención un modelo animal de ELA familiar, hay muchas posibilidades de que el VEGF también sea eficaz en casos esporádicos de ELA. Después de todo, el VEGF tiene efectos de supervivencia para diversos tipos de neuronas, independientemente del tipo de estrés (hipoxia, excitotoxicidad, deprivación de suero, toxicidad relacionada con SOD1 mutantes, etc.) y, por tanto, es un candidato atractivo 15. Parece que la terapia con VEGF va a ser segura y bien tolerada durante periodos de tiempo prolongados sin causar efectos secundarios vasculares. Los hallazgos de los inventores se extienden a las observaciones previas de que el VEGF es conocido por tener actividades biológicas cualitativamente distintas (permeabilidad vascular, angiogénesis) a diferentes concentraciones 57 . Además, bajos niveles de VEGF sólo estimulan la angiogénesis en cerebro isquémico/lesionado cuando se administran directamente al parénquima del cerebro, pero no al LCR 48,58. Ejemplos de la presente divulgación que incluye la invención.

1. Administración sistémica frente a intracerebroventricular de VEGF recombinante

Los inventores evaluaron primero por qué vía, es decir, sistémica o intracerebroventricular, se administraría mejor el VEGF. La terapia de ELA segura y eficaz con factor de crecimiento requiere que la administración de la proteína no eleve una respuesta inmunitaria o induzca efectos adversos sistémicos, pero dé como resultado niveles suficientemente altos, es decir, terapéuticos, en el parénquima de la médula espinal. Estudios iniciales indicaron que todas las preparaciones de VEGF humano, de rata o murino recombinantes comercialmente disponibles, cuando se administran intraperitonealmente a ratones a 1 µg cada dos días (una dosis terapéutica para estimular la angiogénesis 37), produjeron una fuerte respuesta inmunitaria en el plazo de 2 semanas. Los mejores resultados se obtuvieron cuando se usó VEGF de murino producido en E. coli en casa, pero incluso esta preparación produjo una respuesta inmunitaria en el plazo de 4 semanas, excluyéndose así la administración sistémica crónica de VEGF. Además, el VEGF es hidrófilo y tiene un peso molecular de 44 kDa y es, por tanto, poco probable que cruce la barrera hematoencefálica o sangre- líquido cefalorraquídeo (LCR) con una eficiencia superior al 1% de la dosis inyectada 38. Por tanto, para obtener niveles de VEGF suficientes en el parénquima de la médula espinal tendrían que administrarse cantidades excesivas de VEGF, induciendo probablemente efectos secundarios sistémicos tóxicos. Además, el VEGF es atrapado no sólo por la matriz extracelular rica en sulfato de heparán en tejidos, sino también en el plasma, por Flt1 soluble (sFlt1), es decir, el dominio de unión al ligando extracelular del receptor 1 de VEGF (también llamado Flt1) 39, 40. Sin embargo, los inventores detectaron niveles de Flt1 soluble 5 veces mayores en el suero que en el líquido cefalorraquídeo en ratones (3.800 ± 594 pg/ml frente a 810 ± 66 pg/ml; N=3; P<0,05). Por tanto, quedaría atrapada una mayor fracción de VEGF por sFlt1 y la matriz rica en sulfato de heparano cuando se administra sistémicamente en vez de intracerebroventricularmente. Finalmente, aunque los niveles

de VEGF son indetectables en el LCR 41, el plexo coroideo es uno de los pocos sitios en el cuerpo en los que el VEGF permanece constitutivamente expresado en el adulto 42 . Debido a todos estos motivos, los inventores evaluaron si la administración intracerebroventricular (ICV) de VEGF ofrecería una solución alternativa y se optimizaron las técnicas necesarias para una administración ICV a largo plazo de factores de crecimiento. Como los inventores determinaron previamente que la isoforma de VEGF164 (el equivalente humano es VEGF165) presenta las propiedades biológicas óptimas para estimular la supervivencia de las neuronas motoras 13 (documento WO0176620), los inventores usaron esta isoforma en el resto de su estudio. Como se usaron ratas para todos los experimentos de administración (véase más adelante), los inventores clonaron y expresaron una preparación de proteína VEGF164 de rata, que tenía >99% de pureza y estaba libre de endotoxinas.

