JP3983271B1 - エフリンb2を用いた新生血管抑制方法 - Google Patents
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Abstract
内皮細胞のDNA合成,MAPキナーゼ活性化および脈管形成を阻害する方法を提供する。また,血管形成および新生血管を阻害する方法に加え,前記方法に有用な組成物を提供する。
Description
本発明は,血管形成および新生血管に関する。より詳しくは,血管形成および新生血管におけるエフリンB2の使用に関する。
血管形成は,加齢黄斑変性,糖尿病性網膜症,および未熟児網膜症のような多種多様な眼病理症状の特徴である。血管形成カスケードは,多くのメディエータおよびケモカインによって惹き起こされる。例えば,多段階血管形成プロセスに関連する受容体型チロシンキナーゼ(RTK)は,血管形成の重要なメディエータとして認識されている。血管内皮細胞増殖因子(VEGF)を含む血管形成サイトカインが最初に産生することは,毛細血管の発生の概念によく当てはまる事象である。近年,アンジオポエチン/Tie2系が,血管アセンブリおよび成熟を媒介するリガンド−受容体系として同定されている。また,VEGF/VEGF受容体およびアンジオポエチン/Tie2ファミリーもRTKに属する。
参考文献
本出願において下記または本明細書中のどこかで引用される全ての刊行物,特許文献および特許出願は,それぞれの刊行物,特許文献および特許出願の開示が,具体的又は個別に明記されているかのように,それらの全体が本明細書中にとりこまれ,開示されたものとされる。
Adams, R.H.ら,(2001).The cytoplasmic domain of the ligand ephrinB2 is required for vascular morphogenesis but not cranial neural crest migration. Cell,104巻,1号,57−69頁 Adams, R.H.ら,(1999).Roles of ephrinB ligands and EphB receptors in cardiovascular development: demarcation of arterial/ venous domains,vascular morphogenesis, and sprouting angiogenesis. GenesDev.,13巻,3号,295−306頁 Gale, N.W.ら,(2001).EphrinB2 selectively marks arterial vessels and neovascularization sites in the adult, with expression in both endothelial and smooth−muscle cells. Dev.Biol.,230巻,2号,151−160頁 Gerety, S.S.ら,(1999).Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrinB2 in cardiovascular development. Mol.Cell,4巻,3号,403−414頁 Kenyon,B.M.ら,(1996).A model of angiogenesis in the mouse cornea. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.,37巻,8号,1625−1632頁 A Shin, D.ら,(2001). Expression of ephrinB2 identifies a stable genetic difference between arterial and venous vascular smooth muscle as well as endothelial cells, and marks subsets of microvessels at sites of adult neovascularization. Dev.Biol.,230巻,2号,139−150頁 Wang, H.U.ら,(1998).Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrinB2 and its receptor Eph−B4. Cell,93巻,5号,741−753頁
本出願において下記または本明細書中のどこかで引用される全ての刊行物,特許文献および特許出願は,それぞれの刊行物,特許文献および特許出願の開示が,具体的又は個別に明記されているかのように,それらの全体が本明細書中にとりこまれ,開示されたものとされる。
Adams, R.H.ら,(2001).The cytoplasmic domain of the ligand ephrinB2 is required for vascular morphogenesis but not cranial neural crest migration. Cell,104巻,1号,57−69頁 Adams, R.H.ら,(1999).Roles of ephrinB ligands and EphB receptors in cardiovascular development: demarcation of arterial/ venous domains,vascular morphogenesis, and sprouting angiogenesis. GenesDev.,13巻,3号,295−306頁 Gale, N.W.ら,(2001).EphrinB2 selectively marks arterial vessels and neovascularization sites in the adult, with expression in both endothelial and smooth−muscle cells. Dev.Biol.,230巻,2号,151−160頁 Gerety, S.S.ら,(1999).Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrinB2 in cardiovascular development. Mol.Cell,4巻,3号,403−414頁 Kenyon,B.M.ら,(1996).A model of angiogenesis in the mouse cornea. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.,37巻,8号,1625−1632頁 A Shin, D.ら,(2001). Expression of ephrinB2 identifies a stable genetic difference between arterial and venous vascular smooth muscle as well as endothelial cells, and marks subsets of microvessels at sites of adult neovascularization. Dev.Biol.,230巻,2号,139−150頁 Wang, H.U.ら,(1998).Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrinB2 and its receptor Eph−B4. Cell,93巻,5号,741−753頁
