PT1755647E - Tratamento da esclerose lateral amiotrófica - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "TRATAMENTO DA ESCLEROSE LATERAL AMIOTRÓFICA"

Dominio da Invenção A invenção presente diz respeito ao VEGF165 para utilização no tratamento de doenças dos neurónios motores em que o VEGF165 referido é administrado em continuo durante até pelo menos 4 semanas no local de inicio de manifestação ou a uma pequena distância, numa qama de entre 0,01 yg/kg/dia e 0,6 yg/kg/dia. Mais especificamente, a invenção diz respeito ao tratamento da esclerose lateral amiotrófica (ALS). Verifica-se que a veiculação intracerebroventricular de pequenas quantidades de factor de crescimento endotelial vascular num modelo em animal em estado de ALS pré-clinico induz um desempenho motor significativo e o prolongamento da sobrevivência dos animais referidos.

Introdução à invenção A esclerose lateral amiotrófica (ALS) é uma patologia paralisante devastadora, que mata os pacientes nos 3 a 5 anos após a sua manifestação1-4. Os sintomas clinicos resultam sobretudo da degeneração progressiva dos neurónios motores na medula espinal e no tronco cerebral, poupando em larga medida o desempenhos cognitivo. A doença 2 afecta indivíduos saudáveis no meio da sua vida, esporadicamente em > 90 % dos casos sem que exista qualquer historial familiar. Embora sejam afectados mais homens do que mulheres antes da idade de 60 anos, ambos os géneros são afectados similarmente a idades superiores5. Com o aumento de idade da população, cada vez há mais indivíduos que sofrem de ALS - a terceira patologia neurodegenerativa mais comum6. Muitos pacientes com ALS notam em primeiro lugar fraqueza muscular nos seus membros (ALS "com manifestação nos membros") . Em ~ 25 % dos pacientes com ALS, os neurónios motores degeneram em primeiro lugar nos núcleos motores do tronco cerebral (ALS com "manifestação no bolbo"), provocando disartria, disfagia e problemas respiratórios. Os pacientes com ALS de manifestação bulbar exibem em geral uma progressão mais rápida e agressiva da doença do que os pacientes com manifestação nos membros, mas estes últimos acabam por manifestar também sintomas bulbares. A causa exacta da degeneração dos neurónios motores permanece enigmática na maior parte dos casos2,4'7. As mutações SOD-1 provocam degeneração dos neurónios motores em seres humanos e, quando sobre expressas, também em murganhos transgénicos. De facto, murganhos SOD-lG93A têm-se tornado no modelo em animal que é o padrão dourado para se avaliar o potencial terapêutico de novos candidatos a fármacos8. Nos ratos SOD-lG93A desenvolve-se uma forma agressiva de ALS, mas eles ainda não foram utilizados para avaliar novos tratamentos9,10. Não existe nenhuma cura aprovada, eficaz, para a ALS. O riluzole é o único fármaco aprovado em alguns, mas não em todos os países, mas tem um 3 efeito benéfico marginal sobre a sobrevivência, é caro, não é isento de efeitos colaterais e, o que é importante, não é eficaz no caso de sintomas bulbares16. Uma vez que a ALS resulta da degeneração dos neurónios motores, os factores de crescimento neurotróficos, tais como o factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), o factor neurotrófico ciliar (CNTF), o factor de crescimento semelhante à insulina (IGF)-l, o factor de inibição da leucemia (LIF), a cardiotrofina (CT)-l e o factor de crescimento de hepatócitos (HGF) têm sido considerados há muito tempo como candidatos terapêuticos para a ALS. Demonstrou-se que a transferência de genes de GDNF mas em especial de IGF-1, utilizando um vector virai transportado axonalmente de forma retrógrada, prolonga a sobrevivência17'18 de murganhos SOD-lG93A. Embora se estejam a realizar ensaios clinicos, a aplicabilidade clinica da terapia genética para a ALS ainda não se encontra estabelecida e existem preocupações por causa da sua natureza irreversível, do risco de aparecimento de efeitos cromossomais adversos, o controlo da expressão dos transgene é fraco, e seria necessário ultrapassar os problemas para uma produção em larga escala. A veiculação de factores neurotróficos recombinantes, em vez disto, é portanto uma estratégia terapêutica alternativa e atractiva, uma vez que existe um controlo flexível da dose e da duração da proteína que se administra. No entanto, a fusão intratecal de BDNF19, a veiculação intracerebroventricular de GDNF ou a administração sistémica de BDNF ou de CNTF20 não têm, até à data, resultado em melhorias clínicas significativas dos pacientes com ALS, excepto no que toca a uma progressão 26 % mais lenta da doença após a veiculação de IGF-1 num estudo, mas não no outro21'22. Pelo menos parte deste falhanço pode ser atribuído à vida média curta, à imunogenicidade, a um efeito dual sobre a sobrevivência dos neurónios versus apoptose, à toxicidade indesejável é à capacidade limitada para cruzar a barreira sangue-cérebro 2 3 _ 2 5 após veiculação sistémica, que estas proteínas exibem Outra razão possível pode ter a ver com o facto de que diversos de entre estes factores, mesmo que promovam a sobrevivência dos neurónios motores com lesões agudas quando são fornecidos exogenamente, podem não desempenhar um papel tão crítico no controlo endógeno dos neurónios motores de adultos numa doença crónica tal como a ALS. Verificámos recentemente que teores pequenos de VEGF são redundantes para o desenvolvimento dos neurónios motores mas provocam manifestação em adultos de degeneração de neurónios motores semelhante à da ALS, em murganhos modificados (WOOl/76.620) e também aumentam o risco de ALS esporádica e familiar em seres humanos13-15. O VEGF é um protótipo de factor angiogénico, implicado no crescimento de vasos, saudável e na doença11,12. Para se evitarem problemas imunes e efeitos colaterais sistémicos, para ultrapassar a capacidade limitada do VEGF para cruzar a barreira sangue-cérebro, e para conseguir teores máximos em proteína VEGF no parênquima da medula espinal, desenvolvemos uma estratégia, nunca dantes utilizada, para examinar o potencial terapêutico de uma proteína 5 recombinante em estudos pré-clinicos da ALS, isto é, veicular, por via intracerebroventricular, VEGF recombinante durante períodos prolongados utilizando um modelo transgénico SOD-lG93A em rato da ALS. De forma surpreendente, verificámos que teores muito pequenos de VEGFigs não só melhoram significativamente o desempenho motor, mas também prolongam o período de sobrevivência num modelo pré-clínico da ALS em ratos, por uma extensão temporal inesperadamente longa. Os resultados mostram que teores pequenos de VEGFi65 podem tornar mais lenta a progressão da doença em pacientes que sofram da ALS, quando a administração é feita por via intracerebroventricular.

