CN106822183B - 一种光敏富血小板血浆凝胶及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及光敏富血小板血浆凝胶及其制备方法和应用。邻硝基苄基类光响应基团修饰的高分子的生物相容性介质溶液同提取的富血小板血浆(PRP)以一定比例混合形成凝胶前体溶液；然后对凝胶前体溶液进行光照射，邻硝基苄基类光响应基团修饰的高分子中的邻硝基苄基基团在光源的激发下发生光化学反应产生醛基官能团，并同PRP中各种蛋白表面分布的氨基发生偶联反应，形成亚胺键，从而实现光敏富血小板血浆凝胶的制备。与现有技术相比，本发明方法构建的PRP凝胶不仅可以实现内部细胞因子的缓释，同时可以实现PRP凝胶同创面的紧密、无缝的结合。

Description

一种光敏富血小板血浆凝胶及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及再生医学技术领域，尤其是涉及一种光敏富血小板血浆凝胶及其制备方法和用途。
背景技术
富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)，是将动物或人的全血经过离心后得到的含有高浓度血小板的血浆。PRP中含有大量的生长因子，包括血小板衍生生长因子(PDGF)，转化生长因子-β(TGF-β)，类胰岛素生长因子(IGF)，上皮生长因子(EGF)和血管上皮生长因子(VEGF)等，可以有效地促进创面愈合。1997年Whitman首次提出自体富血小板凝胶(autologous platelet－rich gel,APG)的概念，克服了异体血浆所面临的免疫排斥反应，随后自体PRP被陆续应用于骨科、颌面外科、烧伤整形科等领域创面的治疗。目前，PRP在临床上已应用于慢性溃疡创面的治疗、糖尿病足溃疡的处理、烧伤创面的治疗以及皮肤美容等方面，并且取得了明显的治疗和修复效果。另外，还有临床研究将PRP应用于治疗骨折不愈合、骨不连、骨坏死、骨关节炎、关节软骨损伤等疾病，同样取得了治疗效果。
临床中PRP的普遍使用方法是通过凝血酶和氯化钙激活PRP进而形成PRP凝胶，再将其敷在创面上或置于骨组织损伤处。然而由这种方法所制备的PRP凝胶在实际应用中面临着一些亟待解决的问题。首先PRP凝胶难以牢固粘附于损伤创面，以致换药过程容易脱落，尤其在应用PRP凝胶修复骨缺损或肌腱损伤时更是难以固定于组织损伤处；其次，PRP凝胶释放细胞因子的方式是突释的，维持时间短暂(约一周)，对于一些难治性慢性溃疡以及创面需多次使用才能显示效果。因此，如何使PRP凝胶牢固地粘附于创伤处并且缓慢持续释放细胞因子是更好的利用PRP进行组织再生与修复的技术关键。当前，有相关的研究将PRP负载于由透明质酸、明胶、壳聚糖、胶原等物质构建的支架材料中形成PRP复合凝胶，一定程度上实现了PRP内因子的可控释放，但是这些复合凝胶同样是在体外预先制备，并且难以同创面部位进行无缝、牢固的结合。
发明内容
本发明的目的就是为了克服当前PRP凝胶在实际临床应用中存在的缺陷，而提供一种具有优异组织黏附性的光敏富血小板血浆凝胶及其制备方法和用途。
本发明通过在PRP中加入具有光反应基团的高分子衍生物，提出一种全新的光交联方法构建PRP凝胶。利用该方法构建的PRP凝胶不仅可以实现内部细胞因子的缓释，同时可以实现PRP凝胶同创面的紧密、无缝的结合。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面：提供一种具有优异组织黏附性的光敏富血小板血浆凝胶(简称为光敏PRP凝胶)的制备方法。
本发明中光敏PRP凝胶的制备方法如下：邻硝基苄基类光响应基团修饰的高分子(组分A)的生物相容性介质溶液同提取的PRP(组分B)以一定比例混合形成凝胶前体溶液。然后对凝胶前体溶液进行光照射，此时，组分A中的邻硝基苄基基团在光源的激发下发生光化学反应产生醛基官能团，随即同PRP中各种蛋白表面分布的氨基发生偶联反应，形成亚胺键，从而实现光敏PRP凝胶的制备。
本发明中光敏基团邻硝基苄基类光响应基团修饰的高分子组分A结构式如下：
Figure BDA0001191898130000021
