CN110354307B - 基于转人血小板衍生生长因子基因蚕丝的蛋白丝胶凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

基于转人血小板衍生生长因子基因蚕丝的蛋白丝胶凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于转人血小板衍生生长因子(PDGF‑BB)基因蚕丝的蛋白丝胶凝胶及其制备方法和应用，本发明利用人源PDGF‑BB的功能性蚕丝，提取有活性PDGF‑BB蛋白的丝胶蛋白，利用低温诱导丝胶的胶化反应，制得的材料力学性能好、可降解、PDGF‑BB能够稳定存在，细胞相容性好，不具毒性，不会引起细胞凋亡，也不会引起显著的细胞炎症反应且具有促进细胞增殖活性的丝胶凝胶生物材料，能够在组织工程学中的应用。

Description

基于转人血小板衍生生长因子基因蚕丝的蛋白丝胶凝胶及其 制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及基于转人血小板衍生生长因子基因蚕丝的蛋白丝胶凝胶，还涉及蛋白丝胶凝胶的制备方法和应用。
背景技术
蚕丝主要由内层的丝素与外层的丝胶组成，含量分别为75％与25％。长期以来，缫丝工业产生的大量丝胶蛋白被视为“废弃物”而排放掉，产生了严重的环境安全隐患。随着研究的深入，丝胶蛋白具有抗氧化、保湿、促进细胞增殖与加速伤口愈合的功效被揭示，成为潜在生物材料原料。丝胶蛋白在经过化学交联、物理共混、诱导等多种方法交联后能够制备出如丝胶药膏、丝胶-明胶膜、丝胶-羧甲基纤维素基、丝胶聚(乙烯醇)支架等丝胶复合生物材料，体现出巨大的应用价值和潜力。丝胶也可以与功能性蛋白如生长因子等进行混合后，制备具有功能性的丝胶复合生物材料。例如，Zhang等将神经生长因子(NGF)加入到丝胶-壳聚糖复合支架生物材料中用于缓解和治疗慢性神经嵌压症，并取得一定的疗效；Liu等将葡聚糖与丝胶混合制成药载用于治疗恶性黑色素瘤。然而，受限于传统蚕丝生物材料繁杂的制备流程，功能性单一，以及自身还存在的诸如细胞粘附力弱等缺陷，即使通过后期添加功能性物质可以得到改善，但是功能物质的来源和功效所带来的风险因素，以及生产成本的增加，限制了蚕丝生物材料的市场化，至今也少有获得临床批文以及定型产品。因此，系统探索蚕丝蛋白在仿生材料和生物医学材料等领域中的理论基础与关键技术迫在眉睫。
蚕丝纤维是一种蛋白纤维，主要由丝素和丝胶两类结构性蛋白构成，其中丝素蛋白约占丝纤维的75％，由丝素重链(fib-H chain)、丝素轻链(fib-L chain)和P25三个基因的编码产物按照6：6：1分子比例组成。丝胶蛋白约占丝纤维的25％，主要由丝胶I(Sericin1)，丝胶II(Sericin 2)以及丝胶III(Sericin 3)基因编码产物组成，其中丝胶I蛋白比重最大。随着家蚕基因组计划的实施，蚕丝合成分泌机制的解析，以及家蚕分子育种技术体系的建立，理论上可以对蚕丝蛋白编码基因进行遗传改良，从根本上改善蚕丝的缺陷，分子培育家蚕改良品系，提升蚕丝纤维的性能和用途，促进蚕丝在生物医疗等高端领域的应用。在前期的研究中，通过piggyBac转座酶成功将人血小板衍生生长因子(PDGF-BB)基因整合至家蚕基因组，利用家蚕丝腺生物反应器表达系统控制PDGF-BB特异在家蚕丝腺分泌表达至蚕丝中，遗传改良制备了含重组人源PDGF-BB的功能性蚕丝，并具有促进细胞增殖的功能。