エフリンの受容体であるEph受容体は,8つのEphA受容体および6つのEphB受容体からなる,チロシンキナーゼ受容体の最大のファミリーである。このEph受容体チロシンキナーゼファミリーはRTKの新しいクラスを表すが,血管形成におけるEph受容体の役割ははっきりしていない。元来,Eph受容体は,神経経路開拓分子として同定されていたが,ノックアウトマウスおよび成熟エフリンB2−lacZトランスジェニックマウス実験において,EphB受容体およびエフリンBリガンドが,動静脈分化および境界形成を編成する血管アセンブリの重要なレギュレータとして同定された(Adamsら,1999;Galeら,2001;Shinら,2001)。一方,遺伝子標的実験では,エフリンB2は,動脈内皮細胞の初期マーカーであり,その受容体であるEphB4が脊椎動物胚においては静脈内皮細胞を相互にマークしていることが明らかにされている(Wangら,1998;Adamsら,1999;Geretyら,1999;Adamsら,2001)。さらに,成人における内皮細胞は,その非対称的動静脈発現パターンを維持し,これは,エフリンB/EphB系が,血管恒常性を制御する役割をし,そして成人において病理学的血管形成を制御する可能性を有することを示唆している(Galeら,2001;Shinら,2001)。このように,エフリンの作用の態様を決定すること,ならびに特に病理学的状態において血管系を操作するためにこれらの分子を使用し得る手段が所望される。
我々は,エフリンB2が血管形成を抑制するメカニズムを研究した。そして,エフリンB2が内皮細胞(EC)のDNA合成および血管内皮細胞増殖因子(VEGF),塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)によって誘導されるp44/p42MAPキナーゼ活性化を抑制することがわかった。特に,これらの効果は,動脈内皮細胞がエフリンB2に対する受容体を有することが解明されてないにもかかわらず,静脈および動脈内皮細胞(ECs)で発揮される。エフリンB2はまた,ECの脈管形成を阻害し,bFGFに誘導された血管形成を抑制する。これらの結果は,エフリンB2/EphB4および,その抗血管形成シグナリング経路を標的にすることにより,血管形成依存的疾患を治療し得ることを示している。
したがって,本発明の一実施形態は,有効量のエフリンB2で動脈内皮細胞に接触させる工程を含む,内皮細胞におけるDNA合成を阻害する方法に関する。前記内皮細胞におけるDNA合成は,好ましくはVEGF,bFGFまたは血小板由来増殖細胞(PDGF)によって誘導され,前記内皮細胞は動脈内皮細胞であることが好ましい。
本発明はまた,有効量のエフリンB2で動脈内皮細胞を接触する工程を含む,内皮細胞におけるp44/p42MAPキナーゼ活性化を阻害する方法に関する。前記内皮細胞における前記p44/p42MAPキナーゼ活性化は,好ましくはVEGF,bFGFまたはPDGFによって誘導され,前記内皮細胞は動脈内皮細胞であることが好ましい。
本発明の他の実施形態は,有効量のエフリンB2で動脈内皮細胞に接触させる工程を含む,内皮細胞からの脈管形成を阻害する方法に関する。前記内皮細胞の前記脈管形成は,好ましくはVEGF,bFGFまたはPDGFによって誘導され,前記内皮細胞は動脈内皮細胞であることが好ましい。
本発明におけるこれら全ての実施形態はin vivoあるいはin vitroで実施することができる。invivoで実施する場合,エフリンB2は当該技術分野において知られているいかなる方法によっても,内皮細胞を有する哺乳動物へ投与することができる。
さらに,本発明は有効量のエフリンB2を哺乳動物へ投与する工程を含む,哺乳動物における血管形成の阻害方法に関する。前記エフリンB2は,好ましくは全長エフリンB2である。
本発明はまた,有効量のエフリンB2を哺乳動物へ投与する工程を含む,哺乳動物における新生血管抑制方法に関する。前記エフリンB2は,好ましくは全長エフリンB2である。
本発明はさらに,有効量のエフリンB2を哺乳動物へ投与する工程を含む,哺乳動物における異常新生血管に関連する疾患または障害を治療する方法に関する。この疾患または障害は,好ましくは加齢黄斑変性,虚血性網膜症,眼内血管新生,角膜血管新生,網膜血管新生,脈絡膜血管新生,糖尿病性黄斑浮腫,糖尿病性網膜虚血,糖尿病性網膜浮腫,糖尿病性網膜症,癌,関節リュウマチ,および子宮内膜症からなる群から選択される。
エフリンB2は血管形成および新生血管を阻害するのに用いることができる。特に,エフリンB2は加齢黄斑変性症,虚血性網膜症,眼内血管新生,角膜血管新生,網膜血管新生,脈絡膜血管新生,糖尿病性黄斑浮腫,糖尿病性網膜虚血,糖尿病性網膜浮腫,糖尿病性網膜症,癌,関節リュウマチ,および子宮内膜症のような血管形成または新生血管に関連する疾患あるいは障害の治療に有用である。
エフリンB2/EphB4系は,脈管形成および血管形成において大変重要な役割を果たす。そこで,我々はエフリンB2が血管形成を抑制するメカニズムについて検討した。エフリンB2が内皮細胞(EC)のDNA合成,およびVEGFとFGF2が誘導するp44/p42MAPキナーゼ活性化を抑制することがわかった。エフリンB2はまた,ECの脈管形成をも阻害した。マウスにおける角膜のマイクロポケットアッセイおよび角膜の新生血管の定量も行った。エフリンB2はbFGFが誘導した角膜血管新生を抑制した。これらの結果は,エフリンB2/EphB4,およびその抗血管形成シグナリング経路を標的にすることにより,血管形成依存的疾患を治療し得ることを示唆している。
本発明をさらに詳細に説明する前に,本明細書で用いられる用語は,他に指示がなければ,以下に定義されるとおりである。
定義
用語「エフリンB2」とは,異なる記載がない限り,(1)天然のエフリンB2またはその細胞外ドメイン,好ましくは天然のヒトエフリンB2と実質的な配列類似性を有し;そして(2)天然のエフリンB2または細胞外ドメインの生物学的活性を有する,ポリペプチドをいう。
用語「エフリンB2」とは,異なる記載がない限り,(1)天然のエフリンB2またはその細胞外ドメイン,好ましくは天然のヒトエフリンB2と実質的な配列類似性を有し;そして(2)天然のエフリンB2または細胞外ドメインの生物学的活性を有する,ポリペプチドをいう。
天然の分子と「実質的な配列類似性」を有するポリペプチドは,天然の分子とアミノ酸レベルで少なくとも約30%同一である。ポリペプチドは,好ましくは,天然の分子とアミノ酸レベルで少なくとも約40%,50%,60%,70%,80%,85%,90%,95%,もっとも好ましくは少なくとも約98%同一である。