其中，R1为-H或选自以下组的取代基：酯键类如-CO(CH2)xCH3、-CO(CH2CH2O)xCH3、-CO(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等，醚键类如-(CH2)xCH3、-(CH2CH2O)xCH3、-(CH2)x(CH2CH2O)yCH3、
Figure BDA0001191898130000022
等，碳酸酯键类如-COO(CH2)xCH3、-COO(CH2CH2O)xCH3、-COO(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等，异氰酸酯键类如-CONH(CH2)xCH3、-CONH(CH2CH2O)xCH3、-CONH(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等，R1选取的上各取代基中，x和y≥0且为整数，x和y相同或不相同；
R2为-H或选自以下组的取代基：-O(CH2)xCH3、-O(CH2CH2O)xCH3、-O(CH2)x(CH2CH2O)yCH3等，R2选取的上各取代基中，x和y≥0且为整数，x和y相同或不相同；
R3选自氨基类连接键-O(CH2)xCONH(CH2)yNH-等、卤代类连接键-O(CH2)x-等和羧基类连接键-O(CH2)xCO-等，R3选取的上各取代基中，x和y≥1且为整数，x和y相同或不相同；
R4为-H或-CONH(CH2)xCH3等取代基，其中x≥0且为整数；
P1可以是亲水或水溶性天然高聚物，例如天然多糖类(如：透明质酸、肝素、海藻酸、葡聚糖、羧甲基纤维素、乙二醇壳聚糖、丙二醇壳聚糖、壳聚糖乳酸盐、羧甲基壳聚糖、壳聚糖季铵盐等)及其修饰物或降解物；也可以是蛋白或多肽类，比如各种亲水性或水溶性动植物蛋白、胶原、血清蛋白、明胶及其修饰物、改性物和及其降解的多肽类等；也可以是亲水或水溶性合成聚合物，例如两臂或多臂聚乙二醇、聚乙烯亚胺、树枝体、合成多肽、聚赖氨酸或(甲基)丙烯酸酯或(甲基)丙烯酰胺等；以上聚合或接枝的水溶或亲水性聚合物中，单分子聚合物的邻硝基苄基类光响应基团的平均个数大于或等于2(即n≥2)。另外，所述的邻硝基苄基修饰的高分子衍生物可以是同时含有一种或一种以上不同基团的亲水或水溶性高分子，或者是一种或一种以上不同基团的亲水或水溶性高分子的混合物。
本发明中，邻硝基苄基修饰的高分子衍生物的制备方法为化学标记法和人工聚合的方法。其中，化学标记法是利用高分子与邻硝基苄基衍生物中所含的化学基团间的化学反应而连接，可以是羧基的高分子与含氨基的邻硝基苄基类小分子标记(参考文献O.P.Oommen,S.Wang,M.Kisiel,M.Sloff,J.Hilborn,O.P.Varghese,Adv.Funct.Mater.2013,23,1273.)、也可以是含羟基的高分子与含羧基的或含溴的邻硝基苄基类小分子标记(参考文献K.Peng,I.Tomatsu,A.V.Korobko,A.Kros,Soft Matter2010,6,85；L.Li,N.Wang,X.Jin,R.Deng,S.Nie,L.Sun,Q.Wu,Y.Wei,C.Gong,Biomaterials2014,35,3903.)、也可以是含氨基的高分子与含溴的邻硝基苄基类小分子标记(参考文献L.Li,N.Wang,X.Jin,R.Deng,S.Nie,L.Sun,Q.Wu,Y.Wei,C.Gong,Biomaterials 2014,35,3903.)等标记方法。人工聚合的方法是利用邻硝基苄基衍生物功能单体与其它共单体共聚，可以是无规自由基聚合方法，也可以是控制自由基聚合方法(比如ATRP聚合、RAFT聚合方法)等。
本发明中，邻硝基苄基修饰的聚乙二醇类或天然多糖类高分子衍生物的制备方法可以为：将含有羧基的水溶性聚合物或高分子于蒸馏水中溶解，加入含有活性官能团的氨基的邻硝基苄基小分子后，加入缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)和活化剂羟基苯并三唑(HOBt)，然后在室温下搅拌24-48h。反应结束后，将反应液加入透析袋中用稀盐酸溶液透析2-3d，然后冷冻干燥，即可得到所述的邻硝基苄基修饰的高分子衍生物。
上述含有羧基的水溶性聚合物或高分子可以为聚乙二醇类、含羧基的多糖类(如：透明质酸、羧甲基纤维素、海藻酸等)，优选为多臂羧基聚乙二醇、透明质酸、羧甲基纤维素。进一步优选为透明质酸。