但是从从转PDGF-BB蚕丝中提取有活性PDGF-BB蛋白，并制备能够在组织工程学中应用的凝胶生物材料未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于转人血小板衍生生长因子基因蚕丝的蛋白丝胶凝胶；本发明的目的之二在于提供含转人血小板衍生生长因子的蛋白丝胶凝胶的制备方法；本发明的目的之三在于提供所述蛋白丝胶凝胶在制备促进细胞增殖的生物材料中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种基于转人血小板衍生生长因子基因蚕丝的蛋白丝胶凝胶，所述蛋白丝胶凝胶由转人血小板衍生生长因子基因家蚕的茧壳用含尿素的抽提试剂提取含人血小板衍生生长因子的丝胶蛋白溶液，用含尿素的透析液透析后诱导丝胶胶化反应，形成固态的丝胶水凝胶，再对丝胶水凝胶进行透析清除尿素，制得含转人血小板衍生生长因子的蛋白丝胶凝胶。
优选的，所述丝胶蛋白溶液制备过程中，抽提试剂各组分浓度如下：50mM Tris-HCl，8M urea，pH 7.0。
优选的，所述含尿素的透析液各组分的浓度如下：50mM Tris-HCl，4M urea，pH8.0。
优选的，所述提取含人血小板衍生生长因子的丝胶蛋白溶液的具体方法如下：将转人血小板衍生生长因子基因家蚕的茧壳，粉碎成粉末，以50mg/ml的浴比，利用抽提缓冲液在80℃水浴锅中萃取45min，然后用去除未溶解的蚕丝，再经过18000rpm、25℃离心30min，取上清，得到丝胶蛋白溶液；所述抽提缓冲液各组分浓度如下：50mM Tris-HCl，8Murea，pH 7.0；
所述透析为向丝胶蛋白溶液中加入相当于丝胶蛋白溶液体积1/4的pH 9.0、浓度为1M的Tris-HCl，装入截留分子量为3500Da的透析袋，放入透析液中在16℃中透析12h；所述透析液为各组分浓度如下：50mM Tris-HCl，4M urea，pH 8.0。
优选的，所述丝胶水凝胶进行透析的方法是使用PBS溶液中，在4℃下进行透析，每12h置换一次PBS溶液，共置换6次。
优选的，所述诱导丝胶的胶化反应为在4℃中放置至少24h。
优选的，所述蛋白丝胶凝胶的断裂强度为7.75±0.42kPa，压缩模量为74.91±2.9kPa。
优选的，所述蛋白丝胶凝胶的总丝胶蛋白浓度为0.512mg/mL，PDGF-BB蛋白的浓度为1.6μg/mL。
2、含转人血小板衍生生长因子的蛋白丝胶凝胶的制备方法，包括如下步骤：由转人血小板衍生生长因子基因家蚕的茧壳用含尿素的抽提试剂提取含人血小板衍生生长因子的丝胶蛋白溶液，用含尿素的透析液透析后诱导丝胶胶化反应，形成固态的丝胶水凝胶，再对丝胶水凝胶进行透析清除尿素，制得含转人血小板衍生生长因子的蛋白丝胶凝胶。
3、所述蛋白丝胶凝胶在制备促进细胞增殖的生物材料中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了基于转人血小板衍生生长因子基因蚕丝的蛋白丝胶凝胶，通过优化丝胶蛋白的提取条件以及蛋白丝胶凝胶的制备过程，提高了丝胶蛋白凝胶的力学性能，并且制得的蛋白丝胶凝胶PDGF-BB具有生物学活性，细胞相容性好，不具毒性，不会引起细胞凋亡，也不会引起显著的细胞炎症反应，能够在用于组织工程中用作促进细胞增殖活性的生物材料。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为PDGF-BB丝胶蛋白凝胶的制备过程图(A：转PDGF-BB蚕茧；B：转PDGF-BB蚕茧粉末；C：用8M尿素法提取PDGF-BB丝胶溶液；D：离心后的丝胶蛋白上清液；E：丝胶上清液固化成丝胶水凝胶状态；F：圆柱状的PDGF-BB丝胶水凝胶)。
图2为丝胶蛋白水凝胶中PDGF-BB含量的检测和评估(1：正常蚕丝水凝胶；2：不含有尿素的PDGF-BB丝胶水凝胶；3：含有4M尿素的PDGF-BB丝胶水凝胶；4：含有8M尿素的PDGF-BB丝胶水凝胶)。