2. Biodistribución de VEGF después de administración intracerebroventricular

No se sabe nada sobre la farmacocinética de VEGF en el sistema nervioso central después de la administración ICV

38. Incluso se desconoce si el VEGF administrado al LCR podría difundir en el parénquima de la médula espinal a través de la barrera ependimaria. Por tanto, los inventores determinaron primero el patrón de distribución de 125I-VEGF después de la administración ICV a ratas sanas. Una hora después de una inyección ICV en bolo, sólo el 12% de la cantidad inyectada de 125I-VEGF estaba todavía presente en el LCR, mientras que el 70% y el 12% se recuperaron en el parénquima del cerebro y la médula espinal, respectivamente, que indica que el 125I-VEGF difundió fácilmente del LCR al parénquima. Por tanto, similar a como para NGF, pero a diferencia de BDNF, la capa ependimaria no representa una barrera para que el VEGF difunda al parénquima 38. Cuando se expresaron los niveles de 125I-VEGF por gramo de tejido, los niveles de 125I-VEGF fueron los mayores en la proximidad del sitio de inyección y disminuyeron progresivamente en un

gradiente rostro-caudal a lo largo de la médula espinal: los niveles de 125I-VEGF en la médula espinal bulbar/cervical, torácica y lumbar fueron el 80%, 50% y 16%, respectivamente, de aquellos en el cerebro. 3 horas después de la inyección, sólo el 30% del 125I-VEGF inyectado estaba presente en el cerebro y la médula espinal, mientras que cantidades insignificativas fueron detectables después de 24 horas cuando el 125I-VEGF se recuperó en las excreciones, sugiriendo que el VEGF se eliminó en los sistemas venoso y linfático, como se documentó para otros factores de crecimiento 38. De estos experimentos pueden sacarse dos conclusiones. Primera, el VEGF administrado ICV difunde rápidamente del LCR a las neuronas en el parénquima, pero luego se elimina en el plazo de 24 horas del LCR. Como las neuronas motoras en ELA requieren crónicamente señales de supervivencia, el VEGF debe administrarse continuamente. Segundo, después de la administración ICV, el VEGF se distribuye en un gradiente rostro-caudal – éste puede tener consecuencias en la afectación de la supervivencia de las neuronas motoras en un patrón espacial similar.

3. Administración intracerebroventricular a largo plazo de VEGF recombinante

Aunque se ha conseguido la administración ICV prolongada de GDNF durante 8 meses en seres humanos para otros trastornos neurodegenerativos 43, esta vía no se ha usado para evaluar el potencial terapéutico de factores de crecimiento recombinantes en modelos de ELA preclínicos. Para lograr la administración continua y constante a largo plazo de VEGF recombinante, los inventores implantaron minibombas osmóticas subcutáneamente en los lomos de los animales y las conectaron a un catéter que los inventores colocaron estereotácticamente en el ventrículo lateral del cerebro. Aunque es técnicamente viable cateterizar el ventrículo lateral en ratones, los catéteres dejaron de quedarse fijados al cerebro y se desprendieron después de varias semanas ya que los ratones intentaron quitárselos rascándose su cabeza. Además, el gran tamaño de la bomba con

