CN115518200A - 一种脱细胞神经的制备方法及其脱细胞神经 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脱细胞神经的制备方法，所述制备方法先将神经在高渗溶液和低渗溶液中分别处理6‑12小时；再用Triton X‑100溶液和CHAPS溶液中交替处理神经2次；化学去污剂处理后的神经置入硅橡胶模具中，垂直放置于下半部浸入液氮中的金属块上冷冻1‑2小时，待冰晶形成后进行冷冻干燥；在冻干神经重新水化后，用核酸酶处理即可。通过上述制备方法得到的脱细胞神经之中可形成纵向平行排列的微通道结构并且孔隙率显著提升。这些微通道不仅具有更大的直径，而且大小更为均匀。同时，能够更好的保存各类细胞外基质成分和更多的NGF、VEGF和BDNF等生物活性因子，进而获得更加优异的神经修复效果。
Description
技术领域
本发明属于神经生物学技术领域，涉及一种脱细胞神经的制备方法和脱细胞神经。
背景技术
周围神经损伤(Peripheral nerve injury，PNI)是神经系统创伤性损害的主要类型，每年在全球范围内多达数百万人罹患，尤其在年轻人群中高发。PNI会导致相应支配区域运动与感觉出现障碍，其预后不佳、致残率高使得患者承受极大痛苦。自体神经移植被认为是修复周围神经缺损的“金标准”。然而，来源有限和供区损伤等不足的存在，使其临床应用受到极大限制。如何修复受损神经、促进靶器官神经再支配的建立、防止失神经肌肉萎缩、恢复肢体运动和感觉功能成为国内外学者关注的焦点。
随着生物材料学和组织工程学的不断发展，多种由合成或者天然材料构成的组织工程神经被研发出来。然而，合成材料被诸多研究证实难以获得与天然材料相当的生物性能。此外，用于制作人工神经移植物的天然生物材料也往往无法重现神经组织固有细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)所形成的再生微环境。脱细胞同种异体神经(Acellularnerve allografts，ANAs)因为其保留了固有ECM的优势，有望成为最具潜力的自体神经替代物。目前，Sondell脱细胞法和Hudson脱细胞法是被广泛认可的制备ANAs的处理方式。但是在Sondell脱细胞法中，因脱氧胆酸钠溶液反复的长时间处理，会导致ECM成分和生物活性因子的大量丧失，这将严重影响ANAs的神经修复性能。Hudson等人提出的脱细胞方法改良了神经脱细胞流程，并获得了较好细胞性成分去除和ECM保存的效果，但是由于其关键试剂Triton X-200停产，因而无法对Hudson脱细胞法开展进一步研究和临床应用。目前，尽管Sondell方法提出更早，但它仍然作为常规脱细胞方案，被广泛使用。值得注意的是，天然神经的ECM微结构主要由细小的基膜管组成，非常致密，但是目前常规的脱细胞方法并不会明显改变这种ECM固有微结构，因此其所制备的ANAs会存在孔隙率不足的问题，这会对移植后神经内部组织液的扩散以及代谢物质的交换产生不良影响，特别是对于修复长度较大的神经缺损。此外，基膜管直径大多不足10μm，小于再生细胞的直径(10-15μm)，这难以满足移植后的各种细胞迁移的需求。因此，尽管常规的ANAs与其他组织工程神经相比具有许多优势，但它们的内部微结构对于周围神经的修复而言可能并不是最佳选择。
在申请号202010795522.0中提供一种神经脱细胞处理方法，首先通过高低渗溶液交替处理初步裂解细胞，再利用定向冷冻干燥和轴向穿刺对神经内部结构进行改良，最后再进行化学去污剂处理以达到脱细胞的目的。该方法通过定向冷冻干燥所得到的微通道直径虽较固有基膜管有所提升，但是平均直径仅为15.72±4.90μm，这对于神经再生过程中细胞和轴突迁移来说仍略显不足。20μm以上的微通道直径被认为是神经修复再生更加理想的选择。为了进一步获得大通道，该方法还需沿神经长轴纵向插入钢针以进行穿刺，然而这一操作难度较大，不仅可能造成大通道周边微结构的破坏，而且易刺破神经。此外，单纯通过化学去污剂处理进行脱细胞可能难以获得稳定的细胞清除效果，尤其是对于直径较粗、长度较大的神经移植物，可能会导致抗原性物质的残留。这些因素的存在使得其所制备神经移植物的再生效果难以保证，进而增大了神经修复的潜在不良风险。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种进一步改良的脱细胞神经制备方法，可更好的保留生物活性物质，并优化ANAs的内部微结构。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.一种脱细胞神经的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将神经在高渗溶液中处理6-12小时，然后在低渗溶液中处理6-12小时；
(2)用Triton X-100溶液处理神经6-12小时，随后用蒸馏水洗涤3次，而后转移到CHAPS溶液中处理6-12小时，随后用蒸馏水洗涤3次；再采用这两种去污剂重复这一步骤；
(3)将步骤(2)处理的神经置入硅橡胶模具中，垂直放置于下半部浸入液氮中的金属块上，保持1-2小时，再将置入神经的硅橡胶模具放入冷冻干燥装置中，冻干12-24小时；
(4)在冻干神经重新水化后，用核酸酶处理12小时即可。
进一步所述的脱细胞神经的制备方法中，步骤(1)中的神经来源于动物神经或人源神经，所述动物神经包括来自猴、猪、牛、羊、马、犬、鼠的神经。
进一步所述的脱细胞神经的制备方法中，所述高渗溶液选自质量浓度为6％的氯化钠溶液，所述低渗溶液为蒸馏水。
进一步所述的脱细胞神经的制备方法中，所述金属块为铜块或者铁块。
优选的，金属块为铜块。
优选的，金属块为圆柱形，直径7cm，高度5cm。
进一步所述的脱细胞神经的制备方法中，步骤(2)中Triton X-100浓度为2-3％v/v，CHAPS浓度为4-7％w/v。
进一步所述的脱细胞神经的制备方法中，步骤(3)中核酸酶处理具体为将冻干的神经置入PBS中过夜以重新水化，再置于含有DNA酶和RNA酶的溶液中，在37℃条件下处理12小时。
进一步所述的脱细胞神经的制备方法中，含有DNA酶和RNA酶的溶液中DNA酶浓度为50U/ml，RNA酶浓度为5U/ml。
2.一种脱细胞神经，所述脱细胞神经通过上文所述的脱细胞神经的制备方法得到。
3.上所述的脱细胞神经的制备方法得到的脱细胞神经在制备神经移植或修复神经损伤产品中的应用。
