JP2002529513A - 癌の症状を緩和する方法 - Google Patents
癌の症状を緩和する方法Info
- Publication number
- JP2002529513A JP2002529513A JP2000582058A JP2000582058A JP2002529513A JP 2002529513 A JP2002529513 A JP 2002529513A JP 2000582058 A JP2000582058 A JP 2000582058A JP 2000582058 A JP2000582058 A JP 2000582058A JP 2002529513 A JP2002529513 A JP 2002529513A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cancer
- morphogen
- bmp
- cells
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
って調節されない細胞増殖である。癌細胞はまた、別の部位に転移し、そして定
着する能力を発達させ得る。一般的に、HARRISON’S PRINCIP
LES OF INTERNAL MEDICINE,505(Fauciら編
,第14版,1998)を参照のこと。癌は、比較的迅速な細胞代謝回転速度を
有する組織において最も普通である。大部分の場合、2つの型の細胞が、これら
の組織型に存在する:分裂している前駆細胞および分裂していない分化細胞。用
語癌とは、細胞が制御なしで分裂するが転移できない良性の増殖、および細胞が
制御なしで分裂しかつ転移し得る悪性の増殖の両方をいう。
を獲得したら、その運命は代表的には不可逆的である。モルフォゲンは、多数の
組織における前駆細胞の増殖および分化を誘導することが公知である。モルフォ
ゲンとしては、異所性の、軟骨性骨形態形成を誘導する能力によって同定される
骨モルフォゲン性タンパク質(BMP)のファミリーのメンバーが挙げられる。
骨形成性タンパク質とも呼ばれるモルフォゲンは一般に、TGF−βスーパーフ
ァミリーの増殖因子のサブグループとして分類される。Hogan,Genes
& Development 10:1580−1594(1996)。その
スーパーファミリーのメンバーとしては、哺乳動物骨形成性タンパク質−1(B
MP−7としても公知であるOP−1、およびDrosophilaホモログ6
0A)、骨形成性タンパク質−2(BMP−8としても公知のOP−2)、骨形
成性タンパク質−3(OP−3)、BMP−2(BMP−2AまたはCBMP−
2Aとしても公知の、およびDrosophilaホモログDPP)、BMP−
3、BMP−4(BMP−2BまたはCBMP−2Bとしても公知)、BMP−
5、BMP−6およびそのマウスホモログVgr−1、BMP−9、BMP−1
0、BMP−11、BMP−12、GDF3(Vgr2としても公知)、GDF
8、GDF9、GDF10、GDF11、GDF12、BMP−13、BMP−
14、BMP−15、GDF−5(CDMP−1またはMP52としても公知)
、GDF−6(CDMP−2としても公知)、GDF−7(CDMP−3として
も公知)、XenopusホモログVglおよびNODAL、UNIVIN、S
CREW、ADMP、ならびにNEURALが挙げられる。
アミノ酸のカルボキシル末端の活性なドメインを含む成熟ポリペプチドを生じる
「プロ形態」を通したプロセシングから生じる。全てのモルフォゲンは、保存さ
れたパターンのシステインをそのドメインにおいて共有する。この活性な形態は
、単一のスーパーファミリーのメンバーのジスルフィド結合したホモダイマーま
たは2つの異なるメンバーのヘテロダイマーのいずれかである。例えば、Mas
sague,Annu.Rev.Cell Biol.6:597(1990)
;Sampathら,J.Biol.Chem.265:13198(1990
)を参照のこと。
切除、癌組織の放射線誘導破壊、および癌組織の化学誘導破壊に焦点をあててき
た。これらの形態の処置は癌に罹患したものに希望を与えてきたが、これらは、
侵襲性(物理的切除の場合)、細胞傷害性、処置された被験体における重篤な副
作用の生成、制限された治療時間(limited therapeutic
window)および癌組織を完全に破壊する制限された能力を含めて、多くの
例において欠点を有する。さらに、癌細胞に対して応答する、宿主自体の生物学
的機構を調節する生物学的薬剤を開発するために、いくつかのあまり伝統的でな
い試みが行われた。さらに、全ての抗癌剤が、全ての細胞型に対して等しく有効
なわけではない。従って、癌の症状を緩和し得る、より広範な範囲の細胞型で(
あるいは、新たなまたは異なったサブセットの細胞型に)有効でかつ現行の抗癌
剤よりもその使用に関連した問題の少ない、抗癌剤についての必要性が存在する
。
は癌細胞の分化を刺激する、組成物および方法を提供する。多くの癌は、身体全
体のさらなる部位に転移する能力を有するかまたは有さない、制御されない増殖
を示す細胞によって特徴付けられる。癌の症状を緩和するために癌を処置する1
つの方法は、癌細胞の調節されていない増殖を阻害することである。モルフォゲ
ン(骨モルフォゲン性タンパク質、「BMP」または「モルフォゲン性タンパク
質」としても公知である)は、多くの異なる細胞型において細胞の表現型を変更
し得るタンパク質のファミリーである。特に、モルフォゲンは、分化した細胞表
現型を刺激、維持または再生し得る。癌細胞をモルフォゲンに暴露することが、
癌細胞増殖を阻害し、そしてこのような細胞が癌表現型から分化することを引き
起こすことがここで発見された。従って、モルフォゲンを投与することは、癌細
胞の運命に影響を与え得、次いで癌の症状を緩和し得る。
られている方法に対する別のアプローチである。本発明の方法はまた、癌を処置
するための従来の化学療法に伴って代表的に観察される副作用を減少させる。
することにより、癌を処置して癌の症状を緩和する方法である。モルフォゲンは
、配列番号2の残基330〜431を含むヒトOP−1のC末端7システイン骨
格と少なくとも70%相同性のアミノ酸配列、またはヒトOP−1のこのC末端
7システイン骨格と少なくとも60%同一性を有するアミノ酸配列、配列番号3
、配列番号4、配列番号5、配列番号6、または配列番号7のいずれかのアミノ
酸配列を有する、癌細胞の増殖を阻害する、ダイマータンパク質である。本発明
において有用なモルフォゲンとしては、OP−1、OP−2、OP−3、BMP
−2、BMP−3、BMP−3b、BMP−4、BMP−5、BMP−6、BM
P−9、BMP−10、BMP−11、BMP−14、BMP−15、DPP、
Vgl、Vgr−1、60Aタンパク質、CDMP−1、CDMP−2(BMP
−13)、CDMP−3(BMP−12)、GDF−1、GDF−3、GDF−
5、GDF6、GDF−7、GDF−8、GDF−9、GDF−10、GDF−
11、GDF−12、NODAL、UNTVIN、SCREW、ADMP、NE
URAL、およびモルフォゲンとして活性なそれらのアミノ酸配列改変体が挙げ
られるがこれらに限定されない。本発明の別の局面では、このモルフォゲンは、
OP−1、OP−2、60A、GDF−1、BMP−2A、BMP−2B、DP
P、Vgl、Vgr−1、BMP−3、BMP−5、およびBMP−6のプロド
メインより選択される少なくとも1つのプロドメインポリペプチドと非共有結合
的に会合している。本発明の別の局面では、このモルフォゲンは、本明細書中に
記載される組成物および方法において有用なモルフォゲンの1より多くのプロド
メインポリペプチドと非共有結合的に会合している。
たはビヒクルを介して投与される。このキャリアまたはビヒクルは、生理学的に
受容可能な水溶液(例えば、生理食塩水または緩衝溶液(例えば、リン酸緩衝化
生理食塩水溶液))であり得る。このキャリアまたはビヒクルは、生体適合性、
生分解性および/または生体腐食性(bioerodable)である、リポソ
ームまたはミクロスフェアを含む。あるいは、このキャリアまたはビヒクルは、
生分解性または生体腐食性である、生体適合性マトリックスを含む。本発明にお
いてマトリックスとして有用な化合物および物質としては、タンパク質性物質(
例えば、コラーゲン)、単糖および多糖ならびにそれらの誘導体(例えば、カル
ボキシメチルセルロースおよびヒアルロン酸)、合成ポリマー(例えば、ポリグ
リコール酸およびポリ乳酸のポリマーまたはコポリマー)、カルシウム含有化合
物(例えば、ヒドロキシアパタイトまたはリン酸三カルシウム)、ならびにそれ
らの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
し得る細胞を癌細胞に送達することを含む。本発明の別の局面では、モルフォゲ
ンを投与する工程は、特定の組織の細胞におけるモルフォゲンの発現を指向する
プロモーターに作動可能に連結された、モルフォゲンをコードする非感染性の非
組込み型DNAを提供することを含む。本発明の別の局面では、エンハンサーエ
レメントは、このプロモーターと作動可能に会合している。なお別の実施形態で
は、モルフォゲンをコードするDNAは、プロモーターに作動可能に連結される
。このDNAは、DNAの取り込みおよび癌細胞または隣接する非癌細胞による
このモルフォゲンの発現を促進する、リポソーム、ミクロスフェアまたはウイル
ス粒子と会合している。モルフォゲンをコードするDNAを、癌細胞または隣接
する非癌細胞に形質導入する際に有用なウイルス粒子としては、アデノ随伴ウイ
ルス粒子が挙げられる。
乳癌、頸癌、結腸癌、癌体(corpus cancer)、内分泌癌、食道癌
、ファローピウス管癌、脂肪細胞癌、胆嚢癌、胃腸管癌、生殖細胞腫瘍、腎臓癌
、白血病、肝臓癌、リンパ腫、肺癌、筋肉癌、神経系癌、眼組織癌、口腔癌(例
えば、舌、口腔の上皮組織)、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌(アンドロゲン依存性
および非依存性)、直腸癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、胃癌、奇形癌(奇形腫
)、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌、泌尿癌(urinary cancer)、子
宮癌、および未知の原発部位の癌のそれらの転移形態において緩和される。
細胞の調節されていない増殖を阻害することにより、または癌表現型からの癌細
胞の分化を刺激することにより、処置される。本発明の別の局面では、モルフォ
