CN115192775B - 一种复合POU6F1-SCs的脱细胞神经支架及其制备方法与应用 - Google Patents

一种复合POU6F1-SCs的脱细胞神经支架及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种复合POU6F1‑SCs的脱细胞神经支架及其制备方法与应用，属于神经组织工程技术领域。为了构建复合种子细胞完整的具有生物活性ANA空间结构用于理想的支架材料。本发明提供给一种复合POU6F1‑SCs的脱细胞神经支架，所述复合POU6F1‑SCs的脱细胞神经支架是从POU6F1修饰的SCs植入脱细胞神经支架中获得的，POU6F1‑SCs的脱细胞神经支架是一种理想的支架材料。

Description

一种复合POU6F1-SCs的脱细胞神经支架及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于神经组织工程领域技术领域，具体涉及一种复合POU6F1-SCs的脱细胞神经支架及其制备方法与应用。
背景技术
周围神经损伤(PNI)是一个普遍存在的临床问题，全世界每年至少有200万人发生PNI，即使患者得到充分的治疗，但大多数仍可能患有持续和严重的慢性疼痛或永久性运动和感觉缺陷。尽管有早期诊断和现代手术技术，功能恢复仍然较差，治疗效果仍不理想，给经济和社会造成了沉重负担。因此迫切需要有效的修复周围神经缺损治疗策略。对于缺损性神经间隙，使用神经移植物来修复神经缺损。
自体神经移植被认为是神经移植的“金标准”，但自体神经移植有多种缺点，例如：需要二次手术，神经纤维的可用性有限、手术时间增加和供体部位的发病率(疼痛、疤痕、神经瘤和感觉丧失)。限制了其在临床中的广泛应用。因此。研究人员努力开发有效的自体移植替代品来克服这些问题。尤其是在多发神经损伤情况下，同种异体神经移植物优点包括易于获得、并且可以提供广泛的神经组织来源。尽管如此，新鲜的同种异体移植物仍不推荐使用，因为患者需要长期全身免疫抑制治疗，抑制免疫系统使施万细胞(SCs)和外源性轴突被耐受，但使患者容易受到感染和增高肿瘤患病风险。许多研究者使用多种仿生生物材料，例如：聚乙醇酸和聚乙交酯、电纺支架(PCL、PAN、PLLA)以及天然材料(例如壳聚糖、丝素蛋白、多糖和胶原蛋白)来构建神经支架。各种仿生生物材料，在一定程度上确实能促进和引导新生轴突再生和功能恢复，但制备工序复杂，成本较高，不适合在临床大力推广及应用。
脱细胞神经同种异体移植物(ANA)是用于不能直接接近神经末梢的节段性缺损或距离较大的神经间隙的周围神经重建(PNR)的重要选择。ANA是内源性神经节段，其中所有细胞成分和免疫原性成分均已去除，以维持基底层和细胞外基质，这在修复周围神经中起重要作用。ANA保留了其天然的物理、化学、机械和空间对齐结构。因此，将它们用作移植物可促进更多的移植种子细胞增殖、分化、附着、迁移和生物活性，从而确保移植种子细胞的均匀分布。ANA有望模拟细胞外基质(ECM)微环境并支持神经再生和细胞分化。因此，ANA是新鲜同种异体神经移植物的有效替代品，因为它们可以支持周围神经再生而无需免疫抑制。多次研究发现同种异体神经移植物移植效果与自体神经相似或略低，但优于仿生生物材料。研究发现仿生生物材料显示出中间神经纤维的无序模式，而同种异体神经显示均匀分布式再生神经纤维。
制备ANA途径主要有物理方法、酶处理方法、化学方法以及几种方法的合并等。物理方法有低温冻存、冷冻干放射、冷冻千燥、反复冻融等，虽然能够杀死细胞使之崩脱从而降低神经组织的免疫原性，但物理方法制备支架容易导致基底膜断裂并且残留细胞碎片，导致支架强度变低影响移植效果。化学法的脱细胞原理是通过破坏生物膜从而破坏天然神经组织内的神经细胞，尽量不影响神经纤维结缔组织从而保留相对完好的天然神经三维结构。目前使用最广泛Sondel方法基于两个连续步骤，先是3％Triton X-100溶液，然后是4％脱氧胆酸钠溶液，但ANA空间结构破坏较为严重。
发明内容
本发明的目的是为了构建复合种子细胞完整的具有生物活性ANA空间结构用于理想的支架材料。
本发明提供一种复合POU6F1-SCs的脱细胞神经支架，其特征在于，所述复合POU6F1-SCs的脱细胞神经支架是从POU6F1修饰的SCs植入脱细胞神经支架中获得的。
进一步地限定，所述脱细胞神经支架的制备方法如下：异体坐骨神经通过脱氧胆酸钠、脱氧核糖核酸酶I和ChABC至少处理43个小时。
进一步地限定，具体方法如下：将异体坐骨神经放置在质量分数为4％脱氧胆酸钠溶液中，并放置恒温振荡器振荡4h，生理盐水清洗，然后将处理的异体坐骨神经浸泡在含2000kU脱氧核糖核酸酶I的1M NaCl溶液3h，然后将处理的异体坐骨神经浸泡在含有2U/mlChABC的PBS溶液中，水浴12小时，用无菌水清洗后获得脱细胞神经支架。
进一步地限定，获得的ANA经γ辐照灭菌，真空无菌包装在4℃保存。
进一步地限定，获得施万细胞的方法如下：原代SCs取自成年SD大鼠的坐骨神经，切除坐骨神经，在37℃下用I型胶原酶和胰蛋白酶消化60min，选用阿糖胞苷溶液、forskolin、10％FBS和FGF-2的培养基以去除成纤维细胞，贴壁细胞生长密度达到85％后用胰蛋白酶消化传代，获得传代细胞。
