CN108404204A - 丝素蛋白水凝胶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种水凝胶材料，尤其涉及一种丝素蛋白水凝胶；本发明的丝素蛋白水凝胶，包括经丝素蛋白溶液在含大分子量聚乙二醇的诱导剂作用下生成的丝素蛋白水凝胶，所述大分子量聚乙二醇是指重均分子量为3000‑8000的聚乙二醇；本发明的丝素蛋白水凝胶，生物相容性好、可促进细胞增值、机械强度与天然组织匹配、可注射、植入方便、产物无毒副作用。

Description

丝素蛋白水凝胶
技术领域
本发明涉及一种水凝胶材料，尤其涉及一种丝素蛋白水凝胶
背景技术
对于缺陷或欠美观组织(如来自于创伤、手术切除或先天性缺陷)的治疗手段，从组织来源上分包括自体组织移植和人工填充两种；从植入手段上分为窗口式植入和注射填充两种。自体组织受限于来源限制难以广泛应用、且对伤者多会造成二次创伤，人工填充材料在临床的应用越来越广泛；注射填充，由于其创面小、操作简单、患者痛苦小等优势广泛应用于软组织创伤或手术切除后的填充和美容整形领域。因此，注射性软组织填充材料的研究和开发，成为整形美容外科的研究热点。
众所周知，用于组织再生、修复或者美容填充的组织填充材料需具备以下特征：1)与天然组织匹配的生物相容性，可促进细胞增值；2)与天然组织匹配的机械强度；3)方便的植入方式，如注射式植入；4)较长的优效时间；5)降解产物无毒副作用。
合成高分子材料可塑性较强，但其合成过程中使用大量有机溶剂，需格外注意残留物的生物毒性，同时还需考虑其降解能力及降解产物的生物毒性。天然高分子，如胶原蛋白，是动物身体的主要细胞外结构蛋白，已被作为植入材料的基质材料用于修复皮肤、肌肉、软骨和骨组织，作为美容填充剂也被使用数年之久；然而，胶原蛋白价格昂贵，且不具有长期持久的效果。透明质酸(hyaluronic acid，HA)，也称玻尿酸，广泛存在于人体各器官中，已广泛用于眼科手术、美瞳除皱纹、塑形、填充脸部、填充凹痕等等；然而，非交联透明质酸在注射后数月内区域降解，需要频繁重新注射，交联透明质酸功能支链的引入，往往用到有机溶剂，这些支链的降解产物与合成高分子材料降解产物类似，对身体毒性尚待考证。
蚕丝蛋白由于具有无毒、无刺激性，低或者无免疫原性，具有优良的生物相容性，能够促进人体细胞的生长，具有生物可降解性等特点，近几十年来，在生物医药、日用化工等科技领域的研究和应用不断发展。蚕丝蛋白主要由丝胶蛋白和丝素蛋白两种蛋白质组成，外层包覆丝胶蛋白(Sericin)，内层为丝素蛋白(Silk fibroin)。丝素蛋白含量为70～80％，由350KD的H链、25KD的L链和30KD的P25组成。再生丝素蛋白可制备成多种形式的生物材料，如薄膜、凝胶、支架和颗粒等，用于药物载体、组成工程修复和固定化酶制备等领域。
现有技术中，虽然公开了一些可注射丝素蛋白制剂，其形式包括：可注射丝素蛋白泡沫、丝素蛋白原位凝胶、丝素蛋白透明质酸复合凝胶、丝素蛋白/纤维素3D打印墨水、丝素蛋白/黄原胶水凝胶；然而却无法满足以上有关组织填充材料的5点要求。
中国专利公开号为CN 104203292 A的发明专利，公开了一种可注射丝素蛋白泡沫，利用丝素蛋白泡沫(支架)的弹性，将丝素蛋白泡沫置于特定的注射器中压缩，注射到病灶部位丝素蛋白泡沫膨胀后起支撑、修复作用。该技术操作复杂：制备工艺上需要特定模具制作特定缺损部位的填充物，临床操作上需要特殊的注射器，受特殊训练医生才可以完成。医务人员培训和特殊注射器同样增加了患者的医疗费用负担。
