CN1470528A - 治疗糖尿病合并周围神经病变并发症的蛇毒酶神经生长因子 - Google Patents
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Abstract
治疗糖尿病合并周围神经病变并发症的蛇毒酶神经生长因子，涉及一种治疗糖尿病合并周围神经病变并发症的药物，尤其是指利用生物活性物质提取配制而得的药物。从产率、比活性等技术参数优选眼镜蛇毒作为分离纯化神经生长因子的基料，经三步层析，提纯单一组份的神经生长因子。利用生物活性物质改善神经组织中的糖代谢，促进神经元增大，使轴突从近端向远端生长，使细胞器数量增多，从而改善神经细胞功能。改善微循环，蛇毒酶神经生长因子含有精氨酸脂酶、水解蛋白酶及磷酸二脂酶等，能抑制血小板聚集，改善血液粘度，具有溶栓、扩血管等功能。可广泛应用。
Description
(一)技术领域：
本发明涉及一种治疗糖尿病合并周围神经病变并发症的药物，尤其是指利用生物活性物质提取配制而得的药物。
(二)背景技术：
糖尿病是一种由于体内糖代谢紊乱导致血糖升高为主临床特征为全身性内分泌代谢性疾病。糖尿病发展到一定程度，尤其是合并有慢性血管、神经病变时，或者长期使用胰岛素治疗者常常伴有瘀血症表现，诸如面有瘀斑、面部晦暗、肢体疼痛、麻木，痛处固定不移，心前区疼痛，舌边有瘀斑或瘀点等等。西医治疗糖尿病人多用磺脲类，双胍类及胰岛素药物治疗，它们降血糖作用虽然明显，但仅仅能够达到调节代谢紊乱的程度，而且西药副作用大，长期服用会损害肝、肾，影响胃肠功能，导致发生多种糖尿病合并症。中医治疗糖尿病历史悠久、滋阴清热、生津止渴一直是治疗糖尿病所遵循的基本法则。糖尿病患者通过中药治疗以后，虽然在血糖和尿糖方面控制比较理想，但主观症状仍未消除。致使糖尿病周围神经病变的患病率约为60％。
(三)发明内容：
本发明的目的是提供一种利用生物活性物质改善神经组织中的糖代谢，促进神经元增大，改善微循环的治疗糖尿病合并周围神经病变并发症的蛇毒酶神经生长因子。
本发明的技术方案是：
制备工艺：
所有操作均在10℃以下完成。
①CM-SephadexC50层析
取眼镜蛇毒10g，溶于0.01M乙酸钠缓冲液100ml中，PH5.8，溶解后，离心10000转，10分钟，取上清，对上述缓冲液5000ml透析，换3次缓冲液，然后样品上样于用0.01M乙酸盐缓冲液平衡好的层析柱5.5×100cm中，用0-0.7MNaCL线性梯度洗脱，收集具有神经生长因子活性的蛋白峰，浓缩冻干。
②CM-SpharoseFF层析
将上述浓缩的样品，溶于20ml0.01M乙酸钠缓冲液中，PH5.8，上样于用0.01M乙酸钠缓冲液PH5.8平衡好的层析柱2.6×50cm中，用0-1MNaCL线性梯度洗脱，收集具有神经生长因子活性的蛋白峰，浓缩冻干。
③SephdexG75层析
将上述CM-SpharoseFF层析下的样品，溶解在10ml0.01M乙酸钠缓冲液，PH5.8，内含0.15MNaCL中，离心10000转，取上清，上样于用0.01M乙酸钠缓冲液，PH5.8，内含0.15MNaCL平衡好后的SephdexG75柱中，收集含有NGF活性的对称峰，经电泳及高效液相色谱证明为单一峰后，透析除盐，冻干即得半成品，约3mg。
④制剂处方：
原料：神经生长因子半成品，按质量标准的测定半成品的活性，每支规格1000单位，按135％-145％投料。加入1％右旋糖苷(分子量1万)，及每支药中含有1.5mg人血白蛋白，过滤分装，冻干制得。
