CN1055094C - 牛脑神经肽ff的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明为牛脑神经肽FF的制备方法，其制备工艺步骤顺序为将新鲜健康牛脑经蒸馏水两次清洗，在匀浆器中匀浆，在离心机中离心，收集上清液，以滤膜过滤，滤出液在分子筛上柱层析，以部分收集器分部收集，PAGE电泳检测，过滤除菌，冷冻干燥为粉末，牛脑神经肽FF，此方法工艺简便，得率高，工艺过程不破坏牛脑神经肽FF的生物活性，溶剂只用蒸馏水和生理盐水，无污染，价格低廉。

Description

牛脑神经肽FF的制备方法

本发明涉及一种牛脑神经肽FF的制备方法，脑神经肽FF是动物和人脑中天然存在的内源性吗啡和抗吗啡类物质，属于戒毒物质技术领域。如何有效地戒毒，已成为人们普遍关注的社会问题，药物戒毒是最有效的戒毒手段，目前国内广泛采用的方法有：(1)成瘾药品递减疗法，如采用美沙酮等药品，(2)暂时解除意识疗法，如采用安定等睡眠药物，(3)综合疗法，如用美沙酮、丁丙诺非，纳洛酮，纳曲酮分阶段治疗等药物，这些方法虽有一定效果，但又都不很理想，最近美、日等国一些科学家已从一些动物和人脑中发现了一种天然内源性吗啡和抗吗啡类物质，研究发现，这类物质在脱毒、戒瘾、康复、防复吸阶段发挥作用，如果进一步开发利用这类物质，将会从根本上达到戒毒的目的。

1975年美国科学家Hunghes等人在动物脑中发现了内源性类吗啡神经肽以来，已有许多天然内源性类吗啡和抗吗啡神经肽被发现。1979年，日本科学家Rakagi等人从牛脑中发现了一种天然内源性类吗啡肽，并证明这种牛脑肽具有吗啡类物质所具有的止痛作用。1985年，美国科学家Yang等人从牛脑中首次发现了两种抗吗啡类神经肽。它们具有抑制和减少吗啡诱导的各种生物学效应的作用。1991年，美国科学家Rothmam等人报告牛脑神经肽FF(一种八肽。其氨基酸排列顺序为：Phe-Leu-Phe-Gle-Pro-Gln-Arg-Phe-NH₂)具有下调吗啡Mu受体结合位的作用。1996年，美国科学家Goodman等人也报告说当同时给小鼠服用牛脑神经肽FF和吗啡时，牛脑神经肽FF也同样具有下调吗啡Mu受体结合位的功能。这些杰出的研究工作都表明存在于人及动物脑中的与吗啡作用相关的神经肽的重要作用。

对于牛脑神经肽FF的制备方法，除了1985年Yang等人报告的对牛脑神经肽FF的制备方法之外，对国内外各种文献的检索都未发现新的制备方法的报导。Yang等人报告的制备方法包括，图2所示的33个步骤，可分为两个阶段：

(1)初步处理和提取阶段

(2)纯化制备阶段

Yang等人报告的上述制备牛脑神经肽FF的方法和工艺存在的问题是：

1.Yang等人的制备方法和工艺非常复杂。从牛脑中制备出牛脑神经肽FF，需要至少33个以上的处理制备过程。

2.所用溶液有酸(三氟己酸)，有机溶剂(氰酸甲烷)和带毒性物质(

基乙醇)，这不仅为进一步除去这些溶液造成因难，而且影响牛脑神经肽FF的质量。

3.Yang等人的方法中用90℃水浴将牛脑煮10分钟处理不利于保持牛脑神经肽FF的生物活性。

4.Yang等人的方法中设备条件要求高，价格昂贵，如Hplc需要数十万元的高效液相色谱仪，尤其是FMRF-NH₂抗血清CNBr活化的Sephrarose 4B亲合柱造价极其昂贵。这样制备的牛脑神经肽FF的价格也相应地非常昂贵。