中国专利公开号为CN 102836465 A的发明专利，公开了一种丝素蛋白透明质酸复合凝胶，使用的是丝素蛋白自然凝胶后均质机打碎，筛选出来的凝胶颗粒，其作用是起支撑作用，延缓材料的降解时间。但该凝胶是利用透明质酸本身的交联，而不是丝素蛋白分子之间的交联。
中国专利公开号为CN 106267370 A的发明专利，公开了一种丝素蛋白/纤维素3D打印墨水，使用京尼平作为交联剂，文中虽然公开了该材料可用于包埋细胞的特性，然而经试验证明，京尼平的生物相容性差，导致材料整体生物相同性不够优秀，并不能用于包埋细胞，而且其化学交联复杂，其生物安全性待确认。
中国专利公开号为CN 106362208 A的发明专利，公开了一种丝素蛋白/黄原胶水凝胶，使用的是丝素粉体而非再生丝素蛋白，丝素粉体与黄原胶之间交联，并未形成丝素蛋白之间的交联，此时丝素粉体与其他可以交联的颗粒无异，无法体现出丝素蛋白良好的生物相容性；同时，丝素粉体表面是疏水的，不利于细胞粘附和生长。
中国专利公开号为CN 103289107 A的发明专利，公开了一种丝素蛋白原位凝胶，利用单一小分子量聚乙二醇诱导的丝素蛋白凝胶，然而小分子量聚乙二醇渗透压高，导致该丝素蛋白凝胶抑制细胞的粘附与增值。
而中国公开号为CN 101772348 B，使用超声方法制备丝素蛋白凝胶，该丝素蛋白水凝胶不具备可注射性，其丝素蛋白浓度高于4％时，细胞无法正常增值。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种生物相容性好，生物相容性好、可促进细胞增值、机械强度与天然组织匹配、可注射、植入方便、产物无毒副作用的丝素蛋白水凝胶。
本发明的丝素蛋白水凝胶，包括经丝素蛋白溶液在含大分子量聚乙二醇的诱导剂作用下生成的丝素蛋白凝胶，所述大分子量聚乙二醇是指重均分子量为3000-8000的聚乙二醇。
应当说明的是，聚合物不是由分子量相同的同一物质组成，而是分子量不同的同系物的混合物，也存在一定的分布或多分散性。聚合物分子量表示方法有多种不同方式，包括数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)、以及粘均分子量(Mv)。其中，数均分子量(Mn)是按分子数统计的平均，计算方式：Mn＝m/n(m是总质量、n是总摩尔数)。重均分子量(Mw)按照重量的统计平均，通常有光散射法，凝胶渗透色谱法来获得，重均分子量其分子量较大的部分占有较高的权重。粘均分子量(Mv)根据溶液体系的粘度转变为分子量。通常三者有如下关系：Mw>Mv>Mn。
应当说明的是，所述丝素蛋白溶液的制备方法并不局限，通常包括如下步骤实现：
S1、除去蚕丝蛋白表面丝胶蛋白；例如，将蚕茧丝/生丝剪碎后称重，在摩尔浓度为0.02M的碳酸钠水溶液中煮沸30分钟除去丝胶，然后用去离子水反复搓洗3次，水洗完成后放入通风橱干燥；
S2、由脱胶蛋白获得再生丝素蛋白。例如，将脱胶蚕丝溶于9.3M溴化锂溶液中，溶解时间4小时；将溶液置于透析装置中，对水透析出去溴化锂；离心去除未溶解颗粒物。
具体的，丝素蛋白溶液在含大分子量聚乙二醇的诱导剂作用下生成丝素蛋白水凝胶的过程，包括但不限于以下方式：1)丝素蛋白溶液与含大分子量聚乙二醇的诱导剂混合孵育一段时间后生成丝素蛋白凝胶；2)丝素蛋白溶液与含大分子量聚乙二醇的诱导剂混合均匀后成凝胶之前，干燥得到干燥混合物，水相溶液复溶后孵育一段时间后形成丝素蛋白水凝胶。
具体的，丝素蛋白溶液与含大分子量聚乙二醇的诱导剂反应过程中，还包括超声、电刺激、剪切或涡旋振荡以加快成凝胶速度的方式。
