CN111658822A - 一种应用于牙齿的脱钙方法及其脱细胞脱钙牙材料 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种应用于牙齿的脱钙方法，包括如下步骤S1：收集牙齿、S2：浸泡固定、S3：去除杂质、S4：脱钙处理、S5：清洗除酸处理、S6：搅拌粉碎处理、S7：筛选、S8：消毒。本发明不仅能够缩短脱钙时间，而且在尽量保存大量Ⅰ型胶原纤维的前提下，能够溶解作为免疫原的细胞核。而且省略了脱细胞的流程，相对于传统的脱钙牙本质的制备效率更高。

Description

一种应用于牙齿的脱钙方法及其脱细胞脱钙牙材料
技术领域
本发明涉及牙组织脱钙技术领域，特别涉及到一种应用于牙齿的脱钙方法及其脱细胞脱钙牙材料。
背景技术
骨缺损是由于各种肿瘤、炎症和外伤等原因所致牙槽骨及颌骨缺损，从而影响患者吞咽、发音、咀嚼等功能以及美观的一类疾病。骨移植是治疗这种缺损以及保存拔牙位点的最佳治疗手段。一种理想的骨移植材料应具备三种特性：一是骨传导，它为骨再生提供支架；二是骨诱导，促进骨形成细胞(如未分化细胞和成骨前细胞)的募集，并从这些细胞中形成骨；三是成骨能力，诱导移植物材料中包含的细胞促进骨再生。
目前临床上应用最为广泛的骨移植材料是Bio-Oss骨粉，它具有良好的骨传导作用，可以为成骨细胞的生长提供空间，却缺乏骨诱导能力。脱钙牙本质基质(Demineralizeddentin matrix,DDM)是将人类牙齿经过脱钙、脱细胞得到的牙本质基质。脱钙后的牙本质基质具有天然孔隙结构，有利于骨活性物质和细胞因子长入，从而较好地发挥骨传导作用。脱细胞可以破坏其细胞核，降低免疫原性，具有良好的生物相容性。而且脱钙后的牙本质基质主要由Ⅰ型胶原纤维及骨形态发生蛋白。Ⅰ型胶原纤维可以通过胶原-整合素信号通道诱导间充质细胞分化为成骨细胞。骨形态发生蛋白会募集成骨细胞向骨缺损区移动。众多证据表明脱钙牙本质基质可以作为一种良好的骨移植材料。而脱钙牙本质制备工艺繁琐未能得到广泛运用。传统脱钙牙本质中具有羟基磷灰石的含量较多，植入人体后的羟基磷灰石不易被降解等诸多缺点；另外，传统脱钙方法，酸处理时间通常持续3-5d，且对DDM中的Ⅰ型胶原破坏严重；而相对温和的EDTA脱钙更是需要1个月之久。因此寻找一种高效且对胶原破坏较小的脱钙方法是制备骨移植材料的关键。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明目的提供了一种不仅能够缩短脱钙时间，在尽量保存大量Ⅰ型胶原纤维的前提下，能够溶解作为免疫原的细胞核，而且省略了脱细胞的流程，相对于传统的脱钙牙本质的制备效率更高的应用于牙齿的脱钙方法。
为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案来实现的：
一种应用于牙齿的脱钙方法，其特征在于，包括如下步骤
S1：收集牙齿
收集临床上废弃的牙齿；
S2：浸泡固定
将通过步骤S1牙齿放置于双氧水中浸泡24小时，然后再将经过浸泡的牙齿放置于75％酒精中固定24小时；
S3：去除杂质
将通过步骤S2的牙齿通过去杂装置去除牙齿表面附着的牙龈及牙周膜；
S4：脱钙处理
将2mol/L的浓盐酸与通过步骤S3的牙齿按照10-15:1的质量比混合后放置于500ml丝口瓶内，然后将其整体放置于超声脱钙机内进行脱钙处理；
S5：清洗除酸处理
将通过步骤S4的牙齿首先采用蒸馏水进行冲洗，然后再将经过蒸馏水冲洗后的牙齿置入0.1-0.5mol/L氢氧化钠液内进行浸泡，最后再通过蒸馏水进行冲洗；
S6：搅拌粉碎处理
将通过步骤S5的牙齿放置于搅拌机内，随后加入液氮，然后进行搅拌粉碎处理；
