CN112870452A - 3d打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法 - Google Patents

3d打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种3D打印明胶‑羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法，其包括如下步骤：S1、设计支架模型转换成固定格式后导入3D打印机，并调整支架模型的相关参数；S2、将明胶和羟基磷灰石辐射灭菌后按照质量比混匀，再用去离子水配置成混合溶液；S3、将所述S2中的混合溶液通过S1中的3D打印机制作出3D水凝胶支架后，浸没于转谷氨酰胺酶溶液中进行二次交联。本发明将明胶和羟基磷灰石经3D打印技术制成的3D水凝胶支架，采用酶促反应二次交联后，具有合适的生物力学性能、良好的生物相容性、较高的孔隙率和适宜的孔径大小，具有三维多孔相互连通，而且比较稳定的结构，是一种具有极大应用前景的软骨组织工程支架材料。

Description

3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法
技术领域
本发明属于支架技术领域，具体涉及一种3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法。
背景技术
目前，因创伤、遗传因素、肥胖和炎症等所致的关节软骨缺损、退变，从而演变成致残性疾病骨关节炎现已成为临床上的常见病，严重影响患者的生活质量。随着人口老龄化的加剧、肥胖人群的增多及运动创伤的普遍化，预计到2025年关节软骨损伤所致的关节退变性疾病将成为第四大致残性疾病。
关节软骨因没有血供、神经组织及淋巴管道，自身修复能力非常受限，因此一旦发生损伤，多发生软骨的退化，而进展成骨关节炎。目前关节软骨缺损的修复方法有很多，主要有微骨折术、自体骨软骨移植术、异体软骨移植、自体软骨细胞移植术、细胞膜片技术、纳米支架材料等，但每一种方法都有其自身的局限，无法很好地满足临床的需求。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法，将明胶和羟基磷灰石经3D打印技术制成的3D水凝胶支架，采用酶促反应二次交联后，具有合适的生物力学性能、良好的生物相容性、较高的孔隙率和适宜的孔径大小，并具有三维多孔相互连通的结构。
本发明所采用的技术方案是：
一种3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法，其包括如下步骤：
S1、设计支架模型转换成固定格式后导入3D打印机，并调整支架模型的相关参数；
S2、将明胶和羟基磷灰石辐射灭菌后按照质量比混匀，再用去离子水配置成混合溶液；
S3、将所述S2中的混合溶液通过S1中的3D打印机制作出3D水凝胶支架后，浸没于转谷氨酰胺酶溶液中进行二次交联。
优选地，所述S1中设计支架模型采用CAD软件。
优选地，所述S1中的固定格式为STL格式。
优选地，所述S1中导入3D打印机具体为：导入3D打印机的驱动程序。
优选地，所述S1中的调整支架模型的相关参数，具体为：在3D打印机上设置模型的丝间距为1.5mm，层高为0.25mm，大小为20mm×20mm×10mm的长方体。
优选地，所述S2中采用Co60进行辐射灭菌。
优选地，所述S2中明胶和羟基磷灰石的质量比为10:0或10:5。
优选地，所述S2中的混合溶液为质量体积浓度为10％的纯明胶溶液和其中明胶质量体积浓度为10％、羟基磷灰石质量体积浓度为5％的明胶和羟基磷灰石混合溶液。
优选地，所述S3中转谷氨酰胺酶溶液为质量体积浓度为1％的转谷氨酰胺酶溶液。
优选地，所述S3中二次交联的时间长度为6小时。
与现有技术相比，本发明将明胶和羟基磷灰石经3D打印技术制成的3D水凝胶支架，采用酶促反应二次交联后，具有合适的生物力学性能、良好的生物相容性、较高的孔隙率和适宜的孔径大小，具有三维多孔相互连通，而且比较稳定的结构，是一种具有极大应用前景的软骨组织工程支架材料。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的一种3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法的流程图；
