CN221266771U - 一种牙周组织再生用复合细胞支架和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种牙周组织再生用复合细胞支架，包括三层结构；三层结构依次为第一细胞层、支架层和第二细胞层；第一细胞层和第二细胞层所用材料均为牙周膜成纤维细胞；支架层所用材料为脱细胞基质材料；脱细胞基质材料是小肠黏膜下层；支架层为多层小肠黏膜下层。本实用新型还公开了带有该牙周组织再生用复合细胞支架的试剂盒。本实用新型提供的牙周组织再生用复合细胞支架，机械性能良好，厚度适宜，可降解，能够使牙周膜成纤维细胞在脱细胞基质支架上大量增值，极大地提高了牙周组织再生修复率，缩短修复时间。
Description
技术领域
本实用新型属于细胞生物技术领域，特别涉及一种牙周组织再生用复合细胞支架和试剂盒。
背景技术
牙周病是最常见的口腔疾病之一，可造成牙齿支持组织的破坏，牙周附着的丧失，最终导致牙丧失。牙周病治疗的理想结果应是获得牙周支持组织包括牙槽骨、牙骨质及牙周膜的完全再生。目前对牙周病的治疗如生长因子的应用，自体或异体骨移植术及引导组织再生治疗术等，其原理均是在调动机体固有的潜在修复能力基础上促使牙周膜、牙骨质及牙槽骨再生。虽然引导组织再生术(GTR)给牙周组织再生治疗带来突破性进展并获得良好的临床疗效，但GTR仍不能使大面积牙槽骨缺损和老年牙周病患者的牙周组织达到有效地再生和重建，主要是由于牙周骨缺损区再生细胞来源受到限制或活力较低。组织工程技术有望解决这一难题。组织工程学的基本方法是将体外培养的高浓度的功能相关细胞种植于具有良好生物相容性的细胞外基质材料上，经过一段时间的培养，将这种细胞生物材料复合体植入机体病损部位以形成新的具有其原来特殊功能和形态的相应组织和器官，达到修复创伤和重建功能的目的。
牙周组织再生的基础是牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)。牙周膜成纤维细胞(Periodontal ligament fibroblasts，PDLFs)作为PDLCs中的主要细胞，不仅具有成纤维细胞的特性，还表达某些成骨细胞特性，在牙周组织再生过程中发挥着重要作用，是牙周新附着的主要细胞来源。
实用新型内容
为了提高牙周组织再生修复率，缩短修复时间，本实用新型提供牙周组织再生用复合细胞支架和带有该支架的试剂盒。
第一方面，本实用新型公开了一种牙周组织再生用复合细胞支架，包括三层结构；所述三层结构依次为第一细胞层、支架层和第二细胞层；所述第一细胞层和所述第二细胞层所用材料均为牙周膜成纤维细胞；所述支架层所用材料为脱细胞基质材料；所述脱细胞基质材料是小肠黏膜下层(SIS)；所述支架层为多层小肠黏膜下层。
在一些实施方案中，所述牙周膜成纤维细胞取自牙周膜组织。
在一些实施方案中，所述牙周膜组织取自正畸或阻生而拔除的牙体和牙周均健康的牙齿根部。
在一些实施方案中，所述第一细胞层和所述第二细胞层中的牙周膜成纤维细胞为第2代以后的细胞(含第2代细胞)。
在一些实施方案中，所述多层小肠黏膜下层为2-4层小肠黏膜下层。
在一些实施方案中，所述小肠黏膜下层为猪源性材料、牛源性材料、羊源性材料、马源性材料中的任意一种。
在一些实施方案中，所述牙周组织再生用复合细胞支架的形状为方形、梯形、圆形、椭圆形或其他各种规则或不规则形状的任意一种。
在一些实施方案中，所述多层小肠黏膜下层中的相邻SIS彼此连接且呈纵横交替叠加排列。SIS是具有方向性的，包括平行小肠方向和垂直小肠方向。纵横交替叠加排列指在二维坐标轴上，相邻SIS中的一层SIS的平行小肠方向平行于x轴水平放置，则另一层SIS的平行小肠方向就垂直于x轴水平放置，且彼此叠加。
在一些实施方案中，所述第一细胞层的厚度大于等于所述第二细胞层。
所述第一细胞层和所述第二细胞层的命名有利于区分指代不同的细胞层，不代表顺序先后。所述支架层的上表面上覆盖的可以是所述第一细胞层，也可以是所述第二细胞层。
在一些实施方式中，所述支架层和所述第一细胞层、所述第二细胞层的复合方式为向所述支架层接种牙周膜成纤维细胞，于细胞培养液中，37℃，5％CO2细胞培养箱培养2-3h获得。