图3为冻干丝胶蛋白水凝胶结构的SEM图像(A：冻干的PDGF-BB丝胶蛋白水凝胶的结构的SEM图像，比例尺为50μm；B：冻干的PDGF-BB丝胶蛋白水凝胶的结构的SEM图像，比例尺为20μm；C：冻干的WT丝胶水凝胶的结构的SEM图像，比例尺为50μm；D：冻干的WT丝胶水凝胶结构的SEM图像，比例尺为20μm)。
图4为丝胶蛋白水凝胶的FTIR光谱(A：WT和PDGF-BB丝胶蛋白水凝胶的FTIR光谱，从1000cm2到1800cm2，代表特征性酰胺I，II和III区域的三个强峰分别用虚线框表示；B：总结了由FTIR光谱中的酰胺I带计算的WT和PDGF-BB丝胶水凝胶的二级结构的图表(N＝5))。
图5为PDGF-BB丝胶水凝胶在PBS(pH 7.4)中的降解动力学。
图6为方案1制得PDGF-BB丝胶水凝胶的力学性能测试。
图7为方案2制得PDGF-BB丝胶水凝胶的力学性能测试(A:PDGF-BB丝胶水凝胶的机械性能测试；B:WT丝胶水凝胶的机械性能测试；C:丝胶水凝胶的断裂强度；)。
图8为PDGF-BB丝胶水凝胶中PDGF-BB蛋白的降解动力学(A：PDGF-BB丝胶水凝胶中PDGF-BB蛋白的降解动力学；B：在PBS中浸泡的丝胶水凝胶中PDGF-BB的检测；C：丝胶水凝胶中PDGF-BB的检测)。
图9为PDGF-BB从PDGF-BB丝胶水凝胶中的释放。
图10为水凝胶的生物相容性(A：NIH/3T3细胞在丝胶水凝胶上的生长状况；B：对接种于丝胶蛋白水凝胶表面的NIH/3T3细胞进行CCK-8测定。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，t测试)。
图11为水凝胶的促增殖活性(A：通过Edu掺入在丝胶蛋白水凝胶表面上的NIH/3T3s细胞检测增殖。与WT丝胶蛋白水凝胶相比，通过对比Hoechst 33342染料染色的NIH/3T3细胞核，增加的RFP荧光强度表明在PDGF-BB丝胶蛋白水凝胶和PDGF-BB标准品上Edu掺入增加；B：接种于PDGF-BB丝胶蛋白水凝胶和PDGF-BB标准品表面的NIH/3T3细胞进行CCK-8(细胞计数试剂盒-8)测定，WT丝胶水凝胶作为对照。测量以3个重复进行并独立重复三次。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与对照组相比，t检验)。
图12为水凝胶的细胞毒性检测。
图13为细胞炎性实验结果(A：肿瘤细胞坏死因子-α(TNF-α)的含量；B：Westernblotting检测细胞内iNOS的表达水平；C：对Western Blot印迹进行灰度分析)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明使用的材料如下：
细胞系：NIH/Swiss小鼠胚胎细胞系(NIH3T3)，小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(Raw264.7)。NIH3T3细胞与Raw264.7细胞均使用含有10％胎牛血清(Gibico)的DMEM培养基(Gibico)培养。
蚕丝材料：正常蚕丝D9L与转PDGF-BB蚕丝(Wang,F.,et al.,Advanced silkmaterial spun by a transgenic silkworm promotes cell proliferation forbiomedical application.Acta Biomater,2014.10(12):p.4947-55.)。