进一步的，所述诱导剂还包括小分子量聚乙二醇，所述小分子量聚乙二醇是指均分子量为200-400的聚乙二醇或任意组合，所述小分子量聚乙二醇的质量分数不高于大分子量聚乙二醇的两倍。
应当说明的是，小分子量聚乙二醇的作用在于加速凝胶的形成过程，本发明仅以小分子量聚乙二醇为例做进一步的研究，凡是能够实现加速凝胶过程的诱导剂，如酸或碱，均应落入本发明的保护范围，本发明不再赘述。
具体的，所述丝素蛋白的质量分数为1-30％。
具体的，所述丝素蛋白与大分子量聚乙二醇的质量比为1：0.5～1：6。
应当说明的是，考虑到医学上实施时间对患者的影响，所述丝素蛋白凝胶的成凝胶时间，最优的，当混合溶液直接植入受试者待修复或填充部位时，成凝胶时间不大于8小时；当混合溶液成凝胶后再植入受试者待修复或填充部位时，成凝胶时间不大于72小时。
进一步的，所述丝素蛋白组织填充剂中还包括药物、生物活性剂、或美容剂。
具体的，所述药物包括麻醉剂和治疗剂；所述生物活性剂包括细胞、细胞生长因子、肽段、以及核酸；所述美容活性剂包括羟基磷灰石、明胶、透明质酸、胶原蛋白、交联的透明质酸/胶原蛋白、弹性蛋白、抗老化剂、抗自由基剂、抗氧化剂、美白剂、着色剂、脱色剂、防晒剂、以及肌肉松弛剂。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明的丝素蛋白组织填充剂，可不经干燥直接形成水凝胶用于修复或扩充组织，也可将丝素蛋白和大分子量聚乙二醇形成混合干粉后，水复溶后形成凝胶，具体使用时可直接注射、或成凝胶后注射用于修复或扩充组织。该凝胶具有1)与天然组织匹配的生物相容性，可促进细胞生长；2)与天然组织匹配的机械强度；3)方便的植入方式，如注射式植入；4)较长的优效时间；5)降解产物无毒副作用。
中国专利公开号为CN106913900A的发明专利，尽管使用了大分子量聚乙二醇与丝素蛋白形成止血膜或者止血粉，然而其并非凝胶，其使用场景也并非作为组织填充剂，因而无需考虑生物相容性和对细胞生长的作用，大分子量聚乙二醇的分子量也与本发明有所差别；
中国专利公开号为CN103289107A的发明专利公开的可注射丝素蛋白原位凝胶，其使用小分子量聚乙二醇(聚乙二醇300、400、600或1500中的任意一种)与丝素蛋白形成凝胶，本发明后续实施例中指出其抑制细胞生长，因而不具有作为组织填充剂的用途；而中国公开号为CN 101772348 B，使用超声方法制备丝素蛋白凝胶，该丝素蛋白水凝胶不具备可注射性，其丝素蛋白浓度高于4％时，细胞无法正常增值。丝素蛋白降解时间取决于丝素蛋白质量浓度，质量浓度低降解时间快，无法上时间保持缺陷或欠美观组织的改善形貌。因此，同样限制了其作为组织填充剂的用途。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明中质量分数5％不同分子量聚乙二醇的渗透压；
图2是本发明中不同水凝胶表面和截面特征图；
图3是本发明中细胞在不同水凝胶中培养15天后细胞死活染色后荧光显微镜下镜检图，以商用Matrigel、CN103289107A和CN 101772348 B专利水凝胶作为对照；
图4是本发明中细胞在不同浓度水凝胶中培养15天后细胞死活染色后荧光显微镜下镜检图；
图5是本发明水凝胶皮下植入组织切片H&E染色结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一
本实施例提供一种不同分子量聚乙二醇对细胞增值影响的实验过程与结果，具体如下：