图2是本发明实施例1提供的一种3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法的3D打印明胶水凝胶支架及明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的大体观图；
图3是本发明实施例1提供的一种3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法的P3代脐血间充质干细胞形态图；
图4是本发明实施例1提供的一种3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法的3D打印明胶水凝胶支架及明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的孔隙率图；
图5是本发明实施例1提供的一种3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法的3D打印明胶水凝胶支架及明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的含水率图；
图6是本发明实施例1提供的一种3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法的3D打印明胶水凝胶支架及明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的溶胀性能图；
图7是本发明实施例1提供的一种3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法的3D明胶水凝胶支架及明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的红外光谱图；
图8是本发明实施例1提供的一种3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法的明胶水凝胶支架及明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的流变性能图；
图9是本发明实施例1提供的一种3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法的明胶柱状水凝胶支架应力-应变曲线图；
图10是本发明实施例1提供的一种3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法的打印明胶水凝胶支架及明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的应力-应变曲线图；
图11是本发明实施例1提供的一种3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法的3D打印水凝胶支架的微观结构；
图12是本发明实施例1提供的一种3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法的3D打印水凝胶支架浸提液细胞毒性试验图；
图13是本发明实施例1提供的一种3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法的3D打印水凝胶支架细胞增殖试验图；
图14是本发明实施例1提供的一种3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法的3D打印水凝胶支架死活细胞染色图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例1提供一种3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法，如图1所示，其包括如下步骤：
S1、设计支架模型转换成固定格式后导入3D打印机，并调整支架模型的相关参数；
S2、将明胶和羟基磷灰石辐射灭菌后按照质量比混匀，再用去离子水配置成混合溶液；
S3、将所述S2中的混合溶液通过S1中的3D打印机制作出3D水凝胶支架后，浸没于转谷氨酰胺酶溶液中进行二次交联。
这样，采用上述结构，本发明的3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法，利用明胶的温度敏感性的特性，即：30℃-45℃为溶液状态，0℃-30℃为凝胶状态，温度越低，水凝胶越稳定，将明胶和羟基磷灰石经3D打印技术制成的3D水凝胶支架，采用酶促反应二次交联后，具有合适的生物力学性能、良好的生物相容性、较高的孔隙率和适宜的孔径大小，具有三维多孔相互连通，而且比较稳定的结构，是一种具有极大应用前景的软骨组织工程支架材料。