Descrição pormenorizada da invenção A invenção presente mostra que a veiculação intracerebroventricular (ICV) de pequenas quantidades de VEGF torna mais lenta a manifestação inicial, melhora o desempenho motor e prolonga o período de sobrevivência de um rato que sofra de uma forma agressiva da ALS. Este é o primeiro estudo que mostra um efeito terapêutico significativo, de um factor de crescimento recombinante, sobre as características da doença, num modelo pré-clínico da ALS. Avaliaram-se diversos factores de crescimento recombinantes com actividade neurotrófica conhecida, incluindo BDNF, IGF-1, CNTF, LIF e GDNF, em pacientes com ALS ou em murganhos S0D1G93A, mas nenhum factor de crescimento recombinante proporcionou consistentemente um benefício substancial19”22'35, e portanto atento o falhanço 6 em ensaios clínicos anteriores19-22, a administração de factores de crescimento recombinantes tem perdido muita da sua atracção. Tal como se mostra, o VEGFi6s tem efeitos directos sobre os neurónios motores in vivo. Embora se saiba que o VEGF afecta diversos processos neuronais in vivo15, nunca foi estabelecido que o VEGF exercia os seus efeitos directamente sobre neurónios ou indirectamente sobre outros tipos de células ou através de outros intermediários moleculares. Deste modo, o VEGF165 apresenta um espectro de actividades pleiotrópico, que pode ter contribuído para o seu notável benefício terapêutico nesta invenção. A invenção presente proporciona uma isoforma de VEGF165 para utilização no tratamento de patologias dos neurónios motores, e mais especificamente para o tratamento da esclerose lateral amiotrófica e de doenças semelhantes à esclerose lateral amiotrófica, no qual se administra o referido VEGF continuamente perto do local da primeira manifestação, durante pelo menos 4 semanas, uma quantidade adentro da gama de entre 0,01 yg/kg/dia e 0,6 yg/kg/dia. O VEGF165 é uma proteína com 165 aminoácidos que se refere topicamente como VEGF humano (hVEGF). O VEGF está expresso numa série de tecidos diferentes sob a forma de várias formas homo-diméricas (com 121, 145, 165, 189, e 206 aminoácidos por monómero), resultando de cisões alternativas no ARN. O VEGF121 é um mitogénio solúvel que não se liga a heparina; as formas mais longas do VEGF ligam-se a heparina com afinidades progressivamente 7 maiores. As formas de FEGF que se ligam a heparina podem ser clivadas no terminal carboxilo pela plasmina, para libertar forma (s) difusivel (is) de VEGF. Para além disto, também foram identificadas recentemente diversas moléculas estruturalmente relacionadas com o VEGF, incluindo o factor de crescimento placentário (PIGF), o VEGF-B, o VEGF-C, o VEGF-D e o VEGF-E; Ferrara e Davis-Smyth (1997) Endocr. Rev., Ogawa et al. (1998) J. Biological Chem. 273: 31273-31281; Meyer et al. (1999) EMBO J., 18: 363-374. Num caso, a descrição presente diz respeito às expressões 'composição farmacêutica' ou 'medicamento' ou 'utilização para o fabrico de um medicamento para tratar' que dizem respeito a uma composição contendo VEGF165 tal como se descreveu acima, e um veiculo ou excipiente aceitável do ponto de vista farmacêutico (ambos estes termos podem ser utilizados de forma intercambiável) para se tratarem doenças dos neurónios motores tal como indicado acima. Os veículos ou excipientes adequados conhecidos pelo técnico da especialidade são o soro salino, a solução de Ringer, soluções de dextrose, a solução de Hank, óleos fixados, oleato de etilo, 5 % de dextrose em soro salino, substâncias que aumentam a isotonicidade e a estabilidade química, tampões e conservantes. Incluem-se em outros veículos adequados quaisquer veículos que não induzam eles próprios a produção de anticorpos nocivos para o indivíduo a quem é administrada a composição, tais como proteínas, polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos e copolímeros de aminoácidos. Numa concretização específica, o 'medicamento' pode ser administrado por um método, perto do local de manifestação inicial. De facto, o gradiente espacial dos teores em VEGF165 e o seu beneficio terapêutico indicam que, apesar da substituição temporal significativa de CSF, o VEGF165 é depositado com proximidade da dose e do local de injecção. Isto pode oferecer novas oportunidades para se definirem terapias com VEGF face às necessidades do paciente. De facto, os indivíduos que sofrem de ALS com manifestação inicial bulbar podem beneficiar mais de uma veiculação ICV ou intratecal de VEGF a nível cervical, enquanto os pacientes com ALS com manifestação inicial lombar podem beneficiar mais de uma administração por infusão intratecal de VEGF a nível lombar. Num caso específico administra-se o VEGF165 a uma dose de entre 0,01 yg/kg/dia e 1,5 yg/kg/dia, mais preferivelmente de entre 0,05 yg/kg/dia e 1 yg/kg/dia, e preferivelmente de entre 0,2 yg/kg/dia e 0,8 yg/kg/dia. Preferivelmente, utiliza-se uma infusão contínua que inclui a administração subcutânea por intermédio de uma mini bomba osmótica. Noutro caso administra-se continuamente a dose de VEGF165 no local de manifestação inicial dos sintomas, sendo a dose de entre 0,05 yg/kg/dia e 1 yg/kg/dia.