S1、复融冻存P2人骨髓间充质干细胞，接种于T175细胞培养瓶内，使用含10％FBS、1％双抗的DMEM培养基继续培养。待细胞扩增至覆盖培养瓶底部80％时，使用PBS冲洗2次，用2mL0.25％胰酶消化，加入4mL细胞培养液终止消化。离心、使用细胞培养液重悬，计数。
S2、5000细胞/孔接种于24孔细胞培养板中，使用含10％FBS、1％双抗的DMEM培养基继续培养12小时。
S3、弃上清，加入含不同分子量、质量浓度为5％聚乙二醇的培养液，继续培养，分别于培养1天、2天、3天、5天和7天时，加入250μL含10％(v/v)AlamarBlue的新鲜培养液，继续培养4小时，取100μL培养液，测荧光强度(Ex360nm，Em395nm)。
S4、与不添加聚乙二醇的对照组对比，研究不同分子量聚乙二醇对细胞活力/增值影响。
结果如表1所示，小分子量聚乙二醇(重均分子量(Mw)200-1500)，严重影响细胞代谢/增值。
表1中，严重影响细胞增值是指：培养7天与不加聚乙二醇对照组相比，细胞活力低于对照组60％；对细胞增值影响小是指：培养7天与不加聚乙二醇对照组相比，细胞活力高于对照组80％。
表1不同分子量聚乙二醇生物相容性
为进一步说明以上现象，本实施例还研究了不同分子量聚乙二醇的渗透压，包括以下步骤：
S1、使用去离子水配置质量浓度为5％的不同分子量聚乙二醇溶液。
S2、使用Gonotec渗透压测定仪，测定S1各组溶液的渗透压。
图1为5％不同分子量聚乙二醇溶液渗透压柱状图。从图中可以发现，随着聚乙二醇分子量降低，其溶液渗透压逐渐增加，而前述不同分子量聚乙二醇分子对细胞增值的影响，与该因素有关。
实施例二
本实施例提供一种不同分子量聚乙二醇及其组合制备的丝素蛋白水凝胶，并使用扫描电子显微镜研究了水凝胶的三维结构，以检测不同分子量聚乙二醇本身对丝素蛋白凝胶结构的影响。具体步骤如下：
S1、将家蚕茧丝剪碎后称取100克，在40L摩尔浓度为0.02M的碳酸钠水溶液中煮沸30分钟除去丝胶，然后用去离子水反复搓洗3次，水洗完成后放入通风橱干燥，待用。
S2、称取10克脱胶蚕丝，置于40mL9.3M溴化锂溶液中，60℃，处理4小时。置于透析装置中对器离子水透析48小时，离心去除不溶颗粒。
S3、将S2获得的再生丝素蛋白溶液稀释至质量浓度5％以下，高温高压灭菌处理。冷却，待用。
S4、向S3中获得的丝素蛋白溶液中加入单一无菌聚乙二醇(Mw 1500、3200、4000、6000、8000、10000)，其中丝素蛋白与聚乙二醇质量比为1：0.5、1：1、1：2、1：6。
S5、采用冷冻干燥或喷雾干燥等常规方法将步骤S4所获的混合溶液干燥，获得丝素蛋白和聚乙二醇混合物。
需要注意的是，干燥是获得高浓度丝素蛋白/聚乙二醇方法之一，但不是唯一的方法。无菌条件下浓缩也可以获得得高浓度丝素蛋白/聚乙二醇，但浓缩液不可长时间储存。浓缩液粘稠度较高，移取困难。
S6、向S5获得的丝素蛋白/聚乙二醇混合物中加入去离子水，获得2.5％、5％、7.5％、10％、15％、20％和30％的混合溶液，其溶解情况如表2所示。
表2丝素蛋白与聚乙二醇质量比为1：0.5、1：1、1：2、1：6干燥混合物水溶性结果
S7、以步骤S6获得的7.5％可溶性丝素蛋白/聚乙二醇混合溶液为例，37℃孵育72小时。观察混合溶液成凝胶情况，结果如表3所示：
表3.丝素蛋白与聚乙二醇质量比为1：0.5-6干燥混合溶液成水凝胶结果
需要说明的是，大分子量聚乙二醇之间的任意组合，也会得到类似的结论。
实施例三
本实施例提供一种丝素蛋白溶液在大分子量聚乙二醇作用同时，同时添加小分子聚乙二醇促进的丝素蛋白形成水凝胶，其成凝胶速度的结果对比，具体包括如下步骤：
