CN103687631B - 促凝血肽及其衍生物以及它们的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及止血或组织密封材料，其具有：(a)具有序列SEQ ID NO:1的肽或其氨基酸类似物序列，以及(b)用于所述肽或氨基酸类似物序列的支架。所述支架优选地是止血的，例如天然的或经基因工程改造的可吸收聚合物、合成的可吸收聚合物、或它们的组合。所述天然的或经基因工程改造的可吸收聚合物可选自蛋白质、多糖、或它们的组合。

Description

促凝血肽及其衍生物以及它们的用途
序列表
本专利申请包含已经以ASCII格式通过EFS-Web提交的序列表，所述序列表据此完整地引入以供参考。所述ASCII副本创建于2011年6月28日，命名为ETH5623.txt，大小为4,912字节。
技术领域
本发明整体涉及促进止血的试剂和装置以及组织密封材料，并且更具体地讲，涉及具有强效止血性能和组织密封性能并且与支架(例如基于明胶的止血支架)结合的合成肽。
背景技术
血液是液体组织，包括分散于液相中的红细胞、白细胞、触觉小体和血小板。液相是血浆，其包括酸、脂质、溶解的电解质和蛋白质。悬浮于液相中的一种特定蛋白是纤维蛋白原。当出血发生时，纤维蛋白原与水和凝血酶(酶)反应以形成纤维蛋白，所述纤维蛋白不溶于血液中并聚合以形成凝块。
在广泛多样的情况下，动物包括人可遭受由于伤口或外科手术期间的出血。在一些情况下，出血是相对少量的，并且除施加简单急救之外的正常血液凝固功能是所需要的全部。在其他情况下，可发生大量出血。这些情况通常需要专门的设备和材料以及受过训练的施用适当援助的人员。
在解决上述问题的努力中，已开发了用于控制过量出血的材料。
先前已知的材料例如明胶、胶原、氧化纤维素、凝血酶、纤维蛋白原和其他材料已被使用，但这些材料中的每一个具有局限性。例如，一类现有技术的血液凝固材料是血液衍生的蛋白质或酶，包括纤维蛋白原和/或凝血酶，其是昂贵的，需要专门的贮存条件，并且需要广泛纯化，以便消除关于血源性感染传播的可能性。
包含液体凝血酶的止血装置具有特殊处理要求，以保持凝血酶的生物活性。例如，液体凝血酶需要冷藏以保持贮存期稳定性。当使用由动物或人得到的凝血酶时，安全也是所关注的，因为存在污染物或免疫原性的一些风险。另外，由人或动物的血浆纯化的凝血酶和纤维蛋白原非常昂贵。因此，开发具有更大的贮存期稳定性、更低的病毒等污染物风险和更低免疫原性、低成本并且可在肝素化血液中发挥作用的新型止血剂是有利的。
人蛋白血小板反应蛋白-1(TSP-1)和相关的肽在文献中被描述为参与血管生成和血小板聚集。TSP-1是同源三聚体糖蛋白(MW～450K)，首先作为凝血酶敏感蛋白在血小板中发现。
Bonnefoy等人的论文“The evolving role of thrombospondin-1(TSP1)inhemostasis and vascular biology”，Cell.Mol.Life Sci.65(2008)713–727将TSP1描述为参与血管生成、炎症、伤口愈合和止血，并进一步提及了TSP1的结构和域以及氨基酸(SEQID NO:1)肽与CD47的结合。
Trumel等人的论文“Platelet aggregation induced by the C-terminalpeptide of thrombospondin-1requires the docking protein LAT but is largelyindependent of alphaIIb/beta3”，Journal of Thrombosis and Haemostasis,2003Feb；1(2):320-9教导血小板反应蛋白-1(TSP1)在血小板活化期间大量分泌，并且在不可逆的血小板聚集过程中发挥作用。来源于TSP1的C端域的肽(SEQ ID NO:1)可以至少部分地通过其与整联蛋白相关蛋白的结合而活化人血小板。
Chung等人的论文“Thrombspondin Acts via Integrin-associated Protein toActivate the Platelet Integrin αIIbb3”，J Biol Chem 1997；272No.23,Issue ofJune 6,pp.14740–14746教导，来自CBD的肽(SEQ ID NO:2)(4N1K)已被鉴定为IAP激动剂。TS1、CBD以及来自TS1的CBD的IAP激动剂肽(4N1K)将血小板整联蛋白aIIbb3活化，从而使血小板分散在固定化纤维蛋白原上、刺激血小板聚集，并提高粘着斑激酶的酪氨酸磷酸化。
Tuszynski等人的论文“Thrombospondin promotes platelet aggregation”，Blood,72,109-115(1988)教导，虽然TSP在止血过程中的作用尚不是很清楚，但据推测TSP将血小板-纤维蛋白原聚集体交联、稳定纤维蛋白凝块的形成并调节纤维蛋白溶解，并且研究已表明TSP可通过抑制血小板粘附和提供非血栓形成性表面而在止血过程中发挥调节作用。
Chung等人的论文“Thrombospondin-1acts via IAP/CD47to synergize withcollagen in alpha2beta1-mediated platelet activation”，Blood.1999Jul15；94(2):642-8描述，来源于CBD的CD47激动剂肽4N1K(SEQ ID NO:2)与可溶性胶原协同加强富血小板血浆的凝聚。4N1K和完整的TS1还诱导经洗涤且未搅拌的血小板在固定化胶原上的聚集，并且酪氨酸磷酸化快速增加。
Dorahy等人的论文“Stimulation of platelet activation and aggregationby a carboxyl-terminal peptide from thrombospondin binding to the integrin-associated protein receptor”，J.Biol Chem 1997；272:1323–1330教导，来自血小板反应蛋白的羧基端的肽(SEQ ID NO:1)在5-25mM的浓度下直接并特异性地诱导来自不同供体的经洗涤人血小板发生活化和聚集。在低浓度下，肽与次最佳浓度的ADP协同诱导聚集。使用肽亲和色谱以及与单克隆抗体的免疫沉淀反应将羧基端肽的受体识别为整联蛋白相关蛋白。当在5mM EDTA存在下用乱序肽洗涤时，整联蛋白相关蛋白保持结合到包含SEQ IDNO:1的肽柱，从而表明二价阳离子独立性缔合。这表明，整联蛋白相关蛋白是休眠血小板表面上的血小板反应蛋白的主要受体，并且与增强血小板聚集响应有关。