天然の分子とのアナログまたは改変体の用語「パーセント同一性」または「%同一性」とは,2つの配列をアラインした場合に,アナログまたは改変体においても見られる天然分子におけるアミノ酸配列のパーセントをいう。パーセント同一性は,LALIGN,ClustalW,またはBLASTのような当該技術分野で確立された任意の方法または,アルゴリズムによって決定することができる。
ポリペプチドは,天然のエフリンB2の受容体と結合し得る場合,あるいはECのDNA合成,ECにおける細胞外シグナル制御キナーゼ(ERK(p44/p42MAPキナーゼ))リン酸化,ECの脈管形成,血管形成または新生血管を阻害し得る場合に,天然のエフリンB2の「生物学的活性」を有する。ECのDNA合成,ECにおけるERKリン酸化,ECの脈管形成,血管形成または新生血管を阻害する活性は,当該技術分野において公知の任意の方法によって決定することができ,特に,本明細書に記載の方法によって決定することができる。
天然のエフリンB2のような「天然の」分子は,人工的な介入なく天然に存在する分子である。しかし,天然のエフリンB2はまた,人工的な介入なく存在するエフリンB2の細胞外ドメインであってもよい。
「全長」エフリンB2は,細胞外および細胞内の両方のドメインを含むエフリンB2である。全長エフリンB2は,天然に存在しているものでもよく,あるいは天然のエフリンB2のアナログまたは改変体であってもよい。
「有効量」とは,所望の目的を達成するに十分な物質の量である。例えば,DNA合成を阻害するためのエフリンB2の有効量は,in vivoまたはin vitroの場合に応じて,DNA合成の量を減少させるに十分な量である。疾患または障害を治療するためのエフリンB2の有効量は,疾患または障害の徴候を低減または除去するか,または疾患または障害を予防または遅延させるに十分なエフリンB2の量である。所定の物質の有効量は,物質の性質,投与経路,物質を受容する動物のサイズおよび種,ならびに物質を与える目的などの因子で変動する。各場合の有効量は,当該技術分野で確立された方法に従って,当業者によって経験的に決定することができる。
疾患または障害の「治療」という用語は,疾患または障害の徴候の低減または完全な除去をいう。
上皮細胞におけるエフリンB2の効果
内皮細胞はVEGF,bFGFまたはPDGF−BBのような増殖因子に応答して増殖を誘導されることが知られている。この現象におけるエフリンB2の影響を決定するために,エフリンB2がVEGF,bFGFまたはPDGF−BBと結合する動脈または静脈に添加された(実施例1)。その結果,エフリンB2がVEGF,bFGFまたはPDGF−BBといったこれら全ての刺激によって誘導されたDNA合成を阻害したことであるのに対し,EphB4もエフリンB2とEphB4との組み合わせによるものも,VEGF,bFGFまたはPDGF−BBといったこれら全ての刺激によって誘導されたDNA合成を阻害しなかった。図1Aに示されるように,10ng/mLのVEGF,bFGF,またはPDGF−BBによって誘導されたDNA合成の増加量は,200μg/mLのエフリンB2によってそれぞれ40%,30%,および90%阻害された。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)においても,ほとんど同一の結果が得られた(図1B)。特に細胞死は観測されなかったので,エフリンB2によるDNA合成の阻害は,細胞死によって惹き起こされるのではないと考えられる。
内皮細胞はVEGF,bFGFまたはPDGF−BBのような増殖因子に応答して増殖を誘導されることが知られている。この現象におけるエフリンB2の影響を決定するために,エフリンB2がVEGF,bFGFまたはPDGF−BBと結合する動脈または静脈に添加された(実施例1)。その結果,エフリンB2がVEGF,bFGFまたはPDGF−BBといったこれら全ての刺激によって誘導されたDNA合成を阻害したことであるのに対し,EphB4もエフリンB2とEphB4との組み合わせによるものも,VEGF,bFGFまたはPDGF−BBといったこれら全ての刺激によって誘導されたDNA合成を阻害しなかった。図1Aに示されるように,10ng/mLのVEGF,bFGF,またはPDGF−BBによって誘導されたDNA合成の増加量は,200μg/mLのエフリンB2によってそれぞれ40%,30%,および90%阻害された。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)においても,ほとんど同一の結果が得られた(図1B)。特に細胞死は観測されなかったので,エフリンB2によるDNA合成の阻害は,細胞死によって惹き起こされるのではないと考えられる。
したがって,エフリンB2は,VEGF,bFGF,およびPDGFを含む種々の刺激によって誘導されるECのDNA合成を阻害することができる。DNA合成が静脈内皮細胞および動脈内皮細胞の両方で阻害されることは,驚くべきことである。なぜなら,エフリンB2の受容体(EphB4)は,静脈内皮細胞のマーカーであるが,動脈内皮細胞は,この受容体を有することが知られていないからである。
さらに誘導した脈管形成は,7日目には,コントロール群と比較してエフリンB2処理群で減少していた(図1C)。一方,VEGF誘導した脈管形成は,EphB4処理によっては影響を受けなかった。
増殖因子によって誘導された分裂促進反応を,エフリンB2が阻害するメカニズムを解明するために,VEGFまたはbFGFで刺激されたERK(p42/44)リン酸化におけるエフリンB2の効果を検討した(実施例2)。その結果は,エフリンB2は,動脈および静脈内皮細胞においてVEGFまたはbFGF誘導ERKリン酸化を抑制することを示している。しかし,エフリンB2は,VEGF受容体2の自己リン酸化を阻害しなかった(図2B)。このことは,エフリンB2は,VEGF機能を阻害するメカニズムとして,VEGFとVEGF受容体2との間のシグナル伝達を妨害しないことを示している。したがって,エフリンB2は,動脈内皮細胞においても,あるいは静脈内皮細胞においてもVEGFまたはbFGF誘導ERKリン酸化を阻害するのに用いることができるといえる。
塩基性FGF(bFGF)は,強力な血管形成因子であることが知られている。エフリンB2は,bFGFによって誘導されたEC細胞の増殖を阻害することができるので,エフリンB2が同様に血管形成を抑制することができるかどうかを検討した(実施例3)。実際,エフリンB2を投与することで,bFGFによって誘導された血管形成は著しくブロックされたが,EphB4投与によっては効果を示さなかった。
したがって,エフリンB2は,血管形成および新生血管を阻害するのに用いることができるといえる。特に,これらの結果は,エフリンB2が加齢黄斑変性,虚血性網膜症,眼内血管新生,角膜血管新生,網膜血管新生,脈絡膜血管新生,糖尿病性黄斑浮腫,糖尿病性網膜虚血,糖尿病性網膜浮腫,糖尿病性網膜症,癌,関節リュウマチ,および子宮内膜症のような血管新生または新生血管に関連する疾患や障害の治療に有用であることを示している。