ゲンは、癌を処置して、以下を含む癌の他の症状を緩和するために用いられる:
異常な出血、異常な身体機能、異常な細胞形態、異常な酵素レベル、異常なホル
モンレベル、異常な腫瘍胎児抗原レベル、異常な組織増殖、異常な組織重量、異
常な腫瘍関連タンパク質レベル、変化した神経機能、変化した神経学的構造、新
脈管形成、下痢、滲出、疲労、発熱、病変、栄養失調、転移、悪心、身体通路(
bodily passageway)の閉塞、日和見感染、疼痛、乏しいカル
ノフスキー性能状態、細胞表面マーカーの存在、組織学的癌マーカーの存在、細
胞内マーカーの存在、分子マーカーの存在、腫瘍浸潤、尿の頻度、体重減少およ
びそれらの組み合わせ。増殖の阻害は、例えば、生存率の増加、減少した腫瘍サ
イズまたは腫瘍の後退によって測定され得る。
ク質レセプター(BMPR)の発現は、モルフォゲン処置に応答するようである
組織を決定するための手段を提供する。好ましい実施形態では、患者における標
的化された悪性細胞は、BMPRの発現について予めスクリーニングされて、所
定のBMP処置に応答する高い可能性を有する患者の選択を可能にする。
る[3H]−チミジンの細胞取り込み、腫瘍サイズの縮みまたは癌関連抗原の発
現の減少によって測定した場合に細胞増殖を阻害する。本発明の別の局面では、
モルフォゲンは、例えば、癌関連抗原の減少した発現、細胞形態の変化、または
分化した好ましい細胞表現型と関連した、抗原性マーカーもしくは生化学的マー
カーの増加した発現によって示されるように、癌細胞が癌表現型から分化するの
を刺激する。本発明の別の局面では、モルフォゲンを投与する前に、罹患組織は
宿主から取り出される。モルフォゲンをエキソビボプロトコルで投与した後、こ
の罹患組織をこの宿主に戻す。本発明の方法では、モルフォゲンは、1以上の非
モルフォゲン性薬剤(例えば、公知の抗癌剤、鎮痛剤または抗炎症化合物)と組
み合わせて投与され得る。
ゲンとして活性なアミノ酸改変体を投与することにより、癌を処置して、癌の1
以上の症状を緩和する方法を含む。このような改変体としては、癌細胞増殖を阻
害する、天然に存在する対立遺伝子改変体、保存的アミノ酸置換改変体、ペプチ
ドフラグメント改変体、およびこのペプチドフラグメントの保存的アミノ酸置換
改変体が挙げられる。
ミジンの細胞取り込みを阻害する、以下のいずれかのアミノ酸配列を有するダイ
マータンパク質であるモルフォゲンを投与することにより、癌の症状を緩和する
方法を含む:配列番号2の残基330〜431を含むヒトOP−1のC末端7シ
ステイン骨格と少なくとも70%相同性を有する配列、ヒトOP−1のこのC末
端7システイン骨格と少なくとも60%同一性を有するアミノ酸配列、配列番号
3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、または配列番号7。本発明の別の局
面は、骨モルフォゲン性タンパク質または骨モルフォゲン性タンパク質のモルフ
ォゲンとして活性なアミノ酸改変体である物質を投与する工程を含む。改変体と
しては、骨モルフォゲン性タンパク質の天然に存在する対立遺伝子改変体、骨モ
ルフォゲン性タンパク質の保存的アミノ酸置換改変体、骨モルフォゲン性タンパ
ク質のペプチドフラグメント改変体、およびペプチドフラグメント改変体の保存
的アミノ酸置換改変体が挙げられる。
から離れた癌細胞の分化を刺激するか、または癌の種々の他の症状を軽減する、
組成物および方法を提供する。多くの癌は、全身のさらなる部位へ転移する能力
を伴うかまたは伴わない、調節されない増殖を示す細胞によって特徴付けられる
。癌の症状を軽減するための1つの方法は、癌性細胞の増殖および分裂を停止す
ることである。モルフォゲンは、前駆細胞(すなわち、分裂細胞)を分化させ得
る。モルフォゲンへの曝露は、癌細胞の増殖を阻害する。従って、モルフォゲン
を投与することは、癌細胞の運命に影響を与え、次いで、癌の種々の特徴的症状
を軽減する。
う。TGF−βと同様に、BMPは、膜レセプター(I型およびII型)のヘテ
ロマー複合体との相互作用を介してシグナル伝達する。詳細には、リガンド結合
が、II型レセプターによるI型レセプターの交差リン酸化(cross−ph
osphorylation)を生じ;次いで、II型レセプターが、BMPシ
グナル伝達を伝搬する。Yamashitaら、Bone 19;569−57
4(1996)を参照のこと。インビトロ実験は、TGF−βスーパーファミリ
ーに属するBMPの全てのメンバーが、BMPR−IAまたはIBとの組み合わ
せのBMPR−IIに結合することを示した。Yamashitaら、前出を参
照のこと。従って、BMPR−IA、BMPR−IBおよびBMPR−IIは、
BMP特異的レセプターであるようであり、そして癌細胞増殖のモルフォゲン阻
害を媒介するようである。
ル化されたダイマーであり、SDS−PAGEによって決定されるように、代表
的に、約30〜36kDaの見かけの分子量を有する。還元された場合、この3
0kDaのタンパク質は、約16kDaおよび18kDaの見かけの分子量を有
する、2つのグリコシル化ペプチドサブユニットを生じる。還元状態において、
このタンパク質は、検出可能な骨形成活性を有さない。非グリコシル化タンパク
質(これもまた、骨形成活性を有する)は、約27kDaの見かけの分子量を有
する。還元された場合、この27kDaのタンパク質は、約14kDa〜16k
Daの見かけの分子量を有する、2つの非グリコシル化ポリペプチド鎖を生じる
。代表的に、天然に存在する骨形成タンパク質は、前駆体として翻訳され、この
前駆体は、代表的に約30残基未満のN末端シグナルペプチド配列、それに続く
「プロ」ドメイン(これは、切断されて成熟C末端ドメインを生じる)を有する
。このシグナルペプチドは、翻訳の際に迅速に切断部位で切断され、この切断部
位は、Von Heijne,Nucleic Acids Res.14:4
683−4691(1986)の方法を使用して所定の配列において予測され得
る。プロドメインは、代表的に、完全に(frilly)プロセシングされた成
熟C末端ドメインより、約3倍大きい。
テイン骨格(配列番号2の残基330〜431)との少なくとも70%の相同性
を有するか、またはヒトOP−1のこのC末端の7システイン骨格との少なくと
も60%の同一性を有し、そしてSampathおよびReddi(Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 80:6591−6595(1983)
および米国特許第4,968,590号)(これらの開示は、本明細書中に参考
として援用される)によって記載されるバイオアッセイにおいて、軟骨内性骨形
成を刺激する能力を有する、アミノ酸配列によって定義される。モルフォゲンと
してはまた、モルフォゲンレセプターを結合し得る物質、他のモルフォゲンを誘
導し得る物質、およびモルフォゲンレセプターにアゴニスト型活性を示し得る物
質が挙げられる。これらの物質は、当該分野で公知の方法によって、モルフォゲ
ン性能力についてアッセイされ得る。
ノ酸配列または102アミノ酸配列を含むモルフォゲンが挙げられる:DPP(
Drosophila由来)、Vg1(Xenopus由来)、Vgr−1(マ
ウス由来)、OP−1およびOP−2タンパク質(米国特許第5,011,69
1号およびOppermannらを参照のこと)、ならびにBMP−2、BMP
−3、BMP−4(WO88/00205、米国特許第5,013,649号お
よびWO91/18098を参照のこと)、BMP−5およびBMP−6(WO
90/11366、PCT/US90/01630を参照のこと)、BMP−8
およびBMP−9と称するタンパク質。本発明の実施において有用な他のタンパ
ク質としては、OP−1、OP−2、OP−3、BMP−2、BMP−3、BM
P−4、BMP−5、BMP−6、BMP−9、GDF−5、GDF−6、GD
F−7、DPP、Vg1、Vgr、60Aタンパク質、CDMP−1、CDMP
−2(BMP−13)、CDMP−3(BMP−12)、GDF−1、GDF−
3、GDF−5、GDF6、GDF−7、EMP−10、BMP−11、BMP
−15、UNIVIN、NODAL、SCREW、ADMPまたはNEURAL
ならびにこれらのアミノ酸配列改変体の活性形態が挙げられる。現在好ましい実
施形態において、骨形成タンパク質としては、OP−1、OP−2、OP−3、
BMP−2、BMP−4、BMP−5、BMP−6、BMP−9、ならびにこれ
らのアミノ酸配列改変体およびホモログ(これらの種ホモログを含む)の任意の
1つが挙げられる。OP−1配列およびOP−2配列、ならびにその化学的特性
および物理的特性を開示する刊行物としては、米国特許第5,011,691号
および同第5,266,683号(これらの各々は、本明細書中に参考として援
用される)が挙げられる。
としては、ヒトOP−1(配列番号2)のC末端の7システイン骨格のアミノ酸
配列との少なくとも70%の相同性を有し、そしてReddiおよびSampa
thアッセイにおいて、軟骨内性骨形成を誘導する能力を有するタンパク質が挙
げられる。これらの要件を満たす化合物は、公知の応答モルフォゲンと機能的に
等価であると考えられる。候補ペプチドが、参照モルフォゲンと機能的に等価で
あるか否かを決定するために、候補アミノ酸配列および参照モルフォゲンアミノ
酸配列を整列する。整列を実行するための第1工程は、整列ツール(例えば、N
eedlemanら、J.Mol.Biol.48:443(1970)に記載
の動的プログラミングアルゴリズム、およびAlign Program(DN
Astar,Inc.によって生産される市販のソフトウェアパッケージ)(こ
れらの教示は、本明細書中に参考として援用される))を使用することである。
最初の整列が行われた後、次いで、これは、関連タンパク質のファミリー(例え
ば、図1A〜図1Mに示されるような)の複数配列整列に対する比較によって精
錬される。この複数配列整列は、hOP−1を含む、公知のモルフォゲンのファ
ミリーの複数配列整列である。一旦、候補配列および参照配列との間の整列が行
われ、そして改良されると、パーセント相同性スコアが計算される。各配列の個
々のアミノ酸は、それらの類似性に従って、順次互いに比較される。類似性因子
としては、類似のサイズ、形状および電荷が挙げられる。アミノ酸類似性を決定
する1つの特に好ましい方法は、Dayhoffら、5 Atlas of P
rotein Sequence And Structure 345−35
2(1978および補遺)(本明細書中に参考として援用される)に記載される
、PAM25Oマトリクスである。類似性スコアは、整列された対アミノ酸の類
