CN108992709A - 一种脱细胞神经基质材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种脱细胞神经基质材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种脱细胞神经基质材料的制备方法，属于生物医用材料加工领域。本发明所述方法将神经组织块消毒、清洗，震荡破碎，核酸酶酶解，TrionX‑100浸泡，硫酸软骨素酶酶解，NaCl浸泡和清洗，最终获得了具有良好生物相容性和适当生物降解速率的神经脱细胞基质材料。该材料可用于神经再生修复。同时，本发明所述脱细胞神经基质材料的原料来源广泛、易得，价格低廉，制作容易。

Description

一种脱细胞神经基质材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医用材料加工领域，具体涉及一种脱细胞神经基质材料及其制备方法和应用。
背景技术
周围神经缺损的修复治疗一直是困扰临床工作中的难题，尤其是对于大于2-3cm的长段神经缺损。对于较短的周围神经缺损可以直接缝合，而对于长段的神经缺损，自体神经组织移植物被认为是一种良好的修复材料。但由于供移植的神经为皮神经，很难满足临床神经移植的需要，并且会造成供区的永久性神经功能障碍。
组织工程的发展为解决神经缺损修复提供了新的解决途径。当前应用较多的有人工合成高分子材料和脱细胞支架等。人工合成高分子材料可以根据组织和器官的结构特点来制备，具有特定的三维支架结构，例如中国发明专利申请号为201510115560.6和中国发明专利授权号为CN201010241619.3的发明专利。其具备机械强度和降解速率可调节性和可标准化生产的优点。但生物组织一般具有极其复杂的超微结构，人工方法合成接近生物体超微结构的材料是难度极高的；此外合成有机高分子材料一般材料成本较高，并且材料本身不具备生物活性，生物相容性较差，不能引发特异的生物反应，需要对材料进行表面处理和添加生物因子来改善细胞对基质材料的粘附性；而且该材料的降解产物有可能会引发机体的炎症反应。
天然生物材料具备了很多人工合成材料难以比拟的优势。生物材料具有良好的生物相容性，细胞亲和力强，不会产生细胞毒性；此外生物材料可降解，并且降解产物为多糖或氨基酸等，可以被机体有效吸收和利用；另外生物材料还具有来源广，成本低的优点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有良好生物相容性和适当的生物降解速率的脱细胞神经基质及其制备方法和应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种脱细胞神经基质材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将神经组织块消毒、无菌缓冲液清洗，得到消毒神经组织块；
(2)将所述消毒神经组织块置于无菌水中震荡破碎，得到破碎后的神经组织块；
(3)将所述破碎后的神经组织块置于含有核酸酶的无菌缓冲液中酶解，得到去核酸的神经组织块；
(4)将所述去核酸的神经组织块置于含有体积浓度0.5～5％TrionX-100的无菌缓冲液中浸泡，得到去细胞膜的神经组织块；
(5)将所述去细胞膜的神经组织块置于含有硫酸软骨素酶的无菌缓冲液中酶解，得到去硫酸软骨素的神经组织块；
(6)将所述去硫酸软骨素的神经组织块置于0.2～1mol/L NaCl的无菌溶液中搅拌处理0.5～2h，用无菌缓冲液清洗，得到所述脱细胞神经基质材料。
优选的，所述步骤(1)中消毒的方法为：将神经组织块置于体积浓度70％～80％的酒精中浸泡2～3s。
优选的，所述步骤(1)中神经组织块的来源为健康动物神经组织，所述神经组织块的规格为：长2～3cm，直径3～4mm。
优选的，所述步骤(3)和步骤(5)中的无菌缓冲液为PH＝7.3～7.5的D-Hank’s缓冲液；所述步骤(1)、(4)和步骤(6)中的无菌缓冲液独立为摩尔浓度5～20mmol/L的PBS缓冲液。
优选的，所述步骤(3)中核酸酶的浓度为800～1200U/ml；所述步骤(5)中硫酸软骨素酶的浓度为0.5～5U/ml。
