ES2226467T3 - Metodos para aliviar los sintomas del cancer. - Google Patents
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Abstract
Uso de un morfógeno que comprende una proteína dímera que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 70% de homología en aminoácidos o al menos 60% de identidad de aminoácidos con los residuos 330-431 de SEQ ID NO:2, pudiéndose medir los aminoácidos y la homología por el método de la matriz PAM250 descrito por Dayhoff y col [Atlas of Protein Sequence and Structure, volumen 5, 345-352 (1978)], en la preparación de un medicamento para aliviar los síntomas del cáncer, en donde el morfógeno inhibe el crecimiento de células cancerígenas.
Description
Métodos par aliviar los síntomas del cáncer.
El cáncer es una causa principal de muerte en
todo el mundo. Un rasgo característico del cáncer es un crecimiento
celular no regulado por señales externas. Las células cancerígenas
también pueden desarrollar la capacidad de metástasis y colonizar
sitios distantes. Véase en general, HARRISON'S PRINCIPLES OF
INTERNAL MEDICINE, 505 (Fauci y col., compiladores, 14ª ed., 1998).
El cáncer está lo más común en un tejido que tiene una tasa de
recambio celular relativamente rápida. En la mayoría de los casos,
existen dos tipos de células en esos tipos de tejidos: células
progenitoras que se dividen y células diferenciadas que no se
dividen. El término cáncer se refiere al crecimiento benigno en el
que las células se dividen sin regulación, pero no son capaces de
metástasis y al crecimiento maligno en el que las células se dividen
sin regulación y son capaces de metástasis.
En ausencia de enfermedad, tal como el cáncer, o
de trauma, una vez que una célula ha adquirido un estado
diferenciado particular, su destino es típicamente irreversible.
Los morfógenos se conocen por inducir la proliferación y la
diferenciación de células progenitoras en diversos tejidos. Los
morfógenos incluyen miembros de la familia de las proteínas
morfogenéticas del hueso (BMPs), identificadas por su capacidad
para inducir morfogénesis ectópica endocondrial del hueso. Los
morfógenos, también denominados proteínas osteogénicas, se
clasifican generalmente como un subgrupo de la superfamilia
TGF-\beta de factores de crecimiento. Hogan,
Genes & Development 10: 1580-1594
(1996). Los miembros de esta superfamilia incluyen la
proteína-1 osteogénica de mamíferos
(OP-1, también conocida como BMP-7 y
el homólogo 60A de Drosophila), la
proteína-2 osteogénica (OP-2,
también conocida como
\hbox{BMP-8),}la proteína-3 osteogénica (OP-3), BMP-2 (también conocida como BMP-2A o CBMP-2B y el homólogo DPP de Drosophila), BMP-3, BMP-4 (también conocida como BMP-2B o CBMP-2B), BMP-5, BMP-6 y su homólogo de múridos Vgr-1, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, GDF3 (también conocida como Vgr2), GDF8, GDF9, GDF10, GDF11, GDF12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, GDF-5 (también conocida como CDMP-1 o MP52), GDF-6 (también conocida como CDMP-2), GDF-7 (también conocida como CDMP-3), el homólogo de Xenopus Vg1 y NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP y NEURAL.
Los morfógenos comparten características
estructurales comunes. La forma madura es el resultado del
procesamiento a través de una "pro-forma" para
obtener un polipéptido maduro que contiene un dominio activo
carboxilo terminal de aproximadamente 97-106
aminoácidos. Todos los morfógenos comparten un patrón conservado de
cisteínas en este dominio. La forma activa es un homodímero unido
con un puente disulfuro de un miembro aislado de la superfamilia o
un heterodímero de dos miembros diferentes. Véase, p. ej.,
Massague, Annu. Rev. Cell Biol. 6:597 (1990); Sampath y
col., J. Biol. Chem. 265:13198 (1990).
Los esfuerzos para aliviar los síntomas del
cáncer se han dirigido frecuentemente de forma total o parcial, a
la escisión física de tejido cancerígeno, destrucción de tejido
cancerígeno inducida con radiación y destrucción de tejido
cancerígeno inducida con agentes químicos. Aunque estos modos de
tratamiento han proporcionado esperanzas a las personas que padecen
cáncer, tienen inconvenientes en muchos casos que incluyen la
invasividad (en el caso de escisión física), la citotoxicidad, la
producción de efectos secundarios graves en el paciente tratado, el
margen terapéutico limitado y la capacidad limitada para destruir
completamente un tejido cancerígeno. Adicionalmente, se han
realizado algunos esfuerzos menos tradicionales para desarrollar
agentes biológicos que regulan la maquinaria biológica del propio
hospedador, para responder a las células cancerígenas. Además, no
todos los agentes anti-cancerígenos son igualmente
eficaces sobre todos los tipos celulares. Por tanto, existe una
necesidad de agentes anti-cancerígenos que sean
capaces de aliviar los síntomas del cáncer que sean eficaces sobre
un amplio margen de tipos celulares (o, alternativamente, sobre un
nuevo grupo de tipos celulares o sobre un grupo diferente) y que
tengan menos problemas asociados con su uso que los agentes
anti-cancerígenos actuales.
La presente invención proporciona el uso de un
morfógeno tal y como se define en las reivindicaciones de la
presente solicitud, en la preparación de un medicamento para
aliviar los síntomas del cáncer. Muchos cánceres están
caracterizados por células que manifiestan un crecimiento irregular
con o sin la capacidad de metástasis en sitios adicionales por todo
el cuerpo. Un uso terapéutico de la invención para aliviar los
síntomas del cáncer es inhibir la proliferación irregular de
células cancerígenas. Los morfógenos (también conocidos como
proteínas morfogénicas del hueso, "BMPs" o "proteínas
morfogénicas") son una familia de proteínas capaces de alterar el
fenotipo celular en muchos tipos diferentes de células. En
particular, los morfógenos son capaces de estimular, mantener o
regenerar un fenotipo celular diferenciado. Se ha descubierto ahora
que la exposición de células cancerígenas a morfógenos inhibe el
crecimiento celular y causa que dichas células se diferencien
distanciándose del fenotipo cancerígeno. Por tanto, el uso de un
morfógeno puede influir en el destino de las células cancerígenas,
aliviando a su vez los síntomas del cáncer.
La presente invención es un acercamiento
alternativo a los métodos que se vienen usando normalmente para
tratar el cáncer y para aliviar los síntomas de esta enfermedad.
Los usos terapéuticos de la invención también reducen los efectos
secundarios observados típicamente con métodos convencionales de
quimioterapia para tratar el cáncer.
Los morfógenos son proteínas diméricas que tienen
una secuencia de aminoácidos con al menos 70% de homología con el
esqueleto de siete cisteínas C-terminales de
OP-1 humana que incluye los residuos
330-431 de la SEQ ID NO:2, o una secuencia de
aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad con este esqueleto
de siete cisteínas
C-terminales de la OP-1 humana, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7, que inhiben el crecimiento de células cancerígenas. Los morfógenos preferidos útiles en la invención incluyen, pero no están limitados a OP-1, OP-2, OP-3, BMP-2, BMP-3, BMP-3b, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-10, DPP, Vg1,
C-terminales de la OP-1 humana, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7, que inhiben el crecimiento de células cancerígenas. Los morfógenos preferidos útiles en la invención incluyen, pero no están limitados a OP-1, OP-2, OP-3, BMP-2, BMP-3, BMP-3b, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-10, DPP, Vg1,
\hbox{Vgr-1,}proteína 60A, CDMP-1, CDMP-2 (BMP-13), CDMP-3 (BMP-12), GDF-1, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-12, UNIVIN o SCREW y sus variantes de la secuencia de aminoácidos morfogenéticamente activa. En un aspecto preferido de la invención, el morfógeno está asociado no covalentemente con al menos un polipéptido pro-dominio seleccionado entre los pro-dominios de OP-1, OP-2, 60A, GDF-1, BMP-2A, BMP-2B, DPP, Vg1, Vgr-1, BMP-3, BMP-5 y BMP-6. En otro aspecto de esta invención, el morfógeno está asociado no covalentemente con más de un polipéptido pro-dominio de un morfógeno útil en las composiciones y en los métodos descritos en esta memoria.
En otro aspecto de la invención, el morfógeno se
formula con un soporte o vehículo farmacéuticamente aceptable. El
soporte o vehículo puede ser una solución acuosa fisiológicamente
aceptable, tal como solución salina o solución tampón (p. ej., una
solución salina tamponada con fosfato). El soporte o vehículo
comprende un liposoma o una microesfera que es biocompatible,
biodegradable y/o bioerosionable. Alternativamente, el soporte o
vehículo comprende una matriz biocompatible que es biodegradable o
bioerosionable. Los compuestos y las sustancias útiles como
matrices en la invención incluyen, sin limitación, materiales
proteináceos (p. ej., colágeno), mono y polisacáridos y sus
derivados (p. ej., carboximetil celulosa y ácido hialurónico),
polímeros sintéticos (p. ej., polímeros o copolímeros de poli(ácido
glicólico) y poli(ácido láctico)), compuestos que contienen calcio
(p. ej., hidroxiapatita o fosfato tricálcico) y sus
combinaciones.
En un aspecto de la invención, el morfógeno se
puede suministrar a una célula cancerígena en una célula que es
capaz de expresar el morfógeno. En otro aspecto de la invención, el
morfógeno se puede suministrar como un ADN no infeccioso y no
integrador que codifica dicho morfógeno que está ligado
funcionalmente con un promotor que dirige la expresión del
morfógeno en células de un tejido particular. En otro aspecto de la
invención, un elemento potenciador está asociado funcionalmente con
el promotor. En aún otra realización, el ADN que codifica un
morfógeno está ligado funcionalmente con un promotor. El ADN está
asociado con un liposoma, una microesfera o una partícula vírica que
facilita la absorción del ADN y la expresión del morfógeno por
células cancerígenas o por células vecinas no cancerígenas. Las
partículas víricas útiles para transducir el ADN que codifica el
morfógeno, a células cancerígenas o a células vecinas no
cancerígenas, incluyen partículas víricas
adeno-asociadas.
En una realización preferida, los síntomas del
cáncer se alivian en cáncer adrenal, cáncer de ano, cáncer de
vejiga, cáncer de huesos, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer
de cérvix, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer endocrino,
cáncer de esófago, cáncer de tubo de Falopio, cáncer de células
adiposas, cáncer de glándula biliar, cáncer de tracto
gastrointestinal, tumores de células germinales, cáncer de riñón,
leucemia, cáncer de hígado, linfoma, cáncer de pulmón, cáncer de
músculo, cáncer del sistema nervioso, cáncer de tejido ocular,
cáncer bucal (p. ej., lengua, tejido epitelial bucal), cáncer de
ovarios, cáncer pancreático, cáncer de próstata (dependiente de
andrógenos y no dependiente), cáncer rectal, cáncer de piel, cáncer
de intestino delgado, cáncer de tejidos blandos, cáncer de
estómago, teratocarcinoma (teratomas), cáncer testicular, cáncer de
tiroides, cáncer de uretra, cáncer urinario, cáncer uterino y
formas metastásicas de cáncer con sitio primario desconocido.
