CN107641204A - 一种富含巯基的角蛋白及其促进丝素蛋白快速成胶、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富含巯基的角蛋白及其促进丝素蛋白快速成胶、制备方法及其在护肤用品、人造皮肤、敷料或受损组织的修复与重建中的应用。所述制备方法包括富含巯基角蛋白溶液的提取、天然丝素蛋白溶液的提取、角蛋白/丝素蛋白水凝胶的制备等步骤。本发明利用携带大量巯基的角蛋白促进丝素蛋白溶液快速凝胶化，这类角蛋白和丝素蛋白溶液混合后在氨基酸大分子链与氢键的共同作用下，促使β‑微晶构成三维网络结构，从而加速水凝胶的形成，所得水凝胶具有良好的力学性质。
Description
技术领域
本发明涉及一种富含巯基的角蛋白及其促进丝素蛋白快速成胶、制备方法及其应用，特别涉及一种利用还原剂打断角蛋白大分子中的二硫键获得富含巯基的角蛋白溶液，再与丝素蛋白溶液混合而快速成胶、制备方法及其应用。
背景技术
天然高分子形成的水凝胶由于其高含水量、良好的生物相容性和丰富的来源等优点引起学者们的关注，尤其以丝素蛋白为主要成分的水凝胶更被视为有潜力的生物材料。
丝素蛋白自身富含的β-折叠结构可以形成三维网络结构的水凝胶，但凝胶化的过程较长，通常需采用改变外界条件的物理方式或加入交联剂等化学方式进行调控。如专利CN101502670A、CN104107681A和文献“Sonication-induced gelation of silk fibroinfor cell encapsulation”等均采用超声波震荡处理的方式在短时间内将丝素蛋白溶液转变为水凝胶，专利CN103981561A将丝素蛋白通过电泳作用在纳米孔径的屏障膜上快速自组装成水凝胶。
这些物理方式促进丝素蛋白分子链间的静电、氢键作用以及分子链的缠绕，从而加速溶液形成凝胶，但无法准确控制胶凝化的时间，因此更多的研究还是借助化学交联剂或高聚物的促凝作用来加速丝素蛋白的凝胶化过程。如专利CN101531745A在丝素蛋白溶液中引入交联剂N,N’-二甲基双丙烯酰胺、专利102836465A采用甘油醚类的交联剂、专利CN103877617A采用二价金属离子交联剂和羧基活化交联剂双交联、专利CN103951831A采用醛类交联剂加速丝素蛋白溶液转变为水凝胶，专利CN101864177A、CN103289107A利用酸/聚乙二醇促胶凝剂、专利CN103819694A加入N-月桂酰肌氨酸钠作为促凝剂促进丝素蛋白溶液胶凝化的过程，诸如此类的研究很多，在此不作一一赘述，但化学交联剂的加入对材料本身的生物相容性具有一定影响，限制了所得水凝胶在生物医用领域的应用。多糖、纤维素等高聚物的加入也可促进丝素蛋白基水凝胶的形成，专利CN104548200A中的羧甲基化高支化多糖、CN104069120A中的羟丙基纤维素、专利CN104327282、CN104327283A中的壳聚糖、葡萄糖等多元聚合物都起加速了水凝胶的产生。
发明内容
本发明所要解决的问题是：单纯的丝素蛋白溶液在无交联剂和外界刺激作用下凝胶化速度缓慢，且交联剂不利于丝素蛋白的生物相容性的问题。
为了解决上述问题，本发明的基本原理是利用大量还原剂打断角蛋白大分子中的二硫键获得富含巯基的角蛋白溶液，再与丝素蛋白溶液混合后静置过程中，角蛋白大分子与丝素大分子通过氢键作用建立连接，并在β，分子链折叠的基础上形成三维网络结构，从而迅速得到水凝胶。所得水凝胶具有良好的力学性质，可应用于护肤用品、人造皮肤、敷料或受损组织的修复与重建等领域。
本发明的一个具体技术方案是提供了一种富含巯基的角蛋白及其促进丝素蛋白快速成胶的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
步骤1）：富含巯基角蛋白溶液的提取：将角蛋白纤维清洗干净、晾干，并剪成1~2cm小段，加入含浓度为0.1~0.5M的还原剂、浓度为2~8M的溶解剂和0.2~0.5M的十二烷基硫酸钠的混合溶液中搅拌溶解6-12小时，羊毛溶解完全后经离心、透析、浓缩、过滤过程得到富含巯基基团的角蛋白溶液；
步骤2）：天然丝素蛋白溶液的提取：将天然蚕丝纤维经脱胶、溶解、透析、过滤工艺得到丝素蛋白水溶液；
步骤3）：角蛋白/丝素蛋白水凝胶的制备：将步骤1）制得的角蛋白溶液与步骤2）制得的丝素蛋白水溶液混合，加入增塑剂并搅拌均匀后移至任意形状和尺寸的聚四氟乙烯模具中静置1~4小时，恒温恒湿条件下即可得到角蛋白/丝素蛋白水凝胶。