优选地，所述S1中设计支架模型采用CAD软件。
这样，采用CAD软件为设计支架模型的软件，更便于用户设计立体的模型结构。
所述S1中的固定格式为STL格式。
这样，将设计好的支架模型转化成STL格式后，可以便于3D打印机制作出相应的立体水凝胶支架材料。
所述S1中导入3D打印机具体为：导入3D打印机的驱动程序。
这样，可以采用上普博源公司生产的3D打印机CPD1的驱动程序驱动3D打印机开始打印水凝胶支架材料。
所述S1中的调整支架模型的相关参数，具体为：在3D打印机上设置模型的丝间距为1.5mm，层高为0.25mm，大小为20mm×20mm×10mm的长方体。
这样，可以通过调整支架模型的丝间距、层高和大小设置打印出的水凝胶支架材料的规格。
所述S2中采用Co60进行辐射灭菌。
这样，可以采用Co60对明胶和羟基磷灰石进行辐射灭菌，从而使明胶和羟基磷灰石在使用前处于无菌状态。
所述S2中明胶和羟基磷灰石的质量比为10:0或10:5。
这样，可以制作出纯明胶溶液和明胶和羟基磷灰石质量的为10:5的溶液。
所述S2中的混合溶液为质量体积浓度为10％的纯明胶溶液和其中明胶质量体积浓度为10％、羟基磷灰石质量体积浓度为5％的明胶和羟基磷灰石混合溶液。
这样，可以制作质量体积浓度为10％的纯明胶溶液和其中明胶质量体积浓度为10％、羟基磷灰石质量体积浓度为5％的明胶和羟基磷灰石混合溶液，便于后期使用。
所述S3中转谷氨酰胺酶溶液为质量体积浓度为1％的转谷氨酰胺酶溶液。
这样，可以利用质量体积浓度为1％的转谷氨酰胺酶溶液催化转酰胺基反应，催化蛋白质赖氨酸上的e氨基和谷氨酸上的γ-酰胺基结合，从而导致蛋白质(或多肽子)之间发生共价二次交联，形成相应的聚合产物。
所述S3中二次交联的时间长度为6小时。
这样，可以采用6小时的二次交联时长，可以让水凝胶支架材料在转谷氨酰胺酶溶液内充分二次交联。
如图2所示，明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架呈乳白色，单纯的明胶水凝胶支架呈无色透明样；两种水凝胶支架均形态规则，孔径大小规整，明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架冻干后孔隙变化小，形态维持好；而明胶水凝胶支架冻干后孔隙略较前增大，但仍大小均匀。
具体实验验证
(1)、试剂与仪器
DMEM培养基、胎牛血清、双抗、胰蛋白酶(Gibco公司，美国)；明胶、羟基磷灰石(Sigma公司，美国)；转谷氨酰胺酶(BOMEI公司，中国)；CCK-8试剂盒、死活细胞染色试剂盒(Dojindo公司，日本)；电子秤(FANGRUI公司，中国)；真空冷冻干燥机(北京四环公司，中国)；电子万能试验机(SUNS公司，中国)；细胞培养箱(Thermo公司，美国)；高速冷冻离心机(Eppendorf公司，德国)；恒温水浴锅(上海精宏公司，中国)；荧光显微镜(Leica公司，德国)扫描电子显微镜(TESCAN公司，捷克)；酶标仪(Thermo公司，美国)；3D生物打印机CPD1(上普博源公司，中国)。
(2)脐血间充质干细胞的培养
取原代冻存的脐血间充质干细胞解冻复苏后，接种于25cm2培养瓶中，加入适量含10％(v/v)FBS(血清)、1％(v/v)双抗(青霉素100U/ml、链霉素100U/ml)的DMEM培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中培养，每3天换液1次，待细胞铺满瓶底90％时，胰蛋白酶消化传代，传至第3代时行细胞计数。
(3)脐血间充质干细胞复合3D打印水凝胶支架
将培养至P3代的脐血间充质干细胞用胰酶消化下来，1200rpm离心10min后，用完全DMEM培养基将细胞重悬，再用细胞计数板计数，将细胞密度调整至1.0×106/ml，之后将细胞以1.0×105/个的密度接种至交联完成的3D水凝胶支架材料上，加入适量培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中培养。
如图3所示，为倒置显微镜下观察到的P3代脐血间充质干细胞，标尺＝200μm，细胞生长情况良好，分布较规整，形态呈长梭形。
