CN106243366A - 一种可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明所述的一种可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)丝素蛋白溶液的制备;(2)丝素蛋白固化物的制备;(3)亲水性丝素蛋白链段溶液的制备;(4)可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备。所述丝素蛋白水凝胶的制备方法快速方便,并且能够在超低浓度下进行制备,得到的丝素蛋白水凝胶具有显著的可逆触变粘弹性行为,在循环机械触变及静止状态下表现出可逆的凝胶与半凝胶态的转变,能够广泛应用于药物控释、靶向给药、原位组织修复、创面辅料以及美容等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种丝素蛋白水凝胶,具体涉及一种可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备方法。
背景技术
近年来,家蚕丝素蛋白水凝胶因其天然蛋白基材优异的生物相容性、较低的免疫原性、低致敏性以及较好的物理机械性能,人们对其在组织修复、药物控释、创面辅料以及美容领域的研究报道已屡见不鲜。家蚕丝素蛋白溶液是一种动力学稳定而热力学不稳定体系,属于一种半稳定的天然高分子溶液体系。由于丝素蛋白在中性条件下所带负电荷排斥作用以及蛋白质表面水化层的保护作用,导致常温下的布朗运动碰撞难以真正使得丝素分子链发生相互接触产生交联作用,所以常温下的丝素蛋白溶液凝胶化是一个比较漫长的过程。因此,一般高浓度溴化锂溶出并透析后的新鲜丝素溶液的凝胶时间往往在一个月以上。
为此,人们通过许多物理或者化学的方法,实现了一定浓度下丝素蛋白溶液的快速凝胶化。其中有通过调节溶液pH值,或者添加多元醇、离子表面活性剂、超声处理等物理方法破坏丝素蛋白胶粒表面水化层、离子层并改变溶液中的亲疏水环境的方法实现丝素蛋白分子链的接触碰撞与自组装的概率,进而实现丝素蛋白溶液的快速凝胶化。也有通过化学交联的方法实现丝素蛋白分子链间的化学交联,进而实现丝素蛋白溶液的快速凝胶化。然而,无论是上述物理还是化学作用下的凝胶化都是一个单向发展的不可逆体系。
可逆凝胶体系是一种能够响应某种或某些刺激而循环变化粘弹性行为的一类凝胶物质。具体表现为响应刺激而表现出高弹性模量的凝胶与高流动性的半凝胶液体间的智能可逆转变,特别适合原位组织修复、药物控释或靶向给药、创面辅料以及美容领域的应用。
近年来,随着基因工程的巨大进步,人们已经可利用基因工程精确定向、定量设计并翻译出特定氨基酸序列的多肽或蛋白质。通过定向设计多肽、蛋白亲疏水链段或者表现出不同电荷链段的方法,人们已经实现出蛋白或者多肽链依靠自身链段间的亲疏水作用或静电吸附作用而自聚集成可逆蛋白水凝胶。
丝素蛋白分子链中包括重链、轻链以及糖蛋白(P25链)。无论是重链、轻链还是P25糖蛋白链,都是由复杂的亲水、疏水氨基酸序列组成的共聚物。为此,本发明通过去离子水浸泡再生家蚕丝素蛋白固化物的方法,萃取获得了相比原丝素蛋白溶液亲水性更强的丝蛋白溶液。所得的亲水性丝素蛋白溶液可在相比原丝素蛋白溶液更低的浓度条件下更加快速的形成一种具备优异机械可逆触变丝素水凝胶。
发明内容
为解决上述存在的问题,本发明提供了一种可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备方法。所述丝素蛋白水凝胶的制备方法快速方便,并且能够在超低浓度下进行制备,得到的丝素蛋白水凝胶具有显著的可逆触变粘弹性行为,在循环机械触变及静止状态下表现出可逆的凝胶与半凝胶态的转变,能够广泛应用于药物控释、靶向给药、原位组织修复、创面辅料以及美容等领域。
为达到上述目的,本发明的技术方案是:
一种可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备方法,包括如下步骤:
(1)丝素蛋白溶液的制备:将蚕丝通过脱胶、溶解、透析处理后获得纯化的丝素蛋白溶液;
(2)丝素蛋白固化物的制备:采用流延法将纯化后的丝素蛋白溶液浇注于模具中,并于恒温恒湿条件下进行平衡干燥,获得丝素蛋白固化物;
(3)亲水性丝素蛋白链段溶液的制备:在25℃~40℃水浴下,按浴比1:10~1:100,以去离子水浸泡步骤(2)中的丝素蛋白固化物1~3h,萃取其中可溶性丝素蛋白,离心取上清液即为亲水性丝素蛋白链段溶液;
(4)可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备:将步骤(3)中获得的亲水性丝素蛋白链段溶液于20~50℃下中静置1~6h,即得一种可逆触变丝素蛋白水凝胶。
进一步地,所述步骤(1)中脱胶、溶解、透析的具体方法为:按浴比1:10~1:50,将剪碎的蚕丝在浓度为0.01~0.05% w/v的碳酸钠溶液中微沸蒸煮30~60min,重复三次,每次蒸煮后都以去离子水洗净蚕丝表面的丝胶,将脱胶后的蚕丝于50~70℃下烘干6h以上,并于50~60℃下按浴比9:100~15:100,溶于溴化锂溶液中,溶解后采用去离子水透析3d以上,得到纯化的丝素蛋白溶液。
进一步地,所述蚕丝为桑蚕丝、柞蚕丝、蓖麻蚕丝、天蚕丝中的一种或几种。
进一步地,所述溴化锂溶液的浓度为9-10M。
进一步地,所述步骤(2)中平衡干燥的环境温度为22~28℃,环境湿度为60~70%,干燥时间为19h以上。
进一步地,所述步骤(3)中离心的转速为3000-6000r/min。
如上所述的一种可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备方法得到的可逆触变丝素蛋白水凝胶。
进一步地,所述可逆触变丝素蛋白水凝胶含固量最低可至0.2% w/v。
本发明的有益效果在于:
(1)本发明提供的一种可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备方法,通过去离子水浸泡萃取丝素蛋白分子中亲水性较强的链段,得到丝素蛋白亲水链段溶液,其中亲水性氨基酸含量较多,非常容易产生分子链间聚集以及不规整的弱氢键作用,从而快速形成具有可逆触变粘弹性行为的丝素蛋白水凝胶,与传统再生家蚕丝素溶液凝胶过程相比,制备丝素蛋白水凝胶时间从一周至一月降到1~6h,且无需任何化学添加剂,制作方便;
(2)本发明提供的一种可逆触变丝素蛋白水凝胶,与传统再生家蚕丝素溶液凝胶相比,丝素蛋白水凝胶含固量更低,最低可至0.2% w/v,能够实现超低浓度下的凝胶化过程;
(3)本发明提供的一种可逆触变丝素蛋白水凝胶,具有显著的可逆触变粘弹性行为:丝素蛋白水凝胶受到一定的机械触变后会转变成流动性良好的半凝胶态,在一定温度下静置后又重新转变为粘弹性良好的水凝胶,可广泛应用于药物控释、靶向给药、原位组织修复、创面辅料以及美容等领域。
附图说明
图1(a)为实施例一中制备得到的亲水性丝素蛋白链段溶液,图1(b)为可逆触变丝素蛋白水凝胶的照片图。
图2为实施例一中制备得到的亲水性丝素蛋白链段溶液与丝素蛋白固化物水溶液表面张力对比图。
图3为实施例一中制备得到的可逆触变丝素蛋白水凝胶在不同的时间点触变前后粘弹性的变化。
图4为实施例一中制备得到的可逆触变丝素蛋白水凝胶的扫描电镜图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例进一步详细说明。
实施例一:
(1)丝素蛋白溶液的制备:将剪碎的茧壳按浴比1:50在浓度为0.05% w/v的碳酸钠溶液中重复三次微沸蒸煮30min,每次蒸煮后都以去离子水洗净茧丝表面有力的丝胶,再将脱胶后的茧丝于60℃烘干6h。将脱胶并烘干后丝素于60℃下按15:100的浴比溶于9.3M溴化锂溶液,并于去离子水透析3d得纯化的丝素蛋白溶液。