En una realización preferida de la invención, un
cáncer se trata mediante el uso terapéutico de un morfógeno, para
inhibir la proliferación irregular de células cancerígenas o para
estimular la diferenciación de células cancerígenas con un fenotipo
distinto del fenotipo del cáncer. En otro aspecto de la invención,
los morfógenos se emplean para tratar el cáncer para aliviar otros
síntomas de cáncer que comprenden hemorragias anormales, función
anormal del cuerpo, morfología celular anormal, niveles enzimáticos
anormales, niveles hormonales anormales, niveles de antígeno
oncofetal anormales, crecimiento anormal del tejido, masa de tejido
anormal, niveles anormales de proteínas asociadas con tumores,
función neurológica alterada, estructura neurológica alterada,
angiogénesis, diarrea, efusiones, fatiga, fiebre, lesiones,
malnutrición, metástasis, nausea, obstrucción de una vía corporal,
infección oportunista, dolor, índice de Karnofsky bajo, presencia
de marcadores de la superficie celular, presencia de marcadores
histológicos cancerígenos, presencia de marcadores intracelulares,
presencia de marcadores moleculares, invasión tumoral, frecuencia
urinaria, pérdida de peso y combinaciones de las mismas. La
inhibición de la proliferación se puede medir, por ejemplo, mediante
tasas de supervivencia incrementadas, tamaño reducido del tumor o
regresión tumoral.
En otro aspecto de la invención, la expresión de
receptores de proteína morfogénica ósea (BMPRs) sobre células
cancerígenas diana proporciona un medio para determinar la
probabilidad del tejido de responder al tratamiento con morfógenos.
En una realización preferida, las células malignas diana en un
paciente se escrutan previamente en busca de expresión de BMPRs para
facilitar la selección de pacientes con alta probabilidad de
respuesta a un tratamiento dado con BMP.
En otro aspecto de esta invención, los morfógenos
inhiben el crecimiento celular tal y como se mide, por ejemplo,
mediante la incorporación celular de
[^{3}H]-timidina en un ensayo in vitro,
encogimiento del tamaño del tumor o disminución de la expresión de
antígenos asociados con el cáncer. En otro aspecto de la invención,
el morfógeno estimula células cancerígenas para una diferenciación
distanciándose del fenotipo de cáncer, por ejemplo, tal y como se
indica con una expresión disminuida de los antígenos asociados con
el cáncer, un cambio en la morfología celular o una expresión
aumentada de marcadores antigénicos o bioquímicos asociados con un
fenotipo celular diferenciado preferido. En otro aspecto de esta
invención, los morfógenos se pueden aplicar a un tejido afectado
que se ha separado del hospedador en un protocolo ex vivo.
En los usos terapéuticos de la invención, el morfógeno se puede
emplear junto con uno o varios agentes no morfógenos, tales como
agentes anti-cancerígenos conocidos, analgésicos o
compuestos anti-inflamatorios.
Otra realización preferida de la invención
comprende el uso terapéutico de una variante de aminoácido
morfogénicamente activo, de un morfógeno presente en la naturaleza,
cuya variante entre dentro de la definición de "morfógeno"
proporcionada en la reivindicación 1, para aliviar un síntoma de
cáncer. Tales variantes incluyen variantes alélicas presentes en la
naturaleza, variantes con sustituciones conservadas de aminoácidos,
variantes de fragmentos peptídicos y variantes de sustituciones de
aminoácidos conservados de fragmentos peptídicos que inhiben el
crecimiento de células cancerígenas.
Otra realización preferida de la invención
comprende el uso terapéutico definido en la reivindicación 1, en
donde el morfógeno inhibe la incorporación celular de
[^{3}H]-timidina en un ensayo in vitro. En
otro aspecto de la invención, el morfógeno es una proteína
morfogénica ósea o una variante de aminoácido morfogénicamente
activa de una proteína morfogénica ósea. Las variantes incluyen una
variante alélica presente en la naturaleza de una proteína
morfogénica ósea, una variante de una sustitución conservada de
aminoácidos de una proteína morfogénica ósea, una variante de un
fragmento peptídico de una proteína morfogénica ósea y una variante
de una sustitución conservada de aminoácidos de una variante de un
fragmento peptídico.
La invención se entenderá adicionalmente con los
siguientes dibujos, la descripción y las reivindicaciones.
Las Figs. 1A-1M son alineaciones
tabulares de las secuencias de aminoácidos de distintos morfógenos
presentes en la naturaleza con una secuencia de referencia
preferida de OP-1 humana, los residuos
330-431 de SEQ ID NO:2.
Las Figs. 2A-2B son
presentaciones tabulares de aminoácidos alternativos para las
posiciones "Xaa" en las secuencias genéricas SEQ ID NO: 4, 5 y
8 que representan variaciones de aminoácidos en morfógenos
conocidos.
Las Figs. 3A-3C son
presentaciones tabulares de aminoácidos alternativos para las
posiciones "Xaa" en las secuencias genéricas SEQ ID NO: 6, 7 y
9 que representan variaciones de aminoácidos en morfógenos
conocidos.
La Fig. 4 es una presentación tabular de
aminoácidos alternativos para las posiciones "Xaa" en la
secuencia genérica SEQ ID NO: 3 que representa variaciones de
aminoácidos en diferentes variantes alélicas y filogenéticas
identificadas de OP-1 y OP-2.
Las Figs. 5A-5B ilustran la
capacidad del morfógeno (OP-1) para inducir células
NG108 no diferenciadas (Fig. 5A) para sufrir diferenciación de
morfología neural (Fig. 5B).
Las Figs. 6A-6D muestran el
efecto del morfógeno (OP-1) sobre la
rediferenciación de células de carcinoma de embriones humanos.
La Fig. 7 muestra el efecto del morfógeno
(BMP-6 o OP-1
(BMP-7)), activina o TFG-\beta1
sobre el crecimiento celular de células LNCaP de cáncer de próstata
sensibles a andrógenos y no estimuladas.
La Fig. 8 muestra el efecto del morfógeno
(BMP-6 u OP-1
(BMP-7)), activina o TFG-\beta1
sobre el crecimiento celular de células LNCaP de cáncer de próstata
sensibles a andrógenos y estimuladas.
La Fig. 9 muestra el efecto de la folistatina
sobre la bioactividad de los morfógenos (BMP-6 u
OP-1 (BMP-7)) o de la activina en
células LNCaP de cáncer de próstata sensibles a andrógenos.
Las Figs. 10A-10B muestran el
efecto de morfógeno (OP-1) o
TGF-\beta1 sobre el crecimiento celular de
células MCF-7 de cáncer de mama humano sensibles a
estrógenos, en ausencia (Fig. 10A) o en presencia (Fig. 10B) de
medio que contiene 5% de suero.
Las Figs. 11A-11B muestran el
efecto del morfógeno (OP-1) sobre el crecimiento
celular de células MCF-7 de cáncer de mama humanas
sensibles a estrógenos, estimuladas con
17\beta-estradiol o no estimuladas (Fig. 11A) y el
efecto de TGF-\beta1 sobre el crecimiento celular
de células MCF-7 de cáncer de mama humanas
sensibles a estrógenos, estimuladas con
17\beta-estradiol o no estimuladas (Fig.
11B).
La Fig. 12 muestra el efecto del morfógeno
(OP-1), tamoxifeno o ambos combinados, sobre el
crecimiento celular de células MCF-7 de cáncer de
mama humanas sensibles a estrógenos.
La Fig. 13 muestra el efecto del morfógeno
(OP-1) sobre el crecimiento celular de células
A-172 de glioblastoma humano.
La Fig. 14 muestra el efecto del morfógeno
(OP-1) o TGF-\beta2 sobre el
crecimiento celular de células A-549 de carcinoma
pulmonar humano.
La Fig. 15 muestra la expresión de tres BMPRs en
las líneas celulares de cáncer de próstata en múridos E4 y F11.
La Fig. 16 muestra el efecto del morfógeno
(BMP-6) sobre el crecimiento celularen las líneas
celulares de cáncer de próstata en múridos E4 y F11.
La Fig. 17 muestra el efecto del morfógeno
(BMP-6) sobre el volumen tumoral en ratones con
xenoinjertos de cáncer de próstata.
La Fig. 18 muestra el efecto del morfógeno
(BMP-6) sobre el volumen tumoral en ratones con
xenoinjertos de cáncer de próstata, corregidos para animales
supervivientes.
Las Figs. 19A-19B muestran la
necrosis y la inflamación difusa en tumores tratados con morfógeno
(BMP-6) comparados con tumores testigos.
La presente invención proporciona el uso
terapéutico de morfógenos que inhiben la proliferación incontrolada
de células cancerígenas, estimulan la diferenciación de células
cancerígenas que se distancian de su fenotipo cancerígeno
particular, o alivian otros síntomas diversos de un cáncer. Muchos
cánceres están caracterizados por células que presentan un
crecimiento no regulado con o sin la capacidad de metástasis en
sitios adicionales por todo el organismo. Un uso terapéutico de la
invención para aliviar los síntomas del cáncer es detener el
crecimiento y la división de las células cancerígenas. Los
morfógenos son capaces de diferenciar células progenitoras (es
decir, células que se dividen). La exposición a morfógenos inhibe
el crecimiento de células cancerígenas. Por tanto, el uso
terapéutico de un morfógeno influye sobre el destino de las células
cancerígenas y a su vez, alivia diversos síntomas característicos
del cáncer.
La transducción de las señales de BMP sigue el
paradigma establecido para la señalización de
TGF-\beta. Del mismo modo que con
TGF-\beta, las BMPs señalizan a través de una
interacción con un complejo heterómero de los receptores de la
membrana, de tipo I y de tipo II. Específicamente, la unión de
ligandos tiene lugar en una fosforilación cruzada del receptor de
tipo I con el receptor de tipo II; el receptor de tipo II a su vez
propaga la señalización de BMP. Véase, Yamashita y col., Bone
19:569-574 (1996). Experimentos in vitro
han mostrado que todos los miembros de BMP que pertenecen a la
superfamilia de TGF-\beta, se unen a
BMPR-II junto con BMPR-IA o IB.
Véase, Yamashita y col., supra. Por tanto,
BMPR-IA, BMPR-IB y
BMPR-II parecen ser receptores específicos de BMP y
son adecuados para mediar en la inhibición con morfógenos del
crecimiento de células cancerígenas.
En su forma madura, natural, el morfógeno de
fuentes naturales es un dímero glicosilado que tiene típicamente un
peso molecular real de aproximadamente 30-36 kDa,
tal y como se determina por SDS-PAGE. Cuando está
reducida, la proteína de 30 kDa proporciona dos subunidades
peptídicas glicosiladas que tienen pesos moleculares reales de
aproximadamente 16 kDa y 18 kDa. En el estado reducido, la proteína
no tiene actividad osteogénica detectable. La proteína no
glicosilada que también tiene actividad osteogénica, tiene un peso
molecular real de aproximadamente 27 kDa. Cuando está reducida, la
proteína de 27 kDa proporciona dos cadenas polipeptídicas no
glicosiladas que tienen pesos moleculares de aproximadamente 14 kDa
a 16 kDa. Típicamente, las proteínas osteogénicas presentes en la
naturaleza se traducen como un precursor que tiene la secuencia del
péptido señal N-terminal, típicamente con menos de
aproximadamente 30 residuos, seguida de un "pro"-dominio que se
corta para conseguir el dominio
C-terminal maduro. El péptido señal se corta rápidamente después de la traducción, en un sitio de corte que se puede pronosticar en una secuencia dada, empleando el método de Von Heijne, Nucleic Acids Res. 14:4683-4691 (1986). El pro-dominio es típicamente aproximadamente tres veces más largo que el dominio C-terminal maduro procesado de forma ondulada.
C-terminal maduro. El péptido señal se corta rápidamente después de la traducción, en un sitio de corte que se puede pronosticar en una secuencia dada, empleando el método de Von Heijne, Nucleic Acids Res. 14:4683-4691 (1986). El pro-dominio es típicamente aproximadamente tres veces más largo que el dominio C-terminal maduro procesado de forma ondulada.