respecto al tamaño del cuerpo (casi el 30% del tamaño de su cuerpo) excluyó mediciones fidedignas de la actividad motora. Por tanto, los inventores eligieron implantar bombas que administraban los compuestos durante 4 semanas en un modelo de ELA de rata SOD1G93A para evaluar el potencial terapéutico de la administración ICV de proteína VEGF recombinante. Sustituyendo las bombas cada 4 semanas, los inventores tuvieron éxito en la reproducibilidad de la administración de proteína VEGF durante más de 100 días sin ningún efecto adverso (véase más adelante). La correcta posición y la permeabilidad de los catéteres se comprobaron en cada rata en el momento de la disección. Y, lo que es más importante, el VEGF todavía era biológicamente activo en la unión a sus receptores, el receptor 1 de VEGF (también llamado Flt1) y el receptor 2 de VEGF (Flk1), después de incorporarse en la minibomba osmótica en los animales durante varias semanas. De hecho, de las bombas se recuperó después de tres semanas el 89% y el 68% del VEGF residual en la bomba todavía unido a Flt1 y Flk1, respectivamente, que indica que la mayoría del rVEGF164 almacenado en las bombas todavía estaba activo. Como el VEGF nunca había sido administrado al sistema nervioso central crónicamente (la duración más larga fue una semana) y los efectos de la administración aguda frente a la crónica de VEGF pueden ser diferentes, los inventores evaluaron cuidadosamente si una dosis particular de VEGF estimularía la supervivencia de las neuronas motoras sin causar un crecimiento o escape excesivo de vasos sanguíneos, ni siquiera después de administración prolongada durante varios meses. Los experimentos iniciales desvelaron que todas las ratas que recibieron intracerebroventricularmente una alta dosis de VEGF (por ejemplo, 20 µg/kg/día) murieron después de algunos días. A 2 µg/kg/día, el 66% de las ratas enfermaron después de 3 a 4 semanas. Mientras que no estuvieran paralizados (los animales todavía podían andar normalmente cuando se empujaban), estuvieron generalmente apáticos. La inspección macroscópica y el análisis histológico del cerebro y la

médula espinal desvelaron un crecimiento de vasos adicional, dilatación ventricular y enrojecimiento y edema del cerebro y la médula espinal. Un intervalo de dosis entre 0,2 µg/kg/día y 0,6 µg/kg/día fue bien tolerado por las ratas sin inducir edema, ausencia o exceso de crecimiento de vasos

– incluso cuando se administró crónicamente durante más de 100 días. A esta dosis, los niveles de VEGF en el LCR permanecieron indetectables. Las ratas SOD1G93A/LSd (ratas SOD1G93A con baja expresión de SOD1G93A en Sprague-Dawley; véase el Ejemplo 4) se trataron con 0,6 µg de VEGF/kg/día. A esta dosis, los niveles de VEGF en el LCR permanecieron indetectables, supuestamente porque el VEGF infundido difundió rápidamente al parénquima espinal. Esto es importante ya que sólo niveles de VEGF detectables se han asociado a patología 41. Por tanto, los inventores usaron una dosis de 0,6 µg de VEGF/kg/día para tratar ratas SOD1G93A. Esta dosis es, incluso después de la corrección para el volumen de distribución relativo del cuerpo entero frente al cerebro/médula espinal, todavía 5 veces inferior a una dosis usada para la angiogénesis terapéutica 37. El líquido cefalorraquídeo artificial (aLCR), infundido como control, también fue bien tolerado durante periodos prolongados, lo que indica que los procedimientos quirúrgicos eran seguros. Otra ventaja de esta baja dosis de VEGF era que no indujo una respuesta inmunitaria. De hecho, no fueron detectables anticuerpos dirigidos contra VEGF en la sangre periférica o LCR de ratas ni siquiera después de 100 días de administración de un intervalo de dosis de 0,2 µg/kg/día a 0,6 µg/kg/día de VEGF.

4. Efecto de VEGF en un modelo de rata de ELA

Las ratas SOD1G93A no se habían usado previamente para evaluar novedosos paradigmas de tratamiento de ELA. Los inventores usaron ratas SOD1G93A/LSd, generadas por Nagai y col. 10 ("L" se refiere a los bajos niveles, por ejemplo aumentados el doble, de SOD1G93A en este modelo) en Sprague- Dawley (Sd). La progresión de la enfermedad es muy agresiva en este modelo, matando los animales en el plazo de 10 días