Noutro caso, administra-se continuamente a dose de VEGF165 no local de manifestação dos primeiros sintomas, sendo a dose de entre 0,2 yg/kg/dia e 0,8 yg/kg/dia. Numa concretização a administração da dose no local de manifestação inicial será uma administração intratecal. Noutra concretização a dose administrada no local de manifestação dos primeiros sintomas será alvo de uma 9 administração intracerebroventricular. Também deve ser claro que num caso, a administração do VEGF165 é a de uma dose administrada continuamente no local de manifestação dos primeiros sintomas, sendo de entre 0,01 yg/kg/dia e 1,4 yg/kg/dia ou de entre 0,01 yg/kg/dia e 1,3 yg/kg/dia ou de entre 0,.01 yg/kg/dia e 1,2 yg/kg/dia ou de entre 0,01 yg/kg/dia e 1,1 yg/kg/dia ou de entre 0,01 yg/kg/dia e lyg/kg/dia ou de entre 0,01 yg/kg/dia e 0,9 yg/kg/dia ou de entre 0,01 yg/kg/dia e 0,8 yg/kg/dia ou de entre 0,01 yg/kg/dia e 0,7 yg/kg/dia ou de entre 0,01 yg/kg/dia e 0,6 yg/kg/dia ou de entre 0,01 yg/kg/dia e 0,5 yg/kg/dia ou de entre 0,01 e 0,4 yg/kg/dia ou de entre 0,01 yg/kg/dia e 0,3 yg/kg/dia ou de entre 0,01 yg/kg/dia e 0,2 yg/kg/dia ou de entre 0,01 yg/kg/dia e 0,1 yg/kg/dia ou de entre 0,01 yg/kg/dia e 0,09 yg/kg/dia ou de entre 0,01 yg/kg/dia e 0,08 yg/kg/dia ou de entre 0,01 yg/kg/dia e 0,07 yg/kg/dia ou de entre 0,01 yg/kg/dia e 0,06 yg/kg/dia ou de entre 0,01 yg/kg/dia e 0,05 yg/kg/dia ou de entre 0,01 yg/kg/dia e 0,04 yg/kg/dia ou de entre 0,01 yg/kg/dia e 0,03 yg/kg/dia. Noutro caso, a administração de VEGFi65 é a de uma dose continuamente administrada no local de manifestação dos primeiros sintomas, sendo de entre 0,02 yg/kg/dia e 1,5 yg/kg/dia ou de entre 0,03 yg/kg/dia e 1,5 yg/kg/dia ou de entre 0,04 yg/kg/dia e 1,5 yg/kg/dia ou de entre 0,05 yg/kg/dia e l,5yg/kg/dia ou de entre 0,06 yg/kg/dia e 1,5 yg/kg/dia ou de entre 0,07 yg/kg/dia e 1,5 yg/kg/dia ou de entre 0,08 yg/kg/dia e l,5yg/kg/dia ou de entre 0,09 yg/kg/dia e l,5yg/kg/dia ou de entre 0,1 yg/kg/dia e 1,5 yg/kg/dia ou de entre 0,2 yg/kg/dia e 1,5 10 yg/kg/dia ou de entre 0,3 yg/kg/dia e l,5yg/kg/dia ou de entre 0,4 yg/kg/dia e 1,5 yg/kg/dia ou de entre 0,5 yg/kg/dia e 1,5 yg/kg/dia ou de entre 0,6 yg/kg/dia e 1,5 yg/kg/dia ou de entre 0,7 yg/kg/dia e 1,5 yg/kg/dia ou de entre 0,8 yg/kg/dia e 1,5 yg/kg/dia ou de entre 0,9 yg/kg/dia e 1,5 yg/kg/dia ou de entre 1 yg/kg/dia e 1,5yg/kg/dia ou de entre 1,1 yg/kg/dia e l,5yg/kg/dia ou de entre 1,2 yg/kg/dia e l,5yg/kg/dia ou de entre 1,3 yg/kg/dia e 1,5 yg/kg/dia.

Deste modo, numa concretização especifica, a infusão com uma composição incluindo VEGFi65 é intratecal. Pode levar-se a cabo a administração intratecal, por exemplo, implantando cirurgicamente uma bomba e levando um cateter até à espinha.

Para se tornar mais clara a invenção, a expressão 'doença dos neurónios motores' é explicada adiante. A doença dos neurónios motores é um grupo de doenças envolvendo a degeneração das células do corno anterior, nervos do sistema nervoso central que controlam a actividade muscular. Isto leva a um enfraquecimento gradual e eventualmente ao desperdício da musculatura (atrofia). As doenças dos neurónios motores são classificadas consoante o envolvimento dos neurónios motores superiores (UMN) e/ou dos neurónios motores inferiores (LMN). Os neurónios motores superiores têm origem no cérebro, em especial, no córtex motor, e têm sinapses quer directas quer indirectas com os neurónios motores inferiores. Os neurónios motores 11 superiores podem ser referidos com mais precisão como neurónios motores prévios, e eles são responsáveis pela condução de comandos descendentes relativos ao movimento. Os neurónios motores inferiores podem ser classificados em duas categorias: neurónios motores viscerais e neurónios motores somáticos. Os neurónios motores viscerais são neurónios autónomos pré-ganglionares que regulam a actividade dos neurónios ganglionares, que inervam glândulas, vasos sanguíneos, e o músculo liso. Os neurónios motores somáticos inervam o músculo-esquelético e neles se incluem em primeiro lugar as células do corno anterior, que tal como o seu nome implica, se localizam no corno anterior da medula espinal, e em segundo lugar, os neurónios motores inferiores localizados nos núcleos dos nervos cranianos. A esclerose lateral amiotrófica ou ALS é a forma mais frequente (correspondendo a cerca de 80 % de todos os casos) das patologias dos neurónios motores. A ALS é conhecida também como doença de Lou Gehrig, nome do famoso jogador de basebol Ianque. Os sintomas iniciais da ALS são fraqueza nas mãos e pernas e amiúde uma fasciculação dos músculos afectados. Quaisquer que sejam os músculos que são afectados em primeiro lugar, eventualmente vêm a ser afectados os quatro membros. As lesões nos neurónios motores superiores originam fraqueza muscular, incapacidade de coordenação de movimentos e reflexos de hiperactividade dos tendões profundos. As lesões nos neurónios motores inferiores originam fraqueza muscular com atrofia, fasciculações, flacidez e diminuição dos reflexos dos tendões profundos. A ALS tem caracteristicas dos neurónios 12 motores tanto superiores como inferiores, dos nervos cranianos, e portanto os sintomas são isolados na cabeça e pescoço. Alguns pacientes também exibirão envolvimento UMN idos nervos cranianos e quando esta for a única manifestação, a doença é referida como paralisia pseudobulbar. A atrofia muscular espinal ou a atrofia muscular progressiva é uma doença dos neurónios motores que não envolve os nervos cranianos e que é devida à degeneração dos neurónios motores inferiores. A sindrome de Shy-Drager é caracterizada por hipotensão na postura, incontinência, suores, rigidez muscular e tremor, e pela perda dos neurónios dos núcleos toráxicos na medula espinal, aonde têm origem as fibras do simpático. As lesões que destroem a medula espinal originam a perda das células do corno anterior. Isto pode ser observado na mielomeningocelia e na seringomielia, em que um quisto grande repleto de fluido se forma no centro da medula espinal cervical. 0 efeito benéfico com o VEGFi65 diz respeito ao facto de que na invenção presente este factor de crescimento recombinante foi administrado continuamente e directamente no fluido cerebroespinal (CSF) - a disponibilidade dos modelos maiores S0D1G93A em ratos, da ALS, foi portanto instrumental. Os dados acerca da distribuição biológica mostram que o VEGF165, após veiculação pela via ICV, se encontra difundindo rapidamente do CSF para o parênquima da medula espinal, e é portanto capaz de atingir os neurónios motores inferiores embora não 13 se possa excluir que parte do benefício possa também ter tido origem do efeito sobre os neurónios motores superiores. A correlação estreita entre a distribuição biológica do VEGF165 (maior no tronco cerebral do que na medula espinal lombar) e o seu efeito terapêutico mostre que o VEGF induz o seu efeito mais forte em locais nos quais os seus teores são os mais elevados. À medida que o VEGF165 é retirado do sistema nervoso central para além de 3 horas (semelhante ao que acontece para as outras neurotrofinas38) , a veiculação contínua de VEGFi65 contribui provavelmente para o efeito benéfico. Outras razões podem dizer respeito ao perfil de segurança geral do VEGF165 administrado por via ICV (não se observaram quaisquer efeitos adversos proeminentes quando se utilizava uma dose terapêutica, que era 10 vezes inferior ao limiar de toxicidade) e a ausência de uma resposta imune (que poderia de outro modo ter induzido anticorpos neutralizantes). Não ocorreu nenhuma resposta imune aquando da veiculação sistémica do VEGF165 e, provavelmente, a penetração desprezável do VEGF através da barreira sangue-cérebro só poderia ser ultrapassada administrando sistemicamente quantidades maciças - provavelmente tóxicas - do VEGF165. A administração ICV pode parecer incómoda à primeira vista, mas é tecnicamente factível e já está operacional para outras indicações neurológicas crónicas43. O desconforto devido a uma única intervenção cirúrgica, para posicionar a bomba, pode de facto, pesar muito mais do que os benefícios desta via de administração (ausência de 14 efeitos colaterais sistémicos bem como de resposta imune; administração controlável). Os nossos dados genéticos anteriores indicam que o VEGF afecta tanto a ALS esporádica como a familiar14. Embora apenas tivéssemos podido utilizar, na invenção presente, um modelo em animal da ALS familiar, existe uma boa probabilidade de que o VEGF também será eficaz nos casos esporádicos da ALS. Isto porque o VEGF tem efeitos de sobrevivência em diversos tipos de neurónios, independentemente do tipo de stress (hipoxia, excitotoxicidade, privação de soro, toxicidade mutante relacionada com S0D1, etc...) e é portanto um candidato atractivo15. A terapêutica com VEGF parece ser segura e bem tolerada durante períodos de tempo longos, sem provocar efeitos colaterais vasculares. As nossas observações são uma extensão de observações anteriores acerca de o VEGF ser conhecido como apresentando actividades biológicas qualitativamente distintas (permeabilidade vascular, angiogénese) a concentrações diferentes57. Para além disto, teores pequenos de VEGF só estimulam a angiogénese no cérebro isquémico/lesionado quando são administrados directamente no parênquima do cérebro, mas não no CSF48'58.

