PT115689B

PT115689B - Hidrogéis produzidos a partir de membranas fetais humanas, processos e suas aplicações

Info

Publication number: PT115689B
Application number: PT11568919A
Authority: PT
Inventors: Catarina Nunes Da Silva Santos Sara; Filipe Colardelle Da Luz Mano João; De Almeida Custódio Catarina; Araújo Deus Inês
Original assignee: Univ Aveiro
Priority date: 2019-07-31
Filing date: 2019-07-31
Publication date: 2021-10-22
Also published as: PT115689A; WO2021019515A1; EP4003441A1; US20220273849A1

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO RELACIONA-SE COM O RAMO DA MEDICINA, NOMEADAMENTE COM O USO DA MATRIZ EXTRACELULAR (MEC) DE MEMBRANAS FETAIS HUMANAS (MFH) EM ESTRATÉGIAS DE MEDICINA REGENERATIVA, ENGENHARIA DE TECIDOS, COMO UM DISPOSITIVO PRO-ANGIOGÉNICO IMPLANTÁVEL, BIOMATERIAL DE SUBSTITUIÇÃO, SISTEMA PARA ENTREGA DE FÁRMACOS, PLATAFORMA PARA CULTURA TRIDIMENSIONAL DE CÉLULAS E DESENVOLVIMENTO DE MODELOS DE DOENÇA, ASSIM COMO OUTRAS APLICAÇÕES BIOMÉDICAS E BIOLÓGICAS.

Description

DESCRIÇÃO

HIDROGÉIS PRODUZIDOS A PARTIR DE MEMBRANAS FETAIS HUMANAS, PROCESSOS E SUAS APLICAÇÕES

CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção relaciona-se com o ramo da medicina, nomeadamente com o uso da matriz extracelular (MEC) de membranas fetais humanas (MFh) em estratégias de medicina regenerativa, engenharia de tecidos, como um dispositivo pro-angiogénico implantável, biomaterial de substituição, sistema para entrega de fármacos, plataforma para cultura tridimensional de células e desenvolvimento de modelos de doença, assim como outras aplicações biomédicas e biológicas.

ESTADO DA ARTE

[0002] Os hidrogéis são biomateriais muito versáteis capazes de mimetizar a MEC dos tecidos corporais, suportando assim o crescimento de células ex vivo e ín vítro. Por esta razão, estes materiais têm sido muito utilizados nas áreas da biomedicina, biotecnologia e farmacêutica, como plataformas para cultura bidimensional (2D) e tridimensional (3D) de células, matrizes injetáveis e de entrega, plataformas transplantáveis, dispositivos médicos, estruturas imprimiveis, entre outros.

[0003] Nos últimos anos, hidrogéis derivados de MEC surgiram com o intuito de recriar melhor os microambientes extracelulares, na tentativa de replicar a composição do tecido de origem. Estes biomateriais têm sido considerados superiores comparativamente a outros habitualmente utilizados, particularmente aqueles compostos apenas por um componente da MEC. No entantoos hidrogéis derivados de MEC desenvolvidos até ao momento continuam a ser maioritariamente de origem animal, o que levanta preocupações ao nivel da biocompatibilidade, imunogenicidade, transmissão de doenças e aprovação ética.

[0004] As MFh são responsáveis por proteger o feto e permitir a troca de nutrientes e produtos metabólicos durante a gravidez. Para além da sua função biológica, estas membranas têm também sido amplamente utilizadas na formulação de biomateriais devido à sua composição rica em colagénios e outras proteínas estruturais, assim como em fatores bioativos que lhe conferem propriedades antiinflamatórias, anti-bacterianas, não imunogénicas, anticicatrizantes, anti-adesivas e pro-epitelização.

[0005] Inicialmente, as MFh começaram a ser utilizadas ao nível clínico como curativos cirúrgicos, barreiras de proteção e excertos para reconstrução ou substituição de órgãos. Mais particularmente, elas têm sido muito utilizadas nas áreas da dermatologia e oftalmologia, na reparação de queimaduras e feridas, mas também na reconstrução cirúrgica da vagina e prevenção de adesões pós-operação. Mais recentemente, estas membranas têm sido amplamente exploradas como estruturas acelulares para engenharia de tecidos e medicina regenerativa, com eficiência comprovada na regeneração de vários tecidos (como por exemplo da cartilagem), tanto de forma isolada como combinadas com células.