después de la aparición de la enfermedad 10 . Las ratas SOD1G93A/LSd presentaron una gran variabilidad entre camadas en la aparición de la enfermedad que oscila de 95 a 145 días. Para reducir esta variabilidad, los inventores usaron crías de la misma camada SOD1G93A/LSd y analizaron el resultado de un modo emparejado (N=17 ratas analizadas en 6 pares de camadas; véanse los procedimientos para los detalles). En comparación con el LCR artificial (aLCR) de control, el tratamiento de ratas SOD1G93A/LSd con 0,6 µg de VEGF/kg/día a 60 días de edad retrasó significativamente la aparición de la enfermedad y mejoró la actividad motora y el resultado clínico global independientemente del procedimiento de puntuación. Por ejemplo, las ratas SOD1G93A/LSd tratadas con VEGF permanecieron generalmente activas, móviles, atentas y se cepilló su pelo en un momento en el que los animales de aLCR ya mostraban signos de parálisis, y progresivamente iban volviéndose inmóviles y caquécticos. Los animales control tenían más atrofia muscular grave que las ratas tratadas con VEGF. La administración ICV de VEGF retrasó 10 días la aparición de parálisis de los miembros, puntuada como arrastre de un miembro trasero o fallo al usar un miembro delantero al caminar o al ponerse bien (P<0,05). Usando un sistema de detección mediante rayo láser 10 los inventores identificaron la edad a la que las ratas ya no podían cruzar haces láser igualmente separados en una "jaula de actividad" al menos 1.000 veces por hora -una medida de su comportamiento de caminar espontáneo. Después de la administración de VEGF, las ratas permanecieron espontáneamente activas a una edad mayor (135 ± 5 días, aLCR frente a 146 ± 8 días, VEGF; P<0,05). Los inventores también grabaron en vídeo a las ratas y determinaron el tiempo que dedican las ratas a explorar su jaula y contaron la frecuencia con la que las ratas se ponían sobre sus miembros traseros como medida adicional de su actividad espontánea. Antes de la aparición de la enfermedad, es decir, a los 110 días de edad, ambos grupos exploraron su jaula tan activa, y se pusieron sobre sus patas, como frecuentemente (P=NS).

Cuatro días después, las ratas aLCR mostraron los primeros signos de parálisis de los miembros, las ratas tratadas con VEGF exploraron sus jaulas durante más tiempo y se pusieron sobre sus patas más frecuentemente que los animales tratados con aLCR (P<0,05). Finalmente, el VEGF prolongó la supervivencia de estas ratas con ELA 10 días (P<0,01). Por tanto, a pesar de la muy rápida progresión de la enfermedad y la gran variabilidad entre camadas de la aparición de la enfermedad en este modelo, el tratamiento con VEGF retrasó la aparición, mejoró la actividad motora y prolongó la supervivencia de ratas SOD1G93A/LSd sin causar efectos adversos.

5. Mecanismo molecular del efecto neuroprotector de VEGF

Los inventores exploraron adicionalmente los mecanismos por los que el VEGF prolongó la supervivencia de neuronas motoras in vivo. Estudios in vitro indicaron que el VEGF protege las neuronas motoras de muerte celular inducida por estrés uniendo el receptor 2 VEGF (también llamado FIk1)13, pero nunca se ha demostrado una actividad neurotrófica directa de VEGF in vivo. Para tratar el asunto anterior, los inventores generaron ratones transgénicos usando el casete de expresión Thy1.2 para impulsar la expresión de Flk1 de murino en neuronas posnatales 45. En comparación con compañeros de camada no transgénicos, los ratones Thy-Flk1 expresaron más transcripciones de ARNm de Flk1 (copias Flk1/103 copias de HPRT: 470 ± 45 frente a 50 ± 5; N=3; P<0,05) y proteína. La expresión de Flk1 en compañeros de camada no transgénicos fue detectable en vasos sanguíneos y, a un nivel inferior, en neuronas motoras grandes. A diferencia, en ratones Thy-Flk1, altos niveles de Flk1 estaban presentes en neuronas motoras grandes en el asta ventral, además de su expresión inicial en células endoteliales. Los ratones Thy-Flk1 parecían sanos y fértiles y se entrecruzaron con ratones SOD1G93A . Notablemente, la sobreexpresión neuronal de Flk1 en ratones SOD1G93A retasó la aparición de la deficiencia motora 23 días (N=8; P<0,001) y los ratones Thy1-Flk1:SOD1G93A respondieron mejor que los