优选的，在所述步骤(4)在无菌缓冲液中浸泡后还包括：将所述浸泡后的神经组织块进行低频超声清洗，所述低频超声的频率为10～50HZ，所述低频频超声清洗的时间为4min～8min。
优选的，所述步骤(6)中无菌缓冲液清洗后还包括：将清洗后的材料灭菌和包装。
优选的，所述灭菌采用20～30kGY的伽马射线进行辐照。
本发明提供了上述方法制备得到的脱细胞神经基质材料，所述脱细胞神经基质材料中的DNA残留量低于100ng/mg。
本发明还提供了上述神经基质材料在制备神经组织替代品或神经组织的组织工程体外模型中的应用。
有益效果：
本发明以健康动物的神经组织为原料，通过将神经组织块消毒、清洗，震荡破碎，核酸酶酶解，TrionX-100浸泡，硫酸软骨素酶酶解，NaCl浸泡和清洗，最终在维持供体神经组织三维构造不变的前提下，彻底清除了神经组织中的细胞成分，得到具有完整的三维组织构造的脱细胞神经基质。同时，本发明提供的方法简便、易行，经济、合理、安全、可靠。整个工艺过程属于清洁化制备，对环境无污染。
本发明提供的脱细胞神经基质材料具有良好的力学性能和粘附性能，其可赋形性强，能提供良好的细胞分化增殖环境，能作为细胞培养和组织工程体外模型材料，如用于神经再生和发育研究。
本发明提供的脱细胞神经基质材料具有良好生物相容性和适当的生物降解速率，其能作为神经组织替代品，用于创伤或手术后神经损伤和缺失的修复。该脱细胞神经基质材料作为神经组织替代品，不仅能为组织细胞的再生提供空间，还降低了异体或异种移植的免疫反应，并且具备促进细胞分化增殖和定位的活性因子，有利于损伤部位组织微环境的重构和组织的再生。
本发明提供的脱细胞神经基质材料还能作为药品或医疗器械的原材料或组成部位，如促进神经修复的生物制剂。
附图说明
图1为本发明实施例1所述微观结构观察结果，照片的放大倍数为400X；其中，图1-a为含有细胞的新鲜猪胫神经组织的横切面荧光染色显微镜照片；图1-b为含有细胞的新鲜猪胫神经组织的纵切面荧光染色显微镜照片；图1-c为经脱细胞处理后的猪胫神经基质材料的横切面荧光染色显微镜照片；图1-d为经脱细胞处理后的猪胫神经基质材料的纵切面荧光染色显微镜照片；
图2为本发明实施例1所述DNA含量测定结果；
图3为本发明实施例2所述脱细胞神经基质材料的生物相容性测试结果，其中，图3-a为脱细胞神经基质材料照片；图3-b为脱细胞神经基质材料移植两周后的解剖照片。
具体实施方式
本发明提供了一种脱细胞神经基质材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将神经组织块消毒、无菌缓冲液清洗，得到消毒神经组织块；
(2)将所述消毒神经组织块置于无菌水中震荡破碎，得到破碎后的神经组织块；
(3)将所述破碎后的神经组织块置于含有核酸酶的无菌缓冲液中酶解，得到去核酸的神经组织块；
(4)将所述去核酸的神经组织块置于含有体积浓度0.5～5％TrionX-100的无菌缓冲溶液中浸泡，得到去细胞膜的神经组织块；
(5)将所述去细胞膜的神经组织块置于含有硫酸软骨素酶的无菌缓冲液中酶解，得到去硫酸软骨素的神经组织块；
(6)将所述去硫酸软骨素的神经组织块置于0.2～1mol/L的NaCl无菌溶液中搅拌处理0.5～2h，用无菌缓冲液清洗，得到所述脱细胞神经基质材料。
为了制备得到脱细胞神经基质材料，本发明先将神经组织块消毒、无菌缓冲液清洗，得到消毒神经组织块。在本发明中，所述神经组织块的来源优选为健康动物神经组织，所述健康动物组织神经是指新鲜的无病毒感染的、无病史的动物神经组织，所述健康动物神经组织优选为健康猪的胫神经。在本发明中，所述神经组织不限于固定尺寸的神经片段，可取自身体不同部位的神经组织，不限于周围神经组织。作为优选的方案，所述神经组织块的截取规格为：长2～3cm，直径3～4mm。所述消毒优选采用酒精浸泡的方法，所述酒精的体积浓度优选为70％～80％，更优选为75％。所述酒精浸泡的时间优选为2～3s。酒精浸泡消毒后，本发明优使用PBS缓冲液对消毒后的神经组织进行清洗，所述PBS缓冲液的规格优选为5～20mmol/L，更优选为10mmol/L。