Exemplos da especificação presente, incluindo a invenção. 1._Veiculação_sistémica_ver sus intracerebroventricular do VEGF recombinante 15

Avaliámos primeiro qual seria a melhor via de administração, isto é, sistémica ou intracerebroventricular, do VEGF. Uma terapia segura e eficaz da ALS com um factor de crescimento obriga a que a administração da proteína não venha a criar uma resposta imune nem induza efeitos sistémicos adversos, mas resulte em teores suficientemente elevados, isto é, terapêuticos, no parênquima da medula espinal. Os estudos iniciais indicaram que todas as preparações de VEGF disponíveis comercialmente, humana recombinante, de rato ou de murino, quando eram administradas por via intraperitoneal a murganhos a 1 yg de dois em dois dias (uma dose terapêutica para estimular a angiogénese37) , provocavam uma resposta imune forte adentro de 2 semanas. Os melhores resultados foram obtidos quando se utilizou VEGF de murino produzido por E. coli nas nossas instalações, mas mesmo esta preparação provocava uma resposta imune nas primeiras 4 semanas, impedindo deste modo a veiculação sistémica crónica do VEGF. Para além disto, o VEGF é hidroílico e tem uma massa molecular de 44 kDa, sendo portanto provavelmente incapaz de atravessar a barreira sangue-cérebro ou a barreira sangue-fluido cerebroespinal (CSF), com uma eficiência maior do que 1 % da dose injectada38. Para se obterem teores suficientes em VEGF no parênquima da medula espinal, seria portanto necessário administrarem-se quantidades excessivas de VEGF, que provavelmente induziriam efeitos colaterais sistémicos tóxicos. Para além disto, o VEGF é armadilhado não apenas pela matriz extracelular dos tecidos rica em sulfato de heparana, mas 16 também, no plasma, por Fltl solúvel (sFltl) , isto é, o dominio extracelular de ligação de lipidos do receptor-1 de VEGF (também denominado Fltl)39'40. Detectámos, no entanto, teores 5 vezes superiores em Fltl no soro, do que no fluido cerebroespinal, de murganhos (3,800 ± 594 pg/mL, versus 810 ± 66 pg/mL; N= 3; P<0,05). Portanto, seria armadilhada uma fracção de VEGF maior pelo sFltl e pela matriz rica em sulfato de heparana, quando a administração fosse sistémica, e não intracerebroventricular. Por último, embora os teores em VEGF não sejam detectáveis no CSF41, o plexo coróide é um dos poucos locais no corpo em que o VEGF permanece constitutivamente expresso no adulto42. Por todas estas razões, avaliámos se a administração intracerebroventricular (ICV) do VEGF constituiria uma via alternativa e optimizámos as técnicas necessárias para uma administração a longo prazo de factores de crescimento por via ICV. Uma vez que haviamos previamente determinado que a isoforma de VEGF164 (a equivalente humana é o VEGFies) exibe as propriedades biológicas óptimas para estimular a sobrevivência dos neurónios motores13 (WO01/76.620), utilizámos esta isoforma no resto do nosso estudo. Uma vez que se utilizaram ratos para todas as experiências de veiculação (veja-se adiante), clonámos e expressámos uma preparação de proteina VEGF164 de rato, quer tinha uma pureza >99 % e era isenta de endotoxinas. 2. Distribuição biológica do VEGF após administração intracerebroventricular 17 Não se sabe nada acerca da f armacocinética do VEGF no sistema nervoso central, após administração por via ICV38. Não se sabe sequer se o VEGF administrado no CSF será capaz de difundir até ao parênquima da medula espinal através da barreira ependimal. Determinámos portanto em primeiro lugar o perfil de distribuição do 125I-VEGF após administração ICV em ratos saudáveis. Uma hora após a administração de uma injecção de um bolus de ICV, só 12 % da quantidade de 125I-VEGF injectada estava ainda presente no CSF, enquanto 7 0 % e 12 % foram recuperados respectivamente no parênquima do cérebro e no da medula espinal, indicando que o 125I-VEGF difunde facilmente do CSF para o parênquima. Desta forma, à semelhança do que acontece para o NGF, mas ao contrário do que acontece para o BDNF, a camada ependimal não representa uma barreira para a difusão do VEGF até ao parênquima38. Quando se expressam os teores em 125I-VEGF por grama de tecido, os teores em 125I-VEGF eram os maiores na vizinhança do local da injecção e declinavam progressivamente com um gradiente rostro-caudal ao longo da medula espinal: os teores em 125I-VEGF nas zonas bulbar/cervical, toráxica e lombar da medula espinal eram respectivamente de 80 %, 50 % e 16 %, dos que se mediram no cérebro. Três horas após a injecção, só 30 % do 125I-VEGF injectado estava presente no cérebro e na medula espinal, enquanto apenas se detectaram quantidades desprezáveis passadas 24 horas, quando se recuperou o 125I-VEGF nas excreções, sugerindo que o VEGF era eliminado para os sistemas venoso e linfático, tal como documentado para outros factores de crescimento38. Podem retirar-se duas 18 conclusões destas experiências. Em primeiro lugar, o VEGF administrado por ICV difunde rapidamente do CSF para os neurónios no parênquima, mas é então eliminado nas 24 horas seguintes do CSF. Uma vez que os neurónios motores na ALS necessitam cronicamente de sinais de sobrevivência, terá que se administrar o VEGF continuamente. Em segundo lugar, após a administração ICV, o VEGF está distribuído com um gradiente rostro-caudal - isto pode ter consequências por afectar a sobrevivência dos neurónios motores com um perfil espacial semelhantes. 3. Administração intracerebroventricular de VEGF recombinante durante um prazo longo

