CN110639007A - 一种口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶及其在制备增强免疫力的药物中的应用 - Google Patents

一种口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶及其在制备增强免疫力的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白(rhLF)水凝胶及其在制备增强免疫力的药物中的应用，该水凝胶以重组人乳铁蛋白转基因家蚕品系的蚕茧为原料，使用尿素溶液提取丝胶蛋白，透析过程中通过氢键的诱导自组装成水凝胶，制得的水凝胶呈现的持续释放rhLF特性，能提高小鼠的免疫力且无毒，因此作为增强机体免疫力的药物。

Description

一种口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶及其在制备增强免 疫力的药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶，还涉及水凝胶在制备增强免疫力的药物中的应用。
背景技术
免疫系统是脊椎动物在体内平衡受到严重干扰时的一种高度复杂的防御机制，主要由病原体、损伤、外部污染物和感染引起。免疫反应由先天免疫系统和适应性免疫系统激活和介导。在抵抗疾病方面，免疫反应的调节起着重要的作用，早在一百多年前免疫系统控制肿瘤细胞的能力就被提出，并且在过去的十多年中得到证实，药物对免疫调节和免疫刺激的研究非常重要，且得到了广大研究者的重视。癌症是一种极其复杂的疾病，尽管世界各地的研究者对癌症的治疗研究乐此不疲，但仍阻止不了其发生，根据统计，2018年新增癌症病例1700万例，癌症相关死亡950万例，环磷酰胺是临床上重要的化疗药物之一，其治疗效果在一定程度上归因于其刺激抗肿瘤免疫反应的能力，但是在抑制肿瘤生长的同时，环磷酰胺可转化为4-羟基环磷酰胺，与DNA结合，诱导免疫细胞凋亡。已有研究表明，高剂量和长时间使用环磷酰胺可对人体健康和实验动物产生明显的毒副作用。为了降低环磷酰胺产生的毒副作用，更好地发挥环磷酰胺的抗肿瘤作用，研究人员进行了多方面的研究，例如利用环磷酰胺联合辅助药物降低环磷酰胺的使用剂量；在使用高剂量环磷酰胺的同时补充CD4阳性T细胞进行特异性肿瘤免疫，从而抑制肿瘤的生长；或者寻找药物如有天然植物提取物，增强机体自身免疫力，重塑由环磷酰胺引起的免疫器官萎缩，增强小鼠血清免疫蛋白产生。总的来说，免疫系统是人赖以生存的根本之一，癌症病人在治疗过程中化疗药物发挥极其重要的作用，然而化疗药物损害免疫系统的副作用不可忽视，缓解高剂量环磷酰胺带来的毒副作用一直是研究人员致力的研究热点。
乳铁蛋白是一种多功能的天然免疫糖蛋白，研究者已经揭示了其在免疫、抗菌、抗肿瘤、抗氧化，刺激细胞增长等方面的生物学活性。乳铁蛋白在人初乳中含量高达7mg/mL，新生儿在取食乳汁的时候摄入的乳铁蛋白对于其宿主防御中起着关键的作用，主要通过调节新生儿抗感染的先天和适应性免疫反应，在乳铁蛋白作用于免疫细胞研究中发现，乳铁蛋白可经过受体被转运到细胞内，细胞信号通路例如PI3K/Akt和MAPK/ERK被激活，从而激活细胞周期进程，促进细胞增殖和下游细胞反应。乳铁蛋白受体在小肠部位高量表达，这预示着小肠是调节乳铁蛋白多功能的重要场所。因此，食用的乳铁蛋白在穿过消化系统过程中保持蛋白结构完整不被降解是乳铁蛋白受体发挥作用的必要条件。然而，目前几乎所有的蛋白质治疗都是通过静脉注射、皮下注射或肌肉注射进行的，不可否认注射是一种可靠的给药途径，但是这对于患者来说是痛苦的，尤其是在公共场合给药，给药的便捷性降低和给药技术难度等缺陷均这无疑降低患者给药的积极性。由于胃肠道消化的复杂性及消化过程中其他因子(例如pH，酶，离子强度)的存在，药物往往容易被降解，口服蛋白药物的疗效及发展因此受到限制。药物传递系统的研发使口服蛋白药物成为了可能。