本発明に有用なエフリンB2は,必要とされる活性を有する,アナログおよび改変体を含む任意のエフリンB2であってよい。前記エフリンB2は,全長エフリンB2であってもよく,細胞内ドメインを含まず,細胞外ドメインを含むものであってよい。
エフリンB2の投与
エフリンB2を含有する薬学的組成物の調製方法は,当該技術分野で周知である。
エフリンB2を含有する薬学的組成物の調製方法は,当該技術分野で周知である。
エフリンB2は,投与経路に適合した薬学的に許容可能なキャリアと混合して,例えば,経口的に,あるいは筋肉内または静脈内注射によって全身投与することができる。生理学的に許容可能な種々のキャリアをエフリンB2を投与するために使用することができる。そして,その処方は当業者に公知であり,例えば,Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版), A. Gennaro編, Mack Publishing Company, Easton, PA,およびPollockらに記載されている。
エフリンB2は,好ましくは,非経口的に投与される(例えば,筋肉内,腹腔内,静脈内,眼内,硝子体内,または皮下注射によって,あるいは移植によって)。非経口投与のための処方物は,滅菌の水性または非水性溶液,懸濁液,あるいは乳化液を含むものであってもよい。例えば,水,緩衝化水,生理食塩液などの種々の水性キャリアが使用され得る。他の適切な溶媒の例としては,ポリプロピレングリコール,ポリエチレングリコール,植物油,ゼラチン,硬化ナファレン,およびオレイン酸エチルのような注射用有機エステルがあげられる。このような処方物はまた,保存剤,湿潤剤,緩衝化剤,乳化剤,および/または分散剤のような補助物質を含んでもよい。生体適合性,生分解性のラクチドポリマー,ラクチド/グリコシドコポリマー,またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーが,活性成分の放出を制御するために使用されてもよい。
あるいは,エフリンB2は,経口摂取によって投与することができる。経口使用を意図した組成物は,当該薬学的組成物の製造における技術分野で公知の,任意の方法に従って,固体または液体の形態に調製することができる。この組成物は,より嗜好性のよい調製物を提供するために,必要に応じて,甘味剤,香味剤,着色剤,着香剤,および保存剤を含んでいてもよい。
経口投与用の固体投与の形態としては,カプセル剤,錠剤,丸剤,粉剤,および顆粒剤があげられる。一般的に,これらの組成物は,非毒性の薬学的に許容可能な賦形剤と混合された活性成分を含む。
これらは,例えば,炭酸カルシウム,炭酸ナトリウム,ラクトース,スクロース,グルコース,マンニトール,セルロース,デンプン,リン酸カルシウム,リン酸ナトリウム,カオリンなどのような不活性希釈剤を含んでもよい。また,結合剤,緩衝化剤,および/または滑沢剤(例えば,ステアリン酸マグネシウム)を使用してもよい。
錠剤および丸剤は,さらに,腸溶コーティングとともに調製することができる。
経口投与用の液体投与の形態としては,薬学的に許容される乳化液,溶液,懸濁液,シロップ,および軟ゼラチンカプセルがあげられる。
これらの形態は,水または油培地のような当該技術分野で通常使用される不活性希釈剤を含み,そしてまた,湿潤剤,乳化剤,懸濁化剤などのアジュバントを含むことができる。
エフリンB2はまた,例えば,貼付剤によって,あるいは眼への直接適用によって,あるいはイオン浸透法によって,局所的に投与できる。
エフリンB2は,例えば,米国特許第5,672,659号および第5,595,760号に記載されるような徐放性組成物に含める形態で提供され得る。即時または徐放性組成物の使用は,治療される障害の性質に依存する。障害が急性または超急性障害からなる場合,即時放出形態での治療が,徐放性組成物よりも好適である。あるいは,予防または長期治療については,徐放性組成物が適切であり得る。
エフリンB2はまた,インプラントを用いて輸送されてもよい。このようなインプラントは,生分解性および/または生体適合性インプラントであってもよく,あるいは非生分解性インプラントであってもよい。インプラントは,活性成分に対して透過性または非透過性であり得る。眼用インプラントは,前眼房または後眼房のような眼房に挿入されてもよいし,あるいは強膜,脈絡膜横断腔,または硝子体の外面の無血管領域に移植されてもよい。好ましい実施態様として,眼用インプラントは,強膜上のような無血管領域に配置されてもよく,そのため,所望の治療部位,例えば,眼内腔および眼の黄斑への薬物の経強膜拡散を可能にする。さらに,経強膜拡散の部位は,好ましくは黄斑の近くである。
エフリンB2の輸送のためのインプラントの例として,米国特許第3,416,530;3,828,777;4,014,335;4,300,557;4,327,725;4,853,224;4,946,450;4,997,652;5,147,647;5,164,188;5,178,635;5,300,114;5,322,691;5,403,901;5,443,505;5,466,466;5,476,511;5,516,522;5,632,984;5,679,666;5,710,165;5,725,493;5,743,274;5,766,242;5,766,619;5,770,592;5,773,019;5,824,072;5,824,073;5,830,173;5,836,935;5,869,079;5,902,598;5,904,144;5,916,584;6,001,386;6,074,661;6,110,485;6,126,687;6,146,366;6,251,090;および6,299,895号;ならびにWO01/30323およびWO01/28474(これらのすべては,参考資料として本明細書に援用される。)に記載のデバイスがあげられるが,これらに限定されない。
投与量
単回投与剤形を製造するためにキャリア材料と合わせる活性成分の量は,処置する個体および特定の投与態様によって変動する。一般的には,エフリンB2は,疾患の徴候を低減または除去するに十分な量で投与されるべきである。
単回投与剤形を製造するためにキャリア材料と合わせる活性成分の量は,処置する個体および特定の投与態様によって変動する。一般的には,エフリンB2は,疾患の徴候を低減または除去するに十分な量で投与されるべきである。
1回の投与あたりに約1μg/kg体重〜100mg/kg体重のオーダーでの投与レベルは,一般的に新生血管障害の治療に有用である。眼に直接投与する場合は,好ましい投与量範囲は,1眼あたり約0.3mg〜約3mgである。投与量は,単回投与として投与されてもよく,あるいは多数回投与に分割してもよい。一般的に,所望の投与量は,長期間,通常は少なくとも数週間に設定された間隔で投与されるべきであるが,数ヶ月以上のより長い投与期間も必要とされ得る。