Los morfógenos útiles en los métodos de la
invención se definen por una secuencia de aminoácidos que tiene al
menos 70% de homología con el esqueleto de siete cisteínas,
C-terminal de OP-1 humana, los
residuos 330-431 de SEQ ID NO:2, o que tienen al
menos 60% de identidad con este esqueleto de siete cisteínas,
C-terminal de OP-1 humana y que
tiene la capacidad de estimular la formación ósea endocondrial en
el bioensayo descrito por Sampath y Reddi (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 80:6591-6595 (1983) y en el documento
de patente de EE.UU. nº 4.968.590) cuyas descripciones se
incorporan en esta memoria como referencia. Los morfógenos incluyen
también sustancias capaces de inducir otros morfógenos y son
capaces de unirse a receptores de morfógenos y que son capaces de
actividad de tipo agonista en los receptores de morfógenos. Estas
sustancias se pueden someter a ensayo para estudiar las capacidades
morfogénicas según métodos conocidos en la técnica.
Los morfógenos preferidos incluyen los que
comprenden las secuencias de aminoácidos
C-terminales 96 o 102 de DPP (de Drosophila),
Vg1 (de Xenopus), Vgr-1 (de ratón), las proteínas
OP-1 y OP-2 (véase el documento de
patente de EE.UU. nº 5.011.691 y Oppermann y col.), así como las
proteínas referidas como BMP-2,
BMP-3, BMP-4 (véanse los documentos
WO88/00205, la patente de EE.UU. nº 5.013.649 y WO91/18098),
BMP-5 y BMP-6 (véase WO90/1 1366,
PCT/US90/01630) y BMP-8. Otras proteínas útiles en
la práctica de la invención incluyen formas activas de
OP-1, OP-2, OP-3,
BMP-2, BMP-3, BMP-4,
BMP-5, BMP-6, GDF-5,
GDF-6, GDF-7, DPP, Vg1, Vgr,
proteína 60A, CDMP-1, CDMP-2
(BMP-13), CDMP-3
(BMP-12), GDF-1,
GDF-3, GDF-5, GDF-6,
GDF-7, EMP-10, UNIVIN o SCREW y sus
variantes de secuencias de aminoácidos. En una realización
normalmente preferida las proteínas osteogénicas incluyen una
cualquiera entre: OP-1, OP-2,
OP-3, BMP-2, BMP-4,
BMP-5, BMP-6 y sus variantes y
homólogos de la secuencia de aminoácidos, que incluyen homólogos de
especies de los mismos. Publicaciones que describen las secuencias
de OP-1 y OP-2, así como sus
propiedades químicas y físicas, incluyen los documentos de patentes
de EE.UU. nº 5.011.691 y 5.266.683.
En realizaciones preferidas, los morfógenos para
uso en métodos de la invención incluyen proteínas que tienen al
menos 70% de homología con la secuencia de aminoácidos del
esqueleto de siete cisteínas C-terminal de
OP-1 humana, SEQ ID NO:2, y que tienen la capacidad
de inducir la formación ósea endocondrial en el ensayo de Reddi y
Sampath. Los compuestos que reúnen estas condiciones se consideran
funcionalmente equivalentes a un morfógeno con respuesta conocida.
Para determinar si un candidato peptídico es equivalente
funcionalmente a un morfógeno de referencia, la secuencia de
aminoácidos candidata y la secuencia de aminoácidos del morfógeno
de referencia se alinean. La primera etapa para realizar una
alineación es emplear una herramienta de alineación, tal como un
algoritmo de programación dinámica, descrito por Needleman y col.,
J. Mol. Biol. 48:443 (1970), y el programa Align, un paquete
de un programa comercial producido por DNAstar, Inc. Después de la
alineación inicial, ésta se depura a continuación comparando con
una alineación de secuencias múltiples de una familia de proteínas
relacionadas, tales como las mostradas en las Figs. 1A a 1M, que es
una alineación de secuencias múltiples de una familia de morfógenos
conocidos que incluyen hOP-1. Una vez realizada y
depurada la alineación entre las secuencias candidatas y de
referencia, se calcula el índice del porcentaje de homología. Los
aminoácidos individuales de cada secuencia se comparan
secuencialmente de acuerdo con su semejanza entre sí. Los factores
de semejanza incluyen un tamaño, una forma y una carga eléctrica
similares. Un método particularmente preferido para determinar las
semejanzas entre aminoácidos es la matriz PAM250 descrita por
Dayhoff y col., 5 ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE
345-352 (1978 & Sup.) Un índice de semejanza se
calcula en primer lugar como la suma de los índices de semejanzas
de los aminoácidos alineados por parejas. Las inserciones y las
deleciones se ignoran para los fines del porcentaje de homología e
identidad. Por tanto, en este cálculo no se emplean sanciones por
huecos. El índice bruto se normaliza a continuación dividiéndolo
por la media geométrica de los índices del compuesto candidato y el
esqueleto de siete cisteínas de hOP-1. La media
geométrica es la raíz cuadrada del producto de estos índices. El
índice bruto normalizado es el porcentaje de homología.
En una realización alternativa preferida, un
péptido candidato que es funcionalmente equivalente a un morfógeno
de referencia tiene una secuencia de aminoácidos que comparte al
menos 60% de la identidad de aminoácidos con la secuencia de
referencia y tiene la capacidad de inducir la formación ósea
endocondrial en el ensayo de Reddi y Sampath. Una identidad de
aminoácidos del sesenta por ciento significa que cualquier 60% de
los aminoácidos del péptido candidato es idéntico cuando se alinea
a los aminoácidos correspondientes en la secuencia de referencia.
Uno cualquiera o varios de los morfógenos presentes en la
naturaleza o biosintéticos, descritos en esta memoria, se puede
utilizar como secuencia de referencia para determinar si una
secuencia candidata entra en la familia de los morfógenos. En una
realización preferida, la secuencia de referencia es la secuencia
del esqueleto de siete cisteínas C-terminal de
OP-1 humana, tal y como se muestra en la SEQ ID
NO:2. Ejemplos de sustituciones conservadoras para uso en los
cálculos anteriores, incluyen la sustitución de un aminoácido por
otro con características similares, p. ej., las sustituciones en
los siguientes grupos son bien conocidas: (a) valina, glicina; (b)
glicina, alanina; (c) valina, isoleucina, leucina; (d) ácido
aspártico, ácido glutámico; (e) asparagina, glutamina; (f) serina,
treonina; (g) lisina, arginina, metionina; y (h) fenilalanina,
tirosina. La expresión "variante conservada" o "variación
conservada" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en
lugar de un aminoácido precursor no sustituido, en una cadena
polipeptídica dada, con la condición de que los anticuerpos que
tienen especificidad de unión a la cadena polipeptídica resultante
sustituida también tengan especificidad de unión (es decir,
"reacción cruzada" o "inmunorreacción") al polipéptido no
sustituido o precursor.
En una realización preferida, los morfógenos
útiles en la presente invención de acuerdo con la reivindicación 1,
pueden estar definidos simultáneamente por una secuencia de
aminoácidos genérica que representa variaciones en morfógenos
conocidos. Por ejemplo, SEQ ID NO:4 y 5 presentan las variaciones
observadas entre los morfógenos preferidos, incluyendo
OP-1, OP-2, OP-3,
CBMP-2A, CBMP-2B,
BMP-3, BMP-5, BMP-6,
DPP, Vg1, Vgr-1, 60A y GDF-1. La SEQ
ID NO:5 incluye todos los de SEQ ID NO:4 y también incluye en su
extremo N-terminal la secuencia de cinco
aminoácidos de SEQ ID NO:8. Las secuencias genéricas incluyen la
identidad de aminoácidos compartida por estas secuencias en el
dominio C-terminal, definida por los esqueletos de
seis y siete cisteínas (SEQ ID NO:4 y 5, respectivamente), y los
aminoácidos alternativos para posiciones variables en la secuencia.
Las posiciones que permiten aminoácidos alternativos están
representadas por "Xaa". La Fig. 2 muestra los aminoácidos
alternativos para cada posición "Xaa" en las SEQ ID NOs: 4, 5
y 8. Por ejemplo, haciendo referencia a SEQ ID NO:4 y la Fig. 2A,
"Xaa" en la posición 2 puede ser una tirosina o una lisina.
Las secuencias genéricas proporcionan un esqueleto de cisteínas
adecuado para enlaces disulfuro intermoleculares o intramoleculares
y contienen ciertos aminoácidos críticos con probabilidad de
influir en la estructura terciaria de las proteínas. Además,
"Xaa" en la posición 36 en la SEQ ID NO:4 o en la posición 41
en SEQ ID NO:5 puede ser una cisteína adicional, incluyendo, por
tanto, las secuencias morfogénicamente activas de
OP-2 y OP-3.
En otra realización, los morfógenos útiles según
la reivindicación 1, pueden estar definidos simultáneamente por SEQ
ID NO: 6 ó 7, que son secuencias de aminoácidos compuestas de los
siguientes morfógenos: OP-1 humana,
\hbox{OP-2}humana, OP-3 humana, BMP-2 humana, BMP-3 humana, BMP-4 humana, BMP-5 humana, BMP-6 humana,
\hbox{BMP-8}humana, BMP-9 humana, BMP-10 humana, BMP-11 humana, 60-A de Drosophila, Vg-1 de Xenopus, UNIVIN de erizo de mar, CDMP-1 humana (GDF-5 de ratón, MP52), CDMP-2 humana (GDF-6 de ratón, BMP-13 humana), CDMP-3 humana (GDF-7 de ratón, BMP-12 humana), GDF-3 de ratón, GDF-1 humana, GDF-1 de ratón, DORSALIN de pollo, dpp de Drosophila, SCREW de Drosophila, NODAL de ratón, GDF-8 de ratón, GDF-8 humana, GDF-9 de ratón, GDF-10 de ratón, GDF-11 humana, GDF-11 de ratón, BMP-15 humana y BMP-3b de rata. La SEQ ID NO:7 incluye todas las de SEQ ID NO:6 y también incluye en su extremo N-terminal la secuencia de cinco aminoácidos de SEQ ID NO:9. SEQ ID NO:6 acomoda el esqueleto de seis cisteínas C-terminal y SEQ ID NO:7 acomoda el esqueleto de siete cisteínas. Las posiciones que permiten aminoácidos alternativos se representan con "Xaa". Las Figs. 3A-3C muestran los aminoácidos alternativos para cada posición "Xaa" en SEQ ID NO: 6, 7 y 9.
Tal y como se ha indicado anteriormente, ciertas
secuencias preferidas de morfógenos útiles en esta invención tienen
más de 60% de identidad, preferentemente más de 65% de identidad
con la secuencia de aminoácidos que define la secuencia de
referencia preferida de hOP-1. Estas secuencias
particularmente preferidas incluyen variantes alélicas y
filogenéticas de las proteínas OP-1 y
OP-2, incluyendo la proteína 60A de
Drosophila, así como las proteínas estrechamente
relacionadas BMP-5, BMP-6 y
Vgr-1. Por tanto, en ciertas realizaciones
particularmente preferidas, los morfógenos útiles de acuerdo con la
reivindicación 1, se pueden definir simultáneamente por la
secuencia de aminoácidos genérica SEQ ID NO:3 (referida en esta
memoria como "OPX") que define el esqueleto de siete cisteínas
y acomoda las homologías entre diversas variantes identificadas de
OP-1 y OP-2. Las posiciones que
permiten aminoácidos alternativos se representan por "Xaa". La
Fig. 4 muestra los aminoácidos alternativos para cada posición
"Xaa" en SEQ ID NO:3. En aún otra realización preferida, los
morfógenos útiles de acuerdo con la reivindicación 1, incluyen los
que tienen una secuencia de aminoácidos codificada por un
polinucleótido que se hibrida bajo condiciones de alta restricción
con ADN o ARN que codifica un morfógeno de referencia. Las
condiciones de restricción convencionales están bien caracterizadas
en textos de biología molecular convencionales. Véase, en general
MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, (Sambrook y col.,
compiladores, 1989); DNA CLONING,
\hbox{Vol I & II}(D.N. Glover compilador, 1895); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J. Gait, compilador, 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D. Hames & S.J. Higgins, compiladores, 1984); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984).