在过去数十年的研究中，研究人员开发多种传递系统包括水凝胶系统、纳米颗粒、脂质体和胶束等，旨在促进药物渗透，降低蛋白水解率，延长蛋白在肠胃停留时间，从而提高口服蛋白的生物利用率。然而，在这些传递系统中存在药物突发性释放，低载药量，加工复杂或者在加工过程中活性物质失活等缺陷限制了他们在临床应用的发展。因此，发展一种简易且高效的药物传递系统提高乳铁蛋白的治疗效率是有必要的。水凝胶是三维网状交联的水溶性聚合物，通常具有高含水量(可以高达99.9％)和良好的生物相容性。水凝胶在临床实践和实验医学中被广泛应用，如细胞治疗，伤口敷料，生物粘附，组织工程和再生医学等。水凝胶独特的理化性质引起了研究人员对于其用作药物载体的兴趣。丝胶是家蚕丝主要的成分之一，具有良好的亲水性、生物相容性和降解性，是一种非常有用的生物材料，例如丝胶增强细菌纤维素作为组织工程支架用于肠道修复，丝胶和聚乙烯醇组成的水凝胶承载纳米银可以有效抑制细菌和真菌的生长，软琼脂丝胶水凝胶能够促进慢性伤口的愈合，可注射丝胶水凝胶课作为体内缺血心肌修复的生物材料，丝胶/左旋糖酐制备的可注射水凝胶承载阿霉素可以显著抑制小鼠黑色素瘤的生长。有意思的是，丝胶的高分子特性(超过300KDa)可以使其在不添加交联剂的情况下自组装成水凝胶，研究表明以纯丝胶生物材料装载FGF1的水凝胶体外可以显著促进细胞的增殖。
目前对于纯丝胶蛋白制备的生物材料主要用于组织工程修复，而以其制备的纯丝胶水凝胶口服传递药物的研究尚待研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的利用之前的研究中已经建立一种新的家蚕品系，重组人乳铁蛋白转基因家蚕品系，利用该品系制备一种水凝胶，用高浓度的尿素提取丝胶蛋白，透析过程中通过氢键的诱导自组装成水凝胶，同时重组人乳铁蛋白被装载到丝胶水凝胶。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明的目的之一在于提供一种口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶，具体方案如下：
一种口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶，所述水凝胶的制备方法如下：以重组人乳铁蛋白转基因家蚕品系的蚕茧为原料，使用尿素溶液提取丝胶蛋白，透析过程中通过氢键的诱导自组装成水凝胶。
优选的，所述提取丝胶蛋白的具体步骤如下：将蚕茧粉碎成蚕茧粉，用浓度为8M尿素溶液提取，过滤去掉未溶解的丝素，离心收集上清，获得丝胶蛋白。
优选的，所述尿素溶液中含有pH8.0、50mM的Tris-HCl。
优选的，所述提取的条件是80℃水浴锅中提取1h。
优选的，提取丝胶蛋白中蚕茧与尿素溶液的浴比为40mg/mL。
优选的，所述水凝胶酰胺III分析特征峰出现在1413cm-1，160cm-1，和1640cm-1处，酰胺I分析吸收峰分别为1614cm-1，6,10cm-1，1663cm-1和1687cm-1。
优选的，所述水凝胶的外部孔径大于内部孔径，外部孔径集中于5-9微米，内部横截面和纵截面的孔径集中于3-5微米。
本发明的目的之二在于提供重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶的用途，具体方案如下：所述重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶在制备增强机体免疫力的口服药物中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种口服型重组人乳铁蛋白(rhLF)丝蛋白水凝胶，rhLF丝胶水凝胶呈现的持续释放rhLF特性，为提高rhLF生物利用度提供了依据。为了评价重组人乳铁蛋白丝胶水凝胶增强，免疫力的作用，通过建立了环磷酰胺诱导小鼠免疫力低下模型，每天口服给药，给药结束后检测与小鼠免疫力相关的指标，结果显示小鼠的免疫力得到提高，因此可以作为增强机体免疫力的药物。更进一步的急性毒理实验初步评判转基因丝胶水凝胶的毒性，结果显示rhLF水凝胶无毒。rhLF丝胶水凝胶的毒性和增强免疫力的生物学活性研究结果意味着其具有巨大的市场应用前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为水凝胶制备及其特性分析(A：丝胶溶液；B：水凝胶；C：水凝胶二级结构；D和D’：水凝胶外部结构；E和E’：水凝胶内部横切片结构；F和F’：水凝胶内部纵切片结构；D”：水凝胶外部孔径；E”：水凝胶内部横切片孔径；F”：水凝胶内部纵切片孔径)。