进一步，所述神经为面神经、坐骨神经、尺神经、桡神经等周围神经。
本发明的有益效果在于：本发明进一步改良了脱细胞神经的制备方法，可更好的保留生物活性物质，并优化ANAs的内部微结构。为了减少在脱细胞过程中ANAs的ECM成分和活性因子的破坏，在通过高低渗溶液交替处理增强细胞裂解的基础上，引入了两性去污剂CHAPS，将其与低浓度的Triton X-100联合使用。测试发现在冻干之前先用CHAPS与TritonX-100处理对ECM的影响较小，并且可以更好地协调细胞性抗原去除和ECM成分保存之间的平衡，在充分去除细胞性抗原基础上更好的保留ECM成分。针对ANAs存在的基膜管直径过小和孔隙率低下的问题，本方法将液氮作为冷源配合特制模具进行定向冷冻干燥以优化ANAs的内部微结构。在我们之前的研究中发现在去污剂处理之前进行冻干处理，其所形成的微通道直径明显不足，经实验研究分析是因为细胞性成分的存在所导致。因此，为解决前期研究中的技术问题，经多种实验测试和比较，在本专利中采用先进行化学去污剂处理再进行定向冻干处理，以形成具有更大直径的微通道。此外，采用液氮作为冷源能更快的在神经内形成冰晶，且冰晶分布均匀，这使得最后在ANAs中形成的微通道能更好的维持纵向平行排列的形态，并且直径更为均匀，进而使神经修复效果得到有效提升。在脱细胞过程的最后，我们又通过核酸酶对神经进行了处理，以进一步去除抗原性成分，以确保所制备的ANAs满足临床应用的需求。通过细胞培养系统和大鼠坐骨神经缺损模型研究它们的体外生物相容性以及体内条件下对周围神经修复再生影响的相关实验，均证实本发明所提出的改良脱细胞方法所制备创新性ANAs不仅能更好地保存各类ECM成分和生物活性因子，而且具有优化的多通道微结构，进而获得了更加优异的神经修复效果。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为常规Sondell脱细胞法(Sondell acellular nerve allografts，S-ANA)和改良脱细胞法(Modified acellular nerve allografts，M-ANA)制备神经移植物的流程图。
图2为定向冷冻干燥流程及神经微结构优化示意图。
图3为各实验组神经的(A)Masson染色图、PSR染色图、HE染色图，(B，C)DNA残留评价以及(D，E)ECM成分保留评估的实验结果。*表示与Native组相比有统计学差异；#表示与S-ANA组相比有统计学差异。
图4为两个脱细胞组中关键生物活性分子和再生因子的含量比较。其中(A)考马斯亮蓝染色检测两组总蛋白并作为上样对照。(B，C)通过蛋白质印迹比较层粘连蛋白、纤粘连蛋白、I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白含量并通过灰度分析定量。(D)用ELISA检测神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)含量。*表示与Native组相比有统计学差异；#表示与S-ANA组相比有统计学差异。
图5为(A)不同脱细胞组神经移植物的横断面扫描电镜图(SEM)，(B,C,D)微通道直径分布、平均直径和孔隙率比较，以及(E)膨胀比率分析。*表示与Native组相比有统计学差异；#表示与S-ANA组相比有统计学差异。
图6为生物力学试验结果，其中包括(A)杨氏模量、(B)断裂应力、(C)断裂应变和(D)缝合强度。*表示与Native组相比有统计学差异；#表示与S-ANA组相比有统计学差异。
图7为M-ANA和S-ANA支持施万细胞渗透迁移的能力以及生物相容性的比较。其中(A)DAPI染色显示在细胞接种后第3天和第7天S-ANA和M-ANA中施万细胞的增殖和渗透情况(比例尺＝100μm)。虚线代表初始细胞接种位置。进行(B)培养基中DNA释放量检测和(C)浸提液的CCK-8检测以分析M-ANA和S-ANA的细胞毒性。*表示与Native组相比有统计学差异；#表示与S-ANA组相比有统计学差异。
图8为体内植入研究中功能和肌肉恢复情况评估和电生理分析的示意图。其中，(A)为体内植入研究示意图，深色和浅色方框分别代表中央移植物和远端神经的取材位置。柱状图显示(B)移植后第2、4、6、8、10和12周的坐骨神经功能指数和移植后第6和12周的(C)神经传导速度、(D)动作电位振幅比和(E)肌肉湿重比。*表示与ANG组相比有统计学差异；#表示与S-ANA组相比有统计学差异。
图9为体内植入后第6周和第12周轴突再生情况的评估。(A)再生神经中NF200(红色)和S-100(绿色)的免疫荧光染色(比例尺＝20μm)。柱状图显示移植后第6周(B)和第12周(C)NF200阳性区域的比率。*表示与ANG组相比有统计学差异；#表示与S-ANA组相比有统计学差异。
图10为体内植入后第6周和第12周再生轴突髓鞘形成情况的评估。(A)再生神经髓鞘的甲苯胺蓝染色(比例尺＝10μm)和透射电镜(TEM)分析(比例尺＝2μm)。柱状图显示了移植后第6周(B、C、D)和第12周(E、F、G)时髓鞘化轴突的密度、G-ratio和髓鞘厚度。*表示与ANG组相比有统计学差异；#表示与S-ANA组相比有统计学差异。
具体实施方式
下面将结合附图及实施例对本发明的技术方案做进一步说明。所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本研究中的所有动物工作都得到了中国医科大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准，并按照中国卫生部和美国国立卫生研究院的《实验动物护理和使用指南》进行。成年雄性Sprague Dawley大鼠(250±20g)来自长生生物公司(中国，辽宁)。大鼠有12小时的光照/黑暗周期，有标准的水和食物。他们在手术前被运送并保存了7天以上。所有手术都是在全身麻醉下进行的，麻醉方式为腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg体重)。
统计学分析：采用SPSS 17.0统计软件处理实验数据。所有数据均用均数±标准差表示。两组间比较采用t检验进行分析，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Turkey检验或者Dunnett’s T3检验，p<0.05为差异具有统计学意义。