En otra realización, los morfógenos útiles en la
invención incluyen la forma del complejo soluble que comprende un
dímero del morfógeno maduro, de acuerdo con la reivindicación 1,
enlazado a un pro-dominio del morfógeno o a un
fragmento que potencia la solubilidad del mismo. Un fragmento que
potencia la solubilidad es cualquier fragmento
N-terminal o C-terminal de un pro-dominio del morfógeno que forma un complejo con el dímero maduro del morfógeno y que incrementa la solubilidad del dímero del morfógeno. Preferentemente, el complejo soluble comprende un dímero del morfógeno y dos péptidos del pro-dominio. El complejo soluble del morfógeno está descrito en el documento de solicitud de patente internacional WO 94/03600.
N-terminal o C-terminal de un pro-dominio del morfógeno que forma un complejo con el dímero maduro del morfógeno y que incrementa la solubilidad del dímero del morfógeno. Preferentemente, el complejo soluble comprende un dímero del morfógeno y dos péptidos del pro-dominio. El complejo soluble del morfógeno está descrito en el documento de solicitud de patente internacional WO 94/03600.
En aún otra realización, los morfógenos útiles
incluyen estructuras artificiales biosintéticas y biológicamente
activas que caen dentro de la definición de "morfógeno" de la
reivindicación 1, que incluyen nuevos morfógenos biosintéticos y
proteínas quiméricas diseñadas empleando secuencias de uno o varios
morfógenos conocidos. Véase el documento de patente de EE.UU. nº
5.011.691 (p. ej., COP-1, COP-3,
COP-4, COP-5, COP-7
y COP-16).
De modo general, los usos terapéuticos de la
presente invención se pueden aplicar al tratamiento de cualquier
mamífero que padezca cáncer. Una persona experta en las técnicas
médicas o veterinarias está preparada para reconocer si un mamífero
padece cáncer. Por ejemplo, ensayos de rutina y/o la evaluación
clínica o veterinaria de diagnósticos revelarán si el mamífero tiene
alguno de los síntomas del cáncer. Los síntomas del cáncer incluyen
una proliferación irregular de células y/o una proliferación de
células que tienen un fenotipo de célula cancerígena. Otros
síntomas comunes del cáncer incluyen una función corporal anormal,
morfología celular anormal, niveles enzimáticos anormales, niveles
hormonales anormales, niveles de antígenos oncofetales anormales,
crecimiento anormal del tejido, masa de tejido anormal, niveles
anormales de proteínas asociadas con tumores, función neurológica
alterada, estructura neurológica alterada, angiogénesis no deseada
que proporciona un tumor con un suplemento sanguíneo, hemorragias
anormales, diarrea, efusiones, fatiga, fiebre, lesiones,
malnutrición, metástasis, nausea, obstrucción de una vía corporal,
infección oportunista, dolor, índice de Karnofsky bajo, presencia de
marcadores de la superficie celular asociados al cáncer, presencia
de marcadores histológicos asociados al cáncer, presencia de
marcadores intracelulares asociados al cáncer, presencia de
marcadores moleculares asociados al cáncer, invasión tumoral,
frecuencia urinaria y pérdida de peso. Véase en general, HARRISON'S
PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE 493-627 (Fauci y
col., compiladores, 14º ed. 1998).
El cáncer puede afectar a cualquier tejido en el
cuerpo. Sin embargo, tal y como se ha descrito anteriormente,
algunos sitios de los tejidos son más probables de estar afectados
por el cáncer. Algunos de los cánceres más comunes para los cuales
se anticipa el tratamiento con las composiciones y los métodos de la
presente invención, incluyen el cáncer adrenal, cáncer anal, cáncer
de vejiga, cáncer óseo, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer de
cérvix, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer endocrino,
cáncer de esófago, cáncer de tubo de Falopio, cáncer de células
adiposas, cáncer de glándula biliar, cáncer del tracto
gastrointestinal, tumores de células germinales, cáncer de riñón,
leucemia, cáncer de hígado, linfoma, cáncer de pulmón, cáncer de
músculo, cáncer del sistema nervioso, cáncer del tejido ocular,
cáncer bucal, cáncer de ovarios, cáncer pancreático, cáncer de
próstata, cáncer rectal, cáncer de piel, cáncer de intestino
delgado, cáncer de tejidos blandas, cáncer de estómago,
teratocarcinoma (teratomas), cáncer testicular, cáncer de tiroides,
cáncer de uretra, cáncer urinario, cáncer uterino y cáncer
metastásico con sitio primario desconocido. Véase en general,
HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE, 493-627
(Fauci y col., compiladores, 14ª ed., 1998).
El crecimiento de las células cancerígenas está
tipificado por una falta de respuesta general a las señales
extracelulares. Sin embargo, de acuerdo con la presente invención,
se ha descubierto ahora que los morfógenos pueden regular el
crecimiento de las células cancerígenas. Tal y como se ha descrito
anteriormente, los BMPRs median en la señalización de BMP. Por
ejemplo, en el cáncer de próstata, se ha observado que
BMP-2 disminuye la tasa de proliferación de células
LNCaP (véase, ten Dikje y col., J. Biol. Chem.
269:16985-988 (1984)). También se ha observado
que la próstata expresa niveles muy altos de
BMPR-IB (véase, Ide y col., Oncogene
14:1377-382 (1977); Autzen y col.,
Br. J. Cancer 78:1219-223 (1998)). De acuerdo con la presente invención, se ha mostrado ahora que BMP-6 inhibe el crecimiento de xenoinjertos de tumores de próstata en múridos que expresan los tres tipos de BMPRs (véase el Ejemplo 7, a continuación). Por tanto, la determinación de la expresión de BMPRs sobre las células malignas convertidas en dianas representa un nuevo medio para escrutar previamente a un individuo, para permitir la selección de individuos con alta probabilidad de responder a un morfógeno dado. Las células convertidas en diana se pueden obtener a partir de un paciente y la expresión de BMPRs específicos se puede determinar, por ejemplo, mediante aislamiento de ARN mensajero y análisis por transferencia de tipo Northern. Un morfógeno adecuado se puede seleccionar a continuación, lo que proporcionará lo más probable un tratamiento eficaz, basado en la expresión de BMPR en las células hechas diana. Alternativamente, los pacientes con una baja probabilidad de responder al tratamiento con morfógenos, basada en la ausencia de expresión de BMPR requerida en el tejido hecho diana, se pueden referir para terapias alterna-
tivas.
Br. J. Cancer 78:1219-223 (1998)). De acuerdo con la presente invención, se ha mostrado ahora que BMP-6 inhibe el crecimiento de xenoinjertos de tumores de próstata en múridos que expresan los tres tipos de BMPRs (véase el Ejemplo 7, a continuación). Por tanto, la determinación de la expresión de BMPRs sobre las células malignas convertidas en dianas representa un nuevo medio para escrutar previamente a un individuo, para permitir la selección de individuos con alta probabilidad de responder a un morfógeno dado. Las células convertidas en diana se pueden obtener a partir de un paciente y la expresión de BMPRs específicos se puede determinar, por ejemplo, mediante aislamiento de ARN mensajero y análisis por transferencia de tipo Northern. Un morfógeno adecuado se puede seleccionar a continuación, lo que proporcionará lo más probable un tratamiento eficaz, basado en la expresión de BMPR en las células hechas diana. Alternativamente, los pacientes con una baja probabilidad de responder al tratamiento con morfógenos, basada en la ausencia de expresión de BMPR requerida en el tejido hecho diana, se pueden referir para terapias alterna-
tivas.
En el uso de la presente invención, morfógenos o
morfógenos combinados con uno o varios agentes en la presente
invención, pueden ser adecuados para la administración por
cualquier vía compatible. Por ejemplo, los morfógenos pueden ser
adecuados para un suministro directo (p. ej., localmente, tal como
por inyección, implantación o administración tópica en un lugar de
tejido), sistémico (p. ej., parenteral u oralmente), externo (p.
ej., una bolsa intravenosa) o interno (p. ej., un implante
bioerosionable o una colonia de células implantadas que producen
morfógeno) y, una vez suministrados son capaces de inhibir la
proliferación de células cancerígenas y/o la estimulación de la
diferenciación de células que tienen un fenotipo de célula
cancerígena. En una realización preferida, directamente después de
la inyección de morfógenos en el tejido tumoral, el morfógeno da
como resultado la necrosis del tumor y una inflamación difusa. El
agente comprende preferentemente parte de una suspensión o solución
fluida, acuosa o fisiológicamente compatible para una administración
parenteral, tal como por vía intravenosa, subcutánea,
intramolecular, oftálmica, intraperitoneal, intramuscular, bucal,
rectal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intracraneana,
intraespinal, intraventricular, intratecal, intracisternal,
intracapsular, intranasal o con aerosol. El soporte o el vehículo
del morfógeno es fisiológicamente aceptable de modo que el
suministro del agente deseado al paciente, no debe afectar
adversamente de otro modo al equilibrio de electrolitos y/o del
volumen del paciente. El medio fluido para el agente puede
comprender, por tanto, una solución salina fisiológicamente normal
(p. ej., 9,85% de NaCl acuoso, 0,15 M, pH 7-7,4).
Los expertos en la técnica pueden preparar soluciones útiles para
cualquier tipo de administración parenteral, tal y como se ha
descrito, por ejemplo, en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES
(Gennaro, A., compilador, Mack Pub., 1990). La dispersión del
morfógeno, por ejemplo, con un soporte dermatológicamente
aceptable, tal como una loción, crema, ungüento o jabón es una
formulación adecuada para la administración tópica en la superficie
de la piel y es particularmente útil para tratar el cáncer de
piel.
La asociación del dímero del morfógeno maduro con
un pro-dominio de morfógeno da como resultado la
pro-forma del morfógeno que es típicamente más
soluble en soluciones fisiológicas que la forma madura
correspondiente. De hecho, los morfógenos endógenos están
considerados para poder ser transportados (p. ej., secretados y
hechos circular) de este modo en el cuerpo de mamíferos. El medio
de cultivo de las células de mamífero que secretan morfógeno (p.
ej., células que están transfectadas con ácido nucleico que
codifica el morfógeno y que son competentes para expresar el
morfógeno) es una fuente de esta forma soluble de la proteína.
Alternativamente, la formación de un complejo del dímero
polipeptídico morfogénicamente activo y maduro (o un fragmento
activo del mismo) con un polipéptido del
pro-dominio del morfógeno o un fragmento que
potencia la solubilidad del mismo, crea una especie soluble. Los
fragmentos del pro-dominio que potencian la
solubilidad pueden ser cualquier fragmento
N-terminal,
C-terminal o interno de la pro-región de un miembro de la familia de morfógenos que forma complejos con el dímero del polipéptido maduro para mejorar la estabilidad y/o la solubilidad del complejo resultante covalente o no covalente. Típicamente, los fragmentos cortados en el sitio proteolítico Arg-Xaa-Xaa-Arg son útiles. Una descripción detallada de las formas solubles de complejos de proteínas morfogénicas, que incluyen cómo prepararlos, someterlos a ensayo y usarlos, se describe en el documento de patente mundial WO 94/03600 (PCT US 93/07189). En el caso de
C-terminal o interno de la pro-región de un miembro de la familia de morfógenos que forma complejos con el dímero del polipéptido maduro para mejorar la estabilidad y/o la solubilidad del complejo resultante covalente o no covalente. Típicamente, los fragmentos cortados en el sitio proteolítico Arg-Xaa-Xaa-Arg son útiles. Una descripción detallada de las formas solubles de complejos de proteínas morfogénicas, que incluyen cómo prepararlos, someterlos a ensayo y usarlos, se describe en el documento de patente mundial WO 94/03600 (PCT US 93/07189). En el caso de
\hbox{OP-1,}los fragmentos polipeptídicos pro-dominio útiles incluyen el polipéptido pro-dominio intacto (residuos 30-292) y los fragmentos 48-292 y 158-292, todos de SEQ ID NO:2. Adicionalmente, otras moléculas potencian la solubilidad y son particularmente útiles para la administración oral. Por ejemplo, la adición de 0,2% de caseína incrementa la solubilidad de la forma madura activa de OP-1 en 80%. Otros componentes encontrados en proteínas del suero de la leche y/o de otros sueros también pueden ser útiles.
