CN102526803B - 一种仿生基质型生物愈创材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新型仿生基质型生物愈创材料的制备方法，本发明采用具有三维支架结构的小肠粘膜下层和含有特定比例的生物活性因子的富血小板血浆复合，并经特定工艺修饰改性后，形成含有生物诱导因子的三维仿生结构新型材料。采用本发明制成的仿生基质型生物愈创材料不仅可以促进愈合而且可以促进生理性、抑制病理性修复，提高受损组织的再生修复效率和修复质量。而且这种新型生物愈创材料可用于人体各种软组织、膜状组织或腔体壁的修复、空腔的填充，并且可作为理想的细胞外基质仿生物、细胞支架材料用于组织、器官的创伤修复、促进创伤愈合和防粘连等。
Description
技术领域
本发明涉及一种医用仿生材料的制备方法，尤其涉及一种通过特定交联方法制备同时具有复合性、仿生性的仿生基质型生物愈创材料的方法。
背景技术
创伤、感染、肿瘤、功能性萎缩以及手术等因素造成的组织缺损的再生修复一直是困扰临床治疗的主要难题之一。通过生物愈创材料进行替代性组织修复解决上述问题是目前研究的热点，也是国内外学者普遍关注的焦点。目前临床上可供使用的生物愈创材料，其结构和性能与机体组织有明显差异，植入后与机体间相互刺激从而产生各种刺激性反应，严重影响了临床治疗质量。
随着再生医学的理念兴起和完善，仿生化修复已经逐渐成为再生修复的发展方向。仿生化修复材料是根据受体组织或部位的天然结构特征，对生物材料进行相应的修饰或衍生使其结构与受体位点的天然结构相同或相近，再以特定工艺处理赋予其仿生化的细胞外基质成分和因子，从而最终形成的仿生化生物材料。这种材料由于近似天然组织，因此组织相容性好，其特定结构和因子还可诱导受体组织的原位生理性修复，材料自身随着新组织在原位的形成后还可降解吸收，因此比常规治疗方式以及传统的愈创材料更能适应不同临床需求。
小肠粘膜下层（SIS）是一种不含细胞的细胞外基质材料，其结构接近天然结缔组织，不仅可起支架作用，而且具有特殊的生理功能，各种基质成分之间相互关系密切，与细胞亲和力良好，可以更有效地传递分子和细胞信息，引导组织重建、塑形。富血小板血浆（PRP）是自体全血经离心后得到的血小板浓缩物，含大量自体源生长因子如，血小板衍生因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、转化生长因子（TGF）、上皮生长因子（EGF）等，其约为体内正常浓度的3~17倍，但各因子的比例与体内正常比例相似，可协同作用促进组织愈合和组织再生。目前，SIS和PRP均已成功用于再生医学领域的工程支架、创伤修复、组织再生等方面的研究，但受各自结构、组成以及应用形式等因素的限制，仅能在一定程度上促进愈合速度、提高愈合质量，而难以达到功能良好的仿生型再生修复效果。目前已有许多文献报道，将多种生物性能良好的材料以特定比例共混或修饰改性制备复合材料，使其具备更优的生物学性能，例如将SIS与壳硫酸钙、羟基磷灰石等按照一定比例共混，或者将SIS与胶原蛋白、多糖采用化学或生物学手段进行交联，从而制备力学、生物学性能更好的复合型材料。但迄今尚未见有将SIS与PRP共混制备基质型仿生愈创材料的相关报道。
发明内容
本发明提供了一种仿生基质型生物愈创材料的制备方法，其目的在于，弥补上述基质型仿生愈创材料的制备技术缺陷，提供一种通过将SIS与PRP共混方法，从而制备基质型仿生愈创材料。
本发明仿生基质型生物愈创材料的制备方法通过以下技术方案实现其目的：
一种仿生基质型生物愈创材料的制备方法，其中，包括细胞外基质型仿生化三维结构的构建，其制备方法为：
第一步：将动物小肠经物理处理、化学处理以及脱细胞处理后，得到动物小肠粘膜下层，并制成小肠粘膜下层水合凝胶；
第二步：将所制取的小肠粘膜下层水合凝胶与富血小板血浆按一定比例混合；
第三步：在第二步得到的混合物中加入定量的初次交联剂，混匀，反应一定时间后加入二次交联剂，搅匀，反应0.5~10h；
第四步：加入交联反应抑制剂，终止反应并清洗除去副产物，固定成型。
上述的制备方法，其中，第二步中所述富血小板血浆和小肠粘膜下层的质量比例为1:5~1:10。
上述的制备方法，其中，所述第三步中，在加入初次交联剂时，初次交联剂与混合物体积比例为1:120~1:20；加入二次交联剂，二次交联剂与混合物的体积比例为1:20~5:1。