[0006] No entanto, para muitas destas aplicações as MFh possuem propriedades mecânicas fracas e velocidades de degradação indesejáveis. Por esta razão, diferentes estratégias têm sido usadas com intuito de aumentar a sua estabilidade, incluindo a reticulação de MFh descelularizadas (MFhd) [1], estruturas de multicamadas compostas por laminados de MFh [2] materiais compósitos compostos por MFhd e fibras produzidas por eletrofiação [3], materiais compósitos compostos por MFhd e hidrogéis poliméricos [4] e hidrogéis de MEC derivada de MFh [5] . Apesar dos esforços, até ao momento não há relato de se ter desenvolvido um hidrogel completamente derivado de MFh que possua maior estabilidade e propriedades mecânicas ajustáveis de forma a poder ser usado tanto para propósitos médicos (ex. matrizes injetáveis) como de investigação (ex. cultura de células).

[0007] Assim, continua a haver a necessidade de se desenvolver um biomaterial que: (1) contenha as propriedades estruturais e mecânicas de um hidrogel (incluindo elevados conteúdos de água, porosidade e transporte de massa adequados, boa elasticidade, entre outras); (2) possua a composição e estrutura da matriz extracelular nativa, representando assim um microambiente mais apropriado para o crescimento de células ex vivo e ín vítro; (3) abranja as vantagens dos polímeros naturais, incluindo bioatividade e bio-/cito-compatibilidade, sem incluir as suas desvantagens, nomeadamente a fraca estabilidade e propriedades mecânicas.

[0008] Estes factos são discutidos por forma a ilustrar o problema técnico abordado pela presente invenção.

Descrição Geral

[0009] A presente invenção está relacionada com um processo inovador para obter extratos proteicos a partir de MFh de forma a produzir hidrogéis, processos e usos dos mesmos. A presente invenção relaciona-se ainda com a modificação das MFh para produzir hidrogéis com propriedades mecânicas e estabilidade controláveis com potencial para serem aplicados em medicina regenerativa, engenharia de tecidos, como um dispositivo pro-angiogénico implantável, biomaterial de substituição, sistema para entrega de fármacos, plataforma para cultura de células em 3D e desenvolvimento de modelos de doença, assim como outras aplicações biomédicas e biológicas. A maior vantagem destes materiais é a oportunidade de criar hidrogéis sem a necessidade de sínteses complicadas para bioconjugação. Para além disso, estes hidrogéis possuem menos riscos de reatividade cruzada, reação imune ou transmissão de doenças dadas as propriedades das MFh (como por exemplo, ser não imunogénica). 0 processo para obter hidrogéis a partir de MFh resume-se em três passos principais: (1) isolamento, descelularização e solubilização das MFh, (2) modificação das MFh solubilizadas e (3) formação dos hidrogéis por fotopolimerização.

[0010] A presente invenção está relacionada com a produção de hidrogéis bioactivos derivados de MFh. Esta invenção relaciona-se ainda com biomateriais baseados em hidrogéis com aplicação biológica, biomédica, biotecnológica e farmacêutica. Em particular, a invenção relaciona-se com dispositivos médicos/implantáveis, plataformas para cultura de células, matrizes para entrega, sistemas injetáveis e estruturas 3D imprimiveis.

[0011] A presente invenção está relacionada com materiais á base de hidrogel compostos por uma matriz polimérica contendo componentes da MEC, nomeadamente MEC derivada de MFh (MFh-MEC), considerada bioativa por conter elevados conteúdos de componentes como o colagénio, laminina ou fibronectina.

[0012] Em particular, a presente tecnologia está relacionada com a modificação de materiais derivados de MFhMEC com um agente químico que permite posterior reticulação química ou física para criar hidrogéis para uso biomédico, biotecnológico e farmacêutico. A presente tecnologia relaciona-se com um processo inovador de produção de hidrogéis reticulados derivados de MFh-MEC, que demonstram ter maior estabilidade comparativamente a hidrogéis e selantes produzidos á base de MEC, colagénio e membrana basal do estado da arte. Os hidrogéis produzidos pelos métodos da presente invenção, providenciam o suporte estrutural e bioquímico necessário ao crescimento celular, são preferencialmente tridimensionais e particularmente adequados para cultura de células e entrega de células/fármacos.