实施例1
1、大鼠坐骨神经的获取
选用60只健康的雄性8周龄Sprague Dawley大鼠，体重在200-250g之间，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供。大鼠用1％(w/v)戊巴比妥钠腹腔麻醉后,备皮、消毒,做双侧臀部至大腿的弧形切口，显露出坐骨神经后，取出梨状肌下缘至腓总神经分出腓浅和腓深神经前的坐骨神经。去除坐骨神经周围脂肪组织、结缔组织和血液后，用含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的PBS反复冲洗，最后置入PBS中于4℃条件下短期保存以备使用。
2、实验分组及样品的制备
将所获得的神经随机平均分为三组，再分别按照以下制备方法处理，图1为两种脱细胞神经组制备流程图：
Native：天然神经组(Native nerves)；
S-ANA:Sondell脱细胞神经组(Sondell acellular nerve allografts)；
M-ANA:改良脱细胞神经组(Modified acellular nerve allografts)。
各组样品通过以下方案进行制备：
Native：本组样品为新鲜的大鼠坐骨神经，作为其他各组的对照。
S-ANA：本组样品为通过Sondell脱细胞法进行处理的神经，具体步骤如下：
(1)室温下浸泡在蒸馏水中7小时，期间换液一次；
(2)浸泡于3％Triton X-100中，室温振荡(120rmp)处理12小时；
(3)于室温下在蒸馏水中荡洗3次，每次10分钟；
(4)浸泡于4％脱氧胆酸钠中，室温下振荡(120rmp)处理24小时；
(5)于室温下在蒸馏水中荡洗3次，每次10分钟；
(6)浸泡于3％Triton X-100中，室温振荡(120rmp)处理12小时；
(7)于室温下在蒸馏水中荡洗3次，每次10分钟；
(8)浸泡于4％脱氧胆酸钠中，室温下振荡(120rmp)处理24小时；
(9)于室温下在蒸馏水中荡洗3次，每次10分钟；
(10)置于加入1％双抗PBS中，4℃冰箱中储存备用。
M-ANA:本组样品为通过本发明新型改良脱细胞法进行处理的神经，具体步骤如下：
(1)将神经节段在6％(w/v)氯化钠溶液中震荡(120rmp)处理6-12小时，然后在室温下在蒸馏水中震荡(120rmp)处理6-12小时。高渗和低渗溶液交替处理的目的在于对细胞进行初步裂解，为进一步去除各类抗原成分奠定基础。高渗溶液可以使细胞中的蛋白质与DNA分离，低渗溶液则能引起细胞破裂，并且其二者共同作用对ECM的破坏作用极小。
(2)随后进行化学去污剂短时间交替处理。用2-3％(v/v)Triton X-100溶液震荡(120rmp)处理神经6-12小时，随后用蒸馏水洗涤3次，每次15分钟，而后转移到4-7％(w/v)CHAPS(3-(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基-1-丙磺酸(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)溶液中震荡(120rmp)处理6-12小时，然后通过蒸馏水洗涤3次，每次15分钟，再采用这两种去污剂重复这一步骤。非离子型去污剂Triton X-100主要通过破坏脂质-脂质和脂质-蛋白质相互作用来溶解细胞膜，核膜和细胞器膜上的脂质，而对ECM的损害很小。CHAPS作为一种两性型去污剂，兼具离子和非离子去污剂的特性，并且在亲水头基上的净电荷为零，因而其可在高效脱细胞的同时保护蛋白质的天然状态。测试发现在冻干之前先用Triton X-100和CHAPS这两种化学去污剂的联合处理有助于更好地协调脱细胞过程中细胞性成分的去除和ECM的保存之间的平衡，减少ECM的损失，而且对神经损伤较小，并且可保留更多的生物活性因子。
(3)进行液氮定向冷冻干燥来诱导ANAs之中纵向微通道的形成，以改良其内部微结构。在这个过程中需要使用如图2所示的硅橡胶模具和铜柱(直径7cm，高5cm)。硅橡胶模具的作用在于使神经垂直于铜柱并隔离垂直方向以外的其他方向的热量传递；铜柱的作用在于将液氮的低温传递至其上的硅橡胶模具，以使在模具之中形成垂直温度梯度，这有助于在神经内产生纵向冰晶。具体步骤大致为，将神经置入硅橡胶模具中预留的沟槽中，然后含有神经的模具放置在下半部2.5cm浸入液氮的铜柱上，保持1-2小时。随后，将模具迅速转移至真空冷冻干燥机中，冻干12-24小时。图2为定向冷冻干燥流程及微结构优化示意图，如图所示模具内单向性温度梯度可诱导神经内平行排列冰晶的形成并沿着神经长轴生长延伸。此时，神经中的胶原纤维束被挤压并集中在这些冰晶之间，在冰晶升华后则在神经内形成了纵向排列的微通道。与此相比，我们之前的研究发现在去污剂处理之前进行冻干处理的话，其所形成的微通道直径则略显不足，经实验研究分析是因为细胞性成分的存在导致的。因此，为解决前期研究中的技术问题，经多种实验测试和比较，最后发现先进行化学去污剂处理再进行定向冻干处理，有助于微通道形成直径较大的纵向微通道。不仅如此，在定向冷冻的过程中，我们还发现将液氮作为冷源，能更快的在神经内形成冰晶，且有助于维持这些冰晶纵向连续的走形，进而确保了最终形成的微通道平行排列的微形貌。经本发明改良冻干处理后的ANAs的质地变得更为疏松，内部形成了具有较大直径的纵向微通道，并获得了显著提高的孔隙率，这与常规ANAs的主要由细小基膜管所组成的致密结构形成鲜明对比，因而达到了ANAs内部微结构优化的目的。
(4)最后进行核酸酶处理以进一步去除核苷酸等抗原物质和洗脱组织内细胞裂解后的碎片。具体过程大致为，将冻干的神经置入PBS中过夜以重新水化，随后转移至含有DNA酶(50U/ml)和RNA酶(5U/ml)的溶液中，在37℃条件下持续震荡(120rpm)处理12小时。这些核酸酶可以通过催化水解核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸链中的磷酸二酯键来裂解核酸序列，导致RNA或DNA的降解，进而促进这些分子从神经中清除。值得注意的是，优化的内部结构的存在不仅有助于后续核酸酶溶液的渗入并发挥作用，而且可为各类试剂和组织碎片的洗脱提供了更加有利的条件。因此，核酸酶处理被引入到本脱细胞过程中来，作为化学去污剂处理的补充，以进一步确保所制备的ANAs满足临床应用的低免疫原性要求。