Fujimoto等人的论文“Thrombospondin-bound integrin-associated protein(CD47)physically and functionally modifies integrin alphaIIbbeta3by itsextracellular domain”，J Biol Chem 2003；278:26655–26665教导，来自C端细胞结合域的肽(SEQ ID NO:2(4N1K))结合至IAP，并刺激包括血小板聚集在内的整联蛋白依赖性细胞功能。由4N1K诱导的血小板聚集不能通过使用叠氮化钠和2-脱氧-D-葡萄糖进行的能源耗竭完全抑制，但ADP或胶原诱导的血小板响应被完全抑制。
Tulasne等人的论文“C-terminal peptide of thrombospondin-1inducesplatelet aggregation through the Fc receptor chain-associated signalingpathway and by agglutination”，Blood 2001；98:3346-3352教导，已报道来自血小板反应蛋白-1的C端域的肽(Arg-Phe-Tyr-Val-Val-Met-Trp-Lys(SEQ ID NO:1)；称为4N1-1)诱导血小板聚集并结合到整联蛋白相关蛋白(IAP)(其也称为CD47)。已发现，4N1-1或其衍生肽4N1K诱导人血小板中的Fc受体(FcR)g链、Syk、SLP-76和磷脂酶C g2的快速磷酸化。参考文献教导，血小板反应蛋白的C端肽通过FcR g-链信号通路并通过凝集作用诱导血小板聚集。
Voit等人的论文“The C-terminal peptide of thrombospondin-1stimulatesdistinct signaling pathways but induces an activation-independentagglutination of platelets and other cells”，FEBS Letters,2003；544:240-245教导，已经提出来自血小板反应蛋白-1的C端域的肽(4N1-1)通过新型机制刺激血小板聚集，所述机制涉及非活化状态依赖性凝集和活化状态依赖性的由糖蛋白(GP)IIb/IIIa介导的聚集二者，后者涉及GPVI信号转导但不涉及CD47。研究证明，4N1-1刺激与GPVI激动剂convulxin模式不同的信号转导通路。此外，4N1-1诱导的血小板聚集是非活化状态依赖性的，并且不依赖GPVI或GPIIb/IIIa。4N1-1还刺激不同巨核细胞和非巨核细胞的非活化状态依赖性凝集。抗CD47抗体抑制由4N1-1诱导的细胞凝集而不是血小板信号转导。
Bonnefoy等人的论文“A model of platelet aggregation involving multipleinteractions of thrombospondin-1,fibrinogen,and GPIIbIIIa receptor”，J BiolChem 2001；276:5605–5612教导，血小板反应蛋白-1(TSP)在从血小板α颗粒分泌出来后可能参与血小板聚集，但对其作用方式知之甚少。研究评估了TSP通过其与纤维蛋白原(Fg)的相互作用而形成血小板间横桥的能力，所述评估使用涂布Fg的小珠或结合Fg的活化GPIIbIIIa整联蛋白(GPIIbIIIa*)之一进行，后者固定化在小珠或活化的固定血小板(AFP)上，即，处于不含血小板信号转导和分泌机制的体系中。
Frazier等人的美国专利No.5,399,667“Thrombospondin receptor bindingpeptides”(血小板反应蛋白受体结合肽)教导了结合至血小板反应蛋白1受体的新型短肽，其优选地具有五个氨基酸残基，它们共用四肽Arg-Val-Ala-Val(SEQ ID NO:20)并具有特定序列。该专利还教导了结合至血小板反应蛋白1受体的含VVM肽，所述含VVM肽选自RFYVVMWKQVTQS(SEQ ID NO:8)(‘667中的SEQ ID NO:1)及其包含至少序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的片段，以及其包含至少序列SEQ ID NO:5的片段。
授予Jacob等人的美国专利No.5,190,920“Method for using syntheticanalogs of thrombospondin for inhibiting metastasis activity”整体涉及血小板反应蛋白(TSP)的肽片段和合成类似物，它们保持血小板反应蛋白样活性。提供了包含片段的化合物和组合物，以及使用血小板反应蛋白的合成类似物促进或抑制血小板反应蛋白样活性的方法。
授予Thaddeus等人的PCT专利公开WO 1996/040033描述了由生物可降解基质、ε-氨基己酸(EACA)和凝血酶受体活化肽(TRAP)组成的止血贴。该发明还公开了包含作为基质的明胶、海藻酸盐、氧化再生纤维素或胶原，以及作为活性组分的EACA、TRAP、钙、RGD肽和钙的多个代表性实施例。所公开的序列包括SFLLRNPNDKYEPF(SEQ ID NO:9)、SFLLRNPNDKYEP(SEQ ID NO:10)、SFLLRNPNDKYE(SEQ ID NO:11)、SFLLRNPNDKY(SEQ ID NO:12)、SFLLRNPNDK(SEQ ID NO:13)、SFLLRNPND(SEQ ID NO:14)、SFLLRNPN(SEQ ID NO:15)、SFLLRNP(SEQ ID NO:16)、SFLLRN(SEQ ID NO:17)、SFLLR(SEQ ID NO:18)、SFLL(SEQ IDNO:19)、SFL以及它们的衍生物。
授予Stedronsky的美国专利No.7,285,580“Methods of using primermolecules for enhancing the mechanical performance of tissue adhesives andsealants”教导，除天然蛋白质之外，组织粘合剂和密封剂中也可使用各种重组产生的蛋白质。不仅上述的天然蛋白质可以重组产生，而且各种可交联的非天然重组蛋白质也可用于本文。优选的非天然重组产生的蛋白质包括具有天然存在的氨基酸序列块的重复单元的蛋白质，所述序列块来自天然存在的结构蛋白诸如丝蛋白、弹性蛋白、胶原、角蛋白等。所用的优选重复单元蛋白质包括SELP8K、SELP0K-CS1和SELP0K。