本发明的有益效果是：糖尿病周围神经病变的患病率约60％，其发病机制考虑可能与下列因素有关。①代谢障碍，近年通过动物实验和临床研究发现糖尿病时，周围神经中Myo-肌醇(myo-inositol)减少和山梨醇积存，Na+/k+三磷酸腺苷酶的活性降低，从而影响兴奋细胞的传导性。由于胰岛素不足，葡萄糖代谢不能正常进行，而不需胰岛素参与的山梨醇旁路代谢活跃，这种代谢主要在神经组织中进行，因山梨醇难以透过神经细胞膜，使其在神经组织中堆积，神经细胞渗透压升高、水分增多，导致细胞水肿、缺氧、坏死、神经纤维脱髓鞘、轴索变性以及神经传导速度减慢。②血管闭合，糖尿病病人营养神经的血管闭合率较非糖尿病病人为高，伴有神经病变者更高。血管的闭合，可致神经组织缺血坏死，其原因可能与糖尿病病人血脂增高，血小板聚集性增强以及血管基底膜增厚有关。③神经生长因子功能异常，神经生长因子NGF是维持神经组织正常生长和作用不可缺少的物质，文献报道实验性糖尿病小鼠其NGF减少。糖尿病病人可能有NGF减少和功能异常。因NGF与胰岛素有相似的氨基酸序列，两者有相同的抗原簇。糖尿病病人NGF减少和功能异常可能是引起神经病变的原因之一。采用蛇毒酶神经生长因子治疗糖尿病并发周围神经病变取得明显的疗效，其原因(1)蛇毒酶神经生长因子含有NGF，NGF是从蛇毒中分离出来，是促进神经生长的生物活性分子。它能促进神经元的增大，使轴突从近端向远端生长，使细胞器数量增多，从而改善神经细胞功能。(2)调节糖代谢，本申请含有NGF，它与胰岛素有类似的结构和作用部位，可弥补神经细胞中NGF的不足，促进神经细胞利用葡萄糖及合成蛋白与脂质，改善代谢状况，使神经组织中的糖代谢进入正常途径，减少山梨醇积聚，纠正神经细胞的水肿和缺氧。(3)改善微循环，蛇毒酶神经生长因子含有精氨酸脂酶、水解蛋白酶及磷酸二脂酶等，能抑制血小板聚集，改善血液粘度，具有溶栓、扩血管等功能。实验研究证实本申请制剂能降低TxB2浓度，抑制血小板聚集，扩张局部小血管，改善微循环。由于蛇毒酶神经生长因子的独特作用，为防治糖尿病合并的神经病变开辟了一条新途径。另外经神经生长因子对糖尿病大鼠周围神经病变作用的实验研究，得出结论为：早期、长期应用外源性神经生长因子，可增加糖尿病大鼠坐骨神经髓鞘面积，减少神经纤维髓鞘脱失，轴突萎缩，可以改善糖尿病大鼠脊髓前角运动神经元，运动终板和骨髓肌纤维的形态和功能。
(四)具体实施方式：
以下结合实施例及病例对本发明进行详细说明。
实施例制备工艺为：
所有操作均在10℃以下完成。
①CM-SephadexC50层析
取眼镜蛇毒10g，溶于0.01M乙酸钠缓冲液100ml中，PH5.8，溶解后，离心10000转，10分钟，取上清，对上述缓冲液5000ml透析，换3次缓冲液，然后样品上样子用0.01M乙酸盐缓冲液平衡好的层析柱5.5×100cm中，用0-0.7MNaCL线性梯度洗脱，收集具有神经生长因子活性的蛋白峰，浓缩冻干。
③CM-SpharoseFF层析
将上述浓缩的样品，溶于20ml0.01M乙酸钠缓冲液中，PH5.8，上样于用0.01M乙酸钠缓冲液PH5.8平衡好的层析柱2.6×50cm中，用0-1MNaCL线性梯度洗脱，收集具有神经生长因子活性的蛋白峰，浓缩冻干。
③SephdexG75层析
将上述CM-SpharoseFF层析下的样品，溶解在10ml0.01M乙酸钠缓冲液，PH5.8，内含0.15MNaCL中，离心10000转，取上清，上样于用0.01M乙酸钠缓冲液，PH5.8，内含0.15MNaCL平衡好后的SephdexG75柱中，收集含有NGF活性的对称峰，经电泳及高效液相色谱证明为单一峰后，透析除盐，冻干即得半成品，约3mg。
④制剂处方：
原料：神经生长因子半成品，按质量标准的测定半成品的活性，每支规格1000单位，按140％投料。加入1％右旋糖苷(分子量1万)，及每支药中含有1.5mg人血白蛋白，过滤分装，冻干制得。
临床病例112例均为住院治疗者，男58例，女54例。年龄40～65岁，平均53.8岁。糖尿病史1年～14年，平均7.5年。神经病变病程6个月～5年，平均3.4年。全组除2例为胰岛素依赖型糖尿病外，其余均为非胰岛素依赖型糖尿病。为观察感觉神经症状，特设对照组40例，男女各20例。年龄42～66岁，平均54.2岁。神经病变病程8个月～6年，平均4.2年。此组均为非胰岛素依赖型糖尿病。
