MX2008004518A - Metodo para inhibir angiogenesis utilizando ephrin b2 - Google Patents

Abstract

Se pretende proveer un método para inhibir angiogénesis o neoangiogénesis y una composición para lo mismo, y un método que esútil para tratar una enfermedad o un trastorno relacionado con angiogénesis o neoangiogénesis y una composición para lo mismo. Las composiciones antes descritas contienen una cantidad efectiva de Ephrin B2 y los métodos antes descritos implican el paso de administrar una cantidad efectiva de Ephrin B2. Estas composiciones y métodos sonútiles para tratar una enfermedad o un trastorno relacionado con angiogénesis o neoangiogénesis. Asimismo, estas composiciones y métodos pueden inhibir neoangiogénesis proveniente de la retina.

Description

MÉTODO PARA INHIBIR ANGIOGENESIS UTILIZANDO EPHRIN B2 CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a métodos y composiciones para suprimir angiogénesis o neovascularización, y de manera más particular al uso de ephrinB2 en la misma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La angiogénesis es un rasgo característico de diversas condiciones patológicas oculares tales como degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética y retinopatía de pre-madurez. La cascada angiogénica es inducida por un número de mediadores y quimiocinas. Por ejemplo, las tirosina cinasas del receptor de célula endotelial (RTK) , las cuales están asociadas con los procesos de angiogénesis de pasos múltiples, han sido reconocidas como mediadores críticos de angiogénesis. La primera generación de citocinas angiogénicas, incluyendo los factores de crecimiento de célula endotelial vascular (VEGFs) , caben bien dentro del concepto de capilares en desarrollo. De manera más reciente, el sistema de angiopoyetinas/Tie2 ha sido identificado como un sistema de ligando-receptor mediador del ensamblado y maduración de vaso sanguíneo. Las familias de los receptores VEGF/VEGF y angiopoyetinas/Tie2 también se clasifican como RTK. Los receptores Eph, los receptores para los ligandos ephrin, comprenden la familia más grande de receptores de tirosina cinasa, que consisten de ocho receptores EphA y seis receptores EphB. La familia de tirosina cinasa del receptor Eph representa una nueva clase de RTK. Aunque esta familia ha sido identificada originalmente como moléculas exploradoras neuronales, su función en la angiogénesis aún no está dilucidada. Los experimentos con ratones con expresión suprimida y transgénicos ephrinB2-lacZ adultos han identificado a los receptores de EphB y a los ligandos ephrinB como reguladores cruciales del ensamblado vascular, orquestando la diferenciación arteriovenosa y la formación de límites (documentos de tipo no patente 2, 3, y 5) . Por otro lado, los experimentos de selección de gen como blanco han revelado que ephrinB2 es un marcador temprano de las células del endotelio arterial, y su receptor EphB4 marca en forma recíproca las células del endotelio venoso en los embriones de vertebrados (documentos de tipo no patente 1, 2, 4, y 6) . Asimismo, las células del endotelio en adultos mantienen su patrón de expresión arteriovenosa asimétrica, lo que sugiere que el sistema ephrinB/EphB desempeña una función en el control de la homeostasis vascular y posee la posibilidad de controlar la angiogénesis patológica en adultos (documentos de tipo no patente 3 y 5) . También se ha reportado que la administración de antagonista (por ejemplo anticuerpo) del receptor Eph inhibe principalmente la neovascularización cancerosa, mientras que la administración de agonista estimula la neovascularización. Por lo tanto, sería deseable determinar el modo de acción de los ligandos ephrin, así como la manera en la cual estas moléculas se pueden utilizar para manipular el sistema vascular, particularmente en condiciones patológicas. La retinopatía diabética es una causa importante de ceguera de personas con edades entre 20-65 años en los Estados Unidos de Norteamérica. Las condiciones patológicas esenciales para la retinopatía diabética son microangiopatía retiniana e isquemia subsiguiente. Es bien sabido que la hipoxia en la retinopatía conduce a neovascularización de la retina. Sin embargo, en los canales vasculares recién formados por la neovascularización de la retina, el flujo sanguíneo no perfunde de modo que la retina se vuelve isquémica. Esto se debe a que los canales vasculares son inmaduros y diapedéticos . Asimismo, estos canales vasculares con frecuencia penetran una cámara del vitreo. Un tratamiento ideal de la retinopatía diabética es obtener canales vasculares maduros que puedan suprimir dicha neogénesis de vasos sanguíneos cuya dirección de extensión esté equivocada y perfundan la retina hipóxica, y que también la rescaten de la hipoxia. La degeneración macular relacionada con la edad es la causa principal de ceguera en adultos en Europa y los Estados Unidos de Norteamérica, y es una de las tres causas principales en Japón. La naturaleza de la condición patológica es el ingreso de nuevos vasos sanguíneos desde la coroides a la mácula, mientras que la hemorragia proveniente de estos nuevos vasos sanguíneos anormales, el desprendimiento de la retina y similares dan como resultado ceguera. Por lo tanto, suprimir la generación de estos nuevos vasos sanguíneos anormales es un método esencial de tratamiento para mantener la función visual. Se sabe que la extensión de nuevos vasos sanguíneos se suprime cubriendo los nuevos vasos sanguíneos con epitelio del pigmento, pero el mecanismo del mismo aún no se conoce bien.

Referencias Los siguientes documentos se incorporan en la presente invención para referencia. Documento de patente 1: Publicación de solicitud de patente E.U.A. No. 2004/0136983 Documento de tipo no patente 1: Adams, R.H., et al. (2001) . Cell 104 (1) :57-69. Documento de tipo no patente 2: Adams, R.H., et al. (1999). Genes Dev 13 (3) : 295-306. Documento de tipo no patente 3: Gale, N. W., et al. (2001). Dev Biol 230 (2) : 151-160. Documento de tipo no patente 4: Gerety, S. S., et al. (1999). Mol Cell 4 (3) : 403-41 . Documento de tipo no patente 5: Shin, D., et al. (2001). Dev Biol 230 (2 ): 139-150. Documento de tipo no patente 6: Wang, H.U., et al. (1998) . Cell 93(5) :741-753.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Problemas a ser resueltos por la invención Es un objetivo de la presente invención proveer métodos, composiciones y agentes preventivos y/o terapéuticos para suprimir angiogénesis o neovascularización. Es un objetivo de la presente invención proveer métodos, composiciones y agentes preventivos y/o terapéuticos útiles en el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con angiogénesis o neovascularización.

Medios para solucionar los problemas La presente invención provee un método para inhibir la síntesis de ADN en células del endotelio arterial (o células del endotelio venoso) , que comprende poner en contacto las células del endotelio arterial (o células del endotelio venoso) con una cantidad de un ephrinB2. En una modalidad, la síntesis de ADN antes mencionada es inducida por el factor de crecimiento de célula endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF) o factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) . La presente invención también provee un método para inhibir la activación de MAP cinasa p44/p42 en células del endotelio arterial (o células del endotelio venoso) , el cual comprende poner en contacto las células del endotelio arterial (o células del endotelio venoso) con una cantidad efectiva de un ephrinB2. En una modalidad, la activación de MAP cinasa p44/p42 antes mencionada es inducida por VEGF, bFGF o PDGF. La presente invención también provee un método para inhibir la formación de tubo a partir de células del endotelio arterial (o células del endotelio venoso) , que comprende poner en contacto las células del endotelio arterial (o células del endotelio venoso) con una cantidad efectiva de un ephrinB2. En una modalidad, la formación de tubo antes mencionada es inducida por VEGF, bFGF o PDGF. En una modalidad, el contacto antes mencionado se efectúa administrando el ephrinB2 a un mamífero que comprende las células del endotelio arterial (o células del endotelio venoso) . La presente invención también provee un método para suprimir la neovascularización a partir de una retina, que comprende administrar una cantidad efectiva de un ephrinB2 a un individuo. En una modalidad, el individuo antes mencionado es uno con una angiogénesis o neovascularización patológica fuera de la retina o uno con una posibilidad de generar la angiogénesis o neovascularización patológica fuera de la retina. La presente invención también provee un método para tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con angiogénesis o neovascularización, el cual comprende administrar una cantidad efectiva de un ephrinB2 a un individuo que requiere el tratamiento. La presente invención también provee una composición para inhibir la síntesis de ADN en células del endotelio arterial (o células del endotelio venoso) , que comprende una cantidad efectiva de un ephrinB2. La presente invención también provee una composición para inhibir la activación de MAP cinasa p44/p42 en células del endotelio arterial (o células del endotelio venoso) , el cual comprende una cantidad efectiva de un ephrinB2.