似性スコアの合計としてまず計算される。挿入および欠失は、パーセント相同性
およびパーセント同一性の目的のために無視される。従って、ギャップペナルテ
ィーは、この計算においては使用されない。次いで、生のスコアが、候補化合物
およびhOP−1の7システイン骨格のスコアの相乗平均で、この生のスコアを
除算することによって正規化される。この相乗平均は、これらのスコアの積の平
方根である。この正規化された生のスコアが、パーセント相同性である。
候補ペプチドは、その参照配列との少なくとも60%の同一性を有し、そしてR
eddiおよびSampathアッセイにおいて、軟骨内性骨形成を誘導する能
力を有するアミノ酸配列を有する。60%のアミノ酸同一性とは、候補ペプチド
の任意の60%のアミノ酸が、参照配列における対応するアミノ酸と整列された
場合に、同一であることを意味する。本明細書中に開示される任意の1以上の、
天然に存在するモルフォゲンまたは合成モルフォゲンは、候補配列が、そのモル
フォゲンファミリーに属するか否かを決定するための、参照配列として使用され
得る。好ましい実施形態において、この参照配列は、配列番号2に示されるよう
な、ヒトOP−1のC末端の7システイン骨格の配列である。上記計算における
使用のための保存的置換の例としては、あるアミノ酸の、類似の特性を有する別
のアミノ酸についての置換が挙げられ、例えば、以下の群内での置換が、周知で
ある:(a)バリン、グリシン;(b)グリシン、アラニン;(c)バリン、イ
ソロイシン、ロイシン;(d)アスパラギン酸、グルタミン酸;(e)アスパラ
ギン、グルタミン;(f)セリン、トレオニン;(g)リジン、アルギニン、メ
チオニン;および(h)フェニルアラニン、チロシン。用語「保存的改変体」ま
たは「保存的改変」もまた、その生じる置換ポリペプチド鎖に対して結合特異性
を有する抗体もまた、置換されていない、すなわち親ポリペプチドとの結合特異
性を有する(すなわち、「交差反応」または「免疫反応」する)限り、所定のポ
リペプチド鎖における、置換されていない親アミノ酸に代わる置換アミノ酸の使
用を含む。
ルフォゲンにおけるバリエーションを示す、包括的アミノ酸配列によって定義さ
れる。例えば、配列番号4および5は、好ましいモルフォゲン(OP−1、OP
−2、OP−3、CBMP−2A、CBMP−2B、BMP−3、60A、DP
P、Vg1、BMP−5、BMP−6、Vgr−1およびGDF−1を含む)の
間で観察されるバリエーションを包含する。配列番号5は、配列番号4の全てを
含み、そしてそのN末端で、配列番号8の5アミノ酸配列を含む。この包括的配
列は、6および7システイン骨格(それぞれ、配列番号4および5)に定義され
る、C末端ドメインにおけるこれらの配列によって共有されるアミノ酸同一性、
ならびにその配列内の可変位置についての代替的アミノ酸の両方を含む。代替的
アミノ酸を許容する位置は、「Xaa」によって示される。図2は、配列番号4
、5および8における各「Xaa」の位置についての代替的アミノ酸を示す。例
えば、配列番号4および図2Aを参照して、2位の「Xaa」は、チロシンまた
はリジンであり得る。この包括的配列は、分子間または分子内ジスルフィド結合
のための適切なシステイン骨格を提供し、そしてこのタンパク質の三次構造に影
響を与えるような特定の重要なアミノ酸を含む。さらに、配列番号4における3
6位、または配列番号5における41位での「Xaa」は、さらなるシステイン
であり得、これによって、OP−2およびOP−3のモルフォゲンとして活性な
配列を含む。
って定義されるモルフォゲンが挙げられ、これは、以下のモルフォゲンの複合型
のアミノ酸配列である:ヒトOP−1、ヒトOP−2、ヒトOP−3、ヒトBM
P−2、ヒトBMP−3、ヒトBMP−4、ヒトBMP−5、ヒトBMP−6、
ヒトBMP−8、ヒトBMP−9、ヒトBMP−10、ヒトBMP−11、Dr
osophila 60A、Xenopus Vg−1、ウニUNIVIN、ヒ
トCDMP−1(マウスGDF−5、MP52)、ヒトCDMP−2(マウスG
DF−6、ヒトBMP−13)、ヒトCDMP−3(マウスGDF−7、ヒトB
MP−12)、マウスGDF−3、ヒトGDF−1、マウスGDF−1、ニワト
リDORSALIN、Drosophila dpp、Drosophila
SCREW、マウスNODAL、マウスGDF−8、ヒトGDF−8、マウスG
DF−9、マウスGDF−10、ヒトGDF−11、マウスGDF−11、ヒト
BMP−15、およびラットBMP−3b。配列番号7は、配列番号6の全てを
含み、そしてそのN末端で、配列番号9の5アミノ酸配列を含む。配列番号6は
、そのC末端の6システイン骨格に適応し、そして配列番号7は、その7システ
イン骨格に適応する。代替的アミノ酸を許容する位置は、「Xaa」によって示
される。図3A〜3Cは、配列番号6、7および9における各「Xaa」の位置
についての代替的アミノ酸を示す。
OP−1の好ましい参照配列を定義するアミノ酸配列との、60%を超える同一
性、より好ましくは、65%を超える同一性を有する。これらの特に好ましい配
列は、OP−1タンパク質およびOP−2タンパク質の対立遺伝子改変体および
系統学的改変体(Drosophila 60Aタンパク質、ならびに密接に関
連するタンパク質BMP−5、BMP−6およびVgr−1を含む)を含む。従
って、特定の特に好ましい実施形態において、有用なモルフォゲンとしては、包
括的アミノ酸配列である配列番号3(本明細書中で「OPX」と称される)を含
むタンパク質が挙げられ、この配列は、7システイン骨格を定義し、そしてOP
−1およびOP−2のいくつかの同定された改変体の間の相同性に適応する。代
替的アミノ酸を許容する位置は、「Xaa」によって示される。図4は、配列番
号3における各「Xaa」の位置についての代替的アミノ酸を示す。なお別の好
ましい実施形態において、有用なモルフォゲンとして、参照モルフォゲンをコー
ドするDNAまたはRNAと、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するモルフォゲ
ンが挙げられる。標準的なストリンジェンシー条件は、標準的な分子生物学テキ
ストによく特徴付けられている。一般的に、Molecular Clonin
g A Laboratory Manual、(Sambrookら編、19
89);DNA Cloning,第I巻および第II巻(D.N.Glove
r編、1985);OLIGONUCULEOTIDE SYNTHESIS(
M.J.Gait編、1984);Nucleic Acid Hybridi
zation (B.D.HamesおよびS.J.Higgins編、198
4);B.Perbal,A Practical Guide To Mol
ecular Cloning(1984)を参照のこと。
ゲンプロドメインまたはその可溶性増強フラグメントに結合された成熟モルフォ
ゲンダイマーを含む、可溶性複合体形態が挙げられる。可溶性増強フラグメント
は、モルフォゲンプロドメインの任意のN末端またはC末端フラグメントであり
、このフラグメントは、その成熟モルフォゲンダイマーと複合体を形成し、そし
てこのモルフォゲンダイマーの可溶性を増加させる。好ましくは、この可溶性複
合体は、モルフォゲンダイマーおよび2つのプロドメインペプチドを含む。モル
フォゲン可溶性複合体は、公開出願WO94/03600(本明細書中に参考と
して援用される)に記載される。
生合成構築物が挙げられ、これらには、新規な生合成モルフォゲンおよび2以上
の公知のモルフォゲン由来の配列を使用して設計されたキメラタンパク質が挙げ
られる。米国特許第5,011,691号(本明細書中に参考として援用される
)(例えば、COP−1、COP−3、COP−4、COP−5、COP−7お
よびCOP−16)を参照のこと。
物被験体の処置に適用され得る。医学または獣医学分野の当業者は、哺乳動物が
、癌に罹患しているか否かを認識するように訓練されている。例えば、慣用的な
試験、および/または臨床診断もしくは獣医学診断の評価によって、その哺乳動
物が、癌の任意の症状を有するか否かが明らかにされる。癌の症状は、調節され
ない細胞増殖、および/または癌細胞表現型を有する細胞の増殖を含む。他の一
般的な癌の症状としては、以下が挙げられる:異常な身体機能、異常な細胞形態
、異常な酵素レベル、異常なホルモンレベル、異常な腫瘍胎児抗原レベル、異常
な組織増殖、異常な組織重量、異常な組織関連タンパク質レベル、変化した神経
機能、変化した神経構造、腫瘍に血液供給を提供する所望でない脈管形成、異常
な出血、下痢、滲出、疲労、発熱、病変、栄養失調、転移、悪心、身体の通路の
閉塞、日和見感染、疼痛、乏しいカルノフスキー性能状態、癌関連細胞表面マー
カーの存在、癌関連組織学的マーカーの存在、癌関連細胞内マーカーの存在、癌
関連分子マーカーの存在、腫瘍浸潤、尿の頻度、および体重減少。一般的には、
Harrison’s Principles of Internal Me
dicine 493−627(Fauciら編、第14版、1998)を参照
のこと。
部位は、より癌に罹り易いようである。本発明の組成物および方法が処置するこ
とが予測される、いくつかのより一般的な癌としては、以下が挙げられる:副腎
癌、肛門癌、膀胱癌、骨癌、脳の癌、乳癌、頸癌、結腸癌、癌体(corpus
cancer)、内分泌癌、食道癌、ファローピウス管癌、脂肪細胞癌、胆嚢
癌、胃腸管癌、生殖細胞腫瘍、腎臓癌、白血病、肝臓癌、リンパ腫、肺癌、筋肉
の癌、神経系の癌、眼組織の癌、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、
皮膚癌、小腸癌、軟組織の癌、胃癌、奇形癌腫(奇形腫)、精巣癌、甲状腺癌、
尿管癌、泌尿器系(urinary)の癌、子宮癌、および未知の原発部位の転
移性の癌。一般的には、Harrison’s Principles of
Internal Medicine 493−627(Fauciら編、第1
4版、1998)を参照のこと。
。しかし、本発明に従って、現在、モルフォゲンが癌細胞増殖を調節し得ること
が発見された。上記のように、BMPRは、BMPシグナル伝達を媒介する。例
えば、前立腺癌において、BMP−2が、LNCaP細胞の増殖速度を減少させ
ることが示されている(ten Dikjeら、J.Biol.Chem.26
9:16985−988(1994)を参照のこと)。前立腺は、非常に高レベ
ルのBMPR−IBを発現することもまた実証されている(Ideら、Onco
gene 14:1377−382(1997);Autzenら,Br.J.