(4)孔隙率测定
将3D水凝胶支架用真空冷冻干燥机冻干48h后，用电子天平称量水凝胶支架干重M0；将比重瓶装满无水乙醇称重，记为M1；将冻干的水凝胶支架浸没于装有无水乙醇的比重瓶，真空箱抽至水凝胶支架无气泡溢出，待无水乙醇充分充盈水凝胶支架间隙后，加满比重瓶中的无水乙醇，称量其质量记为M2；取出充满无水乙醇的水凝胶支架，称量其质量记为M3。利用以下公式计算水凝胶支架材料孔隙率。每组重复3个样品。
孔隙率P(％)＝(M3-M0)/(M1-M2+M3)×100％
如图4所示，3D打印明胶水凝胶支架的孔隙率为(85.26±2.09)％；3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的孔隙率为(81.29±2.05)％。两组不同材料组成的3D打印水凝胶支架间的孔隙率差异无统计学意义(p＞0.05)。
(5)含水率测定
将转谷氨酰胺酶交联完成的3D水凝胶支架取出，用滤纸轻轻吸干材料表面液体，使用电子天平称量此时水凝胶支架的湿重(M4)，再将水凝胶支架材料置于真空冷冻干燥机冻干48h至恒重，取出水凝胶支架，用电子天平称量冻干水凝胶支架的干重(M5)，按一下公式计算水凝胶支架的含水率(Moisture Content)。每组重复测量3个样。
含水率MC＝(M4-M5)/M4×100％
如图5所示，为3D打印明胶水凝胶支架及明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的含水率图，3D打印明胶水凝胶支架的含水率(91.47±0.42)％明显大于3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架组的含水率(84.29±0.75)％(p＜0.05)。
(6)溶胀性能
3D打印水凝胶支架经冻干机冻干48h后称量水凝胶支架干重，记为Wd，再将冻干水凝胶支架浸没于37℃的去离子水中，分别于不同时间点取出，用滤纸轻轻擦干水凝胶支架表面残留的液体，用电子天平称量此时水凝胶支架的湿重，记录为Ww。根据以下公式计算水凝胶支架的溶胀率(ESR)。每组重复测量3个样品。
溶胀率ESR＝(Ww-Wd)/Wd×100％
如图6所示，溶胀是高分子聚合物在溶剂中吸收溶剂分子后发生体积膨胀的现象。从图6中，我们可以得知3D打印明胶水凝胶支架比3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的吸水溶胀能力要强；并且两组不同材料组成的3D水凝胶支架均在4小时左右达到溶胀平衡。其中纯明胶组成的3D打印明胶水凝胶支架比3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的溶胀率要大。
(7)红外光谱分析
将两组不同材料组成的经转谷氨酰胺酶溶液交联的3D打印水凝胶支架用真空冷冻干燥机冻干48小时，然后，切取适宜大小的干燥后的水凝胶支架样品置于红外光谱仪中测定材料的红外吸收特征。
如图7所示，其中，a为Gelatin/HAP，b为Gelatin，c为HAP，3D打印明胶水凝胶支架及3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的红外光谱图均具有蛋白质的特征振动模式。明胶水凝胶支架和明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架分别在3290cm-1和3300cm-1左右可见酰胺A带，说明氢键的存在。并且酰胺Ⅰ带分别出现在1638cm-1和1633cm-1左右，表明C＝O键的伸缩振动，间接表明明胶水凝胶材料中多肽的二级结构存在。而酰胺Ⅱ带分别出现在1550cm-1和1541cm-1左右，表明C-N键伸缩振动或者N-H键弯曲振动。酰胺Ⅲ带则分别出现在1239cm-1和1238cm-1左右，是C-N的吸收带，说明水凝胶支架还保持有明胶分子的三螺旋结构。除此之外，这两组水凝胶支架材料的红外光谱均在1450cm-1处有一组较强的吸收峰，表示存在肽键的顺式结构，进一步证明了明胶分子的存在。
羟基磷灰石的红外光谱图可以看出在560cm-1，605cm-1，965cm-1和1025cm-1处均有属于PO43-基团的特征性吸收峰存在，并且在明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架中也可以看到550cm-1和1030cm-1等处均有PO43-基团的特征吸收峰。