图2为rhLF释放特性分析。
图3为rhLF水凝胶稳定性分析(A：不同温度下稳定性；B：pH2.5下稳定性；C：pH 5.5下稳定性；D：pH 7.0下稳定性)。
图4为小鼠脾脏组织CD3分子表达。
图5为体内检测rhLF水凝胶提升免疫抑制小鼠免疫力(A：淋巴细胞数量；B：血液白细胞数量；C：强迫性游泳时长；D：碳粒廓清指数测定；E：NK细胞检测；F：DTH检测)。
图6为免疫抑制小鼠器官指数测定(A：环磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型；B：小鼠胸腺组织；C：小鼠胸腺指数；D：小鼠脾脏组织；E：小鼠脾脏指数)。
图7为HE分析各组小鼠脾脏组织。
图8为rhLF水凝胶药代动力学检测。
图9为体外检测rhLF-sh-L毒性。
图10为体内检测rhLF-sh-L毒性(A：小鼠的体重增长情况；B：白细胞数量；C：谷丙转氨酶浓度；D：肌酸激酶浓度；E：肝脏尸检结果；F：脾脏尸检结果；G：肺尸检结果；H：肾脏尸检结果；I：心脏尸检结果)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明实施例使用的实验材料如下：重组人乳铁蛋白蚕茧(rhLF)和野生型蚕茧(WT)由本实验室饲养重组人乳铁蛋白转基因家蚕品系和D9L品系获得。家蚕在25℃人工气候箱中以人工饲料饲养。小鼠纤维母细胞NIH/3T3由实验室保存，并培养于含有10％(v/v)胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM培养基中，培养条件为37℃，5％CO2。实验小鼠品系为Balb/C，雌性，体重约22g，小鼠饲养于屏障环境IVC饲养系统。
本发明实施例分子克隆过程中所用到的常规培养基，试剂缓冲液等参照《分子克隆实验指南第三版译》以及《TaKaRa商品目录》中实验室常规试剂配制方法章节(S1-S11)进行配置。
实施例1、丝胶水凝胶制备
为了制备水凝胶，我们首先用8M的尿素提取丝胶，含有或者不含重组人乳铁蛋白的丝胶在8M尿素中呈溶液状态，随着透析的进行，丝胶溶液逐渐形成水凝胶(图1，A和图1，B)。具体步骤如下：rhLF蚕茧、WT蚕茧由我们实验室通过饲养rhLF家蚕品系(参见Xu S,WangF,Wang Y,Wang R,Hou K,Tian C,Ji Y,Yang Q,Zhao P,Xia Q:A silkworm based silkgland bioreactor for high-efficiency production of recombinant humanlactoferrin with antibacterial and anti-inflammatory activities.J Biol Eng2019,13:61.)和D9L家蚕品系(WT)获得，使用之前蚕茧在室温保存。WT和rhLF家蚕品系用新鲜桑叶饲养后获得WT和rhLF蚕茧，蚕茧用之前保存在室温。蚕茧用液氮冷冻后用高速粉碎机粉碎成蚕茧粉。称取一定量的蚕茧粉末，按照40mg/mL浴比用含有50mM Tris-HCl的pH8.0浓度8M尿素提取于80℃水浴锅中提取1h，然后用纱布过滤，去掉未溶解的丝素得到丝胶溶液，丝胶溶液进行离心，离心条件是10000rpm，25℃，取上清备用。WT丝胶溶液和rhLF-L组丝胶溶液用分子量为10kDa透析，分别设为WT水凝胶组和rhLF-L水凝胶组，rhLF-L组水凝胶组中rhLF浓度为170μg/mL，命名为rhLF-sh-L。用同样的方法提取rhLF丝胶溶液，随后用镍离子亲和层析柱将rhLF纯化出来，将纯化的rhLF添加到rhLF丝胶溶液后用10kDa透析袋透析，其中rhLF的浓度为340mg/mL，命名为rhLF-sh-H。透析过程中透析液为去离子水，每隔12h更换一次透析液，总共透析4天，透析结束后在4℃，12000rpm条件下离心30min，去除多余的水分，沉淀为水凝胶。
