CN108948171B - 高分子量丝素蛋白链段的制备方法 - Google Patents

高分子量丝素蛋白链段的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高分子量丝素蛋白多肽链段的制备方法，采用蚕茧壳脱胶溶解后，加入还原剂还原丝素蛋白中半胱氨酸，将丝素蛋白中的H链（390kDa）和L链（25kDa）之间的二硫键打开，并且在氮气保护的还原性环境下，采用半透膜分离方法，透析去除低分子量部分的丝素蛋白多肽链，获得丝素蛋白中的H链成分。本发明的这种方法分离效率高，不会影响丝素蛋白多肽的生物活性，丝素蛋白中的H链成分，免疫原性低，可用于作为生物医用材料，具有巨大的市场前景和发展潜能。

Description

高分子量丝素蛋白链段的制备方法
技术领域
本发明涉及蛋白提纯领域，特别地，是一种高分子量丝素蛋白链段萃取和制备的有效方法。
背景技术
丝素蛋白是一种亚单元结构，在构成上包括一条名为H链(390kDa)的长链，一条名为L链(25kDa)的短链和糖蛋白链P25（30kDa），其中H链依靠二硫键与L链相连。依靠疏水作用，每6个H-L链的集合与一个P25糖蛋白组合形成一个基本单元，比例为H:L:P25 = 6:6:1。在组成上包括18种氨基酸，其中以甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸为主，约占总含量的80%。丝素蛋白作为一种天然高分子材料，具有非常优异的性能。例如丝素蛋白具有良好的生物相容性、生物降解性、良好的力学性能等，可以被广泛应用于培养细胞，在组织工程中，用以维持具有预制形状的新生组织的力学形态。丝素蛋白的三条多肽链中，H链疏水性较强，容易形成β-折叠结构，结晶性较强；而其他两条多肽链则亲水性较强，容易形成水凝胶。如果能够分离这两种多肽，获得小分子量多肽部分，则能够获得亲水性丝素蛋白多肽链，用于制备亲水性材料。
目前对于丝素蛋白不同链段的分离的报道较少。方法大致为：（1）改变脱胶方法：增加Na2CO3的用量，打断丝素蛋白分子链段之间分子作用力（2）溶解方法CaCl2-乙醇三元溶液体系溶解，酸、碱、酶水解；（3）层析分离技术：使用不同分子量的葡聚糖分子筛对目的蛋白进行筛选；以上方法虽然具有一定的可行性，但是局限性也比较大。例如：1、改变脱胶工艺和溶解方式的方法，其已经将丝素蛋白分子链段打散，也就是说H链段、L链段和P25链段已经断裂开来，变得不再完整，分子量分布较宽，没有进行真正意义上的分离纯化，所得到的不同分子量链段，也无法知晓其原属于哪一段分子链。2、采用凝胶层析过滤的方法，对于实验员操作水平要求高，葡聚糖凝胶分子筛容易堵塞，产量低，分离效率慢，再者说，如果不将半胱氨酸形成的二硫键断裂开，丝素蛋白中的重链和轻链不会分开，在层析过程中就不会产生速度差，也就导致重链会连接轻链一起层析出来，不会达到真正意义上的分离。
在本发明之前，许多研究人员都是增大Na2CO3的用量或者使用CaCL2-乙醇三元溶液体系将丝素蛋白打散，获得分子量分布宽连续的混合溶液，在对溶液进行分离，极大地破坏了丝素蛋白分子链段的完整性。例如：颜若曦等人《一种中分子量水溶性丝素蛋白的制备》，利用CaCL2-乙醇-水体系对丝素蛋白降解，再通过凝胶过滤层析方法来获得50 kDa左右的丝素蛋白分子链段，由于CaCL2-乙醇-水体系溶解过程中，丝素分子链段已被打散，再使用层析柱的方法获得50 kDa左右的丝素蛋白分子，此方法已完全破坏丝素蛋白分子链的完整性。公开号为CN107722116A中国发明专利提供了一种小分子量的丝素肽的分离方法，采用多种类别的葡聚糖分子筛，建立分子筛柱对丝素多肽进行梯度分离，但此方法操作步骤繁琐，对于操作人员要求高，难以获得完整的高分子量丝素蛋白。