本发明中，邻硝基苄基修饰的聚乙二醇类或天然多糖类高分子衍生物的制备方法还可以为：将含有羟基的水溶性聚合物溶解后，加入含有活性官能团的羧基的邻硝基苄基小分子后，加入缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)和催化剂对甲苯磺酸吡啶盐(DPTS)，然后在室温下搅拌24-48h。反应结束后，将反应液倒入难溶性溶剂中重沉淀(比如修饰的聚乙二醇衍生物可倒入乙醚中重沉淀，多糖类高分子衍生物可倒入乙醇中重沉淀)，然后溶于水中用透析袋透析2-3d，冷冻干燥后，即可得到所述的邻硝基苄基修饰的高分子衍生物。
上述含有羟基的水溶性聚合物可以为聚乙二醇类或天然多糖类，优选为多臂聚乙二醇、葡聚糖，进一步优选为葡聚糖。
本发明中，邻硝基苄基修饰的聚乙二醇类或天然多糖类高分子衍生物的制备方法还可以为：将含有氨基或羟基的水溶性聚合物于蒸馏水中溶解，加入含有活性官能团的溴的邻硝基苄基小分子后，加入碳酸钾作为碱，在室温下反应24-48h。反应结束后，将反应液倒入难溶性溶剂(比如修饰的聚乙二醇衍生物可倒入乙醚中，修饰的多糖类高分子衍生物可倒入乙醇中)中重沉淀，然后溶于水中用透析袋透析2-3d，冷冻干燥后，即可得到所述的邻硝基苄基修饰的高分子衍生物。
上述含有氨基或羟基的水溶性聚合物可以为含氨基或羟基的聚乙二醇类或天然多糖类，优选为多臂氨基聚乙二醇、多臂羟基聚乙二醇、乙二醇壳聚糖、丙二醇壳聚糖、羧甲基壳聚糖、壳聚糖乳酸盐类或天然多糖类，进一步优选为乙二醇壳聚糖、多臂羟基聚乙二醇。
上述反应中，水溶性聚合物中的羧基、氨基或羟基与小分子邻硝基苄基类衍生物的摩尔比优选为1:0.1-2；氨基修饰的邻硝基苄基类小分子与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)、活化剂羟基苯并三唑(HOBt)的摩尔比优选为1:2:1.5，羧基修饰的邻硝基苄基类小分子与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)、催化剂DPTS的摩尔比优选为1:2:1.5，溴代的邻硝基苄基类小分子与碳酸钾的摩尔比优选为1:2。
本发明中，邻硝基苄基修饰的合成共聚物的制备方法为：将邻硝基苄基可聚合单体衍生物与一种或几种可聚合共单体经过聚合即可得邻硝基苄基修饰的合成共聚物。经过多次溶解-重沉淀的方法将其纯化。
上述邻硝基苄基可聚合单体衍生物可以为(甲基)丙烯酸酯类、(甲基)丙烯酰胺类，优选为甲基丙烯酸酯类和丙烯酰胺类，进一步优选为甲基丙烯酸酯类。
上述可聚合共单体中至少一种必须是水溶性共单体，可以为甲基丙烯酸聚乙二醇酯(PEG-MA)、丙烯酸聚乙二醇酯、甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酸(AA)、丙烯酸羟乙酯、丙烯酰胺(AM)等任意具有水溶性的可聚合单体，优选为甲基丙烯酸聚乙二醇酯(PEG-MA)。其它共单体根据不同的应用而选择。
上述邻硝基苄基可聚合单体衍生物与水溶性共单体的聚合摩尔比可以为1:20-1:2，优选为1:9-1:3，进一步优选为1:4。
上述聚合方法可以是无规自由基聚合、也可以是控制自由基聚合(比如RAFT聚合、ATRP聚合等)。优选为无规自由基聚合。即邻硝基苄基可聚合单体衍生物与共单体共溶于一定的溶剂中，加入自由基引发剂充分溶解后，经过三次冷冻-抽真空循环操作后，在加热条件下反应过夜。待反应结束后，将反应液倒入无水乙醚中沉淀，经过多次溶解-重沉淀的纯化过程，真空干燥后即可得到含邻硝基苄基的共聚合物。(参考文献G.Delaittre,T.Pauloehrl,M.Bastmeyer,C.Barner-Kowollik,Macromolecules 2012,45,1792-1802.)
本发明中组分A的生物相容性介质可以是生理盐水或生理缓冲液。
本发明中组分B是提取的各种来源的PRP，可以是自体的也可以是异体的，其提取方法根据临床中提取PRP的标准方法进行提取。(参考文献SpakováTímea,Rosocha Ján,Lacko Marek,HarvanováDenisa,Gharaibeh Ahmed,American Journal of PhysicalMedicine&Rehabilitation,91,411-417.)