Cancer 78:1219−223(1998)を参照のこと)。本発明に
従って、現在、BMP−6が、BMPRの3つの型全てを発現する、マウス前立
腺腫瘍異種移植片の増殖を阻害することが示された(実施例7、下記)。それゆ
え、標的化された悪性細胞上でのBMPR発現の決定は、所定のモルフォゲンに
応答する高い可能性を有する被験体の選択を可能にする、被験体のプレスクリー
ニングの新規な方法を表す。標的化された細胞は、患者から得られ得、そして特
異的BMPRの発現が、例えば、メッセンジャーRNA単離およびノーザンブロ
ット分析によって決定され得る。次いで、この標的化された細胞におけるBMP
R発現に基づいて、効果的な処置を提供する可能性が最も高い、適切なモルフォ
ゲンが選択される。あるいは、標的化された組織上での必須要件のBMPR発現
の非存在に基づく、モルフォゲン処置に対して応答する可能性が低い患者が、代
替的治療に参照され得る。
、任意の適合性の経路によって投与され得る。任意の適切な手段(例えば、直接
的(例えば、組織部位への注射、移植または局所的投与によるように、局所的に
)、全身的(例えば、非経口的または経口的)、外在的(例えば、i.v.バッ
ク)または内在的(例えば、生体腐食(bioerodable)移植片、また
は移植された、モルフォゲン産生細胞のコロニー))が、癌細胞増殖を阻害し得
、そして/または癌細胞表現型を有する細胞の分化を刺激し得るモルフォゲン送
達を達成し得る。好ましい実施形態において、モルフォゲンの腫瘍組織への直接
注射が、腫瘍の壊死およびびまん性炎症を生じる。この薬剤は、好ましくは、以
下のような非経口投与のための、水性または生理学的に適合性の液体懸濁物ある
いは溶液の一部を含む:静脈内投与、皮下投与、分子内投与、眼内投与、腹腔内
投与、筋内投与、口腔投与、直腸投与、膣内投与、眼窩内投与、大脳内投与、頭
蓋内投与、脊椎内投与、脳室内投与、髄腔内投与、槽内投与、嚢内投与、鼻内投
与またはエアロゾル投与。モルフォゲンのキャリアまたはビヒクルは、生理学的
に受容可能であり、その結果、所望の薬剤の患者への送達に加えて、患者の電解
質および/または容積のバランスに他の異常な影響を及ぼさない。従って、この
薬剤のための液体媒体は、通常の生理学的生理食塩水(例えば、9.85% N
aCl水溶液、0.15M、pH7〜7.4)を含み得る。当業者は、例えば、
Remington’s Pharmaceutical Science(G
ennaro,A.編、Mack Pub.、1990)に記載のような、任意
の型の非経口投与のための有用な溶液を調製し得る。例えば、ローション剤、ク
リーム剤、軟膏剤または石鹸のような皮膚科学的に受容可能なキャリアでのモル
フォゲンの分散は、皮膚表面への局所適用に適切な処方であり、皮膚癌を処置す
るために特に有用である。
、生理学的な溶液において、その対応する成熟形態よりも、可溶性であるプロ形
態のモルフォゲンを生じる。実際、内因性モルフォゲンは、この形態で哺乳動物
体内で輸送(例えば、分泌および循環)されると考えられる。モルフォゲンを分
泌する哺乳動物細胞(例えば、モルフォゲンをコードする核酸でトランスフェク
トされた細胞、およびモルフォゲンを発現する能力を有する細胞)のための培養
培地は、この可溶性形態のタンパク質の1つの供給源である。あるいは、モルフ
ォゲンプロドメインポリペプチドまたはその可溶性増強フラグメントとの、モル
フォゲンとして活性な成熟ポリペプチドダイマー(またはその活性フラグメント
)の複合体化は、可溶性種を作製する。可溶性増強プロドメインフラグメントは
、モルフォゲンファミリーのメンバーのプロ領域の、任意のN末端、C末端また
は内部フラグメントであり得、これは、成熟ポリペプチドダイマーと複合体化し
て、生じる非共有結合性複合体または共有結合性複合体の安定性および/または
溶解性を増強する。代表的に、タンパク質分解性部位Arg−Xaa−Xaa−
Argで切断されたフラグメントが、有用である。モルフォゲン性タンパク質の
可溶性複合体形態の詳細な説明(それらを作製、試験および使用する方法を含む
)は、WO94/03600(PCT US 93/07189)に記載される
。OP−1の場合、有用なプロドメインポリペプチドフラグメントとしては、イ
ンタクトなプロドメインポリペプチド(残基30〜292)、ならびにフラグメ
ント48〜292および158〜292(全て、配列番号2の残基)が挙げられ
る。さらに、他の分子が、可溶性を増強し、そして経口投与に特に有用である。
例えば、0.2%カゼインの添加は成熟活性形態のOP−1の可溶性を、80%
増加する。乳汁および/または種々の血清タンパク質に見出される他の成分もま
た、有用であり得る。
、首尾よくない。なぜなら、哺乳動物の消化系における消化酵素および酸が、タ
ンパク質が血流内に吸収される前に、ほとんどのタンパク質を分解するからであ
る。しかし、ほとんどのタンパク質とは異なり、モルフォゲンは、代表的に、酸
安定性かつプロテアーゼ耐性である。例えば、米国特許第4,968,590号
を参照のこと。さらに、乳腺抽出物、初乳、および57日目の乳汁は、少なくと
も1つのモルフォゲン、OP−1を含む。乳腺抽出物から精製されたOP−1は
、モルフォゲンとして活性であり、そして血流中に検出される。従って、摂取さ
れた乳汁を介する母系の投与は、OP−1および他のモルフォゲンタンパク質の
自然な送達経路であり得る。例えば、Letterioら、Science 2
64:1936−1938(1994)を参照のこと。さらに、乳汁中に見出さ
れるモルフォゲン(および乳腺抽出物および初乳)は、容易に可溶性であり、こ
れは、おそらく、プロドメインおよび/または別の乳汁成分との会合による。
口投与されるモルフォゲンに有用である。例えば、このモルフォゲンは、胃腸内
層と相互作用し、そしてこの内層を介して吸収される、生物学的に腐食性のミク
ロスフェアの一部であり得る。有用なポリマーとしては、例えば、ポリスチレン
、ポリラクチド(polyactide)および/またはポリグリコリドおよび
/またはポリシアノアクリレートポリマー、ならびにそれらの組み合わせが挙げ
られる。
多くの物質がCNSへ侵入するのを防御する脳の毛細管構造)を越えなければな
らない。当該分野で周知の方法によるモルフォゲンのCNSへの直接注入は、血
液脳関門を回避するための1つの様式である。あるいは、改変されたモルフォゲ
ンが、血液脳関門を横切る輸送の増強を示し得る。例えば、短縮化形態のモルフ
ォゲンが、最も首尾よくあり得る。あるいは、当業者は、本発明のモルフォゲン
を改変して、親油性部分または血液脳関門を横切って活発に輸送される物質に誘
導体化または結合体化させ得る。例えば、Pardridge、Endocri
ne Reviews 7:314−330(1986)および米国特許第4,
801,575号を参照のこと。
会合が、可能である。例えば、抗体、抗体フラグメント、または所望の組織の細
胞上の表面分子と特異的に相互作用する他の結合タンパク質が、モルフォゲンを
標的化するために適切である。米国特許第5,091,513号に開示される単
鎖結合部位技術が、標的化分子を設計するために有用である。
に曝露させるために有用である。罹患組織をモルフォゲンに曝露させることに加
えて、モルフォゲンを発現し得る細胞が、その罹患組織に送達され得る。当業者
は、標準的な手段を使用して、モルフォゲンを発現し得るような細胞を構築し得
る。生体適合性、生分解性、生体腐食性のマトリクス(例えば、コラーゲンまた
はヒドロキシアパタイト)は、細胞が分化の間に、そのマトリクス物質内へ浸潤
および増殖することを可能にするために有用である。さらに、当業者は、宿主か
ら罹患組織を取り出し、その組織を本明細書中に記載の任意の種々のモルフォゲ
ンに曝露させて、次いでその組織を宿主に戻し得る。これらのインビトロ、イン
ビボ、またはエキソビボのいずれかでの適用が、癌細胞増殖を阻害し、そして/
または癌細胞表現型を有する細胞を、その癌細胞表現型から離れるような分化を
刺激するのに有用である。本発明の1つの局面において、NG108−15細胞
、胚性癌腫NTERA−Z CL.D1細胞、LNCaP細胞、MCF−7細胞
、骨肉腫細胞、ヒト肺癌A−549細胞、および神経膠細胞腫A−172細胞の
増殖が、阻害される。
を含む。有効な用量および投薬ストラテジーは、以下を含む多くの因子に依存し
て変化する:選択された薬剤の生物学的効力、特定の薬剤の化学的特性(例えば
、疎水性)、薬剤の処方、投薬経路、標的位置、薬剤の薬物動態、疾患組織の状
態、および特定の哺乳動物の全体的な健康状態。例えば、約200μLの100
ng/mLのBMP−6の腫瘍内投与は、マウスにおける腫瘍増殖を阻害した(
実施例7、下記を参照のこと)。
他の分子と組み合わせて投与され得る。例えば、モルフォゲンと共に、種々の周
知の抗腫瘍剤、鎮痛薬または抗炎症化合物を投与し得る。さらに、モルフォゲン
と共に、種々の周知の増殖因子、ホルモン、酵素、治療組成物、抗生物質または
他の生物活性薬剤を投与し得る。
々のモルフォゲンの効果の実験的証拠を提供する。これらの癌細胞株の各々は、
調節されていない増殖のいくつかの形態により、特徴付けられる。種々の実施例
において以下に示すように、モルフォゲンに曝露された癌細胞の細胞増殖が、阻
害された。さらに、いくつかの実施例においては、細胞分化の形態学的特徴が観
察された。これらの実験データは、恐らく癌細胞の細胞増殖を阻害することおよ
び/または細胞分化を刺激することによって、モルフォゲンが癌の症状を軽減し
得ることのポジティブな証拠を提供する。
導細胞分化) モルフォゲン誘導細胞分化の1例として、神経細胞の分化に対するOP−1の
効果を、培養物中で試験した。具体的には、NG108−15神経芽腫×神経膠
腫ハイブリッドクローン細胞株に対するOP−1の効果を評価した。NG108
−15細胞株(単に「NG108」とも呼ばれる)は、培養物中で、線維芽細胞
型の形態を示す。この細胞株は、0.5mMブチレート、1%DM50または5
00mM Forskolinを使用して、化学的に分化を誘導され得、培養さ
れる一次ニューロンの実質的に全ての重要な神経特性の発現を誘導する。しかし
、これらの細胞の化学的な誘導はまた、細胞分裂の停止を誘導する。
ェルのプレート上で継代培養した。各ウェルは、化学的に規定された2.5ml
の培地中に、40,000〜50,000個の細胞を含んだ。この化学的に規定
された培地は、ダルベッコ改変イーグル培地:Ham’s F−12(3:1)
、NaHCO3(3.7g/リットル)、微量元素(0.5nM Mo、0.5
nM Mn、5nM Cd、15nM Se、25nM Sn、0.25nM
Ni、および0.25nM Si)、25mM HEPES、10:g脂肪酸な
しアルブミンと複合体形成したオレイン酸、50μg/mlトランスフェリン、
25μg/mlインスリン、2mMグルタミン、ならびに25nM Na3VO4 を含有した。Chamessら、J.Biol.Chem.261:3164〜
3169(1986);Peridesら、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 89:10326〜30(1992)(本明細書中に参考として
援用する)を参照のこと。3日目に、2.5:1の、0.025%トリフルオロ
酢酸を含有する60%エタノール中のOP−1を、各ウェルに添加した。0、1
、10、40および100ng/mlの濃度のOP−1を試験した。培地を毎日
、新しいOP−1のアリコートで交換した。4日後、40ngおよび100ng
/mlのOP−1濃度で、OP−1は、NG108細胞の分化を誘導した。図5
は、生じる形態学的変化を示す。OP−1は、細胞の集塊化(clumping
)および円形化(rounding)、ならびに神経表現型に特有の軸索成長の
生成を誘導した(図5A(ナイーブNG108細胞)と図5B(OP−1で処理
された細胞の効果を示す)とを比較のこと)。従って、OP−1は、細胞の、神
経細胞形態への分化を誘導し得る。成長のいくつかは、シナプス型接合に連結す
ることがわかった。この効果は、1〜100ng/mlの濃度のTGF−β1と
共にインキュベートした細胞においては、見られなかった。OP−1の神経保護
効果は、NG108細胞での化学的分化剤との比較によって、実証された。50
,000個の細胞を6ウェルのプレートにプレートし、そしてブチレート、DM
SO、ForskolinまたはOP−1で4日間処理した。細胞計数は、化学
試薬を含有する培養物においては分化に細胞分裂の停止が付随することを実証し
た。対照的に、細胞は、[3H]−チミジン取り込みにより決定されるように、
OP−1によって分化が誘導されて分裂を続けた。これらのデータは、OP−1
が、分化後の培養物において細胞の安定性を維持し得ることを示唆する。
害) 別の関連する実施例は、本発明のモルフォゲンが、形質転換された細胞の「再
分化」を誘導する能力を実証する。ヒト胎生期癌(EC)細胞株NTERA−2
CL.D1(「NTERA2」)を、ヒト奇形癌から誘導した。Andrews
ら、Lab.Invest.50:147〜167(1984)を参照のこと。
外部刺激の非存在下では、これらの細胞は、分化していない幹細胞として維持さ
れ得、そして無血清培地(SFM)内での増殖を誘導し得る。モルフォゲン処置
の非存在下では、細胞は激しく、そして足場非依存的に増殖する。モルフォゲン
処置の効果は、図6A〜Dに見られる。図6Aおよび6Bは、OP−1の存在下
(25ng/ml、6A)またはモルフォゲンの非存在下(6B)での、SFM
中での4日間の増殖を示す。図6Cおよび6Dは、10ng/ml OP−1の
存在下(6C)またはモルフォゲンなし(6D)での、5日間の増殖である。図
6Cおよび6Dは、図6Aおよび6Bと比較して10倍および20倍の拡大であ
る。容易に見られ得るように、OP−1の存在下では、EC細胞は平坦化細胞と
して増殖し、足場依存性になった。さらに、増殖速度は約10倍減少した。最終
的に、これらの細胞は、分化を誘導された。これらの結果は、奇形癌細胞株にお
いて、モルフォゲンが細胞を分化させ、そして細胞の増殖を阻害することを示す
。
ゲン阻害) 55歳を超える全ての男性の約25%が、何らかの形態の前立腺疾患に悩んで
いる。アンドロゲンは、前立腺癌細胞の増殖を刺激することが公知である。代表