Embora uma administração prolongada por via ICV de GDNF durante períodos até 8 meses tenha sido conseguida em seres humanos para tratar outras patologias neurodegenerativas43, esta via não tem sido utilizada para avaliar o potencial terapêutico de factores de crescimento recombinantes em podemos pré-clínicos de ALS. Para se conseguir uma veiculação contínua e constante a longo prazo do VEGF recombinante, implantámos subcutaneamente mini bombas osmóticas nas costas dos animais e ligámos essas bombas a cateteres, que se posicionaram estereotacticamente no ventrículo lateral do cérebro. Embora seja tecnicamente possível cateterizar o ventrículo lateral de murganhos, os cateteres não conseguiam ficar fixos no cérebro e saíam passadas algumas semanas, porque os animais tentavam retirá-los coçando a cabeça. Para além disto, a grande 19 dimensão da bomba, em relação à dimensão corporal (quase 30 % do tamanho do corpo do animal), preludia medições de confiança do desempenho motor. Seleccionámos portanto implantar bombas que administravam os compostos durante até 4 semanas, num modelo animal de ALS em rato S0D1G93A, para avaliar o potencial terapêutico da veiculação ICV da proteina VEGF recombinante. Substituindo as bombas de 4 em 4 semanas conseguimos veicular proteina VEGF de um modo reprodutível durante mais do que 100 dias, sem quaisquer efeitos adversos (veja-se adiante). A posição correcta e a permeabilidade dos cateteres eram avaliadas em cada rato na altura da sua dissecção. De um modo importante, o VEGF ainda estava biologicamente activo na ligação aos seus receptores, os receptores-1 de VEGF (também denominados Fltl) e os receptores-2 de VEGF (Flkl), depois de estar incorporado na mini bomba osmótica nos animais durante diversas semanas. De facto, quando era recuperado das bombas passadas três semanas, 89 % e 68 % do VEGF residual na bomba ainda se ligava, respectivamente a Fltl e a Flkl, indicando que a maior parte do rVEGF164 armazenado na bomba ainda estava activo. ma vez que nunca se administrou VEGF ao sistema nervoso central cronicamente (a duração mais prolongada havia sido de uma semana) e que os efeitos da administração aguda versus crónica de VEGF podem ser diferentes, avaliámos cuidadosamente se uma dose bem determinada de VEGF estimulava a sobrevivência dos neurónios motores sem provocar um crescimento excessivo dos vasos sanguíneos, ou hemorragia excessiva, mesmo após uma veiculação prolongada durante diversos meses. As 20 experiências iniciais revelaram que os ratos que recebiam uma dose elevada de VEGF por via intracerebroventricular (por exemplo de 20 yg/kg/dia) morriam todos ao fim de alguns dias. A 2 yg/kg/dia, 66 % dos ratos ficavam doentes passadas 3 a 4 semanas. Embora não estivessem paralisados, (os animais ainda conseguiam andar normalmente quando eram empurrados), eles estavam em geral apáticos. Uma inspecção macroscópica e uma análise histológica do cérebro e da medula espinal revelaram crescimento de vasos adicionais, dilatação ventricular, e uma coloração mais vermelha e um edema do cérebro e da medula espinal. Uma gama de doses de entre 0,2 yg/kg/dia e 0,6 yg/kg/dia era bem tolerada pelos ratos, sem induzir edema, perda de sangue ou crescimento vascular excessivo - mesmo quando a administração era crónica, de mais do que 100 dias. A esta dose, os teores em VEGF no CSF permaneciam indetectáveis. Trataram-se ratos S0D1G93A/Lsd (ratos S0D1G93A com uma baixa expressão de S0D1G93A sobre uma base Sprague-Dawley; veja-se o exemplo 4) com 0,6 yg de VEGF/kg/dia. A esta dose, os teores em VEGF no CSF permaneciam indetectáveis, presumivelmente porque o VEGF difundia rapidamente para o parênquima espinal. Isto é importante, pois só teores detectáveis de VEGF têm sido associados com situações patológicas41. Utilizámos portanto uma dose de 0,6 yg de VEGF/kg/dia para tratar os ratos SOD1g93a. Esta dose é, mesmo depois de uma correcção para o volume relativo de distribuição do corpo inteiro versus o do cérebro/espinal medula, ainda cinco vezes menor do que uma utilizada para a angiogénese terapêutica37. Fluido cerebroespinal artificial (aCSF) , infundido a título de 21 controlo, também foi bem tolerado durante períodos prolongados, indicando que os procedimentos cirúrgicos eram seguros. Outra vantagem desta dose baixa de VEGF era que não induzia uma resposta imune. De facto, não eram detectáveis nenhuns anticorpos anti-VEGF no sangue periférico nem no CSF dos ratos, mesmo ao fim de 100 dias de administração com uma gama de doses de VEGF de entre 0,2 yg/kg/dia e 0,6 yg//kg/dia. 4. Efeito do VEGF no modelo de ALS no rato Não foram nunca utilizados antes ratos SODlG93A para a avaliação de paradigmas de tratamento da ALS. Utilizámos ratos SODlG93A/LScl, gerado por Nagai et al.10 ("L" refere-se aos teores baixos, por exemplo aumentados para o dobro, de S0D1G93A neste modelo) sobre uma base de Sprague-Dawley (Sd). A progressão da doença é muito agressiva neste modelo, liquidando os animais durante os primeiros 10 dias após a primeira manifestação da doença10. Os ratos S0D1G93A/Lsd exibiam uma grande variabilidade entre ninhadas no que toca à primeira manifestação da doença, que podia ir dos 95 aos 145 dias. Para diminuir esta variabilidade, utilizámos membros da mesma ninhada de SODlG93A/LSd e analisámos os resultados de um modo emparelhado (IV=17 ratos foram analisados em 6 pares da mesma ninhada; vejam-se os pormenores na secção de métodos). Em comparação com o tratamento de controlo com CSF artificial (aCSF) , o tratamento de ratos SOD1 G93A/LSd com 0,6 yg de VEGF/kg/d ia aos 60 dias de idade atrasa significativamente a primeira 22 manifestação da doença, e melhora o desempenho motor e o quadro clínico global, independentemente do método de classificação que se utiliza. Por exemplo, os ratos S0D1G93A/Lsd tratados com VEGF permanecem em geral activos, móveis, atentos, e tratavam do seu pelo, numa altura em que os animais a aCSF já denotavam sinais de paralisia, e estavam progressivamente a ficar imóveis e caquécticos. Os animais de controlo tinham atrofia muscular mais severa do que do que os ratos tratados com VEGF. A veiculação ICV do VEGF atrasava, de 10 dias, o início da paralisia dos membros, classificada como arrastamento de uma pata posterior ou falha em utilizar uma pata anterior durante o andamento ou quando se levantavam (P<0,05). Utilizando um sistema de detecção baseado num feixe de raios laser10, identificámos a idade à qual os ratos já não eram capazes de atravessar feixes de raios laser a distância constante uns dos outros numa "jaula de actividade" pelo menos 1.000 vezes por hora - uma medida das suas actividades espontâneas de locomoção. Depois de se veicular o VEGF, os ratos permaneciam espontaneamente activos até uma idade superior (135 ± 5 dias para o aCSF, versus 146 ± 8 dias, para o VEGF; P<0,05). Gravámos também filmes vídeo dos ratos e determinámos o período de tempo e a velocidade utilizados na exploração da jaula e contámos a frequência com a qual os ratos se levantavam nas patas traseiras, a título de medidas adicionais da sua actividade espontânea. Antes do início da doença, isto é, aos 110 dias de idade, ambos os grupos exploravam as suas jaulas com igual actividade e levantavam-se nos quartos traseiros com a 23 mesma frequência (P=NS). Quatro dias depois os ratos a aCSF denotavam os primeiros sinais de paralisia de membros, os ratos tratados com VEGF exploravam as suas jaulas durante mais tempo e levantavam-se nos quartos traseiros mais frequentemente do que os animais tratados com aCSF (P<0,05) . Por último, o VEGF prolongava o periodo de sobrevivência destes ratos com ALS durante 10 dias (P<0,01). Assim, apesar da progressão muito rápida da doença e da grande variabilidade num a mesma ninhada para a primeira manifestação da doença neste modelo, o tratamento com VEGF atrasava a primeira manifestação, melhorava o desempenho motor e prolongava a sobrevivência dos ratos S0D1G93A/Lsd sem provocar efeitos adversos. 5. Mecanismo molecular do efeito neuroprotector