本发明中，光敏PRP凝胶前体溶液中组分A的质量浓度为0.01％-30％，优选为1％-5％。其中，PRP在凝胶前体溶液中的体积分数为10％-90％，优选为40％-80％。激发光敏PRP凝胶的波长根据邻硝基苄基光响应基团的吸收波长来确定，为250nm–500nm，优选为300-400nm，进一步优选为365nm。光照时间根据所需要形成凝胶的厚度和强度来控制，范围为1min–5min。
本发明第二方面：提供上述制备方法制得的具有优异组织黏附性的光敏富血小板血浆凝胶(简称为光敏PRP凝胶)。
本发明第三方面：提供光敏富血小板血浆凝胶(简称为光敏PRP凝胶)的用途，包括以下应用领域：
本发明的光敏PRP凝胶在细胞因子缓释领域的应用，其可以作为细胞因子缓释剂。
本发明的光敏PRP凝胶作为修复材料在皮肤创面，烧伤创面以及糖尿病诱发的慢性皮肤创面、溃疡面，各种脏器粘膜创面、溃疡面修复的应用，可以作为皮肤创面修复剂、烧伤创面修复剂、糖尿病诱发的慢性皮肤创面修复剂或溃疡面修复剂、各种脏器粘膜创面、溃疡面修复剂。
本发明的光敏PRP凝胶在关节软骨损伤修复的应用，可以作为关节软骨损伤修复剂。
本发明的光敏PRP凝胶在骨组织损伤修复的应用，可以作为骨组织损伤修复剂。
本发明的光敏PRP凝胶在肌腱或韧带损伤修复的应用，可以作为肌腱损伤修复剂。
本发明的光敏PRP凝胶在颌面外科修复牙周骨缺损或拔牙伤口或植牙区骨不足的应用。
本发明的光敏PRP凝胶在中枢或周围神经损伤修复的应用。
本发明的光敏PRP凝胶在退变椎间盘或脊柱融合修复的应用。
本发明的光敏PRP凝胶在各种手术创面的封闭、止血及促进修复的应用。
本发明的光敏PRP凝胶在美容领域的应用，可以作为美容凝胶。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
1.本发明提出的光交联法制备PRP凝胶的成胶过程快速，操作简便，具有优异的时空可控性，可以在创面部位原位形成PRP凝胶，并且完全适应创面的大小和形状，有利于PRP凝胶与创面的粘合；
2.本发明中光敏组分A的原料来源十分广泛，合成成本低廉，可以进行大规模生产；同时，PRP可以从患者自身的血液提取；因此，光敏PRP凝胶具有巨大的临床应用价值；
3.同利用凝血酶和氯化钙激活制备的PRP凝胶相比，本发明中的光交联方法制备的凝胶结构稳定，形成的凝胶具有良好机械强度，并且可以根据具体应用的组织部位进行调节；
4.光交联PRP凝胶的成胶机制不会直接诱导血小板中α颗粒的破坏；同时，从α颗粒中释放的细胞因子首先会包埋在由组分A和PRP中蛋白形成的高分子网络中；因此，光敏PRP凝胶可以有效避免细胞因子的突释，实现细胞因子的可控释放；
5.在原位光敏PRP凝胶的制备过程中，组分A在激发下产生的醛基官能团除了同PRP中蛋白表面氨基反应外，还会同组织表面分布的氨基进行反应，从而实现光敏PRP凝胶同作用部位组织的化学键结合，赋予其牢固的组织粘附能力，有效克服当前临床中使用的PRP凝胶不能有效固定在目标处的问题；
6.同组织化学键的结合赋予光敏PRP凝胶优异的组织整合能力，有利于细胞向凝胶内部的迁移，充分发挥PRP凝胶创面修复支架材料的作用，引导创面的愈合，促进修复。
7.本发明在所公开专利CN105131315A的基础上，进一步明确了PRP作为它的伯胺类高分子衍生物组分所构建的光敏凝胶，能够有效实现创面的治疗和组织修复功能。
附图说明
图1：邻硝基苄醇修饰的羧甲基纤维素(CMC-NB，质量浓度4％)的生理盐水溶液同兔血PRP以1∶1进行混合，形成的光敏PRP凝胶前体溶液(凝胶1)在光照下的流变学曲线。
图2：凝胶1的SEM照片，图片中显示光敏PRP凝胶具备均一的三维网络结构。
图3：光敏PRP凝胶的细胞因子缓释特性。
图4：4％wt的CMC-NB的生理盐水溶液与PRP以不同比例混合形成的光敏PRP凝胶的组织粘附力以及与当前临床中广泛使用的组织粘合剂纤维蛋白胶的对比。
图5：邻硝基苄醇修饰的透明质酸(HA-NB，接枝率为7％，质量浓度5％)溶液同新鲜提取的PRP以1∶1混合形成光敏PRP凝胶修复糖尿病大鼠皮肤创面效果。
图6：利用光敏PRP凝胶(凝胶1)修复兔子膝关节软骨损伤结果。
具体实施方式
下面结合附图以及实施例对本发明作进一步描述，但这些实施例仅是对本发明最佳实施方式的描述，并不对本发明的范围有任何限制。本领域技术人员在不背离本发明精神和保护范围的情况下作出的其它任何变化和修改，仍包括在本发明保护范围之内。
实施例1：
由光敏基团邻硝基苄醇修饰的羧甲基纤维素(CMC-NB)和兔血PRP形成的光敏PRP凝胶的制备及其流变学和形貌分析以及组织粘附力测试
(1)光敏基团邻硝基苄醇(NB)的合成。
Figure BDA0001191898130000081
化合物1的合成：参考文献[Pauloehrl,T.；Delaittre,G.；Bruns,M.；Meiβler,M.；
Figure BDA0001191898130000082
H.G.；Bastmeyer,M.；Barner-Kowollik,C.Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,9181.]