授予Bevec等人的PCT专利公开WO 2009/040034“USE OF A PEPTIDE AS ATHERAPEUTIC AGENT”涉及使用肽化合物Arg-Phe-Tyr-Val-Val-Met-Trp-Lys-OH(SEQ IDNO:1)作为预防和/或治疗癌症、自体免疫疾病、纤维化疾病、炎性疾病、神经退化性疾病、感染性疾病、肺部疾病、心脏和血管疾病以及代谢病的治疗剂，还涉及优选地为包含肽Arg-Phe-Tyr-Val-Val-Met-Trp-Lys-OH(SEQ ID NO:1)、任选地连同至少一种配药学上可接受的载体、冷冻保护剂、冻干保护剂、赋形剂和/或稀释剂的冻干粉或液体缓冲溶液或人工母乳制剂或母乳代替物形式的药物组合物。
发明内容
本发明涉及止血或组织密封材料，其具有：(a)具有序列SEQ ID NO:1的肽或其氨基酸类似物序列，以及(b)用于所述肽或氨基酸类似物序列的支架。支架优选地是止血的，例如天然的或经基因工程改造的可吸收聚合物、合成的可吸收聚合物、或它们的组合。天然的或经基因工程改造的可吸收聚合物可选自蛋白质、多糖、或它们的组合。所述蛋白质可选自：凝血酶原、凝血酶、纤维蛋白原、纤维蛋白、纤粘蛋白、肝素酶、因子X/Xa、因子VII/VIIa、因子IX/IXa、因子XI/XIa、因子XII/XIIa、组织因子、巴曲酶(batroxobin)、安克洛酶(ancrod)、蛇静脉酶(ecarin)、血管性血友病因子、胶原、弹性蛋白、白蛋白、明胶、血小板表面糖蛋白、加压素、加压素类似物、肾上腺素、选择素、促凝血毒液、纤溶酶原激活物抑制剂、血小板活化剂、肽、或它们的组合。所述多糖可选自：纤维素、烷基纤维素、甲基纤维素、烷基羟烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素硫酸酯、羧甲基纤维素的盐、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、壳多糖、羧甲基壳多糖、透明质酸、透明质酸的盐、藻酸盐、藻酸、丙二醇藻酸酯、糖原、葡聚糖、硫酸葡聚糖、凝胶多糖、果胶、普鲁兰多糖、黄原胶、软骨素、硫酸软骨素、羧甲基葡聚糖、羧甲基脱乙酰壳多糖、脱乙酰壳多糖、肝素、硫酸肝素、类肝素、硫酸类肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、角叉菜胶、脱乙酰壳多糖、淀粉、直链淀粉、支链淀粉、聚-N-葡糖胺、聚甘露糖醛酸、聚葡糖醛酸、聚古洛糖醛酸、所述多糖的衍生物、或它们的组合。合成的可吸收聚合物可以是脂族聚酯聚合物、脂族聚酯共聚物、或它们的组合。
明胶可以是可吸收止血粉末基质、海绵基质、糊剂基质、凝胶基质、或它们的组合的形式。另外，明胶可以是交联的并与液体载体呈颗粒形式。液体载体可以是生理盐水溶液，其中明胶和肽与作为液相的生理盐水溶液基本上均匀地混合在一起。所述止血材料(粉末、海绵、糊剂或凝胶)中肽的浓度为约0.0025mM至约1.25mM。可将一种或多种添加剂或化合物掺入止血混合物，所述添加剂或化合物选自：抗微生物剂、表面活性剂、抗氧化剂、湿润剂、润湿剂、润滑剂、增稠剂、稀释剂和辐射稳定剂。另外，可以添加用于增强挤出的量的甘油。
在一个实施例中，肽缀合到生物相容性聚合物。生物相容性聚合物可以是亲水性聚合物，例如聚乙二醇、聚乙二醇的衍生物、聚丙二醇、多糖、改性多糖、蛋白质、改性蛋白质、肽、聚丙交酯乙交酯、己内酯、碳酸亚丙酯、淀粉、改性淀粉、明胶、胶原、或它们的组合。
在可供选择的实施例中，亲水性聚合物是具有被选择为提供快速止血或快速组织密封的分子量的聚乙二醇。聚乙二醇分子可以是线性分子、支链分子、星形分子、或它们的组合。分子量可以为平均约1000道尔顿至约8000道尔顿，优选地，所述分子量为平均2000或5000道尔顿。
在可供选择的实施例中，止血或组织密封材料包含的氨基酸类似物序列得自序列SEQ ID NO:1(其中至少一个氨基酸被对应的类似物氨基酸替换)。氨基酸类似物序列可选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、以及它们的组合。
本发明还涉及为伤口部位提供止血处理或组织密封的方法，该方法包括以下步骤：(a)形成上述的止血或组织密封材料，以及(b)将所述止血或组织密封材料施用到伤口部位。
本发明还涉及制备止血或组织密封材料的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供具有序列SEQ ID NO:1的肽或其氨基酸类似物序列，所述肽任选地缀合到聚乙二醇；(b)提供可吸收支架；以及(c)将所述肽和所述可吸收支架基本上均匀地混合，从而形成止血或组织密封材料。
在一个实施例中，将止血材料或组织密封材料以及上述方法用于具有肝素化血液或换句话讲含有抗凝剂或阻凝剂的患者。
附图说明
图1示出了多个测试体系的止血时间数据。
图2示出了多个测试体系的止血时间数据。
图3示出了多个测试体系的止血时间数据。
图4示出了多个测试体系的止血时间数据。
图5示出了多个测试体系的止血时间数据。
图6示出了多个测试体系的止血时间数据。
图7示出了在肝素化血液中的多个测试体系的止血时间数据。
图8示出了在血小板灭活模型中的两个测试体系的止血时间数据。
具体实施方式
氨基酸和肽的常用缩写如下所示：
根据本发明的一个实施例，已发现可来源于人蛋白TSP-1的具有序列RFYVVMWK(Arg-Phe-Tyr-Val-Val-Met-Trp-Lys(SEQ ID NO:1))的8-氨基酸肽(在本文中也称为RK-8，任选地缀合PEG或聚乙二醇化)在与支架材料，优选地止血支架材料联合使用时，具有强效止血性能和/或组织密封性能。
