CN102114268A - 一种组织工程神经支架及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种组织工程神经支架及其制备方法和应用。本发明采用化学萃取法去除引起排斥反应的主要抗原——细胞、轴突和髓鞘，并采用软骨素酶ABC去除异体神经中的硫酸软骨素蛋白多糖，得到细胞外基质的基底膜管保持完整的去细胞异体神经作为组织工程神经支架。该组织工程神经支架适合修复大鼠、兔、犬、人类等周围神经缺损，对促进轴突再生作用非常明显，并且可以增加修复周围神经缺损的长度，是很好的神经移植医用材料。

Description

一种组织工程神经支架及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医用材料，特别涉及一种化学去细胞异体神经(Chemcially ExtractedAcellular Nerve，CEAN)及其应用，以及促进化学去细胞异体神经的轴突生长和增加其修复周围神经缺损效果的制备方法。

背景技术

在哺乳动物中，成年个体的神经组织具有有限的再生能力，周围神经损伤及损伤后导致的神经缺损是临床上常见的致残性疾病。目前修复周围神经缺损的方法以自体神经移植为标准手术，但供区神经来源有限。化学去细胞异体神经(CEAN)是替代自体神经移植的理想材料之一。但是，在不同长度缺损的修复实验中发现，随着长度的增加，CEAN修复后其再生神经的传导速度、轴突数目、髓鞘厚度及功能恢复结果逐渐变差。同时，研究发现硫酸软骨素蛋白多糖(Chondroitin Sulfate Proteoglycans，CSPG)存在于CEAN的基底膜上，具有抑制神经再生的作用。

某些报告已经表明在周围神经损伤后CSPG表达通常上调，CSPG由葡糖胺聚糖(Glycosaminoglycan GAG)组成，其为一种阻断轴突生长的关键性限制因素，软骨素酶ABC(ChABC)是一种细菌酶，其消化CSPG的GAG侧链。应用ChABC消化CEAN中的CSPG，有望能够增加CEAN修复周围神经缺损的长度。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种组织工程神经支架，是去除了抑制神经再生的物质硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)的化学去细胞异体神经(CEAN)。

本发明的另一个目的是提供上述化学去细胞异体神经的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种组织工程神经支架，是去除了引起免疫排斥反应的细胞、轴突和髓鞘，以及抑制神经再生的物质硫酸软骨素蛋白多糖，而保存了轴突再生所需细胞外基质及三维空间管道结构的化学去细胞异体神经，通过如下方法制备得到：在无菌条件下，先去除周围神经的外膜脂肪及结缔组织，然后采用化学萃取法去除免疫原性物质，最后将去除免疫原性物质的周围神经浸泡在0.1U/ml至10U/ml的软骨素酶ABC溶液中，37℃处理16小时以上，即得所述化学去细胞异体神经。