明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的红外光谱吸收特征是由明胶和羟基磷灰石的红外光谱所叠加形成，两者之间并未有新的化学键形成，说明明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架中的羟基磷灰石和明胶之间并没有发生化学反应。
(8)流变性能分析
本发明的流变性能测试是通过采用Kinexus旋转流变仪在震荡模式下进行的。首先更换流变仪20mm平板夹具，设置板间距为1mm、测量精度为1％，测试温度恒定在30℃，频率为1Hz，先用去离子水充分溶解明胶、羟基磷灰石材料，加入1％转谷氨酰胺酶溶液后，迅速将溶液搅拌均匀立即倒入流变仪平板上进行测试，监测材料的弹性模量及粘性模量随时间的变化情况，最后根据结果绘制分析模量-时间函数。
如图8所示，流变学性能分析可以帮助我们更进一步地了解水凝胶材料的粘弹性模量等力学特性在凝胶化过程的变化情况，并且可以反应水凝胶材料的凝胶点等性质。本发明采用了Kinexus旋转流变仪来测试水凝胶材料的流变性能。如图8所示，显示了水凝胶材料在凝胶化过程中弹性模量G’(即储能模量)和粘性模量G”(即损耗模量)随时间的变化情况。
对于单纯由明胶组成的水凝胶材料来说，其凝胶化的过程非常迅速。从图中可以看到明胶体系在初始阶段处于流体状态时弹性模量G’和粘性模量G”都非常小，但从第100s后弹性模量G’和粘性模量G”两者都迅速增大，并于147s左右两者相等，此时即为该材料的凝胶点；随着交联反应的进行，整个体系由流体向凝胶体转变，随着时间的延长弹性模量和粘性模量逐渐趋向一个稳定的平台期，并且弹性模量远大于粘性模量，此时这个水凝胶体系的交联反应已经基本饱和。
而对于由明胶、羟基磷灰石组成的体系来说，其凝胶化的过程相对缓和。可以看到明胶-羟基磷灰石体系在初始处于流体状态的阶段相对明胶体系要长一些，而且在凝胶化的过程也相对平缓，说明该体系的交联反应效率比较慢。随着时间的进行，明胶-和羟基磷灰石体系的弹性模量G’和粘性模量G”在大约622s时相等，达到了凝胶点。之后开始由流体状态向凝胶体状态转变，并逐渐趋向一个稳定的平台期，说明此时整个体系已经交联完毕，形成一个稳定的凝胶体。
3D打印技术的一个缺点是打印针头容易堵塞，尤其是打印的分辨率越高时打印针头堵塞的概率更大。由流变学测试我们了解到随着羟基磷灰石的加入，明胶体系凝胶化的过程会有所减缓。该特性有助于我们在3D打印过程中更好地在该体系凝胶化过程中对3D打印水凝胶支架的结构进行塑性设计。并且该特点可以在一定程度上克服打印材料在打印塑形过程中避免打印喷头的堵塞。
(9)力学性能检测
首先，分别将10％(w/v)明胶溶液同转谷氨酰胺酶浓度分别为0、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％的溶液按体积比10:1混匀，按标准制成圆柱状材料，再通过电子万能材料试验机对其进行压缩强度测试，加载速度4mm/min。然后，分别将两组不同的3D水凝胶支架分别通过电子万能材料试验机对其进行压缩强度测试，加载速度4mm/min。每组样重复测量3个样。
如图9所示，明胶柱状水凝胶支架的压缩模量随着转谷氨酰胺酶浓度的增加而升高；其中，经转谷氨酰胺酶交联的水凝胶支架压缩模量明显较未交联的明胶水凝胶支架材料强。但是，当转谷氨酰胺酶溶液浓度达到1.0％后，明胶水凝胶支架的压缩模量基本达到最大值；之后随着转谷氨酰胺酶浓度的升高，明胶柱状水凝胶支架的压缩模量增加的幅度很小，明胶水凝胶支架的力学强度的提升不明显；说明当转谷氨酰胺酶溶液浓度为1.0％，明胶材料中的氨基与酰胺基交联的位点基本饱和，所以当酶溶液的浓度继续增加时，明胶水凝胶支架材料的强度基本不再增加。
明胶材料经过转谷氨酰胺酶生物交联后，明胶水凝胶支架的力学强度得到明显的提升。这是因为转谷氨酰胺酶可以催化明胶中的赖氨酸的氨基同谷氨酸的酰胺基结合，发生多肽链之间的共价交联。相较于使用脱氢热处理导致的明胶蛋白结构破坏，紫外辐射交联不充分，以及使用戊二醛等化学交联方法所导致的残留具有细胞毒性的交联剂；使用转谷氨酰胺酶进行生物交联的方式，既可以避免有毒的化学交联剂的引入，保证了水凝胶支架的无毒和良好的生物相容性；同时能对明胶的交联位点进行充分的交联反应；并且交联用的转谷氨酰胺酶还可以通过换液或者冲洗的方式去除。