S7：筛选
将通过步骤S6得到的牙齿粉末用过滤网进行筛选，筛选出所需要直径的牙齿颗粒；
S8：消毒
将通过步骤S7的牙齿颗粒经风干装置进行风干处理，然后将经过风干的牙齿颗粒放置于紫外线消毒装置进行消毒后可使用。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤S4的超声脱钙机内的温度为45摄氏度，脱钙强度为4，脱钙时间为30-48小时。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤S5中的牙齿首先蒸馏水冲洗1分钟，然后再将经过蒸馏水冲洗后的牙齿置入0.1-0.5mol/L氢氧化钠液浸泡10分钟，最后再通过蒸馏水冲洗10分钟。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤S6中的液氮每隔一分钟需要加入1次，且需加入3次。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤S7中所需要的牙齿颗粒的直径为750-1000um。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤S8中牙齿颗粒在紫外线消毒装置内消毒24小时后可使用。
与现有技术相比，本发明不仅能够缩短脱钙时间，而且在尽量保存大量Ⅰ型胶原纤维的前提下，能够溶解作为免疫原的细胞核。而且省略了脱细胞的流程，相对于传统的脱钙牙本质的制备效率更高，采用此种方法脱钙后羟基磷灰石含量更低，以Ⅰ型胶原纤维为主，相对于Bio-Oss骨粉具有骨诱导作用，且采用本方法制备的过程中均选用对身体无毒害的试剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为牙齿在5mol/l浓盐酸中不同时间点的脱钙情况。
图2为牙齿在4mol/l浓盐酸中不同时间点的脱钙情况。
图3为牙齿在3mol/l浓盐酸中不同时间点的脱钙情况。
图4为牙齿在2mol/l浓盐酸中不同时间点的脱钙情况。
图5为脱钙后牙齿的HE染色、Masson染色及DAPI染色示意图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
一种应用于牙齿的脱钙方法，包括如下步骤
S1：收集牙齿
收集临床上废弃的牙齿；
S2：浸泡固定
将通过步骤S1牙齿放置于双氧水中浸泡24小时，然后再将经过浸泡的牙齿放置于75％酒精中固定24小时；
S3：去除杂质
将通过步骤S2的牙齿通过去杂装置去除牙齿表面附着的牙龈及牙周膜；
S4：脱钙处理
将2mol/L的浓盐酸与通过步骤S3的牙齿按照10-15:1的质量比混合后放置于500ml丝口瓶内，然后将其整体放置于超声脱钙机内进行脱钙处理，且超声脱钙机内的温度为45摄氏度，脱钙强度为4，脱钙时间为30-48小时；
S5：清洗除酸处理
将通过步骤S4的牙齿首先蒸馏水冲洗1分钟，然后再将经过蒸馏水冲洗后的牙齿置入0.1-0.5mol/L氢氧化钠液浸泡10分钟，最后再通过蒸馏水冲洗10分钟；
S6：搅拌粉碎处理
将通过步骤S5的牙齿放置于搅拌机内，随后加入液氮，然后进行搅拌粉碎处理，液氮每隔一分钟需要加入1次，且需加入3次；
S7：筛选
将通过步骤S6得到的牙齿粉末用过滤网进行筛选，筛选出所需要直径的牙齿颗粒，需要的牙齿颗粒的直径为750-1000um；
S8：消毒
将通过步骤S7的牙齿颗粒经风干装置进行风干处理，然后将经过风干的牙齿颗粒放置于紫外线消毒装置内消毒24小时后可使用。