La presente invención también provee una composición para inhibir la formación de tubo a partir de células del endotelio arterial (o células del endotelio venoso), que comprende una cantidad efectiva de un ephrinB2. La presente invención también provee una composición para suprimir la neovascularización a partir de una retina, la cual comprende una cantidad efectiva de ephrinB2 para un individuo. La presente invención también provee una composición farmacéutica para tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con angiogénesis o neovascularización, que comprende una cantidad efectiva de un ephrinB2. La presente invención también provee un agente para inhibir la síntesis de ADN en las células del endotelio arterial (o células del endotelio venoso) , que comprende una cantidad efectiva de un ephrin B2. La presente invención también provee un agente para inhibir la activación de MAP cinasa p44/p42 en células del endotelio arterial (o células del endotelio venoso) , que comprende una cantidad efectiva de un ephrin B2. La presente invención también provee un agente para inhibir la formación de tubo a partir de células del endotelio arterial (o células del endotelio venoso) , que comprende una cantidad efectiva de un ephrinB2. La presente invención también provee un agente para suprimir la neovascularización retiniana, que comprende una cantidad efectiva de un ephrinB2. La presente invención también provee un agente para tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con angiogénesis o neovascularización, el cual comprende una cantidad efectiva de un ephrinB2. En una modalidad de los métodos, composiciones, así como agentes para inhibición, supresión y prevención o tratamiento antes mencionados, el ephrinB2 antes mencionado comprende un dominio extracelular pero no un dominio que se extienda a membrana y un dominio citoplasmático de un ephrinB2 original. En otra modalidad de los métodos, composiciones, así como de los agentes para inhibición, supresión y prevención o tratamiento antes mencionados, la enfermedad o trastorno se selecciona a partir del grupo que consiste de degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía isquémica, neovascularización intraocular, neovascularización de la córnea, neovascularización de la retina, neovascularización de la coroides, edema macular diabético, isquemia de retina diabética, edema de retina diabética, retinopatía diabética, cánceres, artritis reumatoide, endometriosis, y alopecia. Incluso en otra modalidad de los métodos, composiciones, así como de los agentes para inhibición, supresión y prevención o tratamiento antes mencionados, la enfermedad o trastorno se selecciona a partir del grupo que consiste de degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía isquémica, neovascularización intraocular, neovascularización de la córnea, neovascularización de la retina, neovascularización de la coroides, edema macular diabético, isquemia de retina diabética, edema de retina diabética, y retinopatía diabética.

Efecto de la invención De conformidad con la presente invención, se proveen métodos y composiciones para suprimir la angiogénesis o neovascularización. Las composiciones y métodos de la presente invención pueden suprimir angiogénesis o neovascularización patológica sin suprimir el flujo sanguíneo fisiológico. Debido a que las composiciones y métodos de la presente invención no afectan los vasos sanguíneos normales, éstos son útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con angiogénesis o neovascularización.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura ÍA es una gráfica que muestra los efectos del tratamiento con ephrinB2 y tratamiento con EphB4 sobre la absorción de timidina en células HaoEC tratadas con VEGF, bFGF, o PDGF-BB. La figura IB es una gráfica que muestra los efectos del tratamiento con ephrinB2 y tratamiento con EphB4 sobre la absorción de timidina en células HUVEC tratadas con VEGF, bFGF, o PDGF-BB. La figura ÍC es una fotografía que muestra las formas de las células endoteliales estimuladas con VEGF a los 7 días para el control (no tratado) , y los grupos tratados con cualquiera de sephrinB2 o sEphB4 y tratados tanto con sephrinB2 como con sEphB . La figura 2A es una fotografía electroforética que muestra los efectos de ephrinB2 sobre la fosforilación de ERK en células HaoEC estimuladas con VEGF o bFGF. La figura 2B es una fotografía electroforética que muestra los efectos de ephrinB2 sobre la autofosforilación del receptor 2 (KDR) de VEGF en células HaoEC estimuladas con VEGF. La figura 3 es una gráfica que muestra un resultado de prueba de cuantificación de neovascularización en una cornea de ratón al cual se coadministran bFGF y ephrinB2. Las figures 4A y 4B son micrografías de fluorescencia que muestran las formas de retinas perfundidas con fluoresceína-dextrano montadas en plano para el control (figura 4A) y modelo tratado con sephrinB (figura 4B) .

La figura 5 es una gráfica que muestra las relaciones de área de regiones no perfundidas en un modelo de control (OÍR) y modelo tratado con sephrinB2 (OÍR + ephrinB2 ) . Las figuras 6A y 6B son micrografías de barrido electrónico que muestran las formas de superficie retiniana de ratón P17 neonato para el modelo de control (OÍR) (figura 6A) y modelo tratado con sephrinB2 (OÍR + ephrinB2) (figura 6B) . La figura 7 es una gráfica que muestra los efectos del tratamiento con ephrinB2 de ratón y tratamiento con ephrinB2 de humano sobre la absorción de timidina en células HUVEC tratadas con bFGF. Las figuras 8A a 8C son fotografías de fluorescencia que muestran los estados de los funduses provistos con tratamiento con 10 ng/ml de ephrinB2 de humano (figura 8A) , tratamiento con PBS (figura 8B) , y tratamiento con 10 ng/ml de ephrinB2 de ratón (figura 8C) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El sistema EphrinB2/EphB4 desempeña un papel importante en la vasculogénesis y angiogénesis. La presente invención se basa en los hallazgos de que el ephrinB2 suprime la síntesis de ADN de célula endotelial (EC) y la activación de MAP cinasa p44/p42 inducida tanto por VEGF como por FGF2. EphrinB2 también inhibe la formación de tubo de EC. Asimismo, de conformidad con la prueba de micro-saco córneo en ratones y la cuantificación de neovascularización de la córnea, ephrinB2 suprime la angiogénesis de la córnea inducida por bFGF. Por consiguiente, seleccionar como blanco a ephrinB2/EphB4 y su ruta de señalización anti-angiogénica podría ser benéfico en el tratamiento de enfermedades dependientes de angiogénesis. Antes de describir la invención con mayor detalle, los términos utilizados en esta solicitud se definen de la siguiente manera a menos que se indique lo contrario.

Definiciones El término "ephrinB2", a menos que se especifique de otra manera, se refiere a un polipéptido que (1) comparte similitud sustancial de secuencia con un ephrinB2 original o dominio extracelular del mismo, de preferencia el ephrinB2 de humano original; y (2) posee una actividad biológica que involucra al ephrinB2 original o dominio extracelular. El término "ephrinB2" incluye al ephrinB2 original (de preferencia el ephrinB2 original de humano) y dominio extracelular del mismo, así como un análogo y variante del mismo que posea la actividad biológica del ephrinB2 original o dominio extracelular antes mencionados. Se debe indicar que la secuencia del ephrinB2 se conoce públicamente en la técnica y que un experto en la técnica puede reconocer completamente la secuencia y posición del dominio extracelular, del dominio que abarca membrana y del dominio citoplasmático. Una molécula "original", tal como un ephrinB2 original, es una molécula que existe sin intervención humana. Sin embargo, un ephrinB2 original también puede ser el dominio extracelular de un ephrinB2 que exista sin intervención humana. Un ephrinB2 de "longitud completa" es un ephrinB2 que contiene tanto un dominio extracelular como un dominio intracelular. El ephrinB2 de longitud completa puede ser original, o éste puede ser un análogo o variante de un ephrinB2 original. Un polipéptido que comparte "similitud sustancial de secuencia" con una molécula original es por lo menos aproximadamente 30% idéntico con la molécula original a nivel de aminoácido. El polipéptido de preferencia es por lo menos aproximadamente 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, más preferido por lo menos aproximadamente 98%, incluso más preferido aproximadamente 99% y de manera incluso más preferida 100% idéntico con la molécula original a nivel de aminoácido . El término "por ciento de identidad" o "% de identidad" de un análogo o variante con una molécula original se refiere al porcentaje de secuencia de aminoácido en la molécula original que también se encuentra en el análogo o variante cuando se alinean las dos secuencias. El por ciento de identidad se puede determinar utilizando cualesquiera métodos o algoritmos establecidos en la técnica, tal como LALIGN, ClustalW o BLAST . Un polipéptido posee una "actividad biológica" de un ephrinB2 original si éste es capaz de unirse al receptor para el ephrinB2 original o de inhibir la síntesis de ADN de EC, la fosforilación de cinasa regulada por señal extracelular (ERK) en EC, formación de tubo de EC, angiogénesis o neovascularización. La actividad para inhibir la síntesis de ADN de EC, fosforilación de ERK en EC, formación de tubo de EC, angiogénesis o neovascularización se puede determinar mediante cualesquiera métodos conocidos en la técnica, particularmente como se describe en la presente solicitud. Una "cantidad efectiva" es una cantidad de una sustancia suficiente para lograr el propósito pretendido. Por ejemplo, una cantidad efectiva de un ephrinB2 para inhibir la síntesis de ADN es una cantidad suficiente, in vivo o in vi tro, como pudiera ser el caso, que dé como resultado una reducción en la cantidad de síntesis de ADN. Una cantidad efectiva de un ephrinB2 para tratar una enfermedad o trastorno es una cantidad del ephrinB2 suficiente para reducir o eliminar los síntomas de la enfermedad o trastorno. La cantidad efectiva de una sustancia dada puede variar con factores tales como la naturaleza de la sustancia, la vía de administración, el tamaño y especie del animal que va a recibir la sustancia, y el propósito de administrar la sustancia. La cantidad efectiva en cada caso individual puede ser determinada empíricamente por el experto en la técnica de conformidad con métodos establecidos en la técnica. El término "individuo" se refiere arbitrariamente a un animal, de preferencia un mamífero humano o no humano, más preferido ratón, rata, otros roedores, conejo, perro, gato, cerdo, vaca, caballo o primate, más preferido aún un humano. Una "angiogénesis o neovascularización patológica" puede ser la formación o neogénesis de vasos sanguíneos que no están en un estado fisiológicamente normal. Dichos vasos sanguíneos, siendo inmaduros y diapedéticos, se pueden convertir en vasos sanguíneos en los cuales la sangre podría no perfundir. Además, la "angiogénesis o neovascularización patológica" podría ser una angiogénesis o neovascularización en una manera diferente a la de un estado fisiológicamente normal. Por ejemplo, el término se puede referir a la formación de nuevos vasos sanguíneos por recepción de estímulos tales como inflamación. Un "individuo con una angiogénesis o neovascularización patológica o con una posibilidad de generar la angiogénesis o neovascularización patológica" es un individuo en el cual la angiogénesis o neovascularización antes mencionada ya ha sido generada o un individuo que pudiera tener un factor que pueda generar dicha angiogénesis o neovascularización. Este último individuo puede ser un individuo que ha sido afectado por una enfermedad o trastorno que puede mostrar síntomas de generar una "angiogénesis o neovascularización patológica" pero que aún no muestra dichos síntomas, un individuo que ha recibido estímulos que puedan generar una "angiogénesis o neovascularización patológica", y similares . Una "angiogénesis o neovascularización patológica" puede ser generada "dentro de la retina" o "fuera de la retina". "Fuera de la retina" se refiere al exterior del tejido retiniano. Estos tipos de angiogénesis o neovascularización incluyen, por ejemplo, la formación o neogénesis de vasos sanguíneos dirigidos desde una retina penetrada a través de una membrana limitante interior hacia el interior de un cuerpo vitreo y la formación o neogénesis de vasos sanguíneos desde una retina hacia una coroides. El término "enfermedad o trastorno relacionado con angiogénesis o neovascularización" se refiere a cualquier enfermedad o trastorno que genere la "angiogénesis o neovascularización patológica" antes mencionada, o que cause que un individuo no funcione adecuadamente debido a "angiogénesis o neovascularización patológica". Para dicha enfermedad o trastorno, se puede mencionar, pero sin limitarse a, degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía isquémica, neovascularización intraocular, neovascularización de la córnea, neovascularización de la retina, neovascularización de la coroides, edema macular diabético, isquemia de retina diabética, edema de retina diabética, retinopatía diabética, cánceres, artritis reumatoide, endometriosis, y alopecia. "Tratar" una enfermedad o trastorno es reducir o completamente eliminar los síntomas de una enfermedad o trastorno (también llamado "curar"), o evitar o retrasar el desarrollo de la enfermedad o trastorno. El término "requiere tratamiento" se refiere a una decisión tomada por un prestador de servicios médicos (caregiver) (por ejemplo médico, enfermera, enfermera clínica, etc. para humanos; veterinario para animales (incluyendo mamífero no humano) ) . Esta decisión se toma con base a diversos factores que están dentro del intervalo de opinión del prestador de servicios médicos, al tiempo que incluye reconocer que el individuo está actualmente enfermo o que podría enfermarse en el futuro como resultado de un cierto estado que puede ser tratado con una composición arbitraria.