得到消毒神经组织块后，本发明将所述消毒神经组织块置于无菌水中震荡，破碎细胞结构，得到破碎后的神经组织块。在本发明中，所述无菌水优选为无菌三级水，所述无菌三级水能去除阴阳离子及其他微量元素对受体的影响。所述震荡时优选控制转速为100～300rpm，更优选为200rpm。所述震荡时的温度优选为2～6℃，更优选为4℃。所述震荡破碎的时间优选为6～18h，更优选为12h。本发明优选使用250ml的广口瓶进行上述震荡破碎操作。
得到破碎后的神经组织块后，本发明将所述破碎后的神经组织块置于含有核酸酶的无菌缓冲液中酶解，去除核酸，降低免疫原性，进而得到去核酸的神经组织块。在本发明中，所述核酸酶的浓度优选为800～1200U/ml，更优选为1000U/ml。所述含有核酸酶的无菌缓冲液优选为D-Hank’s缓冲液，所述D-Hank’s缓冲液的pH值优选为7.3～7.5，更优选为7.4。所述酶解优选在震荡条件下进行，所述震荡时的转速优选为50～150rpm，更优选为100rpm。所述酶解的温度优选为37℃。所述酶解的时间优选为6～18h，更优选为12h。本发明优选使用EP管进行上述酶解操作。
得到去核酸的神经组织块后，本发明将所述去核酸的神经组织块置于含有0.5～5％TrionX-100的无菌缓冲液中浸泡，将细胞膜结构溶解，得到去细胞膜的神经组织块。在本发明中，所述TrionX-100的体积浓度优选为0.5～5％，更优选为1％。所述无菌缓冲液优选为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的规格优选为5～20mmol/L，更优选为10mmol/L。所述浸泡优选在震荡条件下进行，所述震荡时的转速优选为100～300rpm，更优选为200rpm。所述浸泡的温度优选为2～6℃，更优选为4℃。所述浸泡的时间优选为6～18h，更优选为12h。本发明优选使用容积≥250ml的广口瓶进行上述浸泡操作。
本发明用所述含有TrionX-100的无菌缓冲液浸泡神经组织块后，优选还包括：将所述浸泡后的神经组织块进行清洗。所述清洗优选使用PBS缓冲液进行。所述PBS缓冲液的规格优选为5～20mmol/L，更优选为10mmol/L。本发明优选采用超声清洗，所述超声清洗能够更加彻底的将较小的碎片从细胞外基质中清洗出来。所述超声的频率优选为10～50Hz，更优选为25Hz。所述超声清洗的时间优选为3～8min，更优选为4～6min。在本发明更具体的实施方式中，所述超声清洗操作优选将所述去细胞膜的神经组织块装入含有100ml无菌PBS缓冲液的密封袋中进行。
本发明将去细胞膜的神经组织块置于含有硫酸软骨素酶的无菌缓冲液中酶解，得到去硫酸软骨素的神经组织块，从而降低神经基质材料中的硫酸软骨素对轴突再生的抑制作用。在本发明中，所述硫酸软骨素酶的浓度优选为0.5～5U/ml，更优选为2U/ml。所述含有硫酸软骨素酶的无菌缓冲液优选为D-Hank’s缓冲液，所述D-Hank’s缓冲液的pH值优选为7.3～7.5，更优选为7.4。所述酶解优选在震荡条件下进行，所述震荡时的转速优选为50～150rpm，更优选为100rpm。所述酶解的温度优选为37℃。所述酶解的时间优选为4～10h，更优选为6h。本发明优选使用EP管进行上述酶解操作。
得到去硫酸软骨素的神经组织块后，本发明将所述去硫酸软骨素的神经组织块置于0.2～1mol/L的NaCl无菌溶液中搅拌处理0.5～2h，以恢复组织形态，增加神经组织块的机械强度。在本发明中，所述NaCl的浓度优选为0.5mol/L。所述搅拌时的转速优选为100～300rpm，更优选为200rpm。所述搅拌时的温度优选为2～6℃，更优选为4℃。所述搅拌的时间优选为1h。搅拌处理后，本发明用无菌缓冲液清洗，得到所述脱细胞神经基质材料。所述清洗用无菌缓冲液优选为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的规格优选为5～20mmol/L，更优选为10mmol/L。所述清洗时的转速优选为100～300rpm，更优选为200rpm。所述清洗的时间优选为单次5～20min，更优选为单次10min。所述清洗的次数优选为3～10次，更优选为6次。