对于上述去细胞异体神经的制备，所述化学萃取法优选使用萃取剂SB-10、Triton X-200和SB-16进行萃取。

具体而言，所述化学去细胞异体神经的制备过程可包括如下步骤：

1)无菌条件下，去除周围神经的外膜脂肪及结缔组织；

2)将去除了外膜脂肪及结缔组织的周围神经浸泡于蒸馏水中，在10-40℃温度下振荡冲洗12小时以上；

3)将经过步骤2)处理的周围神经浸泡于由SB-10与磷酸盐缓冲液(PBS)配制成的第一萃取液中振荡冲洗12小时以上；

4)将经过步骤3)处理的周围神经用磷酸盐缓冲液冲洗20分钟以上；

5)将经过步骤4)处理的周围神经用由Triton X-200、SB-16和磷酸盐缓冲液配制的第二萃取液中振荡冲洗12小时以上；

6)依次重复3)、4)、5)步骤一次；

7)将周围神经用磷酸盐缓冲液冲洗20分钟以上；

8)将周围神经37℃水浴中浸泡在0.1-10U/ml的ChABC溶液中16小时以上。

优选的，上述方法中，步骤2)中将去除了外膜脂肪及结缔组织的周围神经浸泡于蒸馏水中在室温下振荡冲洗24小时；

步骤3)中所述第一萃取液的配方是0.01M的PBS中含有浓度为125mM的SB-10，

步骤2)处理后的周围神经浸泡于第一萃取液中在室温下振荡冲洗12小时。

步骤4)中PBS溶液的浓度是0.01M，在室温下冲洗3次，每次10分钟。

步骤5)中所述第二萃取液的配方是在0.01M的PBS含有0.14％(v/v，体积百分含量)的TritonX-200和0.6mM的SB-16，步骤4)处理后的周围神经在第二萃取液中室温下振荡冲洗12小时。

步骤7)中PBS溶液的浓度是0.01M，室温下冲洗3次，每次10分钟。

步骤8)中将周围神经用2U/ml至3U/ml的ChABC溶液中浸泡16小时。

本发明中所用到试剂，例如TrionX-200、SB-10、SB-16、ChABC都能从商业途径购买得到。

本发明方法制备得到的化学去细胞异体神经可以存储于液体中，封装后采用γ射线辐照灭菌，然后冷藏保存；也可以采用冷冻干燥法存储，包括-20℃冷冻干燥大于4小时及采用γ射线辐照灭菌，具体方法如下：将本发明方法得到的去细胞神经放置铝板上在-80℃的深低温冰箱中进行速冻，保持神经的外形，然后在冷冻干燥机(Edwards)中-56℃下进行冷冻干燥12小时。用无毒塑料包装袋进行双层封装，250万拉德γ射线辐照灭菌，4℃冰箱保存备用。

本发明采用化学萃取方法去除细胞，并利用软骨素酶ABC消化硫酸软骨素蛋白多糖，组织学染色切片检查结果显示，所制备得到的CEAN不但去除了引起排斥反应的主要抗原——细胞、轴突和髓鞘，以及抑制神经再生的物质CSPG，而且保存了轴突再生所需细胞外基质及三维空间管道结构，为轴突的再生保存了诱导和促进物质及提供完整的再生支架。

由于本发明的去细胞异体神经中引起免疫排斥反应的施旺细胞、轴突和髓鞘被彻底清除，并去除了硫酸软骨素蛋白多糖，同时该去细胞异体神经细胞外基质的基底膜管保持完整，与以往制备的去细胞异体神经相比，具有增加修复周围神经缺损长度，提高修复速度的特性。本发明的方法适用制备大鼠、兔、犬、猪、人类等哺乳动物的化学去细胞异体神经，所得到的CEAN是很好的神经移植医用材料，可用于构建组织工程化的异体神经移植物，供科学研究和临床治疗所用。将本发明的CEAN作为支架，再加入任何种类的神经营养因子和细胞，就可进行常规的神经移植手术。在修复大鼠坐骨神经2cm缺损模型中，发现经过ChABC处理的CEAN，能有效地修复神经缺损，而未经ChABC处理CEAN，形成瘢痕组织，修复效果较差。