实施例1、转PDGF-BB蚕丝中丝胶蛋白的提取方法
将转PDGF-BB家蚕的茧壳(图1，A)经过液氮研磨成粉末(图1，B)，备用。以50mg/ml的浴比，利用抽提缓冲液(50mM Tris-HCl,8M urea,pH 7.0)在80℃水浴锅中萃取45min(图1，C)。萃取结束后先用纱布过滤，除去未溶解的蚕丝，再经过18000rpm、25℃离心30min，取上清，得到丝胶蛋白溶液。利用BCA法测定总蛋白浓度，结果显示，总的丝胶蛋白浓度为3.24mg/mL(图2)。
实施例2、PDGF-BB丝胶蛋白凝胶(SS-PDGF-BB)的制备方法
方案1：
将实施例1制得的丝胶蛋白溶液中加入相当于丝胶蛋白溶液体积1/4的浓度为1M的Tris-HCl(pH 9.0)，将50mL混匀的丝胶溶液装入透析袋(embranes,MWCO 3,500Da,Spectrum Laboratory,Inc,USA)，并在3L的透析缓冲液(50mM Tris-HCl,4M urea,pH 8.0)中，在16℃中透析12h(图1，D)。透析结束后，将丝胶溶液导入不同形态的磨具中，然后置于4℃中放置24-72h(图1，E)，利用低温诱导丝胶的胶化反应。收集形成固态的丝胶水凝胶，再次装入透析袋(embranes,MWCO 3,500Da,Spectrum Laboratory,Inc,USA)，置于PBS溶液中，在4℃环境下进行透析，测地清除凝胶中的尿素，每12h置换一次PBS溶液，共置换6次，最后可将固态水凝胶加工成圆柱体的形态(图1，F)。
检测制备过程中PDGF-BB在丝胶水凝胶中的装载率，当用8M尿素以50mg/mL的预比萃取出丝胶蛋白时，总的丝胶蛋白浓度为3.24mg/mL，其中PDGF-BB蛋白的浓度为12.2μg/mL；进一步透析，当以含有4M尿素的透析液透析后，总的丝胶蛋白浓度为1.86mg/mL，其中PDGF-BB蛋白的浓度为3.8μg/mL；当形成最终状态，成为不含尿素的水凝胶时，总的丝胶蛋白浓度为0.512mg/mL，其中PDGF-BB蛋白的浓度为1.6μg/mL。结果显示，不需通过额外的交联等手段，即可制备出固态的水凝胶，并含有外源蛋白PDGF-BB，该结果提供了一种开发蚕丝新型材料的新策略。
方案2
首先取干燥洁净的转PDGF-BB蚕茧，剪成0.25cm块状茧，冷冻研磨成粉状蚕茧。然后取粉碎后的茧壳于50mL离心管中，按照50mg/mL的浴比加入抽提缓冲液(50mM Tris-HCl,8M urea,pH 7.0)，80℃提取40min，每隔10分钟上下颠倒混匀数次。然后提取结束后先用纱布过滤，除去未溶解的丝素等残留物，再经过18000rpm、25℃离心15min，取上清。然后将离心好的上清液置于透析袋中，透析袋置于透析液(50mM Tris-HCl,pH 8.0)中，4℃透析5h，时间不宜过长，防止胶化。其次将透析完成的丝胶溶液置于具备一定形态的容器中，如多孔板、EP管等，4℃放置24h，使之胶化成为固态。最后将固态水凝胶置于PBS溶液中，于4℃摇床中置换凝胶中残留的尿素，每12h置换一次PBS溶液，共置换6次。
实施例3、PDGF-BB丝胶蛋白凝胶(SS-PDGF-BB)性能分析
(1)SS-PDGF-BB电镜观察(SEM)
将长与宽分别为1cm的SS-PDGF-BB进行冷冻干燥，对样品横截面进行镀金处理，利用扫描电镜(Supra 55sapphire,Zeiss)进行观察与拍照。所有实验在室温下进行，电压为3.0kV。每个实验的样品数为5个独立样品，每个样品拍3次，结果如图3所示。结果显示水凝胶呈层状，多孔和互连的微孔结构，对其孔径进行测量，PDGF-BB丝胶水凝胶的孔径为51.8±8.2μm，WT丝胶水凝胶的孔径为47.4±7.6μm。对其孔隙率进行测试分析，PDGF-BB丝胶水凝胶的孔隙率为72.7％，WT丝胶水凝胶的孔隙率为68.2％(表1)。