本发明用无菌缓冲液清洗后，优选还包括：将清洗后的材料灭菌和包装。在本发明中，所述灭菌优选为辐照灭菌，所述辐照灭菌优选使用伽马射线进行。所述伽马射线的辐照程度优选为20～30kGY，更优选为25kGY。所述包装优选采用无菌密封双层包装，所述包装材料优选为PETG材料。在本发明中，所述灭菌操作优选在包装后进行。
本发明提供了上述方法制备得到的脱细胞神经基质材料，所述脱细胞神经基质材料中的DNA残留量优选低于100ng/mg，更优选低于70ng/mg。所述脱细胞神经基质材料可放置于含有90μg/ml氨苄的无菌缓冲液中，4℃保存2个月以上。
本发明还提供了上述脱细胞神经基质材料在在制备神经组织替代品中的应用。该脱细胞神经基质材料作为神经损伤和缺失后的组织替代品，不仅能为组织细胞的再生提供空间，还降低了异体或异种移植的免疫反应，并且具备促进细胞分化增殖和定位的活性因子，有利于损伤部位组织微环境的重构和组织的再生。
本发明还提供了上述脱细胞神经基质材料在在制备神经组织的组织工程体外模型中的应用。该脱细胞神经基质材料作为神经组织的组织工程体外模型，可用于神经再生和发育研究。
本发明还提供了上述脱细胞神经基质材料作为原材料或组成部分，用于药品或医疗器械的应用。
下面结合实施例对本发明提供的一种脱细胞神经基质材料及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
猪周围神经脱细胞基质的制备
(1)取材：选取健康猪的胫神经，用PBS清洗两遍去除血渍。至于EP管中-80℃冰箱备用。
(2)消毒和准备：把组织块至于75％的酒精中浸泡2-3秒，用PBS清洗两遍，置于250ml的广口瓶中。
(3)预清洗和破碎：加入250ml的无菌三级水，置于震荡摇床上，设置200rpm/min，4℃处理12小时。
(4)去残留核酸：将神经组织转移到含有1000单位的核酸酶的1ml无菌D-Hank’s缓冲液的EP管中，至于震荡摇床上，设置100rpm/min，37℃处理12小时。
(5)破碎并清洗：将神经组织换到装有250ml 1％TrionX-100无菌PBS溶液的广口瓶中，置于震荡摇床，设置200rpm/min。4℃处理12小时。
(6)清洗细胞碎片：将神经组织换到装有100ml无菌PBS缓冲溶液的密封袋中，放置于超声清洗仪中，设置40HZ超声4min。
(7)去除硫酸软骨素：将神经组织块置于含有2U/ml硫酸软骨素酶的D-Hank’s缓冲液中37℃处理6小时。
(8)将神经组块织浸泡于250ml含有0.5M NaCl的无菌溶液中。置于震荡摇床上，设置200rpm/min，4℃处理1小时。
(9)清洗：将神经组织块置于200ml无菌10mmol/L PBS缓冲溶液中，200rpm/min震荡清洗10min，重复清洗6次，获得所述猪脱细胞神经基质材料。
(10)将神经组织置于组织保存液中无菌密封双层包装，25kGY伽马射线辐照灭菌。
结果评价
①微观结构观察：将制备的脱细胞神经组织放入1.5mL干净离心管中，加入OCT包埋剂没过组织；放置于冰冻切片机的托物台上，-20℃待冷冻成白色模块；切成4-8μm的薄片，切好的切片，用冷的丙酮固定30分钟；用PBS缓冲液清洗2次，5分钟/次；在组织切片上滴加荧光探针DIOC6(3)，染色30min，用PBS缓冲液清洗2次；滴加40ul含DAPI的放荧光淬灭封片剂，避光保存，倒置荧光显微镜拍照观察。新鲜神经组织横切面和纵切面显微照片如图1-a和图1-b，脱细胞神经组织横切面和纵切面显微照片如图1-c和图1-d。对照两组照片可见脱细胞神经组织保留了神经束原有轮廓，为细胞的再生提供了最佳的微环境，将有利于细胞再生和定位，此外在脱细胞神经组织不能观察到原有轴突细胞和细胞核染色，证明脱细胞神经材料细胞成分去除彻底，大大降低了脱细胞神经材料的免疫原性。
②神经脱细胞组织中DNA含量检测：将神经脱细胞组织磨碎后，用GeneJETGenomic DNA Purification Kit(Thermo Scientific)裂解消化提取DNA，并用Quant-iTPicoGreen dsDNAAssayKit(invitrogen)测定DNA含量，并与新鲜猪胫神经组织的DNA含量进行对比，结果见图2。可见用本发明方法制得的神经脱细胞组织成功去除了绝大部分核酸残留。