化合物2的合成：将化合物1(1g,3.3mmol)和乙二胺(1.1mL)溶于甲醇(50mL)中，回流过夜反应后，减压旋蒸，将粗产物溶于甲醇中，在乙酸乙酯中重沉淀。经过多次溶解-重沉淀后，过滤、真空干燥即可得到纯的化合物2(0.93g，产率85％)。
(2)CMC-NB的合成：将500mg的羧甲基纤维素置于pH＝4.5，0.1M的磷酸盐缓冲溶液中，35℃下搅拌至充分溶解。随后，向该溶液中加入羟基苯并三唑(HOBt，153mg)，然后将溶于甲醇中的NB(224mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl，200mg)加入到上述溶液中室温反应48h后，先用含氯化钠的稀盐酸溶液(pH＝3.5)透析1d，再用纯水透析1d后，冷冻干燥即可得到CMC-NB(410mg)，根据其核磁氢谱图，可以计算出邻硝基苄基的修饰度大约为2％。
(3)兔血PRP的提取：抽取16mL的新鲜兔子血置于含有4mL枸橼酸葡萄糖溶液的试管中，4℃，800rpm转速下离心15min后，血浆分为3层，取中间血小板层，并在2000rpm转速下再次离心15min。此时，分区上层的血浆，得到0.8mL的新鲜兔血PRP。
(4)光敏PRP凝胶的流变学分析和形貌表征：取80mg的CMC-NB固体，加入到5mL灭菌离心管中，加入2mL的生理盐水，35℃下恒温震荡直至完全溶解，高温高压灭菌。然后，取新鲜提取0.8mL兔血PRP加入到0.8mL灭菌的CMC-NB生理盐水溶液中，进行充分混合，得到光敏PRP凝胶的前体溶液，进行后续测试。
流变学分析中采用的测试平台是HAAKE MASⅢ旋转流变仪，配备光源OmniCureS2000和平板转子。测试条件为控制变量模式，测试频率为1Hz，平板间距0.5mm，测试温度为37℃。如实验结果所示(图1)，随着光照时间的延长，凝胶前体溶液的存储模量和损耗模量均上升。光照14s后，弹性模量大于损耗模量，此时前体溶液已经凝胶化。光照250s后，凝胶达到最大存储模量600Pa左右，该强度足以维持PRP凝胶的3维结构，适合作为创面敷料使用。
利用扫描电子显微镜对光敏PRP凝胶的三维结构进行了观察。首先，取200μL的凝胶前体溶液，置于聚四氟乙烯模具中，365nm光照5min成胶。对形成的凝胶进行冷冻干燥处理后，进行表面喷金，利用SEM对凝胶形态进行观察。如图2结果所示，本发明制得的光敏PRP凝胶具备多孔的三维网络结构，非常利于细胞在凝胶内部的生长和增殖。
利用层剪切法测定了光敏PRP凝胶的组织粘附力。首先，取两块尺寸为6cm×2.5cm大小的钢化玻璃片，在每块玻璃片上用502胶水粘接3.5×2.5cm大小的新鲜猪肠衣膜。随后，将上面制得的200μL光敏PRP凝胶前体溶液均匀涂抹在一片肠衣片上，将另一片粘接有同样大小肠衣膜的玻璃片盖其上，使肠衣膜相互重合。利用365nm光源玻璃片进行10min的光照，使两片肠衣膜之间的前体溶液形成光敏PRP凝胶。最后，将得到的样品固定在高分子拉力机上，测试光敏PRP凝胶的组织粘附力。另外，也用该方法测试了传统PRP凝胶的组织粘附力。实验结果显示(图3)，光敏PRP凝胶的组织粘附能力是PRP凝胶的30倍左右。
实施例2：
光敏PRP水凝胶缓释细胞因子
将CMC-NB溶解到生理盐水中，配置成质量浓度为4％的溶液，高温灭菌。取一定体积新鲜提取的兔血PRP，同上述CMC-NB溶液等体积混合形成凝胶前体溶液。随后，在48孔板的孔中加入200μL凝胶前体溶液，并对每个孔进行5min光照射(365nmLED光源，光强：20mW/cm2)，形成光敏PRP凝胶，作为实验组。另外，对照组中，将160μL新鲜提取的兔血PRP滴加到48孔板中，随即加入40μL含1000U/mL凝血酶的10％wt的氯化钙溶液，混合均匀，直至形成PRP凝胶。接下来，向实验组和对照组的孔中分别加入200μL PBS，每隔24小时收集上次加入的PBS，并补充新鲜的PBS，反复持续14天。最后，通过ELISA检测各时间点收集的PBS中细胞因子(PDGF,TGF-b,FGF)的含量(pg/mL)。实验结果显示(图4)，利用传统方法制备的PRP凝胶在1天内会有大量的细胞因子释放，后续时间细胞因子的释放量逐渐趋于平缓。而本发明制备的光敏PRP凝胶1天内释放的细胞因子量是传统方法制备的PRP凝胶的20％–50％，并且细胞因子成近似线性的释放。因此，本发明方法制备的光敏PRP凝胶可以实现细胞因子的缓释和可控释放。
实施例3：
光敏PRP水凝胶修复糖尿病大鼠皮肤损伤的作用