进一步地限定，I型胶原酶的浓度为625u/ml；所述胰蛋白酶的质量分数为0.25％。
进一步地限定，阿糖胞苷溶液的浓度为10μM；所述forskolin的浓度为2μM；所述FGF-2的浓度为10ng/ml。
本发明提供上述的复合POU6F1-SCs的脱细胞神经支架的制备方法，所述的制备方法的具体步骤如下：
步骤1：POU6F1修饰SCs：SCs接种于细胞6孔板中，当细胞培养至90％融合进行转染，将1×109病毒颗粒/mL的AAV-POU6F1(150μL/孔)转染SCs细胞24h；
步骤2：POU6F1修饰SCs植入脱细胞神经支架：将质量浓度为4μmol/L的PKH26荧光示踪染料添加进步骤1获得的POU6F1-SCs培养液中，获得标记POU6F1-SCs，将2×106POU6F1-SCs移植到ANA中，然后将移植后的ANA在37℃、体积分数为5％的CO2的完全培养基中孵育24h，获得人工神经移植物。
本发明提供上述的复合POU6F1-SCs的脱细胞神经支架在修复大鼠坐骨神经缺损中的应用。
本发明提供上述的复合POU6F1-SCs的脱细胞神经支架在促进神经轴突再生或作为修复周围神经损伤的组织工程神经移植物中的应用。
有益效果：本发明通过RNA-seq结合生物信息学方法，确定了POU6F1是脱细胞同种异体神经移植(ANA)后桥接坐骨神经缺损的关键调控基因。分析表明在ANA治疗后POU6F1显著差异性高表达，具有相对较高的PPI连接度，并高度参与周围神经系统的髓鞘形成。在体外AAV-POU6F1高效转染施万细胞(SCs)，结果表明POU6F1过表达在体外促进SCs的增殖、抗凋亡和迁移。在体内通过建立复合POU6F1-SCs的脱细胞神经支架修复大鼠坐骨神经缺损，结果表明POU6F1过表达促进轴突再生、移植的SCs存活和再生的ANA中的髓鞘形成，以及复合POU6F1-SCs的ANA改善运动轴突再生、肌肉神经再支配和预防肌肉萎缩以及运动功能恢复。所述的POU6F1-SCs的脱细胞神经支架是一种理想的支架材料。
本发明提供了一种能够促进神经轴突再生的用于修复周围神经损伤的组织工程神经移植物及其应用。本发明采用神经组织工程的方法，利用硫酸软骨素酶ABC(Chondroitinase ABC，ChABC)处理ANA结合POU6F1修饰施万细胞构建神经组织工程移植物以修复周围神经缺损。本发明既缩减原有ChABC处理ANA制备时间，保留相对完好的天然神经三维结构，又通过POU6F1修饰的SCs内在增强种子细胞增殖、迁移和生存能力，建立良好神经再生微环境，促进轴突再生并功能重建的理想目标，为临床治疗提供可行方案。
本发明另一目的在于提供一种ChABC处理ANA优选方案，异体坐骨神经通过4％脱氧胆酸钠(SDC)、脱氧核糖核酸酶I(DNase-I)结合ChABC处理，减少了脱细胞过程中化学试剂的用量和浓度，反应次数少，DNase-I对天然神经组织中的其他结构与成分作用缓和不会造成过大破坏，结合SDC体现良好脱细胞效果，保留均匀一致神经基底膜结构。ChABC处理有效降解天然神经组织中CSPGs，制备时间短。
附图说明
图1为本发明示意图；
图2为RNA-seq技术筛选POU6F1为ANA治疗坐骨神经缺损重要调控转录因子；A是火山图显示ANA组与正常组差异性基因表达，B是二组差异表达的特征基因热图，C是高差异性基因(DHEGs)中编码蛋白相互作用的PPI分析图，D是DHEGs进行qRT-PCR验证；
图3为生物信息学分析；A是DHEGs基因GO分析，B是DHEGs基因KEGG信号通路分析；C是周围神经损伤髓鞘化聚类热图分析。
图4为结果图；A为ANA桥接的实物图；B为ChABC处理ANA的基底膜管管壁层粘蛋白免疫荧光染色图；C为复合SCs的ANA桥接的实物图；D为复合POU6F1-SCs的ANA桥接的实物图。
图5为免疫荧光染色结果图；A为ChABC未处理ANA的CSPGs免疫荧光染色鉴定图；B为ChABC处理ANA的CSPGs免疫荧光染色鉴定图；
图6为扫描电镜微观结构结果图；A为ChABC处理ANA的扫描电镜微观结构图；B为复合POU6F1-SCs的ChABC处理ANA的扫描电镜微观结构图；
图7为生物相容性实验结果图；A为各组皮下埋置实验CD3免疫荧光染色检测图；B为CD3平均光密度值检测；C为CCK8实验检测细胞毒性；
图8为SCs培养光镜和S100及GFAP免疫细胞化学染色鉴定图；
图9为POU6F1-SCs免疫细胞化学染色鉴定图；A是POU6F1和S100免疫细胞化学染色检测AAV-POU6F1对SCs转染率，B是POU6F1平均光密度值检测；
图10为POU6F1促进SCs增殖。A：Western Blot检测SCs中POU6F1和增殖标记物PCNA蛋白表达；B：MTT法鉴定POU6F1对SCs增殖作用；
图11为POU6F1促进SCs存活和迁移。A：PI染色鉴定POU6F1对H2O2诱导的SCs细胞凋亡保护作用；B：Transwell迁移试验鉴定POU6F1对SCs迁移作用；