表1、PDGF-BB丝胶水凝胶和WT丝胶水凝胶的孔径和孔隙率
Figure BDA0002131358270000061
(2)SS-PDGF-BB红外光谱分析(FTIR)
将长与宽分别为1cm的SS-PDGF-BB进行冷冻干燥，取其内层作为检测样品。利用红外光谱分析仪(Thermo fisher scientific)进行测定。利用红外光谱分析仪(Thermofisher scientific)分析蚕丝样品在800-4000cm之间的红外吸收光谱图。每个样品测定30次，取平均值进行数据分析，结果如图4所示。结果显示，在WT和PDGF-BB丝胶水凝胶的FTIR光谱中，在1590-1699cm-1，1480-1570cm-1和1200-1310cm-1区域出现三个特征峰，其分别代表酰胺I(C＝O伸缩振动)，酰胺II(N-H弯曲)和酰胺III(C-N伸缩振动)，在1630cm-1，1520cm-1和1230-1cm处出现的吸收峰表明两种类型的丝胶水凝胶中主要为β-折叠结构(图4，A)。随后，对酰胺I进行分峰处理，结果发现PDGF-BB丝胶水凝胶酰胺I中β-sheet含量约占48.95％，β-turn含量约占42.37％，α-helix and random coil含量约占8.67％；WT丝胶水凝胶酰胺I中β-sheet含量约占48.12％，β-turn含量约占43.24％，α-helix and randomcoil含量约占8.64％(图4，B)。
(3)SS-PDGF-BB稳定性分析
在EP管中加入等量的水凝胶，用冷冻干燥机冷冻12h，称取EP管和水凝胶总重为原始重量，加入50μL PBS溶液浸泡凝胶，放置在37℃，在不同时间点从培养箱取出放置水凝胶的EP管，将PBS溶液吸干，再次冻干，称取EP管和水凝胶总重为最终重量。最终重量减去原始重量为损失的重量，绘制曲线图，结果如图5所示。结果显示，在为期42天的统计中，丝胶水凝胶在2天的时间内降解了16.46％，在14天的时间内降解了52.69％，最后共降解了61.84％，整体而言前两周是水凝胶的快速降解期，随后降解速度变慢，趋于稳定。
(4)SS-PDGF-BB水凝胶的力学性能测试
取直径0.9mm、高度0.11mm的正常蚕丝丝胶水凝胶与PDGF-BB蚕丝丝胶水凝胶圆柱体，置于载物台上，使用万能压缩仪检测力学性能，压缩速率为1mm/min，每个样品测定5次，进行数据分析，结果如图6所示。结果显示，PDGF-BB丝胶水凝胶的断裂强度(kPa)约为7.75±0.42kPa(n＝5)，压缩模量约为74.91±2.9kPa(n＝5)。
同时按相同方法以方案2的方法制备直径0.9mm、高度0.11mm的丝胶水凝胶圆柱体，检测其力学性能，结果显示PDGF-BB丝胶水凝胶的断裂强度(kPa)约为2.1±0.2(n＝3)，WT丝胶水凝胶的断裂强度(kPa)约为2.2±0.2；PDGF-BB丝胶水凝胶的压缩模量(kPa)约为2.48±0.19(图7)。
上述结果表明，使用方案1的方法制得的蛋白丝胶水凝胶的力学性能更好，其原因是使用含有4M尿素的透析液透析，经成胶后再置于PBS溶液中，在4℃环境下进行透析，测地清除凝胶中的尿素，成胶前含有4M尿素能够提升PDGF-BB丝胶水凝胶的断裂强度和压缩模量。而方案2中是在成胶前使用50mM Tris-HCl,pH 8.0透析，成胶中不含有尿素，其最后形成的凝胶断裂强度和压缩模量低于成胶后去除尿素的方法。
(5)水凝胶中PDGF-BB蛋白的稳定性分析