优选的止血支架是天然的或经基因工程改造的可吸收聚合物或合成的可吸收聚合物，或它们的混合物。天然的或经基因工程改造的可吸收聚合物的例子是蛋白质、多糖、以及它们的组合。所述蛋白质包括前凝血酶、凝血酶、纤维蛋白原、纤维蛋白、纤粘蛋白、肝素酶、因子X/Xa、因子VII/VIIa、因子IX/IXa、因子XI/XIa、因子XII/XIIa、组织因子、巴曲酶、安克洛酶、蛇静脉酶、血管性血友病因子、胶原、弹性蛋白、白蛋白、明胶、血小板表面糖蛋白、加压素、加压素类似物、肾上腺素、选择素、促凝血毒液、纤溶酶原激活物抑制剂、血小板活化剂、具有止血活性的合成肽，和/或它们的组合。所述多糖包括但不限于：纤维素、烷基纤维素如甲基纤维素、烷基羟烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素硫酸酯、羧甲基纤维素的盐、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、甲壳质、羧甲基甲壳质、透明质酸、透明质酸的盐、藻酸盐、藻酸、丙二醇藻酸盐、糖原、葡聚糖、硫酸葡聚糖、凝胶多糖、果胶、普鲁兰多糖、黄原胶、软骨素、硫酸软骨素、羧甲基脱乙酰壳多糖、脱乙酰壳多糖、肝素、硫酸肝素、类肝素、硫酸类肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、角叉菜胶、脱乙酰壳多糖、淀粉、直链淀粉、支链淀粉、聚-N-葡糖胺、聚甘露糖醛酸、聚葡糖醛酸、聚古洛糖醛酸，以及任何上述物质的衍生物。合成的可吸收聚合物的例子是脂族聚酯聚合物、共聚物和/或它们的组合。脂族聚酯通常在单体的开环聚合反应中合成，所述单体包括但不限于乳酸、丙交酯(包括L-、D-、内消旋和D,L混合物)、乙醇酸、乙交酯ε-己内酯、对二氧杂环己酮(1,4-二氧六环-2-酮)和三亚甲基碳酸酯(1,3-二氧六环-2-酮)。在一个实施例中，天然的可吸收聚合物是明胶，例如得自Ethicon,Inc的SURGIFLOTM，其为与递送装置(例如注射器)中的液体载体和气体组分混合的颗粒形式的交联明胶。
在一个实施例中，使用氨基酸类似物序列，借此SEQ ID NO:1序列中的至少一个氨基酸被类似物或生物相似的氨基酸替换。类似物或生物相似的氨基酸的表提供如下：
氨基酸可以是L、D形式，或它们的衍生物[如，伪氨基酸、官能化的氨基酸(如氟化氨基酸…等)、β氨基酸、γ氨基酸…等]。SEQ ID NO:1肽序列的特别优选类似物肽的例子是：
KRFYVVMWKK
(Lys-Arg-Phe-Tyr-Val-Val-Met-Trp-Lys-Lys(SEQ ID NO:2))
RFYVVM(Arg-Phe-Tyr-Val-Val-Met(SEQ ID NO:3))
FIRVVMYEGKK
(Phe-Ile-Arg-Val-Val-Met-Tyr-Glu-Gly-Lys-Lys(SEQ ID NO:4))
IRVVM(Ile-Arg-Val-Val-Met(SEQ ID NO:5))
根据本发明的一个实施例，肽任选地缀合到生物相容性聚合物，更优选地亲水性聚合物。亲水性聚合物可以是聚乙二醇、聚乙二醇的衍生物、聚丙二醇、多糖、改性多糖、蛋白质、改性蛋白质、多肽、聚丙交酯乙交酯、己内酯或三亚甲基碳酸酯、和/或它们的组合。
根据本发明的一个实施例，包含SEQ ID NO:1序列、与支架(例如明胶)组合用于止血的氨基肽提供如下优点：低分子量肽(例如SEQ ID NO:1)比大型蛋白质性止血剂(例如凝血酶)更稳定，并且可在不冷藏的情况下贮存。肽的大规模制造可通过重组DNA技术或化学肽合成进行，这两种方法均比对生物制剂(如，凝血酶)进行纯化更具成本效益。与PEG缀合的氨基肽SEQ ID NO:1和类似物肽有利地具有肽的改善溶解度。另外，据发现聚乙二醇化的肽在较低浓度下对止血更有效，并且在肝素化血液中很有效。
本发明还涉及向出血部位提供止血处理的方法，包括下列步骤：形成上述止血制剂，以及将该止血制剂施加于出血部位。
本发明还涉及制备半液体止血制剂的方法，该方法包括以下步骤：将止血基质与包含SEQ ID NO:1氨基酸肽和/或其氨基酸类似物序列的止血促进剂混合，以及将所得的材料施用到伤口部位。
明胶载体的描述本发明的明胶材料优选是基于液体可渗透的、水不溶性明胶的海绵或糊剂。明胶是蛋白质胶原的变性形式，已被用于多种伤口敷料中。因为明胶凝胶具有相对低的熔点，所以它们在体温下不是非常稳定的。因此，通过建立蛋白质链之间的交联来稳定这些凝胶是必要的。在实践中，这通常通过用戊二醛或甲醛或热处理明胶来获得。因此交联的明胶可被加工成干燥海绵或碾磨成微粒形式，所述干燥海绵对于诱导出血伤口中的止血是有用的。
术语“明胶”在本文中用于代表膨胀、水合的聚合物网络，该聚合物网络遍及其体积是基本上连续的。蛋白质凝胶由所连接的蛋白质分子的基本上连续的网络和液体(通常含水)溶剂组成，所述液体溶剂填充蛋白质基质内的空间。蛋白质基质对溶剂分子发挥强粘稠阻力，从而阻止它们自由流动。构成凝胶网络的组分分子可通过离子键、疏水键、金属键或共价键连接。共价键是这些键中最热稳定的。
在一个实施例中，本发明的灭菌组合物可含有适用于止血中的生物相容性聚合物的固体、多孔或无孔颗粒，生物相容性液体和如上所述的止血提取物作为其三种主要组分。在有效提供基本上均质的止血组合物的条件下，将颗粒、液体和止血提取物组合并混合，所述止血组合物包含连续液相并且具有均质分散于其中的固体聚合物颗粒，所述连续液相包含止血提取物。组合物中含有的颗粒的量和平均直径以及固体、液体和止血提取物的相对量能够有效地提供具有止血和物理性质的组合物，如下文所述。
如本文所用，“连续的”和“不连续的”以那些词在用于定义和描述分散的标准命名法的上下文中的通常含义使用。
如本文所用，“基本上均质的”代表组合物或糊剂的物理状态，其中固体颗粒是遍及连续液相均匀分散的，使得固体：液体的比率和组合物或糊剂的任何部分或横截面的密度是基本上相同的。
如本文所用，“灭菌的”意指基本上不含活病菌和/或微生物，并且由关于本文描述并请求保护的组合物和医疗装置的政府标准进一步公认并描述。
如本文所用，“止血的”或“止血性质”意指停止或使出血最小化的能力，如止血领域技术人员将会理解的这些术语所意指，如说明书的实例中所进一步举例说明。
多种生物相容性天然、半合成或合成聚合物可被用于制备在本发明的组合物中使用的固体颗粒。所选择的聚合物必须在选择用于特定组合物的液体中是基本上不溶的。优选地，使用水不溶性的生物可降解的聚合物，其提供机械、化学和/或生物止血活性。可使用的聚合物包括但不限于蛋白质和多糖。可使用的多糖包括氧化纤维素、脱乙酰壳多糖、甲壳质、藻酸盐、氧化藻酸盐和氧化淀粉。用于制备颗粒的生物相容性聚合物优选是交联或变性蛋白质，例如明胶、胶原、纤维蛋白原或纤连蛋白。优选的明胶粉末是通过将明胶海绵研磨成颗粒制备的部分交联的明胶粉末，所述颗粒具有约40微米至约1200微米、更优选约100微米至约1000微米的平均直径，如通过激光衍射所测定。
