CN110420354A - 一种增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架，包括以下重量百分比的组分：88‑96％脱钙牙本质颗粒、3‑9％丝素蛋白和1‑3％PEG。本发明增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架可应用于骨组织工程中，将细胞与支架材料结合，解决了骨源短缺、术后并发症众多、材料生物相容性差等缺点，使患者术后面容恢复良好且降低了手术费用；本发明将家蚕丝素蛋白、脱钙牙骨质、PEG合理复配，所得复合载体支架材料力学性能高，在体内降解速度适中，具有定向成骨诱导分化能力，不会产生酸性降解产物，降低了免疫排斥。

Description

一种增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及口腔颌面修复，尤其涉及一种增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架及其制备方法。
背景技术
颌骨损伤与缺损为口腔颌面外科临床上常见病，常给患者造成严重的面容影响、并造成沉重的经济负担。颌骨的修复方法主要包括自体骨修复和外源性骨修复两种。自体骨修复是骨缺损修复的最佳方法，但骨源短缺，且需要二次手术创伤并可能有相应的并发症发生。外源性骨修复来源广，易引起免疫反应，效果较差，易引起感染。目前临床颌骨修复多应用骨组织替代物包括金属、无机物、有机材料，但其在生物相容性和力学性能、功能、外形方面都各有不足。骨组织工程采用细胞与支架(载体)材料结合可以克服以上的缺点。但载体材料目前还不完善，包括人工合成材料和天然材料，这些材料均存在自身缺点，如材料力学性能较差，对修复细胞无定向诱导性，体内降解速度过快，产生酸性降解产物，免疫排斥，塑形差等问题。
发明内容
本发明针对现有颌骨修复所用支架材料存力学性能差、对修复细胞无定向诱导性、降解快等缺点，提供一种增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架及其制备方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架，其特征在于，包括以下重量百分比的组分：88-96％脱钙牙本质颗粒、3-9％丝素蛋白和1-3％PEG。
其中，所述脱钙牙本质颗粒粒径为100-350um，脱钙牙本质中小管直径为2.5-2.6um，脱钙牙本质强度洛氏硬度值为28.5-29；所述丝素蛋白数均分子量为20000-60000，直径为10-110um；所述PEG数均分子量为6000-12000。
本发明还公开了上述增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架的制备方法，包括以下步骤：
1)制备脱钙牙本质颗粒：将牙本质浸入脱钙液中，30℃下脱钙6h，用去离子水冲洗至冲洗液为中性，浸入1×PBS缓冲液中浸泡12h，再悬浸入脱脂液中，30℃下脱脂24h，用去离子水冲洗3-5次，最后浸入体积分数3％的H2O2溶液中，27℃浸泡24h，清洗晾干后粉碎成粒径为100-350um的颗粒，放入蜡封的真空瓶-20℃保存；
2)制备丝素蛋白：将天然蚕丝浸入浓度为0.4wt％的NaHCO3溶液中，在90℃下浸泡1h进行脱胶，漂洗干燥后得丝素蛋白；
3)制备丝素蛋白水溶液：将步骤2)所得丝素蛋白置入浓度为9.3mol/L的LiBr水溶液中，60℃下静置8h使丝素蛋白完全溶解，将丝素蛋白-LiBr混合溶液转移至透析袋中，在蒸馏水中透析3天，再将透析袋在50℃的水浴中浓缩至丝素蛋白为6wt％，得丝素蛋白水溶液；
4)制备增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架：按重量百分比称取脱钙牙本质颗粒、PEG，以及量取对应体积的丝素蛋白水溶液，将脱钙牙本质颗粒和加入丝素蛋白水溶液中搅拌均匀，再加入PEG进行交联，将交联后的溶液注入硅胶模具中，-20℃保存12h，再-80℃保存24h，脱模后35kPa真空度下升华干燥，最后等离子照射消毒，即得。