实施例2、傅立叶变换红外吸收光谱仪(FTIR)分析
水凝胶二级结构用FTIR(Nicolet iN10 instrument，赛默飞，美国)进行分析，光谱采集范围为800-4000cm-1，随后用酰胺I分峰方法进行二级结构分析，其中1610-1628cm-1代表侧链，1648-1660cm-1代表α螺旋，1625-1640cm-1代表β折叠，1625-1640cm-1代表β转角，超过30个独立的样品用于FTIR分析。结果用酰胺III分峰方法，三个明显的特征峰出现在1413，,160，和1640cm-1处，分别代表C-N拉伸,N-H弯曲和C＝O拉伸。进一步酰胺I(C＝O拉伸振动)谱带分析结果显示，1600-1700cm-1波段共检测到4个特征峰，吸收峰1614cm-1，6,10cm-1，1663cm-1和1687cm-1分别代表侧链，β折叠，α螺旋和β转角，其中含量最高的为β折叠(46.80％)，其次是无规则卷曲(27.86％)(图1，C)，高含量的β折叠意味着水凝胶分子之间形成了紧密的氢键网络结构。
实施例3、扫描电子显微镜(SEM)分析
水凝胶制备之后，置于液氮中冷冻1h，冷冻的丝胶水凝胶被刀纵切以便观察纵截面，横切以便观察横截面，丝胶水凝胶被用于冷冻干燥机冻干，冻干的丝胶水凝胶放在扫描电子显微镜专用的载物台，观察面朝上，在真空条件下冻干的水凝胶镀上一层铂金，随后在室温下10kV加速工作电压条件下观察各个样品的结构并拍照，SEM分析冻干的水凝胶外部和内部结构，结果如图1中D-F，D’-F’和D”-F”所示。结果显示，水凝胶呈规则多孔状结构，蛋白的表面光滑。有意思的是，水凝胶的外部和内部孔径略有不同，外部孔径比内部孔径大，集中于5-9微米，而内部横截面和纵截面的孔径则集中于3-5微米，这意味着水凝胶的内部蛋白分子更为致密。水凝胶的这种网络结构无疑有助于维持其稳定性。
实施例4、水凝胶rhLF释放特性
为了检测重组人乳铁蛋白的释放特性，酸性，中性和碱性的PBS溶液(pH4.0，pH7.0和pH 9.0)被用于水凝胶处理，具体方法如下：0.1mM PBS缓冲液分别被用0.1M盐酸或者0.1M氢氧化钠调至pH4、pH7、pH9；40mg rhLF-L组水凝胶置于1mL不同pH PBS中，将各个样品置于摇床上，37℃，100rpm条件并在一定的时间点(5min、15min、30min、60min、120min和240min)离心取上清液，将上清液转移到新的离心管，检测前放在-40℃保存，随后等体积新鲜的不同pH PBS加入到离心管中在同样条件下继续处理水凝胶，所有样品取完后进行Eliza检测rhLF含量。每组三个重复，结果如图2所示。结果显示，在不同pH溶液中，rhLF释放量有较大的区别，酸性pH条件下rhLF释放量显然要超过中性和碱性pH。在240min内，酸性条件下大约31.45±0.46％rhLF能够释放出来，而碱性条件下仅13.72±0.24％被释放。rhLF释放速率先快后慢，无论是何种pH溶液，在释放的rhLF中，80％以上在120min内被释放出来，这些结果说明rhLF可以从水凝胶中缓慢释放出来，酸性条件更有助于水凝胶降解，释放rhLF。
实施例5、水凝胶稳定性检测
水凝胶稳定性检测分为两部分：