在经过上述处理步骤后，最终获得具有多通道微结构的改良ANAs。用蒸馏水洗涤3次(每次15分钟)后，将所制备的ANAs置入添加1％双抗的PBS，4℃冰箱中储存备用。
实施例2
1.1组织学分析
各组样本用4％多聚甲醛固定，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，并切成5μm的切片。横切片用苏木精和伊红(HE)染色，以评估细胞性成分的去除情况。在纵向切片中进行Masson染色和天狼星红染色(PSR)以分析胶原纤维的形态和成分特征。染色结果如图3中A所示。
1.2生物化学分析
测量残留DNA的含量和片段大小以评估脱细胞的程度。使用DNA提取试剂盒(Takara，日本)从样品中提取总DNA，并使用NanoPhotometer N50(IMPLEN，德国)定量。通过1％琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA片段大小。
测量总胶原蛋白和硫酸化糖胺聚糖的含量以评估关键ECM成分的保存情况。总胶原蛋白含量是通过用羟脯氨酸测定试剂盒(Sigma-Aldrich，USA)对羟脯氨酸含量进行量化来确定的。因为羟脯氨酸主要局限于胶原蛋白，它可以作为组织中胶原蛋白含量的指标。总胶原蛋白含量是根据羟脯氨酸与胶原蛋白的比例为1:7.69计算的。此外，硫酸化糖胺聚糖含量通过使用Blyscan试剂盒(Biocolor，英国)的1,9-二甲基亚甲基蓝染料结合试验进行量化。
每个步骤都是按照制造商的说明进行的。所有的生化检测都以组织干重为标准，每组使用5个样本。
1.3免疫印迹分析
为了评估不同的脱细胞方法对主要ECM分子保存的影响，通过免疫印迹法(Western blot)检测M-ANA和S-ANA中的层粘连蛋白、纤粘连蛋白、I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白的含量。使用BCA蛋白试剂盒(Thermo Fisher Scientific,USA)提取样品中的总蛋白并进行定量。等量的蛋白质在两个SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离。一条凝胶用考马斯亮蓝染色以量化总蛋白，作为上样量的对照。另一个被转移到PVDF膜上，进行封闭后，将膜与层粘连蛋白、纤粘连蛋白、I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白的抗体(1:1000，Abcam，USA)在4℃条件下孵育过夜，然后将第二抗体(1:10000，Abcam，USA)在室温下孵育1小时。蛋白质条带用增强型化学发光试剂盒(Thermo Fisher Scientific，USA)进行可视化，并用Image J(National Institutes of Health，USA)进行灰度分析来量化。所有检测均独立重复三次。
1.4酶联免疫吸附试验
为了分析不同的脱细胞方法对关键生物活性因子保留的影响，进行了酶联免疫吸附试验(ELISA)来检测M-ANA和S-ANA中的神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)和脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的含量。根据制造商的说明使用ELISA试剂盒(Thermo Fisher Scientific，USA)。根据标准曲线计算NGF、VEGF和BDNF的浓度。所有的检测都是独立重复3次。
1.5扫描电镜分析
进行扫描电镜(Scanning electron microscopy，SEM)以揭示各组的超微结构特征。样品在2.5％戊二醛中固定2小时，并在4℃条件下用1％锇酸进行后固定30分钟。然后将样品在液氮中淬断以形成断裂面。通过乙醇梯度脱水和临界点干燥后，用铂金喷洒横断面，用扫描电子显微镜(VEGA3，TESCAN，捷克)观察。SEM图像被用来描述每组的内部形态和直径分布。对每组的5个样品进行分析，并在每个样品中随机选择5个高倍镜视野，分别位于横截面的上、下、中、左和右部分。每组超过200个微通道被测量，以获得直径大小的分布和平均值。直径大小由Image-Pro Plus(Media Cybernetics，USA)测量，并以其最短和最长直径的平均值表示。
1.6孔隙率测试
每组的孔隙率是通过气体-乙醇置换法测定的。简而言之，将冻干的样品在量筒中浸入一定体积(V0)的无水乙醇中10分钟，记录浸入乙醇的样品和乙醇的总体积为V1。然后，取出样品，将残留的乙醇体积记录为V2。每组检查5个样品。孔隙率通过以下公式计算：
Porosity(％)＝(V0-V1)/(V1-V2)×100％。
1.7膨胀试验
每组样品的膨胀行为是通过再水化实验来分析的。样品首先被冻干以获得稳定的干重(W0)，然后将冻干的样品在室温下浸泡在PBS中24小时。从PBS中取出样品后，用滤纸除去表面多余的水，以获得稳定的肿胀重量(Ws)。每组有5个样品被检测。膨胀比率按以下公式计算：
膨胀比率＝(Ws-W0)/W0×100％。
2.1脱细胞程度评价
ANAs的脱细胞程度是通过组织学和生物化学分析来评价的。HE染色显示，与S-ANA一样，M-ANA中没有可见的细胞核(图3中A)。DNA定量显示，经过改良脱细胞方法处理后，M-ANA的DNA含量与未处理的Native相比有明显下降(p<0.05)，与常规脱细胞方法制备的S-ANA相当(p>0.05)(图3中C)。此外，在琼脂糖凝胶电泳中，M-ANA没有发现明显的DNA片段条带(图3中B)。
2.2ECM形态学特征分析
ANAs的ECM形态通过HE染色(比例尺＝20μm)、Masson染色(比例尺＝100μm)、PSR染色(比例尺＝50μm)和SEM进行了表征(图3中A，图5中A)，揭示了脱细胞后各组胶原蛋白的完整性和结构特点。Native有典型的包裹轴突和髓鞘的神经内膜结构。在Native中可以观察到纵向的胶原纤维。这些纤维紧密而整齐，主要由I型胶原蛋白组成，并可见一些散在的III型胶原蛋白。脱细胞后，M-ANA和S-ANA的轴突和髓鞘被有效地消除了。S-ANA保留了基膜管的紧凑微结构，但胶原纤维的排列略显混乱。此外，除了I型胶原蛋白，S-ANA在脱细胞后暴露了更多的III型胶原蛋白。在M-ANA中，观察到优化的多通道微结构的存在。胶原蛋白纤维表现出松散的分布状态。在平行纤维之间有许多连续的微通道沿纵向排列。与S-ANA类似，在M-ANA中可以看到大量的III型胶原蛋白均匀地分布在I型胶原蛋白周围。