的に、前立腺癌細胞は、最終的にその増殖のためのアンドロゲンへの依存を失い
、そしてこの癌は、より悪性のアンドロゲン非依存状態に進行する。アンドロゲ
ン応答性の欠損はまた、前立腺癌の転移性形態に特有である。従って、前立腺癌
を処置する従来の方法は、何らかの形態のアンドロゲン制御または剥離を利用し
て、アンドロゲンにより刺激される増殖および前立腺癌のより悪性の転移性形態
への最終的な進行を防止する。
開発により、より最近に可能になった。このような抗原としては、前立腺血清抗
原(PSA)、前立腺酸ホスファターゼ(PAP)、および前立腺インヒビン(
PIP)が挙げられる。早期の検出は、早期の処置の機会を与える。現在、前立
腺癌を処置する最も通常利用可能な方法は、癌性前立腺の除去のための外科手術
または放射線治療を包含する。さらに、ホルモン治療(例えば、アンドロゲンの
剥離または制御)の様々な方法が、固形の転移性の前立腺癌の発達を遅くするた
めに、通常利用される。しかし、前立腺癌の処置のためのこれらの現在利用可能
な治療に供される患者はまた、様々な所望でない副作用(特に、失禁および不能
症)の危険がある。従って、このような所望でない副作用を付随しない治療の必
要性が存在する。
GF−βスーパーファミリーの非モルフォゲンメンバー)の、前立腺癌の処置の
ための治療試薬としての効果を研究した。例えばWangら、Endocrin
ology 137:5476〜5483(1996)を参照のこと。しかし、
高い腎臓毒性が、有効な治療用抗癌剤としてのアクチビンのさらなる開発を、妨
害した。本明細書中に記載のように、モルフォゲン(OP−1およびBMP−6
など)が、アンドロゲン依存性前立腺癌細胞およびアンドロゲン非依存性前立腺
癌細胞の両方の増殖を阻害し得ることが、現在見出されている。アクチビンとは
対照的に、OP−1およびBMP−6などのモルフォゲンは、骨組織、腎臓機能
、および身体の他の軟組織と適合性であることが公知である。従って、本発明は
、OP−1およびBMP−6などのモルフォゲンを前立腺癌患者に投与する工程
を包含する、前立腺癌を処置する方法を提供する。一旦、モルフォゲンが患者に
投与されると、前立腺癌細胞増殖のモルフォゲン媒介阻害が、様々な標準的方法
(組織サイズおよび構造の減少を検出するための試験、循環抗原(PSAなど)
のレベルの測定、ならびに患者の不快感および尿生殖器管機能のモニタリングが
挙げられる)を使用して臨床医によりモニタされ得る。
アンドロゲン応答性LNCaP細胞株(アンドロゲン応答性前立腺癌の樹立され
たインビトロモデル)を使用して実証されるように、前立腺癌細胞の増殖を阻害
する。LNCaP前立腺癌モデルは、3つの実験で利用される。第一に、BMP
−6、OP−1(BMP−7)、アクチビン、またはTGF−β1の、外因性ア
ンドロゲンの非存在下でのLNCaP細胞の細胞増殖に対する効果を試験した。
第二に、BMP−6、OP−1(BMP−7)、アクチビン、またはTGF−β
1の、アンドロゲンに曝露されたLNCaP細胞の細胞増殖に対する効果を試験
した。第三に、LNCaP細胞におけるBMP−6、OP−1(BMP−7)、
およびアクチビンの生物活性に対する、フォリスタチン、アクチビンおよびモル
フォゲン結合タンパク質の効果を試験した。
ection(Rockville、MD)から入手し、そして75cmのフラ
スコ内で、10%ウシ胎仔血清を含有するRPME−1640(RPMI/10
%FBS)で、5%CO2:95%空気の加湿した大気中で増殖させた。培養培
地を3日ごとに交換した。アクチビンおよびBMPのアッセイのために、トリプ
シン化した細胞の懸濁液を96ウェルのプレート上に再プレートすることにより
、ストック培養物を継代培養した。この目的で、LNCaP細胞を、0.5mL
のRPMI/10%FBS中3×104細胞/ウェルで、24ウェルのプレート
内にプレートし、そして48時間インキュベートして、研究用のサブコンフルエ
ントな培養物を樹立した。予備インキュベーション期間の後に、培地を穏やかに
吸引し、細胞を温RPMLで1回洗浄し、そして細胞を、細胞増殖速度(例えば
、細胞増殖)に対する処置効果の研究のために、0.5mlの2%FBS含有R
PMI中で引き続き培養した。様々な用量のアクチビン、BMP、DHT、また
はFSを、単独でまたは組み合わせて、三連ウェルに添加し、そしてインキュベ
ーションをさらに48時間継続した。細胞への[3H]−チミジンの取り込みの
後に、細胞をRPMIで1回洗浄し、そして0.5mLの10%冷トリクロロ酢
酸(TCA)で20分間4℃で沈殿させた。2回のメタノール洗浄の後に、沈殿
物を0.5mLの1N水酸化ナトリウム中に可溶化し、そして放射性の量を、液
体シンチレーションカウンター中で計数した。[3H]−チミジンの取り込みは
、cpm/ウェルで表現され、そして細胞増殖速度の定量的測定を表す。第一の
実験例において、LNCaP細胞(外因性アンドロゲンの非存在下)を、示した
ように、様々な濃度のBMP−6、OP−1(BMP−7)、アクチビン、また
はTGF−β1に曝露した。これらの物質のLNCaP細胞に対する効果を、[ 3 H]−チミジン取り込みアッセイを使用して評価した。図7は、アクチビンお
よびモルフォゲン(BMP−6およびOP−1(BMP−7))が、用量に依存
する様式で、細胞増殖を阻害することを示す。BMP−6は、OP−1(BMP
−7)より高い効力を有した。第二の実験例において、LNCaP細胞(10n
M DHTアンドロゲンに曝露)を、アンドロゲン(10nM DHT)の存在
下で、様々な濃度のBMP−6、OP−1(BMP−7)、アクチビンまたはT
GF−β1に曝露し、そしてこれらの物質の効果を、[3H]−チミジン取り込
みアッセイを使用して評価した。図8は、アクチビンおよびモルフォゲン(BM
P−6およびOP−1(BMP−7))が、用量に依存する様式で、アンドロゲ
ンで刺激されたLNCaP細胞の増殖を阻害したことを示す。BMP−6は、O
P−1(BMP−7)より高い効力を有した。
P−1(BMP−7)、または0.1nMアクチビンに曝露し、続いて0.5:
1、1:1、2:1、5:1、および10:1のフォリスタチン:リガンドの比
で、アクチビン/BMP結合タンパク質フォリスタチン(FS)に曝露した。フ
ォリスタチンおよびリガンドの、LNCaP細胞の増殖に対する効果を、[3H
]−チミジン取り込みアッセイを使用して評価した。図9は、フォリスタチンが
、両方のモルフォゲン(BMP−6およびOP−1(BMP−7))の生物活性
を中和したことを示す。
ゲン阻害および分化のモルフォゲン誘導) この実施例は、モルフォゲンOP−1が、エストロゲン応答性ヒト乳癌MCF
−7細胞の増殖を阻害することを実証する。MCF−7細胞を、5%ウシ胎仔血
清(FBS)、2mM L−グルタミン、イーグル(Earle’s)BSS、
1mMピルビン酸ナトリウム、抗生物質、および10mg/mlウシインスリン
で補充したイーグルMEM中で、単層培養物に増殖させた。フェノールレッド含
有培地からの可能なステロイド様人工産物を防止するために、実験処理の前に、
細胞を、各々内因性ステロイドをデキストラン被覆チャコールで除去し、5%F
BSで補充した、フェノールなしの無血清培地、またはフェノールなしの培地と
共にインキュベートした。
−βの効果を、血清の存在下および非存在下で試験した。細胞を、24ウェルま
たは48ウェルのプレート中で増殖させた。OP−1またはTGF−β1を、示
したような様々な濃度で無血清培地に添加するか、あるいは、OP−1またはT
GF−β1を、5%血清含有培地に、示したような様々な濃度で添加した。図1
0Aおよび10Bは、OP−1およびTGF−β1の両方が、[3H]−チミジ
ン取り込みアッセイを使用して、用量に依存する様式で細胞増殖を阻害したこと
を示す。血清の存在下または非存在下で、OP−1は、細胞増殖を、200ng
/mlでコントロールの約80%まで阻害し(図10A、塗りつぶした正方形)
、そして5%血清含有培地の存在下、200ng/mlでコントロールの約65
%まで阻害した(図10B、塗りつぶした正方形)。TGF−β1は、細胞増殖
を、無血清培地中10ng/mlでコントロールの約65%まで阻害し(図10
A、塗られていない円)、そして5%血清含有培地中、10ng/mlでコント
ロールの約55%まで阻害した(図10B、塗られていない円)。
乳癌細胞に対するOP−1またはTGF−β1の効果を試験した。MCF−7細
胞を、17−βエストラジオール(1×10-11、10-10、10-9、10-8、1
0-7、10-6M)で補充した培地中でインキュベートし、次いで200ng/m
lのOP−1に曝露した。細胞増殖に対する効果を、[3H]−チミジン取り込
みアッセイを使用してアッセイした。図1Aは、17−βエストラジオールに曝
露されたがOP−1には曝露されなかったMCF−7細胞が、10-9M 17−
βエストラジオールで、細胞増殖をコントロールの約250%に増加させたこと
を示す(塗られていない正方形)。10-9M 17−βエストラジオールおよび
OP−1の両方に曝露されたこれらのMCF−7細胞は、コントロールの約80
%の細胞増殖の阻害を示した(塗りつぶした正方形)。すぐ上に記載した同じプ
ロトコルを使用して、10ng/ml TGF−β1を、OP−1で置換した。
図11Bは、TGF−β1が、10-11M 17−βエストラジオールで刺激さ
れたMCF−7細胞において、細胞増殖をコントロールの約40%まで阻害した
ことを示す(塗りつぶした円)。
ロゲンアンタゴニストであるタモキシフェンを、OP−1との比較において、な
らびにOP−1に加えて、その効果について試験した。MCF−7細胞を、1×
10-6Mタモキシフェン、100ng/mlのOP−1、または組み合わせたタ
モキシフェンおよびOP−1に曝露した。細胞増殖を、[3H]−チミジン取り
込みアッセイを使用してアッセイした。図12は、これらの濃度のOP−1また
はタモキシフェンが、細胞増殖をコントロールの約40%まで阻害したことを示
す。共に、OP−1およびタモキシフェンは、細胞増殖をコントロールの約70
%まで阻害した。
殿を使用して、MCF−7細胞へと安定にトランスフェクトした。プラスミドp
CDM8(Invitrogen)から単離したCytomegaloviru
sの主要前初期プロモーター(MIE)を使用して、OP−1 cDNAの転写
を指向した。SV40初期領域スプライスシグナルおよびポリ−A付加シグナル
(pMAMneo(Clonetech、Inc.)から入手)の両方を、3’
プロセシングエレメントとして付加した。イントロンおよびスプライス部位を有
さない、同じベクター由来のより短い3’領域もまた、等しい成功で使用された
。真核生物選択マーカーネオマイシンもまた、SV40初期プロモーターの転写
制御下に、存在した。米国特許第5,712,119号;米国特許第5,614
,385号;米国特許第5,585,237号(それぞれを本明細書中に参考と
して援用する)を参照のこと。
皿の密度でプレートした。OP−1遺伝子を含有するプラスミドから調製した精
製DNA(50マイクログラム)を、リン酸カルシウム沈殿法によって、細胞内
にトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後に、細胞をトリプシン
化し、そして400mg/ml G418を含有する選択培地を含む新しいプレ
ート上に、1:3でプレートした。G418耐性コロニーが、約2週間後に見ら
れ、そしてこれらの細胞のいくつかを使用して、ノーザンブロット分析により、
OP−1遺伝子を検証した。
芽細胞様)の変化が起こった。エストロゲンに対する細胞の応答性もまた、変化
した。OP−1でトランスフェクトしたMCF−7細胞を、様々な用量の17−
βエストラジオール(10-7〜10-11M 17−βエストラジオール)で3日
間処理した。細胞増殖を、[3H]−チミジン取り込みアッセイを使用してアッ
セイした。17−βエストラジオールは、細胞増殖を刺激しなかった。実際に、
OP−1遺伝子でトランスフェクトしたMCF−7細胞は、1×10-7M 17
−βエストラジオールで、コントロールの約50%の細胞増殖の用量依存性阻害
を示した。
ロゲンにより刺激される増殖を阻害することを、集合的に実証する。OP−1は
また、MCF−7細胞の細胞分化を誘導し、これは恐らく、上皮細胞型から間葉
への切り替えであり、特定のエストロゲン応答性ヒト乳癌の治療剤としてのOP
−1などのモルフォゲンの使用に矛盾しない。
の細胞増殖を阻害することを実証する。A−172細胞を、1ウェルあたり5×
104細胞で、48ウェルのプレート内で10%FBSを含有するDMEM中に
プレートした。24時間後、増殖培地を無血清DMEMと交換した。OP−1(
1、10、40、100、200ng/ml)を、この細胞に添加し、そして5
%CO2の存在下で24時間、37℃でインキュベートした(これは、1μCi
[3H]−チミジンでの6時間のパルスを含んだ)。このインキュベーションの
後に、細胞をPBSで洗浄した。TCA(10%)を添加し、そして細胞を15
分間インキュベートした。細胞層を蒸留水で3回洗浄し、そして1%SDSで抽
出した。組み込まれた放射性を、液体シンチレーションアナライザーで測定した
。図13は、モルフォゲンOP−1が、100ng/mlで、A−172癌細胞
の増殖をコントロールの約50%まで阻害したことを示す。
を阻害することを実証する。A−549細胞を、1ウェルあたり5×104細胞
で、48ウェルのプレート内で10%FBSを含有するDMEM中にプレートし
た。24時間後、増殖培地を無血清DMEMと交換した。OP−1(1、10、
20、40、100、200ng/ml)をこの細胞に添加し、そして5%CO 2 の存在下で24時間、37℃でインキュベートした(これは、1μCi[3H]
−チミジンでの6時間のパルスを含んだ)。このインキュベーションの後に、細
胞をPBSで洗浄した。10% TCAを添加し、そして細胞を15分間インキ
ュベートした。細胞層を蒸留水で3回洗浄し、そして1%SDSで抽出した。組
み込まれた放射性を、液体シンチレーションアナライザーで測定した。図14は
、OP−1が、A−549 1mg癌細胞の増殖を、用量に依存する様式(20
0ng/mlで約70%の阻害を達成する)で阻害したことを示す。他方で、T