本发明的灭菌组合物优选包含止血提取物和基于固体明胶的颗粒分散于其中的连续液相。取决于具体医疗装置及其用途，液体可以是含水的或非含水的。优选地，液相是含水的。含水液体可包括但不限于生物相容性含水溶液，例如氯化钙和盐水。更优选地，液相包含盐水。液相和固体微粒相以有效提供组合物的相对量存在，所述组合物为例如适用于提供止血中的糊剂或浆料。在某些实施例中，固体颗粒与液体的重量比一般为约1:1至约1:12，或约1:3至约1:8或甚至约1:5。
止血组合物还可包含有效量的一种或多种添加剂或化合物，包括但不限于抗微生物剂、表面活性剂、抗氧化剂、持湿剂、润湿剂、润滑剂、增稠剂、稀释剂、照射稳定剂例如自由基清除剂、增塑剂和稳定剂。例如，可添加甘油以增强组合物的可挤出性或可注射性。当利用时，以液相的重量计，甘油可以按重量计约0％至约20％存在于组合物中。优选地，以液相的重量计，组合物可包含按重量计约1％至约10％的甘油。更优选地，以液相的重量计，组合物可包含按重量计约1％至约5％的甘油。
此外，季胺可用于向组合物提供增强的性质。例如，以液相的重量计，苯扎氯铵、聚凝胺或Onamer M可以按重量计至多约1百分比的水平使用。优选地，以液相的重量计，苯扎氯铵以按重量计约0.001％至约0.01％的水平使用。更优选地，以液相的重量计，组合物可包含按重量计约0.002至约0.006％的苯扎氯铵。据信季胺可起到多重作用，充当抗微生物剂、发泡剂、自由基清除剂和作为肝素中和剂。
止血制剂还可含有有效量的选自下列的一种或多种添加剂或化合物：抗微生物剂、表面活性剂、抗氧化剂、持湿剂、润湿剂、润滑剂、增稠剂、稀释剂、照射稳定剂例如自由基清除剂、增塑剂和稳定剂，更具体地包含挤出增强量的甘油，并且优选地，其中以总体止血制剂的液相的重量计，甘油以按重量计约1％至约20％的量存在。
此类止血组合物还可包含肝素中和剂、附加的促凝血剂或止血剂，例如纤维蛋白原、纤维蛋白、因子Xa、或因子Vila。“有效量”意指向组合物提供那些性质所需的量，为了所述性质而添加添加剂。有效量还受可添加而不导致有害生物效应的最大量的限制。
用于将肽掺入明胶载体上的方法。在用于制备本发明的组合物的一个实施例中，通过将颗粒与液体混合以形成均匀糊剂来制备基本上均质的糊剂。液体包括止血肽材料，并且可包括有效量的如上所述溶解于其中的其他添加剂。可通过挤出或通过在有效提供固体颗粒在液相中的均匀分散体的条件下在有限空间中混合来实现混合。作为另外一种选择，混合器例如双行星式混合器，可用于制备本发明的组合物中。将含有止血肽材料的液体添加到混合器中。在颗粒添加到溶液之前，液体可包括有效量的溶解于其中的添加剂。例如，可制备含有止血肽材料、甘油和苯扎氯铵的盐水溶液，然后添加到混合器中。随着时间流逝伴随连续混合，将固体颗粒添加到混合器中，直至所有成分已被添加。继续混合直至形成基本上均质的组合物的该时间，所述基本上均质的组合物含有遍及连续液相均匀分散的固体颗粒。
在可供选择的实施例中，通过喷涂或印刷在基本上干燥的海绵的主表面上而施加止血肽。
如上制备的止血组合物可进行灭菌，以提供包含止血肽的灭菌组合物。在一些实施例中，将组合物转移到如上所述的医疗装置中，并且优选通过离子辐射将含有止血提取物的装置灭菌。更优选地，灭菌是通过如本文所举例说明的γ照射进行的。
本发明的组合物包括灭菌的本文所述的组合物，因为它们已用例如离子照射水平进行照射。此类照射可包括电子束或γ照射。照射水平和灭菌条件，包括组合物被照射的时间，是提供如本文所定义的灭菌组合物的那些。当具有本公开内容的有益效果时，本领域技术人员将能够容易地测定提供灭菌组合物所需的照射水平。
在其中可利用本发明的止血组合物的医疗装置包括目前用于将可流动或可注射的止血糊剂或浆料施加于需要止血的部位或伤口的任何装置。海绵可通过手或其他装置以常规方式施加。需要止血的部位可以是损伤或外科手术的结果。装置或涂敷器的例子包括注射器，例如Becton Dickinson或Monoject luer注射器。其他装置在美国专利No.6,045,570中详细公开，该专利的内容全文以引用方式并入。
各种序列的合成肽使用Fmoc-介导的固体支持肽合成过程来合成。将缀合PEG的肽PEG2000-RK-8或PEG5000-RK-8分别表示为P2K-RK-8或P5K-RK-8，它们通过经由溶液合成将甲氧基聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(mPEG-NHS)缀合到经纯化的SEQ ID NO:1的N端上来合成。通过C18RP-HPLC对肽进行纯化，得到>95％的纯度。通过MALDI-TOF MS或ESI-MS分析它们的同一性。
具有SurgifloTM(其为基于明胶的止血基质)的混合物按如下方式制备。测试制品包括基于明胶的SurgifloTM与2mL生理盐水或2mL包含活性组分或例如SEQ ID NO:1、聚乙二醇化的SEQ ID NO:1或其类似物的生理盐水的混合物；或主要含有人凝血酶的2mLEVITHROMTM溶液(的完整组成含有人凝血酶(800-1200IU/mL)、氯化钙、人白蛋白、甘露糖醇、乙酸钠和注射用水)。
对于测试制品的制备，通过如下步骤将SurgifloTM与止血材料充分混合：1.将2mL止血材料溶液(例如盐水或含肽盐水)吸入空注射器中；2.通过将鲁尔连接器(luerconnector)附接到预填充的注射器并将含止血材料溶液的注射器附接到鲁尔适配器的另一端，然后将止血材料溶液注射到预填充的注射器中，混合两种组分；3.通过来回地推动混合的材料而继续混合所述组分直到稠度均一，然后施用到伤口。
例子和图表中的所有浓度是指在与6mL SurgifloTM混合之前2mL盐水中的浓度。在混合时，测试制品中活性成分或赋形剂的浓度将对应于盐水溶液中浓度的1/4；例如，例子中提及的5mM浓度对应于止血材料中0.25×5mM＝1.25mM的最终浓度。
在附图中，SF代表SurgifloTM止血基质；并且TH代表得自Ethicon,Inc.的包含800～1200IU/mL实验用凝血酶(人)的EVITHROMTM。
虽然下列实例展示了本发明的某些实施例，但它们不应被理解为限制本发明的范围，而应理解为有助于完善本发明的描述。
实例1
现在参见图1，其展示了多个测试体系的止血时间数据(单位为分钟)，所有测试体系均包含SurgifloTM(在图中表示为SF)和用于改善止血的不同类型的添加剂，包括：人凝血酶(在图中表示为TH)和具有从0.01mM至5mM不等的浓度的合成肽SEQ ID NO:1。SurgifloTM与凝血酶的混合物在图中表示为SF/TH；SurgifloTM与SEQ ID NO:1的混合物在图中表示为SF/RK-8。