2.3 ECM成分的描述
为了评估脱细胞后ECM成分保留情况，本研究对Native和两种ANAs中的总胶原蛋白和硫酸化糖胺聚糖的含量进行了定量检测。与Native相比，M-ANA和S-ANA中的总胶原含量在脱细胞处理后明显增加(p<0.05)，但它们之间没有明显差异(p>0.05)(图3中D)。就硫酸化糖胺聚糖含量而言，M-ANA和S-ANA与Native相比，表现出明显的下降(p<0.05)。M-ANA的硫酸化糖胺聚糖明显多于S-ANA(p<0.05)(图3中E)。
为了进一步分析不同脱细胞方法保留基质蛋白的能力，分别用Western blot和ELISA比较两个脱细胞组中关键生物活性分子和再生因子的含量。Western blot结果显示，M-ANA和S-ANA中保留的I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白的水平是相当的(p>0.05)。但M-ANA中的层粘连蛋白和纤粘连蛋白的水平明显高于S-ANA(p<0.05)(图4中A，B，C)。此外，ELISA结果显示，与S-ANA相比，M-ANA中VEGF、NGF和BDNF的含量明显更高(p<0.05)(图4中D)。
2.4微通道直径和孔隙率分析
为了确定不同脱细胞方法所制备的ANAs的超微结构特征，进行了孔径分析和孔隙率检测。根据SEM评估了微通道直径分布。图5为不同组神经横断面SEM图，以及微通道直径、孔隙率比较直方图。其中(A)横截面的SEM图像放大倍数为×700的天然神经、S-ANA和M-ANA(比例尺＝50μm)，插图是放大倍数为×2000的SEM图像(比例尺＝20μm)。微通道直径的频率分布(B)、平均直径(C)和孔隙率(D)被评估以研究孔隙的特征。脱细胞后，S-ANA与Native相比，微通道的平均直径明显增加(p<0.05)，但大多数微通道直径仍低于10μm。然而，M-ANA的微通道直径主要分布在20-35μm之间，平均直径为25.08±8.75μm，明显大于其他组(p<0.05)(图5中B，C)。此外，孔隙率测试的结果表明，M-ANA和S-ANA的孔隙率与Native相比明显增加(p<0.05)。M-ANA表现出明显高于S-ANA的孔隙率(p<0.05)(图5中D)。
在申请号为202010795522.0的专利中，定向冷冻干燥所形成的微通道直径大多集中在15-20μm的范围内。然而，在神经再生过程中，施万细胞所形成的Büngner带的直径范围从2-5μm到15-20μm，因此小于20μm的移植物微通道直径可能会对Büngner带的形成造成不良影响，而Büngner带是轴突再生的关键，起到支持和引导的重要作用。在本专利中，经过处理过程优化调整并多次试验后，最终制备的ANAs中微通道直径获得了显著提升，这将为神经修复过程中的各类再生细胞迁移和新生轴突的延伸提供更加有利的条件，而且20-35μm的微通道直径被诸多研究证实是协调轴突有效延伸和紊乱生长之间平衡的理想范围。
2.5吸水性能
膨胀测试是为了评估各组样品的吸水能力。与Native相比，M-ANA和S-ANA在脱细胞处理后表现了明显更高的膨胀比率(p<0.05)。此外，M-ANA的膨胀比率明显高于S-ANA(p<0.05)(图5中E)。
实施例3生物力学试验
为了评估各组样品的生物力学性能，使用动态机电测试仪(天津，中国)进行了拉伸试验。以10mm/min的恒定应变速率施加平行于样品纵轴的单轴拉伸应力。测试期间，样品保持湿润。每组有5个样品被检测。
为了检测拉伸性能，样品的两端被安装在装有砂纸的定制夹子上，夹子之间留有10mm的距离。每个样品被拉伸到完全断裂。测量杨氏模量、断裂应力和断裂应变。
为了检测缝合强度，用8-0尼龙缝合线将每个样品缝合在两个新鲜大鼠坐骨神经之间。缝线在距离样品边缘1mm处穿透外膜，并至少打7个结以确保不发生绳结滑动。将新鲜神经的另一侧夹在测试仪器上。缝线强度被定义为当缝线被拉出神经外膜时的最大负荷。
进行生物力学测试是为了确定ANA在不同的脱细胞过程后的性能变化。表1为生物机械性能分析结果，图6为生物力学试验结果，M-ANA的杨氏模量和断裂应力与Native的没有明显的差异(p>0.05)(图6中A和B)。然而，与Native相比，S-ANA表现出明显的增加(p<0.05)，并明显高于M-ANA(p<0.05)。此外，三组之间的断裂应变和缝合强度没有明显差异(p>0.05)(图6中C和D)。
表1生物机械性能分析结果
实施例4生物相容性评价
4.1体外研究对雪旺细胞的渗透性
为了评估M-ANA和S-ANA支持施万细胞渗透和迁移的能力，进行了细胞渗透试验。将样品预先浸泡在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM/F-12中，在37℃条件下浸泡24小时。将原代施万细胞以1×107个细胞/ml的浓度重新悬浮在培养基中。然后以恒定的速度(0.5μl/s)将5μl的细胞悬液接种在样品一端。30分钟后，将另5μl的细胞悬液接种在样品的同一端。1小时后，向每孔加入2.5ml培养基。此后，制备每个样品的10μm纵向切片，并用4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI，Sigma-Aldrich，USA)染色，以标记施万细胞的细胞核，用于分析施万细胞于体外条件下在不同ANAs中的增殖和渗透行为。
对施万细胞的渗透行为进行分析，以确定优化的超微结构对ANAs功能特性的影响。培养3天后，在S-ANA中没有观察到明显的细胞渗透到ANAs中，大部分的细胞仍然位于初始接种位置。相比之下，在M-ANA中可见许多细胞通过其内部微通道渗入到样品中。培养7天后，两组的施万细胞都表现出明显的增殖。S-ANA的大多数细胞仍留在样品的表浅区域。然而，对于M-ANA，大量的细胞被发现沿着微通道进一步增殖和迁移，并均匀分布于样品之中(图7中A)。