ratones SOD1G93A durante 26 días (N=8; P<0,01). Además, los ratones Thy1-Flk1:SOD1G93A sobrevivieron 10 días más que sus compañeros de camada SOD1G93A (N=8, P<0,05). Por tanto, estos hallazgos genéticos indican que Flk1 en neuronas motoras transmite señales de supervivencia clave de VEGF endógeno, retrasando así la degeneración prematura de las neuronas motoras en ELA. Otra evidencia de un efecto neuroprotector de Flk1 se proporcionó generando ratones transgénicos usando el mismo casete de expresión Thy1.2 para impulsar la expresión neuronal de un Flk1 dominante negativo que confiere señalización de VEGF (Flk1DN). Los ratones ThyFlk1DN también expresaron niveles elevados del transgén Flk1DN en neuronas motoras. A los 3 meses de edad, los ratones Thy-Flk1DN estaban sanos y eran fértiles y tenían fuerza muscular, actividad motora y números de neuronas motoras normales (neuronas motoras SMI32+/asta ventral: 31 ± 4,4, ratones naturales frente a 29 ± 1,2, ratones ThyFlk1DN; N=4; P=NS). Para estresar las neuronas motoras, los ratones se alojaron cada dos días durante 30 días en una cámara con 10% de O2. La hipoxia intermitente crónica reguló por incremento los niveles de VEGF en la médula espinal (pg de VEGF/µg de proteína: 12 ± 0,5, normoxia frente a 22 ± 1,4, hipoxia; N=5; P<0,05). Los ratones naturales toleraron la hipoxia sin ningún problema y su fuerza de prensión incluso aumentó ligeramente. A diferencia, los ratones ThyFlk1DN perdieron el 25% de su fuerza de prensión en el plazo de una semana después de exponerse a hipoxia y quedaron más débiles durante el resto del experimento. El análisis histológico desveló una gliosis marcada en la materia gris de ratones Thy-Flk1DN, pero no en ratones naturales (área de GFAP+/área de materia gris en el asta ventral: 0,13 ± 0,45%, natural frente a 2,7 ± 0,45%, Thy-Flk1DN; N=3-5; P<0,05). Además, las neuronas motoras en Thy-Flk1DN , pero no en ratones naturales, acumularon neurofilamento fosforilado (neuronas SMI31+/10 secciones del asta ventral: ninguno en los naturales frente a 15,3 ± 7,2 en Thy-Flk1DN; N=3-5; P<0,05). Por tanto, estos hallazgos ilustran que Flk1 tiene

una función protectora crítica en el mantenimiento de neuronas motoras adultas en condiciones de estrés hipóxico. Materiales y procedimientos

1.

Producción de VEGF164 de rata recombinante (VEGF164)

Se clonó ADNc de VEGF164 amplificado a partir de una biblioteca de ADNc de rata en el vector de secreción pPICZαA y se expresó usando el sistema de expresión en levadura Pichia pastoris según las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de la diálisis durante la noche del medio acondicionado con levadura contra ácido acético 10 mM (pH 5,5), el VEGF se purificó mediante cromatografía secuencial en columnas de Phenyl Sepharose 6 Phast Flow y de heparina-agarosa (ambas de Amersham Pharmacia Biotech). La concentración de VEGF se determinó usando el ELISA Duoset de rata (R&D Systems, Abingdon, RU). Entonces, el VEGF164 purificado se sometió a electroforesis y se visualizaron bandas individuales teñidas de 45 kDa o 22 kDa bajo condiciones no reductoras y reductoras, respectivamente, mediante tinción con azul de Coommassie y con plata de los geles. Se confirmó que la banda era VEGF164 de rata recombinante mediante inmunotransferencia con un anticuerpo monoclonal específico para rVEGF164 (R&D Systems) y la secuenciación del extremo N después del protocolo de degradación de Edman. Después de la digestión con tripsina de la banda de 45 kDa importante, que fue seguida por la separación de los péptidos escindidos sobre dHPLC, se seleccionaron 3 péptidos internos y se secuenciaron en el extremo N según el protocolo de degradación de Edman. Los tres péptidos eran un apareamiento perfecto a la secuencia de aminoácidos de VEGF164 publicada.