上述的制备方法，其中，所述第三步中，初次交联剂为双醛基交联剂、芳香叠氮化钠基交联剂、碳化二亚胺基交联剂、异氰酸基交联剂、天然生物交联剂中的任意一种。
上述的制备方法，其中，所述天然生物交联剂为：花青素、京尼平苷、天然多酚、生物酶中的任意一种。
上述的制备方法，其中，所述第三步中，二次交联剂为二价金属离子、生物酶、离子/生物酶复合物、天然多糖或小分子多肽类物质中的任意一种。
上述的制备方法，其中，在所述第四步中，抑制剂与所用的全部交联剂体积比为1:1~5:1。
上述的制备方法，其中，所述固定成型方式包括采用冷冻干燥、真空干燥、复层挤压成型。
上述的制备方法，其中，上述第三步中，在加入初次交联剂后静置反应1~30min后，加入二次交联剂。
上述的制备方法，其中，上述第二步中富血小板血浆采用二次离心法制备，其过程为，采用装有抗凝剂的无菌离心管采集血液，在第一次离心7~15min后，吸弃上清液至交界面上3mm；吸取全部上清及交界面下约3mm，二次离心7~15min，吸取全面上清及交界面下约3mm，即制得富血小板血浆。
采用本发明仿生基质型生物愈创材料的制备方法制备而成的生物愈创材料的优点在于：
1．采用本发明制成的仿生基质型生物愈创材料不仅具有细胞外基质制成的仿生型支架结构，而且富含配比接近生理黄金比例的各种活性因子，是“细胞基质+活性因子”的新型仿生结构，其特定结构和因子可诱导受体组织的原位生理性修复，减少因病理性瘢痕修复造成的预后功能不佳或美观度不够等负面情况。
2．采用本发明制成的仿生基质型生物愈创材料自身随着新组织在原位的形成后还可降解吸收，免于二次手术的精神痛苦和经济压力，因此比常规治疗方式以及传统的愈创材料更能适应不同临床需求。
3．采用本发明制成的仿生基质型生物愈创材料具有很好的生物安全性和生物活性，体外细胞试验结果显示，这种新型生物愈创材料可以促进细胞的增殖、蛋白合成、细胞迁移，甚至可以增强细胞对抗逆性环境的能力，显示这种仿生基质型生物愈创材料有望为环境友好型新材料用于临床相关病症的预防或治疗。
4．采用本发明制成的仿生基质型生物愈创材料在临床上可广泛应用于人体各种软组织、膜状组织或腔体壁的修复、空腔的填充，并且可作为理想的细胞外基质仿生物、细胞支架材料用于组织、器官的创伤修复、促进创伤愈合和防粘连等方面，应用范围广。
附图说明
图1a为采用本发明制成的仿生基质型生物愈创材料的立体结构示意图；
图1b为采用本发明制成的仿生基质型生物愈创材料的交联结构示意图；
图2a~ 2d为采用本发明制成的仿生基质型生物愈创材料与不采用本发明制成的材料的常规处理组生理实验结果对比图，其中，图 2a表示材料促进细胞增殖能力；图2b表示材料促进蛋白合成能力；图2c表示材料促进细胞迁移能力；图2d表示增强细胞对抗氧化剂胁迫的能力。
具体实施方式
下面采用具体的实施例用于详细阐述本发明仿生基质型生物愈创材料的制备过程，并对结合附图说明制成的仿生基质型生物愈创材料结构特点及其优点。
实施例1
本发明仿生基质型生物愈创材料的制备方法的步骤如下：
第一步：选择来源可追溯、符合检验检疫要求的猪小肠，刮除肌肉、浆膜等冗余组织，去离子水冲洗干净，EDTA（100mmol/L）/NaOH（10mmol/L）溶液浸泡16h，去离子水冲洗后置于pH值为3~4的盐酸/PBS溶液处理6~8h，去离子水冲洗除去残余的酸溶液，磷酸盐缓冲液（PBS）浸泡16～18h，去离子水反复冲洗。0.1%的过氧乙酸/20%乙醇溶液浸泡8h，再置0.05%叠氮化钠/PBS溶液中清洗2h，γ射线照射灭菌。无菌操作匀浆，制备SIS水合凝胶。
第二步：二次离心法制备富血小板血浆（PRP）：选择18号针头的50ml无菌针管快速取新鲜血液，针管中含10%枸橼酸钠抗凝剂2.4ml，取全血至24ml，转移至50ml无菌离心管中。室温条件下，200×g 离心10min，液体分为三层，中层即为富血小板血浆。用无菌吸管吸弃上清液至上层与中间层的交界面上3mm。用无菌吸管吸取全部上清以及交界面下约3mm，转移至新的无菌离心管中，200×g二次离心10min，吸取全面上清及交界面下约3mm即为PRP。
第三步：取制备好的SIS水合凝胶0.5g和PRP 0.1g，搅拌混匀。