图12为验证POU6F1在再生的ANA中促进轴突再生、髓鞘形成和SCs存活；A是ANA桥接术后7d，NF200免疫荧光染色检测ANA中轴突再生情况，B是ANA中轴突再生指数检测，C是轴突再生最大长度检测，D是ANA桥接术后35d，S100和PKH26免疫荧光染色检测ANA中髓鞘形成和SCs存活情况，E是ANA中PKH26标记SCs存活检测，F是ANA中髓鞘形成检测；
图13为验证POU6F1-SCs促进轴突髓鞘形成、肌肉神经再支配和运动功能恢复；A是检测各组再生ANA中有髓神经纤维甲苯胺蓝染色，应用胫前肌(TA)中HRP逆行示踪标记同侧L3-L5脊髓前角运动神经元评估运动轴突再生，TA肌肉湿重比、同侧TA肌肉运动终板染色评估神经肌肉神经再支配，B是检测各组有髓神经纤维数目，C是髓鞘厚度检测，D是轴突直径检测，E是轴突总直径/纤维总直径(G-ratio)检测，F是L3-5脊髓前角HRP标记运动神经元数量检测，G是TA肌肉湿重比率检测，H是患侧TA肌纤维运动终板数量检测，I是坐骨神经功能指数(SFI)分析，J是电生理检测，K是动作电位波幅检测，L是电位潜伏期检测。
具体实施方式
AAV-POU6F1(Cat#372780560100,abm公司,美国)；
PKH26荧光示踪染料(MINI26-1KT,Sigma-Aldrich公司)。
施万细胞(SCs)
实施例1.组织工程神经移植物的制备方法
1ChABC处理ANA制备
1.1提取成年SD大鼠(30只大鼠)常规麻醉后取60条坐骨神经，用精细显微手术镊和显微手术剪将神经外膜上附着的纤维结缔组织全部清除干净，测量长度为10mm。应用Wistar大鼠(60只大鼠)制备坐骨神经缺损模型(10mm)，将SD大鼠异体坐骨神经制备的脱细胞神经支架作为供体进行神经支架桥接移植。
异体坐骨神经→化学法SDC处理→生理盐水清洗酶法DNase-I处理→生理盐水清洗→ChABC处理→无菌水清洗；异体坐骨神经不分离，振荡浸泡完清洗进入下一步处理。(按处理顺序浸泡；先用脱氧胆酸钠，其脱细胞强度较大，但易残留；DNase-I作用缓和，适用于残留细胞成分去除。如顺序变换不能有效脱细胞。如同时浸泡会因强度过大易粉碎。)
1.2进行神经脱细胞处理:(1)将异体坐骨神经振荡浸浴灭菌三蒸水中6h，每2h更换1次。(2)将振荡浸浴后异体坐骨神经浸泡在质量浓度为4％脱氧胆酸钠(SDC)水溶液中，用37℃恒温振荡器振荡4h(500rpm/min)，该过程在无菌条件下进行。(3)在4℃下用无菌生理盐水于振荡器振荡清洗6h。(4)将处理的异体坐骨神经浸泡在含2000kU脱氧核糖核酸酶I(DNase-I)的1M NaCl溶液，用37℃恒温振荡器振荡3h(500rpm/min)，该过程在无菌条件下进行。(5)将处理的异体坐骨神经浸入灭菌三蒸水中清洗12h。
1.3将步骤1.2获得的脱细胞神经浸泡在100ul PBS(2U/mlChABC，PH7.4)，水浴12h(37℃)，获得处理后的ANA。通过扫描电镜观察最后处理的ANA，如图6A所示，ANA中髓鞘和轴突均已消失，仅剩基底膜管，空虚的基膜管内未见残留结构，管壁膜管排列有序，基底膜管保留完整，显示获得ChABC处理的ANA为细胞的黏附生长提供了理想的三维空间。实施例1获得的复合ChABC处理的ANA，ANA神经形貌观察，图4A呈现了ChABC处理的ANA大体形貌，可见ANA呈乳白色，神经透明度增加，与正常神经大致相同。使用9-0尼龙无张力神经外膜缝线将10mm ANA植入神经间隙。层粘蛋白免疫荧光染色显示ChABC处理的ANA神经内膜结构，如图4B所示，神经内膜结构被较好的保留，细胞和髓鞘、轴突基本被去除，与扫描电镜结果相一致，证实ANA成功脱细胞。硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)免疫荧光染色鉴定ChABC处理效果，CSPGs主要表达在神经组织的基底膜和神经鞘内，具有抑制轴突生长以及抑制细胞外基质促神经再生的能力。如图5所示，未经ChABC处理ANA组(ChABC-组)CSPGs呈强阳性表达，而ANA+ChABC组(ChABC+组)CSPGs呈阴性表达，显示ChABC处理有效降解ANA中CSPGs。
1.4ANA经γ辐照灭菌，真空无菌包装在4℃保存。
本发明所提供的方法中，步骤1.2及1.3所述反应时间如下表1所示。其中通过脱氧胆酸钠(SDC)、脱氧核糖核酸酶I(DNase-I)和ChABC至少处理19h。
表1ANA制备时间表
步骤 操作 时间
1.2(1) 灭菌三蒸水振荡浸浴 6h
1.2(2) SDC振荡 4h
1.2(3) 生理盐水清洗 6h
1.2(4) DNase-I振荡 3h
1.2(5) 三蒸水清洗 12h
1.3 ChABC浸泡 12h
合计 43h
2SCs培养
2.1原代SCs取自成年SD大鼠的坐骨神经，切除坐骨神经，在37℃下用I型胶原酶(625u/ml)和0.25％胰蛋白酶消化60min。选用阿糖胞苷溶液(10-5μM)、forskolin(腺苷酸环化酶激活剂，2μM)、10％胎牛血清(FBS)和10ng/ml FGF-2的培养基以去除成纤维细胞。
