CN1096053A - 低分子量肝细胞生长素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种低分子量肝细胞生长素的制备
方法。它以乳猪肝脏为原料，采用匀浆、加热、离心沉
淀、降解、纯化、冻干等步骤制备。其特征在于用胰蛋
白酶降解，用超滤进行纯化。这种物质分子量低，活
性高。经动物及临床研究和试验，本产品具有对抗肿
瘤坏死因子和内毒素休克的作用，用于治疗重型肝炎
时，可退黄，促进肝功能恢复，帮助肝昏迷病人清醒，
提高重肝患者的存活率。
Description
本发明涉及一种生长激素的制备方法，特别是一种低分子量肝细胞生长素的制备工艺。
早在本世纪三十年代，英国学者Higgins等人发现了肝脏再生现象，推测肝脏本身可能能产生一种使肝脏再生的特异物质，在特定条件下（胚胎发育期或肝损伤时），表现活性，促进正常肝细胞增殖。但是，一直未能成功地找到该物质。进入七十年代后，各国学者相继从不同种属动物的肝脏、血小板和血浆中分离得到能刺激肝细胞生长的活性物质-肝细胞生长因子。八十年代初期，我国有人开始在临床中用从人胎肝细胞悬液中制取的肝细胞生长因子治疗重型肝炎，并取得较为显著的疗效。可是人胎肝来源有限，而且储存不便，使其应用受到很大限制，为了推广其应用，使众多肝病患者受益，各国学者致力于研究该类物质的制备方法。目前已知肝细胞生长因子大多为耐热的蛋白质，主要存在于各种幼稚动物肝脏中，只具器官特异性，不具有种属特异性，因而人们选择了活性接近于人胎肝的乳猪肝为原料，寻找一条周期短、成本低、简便实用的制备肝细胞生长因子的途径。CN1041949A公开的“采用负压透析法制备肝细胞生长素的方法”，它采用乳猪肝为原料，经匀浆，离心沉淀后，取上清透析浓缩，冻干后即得肝细胞生长素。此法因无特异性分离纯化手段，产量虽多但纯度较差：采用负压透析，不仅费时，而且截留分子的准确性较差，虽经分子量为12000透析膜透析，得到的很可能仍是分子量较大的肝细胞生长素，注入人体后，易引起严重的免疫排异反应。CN1068036A公开的“一种乳猪肝脏刺激生长因子的制备工艺”同样采用乳猪肝脏为原料，所不同的是匀浆后通过95℃加热处理除去杂蛋白，过滤，取出滤液，加入乙醇沉淀和离子交换进一步纯化，所得制品纯度虽高，但因分子量较大，临床使用产生免疫排异反应的机率仍较高，并且实验也证明乙醇沉淀并不能有效地提高产品活性，相反会损失大部分活性。
本发明的目的是提供一种以乳猪肝脏为原料制备出的活性高、分子量低的肝细胞生长素的方法。
本发明是这样实现的：取经检疫的1-2月龄乳猪肝脏，绞碎后，加入生理盐水匀浆，加热至80℃-100℃保持15分钟，以除杂蛋白，然后在27000g离心力作用下离心15-30分钟进行分离，取出上清液弃沉淀，测出该上清液即95℃上清液中所含蛋白质的量。根据测出值再加入一定量的生理盐水使蛋白质含量为4-8mg/ml，然后按胰蛋白酶与上清液的蛋白含量比例为1∶50（重量比）加入胰蛋白酶，滴加1mol/L NaOH至PH7.5，在反应温度为30℃-40℃的情况下作用0.5-7小时，这样得到的酶解液为小分子活性多肽，可以减低免疫原性，阻止过敏反应的发生。将得到的酶解液先经G3（10um）过滤除去大颗粒，再用截留分子量10KD的Millipore膜超滤，收集滤出液，在滤出液中加入附形剂和保护剂一起冻干即得低分子量肝细胞生长素。这种制备方法的特征是采用胰蛋白酶降解大分子蛋白为小分子活性肽，最后采用超滤纯化小分子活性多肽。
采用上述制备工艺，其方法简便实用、周期短、成本低，且经胰蛋白酶降解制得的肝细胞生长素是分子量小于1万的活性多肽，纯度高，比活平均可达96.5u/10ug蛋白。下表1将列出生产工艺各阶段肝细胞刺激活性状况。
表1生产工艺各阶段肝细胞刺激活性状况
| 工序 | 比活（u/10ug蛋白） | 纯化倍数 |
| 肝匀浆 | 1.2 | 1 |
| 95℃上清液 | 32.8 | 27 |
| 胰蛋白酶降解 | 32.7 | 27 |
| 超滤处理 | 98.6 | 82 |
| 冻干成品 | 96.5 | 80 |
这种低分子量肝细胞生长素在鸭乙型肝炎肝坏死模型及大白鼠内毒素休克模型上证实具有明显保护作用：
1、低分子量肝细胞生长素具有对抗肿瘤坏死因子（TNF）、保护肝脏的作用。
取20只重庆麻鸭按实验要求随机分为5组，设1对照组，4个实验组（表2）
表2实验鸭分组情况
检测各组鸭血清TNF水平及肝坏死程度，结果见表3。
表3各组鸭血清TNF水平及肝坏死程度
注：“-”：正常;“+”小叶性坏死，少于肝小叶的1/3;
“++”亚大块坏死，坏死范围1/3-1/2;
“+++”广泛大块肝坏死;
“±”局灶性坏死，肝细胞气球样变。