当業者は,正確な個々の投与量は,例えば,以下の種々の因子に依存して調節され得ることを認識する:投与時間;投与経路;処方物の性質;排泄速度;治療される特定の障害;障害の重篤度;ならびに患者の年齢,体重,健康状態,および性別などである。必要とされる投与量の広範囲にわたる変動は,様々な投与経路の異なる有効性を考慮して予測されるべきである。例えば,経口投与は,一般的に,静脈内または硝子体内注射による投与よりも高い投与量レベルを必要とすることが予測される。これらの投与量レベルの変動は,当該技術分野で周知の最適化に対する標準的経験則を用いて調節され得る。正確な治療的に有効な投与量レベルおよびパターンは,好ましくは,上記の因子を考慮して主治医によって決定される。
予め存在している新生血管疾患を治療することに加えて,エフリンB2は,これらの障害の発症を予防または遅延させるために予防的に投与することができる。予防的な適用において,エフリンB2は,特定の血管新生障害になる疑いのある,あるいはその危険性のある対象に投与される。また,投与される正確な量は,対象の健康状態,体重などのような様々な因子に依存する。
以下の実施例において,以下の略語は以下の意味を有する。定義されていない略語は,一般的に許容されている意味を有する:
℃=摂氏度
hr=時間
min=分
sec=秒
μM=マイクロモル濃度
mM=ミリモル濃度
M=モル濃度
mL=ミリリットル
μL=マイクロリットル
mg=ミリグラム
μg=マイクログラム
DMEM=ダルベッコの改変イーグル培地
ITS=インスリン−トランスフェリン−セレニウム
FBS=ウシ胎児血清
MEM=改変イーグル培地
PBS=リン酸緩衝生理食塩水
VEGF=血管内皮細胞増殖因子
FGF=繊維芽細胞増殖因子
PDGF=血小板由来増殖因子
SDS=ドデシル硫酸ナトリウム
PAGE=ポリアクリルアミドゲル電気泳動
EC=内皮細胞
HUVEC=ヒト臍帯静脈内皮細胞
HAoEC=ヒト大動脈内皮細胞
℃=摂氏度
hr=時間
min=分
sec=秒
μM=マイクロモル濃度
mM=ミリモル濃度
M=モル濃度
mL=ミリリットル
μL=マイクロリットル
mg=ミリグラム
μg=マイクログラム
DMEM=ダルベッコの改変イーグル培地
ITS=インスリン−トランスフェリン−セレニウム
FBS=ウシ胎児血清
MEM=改変イーグル培地
PBS=リン酸緩衝生理食塩水
VEGF=血管内皮細胞増殖因子
FGF=繊維芽細胞増殖因子
PDGF=血小板由来増殖因子
SDS=ドデシル硫酸ナトリウム
PAGE=ポリアクリルアミドゲル電気泳動
EC=内皮細胞
HUVEC=ヒト臍帯静脈内皮細胞
HAoEC=ヒト大動脈内皮細胞
試料および方法
試薬
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)をClonetics(サンディエゴ,カリフォルニア,米国)から購入し,10%ウシ胎児血清(FBS)を補充したClonetics EGM培地中で維持した。1型コラーゲンでコーティングされたディッシュはイワキ(日本)から購入した。[α−32P]dCTPはAmershamから購入した。KDR(SC−504)およびFlgに対するウサギのポリクローナル抗体はSanta Cruz Biotechnology(サンタクルズ,カリフォルニア,米国)から購入した。
試薬
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)をClonetics(サンディエゴ,カリフォルニア,米国)から購入し,10%ウシ胎児血清(FBS)を補充したClonetics EGM培地中で維持した。1型コラーゲンでコーティングされたディッシュはイワキ(日本)から購入した。[α−32P]dCTPはAmershamから購入した。KDR(SC−504)およびFlgに対するウサギのポリクローナル抗体はSanta Cruz Biotechnology(サンタクルズ,カリフォルニア,米国)から購入した。
細胞培養
HUVECを,1型コラーゲンでコーティングされたディッシュ(Iwaki, Japan)上の内皮細胞増殖培地(Clonetics Corp., San Diego, California, USA)中で,5%CO2,95%空気中37℃にて培養し,培地を2〜3日ごとに交換することにより維持した。
HUVECを,1型コラーゲンでコーティングされたディッシュ(Iwaki, Japan)上の内皮細胞増殖培地(Clonetics Corp., San Diego, California, USA)中で,5%CO2,95%空気中37℃にて培養し,培地を2〜3日ごとに交換することにより維持した。
ノーザンブロット解析
全RNA試料を,グアニジウムチオシアン酸塩−フェノール−クロロホルム抽出法を用いて,細胞から分離し,ノーザンブロット解析を行った。RNAを2.2Mのホルムアルデヒドを含んだ1%アガロースゲル上で分画し,ナイロン膜(NenTM ライフサイエンスProduct,Inc)上へ転移させた。そして,0.2J/cm2でUV架橋結合(クロスリンク)させた。そして,Amersham マルチプライムラベリングキットおよび[α−32P]dCTPを使用してKDRまたは36B4 cDNAの放射性プローブを発生させた。このナイロン膜をハイブリゾル(Amersham,米国)中,42℃で16時間ハイブリダイズし,32PでラベルしたDNAプローブを作製した。そして,0.1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を加えた2X SSPE(1X SSPEは,0.15Mの塩化ナトリウムと0.015Mのナトリウムクエン酸塩を足したものである)中,室温で一度洗浄し,その後0.1%のSDSを加えた0.5X SSPEで二回洗浄した。メッセンジャーRNAレベルをFujix BAS 2500バイオイメージアナライザー(富士写真フィルム)を用いてデンシトメトリー(濃度測定)によって定量した。
全RNA試料を,グアニジウムチオシアン酸塩−フェノール−クロロホルム抽出法を用いて,細胞から分離し,ノーザンブロット解析を行った。RNAを2.2Mのホルムアルデヒドを含んだ1%アガロースゲル上で分画し,ナイロン膜(NenTM ライフサイエンスProduct,Inc)上へ転移させた。そして,0.2J/cm2でUV架橋結合(クロスリンク)させた。そして,Amersham マルチプライムラベリングキットおよび[α−32P]dCTPを使用してKDRまたは36B4 cDNAの放射性プローブを発生させた。このナイロン膜をハイブリゾル(Amersham,米国)中,42℃で16時間ハイブリダイズし,32PでラベルしたDNAプローブを作製した。そして,0.1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を加えた2X SSPE(1X SSPEは,0.15Mの塩化ナトリウムと0.015Mのナトリウムクエン酸塩を足したものである)中,室温で一度洗浄し,その後0.1%のSDSを加えた0.5X SSPEで二回洗浄した。メッセンジャーRNAレベルをFujix BAS 2500バイオイメージアナライザー(富士写真フィルム)を用いてデンシトメトリー(濃度測定)によって定量した。