优选地，所述步骤1）中的角蛋白纤维为羊毛、鸡毛、人发、兔毛、驼毛、牦牛毛等动物毛发，可采用废弃的毛发；溶解液的浴比为（1~4）：20。
优选地，所述步骤1）中还原剂采用巯基乙醇、二硫苏糖醇或硫化钠；溶解剂采用尿素或氢氧化钠。
优选地，所述步骤1）中角蛋白纤维的溶解条件为温度50~80℃，转子的搅拌速度60~100转/分钟。
优选地，所述步骤2）中脱胶所用的脱胶剂为质量浓度0.5%的碳酸氢钠溶液；溶解所用的溶解剂为浓度9.3M的溴化锂溶液。
优选地，所述步骤3）中角蛋白溶液与丝素蛋白水溶液的浓度相同，均为30~100mg/mL，两者的体积比为（0.25~4）：1。
优选地，所述步骤3）中的增塑剂采用乙醇、丙三醇和聚乙二醇中的任意一种或几种，其添加量为基数的1~30mg/mL；形成角蛋白/丝素蛋白水凝胶的环境条件为温度20-50℃，相对湿度为50~80%。
本发明的另一个具体技术方案是提供了一种采用上述富含巯基的角蛋白及其促进丝素蛋白快速成胶的制备方法制备的角蛋白/丝素蛋白水凝胶。
优选地，所述水凝胶的剪切模量为0.01~10mPa。
本发明的第三个具体技术方案是提供了一种上述角蛋白/丝素蛋白水凝胶在护肤用品、人造皮肤、敷料或受损组织的修复与重建中的应用。
本发明提供了一种利用携带大量巯基的角蛋白促进丝素蛋白溶液快速凝胶化的制备方法，这类角蛋白和丝素蛋白溶液混合后在氨基酸大分子链与氢键的共同作用下，促使β-微晶构成三维网络结构，从而加速水凝胶的形成。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1）以角蛋白的巯基基团的氢键作用和α-大分子链促进混合蛋白溶液中三维网络结构的形成，从而快速获得角蛋白/丝素蛋白水凝胶；
2）该水凝胶的主要成分均为天然高分子蛋白，无毒无刺激，在生物医用领域具有更好的适用性；
3）制备方法简便、有效，为短时间内完成水凝胶的制备并达到一定的效果提供了创新且实用的技术方法。
附图说明
图1为实施例1制得的羊毛角蛋白/丝素蛋白片状水凝胶多角度的实物照片；
图2为实施例2制得的羊毛角蛋白/丝素蛋白溶液-凝胶状态的流变曲线；
图3为实施例3制得的人发角蛋白/丝素蛋白水凝胶压缩应力-应变曲线。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例1
一种富含巯基的角蛋白及其促进丝素蛋白快速成胶的制备方法：
称取5g洗净的羊毛剪碎后加入50ml包含浓度为0.1M的硫化钠、浓度为8M的尿素和0.2M的十二烷基硫酸钠的混合溶液中以60转/分钟的转速搅拌溶解7个小时，待羊毛反应完全经过过滤、透析、浓缩并稀释后制备浓度为携带大量巯基的浓度为50mg/mL的羊毛角蛋白水溶液。称取10g剪成碎片的蚕茧放入2L浓度为0.5%的碳酸氢钠溶液中，煮沸30min并重复两次，脱去蚕丝的丝胶并用去离子水清洗4次。称取5g晾干后的脱胶丝放入30mL浓度为9.3M的溴化锂溶液中，置于50℃条件下溶解4个小时以后取出后用分子量为3500D的透析袋中进行透析，稀释、过滤以后得到质量浓度为50mg/mL的纯丝素蛋白溶液。
将浓度为50mg/mL的角蛋白溶液和丝素蛋白溶液分别用移液管量取200μL和800μL，充分混合均匀后移入聚四氟乙烯板，在温度50℃，相对湿度50%的恒温恒湿箱中静置一个小时，用镊子小心取出，即得白色不透明的角蛋白/丝素蛋白片状水凝胶，如图1所示。
实施例2
一种富含巯基的角蛋白及其促进丝素蛋白快速成胶的制备方法：
称取4g洗净的羊毛剪碎后加入60ml包含浓度为0.2M的巯基乙醇、浓度为8M的尿素和0.3M的十二烷基硫酸钠的混合溶液中以50转/分钟的转速搅拌溶解4个小时，待羊毛反应完全经过过滤、透析、浓缩并稀释后制备浓度为40mg/mL的羊毛角蛋白水溶液。称取6g晾干后的脱胶丝放入30mL浓度为9.3M的溴化锂溶液中，置于60℃条件下溶解6个小时以后取出后用分子量为3500D的透析袋中进行透析，稀释、过滤以后得到质量浓度为40mg/mL的纯丝素蛋白溶液。
将浓度为50mg/mL的角蛋白溶液和丝素蛋白溶液分别用移液管量取400μL和600μL，充分混合均匀后置于流变仪的样品台上，以恒定的频率1Hz、0.1%的剪切应变对角蛋白/丝素蛋白溶液的凝胶化过程进行测试，得到水凝胶的流变曲线，可知2小时以内已形成溶液-凝胶的转变过程，且水凝胶的剪切模量约9kPa，如图2所示。