En el uso de la presente invención, los
morfógenos pueden ser adecuados para la administración oral. Por el
contrario, la administración oral de proteínas generalmente no
tiene éxito porque enzimas digestivas y ácidos del sistema
digestivo de mamíferos degradan la mayoría de las proteínas antes de
que se absorban en la corriente sanguínea. Sin embargo, al
contrario de la mayoría de las proteínas, los morfógenos son
típicamente estables al ácido y resistentes a proteasas. Véase, p.
ej., el documento de patente de EE.UU. nº 4.968.590. Además, un
extracto de glándula mamaria, calostro y leche de 57 días contienen
al menos un morfógeno, OP-1. La OP-1
purificada a partir de extracto de glándula mamaria es
morfogenéticamente activa y se detecta en la corriente sanguínea.
Por tanto, la administración maternal, por la vía de la leche
ingerida, puede ser una ruta natural de suministro de
OP-1 y otras proteínas morfógenas. Véase, p. ej.,
Letterio y col., Science 264:1936-1938
(1994). Además, el morfógeno encontrado en la leche (y en el
extracto de glándula mamaria y calostro) se solubiliza fácilmente,
probablemente por la asociación con un componente
pro-dominio y/u otro componente de la leche.
Alternativamente o, además, un vehículo de
suministro competente para el transporte a través del sistema
gastrointestinal es útil para la administración oral de morfógenos,
de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, el morfógeno
puede formar parte de una microesfera erosionable biológicamente que
interacciona con la envoltura gastrointestinal y se absorbe a
través de esta envoltura. Los polímeros útiles incluyen, por
ejemplo, poliestireno, poliactida y/o poliglicolida y/o polímeros
de policianoacrilato y combinaciones de los mismos.
Los morfógenos de la presente invención tienen
que superar la barrera hematoencefálica, la estructura de la pared
capilar cerebral que evita que muchas sustancias entren en el
sistema nervioso central (SNC), en aplicaciones del SNC. La
infusión directa de morfógenos en el SNC por métodos bien conocidos
en la técnica, es una manera de evitar la barrera hematoencefálica.
Alternativamente, los morfógenos modificados pueden mostrar un
transporte mejorado a través de la barrera hematoencefálica. Por
ejemplo, las formas truncadas de morfógenos pueden tener bastante
éxito. Alternativamente, los expertos en la técnica pueden
modificar los morfógenos de la presente invención para que estén
derivatizados o conjugados con un resto lipofílico o con una
sustancia que se transporta activamente a través de la barrera
hematoencefálica. Véase, p. ej., Pardridge, Endocrine Reviews
7:314-330 (1986) y el documento de patente de
EE.UU. nº 4.801.575.
La asociación de moléculas capaces de dirigir
morfógenos hasta un tejido deseado, con morfógenos de la presente
invención, es posible. Por ejemplo, un anticuerpo, un fragmento de
anticuerpo u otra proteína de unión que interacciona
específicamente con una molécula de la superficie en células del
tejido deseado, son adecuadas para dirigir morfógenos. El sitio de
unión a la cadena sencilla, descrito tecnológicamente en el
documento de patente de EE.UU. nº 5.091.513, es útil para designar
moléculas diana.
Las aplicaciones in vitro, in vivo o ex
vivo son útiles para exponer tejidos afectados a morfógenos.
Los morfógenos para uso en la presente invención, así como las
células capaces de expresar dichos morfógenos, son adecuados para
suministrarlos al tejido afectado. Los expertos en la técnica
pueden construir tales células capaces de expresar morfógenos
empleando medios convencionales. Las matrices biocompatibles,
biodegradables, bioerosionables, tales como colágeno o
hidroxiapatito, son útiles para permitir que las células se
infiltren y crezcan en el material de la matriz durante la
diferenciación. Además, los tejidos afectados que se han separado
del hospedador se pueden exponer a cualquiera de las variedades de
morfógenos descritos en esta memoria. Los tejidos tratados son
entonces adecuados para volver al hospedador. Cualquiera de estas
aplicaciones in vitro, in vivo o ex vivo es útil para
inhibir la proliferación de células cancerígenas y/o estimular la
diferenciación de células que tienen un fenotipo de célula
cancerígena, distanciándolas del fenotipo de células cancerígenas.
En otro aspecto de la invención, se inhibe el crecimiento de
células NG108-15, células
NTERA-ZCL-D1 de carcinoma
embrional, células LNCaP, células MCF-7, células de
osteosarcoma, células A-549 de carcinoma pulmonar
humano y células A-172 de glioblastoma.
Tal y como apreciará un experto ordinario en la
técnica, las composiciones formuladas contienen cantidades
terapéuticamente eficaces del morfógeno. La dosis eficaz y la
estrategia de la dosificación variarán dependiendo de una cantidad
de factores que incluyen la eficacia biológica del agente
seleccionado, las características químicas (p. ej., hidrofobicidad)
del agente específico, la formulación del agente, la vía de
administración, la posición de la diana, las farmacocinéticas del
agente, el estado del tejido enfermo y el estado de salud general
del mamífero en particular. Por ejemplo, la administración
intratumoral de aproximadamente 200 \mul de 100 ng/ml de
BMP-6, inhibía el crecimiento tumoral en ratones
(véase el Ejemplo 7, a continuación).
Los morfógenos de la invención se pueden emplear
de forma aislada o en combinación con otras moléculas conocidas por
ser beneficiosas en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, se
pueden emplear distintos agentes antitumorales bien conocidos,
analgésicos o compuestos anti-inflamatorios con un
morfógeno. Adicionalmente, se pueden emplear diversos factores de
crecimiento bien conocidos, hormonas enzimas, composiciones
terapéuticas, antibióticos u otros agentes bioactivos con un
morfógeno.
Los siguientes ejemplos proporcionan una
evidencia experimental del efecto de diversos morfógenos sobre la
diferenciación celular y el crecimiento celular en varios tipos de
células. Cada una de estas líneas de células cancerígenas se
caracteriza por alguna forma de crecimiento irregular. Tal y como se
muestra a continuación, en una variedad de ejemplos, se inhibía el
crecimiento celular de células cancerígenas expuestas a morfógenos.
Además, en algunos de los ejemplos, se observaron características
morfológicas de la diferenciación celular. Estos datos
experimentales proporcionan una evidencia positiva de que los
morfógenos pueden aliviar los síntomas del cáncer, posiblemente
inhibiendo el crecimiento celular y/o estimulando la diferenciación
celular de las células cancerígenas.
Como un ejemplo de diferenciación celular
inducida con morfógenos, el efecto de OP-1 sobre la
diferenciación de células neuronales se sometió a ensayo en
cultivo. Específicamente, se determinó el efecto de
OP-1 sobre la línea celular clonal
NG108-15 del híbrido neuroblastoma y glioma. La
línea celular NG108-15 (también denominada
simplemente "NG108") muestra una morfología de tipo
fibroblástico en cultivo. La línea celular puede ser inducida para
diferenciarse químicamente empleando butirato 0,5 mM, 1% de DMSO o
Forskolina 500 mM, induciendo la expresión de virtualmente todas
las propiedades neuronales importantes de neuronas primarias
cultivadas. Sin embargo, la inducción química de estas células
también induce el cese de la división celular.
En el presente experimento, las células
NG108-15 fueron subcultivadas en placas de 6
pocillos revestidas con
poli-L-lisina. Cada pocillo contenía
40.000-50.000 células en 2,5 ml de medio definido
químicamente. Este medio definido químicamente contenía medio de
Eagle modificado con Dulbecco: Ham's F-12 (3:1),
NaHCO_{3} (3,7 g/litro), elementos traza (Mo 0,5 nM, Mn 0,5 nM, Cd
5 nM, Se 15 nM, Sn 25 nM, Ni 0,25 nM y Si 0,25 nM), HEPES 25 mM,
\hbox{10 g}de ácido oleico formando complejo con albúmina exenta de ácidos grasos, 50 \mug/ml de transferrina, 25 \mug/ml de insulina, glutamina 2 mM y Na_{3}VO_{4} 25 nM. Véase Chamess y col., J. Biol. Chem. 261:3164-3169 (1986); Perides y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10326-30 (1992). El tercer día, se añadió a cada pocillo 2,5:1 de OP-1 en etanol al 60% que contenía 0,025% de trifluoroacético. Las concentraciones de OP-1 de 0, 1, 10, 40 y 100 ng/ml se sometieron a ensayo. Los medios se cambiaron diariamente con nuevas partes alícuotas de OP-1. Después de cuatro días con concentraciones de OP-1 de 40 y 100 ng/ml, OP-1 inducía la diferenciación de células NG108. La Fig. 5 muestra los cambios morfológicos que tuvieron lugar. La OP-1 inducía la formación de racimos y la redondez de las células y la producción de nacimientos de neuritas característicos del fenotipo neuronal (compárese la Fig. 5A (células NG108 naturales) con la Fig. 5B, que muestra los efectos sobre las células tratadas con OP-1). Por tanto, OP-1 puede inducir a las células a diferenciarse con una morfología de célula neuronal. Algunos de los nacimientos parecían unirse en una unión de tipo sináptica. Este efecto no se observó en las células incubada con TFG-\beta1 con concentraciones de 1 a 100 ng/ml. Los efectos neuroprotectores de OP-1 fueron mostrados comparando con agentes químicos de diferenciación sobre las células NG108. Se extendieron en placas de 6 pocillos 50.000 células y se trataron con butirato, DMSO, Forskolina u OP-1 durante cuatro días. El recuento de las células mostraba que en los cultivos que contenían los agentes químicos, la diferenciación estaba acompañada por un cese de la división celular. Por el contrario, las células inducidas para diferenciarse con OP-1, se continuaban dividiendo, tal y como se determinó con la absorción de [^{3}H]-timidina. Los datos sugieren que OP-1 es capaz de mantener la estabilidad de las células en cultivo después de la diferenciación.
Otro ejemplo relacionado muestra la capacidad de
los morfógenos de la invención para inducir la
"rediferenciación" de células transformadas. La línea celular
de carcinoma embrional humano (EC) NTERA-2CL.D1
("NTERA2") se obtiene a partir de un teratocarcinoma humano.
Véase Andrews y col. Lab. Invest. 50:147-167
(1984). En ausencia de un estimulante externo, estas células pueden
ser mantenidas como células troncales indiferenciadas y se pueden
inducir para crecer en medio exento de suero (SFM). En ausencia de
tratamiento con morfógeno, las células proliferan de forma
exuberante y no dependen de anclajes. El efecto del tratamiento con
morfógeno se observa en las Figs.