S1、将家蚕茧丝剪碎后称取100克，在40L摩尔浓度为0.02M的碳酸钠水溶液中煮沸30分钟除去丝胶，然后用去离子水反复搓洗3次，水洗完成后放入通风橱干燥，待用。
S2、称取10克脱胶蚕丝，置于40mL9.3M溴化锂溶液中，60℃，处理4小时。置于透析装置中对器离子水透析48小时，离心去除不溶颗粒。
S3、向步骤S2中获得的丝素蛋白溶液中加入大分子量聚乙二醇，其中丝素蛋白与聚乙二醇质量比为1：1。
S4、采用冷冻干燥或喷雾干燥等常规方法将S3所获的混合溶液干燥，获得丝素蛋白和大分子量聚乙二醇的干燥混合物。
S5、可以向步骤S4获得的干燥混合物中加入去离子水溶解后，再加入小分子量聚乙二醇(Mw 400)，孵育成水凝胶。
表4中列举了向丝素蛋白浓度7.5％，丝素蛋白与聚乙二醇(Mw 4000)比例为1：1的混合溶液中添加不同量的小分子量聚乙二醇后，混合溶液成凝胶时间。
表4小分子量聚乙二醇加速丝素蛋白/大分子聚乙二醇混合液成凝胶
需要说明的是，丝素蛋白浓度7.5％，丝素蛋白与聚乙二醇(Mw 4000)比例为1：1并不是唯一组合，小分子量聚乙二醇(Mw 200、300、400)，以及其任意组合也可得到类似的实验结果。
实施例五
本实施例提供不同凝胶的表面及截面形态特征的检测实验方法及结果，具体包括以下步骤：
S1、将家蚕茧丝剪碎后称取100克，在40L摩尔浓度为0.02M的碳酸钠水溶液中煮沸30分钟除去丝胶，然后用去离子水反复搓洗3次，水洗完成后放入通风橱干燥，待用。
S2、称取10克脱胶蚕丝，置于40mL9.3M溴化锂溶液中，60℃，处理4小时。置于透析装置中对器离子水透析48小时，离心去除不溶颗粒。
S3、将S2获得的再生丝素蛋白溶液稀释至质量浓度5％以下，高温高压灭菌处理。冷却，待用。
S4、向S3中获得的丝素蛋白溶液中加无菌大分子量聚乙二醇，其中丝素蛋白与聚乙二醇质量比为1：1。
S5、采用冷冻干燥或喷雾干燥等常规方法将S4所获的混合溶液以及S3所获的丝素蛋白容易分别干燥，获得丝素蛋白和大分子量聚乙二醇的混合物干粉以及丝素蛋白干粉。
S6、检测不同凝胶的表面及截面形态特征。
A、向S5中获得的混合物干粉中加入无菌水，获得丝素蛋白终质量浓度7.5％，大分子量聚乙二醇质量浓度为7.5％的混合液，孵育一定时间成水凝胶。水洗除去游离聚乙二醇，液氮冷冻后，冷冻干燥，扫描电子显微镜观察丝素蛋白/聚乙二醇(Mw 4,000)凝胶表面及截面形态特征。
B、向S5中获得的混合物干粉中加入无菌水，形成均匀溶液后，再加入聚乙二醇(MW400)，获得丝素蛋白终质量浓度7.5％，大分子量聚乙二醇质量浓度为7.5％，小分子量聚乙二醇质量浓度为15％的混合液，成水凝胶，水洗除去游离聚乙二醇，液氮冷冻后，冷冻干燥，扫描电子显微镜观察丝素蛋白/聚乙二醇(Mw 4,000)/聚乙二醇(Mw 400)凝胶表面及截面形态特征。
C、向S5中获得的丝素蛋白干粉加入无菌水，形成均匀溶液中加入聚乙二醇(Mw400)，获得丝素蛋白质量终质量浓度7.5％，聚乙二醇(Mw 400)质量浓度为40％的混合液，成凝胶，水洗除去游离聚乙二醇，液氮冷冻后，冷冻干燥，扫描电子显微镜观察丝素蛋白/聚乙二醇(Mw 400)凝胶表面及截面形态特征。
D、向S5中获得丝素蛋白干粉中加入无菌水，形成均匀溶液后，丝素蛋白质量浓度为7.5％，液氮冷冻后，冷冻干燥。扫描电子显微镜观察超声法形成的凝胶表面及截面形态特征。
图2列举了丝素蛋白/聚乙二醇(Mw 4,000)凝胶、丝素蛋白/聚乙二醇(Mw 4,000)/聚乙二醇(Mw 400)凝胶、丝素蛋白/聚乙二醇(Mw 400)凝胶和对照组超声凝胶表面及截面形态特征。