(2)丝素蛋白固化物的制备:以去离子水将上述纯化后的丝素蛋白溶液稀释至0.06g/ml,以流延法将5ml稀释后的丝素蛋白溶液浇注于直径为55mm的塑料培养皿。将以上浇注后的体系置于25℃、65%湿度环境下平衡干燥24h,即得丝素蛋白固化物。
(3)亲水性丝素蛋白链段溶液的制备:按1:100的浴比以去离子水浸泡步骤(2)中的丝素蛋白固化物3h,水浴温度37℃,再将浸泡后的体系在4000r/min的转速下离心,得到的的上清液即为亲水性丝素蛋白链段溶液,该溶液的含固量为0.2%。
(4)可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备:将以上步骤(3)中获得的亲水性丝素蛋白链段溶液于25℃环境中静置4h,即得一种可逆触变丝素蛋白水凝胶,丝素蛋白水凝胶受到一定的机械触变后会转变成流动性良好的半凝胶态,在一定温度下静置后又重新转变为粘弹性良好的水凝胶,图1为可逆触变丝素蛋白水凝胶凝胶前后的照片图。
表面张力的测定:采用平板测试法分别测试等浓度下亲水性丝素蛋白链段溶液与丝素蛋白固化物水溶液表面张力,测试结果如下图2所示。
可逆粘弹性行为的测试:以粘度仪频率扫的方法测试制备得到的可逆触变丝素蛋白水凝胶在不同的时间点凝胶前后的粘弹性行为变化,结果如图3所示。
电镜形貌测试:将制备得到的可逆触变丝素蛋白水凝胶以液氮冷冻并真空冻干并喷金后,在台式扫描电镜下观察凝胶表面形貌,结果如图4所示。
实施例二:
(1)丝素蛋白溶液的制备:将剪碎的茧壳按浴比1:50在浓度为0.05% w/v的碳酸钠溶液中重复三次微沸蒸煮30min,每次蒸煮后都以去离子水洗净茧丝表面有力的丝胶,再将脱胶后的茧丝于60℃烘干6h。将脱胶并烘干后丝素于60℃下按12:100的浴比溶于9.3M溴化锂溶液,并于去离子水透析3d得纯化丝素溶液。
(2)丝素蛋白固化物的制备:以去离子水将上述纯化后家蚕丝素蛋白溶液稀释至0.05g/ml,以流延法将5ml稀释后的再生家蚕丝素蛋白溶液浇注于直径为55mm的塑料培养皿。将以上浇注后的体系置于25℃、65%湿度环境下平衡干燥20h,即得丝素蛋白固化物。
(3)亲水性丝素蛋白链段溶液的制备:按1:50的浴比以去离子水浸泡步骤(2)中的丝素蛋白固化物2h,水浴温度35℃,再将浸泡后的体系在4000r/min的转速下离心,得到的上清液即为亲水性丝素蛋白溶液,该溶液的含固量为0.4%。
(4)可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备:将以上步骤(3)中获得的亲水性丝素蛋白溶液于37℃环境中静置3h,即得一种可逆触变丝素蛋白水凝胶。
实施例三:
(1)丝素蛋白溶液的制备:将剪碎的茧壳按浴比1:50在浓度为0.05% w/v的碳酸钠溶液中重复三次微沸蒸煮30min,每次蒸煮后都以去离子水洗净茧丝表面有力的丝胶,再将脱胶后的茧丝于60℃烘干6h。将脱胶并烘干后丝素于60℃下按15:100的浴比溶于9.3M溴化锂溶液,并于去离子水透析3d得纯化丝素溶液。
(2)丝素蛋白固化物的制备:以去离子水将上述纯化后家蚕丝素蛋白溶液稀释至0.04g/ml,以流延法将5ml稀释后的再生家蚕丝素蛋白溶液浇注于直径为55mm的塑料培养皿。将以上浇注后的体系置于25℃、65%湿度环境下平衡干燥19h,即得丝素蛋白固化物。
(3)亲水性丝素蛋白链段溶液的制备:按1:30的浴比以去离子水浸泡步骤(2)中的丝素蛋白固化物2h,水浴温度30℃,再将浸泡后的体系在4000r/min的转速下离心,得到的上清液即为亲水性丝素蛋白溶液,该溶液的含固量为0.5%。