附图说明

图1是实施例1中未经ChABC处理的CEAN的HE染色切片(未能看见任何细胞，神经基底膜呈波浪状纵形排列，轴突消失而形成管柱状空隙)。

图2是实施例1中ChABC处理后的CEAN的HE染色切片(未能看见任何细胞，神经基底膜呈波浪状纵形排列)。

图3是实施例1中未经ChABC处理的CEAN的CSPG免疫组化染色纵向切片(CSPG免疫组化染色呈阳性深棕色)。

图4是实施例1中ChABC处理后的CEAN的CSPG免疫组化染色纵向切片(CSPG免疫组化染色呈阴性浅棕色)。

图5是实施例1中未经ChABC处理的CEAN的Laminin染色纵向切片(Laminin染色呈阳性深棕色)。

图6是实施例1中ChABC处理后的CEAN的Laminin染色纵向切片(Laminin染色呈阳性深棕色)。

图7显示的是实施例1中去除了神经外膜脂肪及结缔组织并修成2cm长的去细胞异体神经。

图8是实施例1中，大鼠在麻醉状态下，左侧大腿梨状肌下切除1cm坐骨神经，再移植2cm去细胞异体神经的手术照片。

图9是实施例1中，去细胞异体神经移植术后三个月，ChABC处理组大鼠的双侧小腿三头肌大体照片，左侧为患侧三头肌有部分恢复，右侧为健侧三头肌。

图10是实施例1中，去细胞异体神经移植术后三个月，对照组大鼠的双侧小腿三头肌大体照片，左侧为患侧三头肌肌肉严重萎缩，右侧为健侧。

图11是实施例1中，ChABC处理组移植神经术后三个月移植段近端的HE染色切片，显示近端吻合处神经纤维排列有序。

图12是实施例1中，ChABC处理组移植神经术后三个月移植段远端的HE染色切片，显示远端吻合处神经纤维排列呈条索状。

图13是实施例1中，对照组移植神经术后三个月移植段近端的HE染色切片，显示近端吻合处神经纤维排列序。

图14是实施例1中，对照组移植神经术后三个月移植段远端的HE染色切片，显示远端吻合处有较多血管和肉芽组织。

图15是实施例2中未经ChABC处理的人类CEAN的CSPG免疫组化染色纵向切片(CSPG免疫组化染色呈阳性深棕色)。

图16是实施例2中ChABC处理后的人类CEAN的CSPG免疫组化染色纵向切片(CSPG免疫组化染色呈阴性浅棕色)。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证目的，绝不限制本发明的范围。

实施例1

1.材料来源：鼠坐骨神经。

2.CEAN制备流程：

1)无菌条件下，显微镜下去除神经外膜脂肪及结缔组织；

2)25℃，摇床上蒸馏水中振荡浸泡冲洗24h；

3)在第一萃取液中振荡浸泡冲洗24h(第一萃取液的配制方法如下：将SB-10溶解于0.01M的PBS液中配制成125mM的SB-10溶液)；

4)0.01M PBS溶液冲洗30分钟；

5)第二萃取液中振荡冲洗24h(第二萃取液的配制方法如下：将Triton X-200用0.01MPBS稀释成0.14％(v/v，体积百分含量)的浓度，同时将SB-16溶解于此溶液中，配制成0.6mM的SB-16)；

6)依次重复3)、4)、5)步骤一次；

7)用0.01M PBS溶液冲洗30分钟；

8)用2U/ml的ChABC溶液中浸泡16小时。

3.神经移植实验：

1)健康雄性Wistar大鼠20只，体重约280～300g/只，分成2组：经ChABC处理组和未经ChABC处理的对照组，每组10只(n＝10)。将它们用10％水合氯醛腹腔注射麻醉(用药量0.4ml/100g)，无菌条件下取左股后上部切口，显露坐骨神经，梨状肌下缘切除10mm后，去细胞异体神经(20mm)修复坐骨神经缺损，手术显微镜下11-0缝线断端吻合，各组逐层缝合肌肉和皮肤，分笼饲养。

2)饲养三个月后，两组大鼠在10％水合氯醛腹腔注射麻醉(用药量0.4ml/100g)下，紧贴骨面取出小腿三头肌，剔除结缔组织，滤纸吸干表面血迹。

11)取出移植段神经，4％多聚甲醛固定后，进行HE染色。

将本实施例制备得到的化学去细胞异体神经采用下述常规的组织学染色切片检查：1、HE(苏木素-伊红)染色切片(参考文献：朱有华.浅谈石蜡切片HE染色.诊断病理学杂志.997；4(2)：111-112)；2、CSPG染色切片(参考文献：Jian Zuo，Yosbani J，Hernandez.Chondroitin Sulfate Proteoglycan with Neurite-Inhibiting Activity Is Up-regulated followingPeripheral Nerve Injury.J Neurobiol，1998，34(1)：41-54.)3、laminin染色切片(参考文献：Sondell M，Lundborg G， Kanje M.Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts madeacellular through chemical extraction.Brain Res，1998，95：44-54)。