所述数据使用猪肝脏活检穿孔模型[8mm宽×7mm深]采集，初始填塞时间：30s；观察时间：30s；N为每个数据点的实验次数；N＝3。图中的误差线对应于标准偏差。
使用猪肝脏活检穿孔模型执行体内止血活性研究，其中在肝脏上制备8mm宽×7mm深的穿孔伤口开口，并且将测试制品施加于新鲜产生的伤口部位，随后进行闭合指压(填塞)。施加初始压力30秒，并且使用电子定时器定时。在30秒填塞后，停止指压；立即去除制品上的纱布垫。进行30秒止血评价周期。如果在30秒内未观察到自由流动的出血，则以分秒格式记录止血时间，并且对于该制品得出测试结论。如果观察到自由流动的出血，则再施加压力和纱布以用于另外30秒压塞和观察周期，直至实现止血或者直至测试时间达到10分钟。通过在10分钟内自由流动的出血停止而确定止血。将纱布垫用作阴性对照。
如从图1可见，具有较高浓度SEQ ID NO:1(5mM)的SurgifloTM混合物具有与SurgifloTM/凝血酶(SF/TH)混合物类似的功效，表明SEQ ID NO:1肽具备强止血功效。
实例2
现在参见图2，其展示了多个测试体系的止血时间数据(单位为分钟)，所有测试体系均包含SurgifloTM(在图中表示为SF)和用于改善止血的不同类型的添加剂，包括：人凝血酶(在图中表示为TH)和缀合PEG的(或聚乙二醇化的)合成肽SEQ ID NO:1。对于PEG-缀合，使用平均分子量为2000Da的PEG2000或聚乙二醇，在图中将其表示为P2K。聚乙二醇化的SEQID NO:1和SurgifloTM的混合物在图中表示为SF/P2K-RK-8。使用浓度为0.05mM至5mM不等的SEQ ID NO:1测试该混合物。
所述数据使用体内猪脾脏活检穿孔模型[6mm宽×3mm深]采集，初始填塞时间：30s；观察时间：30s；N＝3。
使用猪脾脏活检穿孔模型执行体内止血活性研究，其中在脾脏上制备6mm宽×3mm深的穿孔伤口开口，并且将测试制品施加于新鲜产生的伤口部位，随后进行闭合指压(填塞)。施加初始压力30秒，并且使用电子定时器定时。在30秒填塞后，停止指压；立即去除制品上的纱布垫。进行30秒止血评价周期。如果在30秒内未观察到自由流动的出血，则以分秒格式记录止血时间，并且对于该制品得出测试结论。如果观察到自由流动的出血，则再施加压力和纱布以用于另外30秒压塞和观察周期，直至实现止血或者直至测试时间达到10分钟。通过在10分钟内自由流动的出血停止而确定止血。将纱布垫用作阴性对照。
如从图2可见，在与SurgifloTM的混合物中，聚乙二醇化的SEQ ID NO:1相当于在从0.05mM至5mM的宽泛浓度范围内的凝血酶，其显示出与凝血酶基本上相同的止血时间，并且在0.1mM浓度的聚乙二醇化SEQ ID NO:1下可能具有比凝血酶更佳的止血时间。
实例3
现在参见图3，其展示了多个测试体系的止血时间数据(单位为分钟)，所有测试体系均包含SurgifloTM(在图中表示为SF)和不同类型的对照物或用于改善止血的添加剂，包括：人凝血酶(表示为SF/TH)；具有5mM浓度的SEQ ID NO:1肽(表示为SF/RK-8)；具有5mM浓度与PEG2000缀合的SEQ ID NO:1(在图中表示为SF/PEG2000-RK8)；具有5mM浓度的PEG-2000(在图中表示为SF/PEG2000)；以及生理盐水(在图中表示为SF/盐水)。
所述数据使用猪脾脏活检穿孔模型[6mm宽×3mm深]采集，初始填塞时间：30s；观察时间：30s；N＝3。
如从图3可见，对SurgifloTM与SEQ ID NO:1和与聚乙二醇化的SEQ ID NO:1的混合物、与凝血酶的混合物以及代表与非诱导止血赋形剂(用PEG2000和生理盐水表示)的混合物的对照物进行直接比较，结果表明SurgifloTM与聚乙二醇化的SEQ ID NO:1(5mM)以及与SEQ ID NO:1(5mM)的混合物显示出类似于与凝血酶的混合物的止血功效。SurgifloTM与聚乙二醇化的SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1的混合物表现出比SurgifloTM与盐水和与PEG2000(5mM)的混合物快得多的止血时间。
实例4
现在参见图4，其展示了多个测试体系的止血时间数据(单位为分钟)，所有测试体系均包含SurgifloTM(在图中表示为SF)和不同类型的对照物或用于改善止血的不同浓度的添加剂，包括：
-具有0.05-5mM浓度，与PEG 2000缀合的SEQ ID NO:1(在图中表示为SF/PEG2000-RK8)；
-具有0.05-5mM浓度的SEQ ID NO:1肽(表示为SF/RK-8)；
-对照物：具有人凝血酶的SurgifloTM(表示为SF/TH)；
-对照物：具有生理盐水的SurgifloTM(在图中表示为SF/盐水)。
所述数据使用猪脾脏活检穿孔模型[6mm宽×3mm宽]采集，初始填塞时间：30s；观察时间：30s；N＝3。
如从图4可见，对SurgifloTM与SEQ ID NO:1和与聚乙二醇化的SEQ ID NO:1的混合物以及与凝血酶和与生理盐水的混合物进行直接比较，结果表明SurgifloTM与聚乙二醇化的SEQ ID NO:1的混合物显示出较之SurgifloTM与所有浓度的凝血酶的混合物更佳或类似的止血功效，并且在聚乙二醇化SEQ ID NO:1的浓度为0.05mM时具有特别快的止血时间。另外，SurgifloTM与SEQ ID NO:1的混合物显示出和SurgifloTM与凝血酶的混合物相当的止血功效。在所有情况下，止血功效均比SurgifloTM与盐水的混合物更佳。另外的分析表明，在与SurgifloTM的混合物中，聚乙二醇化的SEQ ID NO:1显示出比SEQ ID NO:1和凝血酶更佳的止血功效。
实例5
现在参见图5，其展示了多个测试体系的止血时间数据(单位为分钟)，所述数据基于两种不同的止血支架，包括SurgifloTM(在图中表示为SF)和由氧化再生纤维素或ORC粉末制成的支架(在图中表示为ORC)。
氧化再生纤维素(ORC)是已知的被广泛使用的止血剂，可作为SURGICELOriginal、SURGICEL Nu-Knit、SURGICEL Fibrillar和SURGICEL SNoW得自Ethicon,Inc.。ORC粉末通过碾磨ORC织物，然后将所得的粉末与生理盐水和/或与对应的肽混合进行制备。
本发明人测试了以下基于ORC的组合物：
-ORC与5mM浓度的聚乙二醇化SEQ ID NO:1的混合物(在图中表示为ORC/PEG2000-RK-8)