丝素蛋白材料中，材料孔的尺寸对装载细胞的增值至关重要。从图中可以看出中丝素蛋白/聚乙二醇(Mw 400)凝胶表面结构致密，无空隙；截面孔隙不完整。丝素蛋白/聚乙二醇(Mw 4000)/聚乙二醇(Mw 400)凝胶表面有少量空隙结构，截面孔隙结构较丝素蛋白/聚乙二醇(Mw 400)凝胶完整。丝素蛋白/聚乙二醇(Mw 4,000)表面孔隙较多，截面孔隙大而结构完整。
由此可以推测，细胞在本发明水凝胶中的增值效果较超声法制备的水凝胶好，此外根据实施例一和二，细胞在本发明水凝胶中的增值效果较小分子量聚乙二醇制备的水凝胶好。值得注意的是丝素蛋白浓度7.5％，丝素蛋白与聚乙二醇(Mw 4000)比例为1：1并不是唯一组合，其它大分子量聚乙二醇或其任意组合均有类似的现象。
实施例六
本实施例提供不同凝胶对细胞存活和增殖影响的检测实验方法及结果，具体包括以下步骤：
S1、将家蚕茧丝剪碎后称取100克，在40L摩尔浓度为0.02M的碳酸钠水溶液中煮沸30分钟除去丝胶，然后用去离子水反复搓洗3次，水洗完成后放入通风橱干燥，待用。
S2、称取10克脱胶蚕丝，置于40mL9.3M溴化锂溶液中，60℃，处理4小时。置于透析装置中对器离子水透析48小时，离心去除不溶颗粒。
S3、将S2获得的再生丝素蛋白溶液稀释至质量浓度5％以下，高温高压灭菌处理。冷却，待用。
S4、向S3中获得的丝素蛋白溶液中加无菌大分子量聚乙二醇，其中丝素蛋白与大分子量聚乙二醇质量比为1：1。
S5、采用冷冻干燥或喷雾干燥等常规方法将S4所获的混合溶液以及S3所获的丝素蛋白容易分别干燥，获得丝素蛋白和大分子量聚乙二醇的混合物干粉以及丝素蛋白干粉。
S6、检测不同凝胶对细胞存活和增值的影响。
A、向S5中获得的丝素蛋白与聚乙二醇干粉中加入无菌水，细胞悬液，获得丝素蛋白终质量浓度7.5％，大分子量聚乙二醇质量浓度为7.5％的混合液，细胞浓度2.5×106cell/mL，置于细胞培养箱成凝胶(丝素蛋白/聚乙二醇(Mw 4,000)凝胶)。加入细胞培养基，置于细胞培养箱继续培养。细胞死活染色观察细胞存活和增值情况。
B、向S 5中获得的丝素蛋白与聚乙二醇干粉中加入无菌水，形成均匀溶液后，加入细胞悬液，再加入小分子量聚乙二醇，获得丝素蛋白终质量浓度7.5％，大分子量聚乙二醇质量浓度为7.5％，小分子量聚乙二醇质量浓度为15％的混合液，细胞浓度2.5×106cell/mL，置于细胞培养箱成凝胶(丝素蛋白/聚乙二醇(Mw 4,000)/聚乙二醇(Mw 400)凝胶)。加入细胞培养基，置于细胞培养箱继续培养。细胞死活染色观察细胞存活和增值情况。
C、向S 5中获得的丝素蛋白干粉中加入无菌水，形成均匀溶液后，加入细胞悬液，再加入聚乙二醇(Mw 400)，获得丝素蛋白终质量浓度7.5％，聚乙二醇(Mw 400)质量浓度为40％的混合液，细胞浓度2.5×106cell/mL，置于细胞培养箱成凝胶(丝素蛋白/聚乙二醇(Mw 400)凝胶)。加入细胞培养基，置于细胞培养箱继续培养。细胞死活染色观察细胞存活和增值情况。
D、向S5中获得丝素蛋白干粉中加入无菌水，形成均匀溶液后，超声处理，溶液形成凝胶前，加入细胞悬液，丝素蛋白质量浓度为7.5％，细胞浓度2.5×106cell/mL，置于细胞培养箱成凝胶。加入细胞培养基，置于细胞培养箱继续培养。细胞死活染色观察细胞存活和增值情况。
使用商用Matrigel(质量浓度2％)重悬细胞，细胞浓度2.5×106cell/mL，置于细胞培养箱成凝胶。加入细胞培养基，置于细胞培养箱继续培养。细胞死活染色观察细胞存活和增值情况。