2.2每3d更换一次培养基，贴壁细胞生长密度达到85％后用质量分数为0.25％胰蛋白酶消化传代，传代细胞铺板并用于所有实验。(第二代SCs倍增时间为3d，即可用于细胞实验，四代倍增时间更短。)
2.3此步骤用于鉴定收集SCs纯度：细胞免疫荧光染色鉴定收集SCs纯度，一抗为S100(1:200)、GFAP(1:200)，孵育过夜，应用二抗室温孵育1h，使用Olympus BX41荧光显微镜观察鉴定SCs，如图8所示，倒置显微镜下SCs形态为长梭形或圆形，胞体折光性强，有两个或两个以上突起，集落生长，分布均匀。用S-100(星形胶质细胞S100β)和GFAP(神经胶质纤维酸性蛋白)对细胞进行双标染色鉴定SCs，结果显示98.2±0.8％细胞S-100和GFAP荧光共标，表明获得细胞具有SCs的生物学特性，纯度在98％以上。
3.SCs接种于6孔板(2×107细胞/孔)中，当细胞培养至90％融合进行转染。
4POU6F1修饰SCs植入脱细胞神经支架(ANA)
4.1取POU6F1-SCs消化成单细胞悬液，与质量浓度为4μmol/L荧光示踪染料PKH26(MINI26-1KT,Sigma-Aldrich公司)在37℃混匀孵育5min。然后加入2mL10％胎牛血清终止反应，离心弃上清，获得标记POU6F1-SCs。
4.2微量注射器把POU6F1-SCs移植到步骤1的ANA中，具体的方法是：沿ANA的神经节在四个均匀间隔的位置注射10μl完全培养基中的总共2×106POU6F1-SCs，获得植入POU6F1修饰SCs的ANA。将植入POU6F1修饰SCs的ANA在37℃、5％CO2的完全培养基中孵育24h，最终制得人工神经移植物(复合POU6F1-SCs的ANA)，然后将复合POU6F1-SCs的ANA用于修复周围神经缺损。实施例1获得的POU6F1-SCs的ANA神经形貌观察，图4C-D呈现了复合SCs的ANA及复合POU6F1-SCs的ANA大体形貌，与ANA相似，呈乳白色，神经透明度增加，与正常神经大致相同。使用9-0尼龙无张力神经外膜缝线将10mm二组ANA植入神经间隙。
5复合POU6F1-SCs的ANA电镜观察及力学性能
如图6B所示，复合POU6F1-SCs的ANA的神经支架在扫描电镜可见POU6F1转染的SCs在ANA基底膜管内均匀分布，细胞呈椭圆形或球形，并与管壁粘连紧密，粘附较好。进一步发现复合POU6F1-SCs的ANA对SCs无细胞毒性，表明复合POU6F1-SCs的ANA利于SCs存活和粘附。机械力学指标与正常神经之间的差异无统计学意义。
实施例2.筛选POU6F1为ANA治疗轴突再生重要调控转录因子
转录组学分析ANA修复坐骨神经缺损重要调控转录因子：
为定位ANA修复坐骨神经缺损后发挥最重要作用的基因，首先使用RNA-seq技术获得了ANA治疗后的差异表达基因(DEG)并进行生物信息学分析。
结果显示POU6F1在ANA治疗后表达显著上调，PPI连接程度相对较高，并高度参与周围神经系统的髓鞘形成。预测POU6F1将在ANA治疗中发挥重要作用，如图1-3所示。
为定位在ANA修复坐骨神经缺损后发挥最重要作用的基因，首先应用实施例1获得ANA修复大鼠坐骨神经缺损模型，步骤如下：在无菌条件下采用乙醚麻醉，剃去右侧臀部及大腿鼠毛，安尔碘消毒后，在右侧臀部至大腿做弧形切口，长约2cm，沿肌肉间隙分离，手术显微镜下显露坐骨神经，于梨状肌下孔5mm处切除坐骨神经，造成10mm神经缺损，应用实施例1所述神经移植体在无张力条件下桥接神经缺损，断端用9-0无损伤线缝合3～4针。缝合肌肉和皮肤，局部应用抗生素预防感染。同时以假手术组(正常神经)为对照组。在ANA桥接术后14d，取神经移植体组织和对照正常神经组织，分为ANA治疗组和正常神经组。
使用RNA-seq技术获得ANA治疗后的差异表达基因(DEG)。首先进行ANA治疗组和正常组神经组织总RNA的提取及质控，加1mL TRIzol预冷试剂，打碎匀浆后离心，加入等体积异丙醇离心沉淀RNA，加入DEPC水溶解。其次进行DNA文库的构建，对插入片段长度以及文库浓度等进行质量控制，应用Illumina PE150上机测序，进行有参转录组测序数据分析，主要包括：参考序列比对分析、转录组样本关系分析、及基因表达水平分析。然后进行差异基因的筛选功能分析，根据log2FoldChange>0.5和FDR<0.001，通过“DeSeq”的R包进行筛选，获得差异表达基因，最后对差异基因进行GO富集分析和KEGG富集分析。
如图2A所示，火山图显示5021个基因在正常对照组和ANA治疗组组织(相当于ANA治疗前与治疗后)间差异表达，包括1261个上调的DEG和3760个下调的DEG。如图2B所示，我们对ANA治疗组中表达量从高到低的基因进行分类，并获得了前100个差异高表达基因(DHEG)特征基因热图，这些基因将在ANA修复坐骨神经缺损中发挥重要作用。