-ORC与5mM浓度的SEQ ID NO:1的混合物(在图中表示为ORC/RK-8)
-ORC与生理盐水的混合物
所述数据使用猪脾脏活检穿孔模型[6mm宽×3mm宽]采集，初始填塞时间：30s；观察时间：30s；N＝4。
与对照物的比较表明，作为止血剂的所有基于ORC的组合物相当于具有生理盐水的SurgifloTM(在图中表示为SF/盐水)，并且与具有人凝血酶的SurgifloTM(表示为SF/TH)相比具有较长的止血时间。因此，基于ORC的止血支架不适合与SEQ ID NO:1和/或聚乙二醇化的SEQ ID NO:1一起使用。
图5还示出了使用SurgifloTM与5mM浓度的聚乙二醇化SEQ ID NO:1和类似具有不同序列的8氨基酸肽的聚乙二醇化SEQ ID NO:1的混合物获得的数据。现在参见表1，其呈现了SEQ ID NO:1和三种类似8氨基酸肽的SEQ ID NO:1的序列，以及它们在图中的缩写名称。包含SEQ ID NO:1的所有肽均为聚乙二醇化的。
表1：肽序列
8氨基酸肽PEG2000-KVYRWFMV(SEQ ID NO:21)或PEG2000-随机RK-8具有随机序列KVYRWFMV(SEQ ID NO:21)；
8氨基酸肽PEG2000-RL4L5K8或PEG2000-SEQ ID NO:6具有与RK-8类似的序列RFYLLMWK((Arg-Phe-Tyr-Leu-Leu-Met-Trp-Lys)SEQ ID NO:6))但VVM被替换为LLM，由于V和L是类似的氨基酸。
8氨基酸肽PEG2000-KR-8或PEG2000-SEQ ID NO:7具有序列KYFLLQFR((Lys-Tyr-Phe-Leu-Leu-Gln-Phe-Arg)SEQ ID NO:7))，其中RK-8的每个单独氨基酸被类似的但具有不同侧链的氨基酸替换。
数据分析表明，8氨基酸聚乙二醇化的肽具有类RK-8序列，尤其是SEQ ID NO:6显示出与聚乙二醇化的SEQ ID NO:1以及凝血酶相比类似的止血功效。
聚乙二醇化的8氨基酸肽SEQ ID NO:7与非聚乙二醇化的SEQ ID NO:1相比，显示出稍长的止血时间。
聚乙二醇化随机序列8氨基酸肽KVYRWFMV(SEQ ID NO:21)与SF/盐水混合物相比，显示出较长的止血时间。
实例6
现在参见图6，其展示了多个测试体系的止血时间数据(单位为秒)，所述数据基于两种不同的止血支架，包括SurgifloTM(在图中表示为Surgiflo)和由Pluronic acid F127制成的支架(在图中表示为Pluronic acid F127)。
Pluronic acid F127是具有12600Da的平均分子量的(PPO)x-(PEO)y嵌段共聚物。其购自BASF并按如下方式制备：将0.58g Pluronic acid F127与2mL盐水或包含5mM聚乙二醇化PR-8的盐水混合。
所述数据使用猪脾脏活检穿孔模型[6mm宽×3mm深]采集，初始填塞时间：30s；观察时间：30s。
对数据的分析表明，Pluronic acid与聚乙二醇化RK-8以及与生理盐水的混合物未通过止血测试。因此，基于Pluronic acid的组合物作为止血剂表现不佳，且不适合与聚乙二醇化RK-8一起使用。
图6还呈现了使用SurgifloTM与盐水的混合物(表示为Surgiflo/盐水)以及与EvithromTM(人凝血酶、实验用凝血酶(人)，800～1200IU/mL)的混合物(表示为Surgiflo/Evithrom)作为对照物，以及SurgifloTM与以下物质的混合物获得的数据：
-5mM浓度的具有序列VVM、LLM、VMV的短3氨基酸肽(在图中表示为Surgiflo/VVM、Surgiflo/LLM、Surgiflo/VMV)
-具有5mM浓度的SEQ ID NO:1肽(表示为Surgiflo/RK-8)
-具有5mM浓度，与PEG 2000缀合的SEQ ID NO:1(在图中表示为Surgiflo/PEG2000-RK8)
-三种单独氨基酸V、V、M(各自具有5mM的浓度)的混合物(在图中表示为Surgiflo/单独V,V,M)
-三种单独氨基酸L、L、M(各自具有5mM的浓度)的混合物(在图中表示为Surgiflo/单独L,L,M)
3氨基酸肽VVM、LLM和VMV由GenScript USA Inc.合成。
图6中呈现的数据分析表明，SurgifloTM与单独氨基酸和短3氨基酸肽的混合物不是有效的止血剂，其中VMV肽稍有止血效果是例外情况。
另外的数据分析显示，SEQ ID NO:1和PEG-SEQ ID NO:1的性能与凝血酶一样好。
实例7
现在参见图7，其呈现了使用肝素化血液的多个测试体系和对照物的止血时间数据(单位为分钟)。
模型是肝素化猪脾脏活检穿孔模型：6mm宽×3mm深，填塞时间：30s；观察时间：30s；如果需要，通过注入另外的2000IU肝素溶液将活化凝血时间(ACT)保持为高于300秒。向39.1Kg猪初始施用9975IU肝素溶液。
从所呈现的数据可以看出：
-纱布(作为阴性对照物，不与任何另外的止血活性材料一起使用)未能作为肝素化血液中的止血剂；
-SurgifloTM与凝血酶的混合物(表示为SF/TH)未能作为肝素化血液中的止血剂；
-SurgifloTM与生理盐水的混合物(表示为SF/盐水)未能作为肝素化血液中的止血剂；
-SurgifloTM与2mL 5mM SEQ ID NO:1的盐水溶液的混合物(表示为SF/RK-8)未能作为肝素化血液中的止血剂；
-SurgifloTM与2mL 5mM PEG2000-SEQ ID NO:1的盐水溶液的混合物(表示为SF/P2K-RK-8)提供了一些止血效果，但实际止血时间太长，为6.8min；
-SurgifloTM与2mL 5mM PEG5000-SEQ ID NO:1的盐水溶液的混合物(表示为SF/P5K-RK-8)提供了显著的止血功效。
因此，聚乙二醇化的SEQ ID NO:1(尤其是缀合PEG-5000的SEQ ID NO:1)在肝素化血液中显示出比凝血酶、非聚乙二醇化的SEQ ID NO:1和其他对照物好得多的止血功效。
实例8
在台式实验中，使用聚乙二醇化SEQ ID NO:1的盐水溶液或使用盐水对照溶液处理合成的多孔垫，以评估与血液的相互作用。样品的制备方式如下：将100μL聚乙二醇化SEQID NO:1的生理盐水溶液(0.5mM)或200μL生理盐水溶液添加至0.025g Monocryl(聚卡普隆25)垫。然后将浸渍的Monocryl*(聚卡普隆25)垫空气干燥2小时，随后真空干燥1小时。