在申请号为202010795522.0的专利中，定向冷冻干燥所形成的微通道直径较小，因而在施万细胞接种初期，只能观察到细胞沿着轴向穿刺形成的大通道进入移植物内部，而并没有观察到明显的细胞沿着微通道渗入的情况。直到在细胞接种第7天，才能初步观察到细胞沿着微通道少量进入移植物。与之形成明显对比，在本专利中形成移植物微通道能够更加有效地支持施万细胞的渗入和迁移，这为神经损伤后的修复再生提供了更加有利的微结构优势。
4.2培养基中DNA含量的检测
检测培养基中的DNA释放量以评估细胞损伤的程度，从而分析M-ANA和S-ANA的生物相容性。用NanoPhotometer N50(IMPLEN，德国)对细胞渗透试验的第3天培养液中的DNA释放量进行了检测。无任何样品培养的施万细胞作为阴性对照，用2％Triton X-100培养的施万细胞作为阳性对照。
对从受损或死亡细胞中释放的DNA进行量化，以评估ANAs的生物相容性。结果发现，与阴性对照组一样，在M-ANA和S-ANA的培养基中几乎检测不到DNA的释放(p>0.05)。此外，它们的DNA含量远远低于阳性对照组(p<0.05)(图7中B)。
4.3细胞毒性评价
CCK-8被用来评估M-ANA和S-ANA的细胞毒性。浸提液通过每组0.1g样品在37℃条件下孵育72小时进行制备。此外，还准备了正常培养基对照(DMEM)、阴性对照(聚乙烯)、阳性对照(DMSO)和空白对照(不含细胞的培养基)。将RSC96细胞接种到96孔板中，浓度为1×104个细胞/孔。更换培养基后，在每个孔中加入10μl CCK-8溶液，然后孵育2小时，在450nm处测量吸光度。细胞增殖分别在24、48和72小时进行评估。在每个时间点，每组有5个样本进行分析。
在24、48和72小时进行CCK-8检测，作为生物相容性分析的补充，以提供全面的评估。结果显示，每组的细胞随着时间的推移而增殖。在三个时间点，M-ANA和S-ANA的OD450值是相当的(p>0.05)，与阴性对照组相比没有明显的差异(p>0.05)。此外，它们明显高于阳性对照组(p<0.05)(图7中C)。
实施例5体内功能性评价
1.1手术方案
雄性Sprague Dawley大鼠(n＝48)被随机分为三组：自体神经移植(ANG)，S-ANA和M-ANA。所有的手术过程都由同一外科医生在无菌条件下进行，戊巴比妥钠麻醉(腹腔注射，40mg/kg体重)。在右侧股二头肌的水平上做一个皮肤切口，然后沿着筋膜解剖肌肉，以暴露坐骨神经。切除一段8mm的坐骨神经，在缩回神经残端后留下10mm的缺损。对于ANG来说，横切的神经段被反转并缝合回缺隙处。对于S-ANA和M-ANA，移植物被缝合到两个神经断端的外膜。所有手术都是在显微镜下使用8-0尼龙缝合线进行的，然后，使用标准技术关闭肌肉和皮肤。除了步态分析(第2、4、6、8、10和12周)之外，其他检测分别在植入后第6周和第12周进行(每个时间点每组n＝8)。
1.2步态分析
步态分析可以测定各组大鼠的坐骨神经功能指数(Sciatic functional index，SFI)，继而评价术后坐骨神经运动功能恢复的情况。具体方法如下，在大鼠双侧后足底部涂上黑色墨水，然后让其走过一个40cm×8cm底部铺有白纸、末端连接暗箱的过道，行走后白纸上留下足迹，分别测量实验侧(E)和正常侧(N)的三个参数：足印长度(Print length，PL)，测量值为足跟到足尖的最长距离，EPL为实验侧足印长度，NPL为正常侧足印长度；足距宽度(Toe spread，TS)，测量值为第一趾到第五趾之间的连线距离，ETS为实验侧足距宽度，NTS为正常侧足距宽度；中间足趾宽度(Intermediary toe spread，ITS)，测量值为第二趾到第四趾之间的连线长度，EITS为实验侧中间足趾宽度，NITS为正常侧中间足趾宽度。
将上面三个测得的参数代入Bain公式如下:
SFI＝-38.3(EPL-NPL)/NPL+109.5(ETS-NTS)/NTS+13.3(EITS-NITS)/NITS-8
根据上述公式计算SFI。SFI为0表示神经功能正常，-100表示功能完全丧失。
1.3电生理检测
在原手术切口处暴露桥接后的神经移植物的近远侧端，采用电生理仪检测并记录复合肌肉动作电位(Compound muscle action potential，CMAP)。刺激电极位于神经移植物的近、远端，记录电极位于胫前肌，地线位于记录电极附近肌肉。测量两个刺激电极间的距离和潜伏期，并通过其二者计算出神经传导速度(Motor nerve conduction velocity,MCV)。与此同时，双侧CMAP的振幅也被记录下来，数据用实验侧与正常侧振幅之比来表示。
1.4肌肉湿重评估
电生理测试后，用过量的戊巴比妥钠对大鼠进行安乐死。然后仔细解剖每组的双侧胫骨前肌，并立即称重以评估肌肉恢复情况。肌肉湿重比表示为手术侧与正常侧的百分比。
1.5甲苯胺蓝染色
将神经移植物和远端神经进行修剪，4℃条件下在2.5％(v/v)的戊二醛中固定2小时后，继续使用1％(w/v)四氧化锇进行后固定20分钟。然后，进行梯度乙醇脱水，并包埋在Epon812环氧树脂中，使用超薄切片机制备1μm半薄切片。之后进行甲苯胺蓝染色具体操作如下：1％甲苯胺蓝溶液在50℃条件下染色5分钟；蒸馏水洗涤，然后立即用95％酒精分色；无水乙醇脱水后再用二甲苯Ⅰ、Ⅱ分别透明2分钟；中性树胶封固。在光学显微镜下观察并采集图像，其中每个切片选择5个高倍视野(×1000，切片的中央、顶部、底部、左侧和右侧)进行分析，通过Image-Pro Plus软件计算有髓神经纤维的平均密度(轴突数量/mm2)。
1.6透射电子显微镜分析
透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)用于分析长入远端断端神经纤维的微观形态特征，从而进一步评估其再髓鞘化程度。为了进行TEM观察，制备了远端断端横向超薄切片，用乙酸铀和柠檬酸铅染色，然后在透射电子显微镜(HT7700，日本日立)下观察。从每个超薄切片的10个随机区域获取图像，用Image J进行分析，测量髓鞘的平均厚度和有髓神经纤维的平均直径。G-ratio计算为轴突直径(纤维直径减去髓鞘厚度)与纤维直径之比。
1.7免疫荧光分析