\hbox{6A-D.}Las Figs. 6A y 6B muestran 4 días de crecimiento en SFM en presencia de OP-1 (25 ng/ml, 6A) o en ausencia de morfógeno (6B). Las Figs. 6C y 6D son 5 días de crecimiento en presencia de 10 ng/ml de OP-1 (6C) o sin morfógeno (6D). Las Figs. 6C y 6D son una ampliación de 10x y 20x comparadas con las Figs. 6A y 6B. Como se puede observar fácilmente, en presencia de OP-1, las células EC crecían como células aplanadas, volviéndose dependientes de anclaje. Además, la tasa de crecimiento se redujo aproximadamente 10 veces. Finalmente, las células fueron inducidas para diferenciarse. Estos resultados indican que en una línea celular de teratocarcinoma, los morfógenos diferencian e inhiben el crecimiento de las células.
Aproximadamente 25% de todos los machos con más
de 55 años padecen alguna forma de enfermedad de la próstata. Los
andrógenos se conocen por estimular la proliferación de células del
cáncer de próstata. Típicamente, las células del cáncer de próstata
pierden eventualmente su dependencia de los andrógenos para
proliferar y el cáncer progresa hasta un estado más maligno,
independientemente de los andrógenos. La pérdida de sensibilidad a
andrógenos es también una característica de las formas metastásicas
del cáncer de próstata. Por tanto, un método común para tratar el
cáncer de próstata es emplear alguna forma de control de andrógenos
o de ablación para evitar la proliferación estimulada con
andrógenos y una progresión eventual hasta una forma más maligna y
metastásica del cáncer de próstata.
Una detección temprana del cáncer de próstata ha
sido recientemente posible con el desarrollo de ensayos de
sensibilidad para antígenos circulantes que son diagnósticos para
el cáncer de próstata. Algunos antígenos incluyen antígeno de suero
de próstata (PSA), fosfatasa de ácido prostático (PAP) e inhibina
prostática (PIP). La detección temprana brinda la oportunidad de un
tratamiento temprano. Normalmente, los métodos disponibles más
generalmente para tratar el cáncer de próstata incluyen la cirugía
o la radioterapia para eliminar la glándula de la próstata
cancerosa. Además, diversos métodos de terapia hormonal (p. ej.,
ablación o control de andrógenos) se emplean generalmente para
ralentizar el desarrollo de cáncer de próstata sólido y metastásico.
Sin embargo, los pacientes sometidos a estas terapias disponibles
normalmente para tratar el cáncer de próstata, tienen también un
riesgo de padecer diversos efectos secundarios indeseables,
especialmente incontinencia e impotencia. Por tanto, existe la
necesidad de una terapia que no esté asociada con tales efectos
secundarios indeseables.
Schneyer y sus colegas estudiaron previamente el
efecto de la proteína activina, un miembro no morfógeno de la
superfamilia de TGF-\beta, como agente
terapéutico para tratar el cáncer de próstata. Véase, p. ej., Wang y
col., Endocrinology 137:5476-5483 (1996).
Sin embargo, una alta toxicidad renal ha frustrado un desarrollo
más avanzado de la activina como agente
anti-cancerígeno terapéuticamente eficaz. Tal y
como se describe en esta memoria, se ha observado ahora que los
morfógenos, tales como OP-1 y BMP-6,
son capaces de inhibir la proliferación de las células de cáncer de
próstata dependientes de andrógenos e independientes. Al contrario
de la activina, los morfógenos tales como OP-1 y
BMP-6 son conocidos por ser compatibles con el
tejido óseo, la función renal y otros tejidos blandos del
organismo. Por tanto, esta invención proporciona un método para
tratar el cáncer de próstata que comprende administrar un morfógeno,
tal como OP-1 o BMP-6, a un
paciente con cáncer de próstata. Una vez que se ha administrado el
morfógeno a un paciente, la inhibición mediada por el morfógeno de
la proliferación de las células del cáncer de próstata, puede estar
vigilada por un médico empleando diversos métodos convencionales,
que incluyen el examen para detectar una disminución del tamaño del
tejido y de la textura, midiendo los niveles de antígenos
circulantes, tales como PSA, y vigilando las molestias del paciente
y la función del tracto genito-urinario.
Tal y como se observa en esta memoria, morfógenos
tales como BMP-6 y OP-1, inhiben la
proliferación de células de cáncer de próstata tal y como se
demostró empleando la línea de células LNCaP sensibles a
andrógenos, un modelo establecido in vitro de cáncer de
próstata sensible a andrógenos. El modelo de cáncer de próstata con
LNCaP se empleó en tres experimentos. Primero, se examinó el efecto
de BMP-6, OP-1
(BMP-7), activina o TGF-\beta1
sobre el crecimiento celular de células LNCaP en ausencia de
andrógeno exógeno. Segundo, se examinó el efecto de
BMP-6, OP-1 (BMP-7),
activina o TGF-\beta1 sobre el crecimiento
celular de células LNCaP expuestas a andrógenos. Tercero, se examinó
el efecto de folistatina, una activina y una proteína de unión a
morfógenos sobre la bioactividad de BMP-6,
OP-1 (BMP-7) y activina en células
LNCaP.
Las células LNCaP se obtuvieron de la American
Type Culture Collection (Rockville, MD) y se dejaron crecer en
frascos de 75 cm con RPMI-1640 que contenía suero
de ternera fetal al 10% (RPMI/10% de FBS) en una atmósfera
humidificada con 5% de CO_{2}:95% de aire. El medio de cultivo se
cambió cada tres días. Para el ensayo de activina y BMPs, los
cultivos de material se subcultivaron entendiendo de nuevo en
placas de 96 pocillos suspensiones de células tripsinizadas. Para
este fin, las células LNCaP se extendieron en placas de 24 pocillos
con 3 x 10^{4} células/pocillo en 0,5 ml de RPMI/10% de FBS y se
incubaron durante 48 horas para establecer cultivos subconfluentes
para el estudio. Después del periodo de preincubación, el medio se
aspiró suavemente, las células se lavaron una vez con RPMI caliente
y las células se cultivaron posteriormente en 0,5 ml de RPMI que
contenía FBS al 2% para estudiar los efectos del tratamiento sobre
la tasa de proliferación celular (p. ej., crecimiento celular).
Dosis variadas de activina, BMPs, DHT o Fs, aisladas o en
combinación, se añadieron por triplicado a los pocillos y se
siguieron incubando durante otras 48 horas. Después de la
incorporación de [^{3}H]-timidina en las células,
las células se lavaron una vez con RPMI y se precipitaron con 0,5 ml
de ácido tricloroacético (TCA) frío al 10% durante 20 minutos a
4ºC. Después de dos lavados con metanol, el material precipitado se
solubilizó en 0,5 ml de hidróxido sódico 1 N y se sometió a
recuento la cantidad de radiactividad en un contador de centelleo
líquido. La incorporación de [^{3}H]-timidina se
expresa como cpm/pocillo y representa una medición cuantitativa de
la tasa de proliferación celular. En el primer paradigma
experimental, las células LNCaP (en ausencia de andrógeno exógeno)
se expusieron a diversas concentraciones de BMP-6,
OP-1
\hbox{(BMP-7),}activina o TGF-\beta1, tal y como se ha indicado. El efecto de estas sustancias sobre las células LNCaP se determinó empleando un ensayo de absorción de [^{3}H]-timidina. La Fig. 7 muestra que la activina y los morfógenos, BMP-6 y OP-1 (BMP-7) inhiben el crecimiento celular en una forma dependiente de la dosis.
\hbox{BMP-6}tenía mayor potencia que OP-1 (BMP-7). En el segundo paradigma experimental, las células LNCaP (expuestas a andrógeno DHT 10 nM) se expusieron a diversas concentraciones de BMP-6, OP-1 (BMP-7), activina o TGF-\beta1 en presencia de andrógeno (DHT 10 nM) y el efecto de estas sustancias se determinó empleando un ensayo de absorción de [^{3}H]-timidina. La Fig. 8 muestra que la activina y los morfógenos (BMP-6 y OP-1 (BMP-7)) inhibían la proliferación de las células LNCaP estimuladas con andrógenos en una forma dependiente de la dosis. BMP-6 tenía más potencia que OP-1 (BMP-7).
En el tercer paradigma experimental, las células
LNCaP se expusieron a BMP-6 1 nM,
OP-1 3 nM (BMP-7) o activina 0,1 nM
y a continuación se expusieron a la folistatina (FS)
activina/proteína de unión a BMP en una proporción de
folistatina:ligando de 0,5:1, 1:1, 2:1, 5:1 y 10:1. los efectos de
folistatina y el ligando sobre la proliferación de células LNCaP se
determinó empleando un ensayo de absorción de
[^{3}H]-timidina. La Fig. 9 muestra que la
folistatina neutralizaba la bioactividad de ambos morfógenos,
BMP-6 y OP-1
(BMP-7).
Este ejemplo muestra que el morfógeno,
OP-1, inhibe el crecimiento de células
MCF-7 de cáncer de mama humano sensibles a
estrógenos. Las células MCF-7 se hicieron crecer en
cultivos monocapa en MEM de Eagle suplementado con suero de ternera
fetal al 5% (FBS), L-glutamina 2 mM, BSS de Earle,
piruvato sódico 1 mM, antibióticos y 10 mg/ml de insulina bovina.
Para evitar posibles artefactos similares a esteroides procedentes
del medio que contiene rojo de fenol, antes de los tratamientos
experimentales, las células se incubaron con medio exento de fenol,
medio exento de suero o medio exento de fenol suplementado con FBS
al 5%, desprovistos cada uno de esteroides endógenos con carbón
vegetal revestido con dextrano.
En el primer experimento, el efecto de
OP-1 y TFG-\beta sobre la
proliferación de células cancerígenas MCF-7, se
sometió a ensayo en presencia y en ausencia de suero. Las células
se hicieron crecer en placas con 24 o con 48 pocillos.
OP-1 o TGF-\beta1 se añadió en
diversas concentraciones, tal y como se ha indicado, en medio
exento de suero o, alternativamente, se añadió OP-1
o TGF-\beta1 en medio que contenía suero al 5%
con diversas concentraciones, tal y como se ha indicado. Las Figs.
10A y 10B muestran que OP-1 y
TGF-\beta1 inhibían el crecimiento celular de una
forma dependiente de la dosis empleando un ensayo de absorción de
[^{3}H]-timidina. En presencia o en ausencia de
suero, OP-1 inhibía el crecimiento celular en
aproximadamente 80% de los testigos a 200 ng/ml (Fig. 10A,
cuadrados negros) y en aproximadamente 65% de los testigos a 200
ng/ml en presencia de medio que contenía suero al 5% (Fig. 10B,
cuadrados negros). TGF-\beta1 inhibía el
crecimiento celular en aproximadamente 65% de los testigos a 10
ng/ml en medio exento de suero (Fig. 10A, círculos blancos) y en
aproximadamente 55% de los testigos con 10 ng/ml en medio que
contenía suero al 5% (Fig. 10B, círculos blancos).
En un experimento relacionado, se examinaron los
efectos de OP-1 o TGF-\beta1
sobre células de cáncer de mama MCF-7 estimuladas
con estradiol 17-\beta. Las células
MCF-7 se incubaron en medio suplementado con
estradiol 17-\beta (1 x 10^{-11}, 10^{-10},
10^{-9}, 10^{-8}, 10^{-7}, 10^{-6} M) y a continuación se
expusieron a 200 ng/ml de OP-1. Los efectos sobre el
crecimiento celular se sometieron a ensayo empleando un ensayo de
la absorción de [^{3}H]-timidina. La Fig. 1A
muestra que las células MCF-7 expuestas a estradiol
17-\beta y no a OP-1, tenían un
incremento del crecimiento celular de aproximadamente 250% sobre el
testigo con estradiol 17-\beta 10^{-9} M
(cuadrados blancos). Las células MCF-7 expuestas a
estradiol 17-\beta 10^{-9} M y a
OP-1, mostraban una inhibición del crecimiento
celular de aproximadamente 80% de los testigos (cuadrados negros).