为研究参与ANA治疗后发病机制的DEGs的相互作用和枢纽基因，ANA治疗后14d，使用STRING构建了ANA治疗组神经移植体样本DEGs-PPI网络。如图2C所示，POU6F1(连接度＝5)为PPI连接度最高的五个基因之一。为评估RNA-seq技术可靠性，随机选择10个DHEG并通过qRT-PCR进行检测，如图2D所示，10个随机选择基因mRNA表达的上调或下调趋势与RNA-seq结果显示相一致。qRT-PCR分析结果证明RNA-seq方法用于大规模基因表达定量是可靠的。
使用Metascape通过GO和KEGG富集分析来表征DEG。如图3A所示，DHEGs基因GO分析发现上调基因主要富集于细胞质膜、免疫系统过程、炎症反应、膜的组成部分、中性粒细胞趋化性、跨膜信号受体活性、中性粒细胞趋化性、细胞迁移、细胞表面受体信号通路、外周神经系统髓鞘形成等。如图3B所示，DHEGs基因KEGG通路富集分析发现上调基因的信号通路主要集中在细胞粘附分子、造血细胞谱系、细胞因子-细胞因子-受体相互作用、同种异体移植排斥反应和JNK信号通路。如图3C所示，基因转录本用GO术语“外周神经系统髓鞘化”注释确定上调的DHEGs包括POU6F1。上述结果表明POU6F1作为ANA治疗后上调DHEGs，PPI连接程度相对较高，并高度参与周围神经系统的髓鞘形成。因此我们预测POU6F1将在ANA治疗中发挥重要作用，并选择POU6F1进行进一步研究。
实施例3.检验复合POU6F1-SCs的ANA结构和生物相容性
一、实验组和外科手术程序
(1)ANA治疗组分三组：(1)ANA仅注射DMEM(100μl)，(2)ANA仅注射SCs(100μl，2×107/mL，SCs)，和(3)ANA注射AAV-POU6F1转导SCs(100μl，2×107/mL，AAV-POU6F1-SCs)。应用Hamilton微量注射器注射，三组ANA在37℃、5％CO2的完全培养基中孵育24h，然后将ANA用于体内实验。
(2)术前用电动剪刀将Wistar大鼠剃除腿毛，并用碘化钾溶液和70％酒精擦拭皮肤。通过吸入异氟醚(2-3％)麻醉大鼠，并暴露右侧坐骨神经。将神经切开，构建1cm的坐骨神经缺损模型。如图4A所示，将上述三组ANA植入神经间隙桥接神经。使用9-0尼龙缝合线将神经移植物与近端和远端神经残端缝合。肌肉和皮肤分层缝合，大鼠放置在加热的毯子上，保持37℃直到麻醉完全恢复。动物分组：假手术组(正常神经组)、ANA组(ANA用DMEM处理)、ANA+SCs组(ANA中植入SCs处理)、ANA+POU6F1-SCs组(复合POU6F1-SCs的ANA)。
二、生物相容性检测
(1)皮下埋置实验
取上述四组(假手术组(正常神经组)、ANA组(ANA用DMEM处理)、ANA+SCs组(ANA中植入SCs处理)、ANA+POU6F1-SCs组(复合POU6F1-SCs的ANA))神经移植物，在异体Wistar大鼠背部皮下各植入一段，术后皮肤切口均用320细丝线缝合，在植入后7d取材，将埋于大鼠背部皮下的神经组织连同周围组织一并切取行冰冻切片。3个ANA治疗组植入的ANA与周围组织粘连较轻，而正常神经组的植入神经与周围组织有明显粘连，不易与周围组织分离。用抗大鼠T淋巴细胞CD3单克隆抗体对切片进行免疫荧光染色，标记植入神经和周围组织中浸润的T淋巴细胞。如图7A-B所示，3个ANA治疗组内仅有少量的CD3+T淋巴细胞亚群的浸润，且3组间无显著差异。而正常神经组神经内有大量的CD3+T淋巴细胞亚群浸润，显著高于3个ANA治疗组。表明3个ANA治疗组具有良好生物相容性。
(2)细胞毒性实验
将培养的SCs配制成6×105/ml的单细胞悬液备用。将培养基与上述四组(假手术组(正常神经组，阳性对照组)、ANA组(ANA用DMEM处理)、ANA+SCs组(ANA中植入SCs处理)、ANA+POU6F1-SCs组(复合POU6F1-SCs的ANA))神经支架按2.5ml/cm2于培养箱中静置24h制成浸提液。
取备用的单细胞悬液种植于96孔培养板(每孔100μl)。培养24h待细胞贴壁后弃去原培养液，加入上述四组浸提液，同时增加以普通培养基培养作为阴性对照组。37℃、5％CO2培养箱中静置培养。每隔24h换液1次。分别于第1、3、5、7d取出96孔板3块，每孔加入CCK810μl/孔，在酶联免疫检测仪上测定每孔的光密度值(OD450)，以时间为横轴，纵轴绘制细胞生长曲线。如图7C所示，相同时间点正常神经组SCs增殖活力显著低于阴性对照组和3个ANA治疗组，而阴性对照组和3个ANA治疗组细胞生长曲线趋势相似，SCs均显著增殖。表明3个ANA治疗组没有细胞毒性。
(3)Wintest机械力学评估ANA的一系列机械力学性能指标。如表1所示。
扫描电镜观察胶原纤维排列有序，基底膜管保留完整，髓鞘和轴突均已消失，与免疫荧光染色结果相一致。移植POU6F1-SCs后可见SCs在两组基底膜管内均匀分布，细胞呈椭圆形或球形，并与管壁粘连紧密(见图6)。生物相容性评价，皮下埋置实验显示复合POU6F1-SCs的ANA中仅少量的CD3+T淋巴细胞亚群的浸润，显著低于正常神经。