一部分用于检测rhLF水凝胶的保存时间，将40mg rhLF-sh-L分别置于1.5mL离心管中，随后分别放在4℃、25℃和37℃条件下避光保存，在一定的时间点(0w、2w、4w、6w和8w)取出水凝胶，每个离心管加入80μL含50mM Tris-HCl的8M尿素，95℃处理5min将水凝胶完全溶解，检测前置于-40℃保存，然后用eliza检测rhLF的残留量用于评价水凝胶的稳定性，每个组设3个重复，结果如图3中A所示。结果显示，低温条件(4℃)有助于水凝胶的保存，经过2周的时间，仍有98.32±0.96％rhLF存在于水凝胶中，而同期的37℃条件下，有88.97±1.32％rhLF存留。水凝胶存放超过8周，8周后4℃，25℃，37℃条件下rhLF存留量分别为83.81±1.36％，77.95±0.80％和77.15±1.34％，在同样的情况下，8周后rhLF-STD溶液降解显著高于rhLF凝胶，这些结果表明水凝胶保护rhLF不被降解；低温条件是水凝胶的最佳保存温度，即使温度稍高的情况下(37℃)仍有77％以上的rhLF存在。
另一部分用于检测rhLF水凝胶在不同pH条件下的稳定性，将40mg rhLF-sh-L分别置于1.5mL离心管中，随后加入1mL pH2.5、5.5和7.0的0.1M氯化钠溶液，样品于37℃，100rpm振荡处理，于一定的时间点(5min、15min、30min、60min、120min和240min)取样，12000rpm，25℃离心2min，去掉上清，加入80μL含50mM Tris-HCl的8M尿素，95℃处理5min将水凝胶完全溶解，检测前置于-40℃保存，此部分实验以rhLF水凝胶当量的rhLF-STD溶液作为对照，每个样品设置3个重复。所有样品均用Eliza方法检测，结果如图3中B所示。结果显示，pH2.5环境中，随着时间的延长，rhLF-std溶液和水凝胶中rhLF均有一定程度的降解，它们的降解速率呈显著差异，超过50％rhLF在60min内被快速降解，而同时间点(60min)有75.36±3.12％rhLF存在于水凝胶；第240min时，rhLF-std溶液中仅有16.87±3.63％rhLF剩余，水凝胶中则有58.83±2.25％。当pH为5.5时，rhLF-std溶液和水凝胶中rhLF降解率均有所下降，60min时，rhLF-std溶液中rhLF剩余量为66.64±1.72％，而这一时间点pH2.5环境中的rhLF剩余量为48.13±3.49％(图3，C)；经过240min的处理，水凝胶和溶液中分别有79.22±4.77％和44.63±4.18％的rhLF剩余。
实施例6、体内活性检测
免疫系统主要由免疫器官和免疫细胞组成，包括脾、胸腺和淋巴细胞，器官指数的变化是机体免疫功能的重要指标之一。因此本实施例通过环磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型，检测脾、胸腺、淋巴细胞和器官指数。
(1)环磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型
168只SPF级，4～6周雌性BALB/C小鼠用于检测rhLF水凝胶缓解环磷酰胺诱导小鼠免疫抑制检测。小鼠被随机分成6个组，分别是空白对照组(CK组)，阴性对照组I生理盐水组(S组)，阴性对照组II WT水凝胶组(WT-sh)，rhLF-L水凝胶组(rhLF-sh-L)，rhLF-H水凝胶组(rhLF-sh-H)和阳性对照组rhLF-STD溶液组(rhLF-STD)，其中除了CK组外，其余处理组均用环磷酰胺进行小鼠免疫抑制。样品处理前第1天，第4天和第28天小鼠接受腹腔注射环磷酰胺，剂量为150mg/kg·BW，随后连续30天每天给予样品处理。小鼠被饲养在22±1℃，湿度60％-80％，12小时暗12小时亮的环境下，自由取食食物与水(图6，A)。
(2)血液白细胞和淋巴细胞数量计算及脾脏和胸腺组织脏器指数测定
血液中白细胞和淋巴细胞数量是反应机体免疫最直观的指标。末次给药1h后，称量各小鼠的体重并做好记录和标记，摘眼球取血，其中80μL新鲜血液加入EDTA·2K抗凝剂中摇匀用于血液白细胞和淋巴细胞数量检测。为了检测淋巴细胞含量，用免疫荧光的方法检测脾脏组织T淋巴细胞表面CD3分子的表达，结果如图4所示，红色荧光和绿色荧光分别表示CD3分子的表达和细胞微丝蛋白，红色荧光的减弱说明S组和WT组小鼠脾脏T淋巴细胞被破坏了，相反，rhLF-STD能减轻脾脏T淋巴细胞的损伤，值得注意的是，rhLF-sh-H处理的小鼠脾脏淋巴细胞损伤最小。在各组中，我们还观察到蓝色荧光点数量比红色荧光点数量多，说明脾脏除了淋巴细胞外仍有其他种类的细胞(比如巨噬细胞)存在。这说明rhLF水凝胶可以很好减缓环磷酰胺对脾脏的损伤。