向EP管中加入等量的凝胶，加入50μL PBS溶液浸泡凝胶，置于37℃培养箱中，不同时间点取出样品，吸干PBS溶液，加入40μL含50mM Tris-HCl，8M尿素，pH 7.4的PBS溶液再次溶解使用，进行Elisa分析，并对其最终含量占初始含量的百分比进行计算(图8，A)。结果显示，在为期56天的统计中，水凝胶中的PDGF-BB蛋白在4天的时间内降解了38.29％，在14天的时间内降解了61.64％，最后共降解了63.18％，整体而言前两周是水凝胶中的PDGF-BB蛋白的快速降解期，随后水凝胶中的PDGF-BB蛋白降解速度变慢。另外对其通过Western Blot印迹进行检测(图8，B)，结果与Elisa结果一致，水凝胶中PDGF-BB蛋白前期会出现一定程度降解，之后趋于稳定。另一方面，不对水凝胶进行浸泡处理，对自然状态下水凝胶中PDGF-BB蛋白的稳定性通过Western Blot印迹进行了检测(图8，C)，结果显示自然状态下水凝胶中PDGF-BB蛋白也能长时间稳定存在，降解缓慢。
(6)水凝胶中PDGF-BB蛋白的释放特征分析
向EP管中加入等量(约1g)凝胶，将其浸入700μL PBS溶液中，置于37℃培养箱中，在不同的时间点之后，吸出全部PBS备用，再次加入700μL新鲜PBS溶液，利用ELISA测定PBS溶液中含有的PDGF-BB的含量，在ELISA实验中使用的抗体包括：一抗：anti-PDGF-BB抗体；二抗：anti-IgG兔抗体。浸提总时间为28天，累加后得到图9中的释放曲线。结果显示PDGF-BB丝胶蛋白水凝胶中的外源蛋白质PDGF-BB蛋白质将从凝胶中缓慢释放。在28天的时间之内，1g的PDGF-BB丝胶蛋白水凝胶中约23ng的PDGF-BB蛋白被释放出来。
(7)水凝胶的生物相容性
将NIH/3T3s细胞重悬于含有10％FBS的DMEM培养基中，并将相同量的细胞种植在紫外处理的含有PDGF-BB，WT凝胶表面和TCP细胞培养皿的凝胶表面上，在显微镜分别在1天，3天和7天观察细胞形态，并拍照记录，向96孔板每个要检测的细胞孔中加入10μL CCK-8试剂，于细胞培养箱中继续培养1h，450nm处检测吸光值，数值的大小可间接表示细胞数量，利用软件Graphpad Prism 6作图，并分析各组数据间的显著性，结果如图10中A所示。结果显示，NIH/3T3细胞具有正常的形态结构，呈饱满规则的梭形，随着时间的推移，细胞数量增多。CCK-8试剂盒(Beyotime)对细胞的数量分析结果如图10中B所示。结果显示，紫外处理后的PDGF-BB丝胶蛋白水凝胶以及WT丝胶蛋白水解凝胶表面的NIH/3T3细胞与接种于对照组TCP的表面的细胞都具有增殖的能力，细胞数量随着时间推移而增多，7天后长满水凝胶或者TCP表面，说明水凝胶不会引起细胞死亡，可以提供NIH/3T3细胞生长的环境，能够让NIH/3T3细胞良好的贴附生长。
(8)细胞增殖实验
为了检测PDGF-BB丝胶蛋白水凝胶的促细胞增殖活性，使用40μL含有约6.4μgPDGF-BB蛋白的PDGF-BB丝胶蛋白水溶液在96孔板的每个孔中制备凝胶，约0.92ng PDGF-BB蛋白可从水凝胶中释放出来以促进细胞增殖，将等量的1ng商业购买的PDGF-BB-std用作阳性对照。然后，将在0.5％血清的培养基中培养的NIH/3T3细胞接种在PDGF-BB丝胶蛋白水凝胶和WT(对照)丝胶蛋白水凝胶的表面上24小时，48小时和72小时。结果显示，接种在WT丝胶蛋白水凝胶上生长的NIH/3T3细胞生长情况较差。于此对比，接种于PDGF-BB丝胶蛋白水凝胶表面和含有PDGF-BB-std的WT丝胶蛋白水凝胶表面的NIH/3T3细胞的生长有所改善。