El término "composición" incluye por lo menos un componente activo, y se refiere a una combinación de sustancias para producir efectos del componente activo en células, tejidos, órganos o animales (de preferencia mamíferos, más preferido ratón, rata, otros roedores, conejo, perro, gato, cerdo, vaca, caballo o primate, más preferido aún un humano) a los cuales se aplica o administra la composición. El experto en la técnica entenderá y reconocerá una técnica apropiada para determinar si el componente activo tiene o no un resultado efectivo deseado tomando como base el requerimiento de dicho experto en la técnica. Una "composición farmacéutica" incluye por lo menos un componente activo, y se refiere a una combinación de sustancias para producir efectos farmacéuticos del componente activo en animales, de preferencia mamíferos, más preferido ratón, rata, otros roedores, conejo, perro, gato, cerdo, vaca, caballo o primate, más preferido aún un humano. El experto en la técnica entenderá y reconocerá una técnica apropiada para determinar si el componente activo tiene o no un resultado deseado efectivo tomando como base el requerimiento de dicho experto en la técnica. Los términos "agente para inhibir", "agente para suprimir", y "agente para prevención y/o tratamiento" se refieren a agentes preparados en una forma apropiada para aplicación o administración para producir los efectos del componente activo. Estos agentes pueden producir efectos del componente activo en células, tejidos, órganos o animales (de preferencia mamíferos, más preferido ratón, rata, otros roedores, conejo, perro, gato, cerdo, vaca, caballo o primate, más preferido aún un humano) a los cuales se aplica o administra la composición.

Efecto de ephrinB2 sobre células endoteliales Las células endoteliales pueden ser inducidas a que proliferen en respuesta a factores de crecimiento, tales como VEGF, bFGF, o PDGF-BB (dímero de subunidad B de PDGF) . EphrinB2 inhibe la síntesis de ADN inducida por todos los estímulos de VEGF, bFGF, y PDGF-BB en células del endotelio arterial (o células del endotelio venoso) . Como se muestra en la figura ÍA, el incremento en la síntesis de ADN inducido por 10 ng/ml de VEGF, bFGF, o PDGF-BB es inhibido por 200 ng/ml de ephrinB2, en 40%, 30%, y 90%, respectivamente. Se obtienen resultados virtualmente idénticos utilizando células de endotelio de vena umbilical de humano (HUVEC) (figura IB) . Este efecto inhibidor de ephrinB2 sobre la síntesis de ADN no es ocasionado por apoptosis. Por consiguiente, ephrinB2 puede inhibir la síntesis de ADN de EC que es inducida por varios estímulos, incluyendo VEGF, bFGF y PDGF. Aunque el receptor para ephrinB2 (EphB4) es un marcador para células del endotelio venoso, la síntesis de ADN se inhibe tanto en células del endotelio venoso como en células del endotelio arterial, aunque se sabe que las células del endotelio arterial no poseen este receptor. En contraste, la formación de tubo inducida por VEGF no se ve afectada por el tratamiento con EphB4. EphrinB2 inhibe la respuesta mitogénica inducida por factor de crecimiento. Esto se debe a que ephrinB2 suprime la fosforilación de ERK (p42/44) inducida tanto por VEGF como por bFGF en células del endotelio tanto arterial como venoso. Sin embargo, ephrinB2 no inhibe la auto-fosforilación del receptor 2 de VEGF, lo que indica que ephrinB2 no interfiere con la transducción de señal entre VEGF y el receptor 2 de VEGF como un mecanismo para inhibir las funciones de VEGF. Por lo tanto, se puede utilizar ephrinB2 para inhibir la fosforilación de ERK inducida por VEGF o bFGF ya sea en células del endotelio arterial o del endotelio venoso. Se sabe que bFGF es un factor angiogénico potente. EphrinB2 puede inhibir la proliferación de célula EC inducida por bFGF. La administración de ephrinB2 bloquea notablemente la angiogénesis inducida por bFGF. En contraste, la administración de EphB4 no muestra efecto.

Efecto de ephrinB2 en modelos in vivo La prueba de micro-saco córneo es un modelo de neovascularización in vivo típico. En este modelo, la angiogénesis inducida por bFGF puede ser bloqueada notablemente por la administración de ephrinB2. En contraste, la administración de EphB4 no muestra efecto. El modelo de retinopatía inducida por oxíqeno (OÍR) es un modelo animal de retinopatía diabética. En este modelo animal, ephrinB2 puede suprimir la anqiogénesis patológica dirigida hacia el exterior de la retina, e intensificar la formación de la red vascular y la maduración vascular dentro de la retina. El modelo de neovascularización de la coroides inducida por láser (CNV) está colocado como un modelo experimental de enfermedad para degeneración macular relacionada con la edad (AMD) . EphrinB2 puede suprimir la CNV. Por lo tanto, ephrinB2 puede suprimir la neogénesis de angiogénesis patológica dirigida hacia el exterior de la retina (por ejemplo neovascularización de la coroides, neovascularización que se extiende a la membrana limitante interior) sin suprimir el flujo sanquíneo fisiológico. Por consiguiente, se puede utilizar ephrinB2 para suprimir angiogénesis o neovascularización patológica. Por lo tanto, ephrinB2 es útil en el tratamiento de degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía isquémica, neovascularización intraocular, neovascularización de la córnea, neovascularización de la retina, neovascularización de la coroides, edema macular diabético, isquemia de retina diabética, edema de retina diabética, retinopatía diabética, cánceres, artritis reumatoide, endometriosis, y alopecia, así como otras enfermedades o trastornos que están asociados con angiogénesis o neovascularización. En una modalidad, ephrinB2 es útil en el tratamiento de enfermedades o trastornos que están asociados con angiogénesis o neovascularización ocular. EphrinB2 no ocasiona daño al flujo sanguíneo fisiológico de la retina, el cual normalmente es ocasionado por tratamiento con terapia fotodinámica (PDT) y varios agentes antiangiogénicos que se utilizan principalmente en la actualidad. Por lo tanto, utilizando ephrinB2, se puede tratar AMD húmeda y seca inicial, por ejemplo, suprimiendo la neovascularización patológica de la coroides sin ocasionar daño al flujo sanguíneo fisiológico de la retina. Además, la retinopatía diabética se puede tratar suprimiendo la neovascularización patológica que se extiende a la membrana limitante interior sin ocasionar daño al flujo sanguíneo fisiológico de la retina.