GF−132は、1ng/mlで最大で77%の細胞増殖を阻害した。
ロで試験した。最初に、これらのマウス前立腺癌細胞株におけるBMPレセプタ
ー(BMPR)の発現を、ノーザンブロット分析により調査した。これらの結果
は、両方の細胞株が3種類のBMPRを発現すること、およびモルフォゲンBM
P6がこれらの細胞株の増殖を用量に依存する様式で阻害することを、実証する
。
の、E4およびF11と称される、2つの細胞株を、10%ウシ胎仔血清(FB
S)、5μg/mlインクリン(inculin)、および108Mジヒドロレ
ステロンで補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中に維持した(F
osterら、Cancer Res.7:3325〜330(1997)を参
照のこと)。全ての細胞を、第20継代から第23継代まで誘導した。
た。次いで、BMP−6を以下の濃度で添加した:1、10、および100μg
/ml。この培地を1日おきに交換した。6日間周期の終了時に、細胞を収集し
、そして血球計を使用して計数した。全てのアッセイを3回行い、そして各回に
、類似の結果を得た。
により検証した。細胞を収集した後に、mRNAを、市販のキット(Ribos
ep、Collaborative Biomolecules、Bedfor
d、MA)を使用して、製造業者の推奨するプロトコルに従って単離した。ノー
ザンブロット分析のために、2μgのポリA RNAを、1%ホルムアルデヒド
−アガロースゲル中で電気泳動により分離し、そしてナイロン膜(Zeta−P
robe GT膜、Bio−Red Laboratories、Hercul
es、CA)に移した。続いて、この膜を2×SSC(1×SSC=0.15M
クエン酸Na、pH7.0)中でリンスした。次いで、分離したRNAを、紫外
光架橋剤を使用して、ナイロン膜に架橋させた。プレハイブリダイゼーションを
、50%ホルムアミド、0.12M Na2HPO4(pH7.2)、0.25M
NaCl、7%(wt/vol)SDS、および250μg/ml熱変性ニシ
ン精子DNA(Promega Corp.Madison、WI)中42℃で
2時間実施した。ハイブリダイゼーションを、ランダムオリゴヌクレオチドプラ
イミングキット(Random Primers DNA標識システム、Lif
e Technologies)を使用して、[32P]−デオキシ−CTP(A
mersham Corp.、Arlington Heights、IL)で
標識されたプローブを含有する、プレハイブリダイゼーション溶液中で、42℃
で一晩実施した。膜をSSCの段階希釈物中で洗浄した後に、オートラジオグラ
フィーを、増感スクリーンを用いて、Kodak X−Moat ARフィルム
(Eastman Kodak、Rochester、NY)を使用して、−7
0℃で実施した。
BMPR−IB、およびBMPR−II)を発現した。以前に報告されたように
、BMPR−IIについて3つのスプライス改変体が存在する。Rosenzw
eigら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7632〜
636(1995)を参照のこと。
で、増殖の速度を劇的に減少させた(図16を参照のこと)。具体的には、10
0ng/ml BMP−6の存在下では、E4細胞およびF11細胞の細胞計数
は、コントロール(BMP−6なし)の細胞計数の約60%であった。これら2
つの細胞株は、3種類全てのBMPRを発現し、そしてBMP−6に感受性であ
ったので、E4細胞株を、BMP−6のインビボでの治療効力を考慮する引き続
く分析のために、無作為に選択した。
うに、マウス前立腺癌細胞株E4を使用して、試験した。成体雄性C57BL/
6マウスを購入し、そしてGuidelines for the Care
and Use of Experimental Animalsに確立され
るNH標準に従って、維持した。30匹のマウスに、107個の細胞を皮下に接
種した。6週間で、21匹のマウスが触知可能な腫瘍を有した。これらの動物を
各7匹の3つのグループに分けた。実験グループは、200μlの100ng/
ml BMP−6を受け、一方でコントロールグループは、ビヒクル(20mM
アセテートおよび5%マンニトール、pH4.5)を受けたか、または処置を受
けなかった。注射を、3週間にわたって1日おきに腫瘍に直接送達した。これら
の動物を、治療の開始後10週間にわたって観察し、そして各動物の腫瘍容積を
毎週測定した。
し、そしてパラフィンに埋包した。続いて、5μm切片を各腫瘍から得、そして
ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色した。
スのうち5匹は生存していたが、他のグループの全ての動物は死亡していた(表
1)。5匹のマウスのうち2匹が、触知可能でない腫瘍を有した。
(図17に示す)は、BMP−6で処置したマウスの平均の腫瘍は、ビヒクルの
みを与えたマウスの平均の腫瘍の約3分の1であったことを示す。ビヒクルを受
けたグループと、処置を受けなかった動物との間では、腫瘍増殖の速度間に有意
な差異がなかった(データは示さない)。
る試みとして、2つの非生存動物(これらはBMP−6処置に応答性ではなかっ
た)からのデータを除いた後に、データの再分析を実施した(図18)。全ての
統計をχ2検定により評価し、そして0.05未満のPを統計的に有意であると
みなした。新たなデータ分析は、処置に対して応答性であった動物へのBMP−
6の注射の2週間後に、腫瘍容積が実際に減少し始めたことを示す。BMP−6
投与の開始後4週間の終了時に、応答性のマウスの平均腫瘍サイズは、ビヒクル
のみを受けたコントロールグループの平均腫瘍サイズの約5%であった。
の試みとして、腫瘍を収集し、そして顕微鏡用にH&Eで染色した。図19Aお
よび19Bに示すように、BMP−6で処置した腫瘍は、重篤な壊死および拡散
性の炎症を示した。
態で実施され得る。従って、本実施形態は、全てに関して、上述の説明によって
よりむしろ添付の特許請求の範囲によって示される本発明の範囲の例示であって
限定ではないとみなされるべきであり、従って特許請求の範囲の均等物の意味お
よび範囲に入る全ての変更は本発明に包含されることが意図される。
OP−1の好ましい参照配列である配列番号2の残基330〜431との、表と
しての整列である。
OP−1の好ましい参照配列である配列番号2の残基330〜431との、表と
しての整列である。
OP−1の好ましい参照配列である配列番号2の残基330〜431との、表と
しての整列である。
OP−1の好ましい参照配列である配列番号2の残基330〜431との、表と
しての整列である。
OP−1の好ましい参照配列である配列番号2の残基330〜431との、表と
しての整列である。
OP−1の好ましい参照配列である配列番号2の残基330〜431との、表と
しての整列である。
OP−1の好ましい参照配列である配列番号2の残基330〜431との、表と
しての整列である。
OP−1の好ましい参照配列である配列番号2の残基330〜431との、表と
しての整列である。
OP−1の好ましい参照配列である配列番号2の残基330〜431との、表と
しての整列である。
OP−1の好ましい参照配列である配列番号2の残基330〜431との、表と
しての整列である。
OP−1の好ましい参照配列である配列番号2の残基330〜431との、表と
しての整列である。
OP−1の好ましい参照配列である配列番号2の残基330〜431との、表と
しての整列である。
OP−1の好ましい参照配列である配列番号2の残基330〜431との、表と
しての整列である。
す、包括的配列である配列番号4、5および8における「Xaa」位についての
代替アミノ酸の、表としての提示である。
す、包括的配列である配列番号4、5および8における「Xaa」位についての
代替アミノ酸の、表としての提示である。
す、包括的配列である配列番号6、7および9における「Xaa」位についての
代替アミノ酸の、表としての提示である。
す、包括的配列である配列番号6、7および9における「Xaa」位についての
代替アミノ酸の、表としての提示である。
す、包括的配列である配列番号6、7および9における「Xaa」位についての
代替アミノ酸の、表としての提示である。
統的改変体におけるアミノ酸のバリエーションを示す、包括的配列である配列番
号3における「Xaa」位についての代替アミノ酸の、表としての提示である。
(図5A)が、神経の形態の(図5B)分化を受けるのを誘導する能力を例示す
る。
果を示す。
殖に対するモルフォゲン(BMP6またはOP−1(BMP7))、アクチビン
またはTGF−β1の効果を示す。
するモルフォゲン(BMP6またはOP−1(BMP7))、アクチビンまたは
TGF−β1の効果を示す。
BMP−6またはOP−1(BMP−7))またはアクチビンの生体活性に対す
るフォリスタチンの効果を示す。
(図10B)におけるエストロゲン応答性ヒト乳癌MCF−7細胞の細胞増殖に
対するモルフォゲン(OP−1)またはTGF−β1の効果を示す。
いない、エストロゲン応答性ヒト乳癌MCF−7細胞の細胞増殖に対するモルフ
ォゲン(OP−1)の効果(図11A)、および17−βエストラジオールで刺
激したかまたは刺激していないエストロゲン応答性ヒト乳癌MCF−7細胞の細
胞増殖に対するTGF−β1の効果(図11B)を示す。
モルフォゲン(OP−1)、タモキシフェン、またはモルフォゲン(OP−1)
とタモキシフェンとの両方の組み合わせの効果を示す。
OP−1)の効果を示す。
1)またはTGF−β2の効果を示す。
発現を示す。
ォゲン(BMP−6)の効果を示す。
フォゲン(BMP−6)の効果を示す。
おける、腫瘍容積に対するモルフォゲン(BMP−6)の効果を示す。
MP−6)で処置した腫瘍における壊死およびびまん性炎症を示す。
Claims (31)
- 【請求項1】 癌の症状を緩和するための方法であって、該方法は、以下の
配列: (a)ヒトOP−1のC末端7システイン骨格、配列番号2の残基330〜43
1と少なくとも70%アミノ酸相同性を有する配列;および (b)ヒトOP−1のC末端7システイン骨格と少なくとも60%アミノ酸配列
同一性を有する配列; からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するダイマータンパク質を含むモル
フォゲンを投与する工程を包含し、ここで該モルフォゲンが、癌細胞の増殖を阻
害する、方法。 - 【請求項2】 前記癌細胞が、NG108−15細胞、胚癌NTERA−Z
CL.D1細胞、LNCaP細胞、MCF−7細胞、骨肉腫細胞、ヒト肺癌A
−549細胞および神経膠芽腫A−172細胞からなる群より選択される、請求
項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記モルフォゲンが、OP−1、OP−2、OP−3、BM
P−2、BMP−3、BMP−3b、BMP−4、BMP−5、BMP−6、B
MP−9、BMP−10、BMP−11、BMP−12、BMP−13、BMP
−14、BMP−15、DPP、Vgl、Vgr−1、60Aタンパク質、CD
MP−1、CDMP−2、CDMP−3、GDF−1、GDF−3、GDF−5
、GDF−6、GDF−7、GDF−8、GDF−9、GDF−10、GDF1
1、GDF−12、NODAL、UNIVIN、SCREW、ADMP、NEU
RAL、およびそれらのモルフォゲンとして活性なアミノ酸配列改変体からなる
群より選択される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 前記モルフォゲンが、OP−1、OP2、60A、GDF−
1、BMP−2A、BMP−2B、DPP、Vgl、Vgr−1、BMP−3、
BMP−5およびBMP−6のプロドメインからなる群より選択される少なくと
も1つのプロドメインポリペプチドと非共有結合的に会合している、請求項1に
記載の方法。 - 【請求項5】 前記モルフォゲンが、前記プロドメインポリペプチドのうち
の1より多くと非共有結合的に会合している、請求項4に記載の方法。 - 【請求項6】 前記投与する工程が、前記モルフォゲンを薬学的に受容可能
なビヒクル中で送達することを含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項7】 前記ビヒクルが、生体適合性ミクロスフェア、生分解性ミク
ロスフェア、および生体腐食性ミクロスフェアからなる群より選択される、請求
項6に記載の方法。 - 【請求項8】 前記ビヒクルが、生体適合性マトリックス、生分解性マトリ
ックス、および生体腐食性マトリックスからなる群より選択される、請求項6に
記載の方法。 - 【請求項9】 前記ビヒクルが、水溶液である、請求項6に記載の方法。
- 【請求項10】 前記投与する工程が、前記モルフォゲンを発現し得る細胞
を、前記癌細胞に送達することを含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項11】 前記投与する工程が、前記モルフォゲンをコードする、プ
ロモーターに作動可能に連結された非感染性の非組込み型DNAを提供すること
を含み、ここで、該DNAが、トランスフェクション促進タンパク質、ウイルス
粒子、リポソーム処方物、荷電した脂質およびリン酸カルシウム沈澱剤と会合し
ておらず、それにより、該DNAが発現される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項12】 前記モルフォゲンをコードする、プロモーターに作動可能
に連結された前記非感染性の非組込み型DNAが、該プロモーターと作動可能に
連結したエンハンサーエレメントをさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項13】 前記癌が、副腎癌、肛門癌、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、
頸癌、結腸癌、癌体、内分泌癌、食道癌、ファローピウス管癌、脂肪細胞癌、胆
嚢癌、生殖細胞腫瘍、胃腸管癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、リンパ腫、肺癌、筋