(4)可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备:将以上步骤(3)中获得的亲水性丝素蛋白溶液于45℃环境中静置1h,即得一种可逆触变丝素蛋白水凝胶。
实施例四:
(1)丝素蛋白溶液的制备:将剪碎的茧壳按浴比1:50在浓度为0.05% w/v的碳酸钠溶液中重复三次微沸蒸煮30min,每次蒸煮后都以去离子水洗净茧丝表面有力的丝胶,再将脱胶后的茧丝于60℃烘干6h。将脱胶并烘干后丝素于60℃下按15:100的浴比溶于9.3M溴化锂溶液,并于去离子水透析3d得纯化丝素溶液。
(2)丝素蛋白固化物的制备:以去离子水将上述纯化后家蚕丝素蛋白溶液稀释至0.03g/ml,以流延法将5ml稀释后的再生家蚕丝素蛋白溶液浇注于直径为55mm的塑料培养皿。将以上浇注后的体系置于25℃、65%湿度环境下平衡干燥36h,即得丝素蛋白固化物。
(3)亲水性丝素蛋白链段溶液的制备:按1:50的浴比以去离子水浸泡步骤(2)中的丝素蛋白固化物2h,水浴温度40℃,再将浸泡后的体系在4000r/min的转速下离心,得到的上清液即为亲水性丝素蛋白溶液,该溶液的含固量为0.4%。
(4)可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备:将以上步骤(3)中获得的亲水性丝素蛋白溶液于50℃环境中静置2h,即得一种可逆触变丝素蛋白水凝胶。
实施例五:
(1)丝素蛋白溶液的制备:将剪碎的茧壳按浴比1:10在浓度为0.01% w/v的碳酸钠溶液中重复三次微沸蒸煮60min,每次蒸煮后都以去离子水洗净茧丝表面有力的丝胶,再将脱胶后的茧丝于50℃烘干8h。将脱胶并烘干后丝素于50℃下按15:100的浴比溶于9M溴化锂溶液,并于去离子水透析4d得纯化丝素溶液。
(2)丝素蛋白固化物的制备:以去离子水将上述纯化后家蚕丝素蛋白溶液稀释至0.03g/ml,以流延法将5ml稀释后的再生家蚕丝素蛋白溶液浇注于直径为55mm的塑料培养皿。将以上浇注后的体系置于22℃、60%湿度环境下平衡干燥36h,即得丝素蛋白固化物。
(3)亲水性丝素蛋白链段溶液的制备:按1:10的浴比以去离子水浸泡步骤(2)中的丝素蛋白固化物1h,水浴温度25℃,再将浸泡后的体系在6000r/min的转速下离心,得到的上清液即为亲水性丝素蛋白溶液,该溶液的含固量为0.4%。
(4)可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备:将以上步骤(3)中获得的亲水性丝素蛋白溶液于30℃环境中静置4h,即得一种可逆触变丝素蛋白水凝胶。
实施例六:
(1)丝素蛋白溶液的制备:将剪碎的茧壳按浴比1:20在浓度为0.03% w/v的碳酸钠溶液中重复三次微沸蒸煮30min,每次蒸煮后都以去离子水洗净茧丝表面有力的丝胶,再将脱胶后的茧丝于70℃烘干6h。将脱胶并烘干后丝素于50℃下按9:100的浴比溶于10M溴化锂溶液,并于去离子水透析5d得纯化丝素溶液。
(2)丝素蛋白固化物的制备:以去离子水将上述纯化后家蚕丝素蛋白溶液稀释至0.03g/ml,以流延法将5ml稀释后的再生家蚕丝素蛋白溶液浇注于直径为55mm的塑料培养皿。将以上浇注后的体系置于28℃、70%湿度环境下平衡干燥36h,即得丝素蛋白固化物。
(3)亲水性丝素蛋白链段溶液的制备:按1:40的浴比以去离子水浸泡步骤(2)中的丝素蛋白固化物3h,水浴温度30℃,再将浸泡后的体系在3000r/min的转速下离心,得到的上清液即为亲水性丝素蛋白溶液,该溶液的含固量为0.5%。
(4)可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备:将以上步骤(3)中获得的亲水性丝素蛋白溶液于20℃环境中静置6h,即得一种可逆触变丝素蛋白水凝胶。