淋巴细胞不仅大量存在于免疫器官(胸腺和脾脏)，其在血液中广泛分布。血常规检测结果显示，环磷酰胺处理的小鼠(S组)血液淋巴细胞和白细胞数量分别降低至正常小鼠的6.29％和14.55％，经过rhLF凝胶处理过后，虽然淋巴细胞和白细胞数量仍显著低于正常小鼠，但是与S组和WT-sh比较则有了显著的提高，其中rhLF-sh-L处理组较S组淋巴细胞和白细胞数量提高了1.97倍和1.90倍，较WT-sh分别提高1.88倍和1.87倍；rhLF-sh-H处理组较S组淋巴细胞和白细胞数量提高了4.11倍和2.21倍，较WT组分别提高3.90倍和2.18倍；rhLF-std组淋巴细胞和白细胞较S组仅提高2.29倍和1.43倍(图5中A,B)。这些结果表明rhLF不仅可以增强脾脏淋巴细胞的增殖，还能增加血液免疫细胞的含量。
取血结束后脱颈椎处死小鼠。小鼠被解剖，取出小鼠胸腺组织和脾脏组织后用0.1M冷PBS清洗，滤纸吸干表面水分后进行称重，记录并计算脾脏和胸腺脏器指数，计算公式为：
脏器指数(mg)＝脾脏或者胸腺重量(mg)/小鼠体重(g)*100
结果如图6所示。结果显示，从外观形态看，与健康小鼠胸腺相比，注射环磷酰胺后用生理盐水和WT水凝胶处理的小鼠胸腺和脾脏器官出现明显的萎缩，而经过rhLF水凝胶和rhLF-std溶液处理的小鼠胸腺和脾脏则与健康小鼠相似(图6中B,D)，进一步称量胸腺和脾脏重量并计算两种脏器指数，与观察到的结果相符，健康小鼠胸腺指数和脾脏指数显著高于生理盐水组，与WT组相比，rhLF-L组胸腺指数和脾脏指数分别升高了32.20％和24.28％；rhLF-H组分别升高了20.77％和34.76％；rhLF-std组分别升高了13.88％和12.15％(图6中B,D)。
(3)脾脏HE染色和免疫荧光检测总T淋巴细胞
将称重完毕的脾脏组织立马固定在4％多聚甲醛，随后用石蜡包埋并进行厚度为6μm切片，HE试剂盒染色观察小鼠脾脏组织滤泡结构及脾脏细胞数量，其中红色代表细胞质，蓝色代表细胞核。为了检测脾脏总T淋巴细胞数量，更进一步地用免疫荧光方法检测小鼠脾脏CD3分子表达，石蜡切片常规脱蜡，用anti-CD3荧光抗体标记CD3分子、F-actin标记细胞膜，DAPI标记细胞核，最后在荧光共聚焦显微镜下进行免疫荧光观察并拍照，最后用软件ZEN 3.0进行分析。结果显示，生理盐水组和WT水凝胶处理的小鼠脾脏滤泡减小，且滤泡内的细胞数量减少，rhLF-sh-L，rhLF-sh-H和rhLF-std脾脏的滤泡大小和细胞数量与CK组小鼠的相近。这些结果说明环磷酰胺可以破坏小鼠脾脏滤泡结构，而rhLF水凝胶可以保护脾脏滤泡不被破坏(图7)。
(4)强迫性游泳时长(FST)检测
在最后一次给药后，小鼠称重，随后将10％的小鼠体重的钢丝绑在小鼠身上，将小鼠放入在30.0±0.5℃下含有40cm深的水中。从小鼠放入水中开始计时，小鼠头部完全沉入水中并持续5秒中立即停止计时。结果显示，健康的小鼠负重可以在水中坚持15.03分钟，而环磷酰胺处理的小鼠仅坚持7.60分钟。rhLF凝胶处理的小鼠游泳时长与S组比较有明显的增加(图5，C)，尤其是rhLF-sh-H组的小鼠游泳时长与正常小鼠相近，这意味着rhLF-sh-L和rhLF-sh-H可改善环磷酰胺免疫抑制小鼠的身体结构。
(5)碳粒廓清指数测定
小鼠末次给药1h后，天平称重，带针注射器从尾静脉注射稀释墨汁(生理盐水稀释4倍，剂量为0.05ml/10g)，在第2min和第10min时，用浸润抗凝剂(EDTA-2K)的毛细玻璃管从眼内眦静脉丛取血滴加到无菌平板上，用移液器吸取血液20μL，加到含有2mL质量分数为0.1％的碳酸钠溶液的离心管中，震荡摇匀。质量分数为0.1％的碳酸钠溶液作为分光光度计比色调零基准，在680nm处比色，测量吸光度值(OD)。小鼠脱颈椎处死，剖取肝脏和脾脏，天平称重。通过公式1和2计算廓清指数k值与吞噬系数α值，其中吞噬系数α值表征小鼠的碳粒廓清的能力，即巨噬细胞吞噬功能的强弱。公式1中t是注射后时间。