2.

Caracterización funcional de VEGF164

La unión de la preparación de VEGF164 de los inventores a receptores rhFc-FLT1 y rhFc-FLK1 inmovilizados (R&D Systems) se comparó con la de VEGF164 de rata comercialmente disponible. El VEGF164 unido se detectó usando anticuerpos dirigidos contra VEGF de rata biotinilados (R&D Systems; 200 ng/ml), el kit de tinción de vectores ABC y lectura

fotoespectrométrica. El VEGF164 preparado en casa presentó una mayor afinidad hacia rhFc-FLK1 y una afinidad de unión similar hacia rhFc-FLT1. Los niveles de endotoxinas se determinaron usando el kit de lisado de amebocito de Limulus (LAL) (Bio-Whittaker, Walkersville, EE.UU.) y desveló la presencia de 1 unidad de endotoxina por 350 µg de VEGF164 (o 3 E10-3 unidades de endotoxina por µg de VEGF164).

3.

Experimentos radiomarcados

El 125I-VEGF humano radiomarcado se compró de Amersham Pharmacia con una actividad específica de 25 µCi/µg de VEGF165. 100 ng de esta preparación se disolvieron en 10 µl y se inyectaron estereotácticamente en el ventrículo lateral izquierdo de ratas Wistar hembra sanas usando un aguja Hamilton de 0,2 mm de diámetro – las coordenadas estereotácticas fueron las mismas que para la implantación de la bomba osmótica (véase más adelante). Tras la inyección ICV, las ratas se diseccionaron después de 1, 3 y 24 horas y el cerebro, la médula espinal (dividida en médula espinal cervical, torácica y lumbar), la sangre y otros órganos (hígado, intestino, corazón, etc.) se pesaron y los recuentos totales por minuto (cpm) se midieron usando un contador gamma. La distribución de 125I-hVEGF165 en el parénquima del cerebro se evaluó por microautorradiografía. Primero, las criosecciones del cerebro y la médula espinal que contenían VEGF165 marcado con 125I se sumergieron en emulsión fotográfica (Kodak, Cedex, Francia). Después de dos días de exposición, las secciones emulsionadas se revelaron y la localización de granos de plata, como se detectan por microscopía óptica, se usó para determinar la distribución de tejido del VEGF165 marcado con 125I.

4.

Generación y caracterización de ratones transgénicos

Los ratones transgénicos que expresaban Flk-1 específicamente en neuronas adultas se generaron usando el casete de expresión Thy1.2 de ratón como se describe previamente 59. Se clonó ADNc de Flk-1 de murino en el casete de expresión Thy-1.2 y la contrucción linealizada se microinyectó en embriones de ratón FvB usando técnicas de

microinyección convencionales. Se identificaron los fundadores usando la PCR y se determinó la expresión del transgén mediante RT-PCR, transferencia Western e inmunotinción, como se describe previamente 13,37.

5.

Animales

El Dr. Itoyama proporcionó amablemente ratas Sprague- Dawley que expresaban el transgén SOD1G93A humano (SOD1G93A-L) 10, mientras que los ratones que expresaban el transgén SOD1G93A humano se retrocruzaron durante más de 10 generaciones en FvB y fueron amablemente proporcionados por el Dr. C. Kunst 60. Todos los experimentos en animales fueron autorizados por el comité de ética animal local.

6.