5.Yang等人报告的方法中，制备过程复杂，制备得率低，难以深入开发，应用。

本发明的目的就是针对上述问题，旨在导找一种新的简便廉价和得率高的制备方法以制备牛脑神经肽FF。

以下结合图1对本发明的制备方法作以下具体说明。

选用新鲜无疾病牛脑1公斤，在0-25℃下放入一大玻璃烧杯中。加入500-2000毫升蒸馏水轻轻摇动。小心除去蒸馏水。再加入500-20000毫升蒸馏水冲洗一次。然后把牛脑放入匀浆器中并加入500-2000毫升蒸馏水，在匀浆器中转速1000-2000转/分，温度0-25℃，匀浆5分钟，取出匀浆后的牛脑放入0℃-10℃的冰箱中冷冻过夜，第二天，取出牛脑浆放入4-25℃水浴中慢慢溶化，在溶化后的牛脑浆中加入500-2000毫升蒸馏水，振荡均匀后在1000-3000转/分和0-25℃条件下离心10分钟。收集上清液，在沉淀物中再加入500-200O毫升生理盐水。振荡均匀后再离心10分钟(离心条件同上)。取上清液并将两次提取的上清液混合。然后将提取的上清液用0.20μ-0,50μ的滤膜过滤。过滤温度0-25℃，滤出液放入0℃～-10℃的冰箱中保存或直接在分子筛(Sephadex G10-G200)上柱层析。柱层析温度0-25℃。洗脱液为蒸馏水。部分收集器以每分钟1毫升的的流速分部收集。收集液保存在0～-10℃冰箱中。取少量收集液经PAGE电泳检测，收集与标准牛脑神经肽FF电泳图谱相似的部分，再做分子筛柱层析(Sephedex G10-G200)。柱层析温度0-25℃，洗脱液为蒸馏水。取少量样品做PAGE电泳。与标准牛脑神经肽FF有同样电泳图谱的即可确定为牛脑神经肽FF。收集的牛脑神经肽FF溶液在无菌操作条件下和0-25℃范围内用除菌滤膜或除菌漏斗抽滤除菌。然后按5∶2比例加入1％的右旋糖苷为复兴剂。在无菌操作和0-25℃条件下，将牛神经肽FF溶液分装于无菌安瓿瓶中(每支1毫升)。之后冷冻干燥，并在无菌操作和0-25℃条件下对安瓿瓶火焰封口，从而制成试验用粉状牛脑神经肽FF。

附图说明：

图1为本发明的工艺流程图，有14个步骤；

图2为对比技术的工艺流程图，有33个步骤；

从本发明的具体说明可以看出本发明突出的优点是：

1、制备牛脑神经肽FF的方法简便。Yang等人报告的制备主法需要33步繁杂的工艺过程，而本发明仅要14步即可完成对牛脑神经肽FF的制备。

2、Yang等人报告的制备方法中对牛脑要在90℃水浴中煮10分钟。本发明无需高温处理牛脑，而在0-25℃的较低温度下制备牛脑神经肽FF，有利于保持牛脑神经肽FF的生物活性。

3、Yang等人报告的制备方法中使用了有机溶剂(氰酸甲烷)，酸碱溶液(三氟乙酸)和有毒物质(

基乙醇)。本发明全过程中不接触任何有机溶剂，酸碱溶液和有毒物质，能制备出高质量的优质安全的牛脑神经肽FF。

4、Yang等人报告的制备方法中使用了许多昂贵的仪器和试剂，本发明使用的是廉价设备和简便的制备条件。因此制备的牛脑神经肽FF价格低廉，可以大量的制备和应用。

5、由于本发明制备方法简单，制备过程损失少，因此牛脑神经肽FF产率高。每公斤牛脑可制备5克的高产量牛脑神经肽FF。而Yang等人的得率很低。

实施例：

根据本发明结合附图的具体说明中的制备方法对牛脑神经肽FF进行了多次实际制备。重复制备试验均获得同样的结果，实施例如下：

取1公斤新鲜无疾病的健康牛脑放入一大烧杯中。加入1000毫升蒸馏水，轻轻振荡后，除去蒸馏水。再加入1000毫升蒸馏水。轻轻振荡后再除去蒸馏水。将牛脑转入匀浆器中并加入1000毫升蒸馏水，在20℃±2℃条件下1400转/分，匀浆5分钟，之后将牛脑浆放入-5℃的冰箱中冷冻过夜。第二天，取出冷冻的牛脑浆放在20℃水盆中使其慢慢溶化，在溶化后的牛脑浆中加入1000毫升蒸馏水。振荡均匀后在离心机中2000转/分，离心10分钟(温度20℃)。收集上清液，在沉淀物中加入1000毫升生理盐水溶液，振荡均匀后再在离心机中2000转/分离心10分钟，再收集上清液。将两次离心获得的上清液含在一起，然后用0.45μ孔径的滤膜过滤(上述操作均在20℃±2℃的条件下进行)，取过滤后的滤出液400毫升立即在1000×100毫米的分子筛柱上层析(Sephedex×G100，层析温度为20℃，洗脱液为蒸馏水)，部分收集器以每分钟1毫升的流速分部收集。取少量收集液做PAGE电泳。收集与标准牛脑神经肽FF相同电泳图谱的部分混合后再做分子筛柱层析(Sephedex G50，柱层析温度20℃，洗脱液为蒸馏水)。再取少量样品做PAGE电泳。收集与标准牛脑神经肽FF相同电脉图谱的部分(即为制备牛脑神经肽FF)，在无菌操作和温度20℃条件下用除菌漏斗过滤除菌。然后按5∶2比例加入无菌复兴剂溶液(1％的右旋糖苷)，在无菌操作和20℃条件下将制备的牛脑神经肽FF溶液(内有复兴剂)分装于无菌安瓿瓶中(每支1毫升)。之后冷冻干燥，并在无菌操作和20℃条件下火焰密封安瓿瓶。从而制成试验用粉状牛脑神经肽FF。按上述制备方法，每公斤牛脑可制备100支试验用粉状牛脑神经肽FF(每支50毫克)，这样每公斤牛脑可制备5克粉状牛脑神经肽FF)。