上述结果可以表明,本发明提供的一种可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备方法,通过去离子水浸泡萃取丝素蛋白分子中亲水性较强的链段,得到丝素蛋白亲水链段溶液,其中亲水性氨基酸含量较多,非常容易产生分子链间聚集以及不规整的弱氢键作用,从而快速形成具有可逆触变粘弹性行为的丝素蛋白水凝胶,与传统再生家蚕丝素溶液凝胶过程相比,制备丝素蛋白水凝胶时间从一周至一月降到1~6h,且无需任何化学添加剂,制作方便;同时与传统再生家蚕丝素溶液凝胶相比,丝素蛋白水凝胶含固量更低,最低可至0.2% w/v,能够实现超低浓度下的凝胶化过程;此外,可逆触变丝素蛋白水凝胶具有显著的可逆触变粘弹性行为:丝素蛋白水凝胶受到一定的机械触变后会转变成流动性良好的半凝胶态,在一定温度下静置后又重新转变为粘弹性良好的水凝胶,可广泛应用于药物控释、靶向给药、原位组织修复、创面辅料以及美容等领域。
对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
Claims (8)
1.一种可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)丝素蛋白溶液的制备:将蚕丝通过脱胶、溶解、透析处理后获得纯化的丝素蛋白溶液;
(2)丝素蛋白固化物的制备:采用流延法将纯化后的丝素蛋白溶液浇注于模具中,并于恒温恒湿条件下进行平衡干燥,获得丝素蛋白固化物;
(3)亲水性丝素蛋白链段溶液的制备:在25℃~40℃水浴下,按浴比1:10~1:100,以去离子水浸泡步骤(2)中的丝素蛋白固化物1~3h,萃取其中可溶性丝素蛋白,离心取上清液即为亲水性丝素蛋白链段溶液;
(4)可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备:将步骤(3)中获得的亲水性丝素蛋白链段溶液于20~50℃下中静置1~6h,即得一种可逆触变丝素蛋白水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中脱胶、溶解、透析的具体方法为:按浴比1:10~1:50,将剪碎的蚕丝在浓度为0.01~0.05% w/v的碳酸钠溶液中微沸蒸煮30~60min,重复三次,每次蒸煮后都以去离子水洗净蚕丝表面的丝胶,将脱胶后的蚕丝于50~70℃下烘干6h以上,并于50~60℃下按浴比9:100~15:100,溶于溴化锂溶液中,溶解后采用去离子水透析3d以上,得到纯化的丝素蛋白溶液。
3.根据权利要求2所述的一种可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备方法,其特征在于,所述蚕丝为桑蚕丝、柞蚕丝、蓖麻蚕丝、天蚕丝中的一种或几种。
4.根据权利要求2所述的一种可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备方法,其特征在于,所述溴化锂溶液的浓度为9-10M。
5.根据权利要求1所述的一种可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中平衡干燥的环境温度为22~28℃,环境湿度为60~70%,干燥时间为19h以上。
6.根据权利要求1所述的一种可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中离心的转速为3000-6000r/min。
7.一种根据权利要求1-6所述的任意一种可逆触变丝素蛋白水凝胶的制备方法得到的可逆触变丝素蛋白水凝胶。
8.根据权利要求7所述的一种可逆触变丝素蛋白水凝胶,其特征在于,所述可逆触变丝素蛋白水凝胶含固量最低可至0.2% w/v。
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