CCK-8分析浸提液对细胞的毒性作用。各时间点POU6F1-SCs的ANA的脱细胞神经的OD450值与阴性对照组(普通培养基培养)比较无显著性差异，显著高于正常神经组。这表明POU6F1-SCs的ANA没有明显的细胞毒性作用，具有良好的生物相容性(见图7)。复合POU6F1-SCs的ANA机械力学指标(极限载荷/N、韧度/N.mm-1、弹性模量/MPa、极限应力/MPa、极限应变、断裂功耗/mJ)与正常神经之间无显著差异(见表1)。
表1各组神经的生物力学测试(n＝10)
实验结论：应用假手术组(正常神经组)作为阳性对照组与3个ANA治疗组比较皮下埋置实验和细胞毒性检测，结果表明3个ANA治疗组皮下埋置实验和细胞毒性等生物相容性指标均显著优于正常神经。
机械力学评估以假手术组(正常神经组)为对照组，结果表明3个ANA治疗组机械力学评估指标与正常神经无差异。
皮下埋置实验和机械力学评估均为四组，假手术组(正常神经组)和3个ANA治疗组；仅细胞毒性增加一组以普通培养基培养的阴性对照组，结果表明3个ANA治疗组与阴性对照组细胞增殖无显著差异，较正常神经组显著增高，充分证明3个ANA治疗组无细胞毒性。上述实验中3个ANA治疗组生物相容性和机械力学评估均无显著性差异。
实施例4.POU6F1促进体外SCs增殖、存活、迁移
一、POU6F1促SCs增殖和迁移试验
(1)AAV-POU6F1对SCs转染率检测：将AAV-NC(腺相关病毒阴性对照组，用的是AAV空载体病毒)和AAV-POU6F1(1×109病毒颗粒/ml，150μl/孔)转染24h。将SCs分为二个实验组：1)AAV-NC组(阴性对照组)：由AAV空载体转染SCs组成。2)AAV-POU6F1组：由AAV-POU6F1转染SCs组成。AAV-POU6F1转染24h，免疫荧光染色和western bolt验证POU6F1转染SCs效果，如图9所示，POU6F1主要表达在细胞核和细胞质，与AAV-NC组比较，AAV-POU6F1组POU6F1表达显著增高，且与S100标记的SCs广泛共定位。Western bolt进一步验证，如图10A所示，与AAV-NC组比较，AAV-POU6F1组的POU6F1蛋白表达显著增高。结果表明AAV-POU6F1具有较高的转染效率，显著促进-POU6F1在SCs中高表达。
(2)MTT检测SCs增殖
使用MTT测定法评估SCs增殖/活性。向AAV-NC对照组(由AAV-NC转染SCs组成)、AAV-POU6F1组(由AAV-POU6F1转染SCs组成)每孔中添加10μl MTT溶液(12mM)，并在37℃下培养4h。在450nm处读取每个孔中的吸光度。实验重复了3次。如图10B所示，转染后2-3d，AAV-POU6F1组的SCs增殖/活性能力显著高于AAV-NC组。这与Western bolt观察结果相一致，如图10A所示，与AAV-NC组比较，AAV-POU6F1组的PCNA(细胞增殖标记物)表达显著增高。结果表明POU6F1增强SCs增殖能力。
(3)PI染色分析细胞凋亡。
H2O2(400μM)处理SCs细胞(2×105个细胞/ml)，在37℃下将DAPI(1:200)加入细胞15min，标记所有细胞核。将上述二组(AAV-NC组和AAV-POU6F1组)中SCs细胞与5μg/mL PI孵育10min，以染色凋亡细胞的细胞核。最后，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗所有细胞，并用4％多聚甲醛(PFA)固定10min。使用ImageJ软件检测PI阳性/DAPI阳性细胞的百分比标记细胞凋亡情况，分析SCs在H2O2(400μM)处理下存活能力。如图11A-B所示，与AAV-NC组比较，AAV-POU6F1组的PI阳性/DAPI阳性细胞的百分比显著降低。显示POU6F1显著抑制SCs在H2O2处理下细胞凋亡，增强其存活能力。
(4)Transwell检测SCs的迁移
细胞分组同上，每层膜均匀涂覆10mg/ml纤维连接蛋白。将6孔板中的AAV-NC组和AAV-POU6F1组各100ml SCs(2×107cells/ml)转移到腔室顶部，并迁移到下部腔室。应用0.1％结晶紫染色并计数粘附在每个膜底表面的细胞。在DMR倒置显微镜下通过在三个随机选择的区域中计数细胞数量来计算细胞迁移。如图11C-D所示，与AAV-NC组比较，AAV-POU6F1组的细胞迁移比率显著增高，表明POU6F1显著促进SCs迁移。
应用AAV病毒载体对SCs修饰，利用免疫细胞化学方法检测AAV-POU6F1在SCs中的转染效率。发现POU6F1与S100标记的SCs广泛共定位，POU6F1在体外的SCs细胞核和细胞质中分布。免疫荧光染色和western bolt验证POU6F1-SCs中POU6F1的表达显著增加。MTT表明AAV-POU6F1转染后2d和3d，AAV-POU6F1组SCs增殖显著增高(见图9-10)。为评估POU6F1对H2O2诱导的SCs细胞凋亡保护作用，对各组中的PI阳性细胞进行计数。与对照组(AAV-NC)相比，POU6F1-SCs组PI阳性细胞比例显著降低。Transwell体外迁移试验表明，与对照组相比，POU6F1促进SCs迁移(见图11)。上述结果表明POU6F1处理可促进SCs的增殖、存活和迁移。