由下述实际应用本发明制备的粉状牛脑神经肽FF经PAGE电泳和生物学试验进一步证明了本发明的制备方法和工艺是完全成功的和有效的。

1、PAGE电泳进一步鉴别

取1支制备的粉状牛脑神经肽FF，加入0.2毫升蒸馏水溶解，加入0.2毫升的25％的庶糖液和10微升4％的溴酚兰溶液，制备15％和18％浓度的两种凝胶做PAGE电泳。加样5微升。100v电脉3小时，然后用氨基黑10B染色液染色，之后用5％的冰己酸脱色，试验结果表明：在15％和18％两种凝胶上电泳，制备的牛脑神经肽FF和标准牛脑神经肽FF都为单一的电泳带，在15％凝胶上它们的泳动距离都为1.0厘米，在18％凝胶上它们的泳动距离都为0.8厘米。

2、阻止吗啡成瘾作用

取18-20克体重的昆明种小鼠40只，分组每组10只共分4组，A组为生理盐水组，B组为单独给于吗啡组，C组为同时给于吗啡和制备的牛脑神经肽FF组，D组为单独制备的牛脑经肽FF组。A组每天每只中小鼠腹腔给生理盐水0.3毫升一次，B组动物每天腹腔给于100毫克/公斤的盐酸吗啡。C组动物每天腹腔除给于100毫克/公斤的盐酸吗啡外，同时给于40毫克/10克的牛脑神经肽FF，D组动物每天腹腔给于40毫克/10克的牛脑神经肽FF，每天一次给药，给于7天后，从第八天开始每天两次给药连续四天，然后在第12天上午给药6小时后，给钠酷酮(5毫克/每只小鼠)做跳台试验，结果表明，单独生理盐水动物(A组)不成瘾。单独吗啡组动物(B)组100％的动物成瘾，吗啡和制备的牛脑神经肽FF合用组(C组)动物仅30％成瘾，70％的不成瘾。单独制备的牛脑神经肽FF组(D组)动物不成瘾，三次重复试验结果完相相同。这说明制备的牛脑神经肽FF具有抗吗啡成瘾作用。这一结果与1991年Rothman和1996年Gooman报告的牛脑神经肽FF具有抑制和减少吗啡诱导的各种生物学作用的结果相吻合。

3、抑制已成瘾动物的发作作用。

取18-22克的昆明种小鼠40只，分组每组10只，共分4组，所有小鼠按体重每次腹腔注射盐酸吗啡100毫升/公斤，一天两次。在第九天上午注射吗啡6小时后做跳台试验。A组为成瘾探测组，每只小鼠注射5毫克/公斤的钠络酮催瘾，结果100％的动物都成瘾，B组为生理盐水治疗组。在给纳络酮前1小时给于0.5毫升/每只的生理盐水，然后再给于5毫克/公斤的纳络酮催瘾，结果30％的成瘾小鼠不发作。C组为制备的牛脑神经肽FF组，在给纳络酮前1小时给于40毫克/10克的牛脑神经肽FF，然后再给于5毫克/公斤的纳络酮催瘾，结果70％的成瘾小鼠不发作。D组为不治疗组，在给纳络酮前不做任何治疗，在给于5毫克/kg的纳络酮催瘾后100％的小鼠都发作。试验重复三次，结果完全相同。

Claims (4)

1、一种牛脑神经肽FF的制备方法，其特征在于制备方法依次包括以下步骤：取新鲜健康牛脑为原料经蒸馏水两次清洗，在匀浆器中匀浆，在离心机中离心，收集上清液，以滤膜过滤，滤出液在分子筛上柱层析，以部分收集器分部收集，PAGE电泳检测，过滤除菌，冷冻干燥为粉状牛脑神经肽FF；

以上工艺流程具体步骤为：首先用0-25℃温度用蒸馏水对新鲜健康牛脑进行轻轻振荡清洗，将清洗过的牛脑经过匀浆器在转速为1000-2000转/分，温度为0-25℃条件下匀浆，匀浆后的牛脑浆经过500-2000毫升蒸馏水和500-2000毫升生理盐水两次分布提取，在1000-3000转/分的离心机0-25℃温度条件下离心获得上清液，用孔径为020μ至0.50μ的滤膜对提取的上清液进行过滤，用分子筛进行两次柱层析，柱层析温度0-25℃，洗脱液为蒸馏水。

2、根据权利要求1所述的牛脑神经肽FF的制备方法，其特征在于收集的牛脑神经肽FF溶液采用除菌滤膜或除菌漏斗抽滤除菌。

3、根据权利要求1所述的牛脑神经肽FF的制备方法，其特征在于除菌后的滤液按5∶2的比例加入1％的右旋糖苷为复兴剂，并分装于无菌安瓿中冷冻干燥为粉末状，并在0-25℃条件下，无菌操作对安瓿瓶火焰封口。

4、根据权利要求1所述的牛脑神经肽FF的制备方法，其特征在于在全部制备过程中仅以蒸馏水、生理盐水为溶剂。

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