培养48小时后，通过Edu染色NIH/3T3细胞，用于体外检测细胞增殖情况，结果显示接种在PDGF-BB丝胶蛋白水凝胶表面上的细胞发出的RFP荧光信号强于接种在WT丝胶蛋白水凝胶和正常培养的TCP板表面的细胞发出的RFP荧光信号(图11，A)。将细胞培养24小时，48小时和72小时后，我们使用CCK-8试剂盒测定NIH/3T3细胞在450nm处的吸光度，吸光度的大小可间接反映细胞数量的多少。培养24小时，48小时和72小时后，与WT丝胶蛋白水凝胶相比，PDGF-BB丝胶蛋白水凝胶和含有PDGF-BB-std的WT丝胶蛋白水凝胶的吸光度都会显著性增强；值得注意的是，24h时，PDGF-BB丝胶蛋白水凝胶和含有PDGF-BB-std的WT丝胶蛋白水凝胶的吸光度对比没有显著性差异；48h时，与含有PDGF-BB-std的WT丝胶蛋白水凝胶相比，PDGF-BB丝胶蛋白水凝胶的吸光度增强，出现显著性差异，P值＜0.01；72h时，与含有PDGF-BB-std的WT丝胶蛋白水凝胶相比，PDGF-BB丝胶蛋白水凝胶的吸光度更加强烈，出现显著性差异，P值＜0.001(图11，B)。这些结果表明人血小板衍生生长因子(PDGF-BB)功能化丝胶水凝胶具有促进细胞增殖的生物活性，并且与标准品相比，由于水凝胶中PDGF-BB蛋白的缓释，PDGF-BB丝胶水凝胶的促增殖活性会持续存在，维持长久有效的促增殖效果。
(9)细胞毒性实验
使用完全培养基铺板至水凝胶表面，待细胞贴壁后，培养24h，PDGF-BB水凝胶组为实验组，正常蚕丝水凝胶为阴性对照组，PDGF-BB标准品组作为阳性对照组。通过Live&Dead染色检测蚕丝对细胞生长有无毒性，共培养结束后，取干净的10ml离心管，量取10ml PBS，再向其中加入200μL B液及5μL A液，混匀后配成染色工作液，向每孔中加入100μL工作液，室温孵育30min，使用荧光显微镜观察并拍照。活细胞被钙黄绿素-AM染料染色，并发出强烈均匀的绿色荧光(ex/em～495nm/～515nm)，于绿色荧光下观察存活的细胞；死细胞被EthD-1染料染色并发出明亮的红色荧光(ex/em～495nm/～635nm)，红色荧光下观察死亡的细胞。结果显示，四组细胞均呈现绿色荧光，均无明显的死细胞，表明PDGF-BB丝胶蛋白水凝胶不具毒性，不会引起细胞凋亡，如图12所示。
(10)细胞炎性实验
使用完全培养基铺板至水凝胶表面，待细胞贴壁后，培养24h，PDGF-BB丝胶凝胶为实验组，正常丝胶凝胶为阴性对照组，PDGF-BB标准品组作为阳性对照组，通过Live&Dead染色检测蚕丝对细胞生长有无毒性。共培养结束后，取干净的10ml离心管，量取10ml PBS，再向其中加入200μLB液及5μL A液，混匀后配成染色工作液，向每孔中加入100μL工作液，室温孵育30min，使用荧光显微镜观察并拍照。于绿色荧光下观察存活的细胞，红色荧光下观察死亡的细胞。采用紫外照射的方法毒6h，备用，Raw264.7细胞用含有10％胎牛血清的DMEM培养基铺于消毒过的24孔板，每孔3×104个细胞，500μL体系，培养24h，收集细胞培养基测定肿瘤细胞坏死因子-α(TNF-α)的含量(图13，A)。结果显示，TCP空白板、PDGF-BB丝胶蛋白水凝胶、WT丝胶蛋白水凝胶、低剂量和高剂量LPS诱导的释放的TNF-α量分别为0.52ng/mL、1.23ng/mL、0.73ng/mL、4.28ng/mL、6.94ng/mL。由PDGF-BB丝胶蛋白水凝胶和WT丝胶蛋白水凝胶诱导的释放的TNF-α量显著低于由低剂量和高剂量LPS(阳性对照)诱导的释放的TNF-α量，与正常培养的Raw264.7细胞相比，培养基中的TNF-α含量无明显差异(如图13，A)。