[3H]チミジン取り込み―HAoECおよびHUBECのDNA合成
ヒト大動脈内皮細胞(HAoEC)およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUBEC)は上述のとおり維持した。4〜5継代の細胞を実験に用いた。ECを,10%FCSを含むDMEM(Nacalai tesque, Japan)中,示した量のエフリンB2またはEphB4のいずれかの存在または不在下で,10ng/mLのVEGF,bFGF,またはPDGF−BBで18時間処理した。次いで,細胞を,20μCi/mLにて[メチル−3H]チミジン(Amersham)に6時間曝露した。この細胞を,トリプシン処理し,自動細胞採取機を用いてガラス繊維フィルター上に回収し,そして[メチル−3H]チミジン取り込みを,直接βカウンターで測定した。
ヒト大動脈内皮細胞(HAoEC)およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUBEC)は上述のとおり維持した。4〜5継代の細胞を実験に用いた。ECを,10%FCSを含むDMEM(Nacalai tesque, Japan)中,示した量のエフリンB2またはEphB4のいずれかの存在または不在下で,10ng/mLのVEGF,bFGF,またはPDGF−BBで18時間処理した。次いで,細胞を,20μCi/mLにて[メチル−3H]チミジン(Amersham)に6時間曝露した。この細胞を,トリプシン処理し,自動細胞採取機を用いてガラス繊維フィルター上に回収し,そして[メチル−3H]チミジン取り込みを,直接βカウンターで測定した。
内皮脈管形成アッセイ
コラーゲンゲルを,氷冷ゼラチン溶液(10×M199,H2O,0.53M NaHCO3,200mM L−グルタミン,I型コラーゲン,0.1M NaOH,100:27.2:50:10:750:62.5(容量比))と,1×基本培地(以下を参照)中の3×106細胞/mLの濃度の細胞とを,4容量のゼラチン溶液:1容量の細胞懸濁液の比で一緒に混合することによって形成した。37℃で30分間ゲル化した後,ゲルを,40ng/mLのbFGF,40ng/mLのVEGF,および80nMのPMAを追加した,1%FBS,1×ITS,2mM L−グルタミン,50μg/mLアスコルビン酸,26.5mM NaHCO3,100ユニット/mLペニシリン,および110ユニット/mLストレプトマイシンを補充したM199からなる1×基本培地で覆った。全薬品は,ゲル化の直後に1×基本培地に添加した。脈管形成を定量するために,高倍率(20×)視野あたりの脈管の数を,基本培地に添加した48時間後に測定した。脈管を,100μmの長さ(長軸)を超える1以上の内皮細胞で構成される延長された構造物として定義した。100μmの光学的区切りによって分離された5つの独立視野を,各ウェルについて評価し,そして20×視野あたりの管の平均数を測定した。細胞傷害性を,Boehringer Mannheimから入手した細胞増殖キットIIを用いて評価した。
コラーゲンゲルを,氷冷ゼラチン溶液(10×M199,H2O,0.53M NaHCO3,200mM L−グルタミン,I型コラーゲン,0.1M NaOH,100:27.2:50:10:750:62.5(容量比))と,1×基本培地(以下を参照)中の3×106細胞/mLの濃度の細胞とを,4容量のゼラチン溶液:1容量の細胞懸濁液の比で一緒に混合することによって形成した。37℃で30分間ゲル化した後,ゲルを,40ng/mLのbFGF,40ng/mLのVEGF,および80nMのPMAを追加した,1%FBS,1×ITS,2mM L−グルタミン,50μg/mLアスコルビン酸,26.5mM NaHCO3,100ユニット/mLペニシリン,および110ユニット/mLストレプトマイシンを補充したM199からなる1×基本培地で覆った。全薬品は,ゲル化の直後に1×基本培地に添加した。脈管形成を定量するために,高倍率(20×)視野あたりの脈管の数を,基本培地に添加した48時間後に測定した。脈管を,100μmの長さ(長軸)を超える1以上の内皮細胞で構成される延長された構造物として定義した。100μmの光学的区切りによって分離された5つの独立視野を,各ウェルについて評価し,そして20×視野あたりの管の平均数を測定した。細胞傷害性を,Boehringer Mannheimから入手した細胞増殖キットIIを用いて評価した。
タンパク質試料の調製およびウェスタンブロッティング
全細胞ライセート,サイトゾル抽出物,または核抽出物を,内皮細胞から単離した。ウエスタンブロッティングを,免疫沈降を用いておよび用いずに行った。タンパク質試料を,ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって分離し,次いでニトロセルロース膜に電気泳動で転移した。スキムミルクでブロッキングした後,ブロットを,ホスホチロシンまたはKDR(sc−504)に対する抗体(Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, California, USA)から購入)とともに4℃にて一晩インキュベートした(1:500)。洗浄後,ニトロセルロース膜を,西洋ワサビペルオキシダーゼ標識2次抗体(Bio−Rad, Richmond, California, USA)(1:3000)とともに室温にて1時間インキュベートした。可視化を,製造業者の指示書に従ってAmersham増強化学発光(ECL)検出システムを用いて行った。
全細胞ライセート,サイトゾル抽出物,または核抽出物を,内皮細胞から単離した。ウエスタンブロッティングを,免疫沈降を用いておよび用いずに行った。タンパク質試料を,ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって分離し,次いでニトロセルロース膜に電気泳動で転移した。スキムミルクでブロッキングした後,ブロットを,ホスホチロシンまたはKDR(sc−504)に対する抗体(Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, California, USA)から購入)とともに4℃にて一晩インキュベートした(1:500)。洗浄後,ニトロセルロース膜を,西洋ワサビペルオキシダーゼ標識2次抗体(Bio−Rad, Richmond, California, USA)(1:3000)とともに室温にて1時間インキュベートした。可視化を,製造業者の指示書に従ってAmersham増強化学発光(ECL)検出システムを用いて行った。
マウスにおける角膜マイクロポケットアッセイ