Procedimientos quirúrgicos

Para infundir VEGF164 de rata recombinante en el ventrículo cerebral de las ratas se usaron bombas osmóticas Alzet (modelo 2004) conectadas con un catéter a un cánula de infusión cerebral. La unidad de infusión cerebral se llenó con 200 µl de una disolución de VEGF164 de rata recombinante 5 µg/ml o con LCR artificial y se sensibilizó durante 48 h en solución salina. La composición del LCR artificial era Na+ 150 mM, K+ 3 mM, Ca2+ 1,4 mM, Mg2+ 0,8 mM, PO43-1 mM, Cl155 mM. Para la implantación de las bombas, las ratas se anestesiaron con halotano, se hizo una incisión mediosagital empezando ligeramente por detrás de los ojos y se expuso el cráneo. Se preparó una bolsa subcutánea en el área medioescapular del lomo de la rata y la bomba osmótica se insertó en la bolsa. Se perforó un orificio por el cráneo y la cánula se colocó usando las siguientes coordenadas estereotáxicas: 0,8 mm posterior al bregma, 1,6 mm lateral y 4,5 mm ventral desde la superficie del cráneo. Cuando se completó el procedimiento de implantación, la incisión de la piel se suturó y se dejó que la rata se recuperara. Después de 28 días, las bombas osmóticas vaciadas se sustituyeron por una bomba osmótica nueva completamente cargada y preparada. Para esto, la rata se anestesió de nuevo y se hizo una pequeña incisión en la piel en la región medioescapular del lomo. El catéter se cortó 5 mm anterior a

la bomba gastada y una bomba nueva se unió a la tubería del catéter. Este procedimiento da como resultado una infusión continua de VEGF164 a una tasa de 0,25 µl/h (correspondiente a 1,25 ng de VEGF/hora) en el LCR. En un ensayo de prevención, las bombas se implantaron a la edad de 60 días y en un ensayo de regresión las bombas se implantaron a 80 días (edad de aparición de la enfermedad). Los ratones se expusieron a hipoxia intermitente crónica transfiriéndolos cada dos días durante 30 días a una cámara de oxígeno que contenía 12% de oxígeno.

7. Análisis conductual

La actividad motora de las ratas se probó tres veces a la semana usando mediciones en cilindro giratorio, dinamómetro y de actividad espontánea. Se usó un cilindro giratorio para ratas (Ugo Basile, Comerio VA, Italia) con una velocidad de rotación constante (15 rotaciones por minuto). El promedio de 5 ensayos de cómo máximo 180 segundos se determinó en un día dado. Cuando el tiempo promedio que una rata podía estar en el cilindro giratorio era inferior a 120 segundos, esto se consideró un fracaso. Para la prueba del dinamómetro se hizo un promedio de 5 ensayos para cada rata, y cuando la rata no pudo tirar en promedio de 800 mg, esto se consideró un fracaso. Para cuantificar la actividad espontánea, las ratas se colocaron durante 3 horas en una jaula de actividad (Ugo Basile) y se calculó la actividad promedio por hora, es decir, el número de veces que la rata cruzó un haz infrarrojo colocado 10 cm por encima del suelo de la jaula. Como criterio para puntuar la edad de aparición de la enfermedad de las ratas se usó el arrastre de un miembro al andar. En estudios previos, el fracaso del animal para ponerse bien por sí mismo después de girarse sobre un lado durante un máximo de 30 segundos se puntuó como "muerte clínica" 9. Sin embargo, los experimentos iniciales desvelaron que ratas SOD1G93A que no pueden ponerse bien por sí mismas todavía podrían sobrevivir durante varios días – esto era particularmente el caso de ratas con enfermedad de los miembros delanteros. Por tanto,

los inventores puntuaron el momento de la muerte como el día en el que las ratas habían perdido el 40% de su peso corporal original a la última edad presintomática, como indicaron los experimentos en los animales dentro de las 2436 horas a partir de entonces. Los datos generados por los ensayos clínicos descritos y los datos de supervivencia se analizaron usando el análisis estadístico de Kaplan Meyer o usando ANOVA de medidas repetidas (cilindro giratorio, dinamómetro y actividad).

8.