从表3中可看出：在鸭乙型肝炎坏死模型中，加用内毒素和鸭乙肝病毒后，TNF细胞毒性指数增高，肝坏死程度严重，加用TNF单抗和肝细胞生长素后，TNF活性水平和肝坏死程度都明显减低，因此证明肝生长素同TNF单抗相似，具有对抗肿瘤坏死因子，保护肝脏的作用。
2、低分子量肝细胞生长素具有对抗内毒素休克的作用。
取19只大白鼠按实验要求随机分为3组，设两对照组，一个实验组。
麻醉大白鼠，待颈总动脉导管插入颈总动脉后，测定其初始血压，静脉注射内毒素的同时腹腔注射肝细胞生长素（4mg/kg），对照组用生理盐水、正常成人肝组织提取物腹腔注射，1小时后检测血压与TNF细胞毒性指数变化情况，结果如下：
表4HSS保护内毒素休克动物模型的血压及TNF细胞毒性指数的变化情况
| 实验分组 | 大白鼠只数 | 血压降低值 | TNF细胞毒性增高值 |
| E+NS | 5 | 47.80±8.23 | 25.42±10.60 |
| E+AHSS | 7 | 44.00±20.66 | 20.01±9.58 |
| E+HSS | 7 | 22.54±8.24 | 3.76±14.49 |
注：E：内毒素;NS：生理盐水;HSS：肝细胞生长素
AHSS：正常成人肝组织提取物
血压单位：mmHg
从表4可看出，加用内毒素后，血压降低和TNF细胞毒性增高明显，注入肝生长素，血压降低幅度和TNF细胞毒性增高水平都显著减低，因此HSS具有对抗内毒素休克的作用，成人肝生长素则无此效应。
这种低分子量肝细胞生长素在临床上试用观察，疗效显著，目前已作为治疗重型肝炎的首选药物。
该发明人在国家“七.五”、“八.五”攻关期间采用低分子量肝细胞生长素治疗重型肝炎，死亡率由攻关前85%降至36%。它包括25例亚急性重型肝炎、16例慢性重型肝炎，共41例，治疗方法为每天静脉或肌注8万单位（约8mg）低分子量肝细胞生长素;疗程平均为30天;临床诊断参照1984年（南宁）全国病毒性肝炎学术会议制订的标准;疗效采用血清总胆红素下降程度、肝昏迷治愈率、存活率等指标进行考核，结果如下：
表5治愈者总胆红素下降速度（单位：mg）
从上述3个表的结果可看出，采用肝细胞生长素治疗重型肝炎，具有较为明显的疗效，可退黄，促进肝功能恢复，帮助肝昏迷病人清醒，提高重肝患者的存活率，其中亚重肝患者的疗效更佳。
下面将结合实施例对本发明作进一步详述：
1.95℃上清液的制备
取经检疫的1-2月龄乳猪肝脏1187g，绞碎后加生理盐水2500ml匀浆，加热匀浆至95℃，保持15分钟，然后以离心力27000g进行离心分离20分钟，弃沉淀，取其上清液即95℃上清液，测定蛋白含量为10.8mg/ml。
2.胰蛋白酶降解
根据测出的蛋白含量值，加生理盐水至2700ml，使95℃上清液蛋白含量为6mg/ml，然后加入胰蛋白酶324mg，滴加1Mol/L NaOH至PH7.5，加热至35℃，作用2小时。
3.超滤纯化
将上述酶解液先经G3（10um）过滤，再用截留分子量10KD的Millipore膜超滤。
4.冻干处理
在滤出液中加入甘露醇80g和人体白蛋白300mg一起冻干，冻干条件10℃，24小时，即得低分子量肝细胞生长素5克。
上述制品经检测：蛋白含量2.5mg/ml和肝细胞刺激活性为6000cpm/10ug蛋白，澄明度、无菌试验、PH值、热原试验均合格。
Claims (5)
1、一种低分子量肝细胞生长素的制备方法，包括取经检疫的1-2月龄乳猪肝脏，绞碎后，用生理盐水匀浆、加热、离心沉淀、冻干的工艺，其特征在于：离心沉淀后，取出上清液即95℃上清液，用稀释剂稀释，再加入胰蛋白酶进行反应，反应后得到的酶解液还需过滤，超滤后再冻干。
2、如权利要求1所述的低分子量肝细胞生长素的制备方法，其特征在于所用稀释剂是生理盐水，将上清液稀释至4-8mg蛋白质/ml。
3、如权利要求1或2所述的低分子量肝细胞生长素的制备方法，其特征在于按胰蛋白酶与95℃上清液的蛋白含量比为1∶50（重量比）加入胰蛋白酶反应，反应条件是滴加1mol/L NaOH至PH7.5加热至30℃-40℃，保持0.5-7小时。
4、如权利要求3所述的低分子量肝细胞生长素的制备方法，其特征在于反应后得到的酶解液经G3（10um）过滤，再用截留分子量10KD的Millipoere膜超滤。
5、如权利要求1所述的低分子量肝细胞生长素的制备方法，其特征在于：超滤后得到的滤液中加入附形剂和保护剂一起冻干，冻干条件为10℃，24小时。
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| CN102652559A (zh) * | 2011-03-04 | 2012-09-05 | 赵蕊 | 一种具有解酒护肝、养胃补肾、生津止渴功能的保健食品及其制备方法 |
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