第二方面，本实用新型还公开了一种牙周组织再生用试剂盒，含有如上所述的牙周组织再生用复合细胞支架。
与现有技术相比，本实用新型具有以下显著优点：本实用新型提供的牙周组织再生用复合细胞支架，机械性能良好，厚度适宜，可降解，能够使牙周膜成纤维细胞在脱细胞基质支架上大量增值，极大地提高了牙周组织再生修复率，缩短修复时间，有利于使大面积缺损的牙槽骨和老年牙周病患者的牙周组织达到有效地再生和重建。本实用新型将组织工程和GTR原理相结合，在充分利用GTR优点的同时提高了缺损区细胞数量及生物活性，为治疗牙周病提供了新的途径。
以下将结合附图对本实用新型的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本实用新型的目的、特征和效果。
附图说明
图1图1是本实用新型一种牙周组织再生用复合细胞支架三维结构示意图；
图2是本实用新型一种牙周组织再生用复合细胞支架剖面结构示意图；
图3是本实用新型的支架层的扫描电镜图。
其中附图标记如下：
第一细胞层1，支架层2，第二细胞层3。
具体实施方式
为了使实用新型实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，进一步阐述本实用新型。但本实用新型不仅限于以下实施的案例。
须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本实用新型可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本实用新型所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本实用新型所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
实施例1：
图1和图2示出了一种牙周组织再生用复合细胞支架，包括三层结构。该三层结构依次为第一细胞层、支架层和第二细胞层。第一细胞层和第二细胞层所用材料均为牙周膜成纤维细胞。牙周膜成纤维细胞取自牙周膜组织。牙周膜组织取自正畸或阻生而拔除的牙体和牙周均健康的牙齿根部。第一细胞层和第二细胞层中的牙周膜成纤维细胞为第2代以后的细胞。支架层所用材料为脱细胞基质材料；脱细胞基质材料是小肠黏膜下层(SIS)；支架层为多层小肠黏膜下层。多层小肠黏膜下层为2-4层小肠黏膜下层。小肠黏膜下层为猪源性材料。
支架层和第一细胞层、第二细胞层的复合方式为向支架层接种牙周膜成纤维细胞，于细胞培养液中，37℃，5％CO2细胞培养箱培养约2h获得。牙周组织再生用复合细胞支架的形状为方形。多层小肠黏膜下层中的相邻SIS彼此连接且呈纵横交替叠加排列。
第一细胞层、支架层和第二细胞层采用的均为现有技术中的已知材料，但将这些已知材料组合形成牙周组织再生用复合细胞支架是本实用新型首次提出。该支架有效提高了牙周组织再生修复率，缩短了修复时间，达到了十分良好的、预料不到的技术效果。
为了使得本实用新型公开的技术方案更完善，这里介绍该支架的各层的制备，具体如下：
A、支架层(即多层小肠黏膜下层)的制备：取材于猪SIS，经去细胞、去DNA、病毒灭活、上模具(每4层叠加)、冻干和辐照灭菌等加工过程后获得。多层小肠黏膜下层的制备具体可以参见CN109125812A中复合膜致密层的制备。
B、牙周膜成纤维细胞的原代培养：取因正畸或阻生而拔除的牙体和牙周均健康的牙齿，术前将拔牙器械及术区周围彻底消毒灭菌，牙拔出后即在无菌条件下立即放入装有无血清DMEM培养液(购自赛默飞)的小瓶中，在超净工作台内用含有抗生素(青霉素100μg/ml，链霉素100μg/ml)的磷酸盐缓冲液(pH＝7.2-7.4)反复冲洗，锐利刀片刮取牙根中1/3的牙周膜组织，磷酸盐缓冲液冲洗，1％胶原酶(从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备获得)37℃消化1小时，离心、弃上清，加入DMEM培养液(内含10％小牛血清，青霉素100μg/ml，链霉素100μg/ml)制成细胞悬液，接种于细胞培养板内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，待细胞贴壁后隔日换液。
C、牙周膜成纤维细胞的传代培养：倒置相差显微镜下观察，当原代牙周膜成纤维细胞铺满培养板底70％左右时，用胰蛋白酶及0.1％乙二胺四乙酸(EDTA)消化传代。利用不同类型细胞对消化酶敏感性不一致，来分离牙周膜成纤维细胞和上皮细胞。首先将原有培养液吸掉，磷酸盐缓冲液振洗两遍，加入约1ml的消化酶及0.1％EDTA混合液，置5％CO2孵箱5min左右，在倒置相差显微镜下观察见细胞胞质回缩，间隙增大，立即加入DMEM培养液终止消化，用弯头吸管反复吹打，形成细胞悬液，经细胞计数后，分别接种新培养板内。首次传代比例为1:1，待细胞铺满80％后，再以1:3传代。
D、牙周膜成纤维细胞与支架层复合培养：取步骤A中获得的支架层，紫外灯照射消毒后放入细胞培养板中，用细胞培养液浸泡1天后，加入6％的牛血清，放入37℃细胞培养箱中孵育12h，待用；取步骤C中传代培养的第2代牙周膜成纤维细胞，加入消化酶溶液消化后，收集消化液并加入DMEM培养液(内含10％小牛血清，青霉素100μg/ml，链霉素100μg/ml)终止消化，将消化液离心后收集牙周膜成纤维细胞，并用含10％牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，将细胞悬液稀释到3-5×105个/mL后多点接种至上述待用的支架层上下表面，将带有接种细胞的支架层的细胞培养板放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养2h，得到支架层上下表面均为细胞层的牙周组织再生用复合细胞支架。
实施例2：
采用扫描电子显微镜扫描实施例1中支架层的表面结构。结果显示：实施例1中支架层的三维结构完整，材料表面胶原纤维纵横交错排列，胶原纤维保留完好，未发现明显断裂纤维，有连通孔通入材料内部，如图3所示。
实施例3：
本实施例提供一种带有实施例1所述的支架的牙周组织再生用试剂盒。该试剂盒可能具有多种功能，其中一种功能是通过牙周组织再生用复合细胞支架来提高牙周组织再生修复率，缩短修复时间。
以上详细描述了本实用新型的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本实用新型的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本实用新型的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种牙周组织再生用复合细胞支架，其特征在于，包括三层结构；所述三层结构依次为第一细胞层、支架层和第二细胞层；所述第一细胞层和所述第二细胞层所用材料均为牙周膜成纤维细胞；所述支架层所用材料为脱细胞基质材料；所述脱细胞基质材料是小肠黏膜下层；所述支架层为多层小肠黏膜下层。
2.如权利要求1所述的牙周组织再生用复合细胞支架，其特征在于，所述牙周膜成纤维细胞取自牙周膜组织。
3.如权利要求2所述的牙周组织再生用复合细胞支架，其特征在于，所述牙周膜组织取自正畸或阻生而拔除的牙体和牙周均健康的牙齿根部。
4.如权利要求1所述的牙周组织再生用复合细胞支架，其特征在于，所述第一细胞层和所述第二细胞层中的牙周膜成纤维细胞为第2代以后的细胞。
5.如权利要求1所述的牙周组织再生用复合细胞支架，其特征在于，所述多层小肠黏膜下层为2-4层小肠黏膜下层。
6.如权利要求1所述的牙周组织再生用复合细胞支架，其特征在于，所述多层小肠黏膜下层为猪源性材料、牛源性材料、羊源性材料、马源性材料中的任意一种。
7.如权利要求1所述的牙周组织再生用复合细胞支架，其特征在于，所述牙周组织再生用复合细胞支架的形状为方形、梯形、圆形、椭圆形或其他各种规则或不规则形状的任意一种。
8.如权利要求1所述的牙周组织再生用复合细胞支架，其特征在于，所述多层小肠黏膜下层中的相邻SIS彼此连接且呈纵横交替叠加排列。
9.一种牙周组织再生用试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1-8任一项所述的牙周组织再生用复合细胞支架。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GR01 | Patent grant |