将神经移植物和远端神经进行修剪，去除周围结缔组织，4℃条件下在4％(w/v)多聚甲醛溶液中固定12小时。通过20％、30％蔗糖溶液浸泡脱水后，OCT包埋,制备10μm冰冻切片。之后进行免疫荧光染色，具体操作如下：将切片在PBS中浸泡10分钟，然后用5％羊血清在37℃条件下封闭1小时；吸去血清，滴加NF200(1:100)和S-100(1:200)抗体混合稀释液，在4℃条件下孵育过夜；PBS洗涤5分钟×5遍，滴加相应的荧光标记二抗混合稀释液(1:500)，在37℃条件下孵育1小时；PBS洗涤5分钟×5遍，抗荧光淬灭封片剂封片。在共聚焦显微镜下观察结果并采集图像，其中每个切片选择5个视野(切片的中央、顶部、底部、左侧和右侧)进行分析，使用Image-Pro Plus软件计算所选区域内NF200阳性面积的百分比。
2.1.运动功能评价
图8为功能恢复和电生理的体内研究和评估示意图。其中，A为体内研究示意图，红色和橙色框分别代表中央移植物和远端神经断端的采样位置。SFI是评估神经修复后运动功能恢复的一个关键指标。研究发现，随着时间的推移，每组的SFI都有改善。然而，在前6周，ANG、S-ANA和M-ANA之间没有明显的差异(p>0.05)。从8周开始，M-ANA表现出比S-ANA更高的SFI(p<0.05)，但与ANG相比仍明显较低(p<0.05)(图8中B)。
2.2电生理学分析
电生理分析可以对移植物形成的靶器官神经再支配进行有效的评估。在移植后第6周时，M-ANA的MCV明显优于S-ANA(p<0.05)，与ANG相比无明显差异(p>0.05)(图8中C)。在CMAP振幅方面，M-ANA和S-ANA之间没有明显差异(p>0.05)，它们明显低于ANG(p<0.05)。在第12周时，M-ANA的MCV和CMAP振幅明显大于S-ANA(p<0.05)，但仍不如ANG(p<0.05)(图8中D)。
2.3肌肉恢复评价
胫骨前肌的湿重比反映了修复后肌肉的恢复程度。结果显示，所有组的湿重比随着时间的推移而增加。在第6周时，三组之间没有明显差异(p>0.05)。在第12周时，与S-ANA相比，M-ANA的湿重比更高(p<0.05)，但明显低于ANG(p<0.05)(图8中E)。
2.4轴突再生和再髓鞘化分析
用NF200和S-100标记的免疫荧光检测来分析新生神经的轴突再生情况(图9中A)。在第6周时，与S-ANA相比，M-ANA的NF200阳性区域在中段移植物中的比例明显较高(p<0.05)。此外，在远端神经，M-ANA也显示出较高比例的趋势，虽然差异没有统计学意义(p>0.05)(图9中B)。在第12周时，M-ANA的中段移植物和远端神经比率都明显高于S-ANA(p<0.05)。在两个时间点，ANG在中段移植物和远端神经都表现出最高的比率(p<0.05)(图9中C)。
通过甲苯胺蓝染色和TEM评估了新生神经的再髓鞘化情况(图10中A)。在第6周时，M-ANA的髓鞘化轴突密度明显高于S-ANA的中段移植物和远端神经(p<0.05)。与ANG相比，M-ANA在中段移植物处没有明显差异(p>0.05)。然而，在远端神经，M-ANA的密度明显低于ANG(p<0.05)。在第12周时，在中段移植物和远端神经，M-ANA的髓鞘化轴突密度明显高于S-ANA(p<0.05)，但明显不如ANG(p<0.05)(图10中B，E)。通过测量G-ratio来进一步评估轴突髓鞘化情况，结果显示ANG获得的G-ratio最低，更接近理想值0.6，所有其他组在第6周和第12周时的G-ratio都明显较高(p<0.05)。值得注意的是，与S-ANA相比，M-ANA表现出较低的G-ratio(p<0.05)，这与ANG更接近(图10中C，F)。就髓鞘厚度而言，在第6周时，M-ANA明显比S-ANA厚(p<0.05)。M-ANA的平均厚度比ANG略小，但差异没有统计学意义(p>0.05)。第12周时，M-ANA仍明显比S-ANA厚(p<0.05)，但与ANG相比明显小(p<0.05)(图10中D，G)。
总的来说，本发明开发了一种由物理、化学和生物处理等多种技术手段相结合的改良脱细胞方案，其目的在于优化ANAs的内部微结构的同时，尽可能去除神经内各类抗原成分，并保留更多的ECM成分和生物活性因子。这种改良的方法将有效应对目前传统脱细胞方法存在的瓶颈性问题，有望制备一种具有比常规ANAs更优异神经修复能力的新型ANAs，这可为临床上PNI治疗效果的有效提升带来更多可能，尤其是可用于面神经、坐骨神经、尺神经、桡神经等周围神经。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种脱细胞神经的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将神经在高渗溶液中处理6-12小时，再在低渗溶液中处理6-12小时；
(2)用Triton X-100溶液处理神经6-12小时，随后用蒸馏水洗涤3次，而后转移到CHAPS溶液中处理6-12小时，随后用蒸馏水洗涤3次，再采用这两种去污剂重复这一步骤；
(3)将步骤(2)处理的神经置入硅橡胶模具中，垂直放置于下半部浸入液氮中的金属块上，保持1-2小时，再将置入神经的硅橡胶模具放入冷冻干燥装置中，冻干12-24小时；
(4)在冻干神经重新水化后，用核酸酶处理12小时即可。
2.根据权利要求1所述的脱细胞神经的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的神经来源于动物神经或人源神经，所述动物神经包括来自猴、猪、牛、羊、马、犬、鼠的神经。
3.根据权利要求1所述的脱细胞神经的制备方法，其特征在于，所述高渗溶液选自质量浓度为6％的氯化钠溶液，所述低渗溶液为蒸馏水。
4.根据权利要求1所述的脱细胞神经的制备方法，其特征在于，所述金属块为铜块或者铁块。
5.根据权利要求1所述的脱细胞神经的制备方法，其特征在于，步骤(2)中Triton X-100浓度为2-3％v/v，CHAPS浓度为4-7％w/v。
6.根据权利要求1所述的脱细胞神经的制备方法，其特征在于，步骤(3)中核酸酶处理具体为将冻干的神经置入PBS中过夜以重新水化，再置于含有DNA酶和RNA酶的溶液中，在37℃条件下处理12小时。
7.根据权利要求6所述的脱细胞神经的制备方法，其特征在于，含有DNA酶和RNA酶的溶液中DNA酶浓度为50U/ml，RNA酶浓度为5U/ml。
8.一种脱细胞神经，所述脱细胞神经通过权利要求1-7任一所述的脱细胞神经的制备方法制备得到。
9.权利要求8所述的脱细胞神经在制备神经移植或修复神经损伤产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述神经为面神经、坐骨神经、尺神经、桡神经等周围神经。