上述凝胶中的细胞继续培养15天后，如图3所示为丝素蛋白/聚乙二醇(Mw 4,000)凝胶、丝素蛋白/聚乙二醇(Mw 4,000)/聚乙二醇(Mw 400)凝胶、丝素蛋白/聚乙二醇(Mw400)凝胶和对照组超声凝胶的Metrigel细胞染色结果。其中，丝素蛋白/聚乙二醇(MW 400)凝胶中细胞仅有少量存活。丝素蛋白/聚乙二醇(MW 4,000)/聚乙二醇(MW 400)凝胶中细胞存活数量明显较丝素蛋白/聚乙二醇(MW 400)中的多，且细胞增值形成细胞团簇。丝素蛋白/聚乙二醇(MW 4,000)凝胶中细胞存活数量最多，且细胞增值形成细胞团簇。丝素蛋白/聚乙二醇(MW 4,000)/聚乙二醇(MW 400)凝胶较丝素蛋白/聚乙二醇(MW 4,000)凝胶，使用了小分子量聚乙二醇(MW 400)促进成凝胶过程，聚乙二醇(MW 400)质量浓度为15％，换言之聚乙二醇(MW 400)的加入对细胞增值有一定的影响，但在浓度为15％时，其影响在可接受范围。值得注意的是丝素蛋白浓度7.5％，进一步的试验结果表明，当小分子量丝素蛋白的质量分数超过大分子量丝素蛋白的质量分数的两倍时，细胞的增殖受到较严重的影响。
实施例七
本实施例提供不同浓度丝素蛋白所形成的凝胶对细胞存活和增殖影响的检测实验方法及结果，具体包括以下步骤：
S1、将家蚕茧丝剪碎后称取100克，在40L摩尔浓度为0.02M的碳酸钠水溶液中煮沸30分钟除去丝胶，然后用去离子水反复搓洗3次，水洗完成后放入通风橱干燥，待用。
S2、称取10克脱胶蚕丝，置于40mL9.3M溴化锂溶液中，60℃，处理4小时。置于透析装置中对器离子水透析48小时，离心去除不溶颗粒。
S3、将S2获得的再生丝素蛋白溶液稀释至质量浓度5％以下，高温高压灭菌处理。冷却，待用。
S4、向S3中获得的丝素蛋白溶液中加无菌大分子量聚乙二醇，其中丝素蛋白与大分子量聚乙二醇质量比为1：1。
S5、采用冷冻干燥或喷雾干燥等常规方法将S4所获的混合溶液干燥，获得丝素蛋白和大分子量聚乙二醇的干燥混合物。
S6、向S5中获得的丝素蛋白与聚乙二醇干燥混合物中加入无菌水，细胞悬液，获得丝素蛋白终质量浓度1.25％、3.75％、7.5％、10％，细胞浓度2.5×106cell/mL，置于细胞培养箱成凝胶。加入细胞培养基，置于细胞培养箱继续培养。细胞死活染色观察细胞存活和增值情况。
上述凝胶中的细胞继续培养15天后，图4列举了1.25％、3.75％、7.5％、10％丝素蛋白/聚乙二醇(Mw 4,000)凝胶细胞染色结果。从图4中可以得出，在高浓度丝素蛋白凝胶细胞增值情况很好，这与中国专利公开号为CN 101772348 B的发明专利中的结果形成鲜明对比。
实施例八
本实施例提供丝素蛋白凝胶体内植入后组织反应和细胞增殖情况的检测实验方法及结果，具体包括以下步骤：
S1、将家蚕茧丝剪碎后称取100克，在40L摩尔浓度为0.02M的碳酸钠水溶液中煮沸30分钟除去丝胶，然后用去离子水反复搓洗3次，水洗完成后放入通风橱干燥，待用。
S2、称取10克脱胶蚕丝，置于40mL9.3M溴化锂溶液中，60℃，处理4小时。置于透析装置中对器离子水透析48小时，离心去除不溶颗粒。
S3、将S2获得的再生丝素蛋白溶液稀释至质量浓度5％以下，高温高压灭菌处理。冷却，待用。
S4、向S3中获得的丝素蛋白溶液中加无菌大分子量聚乙二醇，其中丝素蛋白与大分子量聚乙二醇质量比为1：1。
S5、采用冷冻干燥或喷雾干燥等常规方法将S4所获的混合溶液干燥，获得丝素蛋白和大分子量聚乙二醇的干燥混合物。