如图10所示，为3D打印明胶水凝胶支架及3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的应力-应变曲线。其中3D打印明胶水凝胶支架的压缩模量为(70.49432±0.17209)KPa；而3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架材料的压缩模量为(77.35179±0.15823)KPa。两组3D水凝胶支架的压缩模量差异有统计学意义，说明羟基磷灰石的添加可以提升水凝胶支架的力学强度。
(10)扫描电镜观察
切取4mm×4mm×3mm的水凝胶支架样品，用2.5％戊二醛溶液固定，之后按50％、70％、80％、90％、95％、100％的梯度浓度的乙醇溶液脱水，再用醋酸异戊酯置换，接着将水凝胶支架样品置于真空冷冻干燥机冻干48h，然后将水凝胶支架样品喷金镀膜后，再通过扫描电镜观察。
如图11所示，图A：3D明胶水凝胶支架大体观，标尺＝500μm；图B：3D明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架大体观，标尺＝500μm；图C：3D明胶水凝胶支架的断面结构，标尺＝50μm；图D：3D明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的断面结构，标尺＝50μm；图E：复合细胞的3D明胶水凝胶支架，标尺＝20μm；图F：复合细胞的3D明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架，标尺＝20μm。
从图A、B中可知3D打印明胶水凝胶支架及3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的孔径大小形态基本规则，大小为200-400μm不等；有利于细胞的黏附增殖。其中单纯由明胶组成的3D打印水凝胶支架的表面比较光滑，而3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的表面相对较粗糙。
从断面图可以看到两种不同的水凝胶支架内部均富含形状不规则、大小各异的微孔，微孔的孔隙大小为10-50μm不等。这些小孔可以为细胞提供丰富的附着表面积，有助于细胞的增殖、粘附、迁移等活动，并且这种多孔的结构也有利于营养物质的交换和细胞代谢废物的排出。同时，3D打印水凝胶支架这种三维多孔相互连通的结构对间充质干细胞的成软骨分化也起着至关重要的作用。
图E、F分别为复合了脐血间充质干细胞的3D打印明胶水凝胶支架及3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架。SEM显示脐血间充质干细胞可以贴附在这两种水凝胶支架上生长，并且，3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的表面还可以看到羟基磷灰石结晶。
(11)3D打印水凝胶支架的细胞毒性试验
浸提液提取：按GB/T 16886.12-2005《医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品》标准，以含10％FBS的完全细胞培养基为浸提介质，将打印的3D多孔水凝胶支架以0.1g/ml的浸提比例行浸提液的制备；置于37℃培养箱中浸提72h。
将P3脐血间充质干细胞以1×104个/孔的密度接种至96孔板，之后将96孔板置于37℃、5％CO2的培养箱中培养24h。将制备的浸提液分别稀释成原浓度的25％、50％、75％，然后依照浓度梯度设置浸提液浓度为0、25％、50％、75％、100％，并将上述不同浓度的浸提液以换液形式替换原96孔板培养基，100μl/孔，对照组直接更换完全培养基，之后将上述96孔板置于培养箱中培养24h，24h后取出96孔板加入配置好的CCK-8溶液(100μl/孔，CCK-8：DMEM＝1:10)，37℃下孵育4小时后，用酶标仪测定吸光度。
如图12所示，3D打印水凝胶支架浸提液细胞毒性试验图，*表示p＜0.05，说明两组结果的差异有统计学意义，用体外细胞毒性试验的方法，从细胞水平上评价生物材料的生物相容性是目前国内外基础研究中最常用的方式之一。而利用材料浸提液来评价生物材料细胞毒性是国内医疗器械生物学评价的标准之一，并且该方法简便易行。如图12所示，脐血间充质干细胞在3D打印明胶水凝胶支架和3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架两种不同材料组成的浸提液中培养24小时后的细胞相对活性均保持在75％以上。根据细胞毒性分级标准，3D打印明胶水凝胶支架和3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的细胞毒性均为1级，属于无细胞毒性；说明这两种3D水凝胶支架的生物相容性优良。