Uso y administración de ephrinB2 El ephrinB2 que es útil en la presente invención puede ser cualquier ephrinB2, incluyendo análogos y variantes, que posean la actividad requerida. La estructura del ephrinB2 no está limitada en tanto que se logre el efecto de la presente invención. Aunque el ephrinB2 contiene el dominio extracelular, es posible que el ephrinB2 no contenga el dominio que se extiende a membrana ni el dominio citoplasmático, o el ephrinB2 puede ser de longitud completa. Además, el ephrinB2 puede ser un fragmento acortado. El ephrinB2 utilizado en la presente invención se puede obtener aislando y purificando la proteína normalmente presente en la Naturaleza o se puede producir a partir de microbios o similares mediante recombinación genética. Por ejemplo, con referencia a la secuencia de ADNc de ephrinB2 de humano descrita en la patente E.U.A. No. 6,303,769 o en Mol Immunol. 1995 Nov; 32 (16) : 1197-205, se puede preparar la proteína de longitud completa, la proteína que incluya el dominio extracelular y similares mediante el uso de la técnica convencional. El experto en la técnica puede alterar el ephrinB2 original de preferencia utilizando una técnica convencionalmente utilizada por el experto en la técnica. Además, se puede utilizar cualquier ephrinB2 comercialmente disponible como productos médicos o reactivos. Específicamente, cuando se utiliza ephrinB2 para una composición farmacéutica, es más preferible ephrinB2 purificado hasta una pureza que se utilice para propósitos médicos. Por ejemplo, considerando una propiedad inmunogénica, el ephrinB2 se puede alterar como cualquier forma apropiada para administración a un individuo mediante fusión a un dominio Fe de inmunogloblulina (de preferencia el dominio Fe de IgG de humano) . Se debe indicar que en los ejemplos que se describen posteriormente, se utiliza la proteína con ephrinB2 soluble (por lo general contiene un dominio extracelular pero no un dominio que se extienda a membrana y un dominio citoplasmático) fusionada a Fe de humano debido a su fácil disponibilidad. Sin embargo, esto no indica que el efecto de la presente invención queda limitado al ephrinB2 utilizado en los ejemplos. La composición que contiene ephrinB2 puede tomar varias formas apropiadas para administrar la composición a un individuo (por ejemplo animal de prueba) o para aplicar la composición a una muestra (por ejemplo célula (por ejemplo célula endotelial, específicamente célula del endotelio arterial o venoso), tejido u órgano). Los métodos para preparar dichas formas son bien conocidos en la técnica. En específico, la presente invención también provee una formulación apropiada para un uso predeterminado de ephrinB2. Aunque la formulación apropiada para el uso predeterminado de ephrinB2 no está limitada específicamente, se puede mencionar 2 "agente para inhibición de la síntesis de ADN en células del endotelio arterial (o células del endotelio venoso)", "agente para inhibición de la activación de MAP cinasa p44/p42 en células del endotelio arterial (o células del endotelio venoso)", "agente para inhibición de formación de tubo a partir de células del endotelio arterial (o células del endotelio venoso)", "agente para supresión de neovascularización de la retina", y similares. Dicha formulación que contiene ephrinB2 puede contener componentes diferentes a ephrinB2 en tanto que los efectos de ephrinB2 no sean bloqueados y que al individuo o muestra antes mencionada no se le provea ningún efecto perjudicial. La administración de dicha formulación a un individuo (por ejemplo animal de prueba) o aplicación de dicha formulación a una muestra (por ejemplo célula (por ejemplo célula endotelial, específicamente célula del endotelio arterial o venoso) , tejido, u órgano) se efectúa de tal manera que el ephrinB2 dentro de la formulación entre en contacto con el individuo o muestra antes mencionada. Además, la composición farmacéutica que contiene ephrinB2 puede ser una formulación que tome varias formas apropiadas para administrar la composición a un individuo. Los métodos para preparar dichas formas son bien conocidos en la técnica. Específicamente, la presente invención también provee una formulación apropiada para uso predeterminado de ephrinB2. Aunque la formulación apropiada para uso predeterminado de ephrinB2 no está limitada específicamente, se puede mencionar "agente para inhibición de la síntesis de ADN en células del endotelio arterial (o células del endotelio venoso)", "agente para inhibición de la activación de MAP cinasa p44/p42 en células del endotelio arterial (o células del endotelio venoso)", "agente para inhibición de formación de tubo a partir de células del endotelio arterial (o células del endotelio venoso)", "agente para supresión de neovascularización de la retina", "agente para prevención o tratamiento para tratar una enfermedad o trastorno relacionados con angiogénesis o neovascularización" y similares. Aunque en esta descripción se utiliza la expresión "células del endotelio arterial (o células del endotelio venoso)", las modalidades preferidas de la presente invención se refieren a células del endotelio arterial. La presente invención también provee una composición farmacéutica o un agente para prevención o tratamiento para tratar una enfermedad o trastorno que se selecciona a partir del grupo que consiste de degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía isquémica, neovascularización intraocular, neovascularización de la córnea, neovascularización de la retina, neovascularización de la coroides, edema macular diabético, isquemia de retina diabética, edema de retina diabética, retinopatía diabética, cánceres, artritis reumatoide, endometriosis, y alopecia. EphrinB2 puede tratar o prevenir por lo menos una de las enfermedades o trastornos antes mencionados. Dicha composición que contiene ephrinB2 puede contener una cantidad efectiva de ephrinB2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición puede contener otros componentes farmacéuticamente aceptables (incluyendo aqentes para supresión de neovascularización diferentes a ephrinB2) en tanto que no se bloqueen los efectos de ephrinB2. También se proveen composiciones farmacéuticas o agentes para prevención y/o tratamiento que contienen principalmente ephrinB2. EphrinB2 se puede administrar sistémicamente, por ejemplo, por vía oral o mediante inyección intramuscular o intravenosa, en mezcla íntima con un vehículo farmacéuticamente aceptable adaptado para la vía de administración. Se puede utilizar una variedad de vehículos fisiológicamente aceptables para administrar ephrinB2 y sus formulaciones son conocidas por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (18a edición) , ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA, y Pollock et al. EphrinB2 de preferencia se administra por vía parenteral (por ejemplo, mediante inyección o implante intramuscular, intraperitoneal, intravenoso, intraocular, intravítreo, o subcutáneo) . Las formulaciones para administración por vía parenteral incluyen soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones, o emulsiones. Se puede utilizar una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, agua, agua regulada en cuanto a pH, solución salina, y similares. Los ejemplos de otros vehículos apropiados incluyen polipropilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, gelatina, naftalenos hidrogenados, y esteres orgánicos inyectables, tal como oleato de etilo. Dichas formulaciones también pueden contener sustancias auxiliares, tales como agentes conservadores, humectantes, amortiguadores, emulsificantes, y/o dispersantes. Se pueden utilizar polímero de láctido, copolímero de láctido/glicólido, o copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno biocompatibles, biodegradables para controlar la liberación de los ingredientes activos. De manera alternativa, se puede administrar ephrinB2 mediante ingestión oral. Las formulaciones pretendidas para uso oral se pueden preparar en formas sólidas o líquidas, de conformidad con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas. Las composiciones pueden contener opcionalmente agentes edulcorantes, saborizantes, colorantes, para aroma, y conservadores con el fin de proveer una preparación más aceptable al paladar. Las formas de dosificación sólidas para administración por vía oral incluyen cápsulas, tabletas, pildoras, polvos, y granulos. En general, estas formulaciones contienen al ingrediente activo en mezcla íntima con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos. Estos pueden incluir, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, celulosa, almidón, fosfato de calcio, fosfato de sodio, caolín y similares.

También se pueden utilizar agentes aglutinantes, agentes reguladores de pH, y/o agentes lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio) . Las tabletas y pildoras pueden prepararse de manera adicional con recubrimientos entéricos. Las formas de dosificación líquidas para administración por vía oral incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y cápsulas de gelatina suave, farmacéuticamente aceptables. Estas formas contienen diluyentes inertes utilizados comúnmente en la técnica, tal como agua o un medio oleoso, y también pueden incluir coadyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsificantes, y agentes para suspensión. EphrinB2 también se puede utilizar por vía tópica, por ejemplo, utilizando parches o mediante aplicación directa al ojo, o mediante iontoforesis.

EphrinB2 se puede proveer en composiciones de liberación sostenida, tales como aquellas descritas en, por ejemplo, patentes E.U.A Nos. 5,672,659 y 5,595,760. El uso de composiciones de liberación inmediata o sostenida depende de la naturaleza del trastorno que está siendo tratado. Si el trastorno consiste de un trastorno agudo o sobre-agudo, se prefiere el tratamiento con una forma de liberación inmediata con respecto a una composición de liberación sostenida. De manera alternativa, para algunos tratamientos preventivos o a largo plazo, puede ser apropiada una composición de liberación sostenida. EphrinB2 también se puede suministrar utilizando un implante. Dichos implantes pueden ser implantes biodegradables y/o biocompatibles, o pueden ser implantes no biodegradables. Los implantes pueden ser permeables o impermeables al ingrediente activo. Se puede insertar un implante ocular dentro de una cámara del ojo, tal como las cámaras anterior o posterior o se puede implantar en la esclerótica, en el espacio transcoroidal, o en una región no vascularizada exterior al vitreo. En una modalidad preferida, el implante ocular se puede colocar sobre una región sin vasos sanguíneos, tal como sobre la esclerótica, de modo tal que se permita la difusión trans-esclerótica del fármaco hacia el sitio deseado de tratamiento, por ejemplo, el espacio intraocular y la mácula del ojo. Asimismo, el sitio de difusión trans-esclerótica de preferencia está en proximidad a la mácula. Los ejemplos de implantes para el suministro de ephrinB2 incluyen, pero no se limitan a, los dispositivos descritos en las patentes E.U.A. Nos. 3,416,530; 3,828,777 4,014,335; 4,300,557; 4,327,725; 4,853,224; 4,946,450 4,997,652; 5,147,647; 5,164,188; 5,178,635; 5,300,114 5,322,691; 5,403,901; 5,443,505; 5,466,466; 5,476,511 5,516,522; 5,632,984; 5,679,666; 5,710,165; 5,725,493 5,743,274; 5,766,242; 5,766,619; 5,770,592; 5,773,019 5,824,072; 5,824,073; 5,830,173; 5,836,935; 5,869,079 5,902,598; 5,904,144; 5,916,584; 6,001,386; 6,074,661 6,110,485; 6,126,687; 6,146,366; 6,251,090; y 6,299,895, y en los documentos WO 01/30323 y WO 01/28474, de los cuales todos se incorporan en la presente invención para referencia.