其中，步骤1)中所述脱钙液由4wt％多聚甲醛水溶液850mL、12mol/L的浓盐酸80mL、95％浓甲酸70mL、三氯化铝60g，乙酸25mL配置而成；所述脱脂液由体积比为1:1的甲醇和氯仿混合而成。
本发明的有益效果是：本发明增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架可应用于骨组织工程中，将细胞与支架材料结合，解决了骨源短缺、术后并发症众多、材料生物相容性差等缺点，使患者术后面容恢复良好且降低了手术费用。本发明将家蚕丝素蛋白、脱钙牙骨质、PEG合理复配，所得复合载体支架材料力学性能高，在体内降解速度适中，具有定向成骨诱导分化能力，不会产生酸性降解产物，降低了免疫排斥。本发明增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架可广泛的应用于颌骨损伤与缺损的修复、面部整形等领域，可取得良好的社会和经济效益。
附图说明
图1为实施例1-3体外培养骨髓基质干细胞在材料上的扫描电镜片；
图2为实施例1-3成骨指标图；
图3为实施例1动物模型照片及切片组织电镜图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架，包括以下重量百分比的组分：96％脱钙牙本质颗粒、3％丝素蛋白和1％PEG。
其中，脱钙牙本质颗粒粒径为100um，脱钙牙本质中小管直径为2.6um，脱钙牙本质强度洛氏硬度值为28.5；丝素蛋白数均分子量为60000，直径为110um；PEG数均分子量为6000。
实施例2
一种增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架，包括以下重量百分比的组分：92％脱钙牙本质颗粒、6％丝素蛋白和2％PEG。
其中，脱钙牙本质颗粒粒径为200um，脱钙牙本质中小管直径为2.55um，脱钙牙本质强度洛氏硬度值为28.7；丝素蛋白数均分子量为40000，直径为60um；PEG数均分子量为10000。
实施例3
一种增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架，包括以下重量百分比的组分：88％脱钙牙本质颗粒、9％丝素蛋白和3％PEG。
其中，脱钙牙本质颗粒粒径为350um，脱钙牙本质中小管直径为2.5um，脱钙牙本质强度洛氏硬度值为29；丝素蛋白数均分子量为20000，直径为10um；PEG数均分子量为12000。
实施例1-3增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架的制备方法为：
1)制备脱钙牙本质颗粒：将牙本质浸入脱钙液中，脱钙液由4wt％多聚甲醛水溶液850mL、12mol/L的浓盐酸80mL、95％浓甲酸70mL、三氯化铝60g，乙酸25mL配置而成，30℃下脱钙6h，用去离子水冲洗至冲洗液为中性，浸入1×PBS缓冲液中浸泡12h，再悬浸入体积比为1:1的甲醇和氯仿混合而成脱脂液中，30℃下脱脂24h，用去离子水冲洗3-5次，最后浸入体积分数3％的H2O2溶液中，27℃浸泡24h，清洗晾干后粉碎对应粒径的颗粒，放入蜡封的真空瓶-20℃保存；
2)制备丝素蛋白：将天然蚕丝浸入浓度为0.4wt％的NaHCO3溶液中，在90℃下浸泡1h进行脱胶，漂洗干燥后得丝素蛋白；
3)制备丝素蛋白水溶液：将步骤2)所得丝素蛋白置入浓度为9.3mol/L的LiBr水溶液中，60℃下静置8h使丝素蛋白完全溶解，将丝素蛋白-LiBr混合溶液转移至透析袋中，在蒸馏水中透析3天，再将透析袋在50℃的水浴中浓缩至丝素蛋白为6wt％，得丝素蛋白水溶液；
4)制备增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架：按重量百分比称取脱钙牙本质颗粒、PEG，以及量取对应体积的丝素蛋白水溶液，将脱钙牙本质颗粒和加入丝素蛋白水溶液中搅拌均匀，再加入PEG进行交联，将交联后的溶液注入硅胶模具中，-20℃保存12h，再-80℃保存24h，脱模后35kPa真空度下升华干燥，最后等离子照射消毒，即得。