然后分别将150μL新鲜猪血添加至每个垫，并使其在室温下放置2分钟。然后将垫转移到含有20mL盐水溶液的有盖培养皿，观察从垫扩散出来的非凝结血液。观察到大量凝结血液被捕获在经由聚乙二醇化SEQ ID NO:1处理过的Monocryl垫中，同时还观察到非凝结血液从对照垫中强烈扩散出来。因此，聚乙二醇化的SEQ ID NO:1显示出能够促进血液快速凝结。
实例9
在台式实验中，测试了聚乙二醇化SEQ ID NO:1的生理盐水溶液、非聚乙二醇化SEQ ID NO:1的生理盐水溶液以及生理盐水对照溶液，以评估与血液的相互作用。样品的制备方式如下：将100μL聚乙二醇化SEQ ID NO:1的生理盐水溶液(0.5mM)、SEQ ID NO:1的生理盐水溶液(0.5mM)和生理盐水添加到装有100μL含柠檬酸钠(0.105M)猪血液的单独玻璃小瓶中。当将聚乙二醇化SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1溶液添加到血液时，立即观察到血液浑浊，而添加生理盐水对照溶液的小瓶中未观察到浑浊。2小时后，观察到在装有聚乙二醇化SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的小瓶中血液完全沉淀，而在装有生理盐水对照溶液的小瓶中未观察到血液完全沉淀。因此，聚乙二醇化的SEQ ID NO:1和非聚乙二醇化的SEQ ID NO:1显示出能够促进血液快速凝结。
实例10
现在参见图8，其展示了两个测试体系的止血时间数据(单位为分钟)，所有测试体系均包含SurgifloTM和不同类型的对照物或用于改善止血的添加剂，包括：
-0.5mM缀合PEG 2000的SEQ ID NO:1肽的盐水溶液(在图中表示为Surgiflo/0.5mMPEG2000-RK8的盐水溶液)；
-对照物：具有人凝血酶的SurgifloTM(表示为Surgiflo/TH)。
所述数据使用经氯吡格雷和乙酰水杨酸处理过的猪脾脏活检穿孔模型(6mm宽×3mm深)采集，填塞时间：30s；观察时间：30s；将以下口服剂量施用到4月龄的雌猪(重量：66.1Kg)：
实验前2天：300mg Plavix和325mg阿司匹林。
实验前1天：75mg Plavix和325mg阿司匹林。
实验当天：在外科手术前，75mg Plavix和325mg阿司匹林。
图8中呈现的数据表明，在血小板灭活模型中Surgiflo/聚乙二醇化SEQ ID NO:1肽的作用与Surgiflo/凝血酶一样好，并且显示出类似的止血功效。因此，SEQ ID NO:1肽不仅在非失能血液、肝素化血液中，还在血小板灭活血液中显示出止血功效。

Claims (19)

1.一种止血或组织密封材料，包含：
(a) 具有序列SEQ ID NO: 1或其氨基酸类似物序列的肽，其中所述氨基酸类似物序列选自：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、以及它们的组合，以及
(b) 支架，其中所述支架是与液体载体呈颗粒形式的交联明胶。
2.根据权利要求1所述的止血或组织密封材料，其中明胶包括可吸收止血粉末基质、海绵基质、糊剂基质、凝胶基质、或它们的组合。
3.根据权利要求1或2所述的止血或组织密封材料，其中所述液体载体是生理盐水溶液，其中明胶和所述肽与作为液相的所述生理盐水溶液基本上均匀地混合在一起。
4.根据权利要求1或2所述的止血或组织密封材料，其中所述止血材料中所述肽的浓度为0.0025mM至1.25mM。
5.根据权利要求4所述的止血或组织密封材料，还包含有效量的选自下列的一种或多种添加剂或化合物：抗微生物剂、表面活性剂、抗氧化剂、湿润剂、润湿剂、润滑剂、增稠剂、稀释剂、照射稳定剂、以及它们的组合。
6.根据权利要求5所述的止血或组织密封材料，还包含用于增强挤出的量的甘油。
7.根据权利要求1所述的止血或组织密封材料，其中所述肽缀合到生物相容性聚合物。
8.根据权利要求7所述的止血或组织密封材料，其中所述生物相容性聚合物是亲水性聚合物。
9.根据权利要求8所述的止血或组织密封材料，其中所述亲水性聚合物选自：聚乙二醇、聚乙二醇的衍生物、聚丙二醇、多糖、改性多糖、蛋白质、改性蛋白质、肽、聚丙交酯乙交酯、己内酯、碳酸亚丙酯、淀粉、改性淀粉、明胶、胶原、以及它们的组合。
10.根据权利要求7所述的止血或组织密封材料，其中所述亲水性聚合物是具有被选择为提供快速止血或快速组织密封的分子量的聚乙二醇。
11.根据权利要求10所述的止血或组织密封材料，其中所述聚乙二醇分子是线性分子、支链分子、星形分子、或它们的组合。
12.根据权利要求11所述的止血或组织密封材料，其中所述分子量为平均1000道尔顿至8000道尔顿。
13.根据权利要求11所述的止血或组织密封材料，其中所述分子量为平均2000道尔顿。
14.根据权利要求11所述的止血或组织密封材料，其中所述分子量为平均5000道尔顿。
15.根据权利要求11所述的止血或组织密封材料，其中所述止血材料中所述肽的浓度为0.0025mM至1.25mM，并且其中所述聚乙二醇具有2000至5000道尔顿的分子量。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的止血或组织密封材料在制备用于为伤口部位提供止血处理或组织密封的药物中的用途。
17.一种制备止血或组织密封材料的方法，包括以下步骤：
(a) 提供具有序列SEQ ID NO: 1或其氨基酸类似物序列的肽，其中所述氨基酸类似物序列选自：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、以及它们的组合，所述肽任选地缀合到聚乙二醇；
(b) 提供可吸收支架，其中所述支架是与液体载体呈颗粒形式的交联明胶；以及
(c) 将所述肽和所述可吸收支架基本上均匀地混合，从而形成所述止血或组织密封材料。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述肽缀合到聚乙二醇，并且所述止血材料中所述肽的浓度为0.0025mM至1.25mM，并且其中所述聚乙二醇具有2000至5000道尔顿的分子量。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述止血材料或组织密封材料是用于具有肝素化血液或含有抗凝剂或阻凝剂的患者的材料。
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