S6、向S5中获得的丝素蛋白与聚乙二醇干燥混合物种加入无菌水，细胞悬液，获得丝素蛋白终质量浓度7.5％，总大分子量聚乙二醇质量浓度为7.5％的混合液，细胞浓度2.5×106cell/mL，置于细胞培养箱成凝胶。以不装载细胞空白凝胶为对照，进行SD鼠皮下注入实验。
S7、向S 5中获得的丝素蛋白与聚乙二醇干燥混合物种加入无菌水，形成均匀溶液后，加入细胞悬液，再加入小分子量聚乙二醇，获得丝素蛋白终质量浓度7.5％，总大分子量聚乙二醇质量浓度为7.5％，总小分子量聚乙二醇质量浓度为15％的混合液，细胞浓度2.5×106cell/mL，置于细胞培养箱成水凝胶。以不装载细胞空白凝胶为对照，进行SD鼠皮下注入实验。
S8、麻醉200-250克SD鼠，把S6、S7制备的水凝胶注射到SD鼠皮下，注射量0.5cc，每个动物4个注射点，以脊背为中心，左右对称，每侧2个点。在第2天第2、4、6、7、12周，取1只SD鼠，取出凝胶及其周围组织，固定包埋，制备组织切片，进行H&E染色，并在显微镜下观察组织反应和细胞增值情况。
图5列举了丝素蛋白/聚乙二醇(Mw 4,000)凝胶，体内植入后6周的组织反应及细胞增值情况。从图中可以看出，植入后细胞在丝素蛋白/聚乙二醇(Mw 4,000)凝胶存活良好，作为对照不装载细胞的丝素蛋白/聚乙二醇(Mw 4,000)凝胶内部没有大量巨噬细胞，说明本发明水凝胶生物相容性良好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种丝素蛋白水凝胶，其特征在于：包括经丝素蛋白溶液在含大分子量聚乙二醇的诱导剂作用下生成的丝素蛋白凝胶，所述大分子量聚乙二醇是指重均分子量为3000-8000的聚乙二醇。
2.根据权利要求1所述的丝素蛋白水凝胶，其特征在于：丝素蛋白溶液在含大分子量聚乙二醇的诱导剂作用下生成丝素蛋白水凝胶的过程，包括但不限于以下方式：1)丝素蛋白溶液与含大分子量聚乙二醇的诱导剂混合孵育一段时间后生成丝素蛋白凝胶；2)丝素蛋白溶液与含大分子量聚乙二醇的诱导剂混合均匀后成凝胶之前，干燥得到干燥混合物，水相溶液复溶后孵育一段时间后形成丝素蛋白水凝胶。
3.根据权利要求1所述的丝素蛋白水凝胶，其特征在于：丝素蛋白溶液与含大分子量聚乙二醇的诱导剂反应过程中，还包括超声、电刺激、剪切或涡旋振荡以加快成凝胶速度的方式。
4.根据权利要求1所述的丝素蛋白水凝胶，其特征在于：所述诱导剂还包括小分子量聚乙二醇，所述小分子量聚乙二醇是指均分子量为200-400的聚乙二醇或任意组合，所述小分子量聚乙二醇的质量分数不高于大分子量聚乙二醇的两倍。
5.根据权利要求1所述的丝素蛋白水凝胶，其特征在于：所述丝素蛋白的质量分数为1-30％。
6.根据权利要求1所述的丝素蛋白水凝胶，其特征在于：所述丝素蛋白与大分子量聚乙二醇的质量比为1：0.5～1：6，大分子量聚乙二醇为单一组分或其任意组合。
7.根据权利要求1所述的丝素蛋白水凝胶，其特征在于：所述丝素蛋白水凝胶中还包括药物、生物活性剂、或美容剂。
8.根据权利要求1所述的丝素蛋白水凝胶，其特征在于：所述药物包括麻醉剂和治疗剂；所述生物活性剂包括细胞、细胞生长因子、肽段、以及核酸；所述美容活性剂包括羟基磷灰石、明胶、透明质酸、胶原蛋白、交联的透明质酸/胶原蛋白、弹性蛋白、抗老化剂、抗自由基剂、抗氧化剂、美白剂、着色剂、脱色剂、防晒剂、以及肌肉松弛剂。
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