マウスにおける角膜マイクロポケットアッセイおよび角膜血管新生の定量を,いくらかの改変を加えて行った。簡単に言えば,90ngのヒトbFGFを含む0.3μLのHydronペレット(IFN Sciences, New Brunswick, New Jersey, USA)を調製し,雄BALB/cマウスの角膜に移植した。sエフリンB2またはsEphB4(100ng/ペレット)を,bFGF/Hydron溶液に直接添加した。ペレットを,角膜縁から1.0mmに配置した。移植後,オフロキサシン/点眼剤を各眼に適用した。6日後,動物を屠殺し,そして角膜血管を写真撮影した。マウス角膜における血管新生の定量分析を,ソフトウエアパッケージNIH Imageを用いて行った。その結果,ペレットの移植の6日後,新しい血管の発芽を検査した。bFGFは,マウス角膜において血管形成を劇的に誘導した。
および角膜血管新生の定量を,いくらかの改変を加えて行った。簡単に言えば,90ngのヒトbFGFを含む0.3μLのHydronペレット(IFN Sciences, New Brunswick, New Jersey, USA)を調製し,雄BALB/cマウスの角膜に移植した。エフリンB2またはEphB4(100ng/ペレット)を,bFGF/Hydron溶液に直接添加した。ペレットを,角膜縁から1.0mmに配置した。移植後,オフロキサシン/点眼剤を各眼に適用した。6日後,動物を屠殺し,そして角膜血管を写真撮影した。マウス角膜における血管新生の定量分析を,ソフトウエアパッケージNIH Imageを用いて行った。
マウスにおける角膜マイクロポケットアッセイおよび角膜血管新生の定量を,いくらかの改変を加えて行った。簡単に言えば,90ngのヒトbFGFを含む0.3μLのHydronペレット(IFN Sciences, New Brunswick, New Jersey, USA)を調製し,雄BALB/cマウスの角膜に移植した。sエフリンB2またはsEphB4(100ng/ペレット)を,bFGF/Hydron溶液に直接添加した。ペレットを,角膜縁から1.0mmに配置した。移植後,オフロキサシン/点眼剤を各眼に適用した。6日後,動物を屠殺し,そして角膜血管を写真撮影した。マウス角膜における血管新生の定量分析を,ソフトウエアパッケージNIH Imageを用いて行った。その結果,ペレットの移植の6日後,新しい血管の発芽を検査した。bFGFは,マウス角膜において血管形成を劇的に誘導した。
および角膜血管新生の定量を,いくらかの改変を加えて行った。簡単に言えば,90ngのヒトbFGFを含む0.3μLのHydronペレット(IFN Sciences, New Brunswick, New Jersey, USA)を調製し,雄BALB/cマウスの角膜に移植した。エフリンB2またはEphB4(100ng/ペレット)を,bFGF/Hydron溶液に直接添加した。ペレットを,角膜縁から1.0mmに配置した。移植後,オフロキサシン/点眼剤を各眼に適用した。6日後,動物を屠殺し,そして角膜血管を写真撮影した。マウス角膜における血管新生の定量分析を,ソフトウエアパッケージNIH Imageを用いて行った。
統計解析
実験データはmeans±SDで表される。統計的な有意差は,標準的に分布した母集団においてスチューデント t検定(有意差検定)
を用い,p<0.05のときとした。
実験データはmeans±SDで表される。統計的な有意差は,標準的に分布した母集団においてスチューデント t検定(有意差検定)
を用い,p<0.05のときとした。
エフリンB2による,増殖因子によって刺激されたECの増殖および遊走の阻害
ヒト大動脈内皮細胞(HAoECs)をVEGF,bFGF,またはPDGF−BB(各10ng/mL)で処理することにより,未処理のコントロール群と比較して,DNA合成が3〜10倍に増加した。エフリンB2は,これらのすべての刺激物で刺激されたDNAの合成を阻害したが,EphB4およびエフリンB2+EphB4は,いずれも阻害しなかった。図1Aに示すように,10ng/mLのVEGF,bFGF,またはPDGF−BBによって誘導されたDNA合成の増加は,200μg/mLのエフリンB2によって,それぞれ40%,30%,および90%阻害された。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)を用いてもほとんど同じ結果を得た(図1B)。このインキュベーション期間中に,顕著な死細胞は観察されなかった(データは示さず)。VEGF誘導した脈管形成は7日目には,コントロール群と比較して,エフリンB2処理群で減少した(図1C)。一方,VEGF誘導した脈管形成は,EphB4処理によっては影響を受けなかった。
ヒト大動脈内皮細胞(HAoECs)をVEGF,bFGF,またはPDGF−BB(各10ng/mL)で処理することにより,未処理のコントロール群と比較して,DNA合成が3〜10倍に増加した。エフリンB2は,これらのすべての刺激物で刺激されたDNAの合成を阻害したが,EphB4およびエフリンB2+EphB4は,いずれも阻害しなかった。図1Aに示すように,10ng/mLのVEGF,bFGF,またはPDGF−BBによって誘導されたDNA合成の増加は,200μg/mLのエフリンB2によって,それぞれ40%,30%,および90%阻害された。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)を用いてもほとんど同じ結果を得た(図1B)。このインキュベーション期間中に,顕著な死細胞は観察されなかった(データは示さず)。VEGF誘導した脈管形成は7日目には,コントロール群と比較して,エフリンB2処理群で減少した(図1C)。一方,VEGF誘導した脈管形成は,EphB4処理によっては影響を受けなかった。
したがって,エフリンB2は,VEGF,bFGF,およびPDGFを含む種々の刺激によって誘導されるECのDNA合成を阻害し得ることが分かった。エフリンB2の正確なメカニズムは明らかではないが,DNA合成の減少は,顕著な死細胞が観察されなかったことから,細胞死によって引き起こされたのではないと考えられる。DNA合成が静脈内皮細胞および動脈内皮細胞の両方で阻害されることは,驚くべきことである。なぜなら,エフリンB2の受容体(EphB4)は,静脈内皮細胞のマーカーであるが,動脈内皮細胞は,この受容体を有することが知られていないからである。
DNA合成における効果と一致したことは,エフリンB2は,VEGFによって誘導されるEC脈管形成をも阻害し得るといえる。
増殖因子によって誘導されたp42/44ERKリン酸化および受容体自己リン酸化に対するエフリンB2の効果