Histología, inmunohistoquímica y ELISA

Los animales se perfundieron transcárdicamente bajo anestesia profunda con Nembutal con disolución de NaCl al 0,9% seguido por paraformaldehído tamponado con fosfato al 1%. Se diseccionaron la médula espinal y el cerebro, se fijaron posteriormente en el mismo fijador durante la noche, se deshidrataron y se incluyeron en parafina. Las secciones seriadas se cortaron a 20 µm de espesor para el cerebro y a 7 µm para la médula espinal. Para la inmunohistoquímica, los anticuerpos primarios se usaron del siguiente modo: SMI-32 dirigido contra ratón y SMI-31 dirigido contra ratón (ambos 1:500, Sternberger Monoclonals); GFAP dirigido contra ratón (1:400, Sigma); Glut-1 dirigido contra cabra (1:20, Santa Cruz Biotechnology); ubiquitina dirigida contra conejo (1/100, Dako) y albúmina dirigida contra conejo (1:250, ICN/Cappel). Para los recuentos de neuronas motoras en la médula espinal, las neuronas positivas SMI-32 en el asta ventral se contaron bilateralmente en 5 secciones igualmente separadas durante una distancia de 350 µm. Para determinar el número de neuronas motoras en el núcleo facial, cada 10ª sección de tronco encefálico se tiñó, y se contaron todas las neuronas positivas SMI-32 en la región del núcleo facial. Este número se multiplicó por diez para estimar el número total de neuronas motoras en el núcleo facial.

9.

Respuesta inmunitaria

Los niveles de VEGF164 en la médula espinal y en el plasma fueron inferiores al límite de detección de ELISA (32,5 pg/ml; R&D Systems) en ratones tratados tanto con aLCR

como con VEGF (n=7 para cada grupo). Para detectar si había anticuerpos dirigidos contra VEGF en circulación presentes en ratas tratadas con VEGF, las placas de microvaloración de 96 pocillos se recubrieron durante la noche con 100 µl de una disolución 1 µg/ml de proteína VEGF164. Después de la incubación con plasma o LCR de ratas tratadas con aLCR y VEGF, los anticuerpos dirigidos contra VEGF164 unidos se detectaron usando inmunoglobulinas dirigidas contra rata marcadas con HRP (DAKO; 200 ng/ml), el kit de tinción de vectores ABC y lectura fotoespectrométrica.

10. Estadística

Los inventores usaron la versión 10 de SPSS para todos los cálculos estadísticos. Las estadísticas de la supervivencia acumulada se calcularon usando estadística de Kaplan-Meier. Los datos de actividad espontánea, el cilindro giratorio y de pérdida de peso se analizaron usando ANOVA de medidas repetidas. Las pruebas de la t de Student se usaron para calcular diferencias significativas entre los estudios histológicos. Referencias

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Claims (9)

1. para uso para tratar una enfermedad de las
   1. VEGF165 neuronas motoras en el que dicho VEGF165 se administra continuamente durante al menos 4 semanas al sitio de aparición a un intervalo de dosis entre 0,01 µg/kg/día y 0,6 µg/kg/día.
   

2. 2.

   VEG165 para uso según la reivindicación 1, en el que dicho intervalo está entre 0,01 µg/kg/día y 0,2 µg/kg/día.

3. 3.

   VEGF165 para uso según la reivindicación 1, en el que dicho intervalo está entre 0,01 µg/kg/día y 0,1 µg/kg/día.

4. 4.

   VEGF165 para uso según la reivindicación 1, en el que dicho intervalo está entre 0,01 µg/kg/día y 0,08 µg/kg/día.

5. 5.

   VEGF165 para uso según la reivindicación 1, en el que dicho intervalo está entre 0,01 µg/kg/día y 0,06 µg/kg/día.

6. 6.

   VEGF165 para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha administración es intratecal.

7. 7.

   VEGF165 para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha administración es intracerebroventricular.

8. 8.

   VEGF165 para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha administración continua de VEGF165 se produce por una minibomba osmótica implantada.

9. 9.

   VEGF165 para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha enfermedad de las neuronas motoras es esclerosis lateral amiotrófica.