其中，无论稀释前后，脐血间充质干细胞在明胶水凝胶支架的浸提液中的细胞相对活性均要比在明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架组的高，而且两组间的差别有统计学意义。
(12)CCK-8细胞增殖试验
将P3代脐血间充质干细胞分别接种至直径为15mm，厚2.5mm的3D打印水凝胶支架上，细胞接种密度为1×105/个，对照组直接将细胞接种至48孔板上(1×105/孔)，每组重复3个样；将接种了脐血间充质干细胞的复合水凝胶支架置于5％CO2、37℃培养箱中培养，每3天换一次培养基。分别于接种后1d，3d，7d，按说明书配置培养基：CCK-8＝10:1的CCK-8染液，每个样加入400ul混合液，37℃下孵育2小时；孵育完成后取出CCK-8染液至96孔板中，选定450nm的波长，用酶标仪测定吸光值。
如图13所示，为3D打印水凝胶支架细胞增殖试验图，*表示p＜0.05，说明两组结果的差异有统计学意义，**表示p＜0.01，说明两组结果的差异有显著的统计学意义，脐血间充质干细胞在两种不同材料组成的3D打印水凝胶支架上均可增殖生长，而且细胞在两种不同3D水凝胶支架上的吸光度随着时间的延长而不断增高，说明脐血间充质干细胞在两种不同的三维水凝胶支架上是不断增殖的；但在两组3D打印水凝胶支架的增殖情况均较对照组缓慢。第1天细胞在明胶水凝胶支架上的黏附增殖情况比在明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架上慢，但到了第7天时细胞在明胶水凝胶支架上的增殖情况要优于明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架。说明脐血间充质干细胞在明胶水凝胶支架上的增殖速度要比在明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架上快。
(13)细胞死活染色
将P3代脐血间充质干细胞进行细胞计数，调整细胞密度至1×106/ml；制备直径为20mm、厚1mm的柱状水凝胶支架，每个水凝胶支架以1×105个细胞的密度接种上述细胞，将水凝胶支架置于5％CO2、37℃细胞培养箱中，每3天换一次培养基，分别培养至1d、4d、7d后取出水凝胶支架行细胞死活染色。配置Calcein AM、PI终浓度分别为2μM、3μM的染液，用上述染液对复合水凝胶支架避光下染色，37℃下孵育30min后，荧光显微镜拍照。
如图14所示，为3D打印水凝胶支架死活细胞染色图，标尺＝500μm，3D打印明胶水凝胶支架组比3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架组的透光性能要好。在接种细胞的第1天，两组水凝胶支架上黏附的细胞数量均较少，且形态多呈现圆形，细胞主要聚集在3D打印水凝胶支架的孔内，只有少量的细胞黏附在水凝胶支架的孔径边缘上。到了第4天，3D打印明胶水凝胶支架上黏附增殖的细胞增多，且仍以附着在孔周边缘为主；3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架上的细胞附着在孔周的数量也比第1天有所增多，部分细胞迁移、贴附在下层的水凝胶支架上，呈现条状分布，但在孔周边缘附着分布情况不如明胶组的均匀。第7天时，两种3D水凝胶支架上的活细胞数量都比之前明显增多，并且细胞逐渐向水凝胶支架内部迁移、增殖；其中3D打印明胶水凝胶支架组的细胞密度比3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架组要高，并且分布也比较均匀，基本上整个3D明胶水凝胶支架上都有活细胞附着生长，而不仅仅是局限在孔洞边缘。而3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架组的活细胞也开始从孔洞边缘向水凝胶支架内部生长延伸，但仍以孔周为主。无论是增殖的数量还是迁移分布情况上明胶水凝胶支架均要优于明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架。结合上述情况，我们认为两种3D打印水凝胶支架均有良好的生物相容性，均有助于细胞的增殖、迁移及黏附等活动；并且明胶水凝胶支架比明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架更有助于脐血间充质干细胞的黏附增殖。