Empleando el mismo protocolo descrito inmediatamente arriba, 10
ng/ml de
\hbox{TGF- \beta 1}fueron sustituidos por OP-1. La Fig. 11B muestra que TGF-\beta1 inhibía el crecimiento celular en aproximadamente 40% de los testigos en células MCF-7 estimuladas con estradiol 17-\beta 10^{-11} M (círculos negros).
En otro experimento, tamoxifeno, un antagonista
de estrógenos que es conocido por inhibir el crecimiento de células
MCF-7, fue examinado en relación con sus efectos en
comparación y también en adición con OP-1. Las
células MCF-7 fueron expuestas a tamoxifeno 1 x
10^{-6} M, 100 ng/ml de OP-1 o a ambos tamoxifeno
y OP-1 combinados. Se sometió a ensayo el
crecimiento celular empleando un ensayo de absorción de
[^{3}H]-timidina. La Fig. 12 muestra que
OP-1 o tamoxifeno a estas concentraciones inhibían
el crecimiento celular en aproximadamente 40% de los testigos.
OP-1 y tamoxifeno juntos inhibían el crecimiento
celular en aproximadamente 70% de los testigos.
En otro experimento relacionado, el gen
OP-1 se transfectó de forma estable en células
MCF-7 empleando precipitación convencional con
fosfato cálcico. El promotor temprano inmediato principal (MIE) de
citomegalovirus, aislado a partir del plásmido pCDM8 (Invitrogen),
se empleó para dirigir la transcripción del ADNc de
OP-1. Las señales de corte y empalme de la región
temprana de SV40 y las señales de la adición de una cola
poli-A, obtenidas a partir de pMAMneo (Clonetech,
Inc.), se añadieron a elementos del procesamiento en 3'. Una región
3' más corta obtenida a partir del mismo vector, sin el intrón y los
sitios de corte y empalme, también se ha utilizado con el mismo
éxito. El marcador de selección eucariótico neomicina, también
estaba presente, bajo el control de la transcripción del promotor
temprano de SV40. Véanse los documentos de patentes de EE.UU. nº
5.712.119; nº 5.614.385; nº 5.585.237.
Un día antes de la transcripción, las células se
extendieron en placas con una densidad de 1 x 10^{6} células/100
mm de placa petri. Cincuenta microgramos de ADN purificado
preparado a partir del plásmido que contenía el gen de
OP-1, se transfectaron en las células por el método
de precipitación con fosfato cálcico. Dos días después de la
transfección, las células se tripsinizaron y se extendieron en
placas 1:3 sobre placas de nuevo aporte que contenían el medio de
selección que contenía 400 mg/ml de G418. Las colonias resistentes a
G418 eran visibles aproximadamente dos semanas más tarde y algunas
de esas células se emplearon para verificar la expresión de
OP-1 mediante análisis por transferencia de tipo
Northern.
Cuando las células MCF-7 se
transfectaron con el gen OP-1, tuvo lugar un cambio
en la morfología (similar a fibroblastos). Se había alterado también
la sensibilidad celular a estrógenos. Las células
MCF-7 transfectadas con
\hbox{OP-1}se trataron con diversas dosis de estradiol 17-\beta durante 3 días (estradiol 17-\beta 10^{-7}-10^{-11} M). El crecimiento celular se sometió a ensayo empleando el ensayo de absorción de [^{3}H]-timidina. El estradiol 17-\beta fallaba para la estimulación del crecimiento celular. De hecho, las células MCF-7 transfectadas con el gen OP-1 mostraban una inhibición dependiente de la dosis del crecimiento celular de aproximadamente 50% de los testigos con estradiol 17-\beta 1 x 10^{-7} M.
Estos descubrimientos muestran colectivamente que
OP-1 inhibe el crecimiento basal y el crecimiento
estimulado con estrógenos de células de cáncer de mama
MCF-7. OP-1 también induce la
diferenciación celular en células
\hbox{MCF-7,}posiblemente un cambio de tipo celular epitelial a mesénquima, compatible con el uso de morfógenos tales como
\hbox{OP-1}como agente terapéutico para ciertos cánceres de mama humanos sensibles a estrógenos.
Este ejemplo muestra que el morfógeno
OP-1 inhibe el crecimiento celular de células
A-172 de glioblastoma humano. Las células
A-172 se extendieron en placas con 5 x 10^{4}
células por pocillo en placas de 48 pocillos en DMEM que contenía
FBS al 10%. Después de 24 horas, el medio de crecimiento fue
reemplazado por DMEM exento de suero. OP-1 (1, 10,
40, 100, 200 ng/ml) se añadió a las células y se incubó a 37ºC en
presencia de CO_{2} al 5% durante 24 horas, que incluía 6 h con
impulsos de 1 \muCi de [^{3}H]-timidina. Después
de incubar, las células se lavaron con PBS. Se añadió TCA (10%) y
las células se incubaron durante 15 minutos. La capa celular se
lavó tres veces con agua destilada y se extrajo con SDS al 1%. La
radiactividad incorporada se midió con un analizador de centelleo
líquido. La Fig. 13 muestra que el morfógeno OP-1
inhibía la proliferación de células cancerígenas
A-172 en aproximadamente 50% de los testigos con
100 ng/ml.
Este ejemplo muestra que el morfógeno
OP-1 inhibe el crecimiento celular de células
A-549 de carcinoma pulmonar humano. Las células
A-549 se extendieron en placas con 5 x 10^{4}
células por pocillo en placas de 48 pocillos en DMEM que contenía
FBS al 10%. Después de 24 horas, el medio de crecimiento fue
reemplazado por DMEM exento de suero. OP-1 (1, 10,
20, 40, 100, 200 ng/ml) se añadió a las células y se incubó a 37ºC
en presencia de CO_{2} al 5% durante 24 horas, que incluía 6 h
con impulsos de 1 \muCi de [^{3}H]-timidina.
Después de incubar, las células se lavaron con PBS. Se añadió TCA
(10%) y las células se incubaron durante 15 minutos. La capa
celular se lavó tres veces con agua destilada y se extrajo con SDS
al 1%. La radiactividad incorporada se midió con un analizador de
centelleo líquido. La Fig. 14 muestra que el morfógeno
OP-1 inhibía el crecimiento de células cancerígenas
A-459 en una forma dependiente de la dosis con una
inhibición de 70% alcanzada con 200 ng/ml. TGF-132,
por otro lado, inhibía como máximo 77% del crecimiento celular con
1 ng/ml.
El efecto del morfógeno sobre la proliferación de
dos líneas celulares de cáncer de próstata de múridos se examinó
in vitro. Inicialmente, la expresión de receptores de BMP
(BMPRs) en estas líneas celulares de cáncer de próstata de ratón
fue investigada por análisis con transferencia de tipo Northern. Los
resultados mostraban que ambas líneas celulares expresan los tres
tipos de BMPRs y que un morfógeno, BMP-6, inhibe la
proliferación de estas líneas celulares de una forma dependiente de
la dosis.
Dos líneas celulares, obtenidas a partir de
cáncer de próstata de ratones TRAMP (Transgenic Adenocarcinoma of
Mouse Prostate) y denominadas E4 y F11, se mantuvieron en medio
Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de
ternera fetal al 10% (FBS), 5 \mug/ml de inculina y
dihidroesterona 10^{8} M (véase Foster y col., Cancer Res.
7:3325-330 (1997)). Todas las células se
obtuvieron a partir de los pases 20 a 23.
Antes del tratamiento con BMP-6,
los medios se cambiaron a DMEM suplementado con FBS al 1%. A
continuación, se añadió BMP-6 con las siguientes
concentraciones: 1, 10 y 100 \mug/ml. Los medios se cambiaron
cada dos días. Al final de un periodo de 6 días, se cosecharon las
células y se hizo un recuento con un hemocitómetro. Todos los
ensayos se realizaron tres veces y cada vez se obtuvieron
resultados similares.
La expresión de BMPRs en las células E4 y F11 fue
investigada por análisis con transferencia de tipo Northern.
Después de cosechar las células, se aisló el ARNm empleando un
equipo de reactivos comercial (Ribosep, Collaborative Biomolecules,
Bedford, MA) según el protocolo recomendado por el fabricante. Para
el análisis de tipo Northern, se separaron 2 \mug de ARN poli A
mediante electroforesis en gel de
formaldehído-agarosa al 1% y se transfirieron a
membranas de nilon (membrana Zeta-Probe GT,
Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Las membranas
se lavaron posteriormente en 2 X SSC (1 X SSC = citrato sódico 0,15
M, pH 7,0). Después el ARN separado se retículo con la membrana de
nilon empleando un reticulador de luz ultravioleta. La
prehibridación se realizó en formamida al 50%, Na_{2}HPO_{4}
0,12 M (pH 7,2), NaCl 0,25 M, 7% (peso/volumen) de SDS y 250
\mug/ml de ADN de esperma de arenque desnaturalizado térmicamente
(Promega Corp. Madison, WI) durante 2 h a 42ºC. La hibridación se
realizó durante una noche a 42ºC en la solución de prehibridación
que contenía la muestra marcada con
[^{32}P]-desoxi-CTP (Amersham
Corp., Arlington Heights, IL) empleando un equipo de reactivos para
el cebado de oligonucleótidos al azar (sistema de marcación de
Random Primers DNA, Life Technologies). Después de lavar las
membranas en diluciones secuenciales de SSC, se realizó la
autorradiografía empleando una película de Kodak
X-Moat AR (Eastman Kodak, Rochester, NY) con una
pantalla intensificadora a -70ºC.
Tal y como se muestra en la Fig. 15, ambas líneas
celulares expresaban los tres tipos de BMPRs:
BMPR-IA, BMPR-IB y
BMPR-II. Tal y como se ha descrito previamente,
había tres variantes de corte y empalme para
\hbox{BMPR-II.}Véase, Rosenzweig y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7632-636 (1995).
La adición de BMP-6 a estas
líneas celulares en cultivo de tejido disminuía considerablemente
la tasa de proliferación en una forma dependiente de la dosis
(véase Fig. 16). Específicamente, en presencia de 100 ng/ml de
BMP-6, el recuento de células E4 y F11 era
aproximadamente 60% del recuento de testigos (no
BMP-6). Puesto que las dos líneas celulares
expresaban los tres tipos de BMPRs y eran sensibles a
BMP-6, la línea celular E4 se escogió al azar para
un análisis posterior en relación con el potencial terapéutico de
BMP-6, in vivo.
La capacidad del morfógeno para inhibir la
progresión del cáncer in vivo se sometió a ensayo empleando
la línea celular E4 de cáncer de próstata de múridos, tal y como se
ha descrito en el Ejemplo 7. Se compraron ratones adultos y machos
C57BL/6 y se mantuvieron según el patrón NH establecido en las
Normas para el cuidado y el uso de animales experimentales. Treinta
ratones fueron inoculados con 10^{7} células por vía subcutánea.
A las 6 semanas, 21 ratones tenían un tumor palpable. Estos
animales se dividieron en tres grupos de 7. El grupo experimental
recibió 200 \mul de 100 ng/ml de BMP-6, mientras
que los grupos testigos recibieron el vehículo (acetato 20 mM y
manitol 5%, pH 4,5) o no recibieron tratamiento. Las inyecciones se
realizaron directamente en los tumores una vez cada dos días,
durante tres semanas. Los animales fueron observados durante 10
semanas después de iniciar la terapia y el volumen del tumor se
midió semanalmente en cada animal.
Al final del periodo de diez semanas, todos los
tumores se extirparon y se conservaron en formalina y se embebieron
en parafina. Posteriormente, se obtuvieron secciones de 5 \mum de
cada tumor y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E).