对比例1、对比例2和对比例3为一种丝素蛋白人工颌骨载体支架，分别为实施例1、实施例2和实施例3中去除脱钙牙本质颗粒后PEG交联的丝素蛋白。制备方法为：将天然蚕丝浸入浓度为0.4wt％的NaHCO3溶液中，在90℃下浸泡1h进行脱胶，漂洗干燥后得丝素蛋白；将所得丝素蛋白置入浓度为9.3mol/L的LiBr水溶液中，60℃下静置8h使丝素蛋白完全溶解，将丝素蛋白-LiBr混合溶液转移至透析袋中，在蒸馏水中透析3天，再将透析袋在50℃的水浴中浓缩至丝素蛋白为6wt％，得丝素蛋白水溶液；按重量百分比称PEG以及量取对应体积的丝素蛋白水溶液，向丝素蛋白水溶液中加入PEG进行交联，将交联后的溶液注入硅胶模具中，-20℃保存12h，再-80℃保存24h，脱模后35kPa真空度下升华干燥，最后等离子照射消毒，即得。
本申请对实施例1-3增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架进行物理指标检测及对比、生物学检测以及动物实验检测，具体如下。
一、物理指标
本申请对实施例1-3和对比例1-3按步骤4)冷藏和冷藏后真空干燥后的样品分别进行孔隙率、膨胀率和压缩强度等指标进行对比，如表1所示。
各指标计算方法如下：
孔隙率采用乙醇位移法测量支架的孔隙率方法为先测量支架的干态质量md和体积Vd然后将支架浸入正乙烷中抽负压再取出支架称量质量m2，支架孔隙率的计算公式为Ra＝(m2-md)/ρVd。
膨胀率先测量支架的干态体积Vd再将支架浸入蒸馏水中24h，然后测量支架的湿态体积Vw，支架的膨胀率Rv＝(Vw-Vd)/Vd。
压缩强度使用微机控制的万能试验机测试支架的力学性能，测试之前将支架在PBS缓冲液中浸泡12h，加载速度为1mm/min，绘出应力-应变曲线，得到平均弹性模量和压缩强度,弹性模量定义为应力-应变曲线初始线性部分的斜率，即应变为5％-30％的部分，压缩强度定义为30％应变处的应力。
表1.实施例和对比例性能对比
从表1中数据可以看出，干燥后载体支架的各项指标明显增强，实施例1-3由于添加了脱钙牙本质颗粒，交联后脱钙牙本质颗粒填充在丝素蛋白纤维网之间，使得支架载体的孔径、孔隙率和膨胀率明显降低，且压缩强度明显提升，是为增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架。
二、生物学检测
图1为体外培养骨髓基质干细胞在材料上的扫描电镜片其中，a为实施例1增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架用于扫描电竞，可见材料孔隙减小；b为大鼠骨髓基质干细胞接种初期在对比例1丝素蛋白人工颌骨载体支架上的电镜扫描片，细胞舒展不充分；c为大鼠骨髓基质干细胞接种一周时在实施例2增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架上的电镜扫描片，细胞舒展充分；d为大鼠骨髓基质干细胞接种在实施例3增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架上的电镜扫描片，细胞舒展充分。由此可见，体外培养细胞对实施例1-3增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架有较好的相容性，细胞增殖较快，舒展良好。
支架生物相容性的测定：将外培养骨髓基质干细胞并通过碱性磷酸酶免疫组化测定、钙化结节及免疫组化鉴定，观察干细胞在实施例1-3增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架的粘附率，MTT法测定两种细胞增殖率，westernblot测定干细胞的BMP-2/RUNX2/COL-1等指标的蛋白表达。
图2为实施例1-3增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架的成骨指标在1周、3周和5周时蛋白印染。westernblot RUNX2、ALP、COL-1、BMP-2均为成骨常用检测指标，在复合材料实验中可以发现，ALP、COL-1出现较早，RUNX2次之，BMP-2最晚，随时间的推移，以上指标表达逐渐增强。其中1、2和3分别对应实施例1-3增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架的成骨指标，RUNX2、ALP、COL-1、BMP-2均为成骨常用检测指标，在复合材料实验中可以发现，ALP、COL-1出现较早，RUNX2次之，BMP-2最晚，随时间的推移，以上指标表达逐渐增强。