发明内容
针对上述存在的不足，本发明的目的提供一种高分子量丝素蛋白链段的制备方法，能够保证丝素蛋白高分子链段的完整性且可以快速大批量获得高分子量丝素蛋白，效率高，产量大。
为了实现上述发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种高分子量丝素蛋白多肽链段的制备方法，包括以下步骤：
（1）脱胶：将原料蚕茧壳脱胶烘干后得到纯丝素纤维；其中，与常规蚕茧壳的脱胶方法相同，采用浓度为0.01-0.1mol/L，pH＝9.5的碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液脱胶，脱胶温度100℃，保持微沸30min，取出蚕丝，用去离子水清洗干净，重复脱胶三次，脱去丝胶，然后取出置于60℃的烘箱中烘干得到纯丝素纤维；
（2）溶解：将所述步骤（1）中获得的纯丝素纤维用溴化锂溶液溶解，得到丝素蛋白溴化锂溶液，并将所述的丝素蛋白溴化锂溶液冷却至室温；其中，与常规的丝素蛋白在溴化锂溶液中溶解的方法相同，溴化锂溶液的浓度为8.5-9.5 mol/L，溶解温度为58-62℃，溶解时间为0.5-1h,溴化锂溶液中加入的纯丝素纤维的量为50-150g/L；
（3）还原：将第一还原剂加入到所述步骤（2）中冷却至室温的丝素蛋白溴化锂溶液中，常温反应1-20h；
（4）透析：将所述步骤（3）中还原后的丝素蛋白溴化锂溶液灌入一透析袋中，将装有所述还原后的丝素蛋白溴化锂溶液的透析袋置于第一透析液中透析36h以上，每隔2-6h更新一次第一透析液，而后再将所述的透析袋置于第二透析液中继续透析24h以上，每隔2-6h更新一次第二透析液，第二透析液为去离子水，其中第一透析液和第二透析液的温度均为4-8℃；
其中，所述的透析袋由截留分子量为100-300 kDa的半透膜制成；
其中，所述的第一透析液采用如下方法配制而成：向去离子水中，先通氮气去除所述去离子水中的溶解氧，然后往其中加入第二还原剂，再调节pH值至pH为7-9，制得弱碱性的第一透析液；
（5）抽取：完成所述步骤（4）的透析后，抽取所述透析袋内的溶液，即获得所述高分子量丝素蛋白多肽链段的水溶液。
上述技术方案中，优选地，在所述步骤（3）中，所述的第一还原剂为巯基乙醇、乙二硫醇、丙硫醇、丙二硫醇、二硫苏糖醇、丁硫醇、半胱氨酸、谷胱甘肽中的一种。
上述技术方案中，优选地，在所述步骤（3）中，所述丝素蛋白溴化锂溶液中加入的所述第一还原剂的量为10-200mmol/L。
上述技术方案中，优选地，配制所述的第一透析液时，先通氮气0.5-1h以去除所述去离子水中的溶解氧。
上述技术方案中，优选地，配制所述的第一透析液时，加入的所述第二还原剂为亚硫酸钠、硫代硫酸钠、连二硫酸钠、焦亚硫酸钠中的一种。
上述技术方案中，优选地，配制所述的第一透析液时，加入的所述第二还原剂的量为0.001-0.01mol/L。
上述技术方案中，优选地，配制所述的第一透析液时，通过加入碳酸氢钠调节pH值。
本发明原理是：