未经步骤8)和经过步骤8)制备的CEAN的HE染色检测结果分别如图1和图2所示：从图1的HE染色照片看，未能看见任何细胞，神经基底膜呈波浪状纵形排列，轴突消失而形成管柱状空隙；从图2的HE染色照片看，未能看见任何细胞，神经基底膜呈波浪状纵形排列。说明ChABC处理，不会进一步破坏神经基底膜的结构。

未经步骤8)和经过步骤8)制备的CEAN的CSPG免疫组化染色纵向切片分别如图3和图4所示：图3显示CSPG免疫组化染色呈阳性深棕色，而图4显示CSPG免疫组化染色呈阴性浅棕色，说明ChABC处理去除了抑制神经再生的物质CSPG。

未经步骤8)和经过步骤8)制备的CEAN的Laminin染色纵切片分别如图5和图6所示，可以看出二者的Laminin染色呈阳性深棕色，说明ChABC并不破坏CEAN中Laminin成分。

制备20mm长CEAN(如图7所示)，用于修复大鼠坐骨神经，神经移植手术照片见图8。术后三个月，经ChABC处理组和未经ChABC处理的对照组大鼠的双侧小腿三头肌大体照片分别如图9和图10所示，对比可见，经过ChABC处理的去细胞异体神经移植组，小腿三头肌萎缩程度较轻，说明ChABC处理后，可以减轻神经损伤的肌肉萎缩程度。

将制备的20mm长CEAN，修复大鼠坐骨神经，术后三个月进行HE染色。经ChABC处理组和未经ChABC处理的对照组移植段近端的HE染色切片分别如图11和图13所示，两组大鼠在移植段近端吻合处神经纤维排列都较为有序，而在移植段远端，经ChABC处理组神经移植段远端神经纤维排列较为有序(见图12)，而未经ChABC处理的对照组神经移植段远端神经有较多的癍痕形成(见图14)，说明ChABC处理可以减轻神经移植段远端的癍痕形成，促进神经纤维再生。

综上，从切片结果可以看出，本实施例所制备的化学去细胞异体神经彻底去除了引起排斥反应的施旺细胞、轴突、髓鞘和CSPG，同时基底膜管保持完整；动物实验证实，ChABC可以有效的促进神经纤维再生，减轻神经损伤引起的肌肉萎缩程度。

实施例2

1材料来源：人尺神经(死于急性颅脑损伤捐献者)。

2制备流程：

1)无菌条件下，显微镜下去除神经外膜脂肪及结缔组织；

2)10℃，摇床上蒸馏水中振荡浸泡冲洗24h；

3)第一萃取液中振荡浸泡冲洗24h(第一萃取液的配制方法如下：将SB-10溶解于0.01M的PBS液中配制成125mM的SB-10溶液)；

4)0.1M PBS溶液冲洗40分钟

5)第二萃取液2中振荡冲洗24h(第二萃取液的配制方法如下：将Triton X-200用0.01M PBS稀释成0.14％(v/v)的浓度，同时将SB-16溶解于此溶液中，配制成0.6mM的SB-16)；

6)依次重复3)、4)、5)步骤一次；

7)将人尺神经用0.01MPBS溶液冲洗40分钟；

8)在37℃水浴中用5U/ml的ChABC溶液中浸泡16小时。

将未经步骤8)和经过步骤8)制备得到的化学去细胞异体神经采用下述常规的组织学染色切片检查：CSPG免疫组化染色。检测结果分别见图15和图16，图15显示CSPG免疫组化染色呈阳性深棕色，而图16显示CSPG免疫组化染色呈阴性浅棕色，说明ChABC处理去除了抑制神经再生的物质CSPG。