[0013] A presente tecnologia está relacionada com hidrogéis à base de MFh para aplicação em medicina regenerativa e engenharia de tecidos. Mais particularmente, a presente invenção está relacionada com dispositivos médicos/implantáveis, plataformas para cultura de células, matrizes para entrega, sistemas injetáveis e estruturas tridimensionais imprimiveis.

[0014] A presente tecnologia refere-se a um hidrogel composto por uma matriz polimérica contendo componentes da MEC. Mais particularmente, a presente tecnologia está relacionada com a modificação de proteínas derivadas da MEC de MFh com um agente químico que permite posterior reticulação química ou física para criar hidrogéis. Os hidrogéis produzidos pelos métodos da presente invenção providenciam o suporte estrutural e bioquímico necessário ao crescimento celular e são preferencialmente tridimensionais, particularmente adequados para cultura de células e entrega de células/fármacos.

[0015] A presente tecnologia refere-se a uma composição contendo componentes derivados das MFh funcionalizados por pelo menos uma fração polimerizável e métodos para o seu uso. Numa realização, a composição descrita é composta por proteínas da MEC, citosinas, fatores de crescimento e outros componentes que promovem a adesão e crescimento celulares. A presente tecnologia promove ainda a regeneração e restabelecimento de tecidos, contendo bio- e citocompatibilidade.

[0016] Um aspeto da presente invenção está relacionado com um hidrogel contendo:

Um extrato proteico de MFhd;

Uma fração polimerizável ou montável,

E em que a fração polimerizável ou montável está ligada ao extrato de proteína

E pelo menos um fotoiniciador;

[0017] Numa realização, a fração polimerizável ou montável é selecionada entre metacrilatos, etacrilatos, acrilatos, acrilo, tióis, acrilamidas, aldeídos, azidas, grupos reativos amina, oligossacarídeos cíclicos ou combinações destes.

[0018] Numa realização, o rácio de extrato de proteína para fração polimerizável ou montável varia desde 10:lxl0~⁵(v/v) até 10 :1x1o-¹, mais particularmente entre 10:lxl0~³ e 10 : 1x10-2 (v/v) .

[0019] Numa realização, a MFhd é selecionada entre: membrana amniótica, membrana coriónica ou combinação das mesmas;

[0020] Numa realização, a composição é composta por pelo menos duas frações polimerizáveis ou montáveis diferentes;

[0021] Numa realização, a concentração do extrato de proteína no hidrogel varia entre 1-15% w/v, preferencialmente entre 1-5% w/v; mais preferencialmente entre 1-2.5% w/v.

[0022] Numa realização, a composição pode ainda conter materiais inorgânicos selecionados entre fosfato de cálcio, partículas magnéticas, nanopartícuias metálicas, partículas de biovidro, fibras, ou combinações das mesmas.

[0023] Numa realização, a composição pode também conter quitosano, alginato, laminarina, acido hialurónico, polietilenoglicol, ou combinações das mesmas;

[0024] Outro aspeto da presente divulgação está relacionado com o uso do hidrogel aqui descritos para a formulação de micropartícuias, pós, cápsulas, fibras, membranas, discos, microgeis com geometrias controláveis, esponjas, liofilizados, órgãos-em-chips, estruturas imprimíveis, pomadas, malhas, espumas, scaffolds ou matrizes para entrega.

[0025] Outro aspeto da presente divulgação está relacionado com o uso do hidrogel aqui descritos para a formulação de dispositivos ou sistemas de lab-on-a-chip, substratos para microscópio ou mricroarranjos, pratos para cultura de células e tecidos, placas de micropoços, sistemas de microfluídica ou amostragem e micropartícuias.

[0026] Outro aspeto da presente divulgação está relacionado com o uso do hidrogel aqui descritos para a formulação de substratos;

[0027] Outro aspeto da presente divulgação relaciona-se com o uso do hidrogel aqui descritos em placas para cultura de células e tecidos;

[0028] Outro aspeto da presente divulgação está relacionado com o uso do hidrogel descritos para a formulação de matrizes de entrega, em que esta matriz está carregada com agentes biologicamente ativos ou agentes terapêuticos, incluindo células, células estaminais, proteínas, vacinas, biomoléculas, marcadores de diagnostico, sondas ou combinações das mesmas.