实施例5.验证POU6F1-SCs在再生的ANA中促进轴突再生和SCs存活
一、本发明复合POU6F1-SCs的ANA植入大鼠坐骨神经缺损模型
构建坐骨神经缺损10mm缺损模型，进行复合POU6F1-SCs的ANA植入。在无菌条件下采用乙醚麻醉，剃去右侧臀部及大腿鼠毛，安尔碘消毒后，在右侧臀部至大腿做弧形切口，长约2cm，沿肌肉间隙分离，手术显微镜下显露坐骨神经，于梨状肌下孔5mm处切除坐骨神经，造成10mm神经缺损，如图4A，C-D所示，分别用实施例3所述3种神经移植物(ANA组(ANA用DMEM处理)、ANA+SCs组(ANA中植入SCs处理)、ANA+POU6F1-SCs组(复合POU6F1-SCs的ANA))在无张力条件下桥接神经缺损，断端用9-0无损伤线缝合3～4针。缝合肌肉和皮肤，局部应用抗生素预防感染。术后分笼饲养，术后观察大鼠精神状态、手术肢体活动、饮食、伤口愈合清况等。实验动物分为3组：ANA组、ANA+SCs组和ANA+POU6F1-SCs组。
二、复合POU6F1-SCs的ANA中SCs轴突再生和髓鞘形成检测
(1)免疫组织化学染色
术后7d和35d，乙醚麻醉大鼠，4％多聚甲醛的0.lmol/l磷酸缓冲液灌注后，取各组ANA((ANA组(ANA用DMEM处理)、ANA+SCs组(ANA中植入SCs处理)、ANA+POU6F1-SCs组(复合POU6F1-SCs的ANA))神经移植体、患侧L4-5脊髓、患侧胫前肌(TA)肌腹行冰冻切片。神经移植体冰冻切片用PBST冲洗部分15min×2，用封闭液(90％PBST，10％正常山羊血清)孵育30min。孵育一抗：S100(1:200)，NF200(1:200)。PBST冲洗10min×3，加入二抗室温孵育1h。Olympus荧光显微镜和Neurolucida软件观察分析图像。如图12所示。
(2)上述三组(ANA组、ANA+SCs组和ANA+POU6F1-SCs组)神经移植体组织应用甲苯胺蓝染色检测ANA中段有髓神经纤维数目、轴突直径和髓鞘厚度。如图13A-E所示。
实施例1获得的复合POU6F1-SCs的ANA，为评估再生ANA中的轴突再生，移植后7d通过NF200免疫荧光标记对纵向ANA切片进行分析。如图12A-C所示，与ANA组相比，ANA+SCs组和ANA+POU6F1-SCs的轴突再生指数显著增加。其中ANA+POU6F1-SCs组轴突再生指数显著高于ANA+SCs组。同样，三组最大再生轴突长度表现相同变化趋势。结果表明ANA+POU6F1-SCs组轴突再生优于ANA组和ANA+SCs组。
为进一步评估有髓神经纤维再生和移植SCs在再生ANA中的存活率，在移植后35d对ANA进行纵向切片并通过免疫组织化学观察。如图12D-F所示，与ANA+SCs组相比，ANA+POU6F1-SCs组PKH26标记SCs显著增加，而ANA组未检测到PKH26标记SCs表达。与ANA组相比，ANA+POU6F1-SCs和ANA+SCs组的轴突髓鞘形成(S100标记)显著升高。此外，与ANA+SCs组相比，ANA+POU6F1-SCs组的S100表达显著升高。
移植后35d对ANA进行横向切片并进行甲苯胺蓝染色。如图13A-E所示，与ANA组相比，ANA+SCs组和ANA+POU6F1-SCs组的有髓神经纤维数量、髓鞘厚度、轴突直径和G比率均显著增加。此外，与ANA+SCs组相比，ANA+POU6F1-SCs组有髓神经纤维数量、髓鞘厚度、轴突直径和G比率增加更为显著。以上结果表明POU6F1-SCs处理可改善ANA中的轴突再生、髓鞘形成和SCs存活。
实施例6.验证复合POU6F1-SCs的ANA促进肌肉神经再支配和运动功能恢复
一、复合POU6F1-SCs的ANA促进肌肉神经再支配和运动功能恢复。
ANA分为三组(1)仅注射DMEM(100μl)，(2)仅注射SCs(SCs，100μl，2×107/mL)，和(3)AAV-POU6F1转导SCs(AAV-POU6F1-SCs，100μl，2×107/mL)。应用Hamilton微量注射器注射，三组ANAs在37℃、5％CO2的完全培养基中孵育24h，然后将三组ANA植入大鼠坐骨神经缺损10mm缺损模型。步骤方法同上：在无菌条件下采用乙醚麻醉，剃去右侧臀部及大腿鼠毛，安尔碘消毒后，在右侧臀部至大腿做弧形切口，长约2cm，沿肌肉间隙分离，手术显微镜下显露坐骨神经，于梨状肌下孔5mm处切除坐骨神经，造成10mm神经缺损，分别将上述3种神经移植物在无张力条件下桥接神经缺损，断端用9-0无损伤线缝合3～4针。缝合肌肉和皮肤，局部应用抗生素预防感染。实验动物分为3组：ANA组：ANA用DMEM处理、ANA+SCs组：ANA中植入SCs处理、ANA+POU6F1-SCs组：复合POU6F1-SCs的ANA。