Ⅱ型糖尿病大鼠皮肤缺损模型的制备：取20只正常的SD大鼠，利用标准方法诱发SD大鼠的糖尿病(参考文献Mohsen Khosravi Maharlooei,Mansooreh Bagheri,ZhabizSolhjou,Behnam Moein Jahromi,Majid Akrami,Lili Rohani,Ahmad Monabati,AliNoorafshan,Gholamhossein Ranjbar Omrani，Diabetes Research And ClinicalPractice 2011,93,228-234)。随后，在每只SD大鼠的背部制作直径2cm的完全皮肤缺损模型。并且根据伤口部位处理方式的不同，将这20只SD大鼠随机平均分成五组：实验组中SD大鼠的伤口利用200μL原位成型的光敏PRP凝胶进行处理；阳性对照组中SD大鼠的伤口利用200μL新鲜提取的兔血PRP凝胶进行处理；空白对照组中SD大鼠的伤口不作任何处理。手术后7、14、21天分别观察每组中伤口的愈合情况，并且取21天的组织样本进行组织学分析。实验结果显示(图5)，利用光敏凝胶处理的皮肤创伤的修复速度明显要快于PRP凝胶和空白对照组，并且组织染色的结果与大体观结果一致。
实施例4：
光敏PRP水凝胶修复兔软骨缺损
取12只体重在2.5–3.0kg的新西兰白兔，于每只兔子的膝盖关节面制造直径为4mm的全厚度软骨缺损伤口，建立软骨缺损模型。并且根据软骨损伤处处理的不同，将12只兔子随机平均分成3组：实验分组中软骨损伤处利用20μL原位成型的光敏PRP凝胶(CMC-NB/PRP)进行处理；阳性对照组中软骨损伤利用20μL传统的PRP凝胶进行处理；空白对照组的伤口不进行处理。手术后12周，对各组中兔子的膝关节软骨损伤的修复情况进行评价。实验结果显示(图6)，实验组中兔子的膝关节软骨损伤出都得到了良好的修复。同时，组织学分析(番红-O染色和免疫组化染色)结果显示新生成的透明质软骨同周围的软骨整合良好。而阳性对照组和空白对照组的修复结果较差。
实施例5：
光敏PRP水凝胶修复兔肌腱缺损
采用新西兰雄性大白兔，将后肢跟腱横行切断制造跟腱断裂模型。随后，根据跟腱损伤处处理方式的不同，将兔子随机等分成：A.光敏PRP凝胶组(在跟腱的两断端及其周边均匀涂抹PRP/HA-NB，365nm光致原位成胶，然后缝合断端)；B.PRP凝胶组(直接将PRP涂抹到跟腱断端及周边，然后缝合断端)；C.对照组(跟腱直接缝合)。术后1、2、4、6周，取跟腱标本行大体观察、组织学及免疫组化检测，并进行成纤维细胞计数、胶原纤维含量检测。实验结果显示，光敏PRP凝胶处理的肌腱吻合处纤维组织排布规则，纤维包裹较其他各组明显增多。同时，各时间点新生胶原纤维含量要多于其他组。结果证明光敏PRP凝胶可以显著改善肌腱断裂的愈合质量，促进损伤肌腱的修复。
实施例6：
光敏PRP水凝胶修复兔下颌骨缺损
采用新西兰雄性大白兔，于下颌骨制造1.5×0.8cm骨缺损，建立下颌骨缺损模型。随后，根据跟骨缺损处处理方式的不同，将兔子随机等分成三组：A.光敏PRP凝胶组(将PRP/HA-NB前体溶液滴加到缺损处，365nm光致原位成胶)；B.PRP凝胶组(将体外利用凝血酶的氯化钙溶液制备的PRP凝胶直接移植到缺损处)；C.对照组(缺损不做处理，直接关闭伤口)。术后1,2,3个月取材，并且进行microCT检测，标本固定、脱钙、脱水、石蜡包埋，切片，HE染色。主要观察：①缺损处新骨生成情况；②新生组织与缺损周围组织的整合性。结果显示光敏PRP水凝胶不但可以促进缺损处新骨生成，而且新生骨组织紧密的整合到缺损周围组织，其结果要优于传统PRP凝胶的修复结果。
实施例7：
光敏PRP凝胶修复烧伤创面
深Ⅱ度烧伤创面达深皮层，其再生需要损伤区域残存的少量真皮组织和皮肤附件的自我修复。前期的临床报道显示局部外敷PRP可以刺激血管再生、增加胶原沉积、缩短伤口炎症反应期、加速创面表皮化生。然而目前临床应用PRP的难题在于外敷的PRP难以有效固定在创面，极易自行流失或随敷料移除，严重影响了PRP在创面发挥作用。本发明开发的光敏PRP水凝胶光交联方法成胶，同时可以将PRP凝胶通过化学键牢固的固定到创面发挥修复作用，并且实现对修复过程起关键作用的细胞因子的可控释放，彻底解决了传统PRP凝胶在烧伤创面处理中存在的缺陷
实施例8：
光敏PRP凝胶用于皮肤美容