do VEGF

Explorámos com mais detalhe os mecanismos através dos quais o VEGF prolongava a sobrevivência dos neurónios motores in vivo. Estudos in vitro indicavam que o VEGF protegia os neurónios motores contra a morte celular induzida por stress por se ligar ao receptor-2 de VEGF (também denominado Flkl)13, mas nunca foi demonstrada uma actividade neurotrófica directa para o VEGF in vivo. Para se atacar este último aspecto, gerámos murganhos transgénicos, utilizando a cassete de expressão Thyl.2 para conduzir a expressão de Flkl murino em neurónios pós-natais45. Em comparação com membros não transgénicos da mesma ninhada, os murganhos Thy-Flkl expressavam mais 24

transcrições e mARN de Flkl (cópias de Flkl/103 cópias de HPRT: 470 ± 45 versus 50 ± 5; N= 3; P<0,05) e proteína. A expressão de Flkl em membros não transgénicos da mesma ninhada era detectável nos vasos sanguíneos e, a teores inferiores, nos grandes neurónios motores. Em contraste, nos murganhos Thy-Flkl, estavam presentes teores elevados de Flkl nos grandes neurónios motores no corno ventral, para além da sua expressão em linha de base nas células endoteliais. Os murganhos Thy-Flkl com aspecto saudável e férteis foram cruzados com murganhos S0D1G93A. Era aparente que a sobre-expressão neuronal de Flkl nos murganhos SOD1g93a atrasava o início da incapacidade motor, de 23 dias, (N= 8; P<0,001) e os murganhos Thyl-Flkl: SOD1g93a mostravam um desempenho melhor do que os murganhos S0D1G93A durante 26 dias (N= 8; R<0,01) . Para além disto, os murganhos Thyl-Flkl: S0D1G93A sobreviviam mais 10 dias do que os da mesma ninhada que eram S0D1G93A (N= 8, R<0,05). Deste modo, estes factos genéticos indicam que o Flkl nos neurónios motores transmite sinais chave de sobrevivência de VEGF endógeno, atrasando deste modo a degeneração prematura dos neurónios motores na ALS. Obtiveram-se mais dados acerca do efeito neuroprotector de Flkl gerando murganhos transgénicos, utilizando a mesma cassete de expressão Thyl.2 para se conduzir a expressão neuronal de um Flkl dominante-negativo, que prejudica a sinalização de VEGF (FlklDN) . Os murganhos Thy-FlklDN também expressavam teores elevados do transgene FlklDN nos neurónios motores. Aos 3 meses de idade, os murganhos Thy-FlklDN eram saudáveis e férteis, e tinham força muscular, desempenho 25 motor e número de neurónios motores normais (neurónios motores de SMI32+/corno ventral: 31 ± 4,4 nos murganhos de tipo selvagem versus 2 9 ± 1,2 nos murganhos Thy-FlklDN; N= 4; P=NS) . Para se induzir stress nos neurónios motores, alojaram-se os murganhos, dia sim, dia não ao longo de 30 dias, numa câmara com 10 % de O2. A hipoxia intermitente crónica regulava os teores em VEGF em alta na medula espinal (pg de VEGF/yg de proteína: 12 ± 0,5 para a normoxia versus 22 ± 1,4 para a hipoxia; IV=5; P<0,05). Os murganhos de tipo selvagem toleravam a hipoxia sem qualquer problema e a força com que agarravam objectos até aumentava ligeiramente. Em contraste, os murganhos Thy-FlklDN perderam 25 % da força com que agarravam objectos na primeira semana de exposição a hipoxia e permaneceram mais fracos durante o resto da experiência. Uma análise histológica revelou uma gliose marcada na matéria cinzenta dos murganhos Thy-FlklDN, mas não nos murganhos de tipo selvagem (área GFAP+/matéria cinzenta no corno ventral: 0,13 ± 0,45 % no tipo selvagem versus 2,7 ± 0,45 % nos Thy-FlklDN; N= 3-5; P<0,05). Para além disto, os neurónios motores dos murganhos Thy-FlklDN, mas não nos dos de tipo selvagem, acumulavam neurofilamento fosforilado (neurónios SMI31+/10 secções do corno ventral: nenhum nos murganhos de tipo selvagem versus 15,3 ± 7,2 nos murganhos de tipo Thy-FlklDN; N=3-5; P<0,05). Estes factos ilustram portanto o facto de que o Flkl desempenha um papel protector crítico na manutenção dos neurónios motores dos adultos, em condições de stress hipóxico. 26