ANA桥接术后35d，分别应用HRP逆行神经示踪、TA肌肉湿重比、运动终板染色、坐骨神经功能指数(SFI)和电生理方法检测运动轴突再生、TA肌肉神经再支配、坐骨神经功能恢复情况。如图13A、F-H所示，与ANA组比较，ANA+SCs组和ANA+POU6F1-SCs组HRP标记运动神经元显著增加。此外，与ANA+SCs组相比，ANA+POU6F1-SCs中的HRP标记运动神经元增加。显示POU6F1-SCs显著促进运动轴突再生。为确定POU6F1-SCs是否能促进TA肌肉神经再支配，对TA肌肉的湿重比和运动终板密度进行了分析。与ANA组相比，ANA+SCs和ANA+POU6F1-SCs组TA肌肉湿重比率增加。此外，与ANA+SCs比较，ANA+POU6F1-SCs组组的肌肉湿重比率显著增高。同样，三组TA肌肉的运动终板密度变化趋势相同。上述结果表明POU6F1-SCs显著促进ANA运动轴突再生、TA肌肉神经再支配。
二、运动功能恢复
(1)坐骨神经功能指数(SFI)
通过坐骨神经功能指数(SFI)评估坐骨神经运动功能恢复情况，由一个对治疗定位识别不清的专业助手在手术后每星期评定一次坐骨神经的功能。大鼠双侧后足黑色墨水在一个塑料通道内行走后每侧足留下8～10个足印，测量足印长度(print length，PL)、足趾宽度(toe spread，TS)、中间足趾宽度(intermediary toe spread，IT)，实验检测指标用EPL、ETS和ETI表示，对侧正常的指标用NPL、NTS和NTI表示。将上述3个变量代入Bain公式计算出SFI＝-38.3(EPL－NPL)/NPL+109.5(ETS－NTS)/NTS+13.3(EIT-NIT)/NIT-8.8。SFI以0为正常值，-100为神经完全断离的指标。如图13I所示，术后35天，与ANA组相比，ANA+SCs和ANA+POU6F1-SCs组SFI分值显著增加。与ANA+SCs组相比，ANA+POU6F1-SCs组的SFI增加更为显著。表明复合POU6F1-SCs的ANA促进坐骨神经运动功能。
(2)电生理方法检测电位潜伏期、传导速度和动作电位波幅。如图13J-L所示。
实施例1获得的复合POU6F1-SCs的ANA，利用电生理学评估ANA桥接神经肌肉完整性和神经传导。电生理波幅取决于神经支配的肌纤维数量。动作电位开始的潜伏期表明髓鞘形成的程度和轴突的大小。与ANA组相比，ANA+POU6F1-SCs和ANA+SCs组的波幅显著增加。与ANA+SCs组相比，ANA+POU6F1-SCs组的波幅显著增加。而各组潜伏期变化趋势与波幅完全相反。表明复合POU6F1-SCs的ANA有效促进神经传导。上述结果表明复合POU6F1-SCs的ANA能够显著改善运动功能恢复。

Claims (7)

1.一种复合POU6F1-SCs的脱细胞神经支架，其特征在于，所述复合POU6F1-SCs的脱细胞神经支架是从POU6F1修饰的SCs植入脱细胞神经支架中获得的；脱细胞神经支架是将异体坐骨神经放置在质量分数为4％脱氧胆酸钠溶液中，并放置恒温振荡器振荡4h，生理盐水清洗，然后将处理的异体坐骨神经浸泡在含2000kU脱氧核糖核酸酶I的1M NaCl溶液3h，清洗后将处理的异体坐骨神经浸泡在含有2U/ml ChABC的PBS溶液中，水浴12h，用无菌水清洗后获得脱细胞神经支架；
所述复合POU6F1-SCs的脱细胞神经支架的制备方法的具体步骤如下：
步骤1：POU6F1修饰SCs：SCs接种于细胞板中，当细胞培养至90％融合进行转染，将1×109病毒颗粒/ml的AAV-POU6F1转染SCs细胞24h；
步骤2：POU6F1修饰SCs植入脱细胞神经支架：将质量浓度为4μmol/L的PKH26荧光示踪染料添加进步骤1获得的POU6F1-SCs培养液中，获得标记POU6F1-SCs，将2×106POU6F1-SCs移植到ANA中，然后将移植后的ANA在37℃、体积分数为5％的CO2的完全培养基中孵育24h，获得人工神经移植物。
2.根据权利要求1所述的复合POU6F1-SCs的脱细胞神经支架，其特征在于，获得的ANA经γ辐照灭菌，真空无菌包装在4℃保存。
3.根据权利要求1所述的复合POU6F1-SCs的脱细胞神经支架，其特征在于，获得SCs的方法如下：原代SCs取自成年SD大鼠的坐骨神经，切除坐骨神经，在37℃下用I型胶原酶和胰蛋白酶消化60min，选用阿糖胞苷溶液、forskolin、10％FBS和FGF-2的培养基以去除成纤维细胞，贴壁细胞生长密度达到85％后用胰蛋白酶消化传代，获得传代细胞。
4.根据权利要求3所述的复合POU6F1-SCs的脱细胞神经支架，其特征在于，I型胶原酶的浓度为625u/ml；所述胰蛋白酶的质量分数为0.25％。
5.根据权利要求3所述的复合POU6F1-SCs的脱细胞神经支架，其特征在于，阿糖胞苷溶液的浓度为10μM；所述forskolin的浓度为2μM；所述FGF-2的浓度为10ng/ml。
6.权利要求1-5任一项所述的复合POU6F1-SCs的脱细胞神经支架在制备修复大鼠坐骨神经缺损中的移植物应用。
7.权利要求1-5任一项所述的复合POU6F1-SCs的脱细胞神经支架在制备促进神经轴突再生或修复周围神经损伤的组织工程神经移植物中的应用。
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