在皮肤美容领域，PRP可以通过释放生长因子促进组织生长，改善皮肤皱纹，松弛，以及皮肤质地问题。然而目前临床应用PRP的难点在于如何将其有效聚集到需要美容的皮肤部位发挥作用。局部外敷PRP难以有效固定，PRP极易流失。而局部注射是一种有创操作，增加了患者的痛苦，注射部位有感染风险，且有误伤血管神经的风险。本研究开发的光敏PRP凝胶可以有效黏附在皮肤表面发挥美容作用。另外该光敏PRP凝胶的中可以使用透明质酸组分成胶，而透明质酸可以使皮肤保水、柔嫩、光滑、去皱、增加弹性和防止衰老，在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂。
实施例9：
光敏PRP凝胶修复周围神经损伤
周围神经损伤后，损伤部位需要大量生长因子对损伤神经元和神经纤维进行修复。PRP富含生长因子，目前已有探讨PRP局部注射治疗周围神经损伤的实验报道。然而采用局部注射的方式难以充分发挥PRP的作用，局部注射无法有效定位损伤部位，且PRP很快被吸收或弥散，无法在损伤部位长期聚集，局部注射还有造成血管神经损伤的风险。本研究开发的光敏PRP凝胶可以有效粘附于神经损伤部位发挥作用。本研究验证了光敏PRP凝胶对神经损伤的修复效果，采用新西兰大白兔，制造坐骨神经损伤模型(在梨状肌下缘1.5cm出锐刀切断坐骨神经，并用8-0纤维缝线缝合)。动物随机分成3组，A.光敏PRP凝胶组(将PRP/HA-NB前体溶液均匀涂抹到神经损伤处，365nm光致原位成胶)；B.PRP凝胶组(将体外利用凝血酶的氯化钙溶液制备的PRP凝胶直接外敷到神经损伤处)；C.对照组(神经损伤缝合后直接关闭伤口)。术后8、12周行大体观察、神经电生理检测，并取材行光镜电镜检测。结果显示，光敏PRP凝胶组神经传导速度较优于其他两组，差异有显著性差异；大体观察显示神经的连续性和完整性较好，神经表面血管新生丰富；光镜电镜观察可见大量有髓纤维再生。这说明光敏PRP凝胶原位固定到神经损伤部位可以显著促进神经修复。
实施例10：
光敏PRP凝胶促进退变椎间盘修复
椎间盘退变是下腰疼的主要病因，研究显示PRP对退变椎间盘组织有修复作用，然后局部注射难以将PRP有效固定在椎间隙发作作用，本研究采用光敏PRP凝胶修复退变椎间盘。采用新西兰大白兔，通过纤维环穿刺法建立兔椎间盘退变模型(intervertebral discdegeneration,IDD)。动物随机分成3组，A.光敏PRP凝胶组(将PRP/HA-NB前体溶液注射到椎间盘内，365nm光致原位成胶)；B.PRP组(将PRP直接注射到椎间盘内)；C.对照组(暴露椎间隙后不做特殊处理)。干预后2周，行X线及MRI检测，取材行HE染色、番红O染色、Masson染色及免疫组化染色。结果显示，光敏PRP凝胶组有效维持了椎间隙高度，椎间盘组织形态变化不明显，髓核软骨细胞无明显退变和坏死。这说明光敏PRP凝胶可以将PRP牢固固定在椎间盘部位修复退变椎间盘组织。
实施例11：
光敏PRP凝胶修复口腔粘膜溃疡
口腔黏膜溃疡临床较为常见，因口腔黏膜的敏感性和粘液分泌等因素增加了修复的难度，导致创面愈合较差。传统治疗方法包括消炎喷剂贴剂等不能有效固定于损伤部位，仅能在短期内缓解疼痛症状。PRP含有丰富的生长因子，局部应用能够对组织损伤有促进作用。光敏PRP凝胶可以将PRP牢固的固定于损伤部位发作作用。我们检测了该光敏PRP凝胶对大鼠口腔溃疡模型的治疗作用。采用清洁级雄性Wister大鼠，在口腔颊粘膜制作直径10mm圆形缺损，造成口腔黏膜缺损模型。大鼠随机分成3组，A.光敏PRP凝胶组(将PRP/HA-NB前体溶液滴加到黏膜缺损处，365nm光致原位成胶)；B.PRP凝胶组(将体外利用凝血酶的氯化钙溶液制备的PRP凝胶直接移植到黏膜缺损处)；C.对照组(黏膜缺损不做处理)。术后1、2、3周行大体观察，并取材通过组织学评价新生口腔黏膜变化，对比新生黏膜炎症细胞及成纤维细胞的生成情况；通过免疫组化评价新生黏膜的血管化及上皮角化程度。结果显示光敏PRP水凝胶组可见排列规则、层数较厚的新生上皮细胞，固有层可见较多新生小血管，胶原排列致密，且新生的黏膜组织与周围正常组织具有良好的整合性。这说明光敏水凝胶可以将PRP稳定的固定在缺损部位发挥修复黏膜损伤的作用。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种光敏富血小板血浆凝胶的制备方法，其特征在于，邻硝基苄基类光响应基团修饰的高分子的生物相容性介质溶液同提取的PRP以一定比例混合形成凝胶前体溶液；然后对凝胶前体溶液进行光照射，邻硝基苄基类光响应基团修饰的高分子中的邻硝基苄基基团在光源的激发下发生光化学反应产生醛基官能团，并同PRP中各种蛋白表面分布的氨基发生偶联反应，形成亚胺键，从而实现光敏富血小板血浆凝胶的制备。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的邻硝基苄基类光响应基团修饰的高分子结构如下所示：