[0029] Outro aspeto da presente divulgação está relacionado com o uso do hidrogel aqui descritos para fins medicinais. Preferencialmente estudos farmacêuticos, processos biotecnológicos, ou estudos ex vivo e in vitro.

[0030] Mais particularmente, o uso do hidrogel aqui descritos em medicina regenerativa, engenharia de tecidos, como dispositivos implantáveis pro-angiogénicos, biomateriais de substituição, entrega de fármacos, plataformas para cultura tridimensional de células e modelos de doença, assim como outras aplicações biomédicas e biológicas.

[0031] Inclui ainda o uso do hidrogel aqui descritos para cultura de células, encapsulamento de células vivas, entrega de fármacos e/ou células, regeneração celular, desenvolvimento de órgãos e crescimento de tecidos.

[0032] Outro aspeto da presente divulgação está relacionado com o método de obtenção do extrato proteico funcionalizado a partir de MFhd aqui descrito, composto pelos seguintes passos:

lavar as MFh isoladas;

descelularizar as MFh lavadas;

solubilizar as MFhd;

congelar, liofilizar e/ou moer as MFh solubilizadas;

funcionalizar o extrato proteico com pelo menos uma fração polimerizável ou montável de forma a obter um extrato com reatividade reforçada.

[0033] Numa realização, o método é ainda composto por um passo de armazenamento do extrato proteico funcionalizado a temperaturas entre -80°C e 4°C.

[0034] Numa realização, o método é ainda composto pelos seguintes passos:

Conjugação com um fotoiniciador, em particular um fotoiniciador radical livre selecionado entre: (2-hidroxi4'-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona), acetofenona, benzil, benzofenona, 1-hidroxiciclohexil fenil cetona, entre outros.

Modificação química do extrato proteico de MFh com ligações biodegradáveis, que podem incluir, por exemplo, ligações ester, ligações amida, ligações de cicloadição azida-alceno, ligações tiol-acrilato, ligações uretano e/ou ligações tiolmetacrilato, e combinações das mesmas.

[0035] Numa realização, o método é composto por um passo de esterilização terminal do extrato proteico de MFh utilizando filtração; reações químicas, preferencialmente com acido peracético, óxido de etileno ou dióxido de carbono supercritico; irradiação, preferencialmente com luz ultravioleta (UV) ou radiação gama.

[0036] Numa realização o passo de descelularização é executado recorrendo a detergentes, métodos enzimáticos, químicos ou físicos ou combinações dos mesmos, de forma a obter uma composição livre de células e, consequentemente, mais bio- e cito-compatível.

[0037] Numa realização, o passo de solubilização é executado via digestão enzimática, particularmente usando pepsina a um pH baixo, mantendo a bioactividade nativa da enzima.

[0038] Numa realização, o passo de moagem reduz a composição a pó.

[0039] Numa realização, a reticulação é realizada via reticulação química, ligações não covalentes, tais como complexos guest-host ou coordenação de metais, ou reticulado enzimaticamente via transglutaminase, ou combinações destes

[0040] De acordo com a presente divulgação, as MFh podem ser modificadas para aumentar a sua reatividade química. A fração polimerizável da presente divulgação deve ser selecionada, por exemplo, entre metacrilatos, etacrilatos, acrilatos, tióis, acrilamidas, aldeídos, azidas, grupos reativos amina ou oligossacarídeos cíclicos e combinações destes. Numa realização a polimerização da presente composição contendo o precursor modificado de MFh ocorre via reticulação química, ligações não covalentes, tais como complexos guest-host ou coordenação de metais, ou reticulado enzimaticamente via transglutaminase, ou combinações destes, usando agentes de reticulação apropriados.

[0041] Os hidrogéis derivados de MFh descritos na presente divulgação apresentam propriedades mecânicas expectavelmente melhores do que as dos hidrogéis nãomodificados anteriormente descritos no estado da arte e estas propriedades podem ser facilmente ajustadas de acordo com o propósito final. Para além disso, o hidrogel aqui descrito possui ainda uma maior estabilidade contra degradação enzimática e proteolítica quando comparado com composições semelhantes não modificadas. Numa realização, a presente tecnologia, contendo propriedades mecânicas ajustáveis, pode ser usada para controlar respostas biológicas, fazendo-se variar a composição, metodologia e/ou densidade de reticulação.