Al final del periodo de diez semanas después de
la iniciación del tratamiento, 5 de los 7 ratones tratados con
\hbox{BMP-6}estaban vivos mientras que todos los animales en el otro grupo estaban muertos (Tabla 1). De los cinco animales, dos tenían un tumor no palpable.
Además de la tasa de supervivencia, con el
tratamiento con BMP-6 también disminuía la tasa de
crecimiento tumoral. Los resultados, mostrados en la Fig. 17,
mostraban que el tumor promedio en ratones tratados con
BMP-6 era aproximadamente un tercio del que tenían
los ratones a los que sólo se había dado vehículo. No había
diferencias significativas entre la tasa de crecimiento tumoral
entre el grupo que había recibido el vehículo y los animales que no
habían tenido (datos no mostrados).
Inóculo | nº supervivientes/nº total % | Valor P |
Nada | 0/7 (0) | |
Vehículo | 0/7 (0) | |
BMP-6 | 5/7 (71)** | <0,001 |
* Supervivencia a las 10 semanas después de que el tumor fuera palpable | ||
**Dos tenían tumor no palpable mientras que 2 tenían centro necrótico |
En un intento de determinar el efecto del
tratamiento con morfógenos sobre ratones que eran sensibles al
tratamiento, el análisis de nuevo de los datos se realizó después
de separarlos de los dos animales no supervivientes, que no
respondían al tratamiento con BMP-6 (Fig. 18). Se
evaluaron todas las estadísticas con el prueba de \chi^{2} y
P<0,05 era considerado estadísticamente significativo. El nuevo
análisis de los datos indica que el volumen tumoral empieza a
disminuir realmente 2 semanas después de la inyección de
BMP-6 en animales que respondían al tratamiento. Al
final de las 4 semanas después de la iniciación de la
administración de BMP-6, el tamaño tumoral promedio
de los ratones que respondían era aproximadamente 5% del tamaño del
grupo de testigos que recibían sólo el vehículo.
Como un intento inicial para determinar el
mecanismo que sostiene la regresión tumoral inducida con morfógeno
observada en el estudio presente, los tumores se cosecharon y se
tiñeron con H&E para microscopía. Tal y como se muestra en las
Figs. 19A y 19B, los tumores que se trataban con
BMP-6 mostraban una necrosis grave e inflamación
difusa.
La invención se puede realizar de otras formas
específicas sin alejarse del espíritu o de las características
esenciales de la misma. Las presentes realizaciones se deben
considerar, por tanto, en todos los aspectos como ilustrativas y no
restrictivas, estando indicado el alcance de la invención por las
reivindicaciones anejas más que por la anterior descripción y todos
los cambios que entran dentro del significado y rango de
equivalencia de las reivindicaciones están por ello incluidos en
las mismas.
Otras realizaciones de la invención están en las
siguientes reivindicaciones.
<110> Creative Biomolecules, Inc. Sampath y
col.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Métodos para aliviar los síntomas del
cáncer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> CRP-166 PCT
(00960-521; CBM-21)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> presentada junto con
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
12-11-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1822
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (49)..(1341)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína osteogénica; OP1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 431
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(102)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OPX; en donde cada Xaa se selecciona
independientemente de un grupo de uno o varios aminoácidos
especificados tal y como se ha definido en la memoria
descriptiva
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(97)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
Generic-Seq-7; en donde cada Xaa se
selecciona independientemente a partir de un grupo de uno o varios
aminoácidos especificados, tal y como se ha definido en la memoria
descriptiva
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(102)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
Generic-Seq-8; en donde cada Xaa se
selecciona independientemente a partir de un grupo de uno o varios
aminoácidos especificados, tal y como se ha definido en la memoria
descriptiva
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(97)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
Generic-Seq-9; en donde cada Xaa se
selecciona independientemente a partir de un grupo de uno o varios
aminoácidos especificados, tal y como se ha definido en la memoria
descriptiva
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(102)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
Generic-Seq-10; en donde cada Xaa se
selecciona independientemente a partir de un grupo de uno o varios
aminoácidos especificados, tal y como se ha definido en la memoria
descriptiva
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> en donde cada Xaa se selecciona
independientemente a partir de un grupo de uno o varios aminoácidos
especificados, tal y como se ha definido en la memoria
descriptiva
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> en donde cada Xaa se selecciona
independientemente a partir de un grupo de uno o varios aminoácidos
especificados, tal y como se ha definido en la memoria
descriptiva
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa}
Claims (30)
1. Uso de un morfógeno que comprende una proteína
dímera que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 70% de
homología en aminoácidos o al menos 60% de identidad de aminoácidos
con los residuos 330-431 de SEQ ID NO:2, pudiéndose
medir los aminoácidos y la homología por el método de la matriz
PAM250 descrito por Dayhoff y col [Atlas of Protein Sequence and
Structure, volumen 5, 345-352 (1978)], en la
preparación de un medicamento para aliviar los síntomas del cáncer,
en donde el morfógeno inhibe el crecimiento de células
cancerígenas.
2. Uso según la reivindicación 1, en donde las
células de dicho cáncer son células NG108-15,
células LNCaP, células MCF-7, células de
osteosarcoma, células A-549 de carcinoma pulmonar
humano, células TRAMP, células NTREA2 o células
A-172 de glioblastoma.
3. Uso según la reivindicación 1, en donde dicho
cáncer es: cáncer de huesos, cáncer cerebral, cáncer de mama,
tumores de las células germinales, cáncer de pulmón, cáncer del
sistema nervioso, cáncer de próstata o teratocarcinoma.
4. Uso según la reivindicación 1, en donde el
morfógeno es: OP-1, OP-2,
OP-3, BMP-2, BMP-3,
BMP-3b, BMP-4,
BMP-5, BMP-6,
BMP-10, BMP-12,
BMP-13, DPP, Vg1, Vgr-1, proteína
60A, CDMP-1, CDMP-2,
CDMP-3,
\hbox{GDF-1,}GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-12, UNIVIN o SCREW.
5. Uso según la reivindicación 1, en donde el
morfógeno es: OP-1, OP-2,
OP-3, BMP-2, BMP-4,
BMP-5, BMP-6, DPP, Vg1,
Vgr-1, UNIVIN o proteína 60A.
6. Uso según la reivindicación 1, en donde el
morfógeno es: OP-1, OP-2,
OP-3, BMP-5, BMP-6,
Vgr-1, UNIVIN o proteína 60A.
7. Uso según la reivindicación 1, en donde el
morfógeno está asociado no covalentemente con al menos un
polipéptido pro-dominio seleccionado entre el grupo
que consta de los pro-dominios de
OP-1, OP-2, 60A,
GDF-1, BMP-2A,
BMP-2B, DPP, Vg1, Vgr-1,
BMP-3, BMP-5 y
BMP-6.
8. Uso según la reivindicación 7, en donde el
morfógeno está asociado no covalentemente con más de uno de los
polipéptidos pro-dominio.
9. Uso según la reivindicación 1, en donde el
morfógeno está presente en un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
10. Uso según la reivindicación 9, en donde el
vehículo se selecciona entre el grupo consistente en microesferas
biocompatibles, microesferas biodegradables y microesferas
bioerosionables.
11. Uso según la reivindicación 9, en donde el
vehículo se selecciona entre el grupo consistente en matrices
biocompatibles, matrices biodegradables y matrices
bioerosionables.
12. Uso según la reivindicación 9, en donde el
vehículo es una solución acuosa.
13. Uso según la reivindicación 1, en donde el
medicamento comprende células capaces de expresar el morfógeno.
14. Uso según la reivindicación 1, en donde el
medicamento comprende un ADN no infeccioso y no integrador que
codifica el morfógeno ligado funcionalmente a un promotor, en donde
el ADN no tiene asociación con proteínas que facilitan la
transfección, partículas víricas, formulaciones liposómicas, lípidos
cargados y agentes de precipitación de fosfato cálcico.
15. Uso según la reivindicación 14, en donde el
ADN no infeccioso y no integrador que codifica el morfógeno ligado
funcionalmente a un promotor, comprende adicionalmente un elemento
potenciador asociado funcionalmente con el promotor.
16. Uso según la reivindicación 1, en donde el
cáncer se selecciona a partir del grupo consistente en cáncer
adrenal, cáncer de ano, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, cáncer
de cerebro, cáncer de mama, cáncer de cérvix, cáncer de colon,
cáncer de endometrio, cáncer endocrino, cáncer de esófago, cáncer de
tubo de Falopio, cáncer de células adiposas, cáncer de glándula
biliar, cáncer de tracto gastrointestinal, tumores de células
germinales, cáncer de riñón, leucemia, cáncer de hígado, linfoma,
cáncer de pulmón, cáncer de músculo, cáncer del sistema nervioso,
cáncer de tejido ocular, cáncer bucal, cáncer de ovarios, cáncer
pancreático, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de piel,
cáncer de intestino delgado, cáncer de tejidos blandos, cáncer de
estómago, teratocarcinoma, cáncer testicular, cáncer de tiroides,
cáncer de uretra, cáncer urinario, cáncer uterino y cáncer
metastásico con sitio primario desconocido.
17. Uso según la reivindicación 1, en donde los
síntomas se seleccionan entre el grupo consistente en función del
cuerpo anormal, morfología celular anormal, niveles enzimáticos
anormales, niveles hormonales anormales, niveles de antígeno
oncofetal anormales, crecimiento anormal de tejido, masa de tejido
anormal, niveles anormales de proteínas asociadas con tumores,
función neurológica alterada, estructura neurológica alterada,
angiogénesis, hemorragia, células que tienen un fenotipo de célula
cancerosa, diarrea, efusiones, fatiga, fiebre, lesiones,
malnutrición, metástasis, nausea, obstrucción de una vía corporal,
infección oportunista, dolor, índice de Karnofsky bajo, presencia de
marcadores de la superficie celular, presencia de marcadores
histológicos, presencia de marcadores intracelulares, presencia de
marcadores moleculares, invasión tumoral, proliferación celular
irregular, frecuencia urinaria y pérdida de peso.
18. Uso según la reivindicación 1, en donde el
morfógeno inhibe la incorporación celular de
[^{3}H]-timidina en un ensayo in vitro.
19. Uso según la reivindicación 1, en donde el
morfógeno es una proteína morfogénica ósea.
20. Uso según la reivindicación 1, en donde el
medicamento comprende adicionalmente al menos una sustancia junto
con el morfógeno.
21. Uso según la reivindicación 20, en donde las
sustancias son un agente anti-cancerígeno.
22. Uso según la reivindicación 1, en donde las
células cancerígenas expresan almenos un receptor de la proteína
morfogénica ósea (BMPR), específico para el morfógeno.
23. Uso según la reivindicación 22, en donde el
BMPR se selecciona a partir del grupo consistente en
BMPR-IA, BMPR-IB,
BMPR-II y sus variantes de corte y empalme.
24. Uso según la reivindicación 1, en donde el
morfógeno reduce el tamaño del tumor o su desarrollo.
25. Uso según la reivindicación 1, en donde el
morfógeno incrementa la tasa de supervivencia.
26. Uso según la reivindicación 1, en donde el
morfógeno da como resultado la necrosis del tumor y una inflamación
difusa.
27. Uso según la reivindicación 1, en donde el
morfógeno es específico de un receptor de proteínas morfogénicas
óseas (BMPR) en la preparación de un medicamento para tratar el
cáncer en un mamífero en donde el mamífero expresa al menos uno de
dichos BMPR.
28. Uso según la reivindicación 27, en donde el
cáncer es cáncer de próstata.
29. Uso según la reivindicación 28, en donde el
BMPR se selecciona a partir del grupo consistente en
BMPR-IA, BMPR-IB,
BMPR-II y sus variantes de corte y empalme.
30. Uso según la reivindicación 28, en donde el
morfógeno es BMP-6.
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