Figure FDA0002222842040000011
其中，R1为-H或选自以下组的取代基：
酯键类取代基：-CO(CH2)xCH3、-CO(CH2CH2O)xCH3、-CO(CH2)x(CH2CH2O)yCH3，
醚键类取代基：-(CH2)xCH3、-(CH2CH2O)xCH3、-(CH2)x(CH2CH2O)yCH3、
Figure FDA0002222842040000012
碳酸酯键类取代基：-COO(CH2)xCH3、-COO(CH2CH2O)xCH3、-COO(CH2)x(CH2CH2O)yCH3，
异氰酸酯键类取代基：-CONH(CH2)xCH3、-CONH(CH2CH2O)xCH3、-CONH(CH2)x(CH2CH2O)yCH3，
R1选取的以上各取代基中，x和y≥0且为整数，x和y相同或不相同；
R2为-H或选自以下组的取代基：-O(CH2)xCH3、-O(CH2CH2O)xCH3、-O(CH2)x(CH2CH2O)yCH3，R2选取的以上各取代基中，x和y≥0且为整数，x和y相同或不相同；
R3选自氨基类连接键-O(CH2)xCONH(CH2)yNH-、卤代类连接键-O(CH2)x-或羧基类连接键-O(CH2)xCO-，R3选取的以上各取代基中，x和y≥1且为整数，x和y相同或不相同；
R4为-H或-CONH(CH2)xCH3，其中x≥0且为整数；
P1为亲水性或水溶性天然多糖类聚合物、亲水性或水溶性蛋白及多肽类聚合物、或亲水性或水溶性合成聚合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述亲水性或水溶性天然多糖类聚合物包括天然多糖类聚合物及其修饰物或降解物，天然多糖类聚合物包括透明质酸、海藻酸、肝素、葡聚糖、羧甲基纤维素、乙二醇壳聚糖、丙二醇壳聚糖、壳聚糖乳酸盐、羧甲基壳聚糖及壳聚糖季铵盐；
所述亲水性或水溶性蛋白及多肽类聚合物选自各种亲水性或水溶性动植物蛋白、胶原、血清蛋白、明胶及其修饰物、改性物和及其降解的多肽类聚合物；
所述亲水性或水溶性合成聚合物选自两臂或多臂聚乙二醇、聚乙烯亚胺、树枝体、合成多肽、聚赖氨酸、甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酰胺的聚合物及其修饰物；以上聚合或接枝的水溶或亲水性聚合物中，单分子聚合物的邻硝基苄基类光响应基团的平均个数大于或等于2。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述生物相容性介质选自生理盐水或生理缓冲液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述PRP是提取的各种来源的PRP，其提取方法根据临床应用中提取PRP的标准方法进行提取。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述凝胶前体溶液中邻硝基苄基类光响应基团修饰的高分子的质量浓度为0.01％-30％，PRP在凝胶前体溶液中的体积分数为10％-90％。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，进行光照射时所使用光源的波长为250nm–500nm，光照时间为1min–5min。
8.一种采用权利要求1-7中任一项所述制备方法制得的光敏富血小板血浆凝胶。
9.如权利要求8所述的光敏富血小板血浆凝胶的应用，其特征在于，光敏富血小板血浆凝胶包括以下领域的应用：
所述的光敏富血小板血浆凝胶在制备细胞因子缓释剂上的应用；
所述的光敏富血小板血浆凝胶在制备皮肤创面修复剂、烧伤创面修复剂、糖尿病诱发的慢性皮肤创面修复剂或溃疡面、各种粘膜创面或溃疡面修复剂上的应用；
所述的光敏富血小板血浆凝胶在制备关节软骨损伤修复剂上的应用；
所述的光敏富血小板血浆凝胶在制备骨组织损伤修复剂上的应用；
所述的光敏富血小板血浆凝胶在制备肌腱或韧带损伤修复剂上的应用；
所述的光敏富血小板血浆凝胶在制备颌面外科治疗牙周骨缺损或拔牙伤口或植牙区骨不足修复剂上的应用；
所述的光敏富血小板血浆凝胶在制备中枢或周围神经损伤修复剂上的应用；
所述的光敏富血小板血浆凝胶在制备退变椎间盘或脊柱融合修复剂上的应用；
所述的光敏富血小板血浆凝胶在制备各种手术创面的封闭、止血及促进修复用剂上的应用；
所述的光敏富血小板血浆凝胶在制备美容凝胶上的应用。
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