第四步：4℃条件下，无菌操作向第三步的混合物中加入0．25%戊二醛/乙酸溶液（pH值为5）0.025ml，混匀，静置1.5h，加入100U／ml牛凝血酶/10%CaCl2溶液2ml，混匀，室温交联4h。加入0.2ml 0.2mol/L赖氨酸终止交联反应。
第五步：吸弃残余溶液，用15ml无菌PBS液少量多次，反复冲洗。
第六步：将上述反应产物转移至无菌模具中，低温冷冻干燥，成型，制得仿生基质型生物愈创材料。
所述的猪小肠其来源应由有国家认可资质的生产企业提供的动物检验检疫证书，有可追溯编号。
实施例2
本发明仿生基质型生物愈创材料的制备方法的步骤如下：
第一步：同实施例1。
第二步：同实施例1。
第三步.取制备好的SIS水合凝胶0.5g和PRP 0.25g，搅拌混匀。
第四步：4℃条件下，无菌操作向第三步的混合物中加入0．2%京尼平/NaHCO3 溶液（pH值为10）0.75ml，混匀，静置1.5h，加入10%CaCl2溶液3.5ml，混匀。室温交联5.5h。
第五步：吸弃残余溶液，用10ml无菌PBS液少量多次反复冲洗。
第六步：将上述反应产物至无菌模具中，-20℃反复冻融3次，再冷冻干燥成型，制得仿生基质型生物愈创材料。
实施例3
本发明仿生基质型生物愈创材料的制备方法的步骤如下：
第一步：同实施例1。
第二步：同实施例1。
第三步：取制备好的SIS水合凝胶0.5g和PRP 0.5g，搅拌混匀。
第四步：4℃条件下，无菌操作向第三步的混合物中加入0．25%醛化褐藻酸/乙酸溶液（pH值为5）0.5ml，混匀，静置1 h，加入10%CaCl2溶液4.5ml，混匀。室温交联5 h。
第五步：吸弃残余溶液，用12.5ml无菌PBS液少量多次，反复冲洗。
第六步：将上述反应产物至无菌模具中，-20℃反复冻融3次，再冷冻干燥成型，得仿生基质型生物愈创材料。
实施例4
本发明仿生基质型生物愈创材料的制备方法的步骤如下：
第一步：同实施例1。
第二步：同实施例1。
第三步：取制备好的SIS水合凝胶0.5g和PRP 0.05g，搅拌混匀。
第四步：4℃条件下，无菌操作向第三步的混合物中加入0．1%花青素溶液0.5ml，混匀，静置2.5h，加入100U／ml牛凝血酶-10%CaCl2溶液0.25ml，混匀。室温交联5.5 h。
第五步：吸弃残余溶液，用10ml无菌PBS液少量多次，反复冲洗。
第六步：将上述反应产物至无菌模具中，紫外照射30min，真空干燥成型，得仿生基质型生物愈创材料。
附图解析
如图1a和1b所示，其中图1a为采用本发明制成的仿生基质型生物愈创材料为细胞外基质型仿生化三维结构结构示意图，图1b为本发明制成的仿生基质型生物愈创材料的交联结构图所示，其中图1b为图1a的任意向的剖面视图。图中三维支架1由小肠粘膜下层构成，其内部主体结构为三维网状结构，且充填有富血小板血浆血浆。其中标记2、3、4为富血小板血浆中的各类活性因子。
性能测试：
根据ISO10993-12:2007标准的要求制备仿生基质型生物愈创材料的浸提液，将本发明上述实施例1中制备的仿生基质型生物愈创材料浸泡在所述测试液中，进行细胞实验，得出各项数据。并与不采用本发明制成的材料治疗的常规处理创伤时人体的创伤处的各项性能数据作分析对比。
其中，实验组代表本发明实施例1中制备的仿生基质型生物愈创材料的测试数据；对照组为常规处理的测试数据。图2a表示材料促进细胞增殖能力对比（测试条件490nm）；图2b表示材料促进蛋白合成能力；图2c表示材料促进细胞迁移能力；图2d表示增强细胞对抗氧化剂胁迫的能力（测试条件490nm）。图2a和2d中的纵坐标OD是optical density（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里的专有名词，其中1OD＝1og（1／trans），其中trans为检测物的透光值。光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成正比。
对比结果如图2所示：采用本发明制备的仿生基质型生物愈创材料的各项数据均优于常规处理组。如图所示：
图2a中，实验组的OD值明显大于对照组，其结果表明，在相同治疗过程中，采用本发明制备的仿生基质型生物愈创材料治疗的人体创伤部份的细胞增殖速度明显强于常规处理方法的细胞增殖速度，其更有利于人体创伤处伤口的愈合。