Figure BDA0002279262860000091
Figure BDA0002279262860000092
碳粒廓清指数显示rhLF-H和rhLF-STD处理组显著高于S组和WT组，而与正常小鼠差别较小，表明rhLF-H和rhLF-STD增强了小鼠巨噬细胞的功能和肝脏清除的能力(图5，D)。
(6)NK细胞检测
制备靶细胞(YAC-1细胞)：活性检测实验前24h将YAC-1细胞进行传代培养。临用前用RPMI-1640培养液洗涤3次，800rpm离心5min，再用完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。制备效应细胞(脾淋巴细胞悬液)：末次给药24h后，脱颈椎处死小鼠，无菌条件下取出小鼠脾脏，随后将脾脏置于冷1640培养基中保存，在无菌条件下用脾脏淋巴细胞分离试剂盒制备脾脏淋巴细胞悬液，最后用RPMI-1640完全培养液将脾细胞悬液调整为2×107个/mL备用；NK细胞活性检测：取效应细胞和靶细胞各100μL(个数比约为1:50)，加入到96孔培养板中。靶细胞自然释放孔加培养液和靶细胞各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5％Triton各100μL，然后放于37℃5％二氧化碳培养箱中培养4h后，每孔吸取上清液100μL到新的96孔培养板中，加入新鲜配制的LDH基质液(pH8.2 0.2mol/L Tris-HCl，5×10-2mol/L乳酸锂、6.6×10-4mol/L硝基氯化四氮唑(INT)、2.8×10-4mol/L吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)、1.3×10-3mol/L氧化型辅酶I(NAD)，搅拌溶解，现用现配)100μL，根据室温和颜色变化的不同反应3～10min，每孔加1mol/L盐酸溶液30μL，在酶标仪490nm处测量吸光度值(OD)。NK细胞的活性由公式3算出：
从各组的小鼠分离出NK细胞并检测了其活性，rhLF水凝胶和rhLF-std均显著提高了N细胞活性，且rhLF浓度越高，活性越强(图5，E)。
(7)DTH检测
在完成给药三天之前，小鼠用0.2mL的5％(v/v)SRBC注射到腹腔中以致敏4天。测量左足垫厚度，然后用20μL 20％(v/v)SRBC(绵羊红细胞)注射至小鼠左足进行第二次致敏。24小时后，再次测量所有小鼠的左足垫厚度，并计算如下差异：足垫肿胀(mm)＝刺激后的足垫厚度-刺激前的足垫厚度。
DTH法检测rhLF凝胶对细胞免疫应答的影响，注射绵羊红细胞诱导小鼠免疫24小时后，S组和WT组小鼠的足部有明显的肿胀现象。而rhLF水凝胶和rhLF-std处理组与S组相比显著抑制了小鼠足肿胀，这个结果反应了rhLF水凝胶通过增强小鼠体内抗SRBC抗体的产生显著刺激了小鼠体液免疫(图5，F)。
实施例7、药物代谢动力学
取SPF级雌性Balb/C小鼠42只，随机分为2组，每组21只：分别为rhLF-STD组和rhLF-sh-L组；实验组灌胃rhLF-sh-L 0.3mL，而rhLF-STD组灌胃与凝胶组rhLF当量的rhLF-STD溶液0.3mL；于10min、30min、50min、70min、90min、120min和150min时摘眼球取血，血液加入装有20μL柠檬酸钠(37mg/ml)的试管中，充分混匀；4℃放置6h后，4℃，3000g离心5min取上清即为血浆，随后用eliza试剂盒进行rhLF含量测定。结果显示，rhLF在血浆中的浓度达到最大值分别是70min和90min对于水凝胶组和溶液在灌胃了rhLF水凝胶和等量的rhLF-STD之后。更重要的是，血浆中rhLF的浓度在给药之后的70到150min，水凝胶组处理的小鼠显著高于溶液处理的小鼠。进一步AUC计算结果显示，rhLFS水凝胶处理组也显著高于rhLF-std溶液，这些结果说明rhLF经过胃部和小肠的消化之后，绝大多数被降解了，而rhLF水凝胶能够保护rhLF不被降解(图8)。口服蛋白常常容易被肠胃的酸碱环境或者酶、离子物质降解，我们灌胃rhLF后15-150min，在小鼠血清均检测到了rhLF的存在，主要原因是rhLF本身在机体存在，在15-90min内乳铁蛋白含量出现波动，有可能是rhLF-std被小肠吸收。生物利用率结果显示，rhLF水凝胶rhLF的利用率比溶液状态高约38％。