Dosificación La cantidad de ingrediente activo que se combina con los materiales de vehículo para producir una sola dosificación puede variar en función del individuo que está siendo tratado y del modo particular de administración. En términos generales, ephrinB2 se debe administrar en una cantidad suficiente para reducir o eliminar un síntoma de una enfermedad. Generalmente son útiles niveles de dosificación del orden de aproximadamente 1 µg/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal por administración en el tratamiento de trastornos neovasculares . Cuando se administran directamente al ojo, la administración preferida debe dar como resultado una concentración intraocular de aproximadamente 1 ng/ml hasta aproximadamente 100 ng/ml. La dosificación se puede administrar como una sola dosis o se puede dividir en dosis múltiples. En general, la dosis deseada se debe administrar a intervalos fijos durante un periodo prolongado, usualmente por lo menos en un lapso de varias semanas, aunque podrían ser necesarios periodos de administración más prolongados de varios meses o más. El experto en la técnica apreciará que las dosis individuales exactas se pueden ajustar un poco dependiendo de una variedad de factores: el tiempo de administración; la vía de administración; la naturaleza de la formulación; la velocidad de excreción; el trastorno particular que está siendo tratado; la gravedad del trastorno; y la edad, peso, salud, y género del paciente. Se deben esperar amplias variaciones en la dosis necesaria en vista de las diferentes eficiencias de las diversas vías de administración. Por ejemplo, en términos generales se puede esperar que la administración por vía oral requiera de niveles de dosis más altas que la administración mediante inyección intravenosa o intravítreo. Las variaciones en estos niveles de dosificación se pueden ajustar utilizando rutinas empíricas estándar para optimización, las cuales son bien conocidas en la técnica. De preferencia, los niveles y patrones de dosificación terapéuticamente efectivos, precisos, son determinados por el médico encargado en consideración de los factores antes identificados . Además de tratar enfermedades neovasculares preexistentes, ephrinB2 se puede administrar de manera profiláctica con el fin de evitar o desacelerar el inicio de estos trastornos. En aplicaciones profilácticas, ephrinB2 se administra a un individuo susceptible de o que esté en riesgo de un trastorno neovascular particular. De nuevo, las cantidades precisas que se administran dependen de varios factores tales como el estado de salud, peso, etc. del individuo. Aunque la presente invención se describe a continuación con base a ejemplos, la presente invención no queda limitada a dichos ejemplos.

EJEMPLOS En los siguientes ejemplos, las siguientes abreviaturas tienen los siguientes significados. Las abreviaturas no definidas tienen sus significados generalmente aceptados.

°C= grado Celsius hr = hora min = minuto seg = segundo µM = micromolar mM = milimolar M = molar ml = mililitro µl = microlítro mg = miligramo µg = microgramo DMEM = Medio de Eagle modificado de Dulbecco ITS = Insulina-transferrina-selenio FBS = suero fetal de bovino MEM = medio de Eagle modificado PBS = solución salina regulada con fosfato VEGF = factor de crecimiento de célula endotelial vascular FGF = factor de crecimiento de fibroblasto PDGF = factor de crecimiento derivado de plaquetas SDS = dodecilsulfato de sodio PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida EC = célula endotelial HUVEC = célula endotelial de vena umbilical de humano HAoEC = célula endotelial de aorta de humano OÍR = retinopatía inducida por oxíqeno CNV = neovascularización de la coroides AMD = degeneración macular relacionada con la edad En los ejemplos, se utilizan proteínas solubles como ephrinB2 y EphB4 debido a su fácil disponibilidad (de aquí en adelante, referidas como "sephrinB2" y "sEphB4", respectivamente; éstas son proteínas que contienen un dominio extracelular pero no un dominio que se extienda a membrana ni un dominio citoplasmático) . SephrinB2 y sEphB4 de ratón se obtienen a partir de R&D Systems, Inc. (614 McKinley Place NE, Minneapolis 55413, EUA) (ambas están en forma fusionada al dominio Fe de humano) . Como se describe en el ejemplo 5 más adelante, la proteína sintetizada ephrinB2 de humnao-Fc de humano también se utiliza como ephrinB2. Los experimentos que se muestran más adelante se repiten tres veces a menos que se menciona específicamente, y se indican los datos (medias ± SD) del experimento representativo. Se considera significancia estadística cuando p < 0.05 utilizando la prueba t de Student en poblaciones con distribución normal.

EJEMPLO 1 EphrinB2 inhibe la proliferación y migración de células EC estimuladas por factores de crecimiento Para investigar los efectos de si ephrinB2 y EphB4 en células del endotelial vascular estimuladas por factores de crecimiento, se efectúa la síntesis de ADN-absorción de [3H] timidina de células HAoEC y HUVEC y la prueba de tubo endotelial. 1. Absorción de [3H] timidina -síntesis de ADN de células HAoEC y HUVEC Se adquieren células del epitelio aórtico de humano (HAoEC) y células de endotelio de vena umbilical de humano (HUVEC) a partir de Clonetics Corp. (San Diego, California, EUA) y se mantienen en medio EGM de Clonetics complementado con suero fetal de bovino (FBS) al 10%. Los complementos para crecimiento de célula endotelial también son provistos por Clonetics. Las células HaoEC y HUVEC se cultivan en placas recubiertas con colágena tipo 1 (I aki, Japón) en medio de crecimiento endotelial (Clonetics Corp., San Diego, California, EUA) a 37°C en 5% de C02, 95% de aire, y el medio se cambia cada 2-3 días. Se utilizan las células provenientes de los pases 4 a 5 para los experimentos. Las EC se tratan durante 18 horas en DMEM (Nacalai tesque, Japón) que contiene FCS al 10% con 10 ng/ml de VEGF, bFGF, o PDGF-BB en presencia o ausencia de 200 ng/ml de cualquiera de ephrinB2 o EphB4. Las células se exponen después a [metil-3H] timidina (Amersham) a 20 µCi/ml durante 6 horas. Las células se tratan con tripsina y se recuperan sobre filtros de fibra de vidrio utilizando una recolectora de células automática, y se mide la absorción de [metil-3H] timidina en una contadora ß directa. Los resultados se muestran en las figuras ÍA y IB. El tratamiento de células del epitelio aórtico de humano (HAoECs) con VEGF, bFGF, o PDGF-BB incrementa la síntesis de ADN en 3-10 veces en comparación con el control no tratado. EphrinB2 inhibe la síntesis de ADN estimulada con todos estos estimulantes, mientras que ni sEphB4 ni tampoco sephrinB2 + sEphB4 lo hacen. Las figuras ÍA y IB respectivamente muestran los efectos de sephrinB2 sobre la síntesis de ADN estimulada con VEGF, bFGF, o PDGF-BB para las células HaoEC (figura ÍA) y HUVEC (figura IB) . Los caracteres de referencia en las figuras representan lo siguiente: C: control (no tratado), B2 : tratado con sephrinB2, B4 : tratado con sEphB4. En las figuras, la marca * indica que el resultado es significativamente diferente del caso no tratado sin estimulación con factores de crecimiento, mientras que la marca ** indica que el resultado es significativamente diferente del caso no tratado con sephrinB2 o sEphB4 aunque estimulado con los mismos factores de crecimiento. Como se muestra en la figura ÍA, el incremento en síntesis de ADN inducido por 10 ng/ml de VEGF, bFGF, o PDGF-BB es inhibido por 200 µg/ml de sephrinB2, en 40%, 30%, y 90%, respectivamente. Se obtienen resultados virtualmente idénticos utilizando células de endotelio de vena umbilical de humano (HUVEC) (figura IB) . No se observan células apoptóticas significativas durante este pedido de incubación (datos no mostrados) . 2. Prueba de tubo endotelial Se forman geles de colágena mezclando juntos solución para gelificación helada (10 x M199, H20, NaHC03 0.53 M, L-glutamina 200 mM, colágena tipo 1, NaOH 0.1 M, 100:27.2:50:10:750:62.5 en volumen) y células en medio 1 x basal (véase más adelante) a una concentración de 3 x 106 células/ml a una relación de 4 volúmenes de solución de gelificación: 1 volumen de células. Después de gelificar a 37°C durante 30 minutos, los geles se tienden con medio lx basal que consiste de FBS al 1%, L-glutamina 2 mM, ácido ascórbico 50 µg/ml, NaHC03 26.5 mM, 100 unidades/ml de penicilina, y 110 unidades/ml de estreptomicina, complementado con 40 ng/ml de bFGF, 40 ng/ml de VEGF, y 80 nM de PMA, lx ITS. Se agregan sephrinB2 y sEphB4 (200 ng/ml de cada uno) al medio lx basal inmediatamente después de la gelificación. Para cuantificar la formación de tubo, se determina el número de tubos por campo de aumento alto (20x) 48 horas después de la adición del medio basal. Un tubo se define como una estructura alargada constituida por una o más células endoteliales que superan los 100 µm de longitud. Se analizan cinco campos independientes separados por secciones ópticas de 100 µm para cada cavidad, y se determina el número promedio de tubos/campo 20x. La citotoxicidad se evalúa utilizando un estuche para proliferación celular II de Boehringer Mannheim. Además, se observan formas de células endoteliales estimuladas por VEGF a los 7 días para el control (no tratado) y los grupos tratados con cualquiera de sephrinB2 o sEphB4 y para tratamiento tanto con sephrinB2 como con sEphB4. La figura ÍC es una fotografía que muestra los estados de formación de tubo de células endoteliales estimuladas con VEGF a los 7 días para el control (no tratado) , y los grupos tratados con cualquiera de sephrinB2 o sEphB4 y tratados tanto con sephrinB2 como con sEphB4. La formación de tubo inducido por VEGF se reduce en el grupo tratado con sephrinB2 en comparación con los controles a los 7 días (figura ÍC) . En contraste, la formación de tubo inducida por VEGF no se ve afectada por el tratamiento con sEphB4. Por consiguiente, ephrinB2 puede inhibir la síntesis de ADN de EC que es inducida por varios estímulos, incluyendo VEGF, bFGF y PDGF. Aunque no es claro el mecanismo exacto de ephrinB2, la reducción en la síntesis de ADN no es ocasionada por apoptosis, debido a que no se observa apoptosis significativa de conformidad con la evaluación citotóxica. Es sorpresivo que la síntesis de ADN sea inhibida tanto en células del endotelio venoso como en células del endotelio arterial, debido a que el receptor para ephrinB2 (EphB4) es un marcador para células del endotelio venoso, mientras que no se sabe que las células del endotelio arterial posean este receptor. Consistente con sus efectos sobre la síntesis de ADN, ephrinB2 también puede inhibir la formación de tubo de EC que es inducida por VEGF.