[0042] Num aspeto em particular, a presente divulgação está relacionada com um hidrogel à base de componentes das MFhd reticulado química ou fisicamente com grupos funcionais, formado via ligações não covalentes, tais como complexos guest-host ou coordenação de metais, reticulado enzimaticamente, ou combinações destes, usando agentes de reticulação adequados.

[0043] Noutro aspeto, a presente divulgação refere-se a um hidrogel bioativo para cultura e encapsulamento de células vivas;

[0044] Ainda em outro aspeto, a presente divulgação refere-se a hidrogéis tridimensionais imprimíveis e sistemas injetáveis compostos pelo hidrogel descrito na presente invenção.

[0045] Ainda em outro aspeto, a presente divulgação refere-se ao uso do hidrogel descrito na presente invenção em sistemas de lab-on-a-chip, substratos para microscópio ou mricroarranjos, pratos para cultura de células e tecidos, placas de micropoços, sistemas de microfluidica ou amostragem e micropartícuias.

[0046] Numa realização, a composição é um hidrogel. Numa realização, a composição é um pó. Numa realização, a composição é uma esponja. Numa realização, a composição é um liofilizado. Numa realização, a composição é um scaffold.

[0047] A presente tecnologia pode ser usada como um biomaterial, em particular pode ser usada como um biomaterial em medicina, estudos farmacêuticos, processos biotecnológicos ou estudos ex vivo e ín vítro. Em algumas ocasiões, a referida composição é configurada como uma plataforma para cultura de células ou matriz para encapsulamento de células para fins comerciais ou de investigação. Em algumas ocasiões, a referida composição é configurada como uma matriz de entrega, que pode ser carregada com agentes biologicamente ativos ou terapêuticos, incluindo, mas não se limitando a, células, células estaminais, proteínas, vacinas, biomoléculas, marcados de diagnostico, sondas, ou combinações destes. Em algumas ocasiões, a referida composição é configurada como um sistema injetável para engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Em algumas ocasiões, a referida composição é configurada como um scaffold imprimivel. Em algumas ocasiões, a referida composição é configurada como uma estrutura implantável. Em algumas ocasiões, a referida composição é configurada como um sistema de lab-on-a-chip ou de microfluídica. Em algumas ocasiões, a referida composição é configurada como nanopartícuias, micropartícuias, microgéis, cápsulas, fibras, membranas, discos, pensos, entre outros.

[0048] Numa realização, a composição composta por componentes das MFh é descelularizada. A descelularização é obtida utilizando detergentes, métodos enzimáticos, químicos, ou físicos ou combinações dos mesmos, tornando a composição livre de células e aumentando a sua bio- e citocompatibilídade.

[0049] Numa realização, a composição composta por componentes das MFh é solubilizada. A solubilização é obtida via digestão enzimática com, por exemplo, pepsina a um pH baixo, de forma a mantes a bioactividade natural da enzima. Em algumas ocasiões, a composição já solubilizada contendo componentes das MFh pode ser congelada, liofilizada ou desfeita a pó.

[0050] Numa realização, a composição composta por componentes das MFh é modificada quimicamente. Em algumas ocasiões, a modificação química da presente composição é composta por uma fração fotoreativa (por exemplo, grupos metacrilato ou acrilo) e polimeriza quando exposta a luz UV. Em algumas ocasiões, a composição composta por componentes das MFh conjugados com frações fotoreativas é posteriormente combinada com um fotoiniciador, em particular um fotoiniciador radical livre, selecionado entre: (2-hidroxi4'-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona), acetofenona, benzil, benzofenona, 1-hidroxiciclohexil fenil cetona, entre outros. Em algumas ocasiões, a modificação química da presente composição é composta por ligações biodegradáveis que podem incluir, por exemplo, ligações ester, ligações amida, ligação de cicloadição azida-alceno, ligações tiolacrílato, ligações uretano e/ou ligações tiol-metacrilato, e combinações das mesmas.

[0051] Numa realização, a composição composta por componentes das MFh é submetida a esterilização terminal. Em algumas ocasiões, a presente composição está na forma solúvel sendo esterilizada por filtração ou reação química. Em algumas ocasiões, a presente composição está no formato sólido e é esterilizada por irradiação (por exemplo, com luz UV ou radiação gama) ou reação química (por exemplo, com oxido de etileno ou dióxido de carbono supercrítico) .