三、动物实验检测
大鼠颅骨缺损的动物模型：在实验大鼠的颅顶截取直径5mm以上的骨质，并标记缺损部位，构建出实验颅骨缺损的动物模型。将实施例1增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架置入动物模型中，如图3所示。图中，A为动物体内植入复合材料的颅骨切口；B为颅骨缺损模型的建立，两个缺损区；C为材料修复颅骨缺损；D为缝合切口；E为材料植入两周时的HE切片图像，细胞在动物体内生长良好，材料没有吸收；F为4周时材料与骨缺损边缘初步接触，材料初步吸收；G为12周时可以看到大量的细胞在牙本质周围形成，细胞条索长入材料内部；H为24周时牙本质大部分吸收，大量的骨改造逐步进行，材料中骨岛形成。置入实施例1增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架后移植物周围无明显的炎症反应，在第三月时大部分丝素蛋白已吸收。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架，其特征在于，包括以下重量百分比的组分：88-96％脱钙牙本质颗粒、3-9％丝素蛋白和1-3％PEG。
2.根据权利要求1所述的增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架，其特征在于，所述脱钙牙本质颗粒粒径为100-350um，脱钙牙本质中小管直径为2.5-2.6um，脱钙牙本质强度洛氏硬度值为28.5-29。
3.根据权利要求1所述的增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架，其特征在于，所述丝素蛋白数均分子量为20000-60000，直径为10-110um。
4.根据权利要求1所述的增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架，其特征在于，所述PEG数均分子量为6000-12000。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备脱钙牙本质颗粒：将牙本质浸入脱钙液中，30℃下脱钙6h，用去离子水冲洗至冲洗液为中性，浸入1×PBS缓冲液中浸泡12h，再悬浸入脱脂液中，30℃下脱脂24h，用去离子水冲洗3-5次，最后浸入体积分数3％的H2O2溶液中，27℃浸泡24h，清洗晾干后粉碎成粒径为100-350um的颗粒，放入蜡封的真空瓶-20℃保存；
2)制备丝素蛋白：将天然蚕丝浸入浓度为0.4wt％的NaHCO3溶液中，在90℃下浸泡1h进行脱胶，漂洗干燥后得丝素蛋白；
3)制备丝素蛋白水溶液：将步骤2)所得丝素蛋白置入浓度为9.3mol/L的LiBr水溶液中，60℃下静置8h使丝素蛋白完全溶解，将丝素蛋白-LiBr混合溶液转移至透析袋中，在蒸馏水中透析3天，再将透析袋在50℃的水浴中浓缩至丝素蛋白为6wt％，得丝素蛋白水溶液；
4)制备增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架：按重量百分比称取脱钙牙本质颗粒、PEG，以及量取对应体积的丝素蛋白水溶液，将脱钙牙本质颗粒和加入丝素蛋白水溶液中搅拌均匀，再加入PEG进行交联，将交联后的溶液注入硅胶模具中，-20℃保存12h，再-80℃保存24h，脱模后35kPa真空度下升华干燥，最后等离子照射消毒，即得。
6.根据权利要求5所述的增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述脱钙液由4wt％多聚甲醛水溶液850mL、12mol/L的浓盐酸80mL、95％浓甲酸70mL、三氯化铝60g，乙酸25mL配置而成。
7.根据权利要求5所述的增强型丝素蛋白人工颌骨载体支架的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述脱脂液由体积比为1:1的甲醇和氯仿混合而成。
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