实施例3
将洗净的废弃人发用4M的氢氧化钠和0.2M的巯基乙醇进行搅拌溶解，经过滤、透析、浓缩和稀释以后得到浓度为50mg/mL的人发角蛋白水溶液。称取10g剪成碎片的蚕茧放入2L浓度为0.5%的碳酸氢钠溶液中，煮沸30min并重复两次，脱去蚕丝的丝胶并用去离子水清洗4次。称取5g晾干后的脱胶丝放入30mL浓度为9.3M的溴化锂溶液中，置于50℃条件下溶解4个小时以后取出后用分子量为3500D的透析袋中进行透析，稀释、过滤以后得到质量浓度为50mg/mL的纯丝素蛋白溶液。
将浓度为50mg/mL的角蛋白溶液和丝素蛋白溶液分别用移液管量取600μL和400μL，充分混合均匀后移入柱状模具中，在温度40℃，相对湿度70%的恒温恒湿箱中静置一个小时，用镊子小心取出，即得柱状水凝胶，用Instron拉力仪对其进行压缩测试，可得水凝胶的压缩应力-应变曲线，如图3所示。
Claims (10)
1.一种富含巯基的角蛋白及其促进丝素蛋白快速成胶的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
步骤1)：富含巯基角蛋白溶液的提取：将角蛋白纤维清洗干净、晾干，并剪成1～2cm小段，加入含浓度为0.1～0.5M的还原剂、浓度为2～8M的溶解剂和0.2～0.5M的十二烷基硫酸钠的混合溶液中搅拌溶解6-12小时，羊毛溶解完全后经离心、透析、浓缩、过滤过程得到富含巯基基团的角蛋白溶液；
步骤2)：天然丝素蛋白溶液的提取：将天然蚕丝纤维经脱胶、溶解、透析、过滤工艺得到丝素蛋白水溶液；
步骤3)：角蛋白/丝素蛋白水凝胶的制备：将步骤1)制得的角蛋白溶液与步骤2)制得的丝素蛋白水溶液混合，加入增塑剂并搅拌均匀后移至任意形状和尺寸的聚四氟乙烯模具中静置1～4小时，恒温恒湿条件下即可得到角蛋白/丝素蛋白水凝胶。
2.如权利要求1所述的富含巯基的角蛋白及其促进丝素蛋白快速成胶的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的角蛋白纤维为羊毛、鸡毛、人发、兔毛、驼毛、牦牛毛；溶解液的浴比为(1～4)∶20。
3.如权利要求1所述的富含巯基的角蛋白及其促进丝素蛋白快速成胶的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中还原剂采用巯基乙醇、二硫苏糖醇或硫化钠；溶解剂采用尿素或氢氧化钠。
4.如权利要求1所述的富含巯基的角蛋白及其促进丝素蛋白快速成胶的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中角蛋白纤维的溶解条件为温度50～80℃，转子的搅拌速度60～100转/分钟。
5.如权利要求1所述的富含巯基的角蛋白及其促进丝素蛋白快速成胶的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中脱胶所用的脱胶剂为质量浓度0.5％的碳酸氢钠溶液；溶解所用的溶解剂为浓度9.3M的溴化锂溶液。
6.如权利要求1所述的富含巯基的角蛋白及其促进丝素蛋白快速成胶的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中角蛋白溶液与丝素蛋白水溶液的浓度相同，均为30～100mg/mL，两者的体积比为(0.25～4)∶1。
7.如权利要求1所述的富含巯基的角蛋白及其促进丝素蛋白快速成胶的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中的增塑剂采用乙醇、丙三醇和聚乙二醇中的任意一种或几种，其添加量为基数的1~30mg/mL；形成角蛋白/丝素蛋白水凝胶的环境条件为温度20-50℃，相对湿度为50~80%。
8.一种采用权利要求1-7任意一项所述的富含巯基的角蛋白及其促进丝素蛋白快速成胶的制备方法制备的角蛋白/丝素蛋白水凝胶。
9.如权利要求1所述的角蛋白/丝素蛋白水凝胶，其特征在于，所述水凝胶的剪切模量为0.01～10mPa。
10.一种权利要求9或10所述的角蛋白/丝素蛋白水凝胶在护肤用品、人造皮肤、敷料或受损组织的修复与重建中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20180130 |