糖尿病的治疗方法是两组均在饮食治疗基础上加用降血糖药物，治疗组2例用胰岛素，其余均用中药消渴丸或世良降糖散治疗。
神经病变的治疗，治疗组用蛇毒酶神经生长因子，每日1u，溶于生理盐水250ml中静滴，3周为1疗程，必要时用第2疗程。对照组用vit B1 30mg/d，vit B12 150mg/d，口服。
观察项目：(1)、空腹血糖水平。(2)、感觉神经症状(肢体疼痛及麻木)的变化。(3)、治疗组中40例观察治疗前后右尺神经和右腓神经的传导速度。(4)、疗效判定，显效：症状完全消失，肌电图示运动神经传导速度明显增快。有效：症状减轻，运动神经传导速度增快。无效：病情无变化。
结果：感觉神经症状，治疗组用蛇毒酶神经生长因子后，第4～10天症状开始改善，一般上肢恢复先于下肢，肢体近端先于远端，两组对比，具有明显的差别，见表1。
表1 两组感觉神经症状有效率比较(％)
疼 痛 麻 木
n 显 有 无 有效 n 显 有 无 有效
效 效 效 率 效 效 效 率治疗 112 42 68 2 98.2 112 26 86 0 100组对照 40 0 5 35 12.5 40 0 6 34 15组
运动神经传导速度，40例采用1500 DISA型肌电图机，观察尺神经和腓神经传导速度。治疗组经治疗后神经传导速度明显增快。见表2。
表2 治疗前后运动神经传导速度比较(m/s)
尺神经X±S 腓神经X±S治疗前 53.04±7.62 44.06±8.50治疗后 56.66±8.46 46.36±7.64P值 ＜0.05 ＜0.05
血糖变化，经治疗后两组血糖平均有不同程度的下降，治疗组治疗前后分别为：17.2±6.4mmol/L和9.6±6.6mmol/L(p＜0.05)；对照组治疗前后为：18.2±8.4mmol/L和10.7±7.6mmol/L(p＜0.05)。促进神经元增大，调节糖代谢，改善微循环。
用法和用量及给药途径：
①每次1000-2000单位，肌肉注射，每日一次，20天为一个疗程。
②四肢损伤手术中，可在术局部喷洒给药或损伤神经处局部注射，每次1-2支。
Claims (1)
1、治疗糖尿病合并周围神经病变并发症的蛇毒酶神经生长因子，其特征是：制备工艺为：
所有操作均在10℃以下完成，
①CM-SephadexC50层析
取眼镜蛇毒10g，溶于0.01M乙酸钠缓冲液100ml中，PH5.8，溶解后，离心10000转，10分钟，取上清，对上述缓冲液5000ml透析，换3次缓冲液，然后样品上样于用0.01M乙酸盐缓冲液平衡好的层析柱5.5×100cm中，用0-0.7MNaCL线性梯度洗脱，收集具有神经生长因子活性的蛋白峰，浓缩冻干，
②CM-SpharoseFF层析
将上述浓缩的样品，溶于20ml0.01M乙酸钠缓冲液中，PH5.8，上样于用0.01M乙酸钠缓冲液PH5.8平衡好的层析柱2.6×.50cm中，用0-1MNaCL线性梯度洗脱，收集具有神经生长因子活性的蛋白峰，浓缩冻干，
③SephdexG75层析
将上述CM-SpharoseFF层析下的样品，溶解在10ml 0.01M乙酸钠缓冲液，PH5.8，内含0.15MNaCL中，离心10000转，取上清，上样于用0.01M乙酸钠缓冲液，PH5.8，内含0.15MNaCL平衡好后的SephdexG75柱中，收集含有NGF活性的对称峰，经电泳及高效液相色谱证明为单一峰后，透析除盐，冻干即得半成品，
④制剂处方：
原料：神经生长因子半成品，按质量标准的测定半成品的活性，每支规格1000单位，按135％-145％投料，加入1％右旋糖苷，及每支药中含有1.5mg人血白蛋白，过滤分装，冻干制得。
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