本发明采用弱碱性碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液脱胶，使用溴化锂溶液溶解丝素，以获得相对完整的丝素大分子链段；使用步骤（3）中的第一还原剂还原丝素蛋白中由半胱氨酸所形成的二硫键，以此将丝素蛋白中的H链（390kDa）和L链（25kDa）之间的二硫键打开，并且在无氧气存在条件下，用高分子量透析袋去除低分子量部分丝素蛋白多肽链段，用去离子水透析，以此获得高分子量丝素蛋白多肽链段。为了防止在透析过程中二硫键重新结合，在配制第一透析液时，先在去离子水中通氮气，去除溶解氧，然后加入第二还原剂，以保证透析环境为还原性环境。由于丝素蛋白中二硫键已被打开，经过透析后，丝素蛋白水溶液中小分子量部分的丝素多肽链段通过半透膜进入透析袋外面的溶液中，留在透析袋内部的即为高分子量部分。因为丝素蛋白链段低分子量部分多肽链段是L链段和P25链段的分子量在25kDa-30kDa，采用高分子量透析袋可以加快低分子量部分链段的去除，因此采用100 kDa-300 kDa的透析膜可以去除小分子量部分而保留高分子量部分。
本发明与现有技术相比获得如下有益效果：
（1）本发明通过使用第一还原剂断裂H链与L链之间的二硫键，不破坏其它链段，保证丝素蛋白高分子链段的完整性。
（2）使用透析袋而不采用凝胶层析柱，可以快速大批量获得高分子量丝素蛋白，效率高，产量大。
附图说明
附图1为SDS-PAGE凝胶电泳图；
其中，从左到右分别为标准蛋白、普通的纯丝素蛋白以及本发明所制备的高分子丝素蛋白。
具体实施方式
为详细说明发明的技术内容、构造特征、所达成目的及功效，下面将结合实施例并配合附图予以详细说明。
实施例一：
（1）脱胶蚕丝的制备：用天平称取80 g家蚕茧壳，配制浓度为0.02mol/L、pH＝9.5的碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液4000毫升，将碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液加热到沸腾后加入称取的80g茧壳，继续微沸30min，取出茧丝并用去离子水清洗干净，重复以上试验三次，脱去丝胶，然后取出置于60 ℃的烘箱中烘干得到纯丝素纤维。
（2）溶解：取15g步骤（1）中得到的纯丝素纤维溶于150ml浓度为9 mol/L的LiBr溶液中，在60℃下溶解1h，得到丝素蛋白溴化锂溶液，并将丝素蛋白溴化锂溶液冷却至室温。
（3）还原：将第一还原剂巯基乙醇加入到步骤（2）中冷却至室温的丝素蛋白溴化锂溶液中，巯基乙醇的浓度为60mmol/L，通氮气10min后，封口，常温反应4h。
（4）配制第一透析液：取12L去离子水，通氮气35min以去除去离子水中的溶解氧，并往其中加入第二还原剂硫代硫酸钠，硫代硫酸钠的浓度为0.005mol/L，加入碳酸氢钠1g，使第一透析液呈弱碱性。
（5）透析：将步骤（3）中还原后的丝素蛋白溴化锂溶液灌入截留分子量为100 kDa的透析袋中，将透析袋放入步骤（4）中制得的第一透析液中透析3天，其中，每隔3h换一次第一透析液，第一透析液的温度为4℃；而后将透析袋放入第二透析液中继续透析2天，每隔3.5h换一次第二透析液，其中，第二透析液为去离子水，第二透析液的温度为4℃。
（6）抽取：完成步骤（5）的透析后，抽取透析袋内的溶液，即获得高分子量丝素蛋白多肽链段的水溶液。
实施例二：
（1）脱胶蚕丝的制备：用天平称取70 g家蚕茧壳，配制浓度为0.02mol/L、pH＝9.5的碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液4000毫升，将碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液加热到沸腾后加入称取的70g茧壳，继续微沸30min，取出茧丝并用去离子水清洗干净，重复以上试验三次，脱去丝胶，然后取出置于60 ℃的烘箱中烘干得到纯丝素纤维。