实施例2
脱细胞神经基质材料的生物相容性
(1)选取3-3.5KG的健康雄性新西兰大白兔，在兔右侧脸颊切除2cm的面神经；
(2)将脱细胞神经基质材料截取2cm的长度，用生理盐水清洗，手术缝合在神经缺损部位；
(3)将手术切口缝合；
(4)两周之后拆线，检测神经修复情况和炎症反应程度。
移植脱细胞神经基质材料的兔子，在两周内表现了健康的生活状态，没有出现并发症，咀嚼、听觉等无异样。移植结果如图3所示，图3-a为脱细胞神经基质材料照片；图3-b为脱细胞神经基质材料移植两周后的解剖图片，其中黑色方框标示的组织为脱细胞神经基质材料修补部位。该材料在动物体内表现出了良好的生物相容性，没有发生明显的溶解和脱离的现象。此外，较轻的免疫排斥反应也被观察到。因此，通过动物实验证明了脱细胞神经基质材料是优良的组织工程材料。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种脱细胞神经基质材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将神经组织块消毒，无菌缓冲液清洗，得到消毒神经组织块；
(2)将所述消毒神经组织块置于无菌水中震荡破碎，得到破碎后的神经组织块；
(3)将所述破碎后的神经组织块置于含有核酸酶的无菌缓冲液中酶解，得到去核酸的神经组织块；
(4)将所述去核酸的神经组织块置于含有体积浓度0.5～5％TrionX-100的无菌缓冲液中浸泡，得到去细胞膜的神经组织块；
(5)将所述去细胞膜的神经组织块置于含有硫酸软骨素酶的无菌缓冲液中酶解，得到去硫酸软骨素的神经组织块；
(6)将所述去硫酸软骨素的神经组织块置于含有0.2～1mol/LNaCl的无菌溶液中搅拌处理0.5～2h，用无菌缓冲液清洗，得到脱细胞神经基质材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中消毒的方法为：将神经组织块置于体积浓度70％～80％的酒精中浸泡2～3s。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中神经组织块的来源为健康动物神经组织，所述神经组织块的规格为：长2～3cm，直径3～4mm。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)和步骤(5)中的无菌缓冲液为pH＝7.3～7.5的D-Hank’s缓冲液；所述步骤(1)、(4)和步骤(6)中的无菌缓冲液独立为摩尔浓度5～20mmol/L的PBS缓冲液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中核酸酶的浓度为800～1200U/ml；所述步骤(5)中硫酸软骨素酶的浓度为0.5～5U/ml。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(4)在无菌缓冲液中浸泡后还包括：将所述浸泡后的神经组织块进行低频超声清洗，所述低频超声的频率为10～50HZ，所述低频频超声清洗的时间为4min～8min。
7.根据权利要求1～6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中无菌缓冲液清洗后还包括：将清洗后的材料灭菌和包装。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌采用20～30kGY的伽马射线进行辐照。
9.权利要求1～8任一项所述方法制备得到的脱细胞神经基质材料，其特征在于，所述脱细胞神经基质材料中的DNA残留量低于100ng/mg。
10.权利要求9所述神经基质材料在制备神经组织替代品或神经组织的组织工程体外模型中的应用。
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