ヒト大動脈内皮細胞(HAoECs)に対するVEGFまたはbFGF誘導した分裂促進応答をエフリンB2が阻害するメカニズムについて検討するために,VEGFまたはbFGFで刺激したERK(p42/44)リン酸化に対するエフリンB2の効果をウエスタン分析によって実験した。ERKリン酸化は,10ng/mLのVEGFまたはbFGFの刺激によって増加した。エフリンB2はVEGFおよびbFGFの両方が誘導したERKリン酸化を阻害した。例えば,200μg/mLのエフリンB2は,VEGF誘導したERKリン酸化を70%阻害した(図2A)。次に,VEGFで刺激したヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)におけるVEGF受容体2(KDR)自己リン酸化について検討した。VEGF受容体2(KDR)自己リン酸化は10ng/mLのVEGFによって14倍増加した。エフリンB2は,VEGF受容体2(KDR)自己リン酸化を阻害しなかった(図2B)。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)を用いてもほとんど同じ結果を得た(データは示さず)。
したがって,これらの結果は,エフリンB2が,動脈または静脈の内皮細胞においてVEGFまたはbFGFで誘導されたERKリン酸化を阻害することを示している。この効果は,おそらく,少なくとも部分的に,エフリンB2がVEGFまたはbFGFで誘導したこれらの細胞の増殖を阻害するという活性を説明できる。しかし,エフリンB2は,VEGF受容体2の自己リン酸化を阻害しない。したがって,エフリンB2は,VEGF機能を阻害するメカニズムとして,VEGFとVEGF受容体2との間のシグナル伝達を妨害しないと考えられる。
マウス角膜におけるエフリンB2の同時投与によってbFGF誘導した血管形成の阻害
塩基性FGF(bFGF)は,強力な血管形成因子であることが知られている。エフリンB2は,bFGFによって誘導されたEC細胞の増殖を阻害し得るので,エフリンB2が同様に血管形成を抑制し得るかどうかを検討した。
塩基性FGF(bFGF)は,強力な血管形成因子であることが知られている。エフリンB2は,bFGFによって誘導されたEC細胞の増殖を阻害し得るので,エフリンB2が同様に血管形成を抑制し得るかどうかを検討した。
ヒトbFGFが浸み込んだHydronペレットをマウスの角膜に移植した。ペレットの移植後6日目に,新しい血管の発芽を検査した。bFGFは,マウス角膜において血管形成を劇的に誘導した。bFGFは,マウス角膜において血管形成を劇的に誘導した。さらに,bFGF誘導した角膜新生血管に対するエフリンB2またはEphB4の効果を検討した。
エフリンB2の投与により,bFGFによって誘導された血管形成は顕著にブロックされたが,EphB4の投与では何の効果も示さなかった。定量分析によっても,bFGF誘導した角膜新生血管が,エフリンB2によって完全に阻害されたことが示された(図3)。
エフリンB2の投与により,bFGFによって誘導された血管形成は顕著にブロックされたが,EphB4の投与では何の効果も示さなかった。定量分析によっても,bFGF誘導した角膜新生血管が,エフリンB2によって完全に阻害されたことが示された(図3)。
したがって,エフリンB2は血管形成および新生血管を阻害するのに用いることができる。特に,これらの結果は,エフリンB2が加齢黄斑変性症,虚血性網膜症,眼内血管新生,角膜血管新生,網膜血管新生,脈絡膜血管新生,糖尿病性黄斑浮腫,糖尿病性網膜虚血,糖尿病性網膜浮腫,糖尿病性網膜症,癌,関節リュウマチ,および子宮内膜症のような血管形成または新生血管に関連する疾患あるいは障害の治療に有用であることを示している。
本発明の多くの実施例が述べられたが,発明の趣旨および範囲から逸脱しない範囲で,種々の改変をすることができる。
エフリンB2は血管形成および新生血管を阻害するのに用いることができる。特に,エフリンB2は加齢黄斑変性症,虚血性網膜症,眼内血管新生,角膜血管新生,網膜血管新生,脈絡膜血管新生,糖尿病性黄斑浮腫,糖尿病性網膜虚血,糖尿病性網膜浮腫,糖尿病性網膜症,癌,関節リュウマチ,および子宮内膜症のような血管形成または新生血管に関連する疾患あるいは障害の治療に有用である。
Claims (22)
- 有効量のエフリンB2を含む,動脈内皮細胞におけるDNA合成を阻害するための薬学的組成物。
- 前記DNA合成がVEGF,bFGFまたはPDGFによって誘導される,請求項1に記載の薬学的組成物。
- 有効量のエフリンB2を含む,動脈内皮細胞におけるp44/p42MAPキナーゼ活性化を阻害するための薬学的組成物。
- 前記p44/p42MAPキナーゼ活性化が,血管内皮細胞増殖因子,塩基性繊維芽細胞増殖因子,または血小板由来増殖因子によって誘導される,請求項3に記載の薬学的組成物。
- 有効量のエフリンB2を含む,動脈内皮細胞からの脈管形成を阻害するための薬学的組成物。
- 前記脈管形成が,VEGF,bFGFまたはPDGFによって誘導される,請求項5に記載の薬学的組成物。
- 前記エフリンB2が,天然のエフリンB2の細胞外ドメインを含むが,細胞質ドメインを含まない,請求項1又は請求項2に記載の薬学的組成物。
- 前記エフリンB2が,天然のエフリンB2の細胞外ドメインを含むが,細胞質ドメインを含まない,請求項3又は請求項4に記載の薬学的組成物。
- 前記エフリンB2が,天然のエフリンB2の細胞外ドメインを含むが,細胞質ドメインを含まない,請求項5又は請求項6に記載の薬学的組成物。
- 有効量のエフリンB2を含む,静脈内皮細胞におけるDNA合成を阻害するための薬学的組成物。
- 前記DNA合成がVEGF,bFGFまたはPDGFによって誘導される,請求項10に記載の薬学的組成物。
- 有効量のエフリンB2を含む,静脈内皮細胞におけるp44/p42MAPキナーゼ活性化を阻害するための薬学的組成物。
- 前記p44/p42MAPキナーゼ活性化が,VEGF,bFGFまたはPDGFによって誘導される,請求項12に記載の薬学的組成物。
- 有効量のエフリンB2を含む,静脈内皮細胞からの脈管形成を阻害するための薬学的組成物。
- 前記脈管形成が,VEGF,bFGFまたはPDGFによって誘導される,請求項14に記載の薬学的組成物。
- 前記エフリンB2が,天然のエフリンB2の細胞外ドメインを含むが,細胞質ドメインを含まない,請求項10又は請求項11に記載の薬学的組成物。
- 前記エフリンB2が,天然のエフリンB2の細胞外ドメインを含むが,細胞質ドメインを含まない,請求項12又は請求項13に記載の薬学的組成物。
- 前記エフリンB2が,天然のエフリンB2の細胞外ドメインを含むが,細胞質ドメインを含まない,請求項14又は請求項15に記載の薬学的組成物。
- 有効量のエフリンB2を含む,哺乳類の眼内の血管新生抑制するための薬学的組成物。
- 前記エフリンB2が,天然のエフリンB2の細胞外ドメインを含むが,細胞質ドメインを含まない,請求項19に記載の薬学的組成物。
- 有効量のエフリンB2を含む,哺乳類の脈絡膜血管新生抑制するための薬学的組成物。
- 前記エフリンB2が,天然のエフリンB2の細胞外ドメインを含むが,細胞質ドメインを含まない,請求項21に記載の薬学的組成物。
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