（2）溶解：取15g步骤（1）中得到的纯丝素纤维溶于150ml浓度为9.2 mol/L的LiBr溶液中，在60℃下溶解1h，得到丝素蛋白溴化锂溶液，并将丝素蛋白溴化锂溶液冷却至室温。
（3）还原：将第一还原剂二硫苏糖醇加入到步骤（2）中冷却至室温的丝素蛋白溴化锂溶液中，二硫苏糖醇的浓度为50mmol/L，通氮气10min后，封口，常温反应12h。
（4）配制第一透析液：取15L去离子水，通氮气30min以去除去离子水中的溶解氧，并往其中加入第二还原剂连二硫酸钠，连二硫酸钠的浓度为0.005mol/L，加入碳酸氢钠0.8g, 使第一透析液呈弱碱性。
（5）透析：将步骤（3）中还原后的丝素蛋白溴化锂溶液灌入截留分子量为200 kDa的透析袋中，将透析袋放入步骤（4）中制得的第一透析液中透析3天，其中，每隔4h换一次第一透析液，第一透析液的温度为5℃；而后将透析袋放入第二透析液中继续透析2天，每隔4h换一次第二透析液，其中，第二透析液为去离子水，第二透析液的温度为5℃。
（6）抽取：完成步骤（5）的透析后，抽取透析袋内的溶液，即获得高分子量丝素蛋白多肽链段的水溶液。
实施例三：
（1）脱胶蚕丝的制备：用天平称取60 g家蚕茧壳，配制浓度为0.04mol/L、pH＝9.5的碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液4000毫升，将碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液加热到沸腾后加入称取的60g茧壳，继续微沸30min，取出茧丝并用去离子水清洗干净，重复以上试验三次，脱去丝胶，然后取出置于60 ℃的烘箱中烘干得到纯丝素纤维。
（2）溶解：取12g步骤（1）中得到的纯丝素纤维溶于150ml浓度为8.9 mol/L的LiBr溶液中，在60℃下溶解1h，得到丝素蛋白溴化锂溶液，并将丝素蛋白溴化锂溶液冷却至室温。
（3）还原：将第一还原剂丙二硫醇加入到步骤（2）中冷却至室温的丝素蛋白溴化锂溶液中，丙二硫醇的浓度为150mmol/L，通氮气10min后，封口，常温反应15h。
（4）配制第一透析液：取10L去离子水，通氮气45min以去除去离子水中的溶解氧，并往其中加入第二还原剂亚硫酸钠，亚硫酸钠的浓度为0.01mol/L，加入碳酸氢钠1.1g, 使第一透析液呈弱碱性。
（5）透析：将步骤（3）中还原后的丝素蛋白溴化锂溶液灌入截留分子量为150 kDa的透析袋中，将透析袋放入步骤（4）中制得的第一透析液中透析3天，其中，每隔5h换一次第一透析液，第一透析液的温度为6℃；而后将透析袋放入第二透析液中继续透析2天，每隔4h换一次第二透析液，其中，第二透析液为去离子水，第二透析液的温度为6℃。
（6）抽取：完成步骤（5）的透析后，抽取透析袋内的溶液，即获得高分子量丝素蛋白多肽链段的水溶液。
实施例四：
（1）脱胶蚕丝的制备：用天平称取90 g家蚕茧壳，配制浓度为0.04mol/L、pH＝9.5的碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液4000毫升，将碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液加热到沸腾后加入称取的90g茧壳，继续微沸30min，取出茧丝并用去离子水清洗干净，重复以上试验三次，脱去丝胶，然后取出置于60 ℃的烘箱中烘干得到纯丝素纤维。
（2）溶解：取16g步骤（1）中得到的纯丝素纤维溶于150ml浓度为9.3 mol/L的LiBr溶液中，在60℃下溶解1h，得到丝素蛋白溴化锂溶液，并将丝素蛋白溴化锂溶液冷却至室温。