利用含有抑制剂PMSF的RIPA裂解液收集细胞内蛋白样品测定诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达情况，通过Western blotting检测细胞内iNOS的表达水平，并对WesternBlot印迹进行灰度分析，结果显示低剂量和高剂量的LPS在Raw264.7细胞中诱导显著的iNOS表达，而PDGF-BB丝胶蛋白水凝胶和WT丝胶水凝胶仅诱导iNOS的轻微表达，与在TCP空白板正常培养的Raw264.7细胞相比，iNOS的表达水平无明显差异。这些结果表明PDGF-BB丝胶蛋白水凝胶不会引起显著的细胞炎症反应(图13，B和C)。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (8)

1.一种基于转人血小板衍生生长因子基因蚕丝的蛋白丝胶凝胶，其特征在于：所述蛋白丝胶凝胶由转人血小板衍生生长因子基因家蚕的茧壳用含尿素的抽提试剂提取含人血小板衍生生长因子的丝胶蛋白溶液，用含尿素的透析液透析后诱导丝胶胶化反应，形成固态的丝胶水凝胶，再对丝胶水凝胶进行透析清除尿素，制得含转人血小板衍生生长因子的蛋白丝胶凝胶；所述抽提试剂各组分浓度如下：50mM Tris-HCl，8M urea，pH 7.0；所述含尿素的透析液各组分的浓度如下：50mM Tris-HCl，4 M urea，pH 8.0。
2.根据权利要求1所述的蛋白丝胶凝胶，其特征在于：所述提取含人血小板衍生生长因子的丝胶蛋白溶液的具体方法如下：将转人血小板衍生生长因子基因家蚕的茧壳，粉碎成粉末，以50mg/ml的浴比，利用抽提缓冲液在80℃水浴锅中萃取45 min，然后用去除未溶解的蚕丝，再经过 18000rpm、25℃离心30 min，取上清，得到丝胶蛋白溶液；所述抽提缓冲液各组分浓度如下：50mM Tris-HCl，8M urea，pH 7.0；
所述透析为向丝胶蛋白溶液中加入相当于丝胶蛋白溶液体积1/4的pH 9.0、浓度为1M的Tris-HCl，装入截留分子量为3500 Da的透析袋，放入透析液中在16 ℃中透析12 h；所述透析液为各组分浓度如下：50mM Tris-HCl，4 M urea，pH 8.0。
3.根据权利要求1所述的蛋白丝胶凝胶，其特征在于：所述丝胶水凝胶进行透析的方法是使用PBS溶液中，在4℃下进行透析，每12h置换一次PBS溶液，共置换6次。
4.根据权利要求1所述的蛋白丝胶凝胶，其特征在于：所述诱导丝胶的胶化反应为在4℃中放置至少24 h。
5.根据权利要求1~4任一项所述的蛋白丝胶凝胶，其特征在于：所述蛋白丝胶凝胶的断裂强度为7.75±0.42 kPa，压缩模量为74.91±2.9 kPa。
6.根据权利要求1~4任一项所述的蛋白丝胶凝胶，其特征在于：所述蛋白丝胶凝胶的总丝胶蛋白浓度为0.512 mg/mL，PDGF-BB蛋白的浓度为1.6 μg/mL。
7.含转人血小板衍生生长因子的蛋白丝胶凝胶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：由转人血小板衍生生长因子基因家蚕的茧壳用含尿素的抽提试剂提取含人血小板衍生生长因子的丝胶蛋白溶液，用含尿素的透析液透析后诱导丝胶胶化反应，形成固态的丝胶水凝胶，再对丝胶水凝胶进行透析清除尿素，制得含转人血小板衍生生长因子的蛋白丝胶凝胶。
8.权利要求1~6任一项所述蛋白丝胶凝胶在制备促进细胞增殖的生物材料中的应用。
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