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110276066A1 (en) * | 2010-04-15 | 2011-11-10 | National University Of Ireland, Galway | Multichannel collagen nerve conduit for nerve repair |
| WO2013070907A1 (en) * | 2011-11-08 | 2013-05-16 | Tufts University | A silk-based scaffold platform for engineering tissue constructs |
| US20180105795A1 (en) * | 2016-10-13 | 2018-04-19 | Sun Yat-Sen University | Method for preparation of extracellular matrix-modified decellularized nerve scaffold and use thereof |
| CN108992709A (zh) * | 2018-07-27 | 2018-12-14 | 山东省眼科研究所 | 一种脱细胞神经基质材料及其制备方法和应用 |
| CN109602954A (zh) * | 2018-12-17 | 2019-04-12 | 浙江华臻医疗器械有限公司 | 一种脱细胞神经基质及其制备方法 |
| WO2019165103A1 (en) * | 2018-02-21 | 2019-08-29 | University Of Florida Research Foundation | Decellularized tissues, hydrogels thereof, and uses thereof |
| CN110464877A (zh) * | 2019-06-25 | 2019-11-19 | 滨州医学院 | 一种脱细胞神经支架的制备方法及其效果评价方法 |
| CN110585488A (zh) * | 2019-10-29 | 2019-12-20 | 中国医科大学 | 一种新型复合材料制备的神经修复导管及其制备方法 |
| CN111714701A (zh) * | 2020-08-10 | 2020-09-29 | 四川大学 | 一种神经脱细胞预处理方法 |
-
2022
- 2022-10-08 CN CN202211223168.XA patent/CN115518200B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110276066A1 (en) * | 2010-04-15 | 2011-11-10 | National University Of Ireland, Galway | Multichannel collagen nerve conduit for nerve repair |
| WO2013070907A1 (en) * | 2011-11-08 | 2013-05-16 | Tufts University | A silk-based scaffold platform for engineering tissue constructs |
| US20180105795A1 (en) * | 2016-10-13 | 2018-04-19 | Sun Yat-Sen University | Method for preparation of extracellular matrix-modified decellularized nerve scaffold and use thereof |
| WO2019165103A1 (en) * | 2018-02-21 | 2019-08-29 | University Of Florida Research Foundation | Decellularized tissues, hydrogels thereof, and uses thereof |
| CN108992709A (zh) * | 2018-07-27 | 2018-12-14 | 山东省眼科研究所 | 一种脱细胞神经基质材料及其制备方法和应用 |
| CN109602954A (zh) * | 2018-12-17 | 2019-04-12 | 浙江华臻医疗器械有限公司 | 一种脱细胞神经基质及其制备方法 |
| CN110464877A (zh) * | 2019-06-25 | 2019-11-19 | 滨州医学院 | 一种脱细胞神经支架的制备方法及其效果评价方法 |
| CN110585488A (zh) * | 2019-10-29 | 2019-12-20 | 中国医科大学 | 一种新型复合材料制备的神经修复导管及其制备方法 |
| CN111714701A (zh) * | 2020-08-10 | 2020-09-29 | 四川大学 | 一种神经脱细胞预处理方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| SRIDHAMN R, ET AL: "Decellularized grafts with axially aligned channels for peripheral nerve regeneration", JOURNAL OF THE MECHANICAL BEHAVIOR OF BIOMEDICAL MATERIALS, vol. 41, pages 126 - 127 * |
| 李子健;黄英如;曾欢欢;汪一;张松;: "冷诱导RNA结合蛋白促进冷冻保存大鼠坐骨神经异体移植后神经再生的作用", 中国康复理论与实践, no. 04 * |
| 赵斌;马信龙;孙晓雷;李秀兰;马剑雄;杨召;李爽;徐桂军;杨强;: "低渗联合冻干技术制备脱细胞神经支架及其力学性能分析", 医用生物力学, no. 04 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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