注：组织染色参考文献同实施病例1。

Claims (9)

1.一种组织工程神经支架，是去除了引起免疫排斥反应的细胞、轴突和髓鞘，以及抑制神经再生的物质硫酸软骨素蛋白多糖，而保存了轴突再生所需细胞外基质及三维空间管道结构的化学去细胞异体神经，通过如下方法制备得到：在无菌条件下，先去除周围神经的外膜脂肪及结缔组织，然后采用化学萃取法去除免疫原性物质，最后浸泡在0.1U/ml至10U/ml的软骨素酶ABC溶液中，37℃处理16小时以上。

2.如权利要求1所述的组织工程神经支架，其特征在于，所述化学萃取法使用萃取剂SB-10、Triton X-200和SB-16进行萃取。

3.如权利要求2所述的组织工程神经支架，其特征在于，所述化学去细胞异体神经的制备过程包括如下步骤：

1)无菌条件下，去除周围神经的外膜脂肪及结缔组织；

2)将去除了外膜脂肪及结缔组织的周围神经浸泡于蒸馏水中，在10-40℃温度下振荡冲洗12小时以上；

3)将经过步骤2)处理的周围神经浸泡于由SB-10与磷酸盐缓冲液配制成的第一萃取液中振荡冲洗12小时以上；

4)将经过步骤3)处理的周围神经用磷酸盐缓冲液冲洗20分钟以上；

5)将经过步骤4)处理的周围神经用由Triton X-200、SB-16和磷酸盐缓冲液配制的第二萃取液中振荡冲洗12小时以上；

6)依次重复步骤3)、4)和5)一次；

7)将周围神经用磷酸盐缓冲液冲洗20分钟以上；

8)将周围神经37℃水浴中浸泡在0.1-10U/ml的软骨素酶ABC溶液中16小时以上。

4.如权利要求3所述的组织工程神经支架，其特征在于，所述步骤3)中的第一萃取液是含有浓度为125mM的SB-10的0.01M磷酸盐缓冲液；所述步骤5)中的第二萃取液是含有体积百分含量为0.14％的Triton X-200和0.6mM SB-16的0.01M磷酸盐缓冲液。

5.一种制备化学去细胞异体神经的方法，是在无菌条件下，先去除周围神经的外膜脂肪及结缔组织，然后采用化学萃取法去除免疫原性物质，最后浸泡在0.1U/ml至10U/ml的软骨素酶ABC溶液中，37℃处理16小时以上。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述化学萃取法使用萃取剂SB-10、Triton X-200和SB-16进行萃取。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：

1)无菌条件下，去除周围神经的外膜脂肪及结缔组织；

2)将去除了外膜脂肪及结缔组织的周围神经浸泡于蒸馏水中，在10-40℃温度下振荡冲洗12小时以上；

3)将经过步骤2)处理的周围神经浸泡于由SB-10与磷酸盐缓冲液配制成的第一萃取液中振荡冲洗12小时以上；

4)将经过步骤3)处理的周围神经用磷酸盐缓冲液冲洗20分钟以上；

5)将经过步骤4)处理的周围神经用由Triton X-200、SB-16和磷酸盐缓冲液配制的第二萃取液中振荡冲洗12小时以上；

6)依次重复步骤3)、4)和5)一次；

7)将周围神经用磷酸盐缓冲液冲洗20分钟以上；

8)将周围神经37℃水浴中浸泡在0.1-10U/ml的软骨素酶ABC溶液中16小时以上。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的第一萃取液是含有浓度为125mM的SB-10的0.01M磷酸盐缓冲液；所述步骤5)中的第二萃取液是含有体积百分含量为0.14％的Triton X-200和0.6mM SB-16的0.01M磷酸盐缓冲液。

9.权利要求1～4任一所述的组织工程神经支架在制备神经移植用医用材料中的应用。

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