Materiais e Métodos 1. Produção de VEGFi64 recombinante de rato (VEGFi64)

Clonou-se cADN de VEGF164 amplificado a partir de uma biblioteca de cADN de rato no vector de secreção pPICZaA e expressou-se utilizando o sistema de expressão da levedura Pichia pastoris, de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Depois de uma diálise de um dia para o outro, do meio condicionado por levedura contra uma solução aquosa de ácido acético 10 mM (pH 5,5), purificou-se o VEGF por cromatografia sequencial sobre colunas em Phenyl-Sepharose 6 Phast-flow e de heparina-agarose (ambas de Amersham Pharmacia Biotech). Determinou-se a concentração em VEGF utilizando o Duoset ELISA de rato (R&D Systems, Abingdon, Reino Unido). Submeteu-se então o VEGF164 purificado a uma electroforese e contrastaram-se as bandas únicas de 45kDa ou 22kDa, respectivamente sob condições não redutoras e redutoras, que se visualizaram por contrastação dos geles com azul de Coommassie - e com prata. Confirmou-se que a banda se devia ao VEGF164 recombinante de rato por imunotransferência com um anticorpo monoclonal específico para rVEGFi64 (R&D Systems) e por sequenciação do terminal N recorrendo ao protocolo de degradação de Edman. Depois de uma digestão da banda proeminente de 45 kDa com tripsina, que foi seguida por uma separação dos péptidos clivados por dHPLC, seleccionaram-se 3 péptidos internos que se sequenciaram a 27 partir do terminal N de acordo com o protocolo de degradação de Edman. Todos estes três péptidos eram iguais aos da sequência de aminoácidos publicada do VEGF164. 2. Caracterização funcional do VEGF164

Comparou-se a ligação da nossa preparação de VEGF164 e receptores imobilizados rhFc-FLTl e rhFc-FLKl (R&D Systems) com a obtida com VEGFi64 de rato comercialmente disponível. Detectou-se o VEGF164 ligado utilizando anticorpos biotinilados contra VEGF anti-rato (R&D Systems; a 200 ng/mL), o estojo de contrastação do vector ABC e leituras fotoespectrométricas. O VEGFi64 feito por nós exibia uma maior afinidade em relação ao rhFc-FLKl e uma ligação semelhante ao rhFc-FLTl. Determinaram-se os teores em endotoxina utilizando o estojo de Lisado de Limulus Amebocyte (LAL) (Bio-Whittaker, Walkersville, EUA) que revelou a presença de 1 unidade de endotoxina por 350 pg de VEGF164 (ou 3 X 10”3 unidades de endotoxina por pg de VEGFi64) . 3. Experiências com marcadores radioactivos

Adquiriu-se 125I-VEGF humano marcado radioactivamente na Amersham Pharmacia, com uma actividade especifica de 25 pCi/pg VEGF16s. Dissolveram-se 100 ng desta preparação em 10 pL e injectaram-se estereotacticamente no ventrículo lateral esquerdo de ratos Wistar fêmea saudáveis utilizando uma agulha de Hamilton de Calibre 33 - as 28 coordenadas estereotácticas eram as mesmas que se utilizaram para a implantação da bomba osmótica (veja-se adiante) . Após a injecção ICV, dissectaram-se os ratos passadas 1, 3 e 24 horas, e pesaram-se em separado o cérebro, a medula espinal (dividida na medula espinal cervical, toráxica e lombar), o sangue e outros órgãos (figado, intestino, coração, etc...) , medindo-se para cada um as contagens totais por minuto (cpm), com um contador gama. Avaliou-se a distribuição de 125I-hVEGFi65 no parênquima cerebral por microauto-radiografia. Em primeiro lugar, mergulharam-se crio-secções do cérebro e da medula espinal, contendo VEGF165 marcado com 125I, numa emulsão fotográfica (Kodak, Cedex, França).Passados dois dias de exposição, revelaram-se as secções emulsionadas e utilizou-se a localização dos grãos de prata, detectados por microscopia no visível, para se determinar a distribuição do VEGF165 marcado com 125I pelo tecido. 4. Geração e caracterização dos murganhos transgénicos

Geraram-se murganhos transgénicos expressando Flk-1 especificamente nos neurónios adultos, utilizando a cassete de expressão do murganho Thyl.2, tal como se havia descrito acima59. Clonou-se o cADN de Flk-1 murino na cassete de expressão Thy-1., e microinjectou-se esta construção linearizada em embriões FvB de murganho utilizando técnicas de microinjecção habituais. Identificaram-se fundadores utilizando PCR e determinou-se 29 a expressão do transgene por RT-PCR, transferência Western e imunocontrastação, tal como se havia descrito anteriormente13'37. 5. Animais 0 Dr. Itoyama10 cedeu-nos amavelmente ratos Sprague-Dawley que expressavam o transgene humano SODlG93A (ratos SOD1g93a-L) , enquanto se cruzaram ratos que expressavam o transgene S0D1G93A humano mais do que 10 gerações sobre um fundo FvB e que foram amavelmente cedidos pelo Dr. C. Kunst60. Todas as experiências sobre animais foram aprovadas pela comissão de ética animal local. 6. Procedimentos cirúrgicos

Para se fazer uma infusão de VEGFi64 recombinante de rato no ventrículo cerebral dos ratos, utilizaram-se bombas osmóticas Alzet (modelo 2004) ligadas por um cateter a uma cânula para infusão cerebral. Encheu-se a montagem para infusão cerebral com 200 pL de uma solução de 5 pg/mL de VEGFi64 recombinante de rato ou com CSF artificial, e ferrou-se durante 48 h em soro salino. A composição do CSF artificial era de 150 mM em Na+, 3 mM em K+, 1,4 mM em Ca2+, 0,8 mM em Mg2+, 1 mM em P043", 155 mM em Cl'. Para a implantação das bombas, anestesiaram-se os ratos com halotano, praticou-se uma incisão pela linha média sagital iniciada logo atrás dos olhos, e expôs-se o crânio. Preparou-se uma bolsa subcutânea na área média escapular da 30 parte traseira do rato, e inseriu-se a bomba osmótica na bolsa. Furou-se um buraco através do crânio, e colocou-se a cânula utilizando as seguintes coordenadas estereotácticas: 0,8 mm posterior ao bregma, 1,6 mm lateral, e 4,5 mm ventral a partir da superfície do crânio. Quando se completou o processo de implantação, suturou-se a incisão feita na pele, e deixou-se o rato recuperar. Passados 28 dias, substituíram-se as bombas osmóticas esvaziadas por bombas osmóticas completamente cheias e ferradas. Para fazer isto, anestesiou-se de novo o rato e praticou-se uma pequena incisão na zona escapular média da parte traseira. Cortou-se o cateter 5 mm anterior à bomba já gasta, e ligou-se uma nova bomba à tubagem do cateter. Este processo origina uma infusão contínua de VEGF164 a uma velocidade de 0,25 pL/h (correspondendo a 1,25 ng VEGF/hora) no CSF. Num ensaio de prevenção, implantaram-se as bombas aos 60 dias de idade, e num ensaio de regressão, implantaram-se as bombas aos 80 dias (idade da primeira manifestação da doença). Expõem-se os murganhos a uma hipóxia intermitente crónica transferindo-os, dia sim, dia não, para uma câmara de oxigenação, contendo apenas 12 % de oxigénio. 7. Análise do Comportamento