（3）还原：将第一还原剂半胱氨酸加入到步骤（2）中冷却至室温的丝素蛋白溴化锂溶液中，半胱氨酸的浓度为25mmol/L，通氮气10min后，封口，常温反应15h。
（4）配制第一透析液：取13L去离子水，通氮气55min以去除去离子水中的溶解氧，并往其中加入第二还原剂焦亚硫酸钠，焦亚硫酸钠的浓度为0.008mol/L，加入碳酸氢钠1.1g, 使第一透析液呈弱碱性。
（5）透析：将步骤（3）中还原后的丝素蛋白溴化锂溶液灌入截留分子量为200 kDa的透析袋中，将透析袋放入步骤（4）中制得的第一透析液中透析3天，其中，每隔5h换一次第一透析液，第一透析液的温度为6℃；而后将透析袋放入第二透析液中继续透析2天，每隔5h换一次第二透析液，其中，第二透析液为去离子水，第二透析液的温度为6℃。
（6）抽取：完成步骤（5）的透析后，抽取透析袋内的溶液，即获得所述高分子量丝素蛋白多肽链段的水溶液。
将本发明制得的丝素蛋白与普通的丝素蛋白分别通过凝胶电泳法测试分子量，得到如图1所述的凝胶电泳测试照片，从图1可以看到，普通的纯丝素分子量从高到低都有，尤其含有较多的25-30KDa的L链段，本专利所制备的丝素蛋白多肽分子量集中在100Kda以上，没有小分子量部分。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (3)

1.一种高分子量丝素蛋白多肽链段的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)脱胶：将原料蚕茧壳脱胶烘干后得到纯丝素纤维；
(2)溶解：将所述步骤(1)中获得的纯丝素纤维用溴化锂溶液溶解，得到丝素蛋白溴化锂溶液，并将所述的丝素蛋白溴化锂溶液冷却至室温；
(3)还原：将第一还原剂加入到所述步骤(2)中冷却至室温的丝素蛋白溴化锂溶液中，常温反应1-20h；
(4)透析：将所述步骤(3)中还原后的丝素蛋白溴化锂溶液灌入一透析袋中，将装有所述还原后的丝素蛋白溴化锂溶液的透析袋置于第一透析液中透析36h以上，每隔2-6h更新一次第一透析液，而后再将所述的透析袋置于第二透析液中继续透析24h以上，每隔2-6h更新一次第二透析液，第二透析液为去离子水，其中第一透析液和第二透析液的温度均为4-8℃；
其中，所述的透析袋由截留分子量为100-300kDa的半透膜制成；
其中，所述的第一透析液采用如下方法配制而成：向去离子水中，先通氮气去除所述去离子水中的溶解氧，然后往其中加入第二还原剂，再调节pH值至pH为7-9，制得弱碱性的第一透析液；
(5)抽取：完成所述步骤(4)的透析后，抽取所述透析袋内的溶液，即获得所述高分子量丝素蛋白多肽链段的水溶液；
在所述步骤(3)中，所述的第一还原剂为巯基乙醇、乙二硫醇、丙硫醇、丙二硫醇、二硫苏糖醇、丁硫醇、半胱氨酸、谷胱甘肽中的一种；
在所述步骤(3)中，所述丝素蛋白溴化锂溶液中加入的所述第一还原剂的量为10-200mmol/L；
配制所述的第一透析液时，加入的所述第二还原剂为亚硫酸钠、硫代硫酸钠、连二硫酸钠、焦亚硫酸钠中的一种；
配制所述的第一透析液时，加入的所述第二还原剂的量为0.001-0.01mol/L。
2.根据权利要求1所述的高分子量丝素蛋白多肽链段的制备方法，其特征在于，配制所述的第一透析液时，先通氮气0.5-1h以去除所述去离子水中的溶解氧。
3.根据权利要求1所述的高分子量丝素蛋白多肽链段的制备方法，其特征在于，配制所述的第一透析液时，通过加入碳酸氢钠调节pH值。
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