(14)统计学分析
采用SPSS 19.0进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示；若各组数据服从正态分布及方差齐性，则组间比较采用单因素方差分析；如果各组数据不满足正态分布以及方差不齐时，采用Kruskal-Wallis检验；当p＜0.05时，则认为差异有统计学意义。
本发明的3D打印技术是增材制造技术中的一种，能实现材料和种子细胞在空间上的精准装配，完成个性化水凝胶支架的构建。理想的组织工程水凝胶支架应该满足如下条件：具有优异的生物相容性、适宜的生物降解性以允许胞外基质和天然组织的替代、适合的孔径和孔隙率便于氧气、养分和代谢废物的交换扩散、和软骨组织相似的机械性能、无毒无免疫原性、可塑性强便于加工塑形。本发明将明胶及羟基磷灰石，经过3D打印技术构建的复合水凝胶支架，采用酶促反应的交联方式，具有合适的力学性能、良好的生物相容性、较高的孔隙率和适宜的孔径大小，具有三维多孔相互连通的结构，是一种具有极大应用前景的软骨组织工程水凝胶支架材料。本发明为进一步构建组织工程化软骨水凝胶支架的实验研究提供了一定的理论基础。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法，其特征在于，其包括如下步骤：
S1、设计支架模型转换成固定格式后导入3D打印机，并调整支架模型的相关参数；
S2、将明胶和羟基磷灰石辐射灭菌后按照质量比混匀，再用去离子水配置成混合溶液；
S3、将所述S2中的混合溶液通过S1中的3D打印机制作出3D水凝胶支架后，浸没于转谷氨酰胺酶溶液中进行二次交联。
2.根据权利要求1所述的3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法，其特征在于，所述S1中设计支架模型采用CAD软件。
3.根据权利要求2所述的3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法，其特征在于，所述S1中的固定格式为STL格式。
4.根据权利要求3所述的3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法，其特征在于，所述S1中导入3D打印机具体为：导入3D打印机的驱动程序。
5.根据权利要求4所述的3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法，其特征在于，所述S1中的调整支架模型的相关参数，具体为：在3D打印机上设置模型的丝间距为1.5mm，层高为0.25mm，大小为20mm×20mm×10mm的长方体。
6.根据权利要求5所述的3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法，其特征在于，所述S2中采用Co60进行辐射灭菌。
7.根据权利要求6所述的3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法，其特征在于，所述S2中明胶和羟基磷灰石的质量比为10:0或10:5。
8.根据权利要求7所述的3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法，其特征在于，所述S2中的混合溶液为质量体积浓度为10％的纯明胶溶液和其中明胶质量体积浓度为10％、羟基磷灰石质量体积浓度为5％的明胶和羟基磷灰石混合溶液。
9.根据权利要求8所述的3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法，其特征在于，所述S3中转谷氨酰胺酶溶液为质量体积浓度为1％的转谷氨酰胺酶溶液。
10.根据权利要求1-9任一项所述的3D打印明胶-羟基磷灰石复合水凝胶支架的制作方法，其特征在于，所述S3中二次交联的时间长度为6小时。
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