图2b中，在相同条件环境下，实验组的蛋白质含量远远超过对照组的蛋白质含量，其结果表明，采用本发明制备的仿生基质型生物愈创材料，更有利于蛋白质的合成。
图2c中，将常规处理组的细胞迁移能力设定为100%，则图中数据表明，采用本发明制备的仿生基质型生物愈创材料的实验组的细胞迁移能力显著增强，使得创伤发生后其他部位的正常细胞能更快的迁移至伤口处，促进组织修复，加快伤口愈合。
图2d中，其中对照组、胁迫组、实验组分别代表了为正常条件下细胞的增殖能力、氧化剂存在的逆性环境条件下细胞的增殖能力、和氧化剂存在的逆性环境条件下采用本发明制备的仿生基质型生物愈创材料的细胞增殖能力。其数据结果表明，即使在有氧化剂存在的逆性环境条件下，本发明仿生基质型生物愈创材料的细胞依然有很强细胞增殖能力，表明本材料可有效的增强细胞对抗逆性环境的能力，减轻逆性因素对细胞造成的损伤，使得细胞在逆性环境中仍然保持良好的增殖能力，有助于创伤修复。
根据上述实验结果的分析，可以看出采用本发明制备的仿生基质型生物愈创材料能很好地显著促进细胞增殖增殖、蛋白合成、细胞迁移，甚至可以增强细胞对抗逆性环境的能力，减轻氧化剂对细胞的胁迫作用。这些功效可有效的增快人体创伤处伤口的愈合速度。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种仿生基质型生物愈创材料的制备方法，其特征在于，包括细胞外基质型仿生化三维结构的构建，其制备方法为：
第一步：将动物小肠经物理处理、化学处理以及脱细胞处理后，得到动物小肠粘膜下层，并制成小肠粘膜下层水合凝胶；
第二步：将所制取的小肠粘膜下层水合凝胶与富血小板血浆按一定比例混合；
第三步：在第二步得到的混合物中加入定量的初次交联剂，混匀，反应一定时间后加入二次交联剂，搅匀，反应0.5～10h；
第四步：加入交联反应抑制剂，终止反应并清洗除去副产物，固定成型。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，第二步中所述富血小板血浆和小肠粘膜下层的质量比例为1:5～1:10。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第三步中，在加入初次交联剂时，初次交联剂与混合物体积比例为1:120～1:20；加入二次交联剂，二次交联剂与混合物的体积比例为1:20～5:1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第三步中，初次交联剂为双醛基交联剂、芳香叠氮化钠基交联剂、碳化二亚胺基交联剂、异氰酸基交联剂、天然生物交联剂中的任意一种。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述天然生物交联剂为：花青素、京尼平苷、天然多酚、生物酶中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第三步中，二次交联剂为二价金属离子、生物酶、离子/生物酶复合物、天然多糖或小分子多肽类物质中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述第四步中，抑制剂与所用的全部交联剂体积比为1:1～5:1。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述固定成型方式包括采用冷冻干燥、真空干燥、复层挤压成型。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，上述第三步中，在加入初次交联剂后静置反应1～30min后，加入二次交联剂。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，上述第二步中富血小板血浆采用二次离心法制备，其过程为，采用装有抗凝剂的无菌离心管采集血液，在第一次离心7～15min后，吸弃上清液至交界面上3mm；吸取全部上清及交界面下约3mm，二次离心7～15min，吸取全部上清及交界面下约3mm，即制得富血小板血浆。
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