一种脱细胞脱钙牙材料，该脱细胞脱钙牙材料为采用上述方法所得到的，采用此种材料能够降低今后骨移植材料的羟基磷灰石含量，该脱细胞脱钙牙材料以Ⅰ型胶原纤维为主，相对于Bio-Oss骨粉具有骨诱导作用。
参照图1所示，牙齿在5mol/l浓盐酸中不同时间点的脱钙情况，从图中可以直观的观测到在8h时牙齿破坏严重且脱钙不均匀。
参照图2所示，牙齿在4mol/l浓盐酸中不同时间点的脱钙情况，从图中可以直观的观测到在8h时牙齿破坏严重且脱钙不均匀。
参照图3所示，牙齿在3mol/l浓盐酸中不同时间点的脱钙情况，从图中可以直观的观测到在14h时牙齿脱钙明显缩小且脱钙不均匀。
参照图4所示，牙齿在2mol/l浓盐酸中不同时间点的脱钙情况，从图中可以直观的观测到在34h时牙齿脱钙完全且保留较为完整。
参照图5所示，脱钙后牙齿的HE染色、Masson染色及DAPI染色的情况，从图中可以直观的观测到脱钙后的牙齿含有大量的胶原纤维且其中的细胞核已经被破坏。
综上所述本发明不仅能够缩短脱钙时间，而且在尽量保存大量Ⅰ型胶原纤维的前提下，能够溶解作为免疫原的细胞核。而且省略了脱细胞的流程，相对于传统的脱钙牙本质的制备效率更高，采用此种方法脱钙后羟基磷灰石含量更低，以Ⅰ型胶原纤维为主，相对于Bio-Oss骨粉具有骨诱导作用，且采用本方法制备的过程中均选用对身体无毒害的试剂。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (7)

1.一种应用于牙齿的脱钙方法，其特征在于，包括如下步骤
S1：收集牙齿
收集临床上废弃的牙齿；
S2：浸泡固定
将通过步骤S1牙齿放置于双氧水中浸泡24小时，然后再将经过浸泡的牙齿放置于75％酒精中固定24小时；
S3：去除杂质
将通过步骤S2的牙齿通过去杂装置去除牙齿表面附着的牙龈及牙周膜；
S4：脱钙处理
将2mol/L的浓盐酸与通过步骤S3的牙齿按照10-15:1的质量比混合后放置于500ml丝口瓶内，然后将其整体放置于超声脱钙机内进行脱钙处理；
S5：清洗除酸处理
将通过步骤S4的牙齿首先采用蒸馏水进行冲洗，然后再将经过蒸馏水冲洗后的牙齿置入0.1-0.5mol/L氢氧化钠液内进行浸泡，最后再通过蒸馏水进行冲洗；
S6：搅拌粉碎处理
将通过步骤S5的牙齿放置于搅拌机内，随后加入液氮，然后进行搅拌粉碎处理；
S7：筛选
将通过步骤S6得到的牙齿粉末用过滤网进行筛选，筛选出所需要直径的牙齿颗粒；
S8：消毒
将通过步骤S7的牙齿颗粒经风干装置进行风干处理，然后将经过风干的牙齿颗粒放置于紫外线消毒装置进行消毒后可使用。
2.如权利要求1所述的一种应用于牙齿的脱钙方法，其特征在于：所述步骤S4的超声脱钙机内的温度为45摄氏度，脱钙强度为4，脱钙时间为30-48小时。
3.如权利要求1所述的一种应用于牙齿的脱钙方法，其特征在于：所述步骤S5中的牙齿首先蒸馏水冲洗1分钟，然后再将经过蒸馏水冲洗后的牙齿置入0.1-0.5mol/L氢氧化钠液浸泡10分钟，最后再通过蒸馏水冲洗10分钟。
4.如权利要求1所述的一种应用于牙齿的脱钙方法，其特征在于：所述步骤S6中的液氮每隔一分钟需要加入1次，且需加入3次。
5.如权利要求1所述的一种应用于牙齿的脱钙方法，其特征在于：所述步骤S7中所需要的牙齿颗粒的直径为750-1000um。
6.如权利要求1所述的一种应用于牙齿的脱钙方法，其特征在于：所述步骤S8中牙齿颗粒在紫外线消毒装置内消毒24小时后可使用。
7.一种采用如权利要求1-6任意一项所述的一种应用于牙齿的脱钙方法所得到的用于骨缺损修复的脱细胞脱钙牙材料，并最终可制成成骨支架相关材料。
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