肉癌、神経系癌、眼組織癌、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、皮膚
癌、小腸癌、軟組織癌、胃癌、奇形癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌、泌尿器系の
癌、子宮癌および未知の原発部位の転移癌からなる群より選択される、請求項1
に記載の方法。 - 【請求項14】 前記症状が、異常な身体機能、異常な細胞形態、異常な酵
素レベル、異常なホルモンレベル、異常な腫瘍胎児抗原レベル、異常な組織増殖
、異常な組織重量、異常な腫瘍関連タンパク質レベル、変化した神経機能、変化
した神経構造、新脈管形成、出血、癌細胞表現型を有する細胞、下痢、滲出、疲
労、発熱、病変、栄養失調、転移、悪心、身体の通路の閉塞、日和見感染、疼痛
、乏しいカルノフスキー性能状態、細胞表面マーカーの存在、組織学的マーカー
の存在、細胞内マーカーの存在、分子マーカーの存在、腫瘍浸潤、調節されてい
ない細胞増殖、尿の頻度および体重減少からなる群より選択される、請求項1に
記載の方法。 - 【請求項15】 前記モルフォゲンが、インビトロアッセイにおける[3H
]−チミジンの細胞取り込みを阻害する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項16】 前記投与する工程の前に、罹患組織を宿主から取り出す工
程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項17】 前記投与する工程の後に、前記宿主からの前記罹患組織を
戻す工程をさらに包含する、請求項16に記載の方法。 - 【請求項18】 癌の症状を緩和するための方法であって、該方法は、骨モ
ルフォゲン性タンパク質および該骨モルフォゲン性タンパク質のモルフォゲンと
して活性なアミノ酸改変体からなる群より選択される物質を投与する工程を包含
し、該改変体は、以下: (a)該骨モルフォゲン性タンパク質の天然に存在する対立遺伝子改変体; (b)該骨モルフォゲン性タンパク質の保存的アミノ酸置換改変体; (c)該骨モルフォゲン性タンパク質のペプチドフラグメント改変体;および (d)該ペプチドフラグメント改変体の保存的アミノ酸置換改変体、を含み、こ
こで、該物質が、癌細胞の増殖を阻害する、方法。 - 【請求項19】 癌細胞の集団における癌細胞の数を減少させるための方法
であって、以下の配列: (a)ヒトOP−1のC末端7システイン骨格、配列番号2の残基330〜43
1と少なくとも70%アミノ酸相同性を有する配列; (b)ヒトOP−1のC末端7システイン骨格と少なくとも60%アミノ酸配列
同一性を有する配列; (c)配列番号3(OPX)によって規定される配列; (d)配列番号4によって規定される配列; (e)配列番号5によって規定される配列; (f)配列番号6によって規定される配列;ならびに (g)配列番号7によって規定される配列、 からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するダイマータンパク質を含むモル
フォゲンを投与する工程を包含し、ここで、該モルフォゲンが、インビトロアッ
セイにおける[3H]−チミジンの細胞取り込みを阻害する、方法。 - 【請求項20】 前記投与する工程が、骨モルフォゲン性タンパク質および
該骨モルフォゲン性タンパク質のモルフォゲンとして活性なアミノ酸改変体から
なる群より選択される物質を投与することを含み、該改変体が以下: (a)該骨モルフォゲン性タンパク質の天然に存在する対立遺伝子改変体; (b)該骨モルフォゲン性タンパク質の保存的アミノ酸置換改変体; (c)該骨モルフォゲン性タンパク質のペプチドフラグメント改変体;ならびに
(d)該ペプチドフラグメント改変体の保存的アミノ酸置換改変体、 を含む、請求項19に記載の方法。 - 【請求項21】 前記投与する工程が、前記モルフォゲンと組み合わせた1
以上の物質を投与することをさらに包含する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項22】 前記1以上の物質のうちの少なくとも1つが抗癌剤である
、請求項21に記載の方法。 - 【請求項23】 前記癌細胞が、前記モルフォゲンに特異的な少なくとも1
つの骨モルフォゲン性タンパク質レセプター(BMPR)を発現する、請求項1
に記載の方法。 - 【請求項24】 前記BMPRが、BMPR−IA、BMPR−IB、BM
PR−IIおよびそれらのスプライス改変体からなる群より選択される、請求項
23に記載の方法。 - 【請求項25】 前記モルフォゲンが、腫瘍のサイズまたは発生を減少させ
る、請求項1または18に記載の方法。 - 【請求項26】 前記モルフォゲンが、生存率を増加させる、請求項1また
は18に記載の方法。 - 【請求項27】 前記モルフォゲンの投与が、腫瘍壊死およびびまん性炎症
をもたらす、請求項1または18に記載の方法。 - 【請求項28】 哺乳動物における癌を処置する方法であって、該方法が、
以下の工程: (a)該哺乳動物内の標的化された癌細胞が、少なくとも1つのBMPRを発現
するか否かを決定する工程、および (b)該BMPRに特異的なモルフォゲンを投与する工程であって、該モルフォ
ゲンが、以下の配列: (i)ヒトOP−1のC末端7システイン骨格、配列番号2の残基330〜
431と少なくとも70%アミノ酸相同性を有する配列;および (ii)ヒトOP−1のC末端7システイン骨格と少なくとも60%アミノ
酸配列同一性を有する配列、 からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するダイマータンパク質を含む、工
程、を包含し;ここで、該モルフォゲンが、癌細胞の増殖を阻害する、方法。 - 【請求項29】 前記癌細胞が、前立腺癌細胞を含む、請求項28に記載の
方法。 - 【請求項30】 前記BMPRが、BMPR−IA、BMPR−IB、BM
PR−IIおよびそれらのスプライス改変体からなる群より選択される、請求項
29に記載の方法。 - 【請求項31】 前記モルフォゲンがBMP−6である、請求項29に記載
の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US19123998A | 1998-11-13 | 1998-11-13 | |
US09/191,239 | 1998-11-13 | ||
PCT/US1999/026636 WO2000029012A2 (en) | 1998-11-13 | 1999-11-12 | Methods of alleviating cancer symptoms |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010052381A Division JP2010150278A (ja) | 1998-11-13 | 2010-03-09 | 癌の症状を緩和する方法 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002529513A true JP2002529513A (ja) | 2002-09-10 |
JP2002529513A5 JP2002529513A5 (ja) | 2006-12-28 |
JP4892131B2 JP4892131B2 (ja) | 2012-03-07 |
Family
ID=22704676
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000582058A Expired - Fee Related JP4892131B2 (ja) | 1998-11-13 | 1999-11-12 | 癌の症状を緩和する方法 |
JP2010052381A Withdrawn JP2010150278A (ja) | 1998-11-13 | 2010-03-09 | 癌の症状を緩和する方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010052381A Withdrawn JP2010150278A (ja) | 1998-11-13 | 2010-03-09 | 癌の症状を緩和する方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP1131087B2 (ja) |
JP (2) | JP4892131B2 (ja) |
AT (1) | ATE275416T1 (ja) |
AU (1) | AU1616700A (ja) |
CA (1) | CA2349038C (ja) |
DE (1) | DE69920033T3 (ja) |
DK (1) | DK1131087T4 (ja) |
ES (1) | ES2226467T5 (ja) |
PT (1) | PT1131087E (ja) |
WO (1) | WO2000029012A2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006112441A1 (ja) * | 2005-04-18 | 2006-10-26 | Tokyo Medical And Dental University | Bmp-7を含む抗c型肝炎ウイルス剤 |
JP2009502771A (ja) * | 2005-07-19 | 2009-01-29 | ステムジェン ソシエタ ペル アチオニ | Lifおよびbmpによる腫瘍性幹細胞の潜在的腫瘍形成能力の抑制 |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10026713A1 (de) * | 2000-05-30 | 2001-12-06 | Walter Sebald | Mutein einer Kette eines Proteins aus der Superfamilie des Wachstumsfaktors TGF-beta |
JP2005536439A (ja) * | 2001-09-18 | 2005-12-02 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 腫瘍の診断及び治療のための組成物と方法 |
JP2008500816A (ja) * | 2004-03-31 | 2008-01-17 | ゼンコー・インコーポレイテッド | 改善された性質を有するbmp−7変異体 |
US20100035240A1 (en) * | 2004-08-10 | 2010-02-11 | Cardiff Biologicals Limited | Methods and kit for the prognosis of breast cancer |
WO2006029406A2 (en) * | 2004-09-09 | 2006-03-16 | Stryker Corporation | Methods for treating bone tumors using bone morphogenic proteins |
ATE533781T1 (de) | 2005-05-27 | 2011-12-15 | Bbs Bioactive Bone Substitutes Oy | Heparin-bindungsstelle enthaltendes knochenmorphogenetisches protein 6 und osteogene vorrichtungen und pharmazeutische produkte, die diese enthalten |
ES2642591T3 (es) | 2005-05-27 | 2017-11-16 | Bbs-Bioactive Bone Substitutes Oy | Proteína morfogenética ósea 3 y dispositivos osteogénicos y productos farmacéuticos que contienen la misma |
US7807627B2 (en) | 2005-05-27 | 2010-10-05 | Bbs-Bioactive Bone Substitutes Oy | Bone morphogenetic protein 4 and osteogenic devices and pharmaceutical products containing thereof |
GB0615129D0 (en) * | 2006-07-29 | 2006-09-06 | Univ Cardiff | Anti-cancer activity of BMP-9 and BMP-10 and their use in cancer therapies |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5739107A (en) * | 1991-03-11 | 1998-04-14 | Creative Biomolecules, Inc. | Morphogen treatment of gastrointestinal ulcers |
DK0575555T3 (da) † | 1991-03-11 | 2001-11-05 | Curis Inc | Proteininduceret morfogenese |
US5652118A (en) † | 1991-03-11 | 1997-07-29 | Creative Biomolecules, Inc. | Nucleic acid encoding a novel morphogenic protein, OP-3 |
US6287816B1 (en) * | 1991-06-25 | 2001-09-11 | Genetics Institute, Inc. | BMP-9 compositions |
DK0653942T3 (da) † | 1992-07-31 | 2003-10-20 | Curis Inc | Morphogen-induceret nerve-regenerering og -reparation |