Três vezes por semana, testou-se o desempenho motor dos ratos utilizando medições com o rotarod, um dinamómetro, e da actividade espontânea. Utilizou-se um rotarod para ratos (Ugo Basile, Comerio VA, Itália) com uma velocidade de rotação constante (15 rotações por minuto). 31

Determinou-se num dado dia a média de 5 ensaios com o período máximo de 180 segundos cada um. Quando o periodo de tempo médio que um rato conseguia permanecer sobre o rotarod era inferior a 120 segundos, considerava-se que tinha falhado o teste. Para o teste com o dinamómetro, obteve-se a média de 5 ensaios feitos com cada rato, e quando o rato era incapaz de puxar um peso médio 800 mg, considerava-se que tinha falhado. Para se quantificar a actividade espontânea, colocaram-se os ratos durante 3 horas numa jaula de medição da actividade (Ugo Basile), e determinou-se a sua actividade horária média, isto é, o número de vezes que o rato atravessava um feixe de raios infravermelhos posicionado 10 cm acima do chão da jaula. A titulo de critério para se classificar a idade em que surgia a primeira manifestação da doença nos ratos, utilizou-se o facto de se observar o arrastamento de uma pata. Nos estudos anteriores, classificava-se a incapacidade de o animal se endireitar depois de ter sido virado sobre qualquer um dos seus lados durante no máximo 30 segundos, como sendo uma "morte clinica"9. No entanto, as primeiras experiências revelaram que os ratos S0D1G93A, incapazes de se porem em pá, conseguiam sobreviver ainda diversos dias - e isto era em especial assim para os animais com a doença manifestada nas patas anteriores. Portanto classificámos a altura da morte como sendo a do dia em que os ratos haviam perdido 40 % da sua massa corporal inicial, na última ocasião isenta de sintomas, confirmada pelo seu aparecimento nos animais 24-36 horas depois. Os dados gerados pelos testes clinicos descritos e 32 os dados acerca da sobrevivência foram analisados utilizando a análise estatística de Kaplan Meyer ou utilizando um ANOVA para medidas repetidas (rotarod, dinamómetro e actividade).

8. Histologia, imunohistoquímica e testes ELISA

Sob anestesia profunda com Nembutal, efectuaram-se perfusões transcardíacas nos animais, com uma solução de 0,9 % de NaCl e em seguida com uma solução de paraformaldeído tamponizado com 1 % de fosfato. Dissectaram-se o cérebro e a medula espinal, fixaram-se a posteriori no mesmo agente de fixação de um dia para o outro, desidrataram-se e incorporaram-se em parafina. Cortaram-se séries de secções a espessuras de 20 ym no caso do cérebro e a 7 ym no caso da medula espinal. Para a imunohistoquímica, utilizaram-se anticorpos primários como se segue: anti-SMI-32 de murganho e anti-SMI-31 de murganho (ambos a 1:500, Sternberger Monoclonals) ; anti-GFAP de murganho (a 1:400, Sigma); anti-Glut-1 de cabra (a 1:20, Santa Cruz Biotechnology); anti-ubiquitina de coelho (a 1/100, Dako) e anti-albumina de coelho (a 1:250, ICN/Cappel). Para contagens de neurónios motores na medula espinal, contaram-se bilateralmente os neurónios positivos face a SMI-32 no corno ventral, em 5 secções com espaçamentos constantes, cobrindo uma distância total de 350 ym. Para se determinar o número de neurónios motores no núcleo facial, contrastou-se cada décima secção do tronco cerebral, e contaram-se todos os neurónios positivos para 33 SMI-32 na região do núcleo facial. Multiplicou-se este número por dez, para se estimar o número total de neurónios motores no núcleo facial. 9. Resposta imunológica

Os teores em VEGFi64 na medula espinal e no plasma eram inferiores ao limite de detecção por ELISA (32,5 pg/mL; R&D Systems) tantos nos murganhos tratados com aCSF como com VEGF (n=7 em cada grupo). Para detectar se existiam anticorpos anti-VEGF circulantes presentes nos ratos tratados com VEGF, revestiram-se placas de microtitulação com 96 poços de um dia para o outro com 100 pL de uma solução a 1 pg/mL de proteina VEGF164. Após incubação com plasma ou com CSF dos ratos tratados com aCSF e com VEGF, detectaram-se anticorpos anti-VEGFi64 ligados utilizando imunoglobulinas anti-rato marcadas com HRP (DAKO; 200 ng/mL), o estojo de contrastação de vectores ABC e uma leitura fotoespectrométrica. 10. Estatística

Utilizámos a versão 10 do SPSS para todos os cálculos estatísticos. Calcularam-se as estatísticas de sobrevivência acumulada utilizando as estatísticas de Kaplan-Meier. A actividade espontânea, no rotarod e os dados de perda de peso foram analisados utilizando ANOVA para medições repetidas. Utilizaram-se testes t de Student 34 para calcular as diferenças significativas para os estudos histológicos.

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Lisboa, 22 de Setembro de 2010.

Claims (9)

1 REIVINDICAÇÕES 1. VEGFigs para utilização para tratar uma doença dos neurónios motores, em que o VEGF165 referido seja continuamente administrado durante até pelo menos 4 semanas no local da primeira manifestação, a uma gama de dose de entre 0,01 yg/kg/dia e 0.6 yg/kg/dia.

2. VEGi65 para utilização e acordo com a reivindicação 1, em que a gama referida seja de entre 0,01 yg/kg/dia e 0,2 yg/kg/dia.

3. VEGF165 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a gama referida seja de entre 0,01 yg/kg/dia e 0,1 yg/kg/dia. de acordo com a seja de entre 0,01

4. VEGFies para utilização reivindicação 1, em que a gama referida yg/kg/dia and 0,08 yg/kg/dia.

5. VEGF165 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a gama referida seja de entre 0,01 yg/kg/dia e 0,06 yg/kg/dia.

6. VEGF165 para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a administração referida seja intratecal. 2

7. VEGFiss para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a administração referida seja intracerebroventricular.

8. VEGFies para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a administração continua referida de VEGF165 ocorra por intermédio de uma mini-bomba osmótica implantada.

9. VEGF165 para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que a doença dos neurónios motores referida seja a esclerose lateral amiotrófica. Lisboa, 22 de Setembro de 2010.