实施例8、急性毒理检测
取SPF级雌性Balb/C小鼠9只，随机分为3组，每组3只，分别为生理盐水组、WT-sh和rhLF-sh-L。小鼠灌胃前禁食12h，但可以自由饮水，随后分别灌胃生理盐水、WT-sh和rhLF-sh-L 1mL。每天观察小鼠存活率，观察外貌特征是否异常及称重，连续记录14天后牺牲小鼠，摘眼球取血，血液分成两部分，其中一部分用EDTA-2K抗凝用于血常规检测；另一部分置于另一离心管中，4℃静置6h，离心取上清(血清)检测小鼠部分肝功能和肾功能。取血结束后解剖小鼠，分别取小鼠心、肝、脾、肺和双肾进行脏器器官指数测定。结果显示，观察到实验动物的行为和健康小鼠并没有太大的差异，在观察期间没有发现任何中毒迹象，小鼠的体重增长趋势正常，没有出现明显的毛发脱落的现象，鼻孔分泌物无异常(图10，A)，所有动物均存活。尸检结果显示，小鼠的心、肝、脾、肺、肾脏器器官，颜色和形态无异常(图10，E-I)。进一步的血常规和部分肝功能肾功能检测结果显示，各项指标健康小鼠和水凝胶处理的小鼠比较均没有显著性差异(图10，B-D)。结合脾脏炎性因子表达和急性毒理实验结果，初步表明rhLF水凝胶无毒。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (8)

1.一种口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶，其特征在于，所述水凝胶的制备方法如下：以重组人乳铁蛋白转基因家蚕品系的蚕茧为原料，使用尿素溶液提取丝胶蛋白，透析过程中通过氢键的诱导自组装成水凝胶。
2.根据权利要求1所述口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶，其特征在于：所述提取丝胶蛋白的具体步骤如下：将蚕茧粉碎成蚕茧粉，用浓度为8M尿素溶液提取，过滤去掉未溶解的丝素，离心收集上清，获得丝胶蛋白。
3.根据权利要求1所述口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶，其特征在于：所述尿素溶液中含有pH8.0、50mM的Tris-HCl。
4.根据权利要求1所述口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶，其特征在于：所述提取的条件是80℃水浴锅中提取1h。
5.根据权利要求1所述口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶，其特征在于：提取丝胶蛋白中蚕茧与尿素溶液的浴比为40mg/mL。
6.根据权利要求1所述口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶，其特征在于：所述水凝胶酰胺III分析特征峰出现在1413cm-1，160cm-1，和1640cm-1处，酰胺I分析吸收峰分别为1614cm-1，6,10cm-1，1663cm-1和1687cm-1。
7.根据权利要求1所述口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶，其特征在于：所述水凝胶的外部孔径大于内部孔径，外部孔径集中于5-9微米，内部横截面和纵截面的孔径集中于3-5微米。
8.权利要求1～7任意项所述重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶在制备增强机体免疫力的口服药物中的应用。
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