WO1994006420A2 (en) * | 1992-09-15 | 1994-03-31 | Creative Biomolecules, Inc. | Morphogen treatment of gastrointestinal ulcers |
US5863738A (en) † | 1994-04-29 | 1999-01-26 | Creative Biomolecules, Inc. | Methods of antagonizing OP-1 binding to a cell surface receptor utilizing ALK polypeptides |
JPH08225454A (ja) * | 1995-02-23 | 1996-09-03 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | マイクロスフェア製剤 |
FR2737501B1 (fr) * | 1995-07-31 | 1997-10-24 | Transgene Sa | Nouveaux virus auxiliaires pour la preparation de vecteurs viraux recombinants |
AU7115996A (en) † | 1995-09-21 | 1997-04-09 | Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The | Uses of bone morphogenetic proteins |
WO1998050061A1 (en) * | 1997-05-07 | 1998-11-12 | Biogen, Inc. | Novel therapies for cystic kidney disease |
-
1999
- 1999-11-12 EP EP99958892A patent/EP1131087B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-12 WO PCT/US1999/026636 patent/WO2000029012A2/en active IP Right Grant
- 1999-11-12 AT AT99958892T patent/ATE275416T1/de active
- 1999-11-12 JP JP2000582058A patent/JP4892131B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-12 PT PT99958892T patent/PT1131087E/pt unknown
- 1999-11-12 AU AU16167/00A patent/AU1616700A/en not_active Abandoned
- 1999-11-12 EP EP04008347A patent/EP1435243A3/en not_active Withdrawn
- 1999-11-12 DK DK99958892T patent/DK1131087T4/da active
- 1999-11-12 ES ES99958892T patent/ES2226467T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-12 DE DE69920033T patent/DE69920033T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-12 CA CA2349038A patent/CA2349038C/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-03-09 JP JP2010052381A patent/JP2010150278A/ja not_active Withdrawn
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006112441A1 (ja) * | 2005-04-18 | 2006-10-26 | Tokyo Medical And Dental University | Bmp-7を含む抗c型肝炎ウイルス剤 |
JP2009502771A (ja) * | 2005-07-19 | 2009-01-29 | ステムジェン ソシエタ ペル アチオニ | Lifおよびbmpによる腫瘍性幹細胞の潜在的腫瘍形成能力の抑制 |
JP2012107063A (ja) * | 2005-07-19 | 2012-06-07 | Stemgen Spa | Lifおよびbmpによる腫瘍性幹細胞の潜在的腫瘍形成能力の抑制 |
KR101338533B1 (ko) * | 2005-07-19 | 2013-12-12 | 스템젠 에스.피.에이. | Lif 및 bmp에 의한 종양 줄기 세포의 종양발생가능성의 억제 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PT1131087E (pt) | 2004-12-31 |
AU1616700A (en) | 2000-06-05 |
DE69920033T3 (de) | 2009-10-08 |
ES2226467T3 (es) | 2005-03-16 |
EP1131087B2 (en) | 2009-04-01 |
ATE275416T1 (de) | 2004-09-15 |
WO2000029012A2 (en) | 2000-05-25 |
JP2010150278A (ja) | 2010-07-08 |
EP1131087A2 (en) | 2001-09-12 |
WO2000029012A3 (en) | 2000-11-16 |
DK1131087T4 (da) | 2009-08-03 |
ES2226467T5 (es) | 2009-08-27 |
DE69920033T2 (de) | 2005-09-22 |
EP1131087B1 (en) | 2004-09-08 |
WO2000029012A8 (en) | 2001-01-11 |
JP4892131B2 (ja) | 2012-03-07 |
EP1435243A3 (en) | 2005-02-09 |
DE69920033D1 (de) | 2004-10-14 |
DK1131087T3 (da) | 2004-12-13 |
EP1435243A2 (en) | 2004-07-07 |
CA2349038C (en) | 2011-08-02 |
CA2349038A1 (en) | 2000-05-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2010150278A (ja) | 癌の症状を緩和する方法 | |
Yamashita et al. | Post-occlusion treatment with BDNF reduces infarct size in a model of permanent occlusion of the middle cerebral artery in rat | |
Krum et al. | VEGF mRNA and Its Receptorflt-1Are Expressed in Reactive Astrocytes Following Neural Grafting and Tumor Cell Implantation in the Adult CNS | |
US5428011A (en) | Pharmaceutical preparations for inhibiting tumours associated with prostate adenocarcinoma | |
Lazarowski et al. | Neuronal and glial expression of the multidrug resistance gene product in an experimental epilepsy model | |
Weinmann et al. | Intrathecally infused antibodies against Nogo-A penetrate the CNS and downregulate the endogenous neurite growth inhibitor Nogo-A | |
JP2007130027A (ja) | 星状細胞の増殖の誘導方法およびそのための組成物 | |
JP2008530003A (ja) | 創傷治癒を向上させるための、および線維症予防のためのミオスタチン(gdf−8)アンタゴニストの使用 | |
WO1993019783A1 (en) | Methods of inhibiting or enhancing scar formation in the cns | |
JP6523910B2 (ja) | 腫瘍幹細胞におけるeph受容体発現 | |
KR20080108530A (ko) | 신경 쓰레드 단백질 기초 펩티드를 사용하여 암 위험 또는 발병을 예방 또는 감소시키는 방법 | |
Hanisch et al. | Neurotoxic consequences of central long-term administration of interleukin-2 in rats | |
Wu et al. | Neuroprotective effect of upregulated sonic Hedgehog in retinal ganglion cells following chronic ocular hypertension | |
Hachana et al. | The effects of anti‐VEGF and kinin B1 receptor blockade on retinal inflammation in laser‐induced choroidal neovascularization | |
Smith et al. | Regional differences in the expression of corticostriatal synaptic plasticity | |
US7713933B2 (en) | Pharmaceutical composition containing an activin or inhibin stimulator | |
Stark et al. | Distribution of TGF-β, the TGF-β type I receptor and the R-II receptor in peripheral nerves and mechanoreceptors; observations on changes after traumatic injury | |
EP1007559B1 (en) | Genetically engineered cells which express bone morphogenetic proteins | |
JP4592186B2 (ja) | 関節内注射用の組成物を生産する方法 | |
WO2009052119A1 (en) | A method for treating endometriosis by administering mullerian inhibiting substance | |
WO2011148200A1 (en) | Treatment of pain | |
CN110997708A (zh) | 人bmp7蛋白的变体 | |
Meikle et al. | Transforming growth factor beta-1 and beta-2 and type II receptor functional regulation of ALVA-101 human prostate cancer cells | |
Hernández Pascual et al. | SOCS1-derived peptide administered by eye drops prevents retinal neuroinflammation and vascular leakage in experimental diabetes | |
EP3946486A1 (en) | Cartilage regeneration using chondrocyte and tgf-? |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061020 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20061020 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20090610 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091210 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100309 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110323 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20110622 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20110629 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110725 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20111202 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20111219 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20141222 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |