CN108578771A - 具有促进细胞增殖活性的fgf1丝胶蛋白凝胶的制备方法及其产品 - Google Patents

具有促进细胞增殖活性的fgf1丝胶蛋白凝胶的制备方法及其产品 Download PDF

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Abstract

本发明涉及具有促进细胞增殖活性的FGF1丝胶蛋白凝胶的制备方法及其产品，其制备方法步骤如下：利用转人FGF1基因蚕丝提取含人FGF1蛋白的丝胶蛋白，得含人FGF1蛋白的丝胶蛋白溶液，然后经复性后再用水透析得FGF1丝胶蛋白水溶液，离心获得FGF1丝胶蛋白水凝胶，然后在4℃放置，化学交联剂交联或诱导剂诱导形成FGF1丝胶蛋白凝胶材料，值得的凝胶材料具有促进细胞增殖的活性，在组织工程学中具有广阔的应用潜力。

Description

具有促进细胞增殖活性的FGF1丝胶蛋白凝胶的制备方法及其 产品
技术领域
本发明属于生物技术领域，具有促进细胞增殖活性的FGF1丝胶蛋白凝胶的制备方法，还涉及由该方法制得的产品。
背景技术
蚕丝主要由内层的丝素与外层的丝胶组成，含量分别为75％与25％。长期以来，缫丝工业产生的大量丝胶蛋白被视为“废弃物”而排放掉，产生了严重的环境安全隐患。随着研究的深入，研究人员发现丝胶蛋白具有抗氧化、保湿、促进细胞增殖与加速伤口愈合的功效，是潜在生物材料原料。丝胶蛋白在经过化学交联、物理共混、诱导等多种方法交联后能够制备出如丝胶药膏、丝胶-明胶膜、丝胶-羧甲基纤维素基、丝胶聚(乙烯醇)支架等丝胶复合生物材料，体现出巨大的应用价值和潜力。在此基础之上，研究人员也尝试过将功能性蛋白如生长因子等与丝胶蛋白混合后，制备具有功能性的丝胶复合生物材料。例如，Zhang等将神经生长因子(NGF)加入到丝胶-壳聚糖复合支架生物材料中用于缓解和治疗慢性神经嵌压症，并取得一定的疗效；Liu等将葡聚糖与丝胶混合制成药载用于治疗恶性黑色素瘤。然而，受限于传统蚕丝生物材料繁杂的制备流程，功能性单一，以及自身还存在的诸如细胞粘附力弱等缺陷，即使通过后期添加功能性物质可以得到改善，但是功能物质的来源和功效所带来的风险因素，以及生产成本的增加，限制了蚕丝生物材料的市场化，至今也少有获得临床批文以及定型产品。因此，系统探索蚕丝蛋白在仿生材料和生物医学材料等领域中的理论基础与关键技术迫在眉睫。
蚕丝纤维是一种蛋白纤维，主要由丝素和丝胶两类结构性蛋白构成，其中丝素蛋白约占丝纤维的75％，由丝素重链(fib-H chain)、丝素轻链(fib-L chain)和P25三个基因的编码产物按照6：6：1分子比例组成。丝胶蛋白约占丝纤维的25％，主要由丝胶I(Sericin1)，丝胶II(Sericin2)以及丝胶III(Sericin3)基因编码产物组成，其中丝胶I蛋白比重最大。随着家蚕基因组计划的实施，蚕丝合成分泌机制的解析，以及家蚕分子育种技术体系的建立，理论上可以对蚕丝蛋白编码基因进行遗传改良，从根本上改善蚕丝的缺陷，分子培育家蚕改良品系，提升蚕丝纤维的性能和用途，促进蚕丝在生物医疗等高端领域的应用。在前期的研究中，本课题组通过piggyBac转座酶将人酸性成纤维细胞生长因子(FGF1)的基因整合至家蚕基因组，利用家蚕丝腺生物反应器表达系统控制FGF1特异在家蚕丝腺分泌表达至蚕丝中，遗传改良制备了含重组人源FGF1的功能性蚕丝，并具有促进细胞增殖的功能。为深度开发利用人源FGF1的功能性蚕丝，制备具有生物活性的FGF1再生丝胶蛋白生物材料。为此，我们进一步探索建立了从转FGF1蚕丝中提取有活性FGF1蛋白的技术方法，并制备具有促进细胞增殖活性的丝胶凝胶生物材料，在组织工程学中具有广阔的应用潜力。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供具有促进细胞增殖活性的FGF1丝胶蛋白凝胶的制备方法；本发明的目的之二在于提供由所述的制备方法制得的具有具有促进细胞增殖活性的FGF1丝胶蛋白凝胶。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
具有促进细胞增殖活性的FGF1丝胶蛋白凝胶的制备方法，包括如下步骤：利用转人FGF1基因蚕丝提取含人FGF1蛋白的丝胶蛋白，得含人FGF1蛋白的丝胶蛋白溶液，然后经复性后再用水透析得FGF1丝胶蛋白水溶液，离心获得FGF1丝胶蛋白水凝胶，然后在4℃放置，化学交联剂交联或诱导剂诱导形成FGF1丝胶蛋白凝胶材料。
优选的，所述提取为将转人FGF1基因蚕丝经过液氮研磨成粉末，加水制成50mg/ml的浓度，利用抽提缓冲液在萃取，然后于4℃条件下，18,000rpm条件下离心10min，上清液即为含人FGF1蛋白的丝胶蛋白溶液。
优选的，所述抽提缓冲液为pH 7.0、含50mM Tris-HCl和8M尿素的溶液；或浓度为9.3M的LiBr；或浓度为0.02M的Na2CO3。
优选的，所述萃取为使用pH 7.0、含50mM Tris-HCl和8M尿素的溶液在80℃条件下萃取1h。
优选的，所述复性为利用二硫苏糖醇/谷胱甘肽氧化还原系统复性。
优选的，所述复性为将含人FGF1蛋白的丝胶蛋白在透析液中、4℃透析上清液12h，然后利用对半稀释法用复性液对透析液进行置换，重复4次，每次12h，再用水透析去除复性液，最后将复性的含有重组FGF1蛋白的丝胶蛋白溶液在4℃、4000rmp条件下离心10min，收集沉淀即可。
优选的，所述透析液各组分浓度如下：尿素8M，二硫苏糖醇1mM，Tris-Cl 50mM、pH7.0；NaCl 250mM；所述复性液各组分浓度如下：谷胱甘肽2.0mM；氧化谷胱甘肽0.2mM；二硫苏糖醇1mM；Tris-Cl 50mM、pH 7.0；NaCl 250mM。
2、由所述的制备方法制得的具有具有促进细胞增殖活性的FGF1丝胶蛋白凝胶。
本发明的有益效果在于：本发明公开了具有促进细胞增殖活性的FGF1丝胶蛋白凝胶的制备方法，方法简单，制得的蛋白凝胶具有极强的吸水性能，可降解，并且具有促细胞增殖的活性，并且无明显的细胞毒性，也不会诱导过量细胞炎性反应，可作为组织工程生物材料使用。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为丝胶蛋白提取溶剂的选择；(A)尿素、溴化锂与碳酸钠提取的丝胶蛋白溶液制备的冷冻干燥后的丝胶凝胶样品与内部结构图；(B)尿素、溴化锂与碳酸钠提取的丝胶蛋白溶液制备的凝胶样品中重组FGF1蛋白检测结果。
图2为SS-FGF1的制备流程与重组FGF1蛋白的检测；(A)SS-FGF1的制备流程；(B)SS-FGF1中重组FGF1蛋白的含量测定。
图3为SS-FGF1的内部结构；(A)为SS-FGF1内部100倍的SEM图；(B)为SS-FGF1内部220倍的SEM图。
图4为丝胶蛋白凝胶的红外吸收光谱图。
图5为SS-FGF1的稳定性与吸水性；(A)为SS-FGF1吸水性能结果；(B)为SS-FGF1稳定性结果。
图6为SS-FGF1中重组FGF1蛋白的释放特征。
图7为NIH3T3细胞在SS-FGF1的表面的贴附性能；(A)与(B)DAPI染色接种NIH3T3细胞2h后存留在SS-FGF1与细胞培养板上的细胞；(C)SS-FGF1细胞贴附性能。
图8为NIH3T3细胞在SS-FGF1的表面正常生长；(A)DAPI染色SS-FGF1与TCP表面的NIH3T3细胞；(B)与(C)分别为NIH3T3细胞在TCP与SS-FGF1表面的生长曲线。
图9为SS-FGF1具有促进NIH3T3细胞增殖的活性；(A)细胞生长状态；(B)CCK-8检测结果。
图10为SS-FGF1具有促进NIH3T3细胞增殖的活性。
图11为SS-FGF1中重组FGF1蛋白的稳定性；(A)与(B)分别为4℃、37℃条件下处理的SS-FGF1促进NIH3T3细胞增殖活性的检测与重组FGF1蛋白的检测结果。
图12为SS-FGF1无明显细胞毒性。
图13为SS-FGF1不诱导过量的细胞炎性反应；(A)细胞培养基中TNF-a的含量测定；(B)细胞培养基中NO的含量测定；(C)Raw264.7细胞中iNOS的表达情况；(D)定量分析iNOS的表达情况。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
本发明实施里使用的实验材料如下：
细胞系：NIH/Swiss小鼠胚胎细胞系(NIH3T3)，小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(Raw264.7)。NIH3T3细胞与Raw264.7细胞均使用含有10％胎牛血清(Gibico)的DMEM培养基(Gibico)培养。
蚕丝材料：正常蚕丝D9L与转人FGF1蚕丝，其中转人FGF1基因蚕丝由前期研究中成功获得的转人FGF1基因家蚕品系制得(Wang,F.,et al.,Advanced silk material spunby a transgenic silkworm promotes cell proliferation for biomedicalapplication.Acta Biomater,2014.10(12):p.4947-55.Wang,F.,et al.,Large-scaleproduction of bioactive recombinant human acidic fibroblast growth factor intransgenic silkworm cocoons.Sci Rep,2015.5:p.16323.)。
实施例1、转人FGF1蚕丝中丝胶蛋白的提取方法
茧壳经过液氮研磨成粉末，备用；以50mg/ml的浓度，利用抽提缓冲液1(50mMTris-HCl,8M urea,pH 7.0)在80℃条件下萃取1h；利用抽提缓冲液2(9.3M LiBr)在60℃条件下萃取4h；利用抽提缓冲液3(0.02M Na2CO3)沸水浴中萃取1h，得到含人FGF1蛋白的丝胶蛋白溶液。
实施例2、含人FGF1蛋白的丝胶蛋白凝胶(SS-FGF1)的制备方法
将抽提缓冲液1的提取液在80℃、13400rpm～18,000rpm条件下离心30min，取上清液利用二硫苏糖醇/谷胱甘肽(DTT/GSSH)氧化还原系统复性上清液中的FGF1蛋白。复性过程：在4℃条件下，利用透析袋(MWCO 1000Da,Spectrum Laboratory,Inc,USA)充分透析上清液12h，置换成为透析液(8M urea,1mM dithiothreitol(DTT),50mM Tris–Cl(pH 7.0),and250mM NaCl)；利用对半稀释的方法利用复性液(2.0mM reduced glutathione(GSH),0.2mM oxidized glutathione(GSSG),1mM DTT,50mM Tris–Cl(pH 7.0),and 250mM NaCl)对透析液进行置换，每次透析12h，重复4次；利用超纯水透析6次，去除复性液，每次12h。复性完成后，丝胶蛋白水溶液在4℃、4000rmp条件下离心10min，下层为含有FGF1蛋白的丝胶蛋白水凝胶。取一定量的含有FGF1蛋白的丝胶蛋白水凝胶在4℃条件下静置一段时间(超过24h)，或利用化学交联剂交联即得到各种形态的、各种力学性能的SS-FGF1生物材料。
为了研究传统的丝胶提取剂是否会破坏重组FGF1蛋白的活性，首先，利用尿素、溴化锂与碳酸钠三种丝胶蛋白提取剂抽提了FGF1蚕丝的丝胶蛋白，制备了凝胶材料。结果显示，尿素、溴化锂与碳酸钠提取的丝胶溶液制备出的凝胶经过冻干后均为多孔状结构，其中尿素与溴化锂提取丝胶溶液制备的材料表面有明显的连接现象，说明其更能够形成稳定的结构(图1，A)。
SDS-PAGE与Western Blotting：上述细胞样品、丝胶凝胶蛋白样品采用增强型BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度(Beyotime)。取等质量的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，利用考马斯亮蓝染色与Western Blotting进行检测。电泳完成后，通过转膜仪将蛋白样品转到PVDF膜，经过5％脱脂奶粉封闭、5次PBST洗膜、孵一抗(anti-FGF1抗体、anti-GADPH抗体与anti-iNOS抗体)、5次PBST洗膜、孵二抗(抗鼠或兔IgG抗体)等操作后，利用ECL WesternBlotting Detection System(Amersham Biosciences)显现膜上的条带，曝光方式采用自动曝光。结果显示，尿素与溴化锂提取的丝胶蛋白溶液中能够较好地保持重组FGF1蛋白的稳定(图1，B)。因此，选择尿素作为丝胶蛋白的提取剂。上述细胞蛋白样品由以下方法提取：弃去培养基，利用1mL PBS(135mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH2PO4和8mM K2HPO4，PH7.4)清洗细胞3次，加入150μl新配的含有蛋白酶抑制剂PSPF的RIPA裂解液，置于冰上30min，收集细胞后13400rpm离心5min，取上清为细胞蛋白样品。
经过条件优化，SS-FGF1的制备流程如图2所示，FGF1茧壳经过粉碎后，利用丝胶蛋白提取剂1在80℃条件下搅拌提取30min，4000rmp离心10min，留上清液。上清液经过透析复性FGF1蛋白后，再利用超纯水继续透析，得到FGF1丝胶蛋白水溶液。FGF1丝胶蛋白水溶液在13400rmp离心10min，得到FGF1丝胶蛋白水凝胶。FGF1丝胶蛋白水凝胶注入不同的磨具，放置于4℃超过24h，或者利用化学交联剂交联、诱导剂诱导后即形成各种形态的FGF1丝胶蛋白凝胶材料(图2，A)。经过检测，FGF1丝胶蛋白水凝胶中重组FGF1蛋白的含量为8.03ng/μl(图2，B)。
实施例3、含人FGF1蛋白的丝胶蛋白凝胶性能检测
a.电镜观察(SEM)
将长与宽分别为1cm的SS-FGF1进行冷冻干燥，取其内层进行喷金处理，利用扫描电镜(Supra 55sapphire,Zeiss)进行观察与拍照。所有实验在室温下进行，电压为3.0kV。每个实验的样品数为5个独立样品，每个样品拍3次。SEM结果显示，SS-FGF1内部为多孔状疏松结构，空隙大小为137±48μm(图3)。
b.红外光谱分析(FTIR)
将长与宽分别为1cm的SS-FGF1进行冷冻干燥，取其内层作为检测样品。利用红外光谱分析仪(Thermo fisher scientific)进行测定。利用红外光谱分析仪(Thermo fisherscientific)分析蚕丝样品在800～4000cm之间的红外吸收光谱图。每个样品测定30次，取平均值进行数据分析，结果如图4所示。结果显示，WT与SS-FGF1在800～4000cm范围内具有相似的吸收光谱谱图与吸收峰特征，如酰胺I(C-N)、酰胺II(N-N)与酰胺III(C-O)。酰胺I分峰结果说明，WT与SS-FGF1含有相同的二级结构特征，如反向的β-折叠、β-转角、无规卷曲、α-螺旋、天然β-折叠和分子间β-折叠，它们的含量分别为7～8％、15～16％、19～20％、20～21％与34～36％。
c.稳定性分析
称取等量的SS-FGF1材料浸泡在PBS(pH7.4)或PBS(pH7.4)+lysozyme溶液中，置于37℃条件下，一定时间后，取出凝胶样品利用滤纸吸干多于的水分后称量。稳定性实验结果显示，在37℃条件下，SS-FGF1逐渐溶解，在一周的时间内降解率超过70％；在含有10U/ml溶菌酶的PBS条件下，SS-FGF1的溶解速率更快，表明SS-FGF1具有可降解性(图5，B)。
d.吸水性分析
利用真空冷冻干燥法干燥SS-FGF1材料。在37度条件下，将干燥后的SS-FGF1材料浸入PBS(pH7.4)溶液，一定时间后，取出样品去除附着的水分后称量。吸水性实验结果显示，冻干后的SS-FGF1能够吸收自身重量约43倍的PBS溶液，说明其具有极强的吸水性能(图5)。
e.SS-FGF1中FGF1蛋白的释放
取1ml FGF1丝胶蛋白液体凝胶置于24孔培养板，在4℃条件下静置24h后，将其置于冰上利用紫外光直接照射8h。然后，向每个培养孔中加入500μl的PBS(pH7.4)，置于37℃条件下，孵育一定时间后取出PBS提取液，冷藏备用。向每个培养孔中重新加入500μl新鲜的PBS，重复该过程。最后，利用ELISA的方法检测释放到PBS中的FGF1的含量。SS-FGF1中重组FGF1蛋白释放结果显示，SS-FGF1能够稳定、持续地释放出重组FGF1蛋白。SS-FGF1中的重组FGF1蛋白在前3天内迅速释放，释放量超过80％，之后，其释放速率放缓。最终，从0.5ml的SS-FGF1中能够释放出超过320ng的FGF1蛋白(图6)。
f.SS-FGF1持续释放FGF1蛋白
利用NIH3T3细胞检测了SS-FGF1维持细胞正常生长的能力。SS-FGF1对NIH3T3细胞的贴附性能结果可知，在细胞培养板(TCP)与SS-FGF1表面接种NIH3T3细胞2h后，附着的细胞数量无明显差异，说明SS-FGF1具有良好的NIH3T3细胞贴附能力(图7)；将少量的NIH3T3细胞接种到TCP与SS-FGF1表面连续培养数天，利用DAPI染色与CCK-8试剂盒检测了细胞的生长情况的结果可知，NIH3T3细胞的数量随着培养时间的延长而迅速生长，4天后几乎长满整个SS-FGF1与TCP表面。NIH3T3细胞在SS-FGF1表面生长的初期，其生长速率较TCP表面低，但是，随着培养时间的延长，NIH3T3细胞迅速生长，峰值出现在第6天。TCP上培养的NIH3T3细胞的生长峰值出现在第3天(图8)。
g.细胞增殖实验
取100μl的WT与再生FGF1丝胶蛋白液体凝胶置于96孔培养板，在4℃条件下静置24h后，置于冰上紫外消毒8h。然后，分别利用PBS、0.25％血清的DMEM培养基浸泡2h，备用。NIH3T3细胞用含有0.25％胎牛血清的DMEM培养基接种于再生丝胶凝胶表面，每孔500个细胞，100μl体系，连续培养数天。设置添加了FGF1标准品蛋白的细胞孔作为阳性对照组。利用Click-iT EdU试剂盒(Invitrogen)对正在发生增殖的细胞进行染色；利用Live-Dead染色试剂盒(Molecular ProbesTM)分别对活细胞与死细胞进行染色；利用CCK-8试剂盒(Beyotime)对细胞的数量进行分析。
结果表明，与Null、SS-WT组相比，SS-FGF1表面的细胞数量较多，与FGF1标准品组相近(图9，A)；CCK-8试剂盒测定结果显示，SS-FGF1组与标准品FGF1组的细胞数量显著多于Null、SS-WT组(图9，B)；EdU染色可以将正在发生增殖的细胞染出红色的荧光信号，结果表明，在SS-FGF1组中具有红色荧光信号的NIH3T3细胞显著多于SS-WT组(图10)。综上，SS-FGF1具有促进NIH3T3细胞增殖的能力。
h.SS-FGF1中重组FGF1蛋白的生物活性的稳定性
将再生FGF1丝胶蛋白凝胶分别置于4℃、37℃条件下，孵育一定时间后，取出丝胶凝胶样品，检测FGF1蛋白含量以及促细胞增殖的活性。利用NIH3T3细胞检测细胞增殖活性，Western blotting样品中重组FGF1蛋白含量。促进NIH3T3细胞增殖活性的结果显示，相对于SS-WT，SS-FGF1显著地促进了NIH3T3细胞的增殖生长，说明，SS-FGF1能够长期的保持重组FGF1蛋白的生物活性(图11)。
i.细胞毒性实验
取100μl的WT与再生FGF1丝胶蛋白液体凝胶置于96孔培养板，在4℃条件下静置24h后，置于冰上紫外消毒8h。然后，分别利用PBS、0.25％血清的DMEM培养基浸泡2h，备用。NIH3T3细胞用含有10％胎牛血清的DMEM培养基铺于96孔板，每孔500个细胞，100μl体系，连续培养数天。利用Live-Dead染色试剂盒(Molecular ProbesTM)分别对活细胞与死细胞进行染色；利用CCK-8试剂盒(Beyotime)对细胞的数量进行分析。结果显示，培养1天后，SS-FGF1组的活细胞数量明显多于Null、SS-WT组，死细胞数量少于Null、SS-WT组；培养5天后，SS-FGF1组的NIH3T3细胞持续生长，且只有少量的死细胞(图12)。表明，SS-FGF1对NIH3T3无明显的细胞毒性。
j.细胞炎性实验
分别取1ml的WT与FGF1丝胶蛋白液体凝胶置于冰上紫外消毒8h，备用。Raw264.7细胞用含有10％胎牛血清的DMEM培养基铺于24孔板，每孔3×104个细胞，500ul体系，培养过夜。将消毒后的WT与FGF1丝胶蛋白液体凝胶与10％胎牛血清的DMEM培养基充分混合后替换原来的培养基，孵育1天、2天后，收集细胞培养基测定TNF-a与NO的含量，利用含有抑制剂PMSF的RIPA裂解液收集细胞内蛋白样品测定iNOS的表达情况。利用Mouse TNF-alphaDuoSet ELISA(RD)测定细胞培养基中的TNF-a的含量；利用NO试剂盒测定细胞培养基中的NO的含量；利用Western blotting检测细胞内iNOS的表达水平。结果显示，SS-WT组、SS-FGF1组培养基中炎性因子TNF-a的含量与Null组无明显差异，显著低于100ng/ml、1000ng/ml LPS阳性诱导组；Raw264.7细胞中iNOS的表达与培养基中NO的含量也显示，含有总丝胶蛋白0.1mg/ml、0.5mg/ml与1mg/ml的SS-WT组、SS-FGF1组与Null组无明显差异，显著低于100ng/ml、1000ng/mlLPS阳性诱导组(图13)。表明，SS-FGF1不会诱导Raw264.7细胞产生过量的细胞炎性反应。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.具有促进细胞增殖活性的FGF1丝胶蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：利用转人FGF1基因蚕丝提取含人FGF1蛋白的丝胶蛋白，得含人FGF1蛋白的丝胶蛋白溶液，然后经复性后再用水透析得FGF1丝胶蛋白水溶液，离心获得FGF1丝胶蛋白水凝胶，然后在4℃放置，化学交联剂交联或诱导剂诱导形成FGF1丝胶蛋白凝胶材料。
2.根据权利要求1所述具有促进细胞增殖活性的FGF1丝胶蛋白凝胶的制备方法，其特征在于：所述提取为将转人FGF1基因蚕丝经过液氮研磨成粉末，加水制成50mg/ml的浓度，利用抽提缓冲液在萃取，然后于4℃条件下，18,000rpm条件下离心10min，上清液即为含人FGF1蛋白的丝胶蛋白溶液。
3.根据权利要求2所述具有促进细胞增殖活性的FGF1丝胶蛋白凝胶的制备方法，其特征在于：所述抽提缓冲液为pH 7.0、含50mM Tris-HCl和8M尿素的溶液；或浓度为9.3M的LiBr；或浓度为0.02M的Na2CO3。
4.根据权利要求2所述具有促进细胞增殖活性的FGF1丝胶蛋白凝胶的制备方法，其特征在于：所述萃取为使用pH 7.0、含50mM Tris-HCl和8M尿素的溶液在80℃条件下萃取1h。
5.根据权利要求1所述具有促进细胞增殖活性的FGF1丝胶蛋白凝胶的制备方法，其特征在于：所述复性为利用二硫苏糖醇/谷胱甘肽氧化还原系统复性。
6.根据权利要求1所述具有促进细胞增殖活性的FGF1丝胶蛋白凝胶的制备方法，其特征在于：所述复性为将含人FGF1蛋白的丝胶蛋白在透析液中、4℃透析上清液12h，然后利用对半稀释法用复性液对透析液进行置换，重复4次，每次12h，再用水透析去除复性液，最后将复性的含有重组FGF1蛋白的丝胶蛋白溶液在4℃、4000rmp条件下离心10min，收集沉淀即可。
7.根据权利要求5所述具有促进细胞增殖活性的FGF1丝胶蛋白凝胶的制备方法，其特征在于：所述透析液各组分浓度如下：尿素8M，二硫苏糖醇1mM，Tris-Cl 50mM、pH 7.0；NaCl250mM；所述复性液各组分浓度如下：谷胱甘肽2.0mM；氧化谷胱甘肽0.2mM；二硫苏糖醇1mM；Tris-Cl 50mM、pH 7.0；NaCl 250mM。
8.由权利要求1～7任一项所述的制备方法制得的具有具有促进细胞增殖活性的FGF1丝胶蛋白凝胶的制备方法。
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