EJEMPLO 2 Efectos de EphrinB2 sobre la fosforilación y auto- fosforilación de receptor ERK p42/44 inducida por factor de crecimiento Para el mecanismo mediante el cual ephrinB2 inhibe la respuesta mitogénica inducida por VEGF o bFGF sobre las células endoteliales, se investiga el efecto de ephrinB2 sobre la fosforilación de ERK (p42/44) estimulada por VEGF o bFGF en células endoteliales mediante análisis Western. Las células EC se dejan reposar durante 1 hora en EGM-DMEM (que contiene FCS al 3%) (Nacalai tesque, Japón) en presencia o ausencia de 50 ng/ml de sephrinB2. Además, las células EC se tratan durante 5 minutos con 10 ng/ml de bFGF o 10 ng/ml de VEGF (los controles se dejan sin tratar) . La preparación de las muestras de proteína provenientes de las células endoteliales y del análisis Western blot se efectúa de la siguiente manera: se aislan usados celulares enteros, extractos citosólicos o nucleares a partir de las células endoteliales. El análisis Western blot se efectúa tanto con inmunoprecipitación como sin inmunoprecipitación. Las muestras de proteína se separan mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) , seguido por transferencia electroforética a membranas de nitrocelulosa. Después de bloquear con leche descremada, los blots se incuban durante la noche a 4°C con anticuerpos (adquiridos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California, EUA)) contra fosfotirosina o KDR (sc-504) (1:500). Después de lavar, las membranas se incuban con anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa de rábano (Bio-Rad, Richmond, California, EUA) (1:3000) durante 1 hora a temperatura ambiente. La visualización se efectúa utilizando el sistema de detección de quimioluminiscencia realzada (ECL) de Amersham de conformidad con las instrucciones del fabricante. La figura 2A es una fotografía electroforética que muestra los efectos de ephrinB2 sobre la fosforilación de ERK en células HaoEC estimuladas con VEGF o bFGF (p44/p42:ERK total. pp44/pp42:ERK fosforilada) . La fosforilación de ERK se incrementa mediante tratamiento con 10 ng/ml de VEGF o mediante tratamiento con 25 ng/ml de bFGF. SephrinB2 suprime la fosforilación de ERK inducida tanto por VEGF como por bFGF. Por ejemplo, 200 µg/ml de sephrinB2 inhiben la fosforilación de ERK inducida por VEGF en un 70%. Por lo tanto, se observa que ephrinB2 inhibe la fosforilación de ERK estimulada por VEGF y bFGF en células HAoEC. Enseguida, se investiga la auto-fosforilación del receptor 2 de VEGF (KDR) en HUVECs estimuladas con VEGF. Las células EC se dejan reposar durante 1 hora en EGM-DMEM (que contiene FCS al 3%) (Nacalai tesque, Japón) en presencia o ausencia de 50 ng/ml de sephrinB2. Además, las células EC se tratan durante 5 minutos con 10 ng/ml de bFGF o 10 ng/ml de VEGF (los controles se dejan sin tratar) . En la misma manera que la anterior, el receptor (KDR) se inmunoprecipita (IP) de los usados celulares, y el blotting se efectúa con el anticuerpo fosfotirosina (PY20) . La figura 2B es una fotografía electroforética que muestra los efectos de ephrinB2 sobre la autofosforilación del receptor 2 (KDR) de VEGF en HAoECs estimuladas con VEGF. La figura 2B muestra que ephrinB2 no tiene un efecto notable sobre la autofosforilación del receptor 2 de VEGF en células HAoEC estimuladas con VEGF. La auto-fosforilación del receptor 2 de VEGF se incrementa 14 veces utilizando 10 ng/ml de VEGF. SephrinB2 no inhibe la auto-fosforilación del receptor 2 de VEGF. Se obtienen resultados virtualmente idénticos utilizando HUVECs (datos no mostrados) en las dos pruebas de fosforilación antes mencionadas. Estos resultados indican por lo tanto que ephrinB2 inhibe la fosforilación de ERK inducida por VEGF o bFGF en células endoteliales (arteriales y venosas) . Este efecto probablemente explica, por lo menos parcialmente, la actividad de ephrinB2 para inhibir la proliferación de estas células inducida por VEGF o bFGF. Sin embargo, ephrinB2 no inhibe la auto-fosforilación del receptor 2 de VEGF. Por lo tanto, ephrinB2 no interfiere con la transducción de señal entre VEGF y el receptor de VEGF como un mecanismo para inhibir las funciones de VEGF.

EJEMPLO 3 Inhibición de angiogénesis inducida por bFGF mediante coadministración de EphrinB2 en córneas de ratón Se sabe que FGF básico (bFGF) es un factor angiogénico potente. Debido a que ephrinB2 puede inhibir la proliferación de célula EC inducida por bFGF, se examina si ephrinB2 puede suprimir también la angiogénesis. Esencialmente se efectúa la prueba de micro-saco córneo en ratones y la cuantificación de neovascularización de la córnea 'en la forma previamente descrita por Kenyon, B.M. et al., (1996) Ophthalmol . Vis. Sci., Vol. 37(8):1625-1632, con algunas modificaciones. Brevemente, se preparan 0.3 µl de comprimidos Hydron (IFN Sciences, New Brunswick, New Jersey, EUA) que contienen 90 ng de bFGF de humano y se implantan en las corneas de ratones BALB/c de género masculino. Se agrega sephrinB2 o sEphB4 (lOOng/comprimido) directamente a la solución de bFGF/Hydron. El comprimido se posiciona a 1.0 mm desde el limbo de la córnea. Después del implante, se aplican gotas oftálmicas de ofloxacin a cada ojo. Después de 6 días, los animales se sacrifican y se fotografían los vasos sanguíneos de la córnea. El análisis cuantitativo de neovascularización en corneas de ratón se lleva a cabo utilizando el paquete de software NTH Image. Seis días después de la implantación del comprimido, se examina el surqimiento de nuevos vasos sanguíneos. bFGF induce dramáticamente la angiogénesis en córneas de ratón. Se examinan también los efectos de sephrinB2 y sEphB4 sobre la neovascularización de la córnea inducida por bFGF. La administración de sephrinB2 bloquea marcadamente la angiogénesis inducida por bFGF, sin embargo la administración de EphB4 no muestra efecto. La figura 3 muestra el resultado del análisis cuantitativo de angiogénesis en córneas de ratón con la co-administración de bFGF y ephrinB2. El eje longitudinal de la figura 3 indica el valor en términos de área de la región con neovascularización representado mediante porcentaje cuando la región con neovascularización en presencia de bFGF se representa mediante 100%. Las barras son la desviación estándar para todos los animales en cada grupo (n=6 por grupo) . El análisis cuantitativo también demuestra que la neovascularización de la córnea inducida por bFGF es inhibida completamente por ephrinB2 (figura 3) .

EJEMPLO 4 Efectos de ephrinB2 sobre neovascularización retiniana inducida por oxigeno El modelo de retinopatía inducida por oxígeno (OÍR) se prepara de la siguiente manera utilizando ratones C57BL/6J (obtenidos a partir de SLC Japón) . Los ratones en el día post-natal 7 (P7) y sus madres se colocan en una caja que se pone en estado de 75% de hiperoxia durante 5 días. 5 días después que se ponen en la condición hiperóxica, que es en el día post-natal 12 (P12) , los ratones se regresan a la condición normal de 20% de oxígeno, y se estudia la reacción de los vasos sanguíneos retiñíanos después de esto. Los ratones tratados de esta manera muestran progresión extensiva de neovascularización de la retina. La neovascularización de la retina se forma en 100% de los animales en el día P19. En el día P19, los haces neovasculares son claros, y se extienden desde las membranas internas limitantes hacia el vitreo especialmente en la periferia intermedia. Para investigar los efectos de ephrinB2 sobre la neovascularización de la retina, se inyectan por vía intraperitoneal 200 µg de sephrinB2 en 100 µl de PBS (n=6) y 200 µl PBS sola (n=6) como control una vez por día a ratones OÍR de P13 y P15. La neovascularización de la retina se evalúa en el día P17. Siguiendo el protocolo que se presenta en forma resumida a continuación, se evalúan retinas montadas en plano utilizando angiografía con fluoresceína-dextrano (Lab Invest. 2004; 84(8): 973-80). Primero, los ratones se anestesian profundamente y se perfunde el ventrículo izquierdo con 0.03 ml/g de peso corporal de solución 50 mg/ml de fluoresceína-dextrano con peso molecular de 2 x 106 (Sigma) . Se extirpan los ojos y se fijan en paraformaldehído al 4% durante por lo menos 3 horas. Después se retiran las córneas y cristalinos, se disecan las retinas periféricas y se montan en plano sobre portaobjetos para microscopio para examen bajo un microscopio de fluorescencia. En las figuras 4A y 4B se muestran micrografías de fluorescencia de las retinas perfundidas con fluoresceína-dextrano montadas en plano para el control y el modelo tratado con sephrinB. (4A: modelo OÍR de control; 4B: modelo tratado con sephrinB) . En el modelo tratado con sephrinB, desde el centro hacia la periferia de la retina es claramente blanco (figura 4B) . Esto indica que existen vasos sanguíneos normales en la retina en los cuales se puede perfundir la fluoresceína-dextrano. La existencia de los vasos sanguíneos normales se observa relativamente más en el modelo tratado con sephrinB en comparación con el modelo OÍR (figura 4A) . Además, a la micrografía de fluorescencia de las retinas perfundidas con fluoresceína-dextrano montadas en plano se le aplica un software para medir el área de regiones no perfundidas. La figura 5 es una gráfica que muestra relaciones de área de regiones no perfundidas en un modelo de control (OÍR) y en un modelo tratado con sephrinB2 (OÍR + ephrinB2) . El eje longitudinal de la figura 5 indica una relación de área de regiones no perfundidas, la cual se representa mediante porcentaje (%) cuando la región no perfundida en el modelo OÍR está representada por 100%. Las barras son la desviación estándar para todos los animales en cada grupo (n=6 por grupo) . A partir de la figura 5 se observa que el modelo tratado con sephrinB tiene área reducida de región no prefundida en comparación con el modelo de control. La relación de no vascularidad de la retina entre el modelo tratado con sephrinB2 y el modelo de control es estadísticamente significativa (indicada con la marca ** en la figura 5: p<0.01). Asimismo, se examinan los efectos de sephrinB2 sobre neogénesis de nuevos vasos sanguíneos con un microscopio de barrido electrónico. Como previamente se describió en Cell Tissue Res. (1992) 270:165-172, se efectúa microscopía de barrido de transmisión electrónica bajo una condición optimizada para analizar el sistema vascular sanguíneo. Las fotografías se toman con un microscopio de transmisión Hitachi H-800 y un microscopio de barrido electrónico. Las figuras 6A y 6B son fotografías de SEM (la retina se observa desde el lado del cuerpo vitreo) que muestran la superficie retiniana de ratón neonato P17 para el modelo de control (OÍR) (figura 6A) y el modelo tratado con sephrinB2 (OÍR + ephrinB2) (figura 6B) . En la fotografía del modelo de control de la figura 6A, se observa neogénesis de vasos sanguíneos nuevos anormales (neovascularización que se extiende a la membrana limitante interior) desde la retina hacia el interior del cuerpo vitreo (específicamente, la porción tipo agujero en el lado derecho de la fotografía) . Por el contrario, en la fotografía del modelo tratado con sephrinB2 de la figura 6B, no se observa dicha porción tipo agujero, de modo que parece ser que se suprime la neogénesis de nuevos vasos sanguíneos al interior del cuerpo vitreo. Por lo tanto, tratando los ratones OÍR con sephrinB2, se suprime la neogénesis de nuevos vasos sanguíneos formados hacia el cuerpo vitreo, aunque se observa que la red vascular se extiende virtualmente en dirección paralela a la membrana. Además, el tratamiento con seprinB2 no reduce el flujo sanguíneo propio de la retina. Esto es un papel importante de sephrinB2 en el crecimiento de vasos sanguíneos. SephrinB2 no sólo suprime la neovascularización patológica dirigida hacia el exterior de la retina (extendiéndose hacia el cuerpo vitreo en este ejemplo) , sino que es capaz de incrementar la formación de la red vascular y la maduración vascular dentro de la retina. Dicho efecto puede ser óptimo para el tratamiento de retinopatía diabética.

EJEMPLO 5 Efecto supresor de ephrinB2 de humano sobre la neovascularización En este ejemplo, se evalúa una proteína de fusión de ephrinB2 derivada a partir de una genoteca de ADN humano y Fe de humano, y el efecto supresor de neovascularización de la misma. 1. Preparación de proteína sintética ephrinB2 de humano-Fe de humano Como se describe más adelante, se fusiona un fragmento de ADNc de ephrinB2 a un extremo 5' terminal de ADNc que codifica para la porción Fe del anticuerpo IgGl de humano. Se hace referencia a la patente E.U.A. No. 6,303,769 o Mol Immunol. 1995 Nov; 32 (16) : 1197-205 para la secuencia de este ADNc de ephrinB2 de humano. La clonación de Fe se efectúa de la siguiente manera: se efectúa PCR utilizando la genoteca de ADNc de bazo de humano (100 ng) como una plantilla, el iniciador hacia el extremo 5': GAA GAT CTC CCA AAT CTT GTG ACÁ AAA CTC (SEQ ID NO: 1) y el iniciador hacia el extremo 3': GCG GCC GCT CAT TTA CCC GGA GA (SEQ ID NO: 2), y KODplus (TOYOBO). Se purifica el fragmento de ADN amplificado de aproximadamente 700 pb, el fragmento de ADN purificado se subclona en el vector Teasy (Promega) , y se confirma que es IgGIFc de humano. La clonación de ephrinB2 de humano se efectúa de la siguiente manera: la PCR se efectúa utilizando la genoteca de ADNc de placenta de humano (100 ng) como una plantilla, el iniciador hacia el extremo 5': GCG AAG CTT ACC ATG GCT GTG AGA AGG GAC (SEQ ID NO: 3) y el iniciador hacia el extremo 3': GCG AGA TCT GGC CAC TTC GGA ACC GAG GAT (SEQ ID NO: 4), y KODplus (TOYOBO) . Se purifica el fragmento de ADN amplificado de aproximadamente 680 pb. Cuando el fragmento de ADN purificado se subclona en el vector Teasy (Promega), y se confirma la secuencia de bases, éste es el fragmento de ADN de 678 pb mostrado en las posiciones de base 1-678 en la secuencia de bases del ADNc de ephrinB2 de humano antes mencionado. Se asume que la proteína codificada por este fragmento de ADN de ephrinB2 de humano incluye el dominio extracelular de la proteína ephrinB2 de humano pero no el dominio citoplasmático ni el dominio de extensión a membrana. Para el fragmento de ADN de EFN-B2 clonado, el extremo terminal 5' se trata con HindIII, y el extremo terminal 3' se trata con la enzima de restricción BglII, mientras que para el fragmento de ADN de Fe, el extremo terminal 5' se trata con BglII, y el extremo 3' terminal se trata con la enzima de restricción Notl. Para estos fragmentos, se efectúa la ligación de tres piezas utilizando el vector de expresión de mamífero pcDNA4-Myc-His A (Invitrogen) tratado con las enzimas de restricción HindIII y Notl y el estuche para ligación de ADN ver.2.1 (TAKARA). El vector obtenido mediante ligación se transforma en Escherichia coli XL21. Cuando se purifica el plásmido a partir de la colonia de Escherichia coli cultivada, y se confirma la secuencia de bases, éste es EFN-B2 (l-678bp) -Fe de humano. Este plásmido se transfecta en células HEK293 y se incuba bajo las siguientes condiciones de incubación. Como medio, se utilizan DMEM (SIGMA) complementado con FBS al 10% (Biowest Fetal Bovine Serum) y antibióticos (1% de penicilina y 1% de estreptomicina de GIBCO) . La incubación se efectúa en una incubadora con 5% de C02 durante 3 días a 37 °C. Se obtiene la línea celular estable de EphrinB2 mediante transfección de gen con el método de fosfato de calcio y selección de fármaco con Zeocina 250µg/ml (invivogen) . Cuando se recolecta el sobrenadante de cultivo a partir de la línea celular estable, la incubación se efectúa con medio GIT (Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.). Posteriormente, la proteína expresada se purifica de la siguiente manera a partir de la línea celular estable de ephrinB2-Fc. Se recolectan aproximadamente 100 ml de sobrenadante de cultivo y se centrifugan (1100 rpm, 5 minutos, 4°C) para eliminar restos tales como células muertas. Se agregan 100 µl de proteína A-sefarosa al mismo y se hace girar durante 2 horas a 4°C. Después de esto, se retira el sobrenadante mediante centrifugación (2000 rpm, 5 minutos, 4°C) , y se remueven la proteína absorbida no especifica y similares mediante adición de solución reguladora para lavado (Tris-HCl 10 mM, pH7.4, 150 mM de NaCl, NP40 al 0.1%) para precipitación (sefarosa + ephrinB2). Esta operación de lavado se efectúa 3 veces. Después de lavar 3 veces, se agregan 70 µl de solución reguladora para elución (glicina 0.1 M, pH 3.0), se deja reposar en hielo durante 10 minutos, y la precipitación se recolecta después de centrifugar (2000 rpm, 2 minutos, 4°C) . Esta operación se repite 7 veces. Se mide la concentración de proteína del sobrenadante recolectado a una absorbancia de D02ßo- Aquellos con una alta concentración de proteína se recolectan, se neutralizan agregando 1/10 la cantidad de Tris-HCl 1M, pH8.0, y se dializa durante la noche contra solución salina regulada con fosfatos. La muestra se recolecta después de dializar, y se efectúa la determinación cuantitativa de proteína utilizando el método BCA. Se efectúa SDS-PAGE al mismo tiempo en un estado no reducido o reducido, y la muestra se confirma como proteína sintética ephrinB2 de humano-Fc de humano mediante peso molecular. 2. Absorción de [3H] Timidina-Síntesis de ADN de HUVEC En la misma manera que la del ejemplo 1, para la proteína sintética ephrinB2 de humano-Fc de humano antes mencionada, se investigan los efectos de HUVEC sobre la síntesis de ADN. Sin embargo, las células EC se tratan durante 18 horas en DMEM (Nacalai tesque, Japón) que contiene FCS al 10% con 0.6 nM de bFGF en presencia o ausencia de 1 nM, 10 nM, o 100 nM de proteína ephrinB2-Fc de humano. Como un control positivo, se utilizan 100 nM de proteína quimérica ephrinB2 de ratón-Fe de humano (R&D Systems, Inc. (614 McKinley Place NE, Minneapolis 55413, EUA)). El resultado de la absorción de timidina por HUVEC se muestra en la figura 7. El eje longitudinal de la figura 7 indica el porcentaje (%) para los casos sin tratamiento de bFGF y ephrinB2. Cuando la HUVEC se estimula con bFGF (0.6 nM) sin tratamiento de ephrinB2, la síntesis de ADN se incrementa 5 veces en comparación con el control no tratado con bFGF. 100 nM de la proteína sintética ephrinB2 de humano-Fc de humano inhiben la síntesis de ADN incluso sin estimulación con bFGF. El incremento de la síntesis de ADN inducida por 0.6 nM de bFGF es inhibido por 1 nM, 10 nM, y 100 nM of proteína sintética ephrinB2-Fc de humano en 10%, 30%, y 95%, respectivamente (figura 7). No se observan células apoptóticas significativas durante este periodo de incubación (datos no mostrados) .

EJEMPLO 6 Evaluación de EphrinB2 sobre el modelo de CNV Se evalúan los efectos de proteína sintética ephrinB2 de humano-Fc de humano sobre la supresión de neovascularización utilizando el modelo de neovascularización de la coroides (CNV) inducida por láser que es considerada como un modelo biológico de AMD.

Animales experimentales Se utilizan 12 ojos obtenidos a partir de 6 monos cinomolgus. Estos animales se tratan sin generarles dolor, y se escogen sin patógenos a partir de Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Los experimentos se efectúan bajo anestesia general con clorhidrato de etamina. Los experimentos se efectúan siguiendo la norma ética (Autorización No. cl89-001) aprobada por el Comité de Etica Sobre Experimentación con Animales (Animal Experimentation Ethics Committee) de Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd.

Inducción experimental de neovascularización de la coroides (CNV) Se induce CNV experimental mediante fotocoagulación utilizando láser multicolor (longitud de onda 647 nm) (Novus Omni Láser; Lumenis, Santa Clara, Calif) en el polo posterior del fundus de los ojos de los monos antes mencionados. El tamaño de la mancha es de 100 µm de diámetro y el tiempo de exposición es de 0.1 segundos. La potencia de salida en la superficie de la córnea es de 700 mW utilizando un lente de contacto, se efectúan 8 quemaduras en porciones que excluyen la fovea central en cada ojo.

Método de administración y concentración de ephrinB2 Inmediatamente después de la irradiación con láser y 5 días después de la irradiación, en específico dos veces en total, se efectúa la administración intra-vítreo de la proteína sintética ephrinB2 de humano-Fc de humano preparada en la modalidad 5 antes mencionada. Se inyectan 0.1 ml de solución de PBS que se ajusta para hacer que la concentración de ephrinB2 intra-vítreo respectivamente sea de 1 ng/ml, 10 ng/ml, y 100 ng/ml en el ojo utilizando una aguja de calibre 27 desde el anillo ciliar. Como un control negativo, se inyectan 0.1 ml de PBS. Como un control positivo, se utilizan 10 ng/ml y 100 ng/ml de la proteína quimérica ephrinB2 de ratón-Fe de humano antes mencionada.

Evaluación de CNV 10 días después de la irradiación láser se efectúa angiografía de fundus con fluoresceína para evaluar la neovascularización de la coroides. Se administran por vía intravenosa 0.1 ml/kg de fluoresceína de sodio al 5%, y se efectúa la fotografía del fundus con fluoresceína con una cámara para fundus (TRC-50EX, Topcon Corporation) . La hiperlucencia de la neovasculatura de la coroides se evalúa para las fotografías 5-6 minutos después de comenzar la inyección. La evaluación sobre las fotografías es efectuada por un experto especialista en oftalmología. Excepto por 3 ojos que fueron imposibles de evaluar debido a la opacidad del medio óptico, se determina que la lesión para cada punto de láser con hiperlucencia significativa de fluorocromo tiene actividad. Las figuras 8A a 8C son fotografías de fluoresceína de funduses provistos con los siguientes tratamientos. La figura 8A es el resultado del tratamiento con 10 ng/ml de ephrinB2 de humano, la figura 8B es el resultado de un control negativo (tratamiento con PBS) , y la figura 8C es el resultado del tratamiento con 10 ng/ml de ephrinB2 de ratón. Para el control negativo con inyección de PBS, 10/16 son CNV con actividad. Por otro lado, en el grupo al que se administra ephrinB2 las relaciones de lesión de CNV activa son 5/16 para 1 ng/ml, 0/8 para 10 ng/ml, y 3/8 para 100 ng/ml. En el grupo de control positivo utilizando 10 ng/ml y 100 ng/ml de proteína quimérica ephrinB2 de ratón-Fe de humano, 5/8 y 5/16 son CNV activos. Como se describió anteriormente, la proteína sintética ephrinB2 de humano-Fc de humano suprime en una forma dependiente de la concentración la proliferación en sistemas in vi tro utilizando HUVEC. Específicamente, con la concentración de 100 nM, la capacidad para suprimir la proliferación es de 95%. Además, la proteína sintética ephrinB2 de humano-Fc de humano suprime la generación de nuevos vasos sanguíneos en el modelo de CNV inducida por láser. La concentración intra-vítreo de 10 ng/ml es efectiva. EphrinB2 se expresa en el epitelio del pigmento que migró en el modelo de láser (datos no mostrados) . Por lo tanto, se asume que la neovascularización fue detenida por la expresión de ephrinB2 en epitelio del pigmento. El resultado de esta modalidad demuestra el efecto de ephrinB2 sobre la supresión de neovascularización.

Aplicabilidad industrial Las composiciones y métodos de la presente invención son útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos que están asociados con angiogénesis o neovascularización. Específicamente, las composiciones y métodos de la presente invención son capaces de angiogénesis y neovascularization patológica fuera de la retina sin suprimir el flujo sanguíneo fisiológico dentro de la retina. Por lo tanto, las composiciones y métodos de la presente invención se pueden utilizar de manera conveniente en el tratamiento de enfermedades o trastornos que están asociados con angiogénesis o neovascularización, tal como AMD y retinopatía diabética, en comparación con el método de tratamiento actual sugerido por inyección de PTD y otros diversos agentes anti-angeogenéticos (por ejemplo agente anti-VEGF) .

Claims (12)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1.- Una composición para inhibir la síntesis de ADN en células del endotelio arterial, que comprende una cantidad efectiva de un ephrinB2. 2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ephrinB2 comprende un dominio extracelular, el ephrinB2 no comprende un dominio que se extiende a membrana de un ephrinB2 original, y el ephrinB2 no comprende un dominio citoplasmático de un ephrinB2 original. 3.- Un agente para la prevención o tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con angiogénesis o neovascularización, el agente comprende la composición de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2. 4.- El agente para prevención o tratamiento de una enfermedad o trastorno de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la enfermedad o trastorno se selecciona a partir del grupo que consiste de "degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía isquémica, neovascularización intraocular, neovascularización de la córnea, neovascularización de la retina, neovascularización de la coroides, edema macular diabético, isquemia de retina diabética, edema de retina diabética, y retinopatía diabética". 5.- El agente para prevención o tratamiento de una enfermedad o trastorno de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es neovascularization a partir de una retina. 6.- El agente para prevención o tratamiento de una enfermedad o trastorno de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el agente se administra a un individuo, el individuo tiene una angiogénesis o neovascularización patológica fuera de la retina o tiene una posibilidad de generar la angiogénesis o neovascularización patológica fuera de la retina. 1 . - Una composición para inhibir la formación de tubo a partir de células del endotelio arterial, que comprende una cantidad efectiva de un ephrinB2. 8. - La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el ephrinB2 comprende un dominio extracelular, el ephrinB2 no comprende un dominio que se extienda a membrana de un ephrinB2 original, y el ephrinB2 no comprende un dominio citoplasmático de un ephrinB2 original. 9.- Un agente para la prevención o tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con angiogénesis o neovascularización, el agente comprende la composición de conformidad con las reivindicaciones 7 u 8. 10.- El agente para prevención o tratamiento de una enfermedad o trastorno de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la enfermedad o trastorno se selecciona a partir del grupo que consiste de "degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía isquémica, neovascularización intraocular, neovascularización de la córnea, neovascularización de la retina, neovascularización de la coroides, edema macular diabético, isquemia de retina diabética, edema de retina diabética, y retinopatía diabética" . 11.- El agente para la prevención o tratamiento de una enfermedad o trastorno de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es neovascularización a partir de una retina. 12.- El agente para prevención o tratamiento de una enfermedad o trastorno de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el agente se administra a un individuo, el individuo tiene una angiogénesis o neovascularización patológica fuera de la retina o tiene una posibilidad de generar la angiogénesis o neovascularización patológica fuera de la retina.