[0052] Numa realização, a composição é composta por precursores de MFhd movdificados a uma concentração entre 1% e 15% (w/V), preferencialmente 1%, 2.5% ou 5% (w/V).

[0053] Numa realização, a composição é composta por precursores de MFhd modificados combinados com outros polímeros de base natural ou sintética, tais como quitosano, alginato, laminarina, ácido hialurónico ou polietileno glicol (PEG). Numa realização, a composição é composta por precursores de MFhd e modificadas combinados com materiais inorgânicos tais como fosfato de cálcio, nanoparticuias de cálcio, partículas magnéticas ou fibras.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0054] Figura 1 - Processo de fabrico dos hidrogéis derivados de MFhd. Após o isolamento, descelularização, digestão e modificação, os hidrogéis derivados de MFhd são formados por fotopolimerização com luz UV.

[0055] Figura 2 - Marcação com DAPI das MFhd após descelularização.

[0056] Figura 3 - Hidrogéis derivados de MFhd (1%, 2.5% e 5% (w/v)) formados após modificação das MFhd com grupos fotoresponsivos e exposição à luz UV.

[0057] Figura 4 - (A) Imagens de Live/Dead de células estaminais humanas derivadas do tecido adiposo (hASCs) e células endoteliais humanas da veia umbilical (HUVECs) semeadas no topo do hidrogel derivado de MFhd após 1 e 7 dias de cultura. (B) Marcação DAPI/Faloidina de hASCs e HUVECs aos 7 dias de cultura.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0058] A presente divulgação refere-se a uma composição composta por componentes derivados de MFh, métodos para o seu processamento e usos da mesma. A presente divulgação inclui ainda métodos para a funcionalização da composição acima descrita e usos da mesma.

[0059] Numa realização, as MFh têm de ser isoladas da placenta. As MFh isoladas são posteriormente processadas para remover quaisquer coágulos de sangue e vasos sanguíneos presentes. A limpeza da referida amostra pode incluir o uso de, por exemplo, água destilada ou solução salina. As MFh são cortadas em pequenos pedaços de forma a facilitar o processo seguinte.

[0060] Numa realização, as MFh são descelularizadas. O método de descelularização é composto pelos seguintes passos: tratar a amostra com um detergente iónico (por exemplo, dodecil sulfato de sódio) e um detergente não iónico (por exemplo, Triton X-100) para promover a disrupção das membranas celulares. Incubar a amostra com uma solução de nucleases, contendo um tampão de reação, RNase e ADNse, para remover detritos nucleares. A composição que resulta deste processo contem componentes das MFh, nomeadamente componentes da MEC, livres de células e detritos celulares. A eficiência deste processo por ser verificada por quantificação do ácido desoxirribonucleico (ADN) presente por miligrama de MEC (peso seco), quantificação do numero de pares de bases dos fragmentos de ADN ou por visualização do material nuclear presente no tecido através de colorações histológicas, tais como hematoxilina e eosina (H&E) ou 4^T,6^T— diamino-2-fenil-indol (DAPI) (Figure 4).

[0061] Numa realização, a MFhd é solubilizada. Em algumas ocasiões, a MFhd pode ser congelada, liofilizada ou moida previamente à sua solubilização. O método de solubilização é composto pela incubação da amostra com uma solução enzimática. Em algumas ocasiões, a solução enzimática por conter pepsina a um pH baixo, obtido pela adição de, por exemplo, ácido clorídrico (HC1). Em algumas ocasiões, a amostra solubilizada é liofilizada ou re-liofilizada.

[0062] Numa realização, a amostra resultante é posteriormente armazenada a baixas temperaturas, preferencialmente entre 4°C e -80°C.

[0063] Numa realização, a composição da presente divulgação é composta por uma matriz polimérica contendo grupos amina. Em algumas ocasiões, é adicionado anidrido metacrilico que reage com estes grupos das proteínas, adicionando grupos acrilato pendentes. Esta reação ocorre rapidamente e com elevada eficiência. Esta reação é executada a temperaturas controladas, em particular a 18-25°C. Deste processo resulta um biomaterial fotopolimerizável composto por precursores fotoreativos.

[0064] Numa realização, as propriedades físico-químicas e biológicas da composição contendo componentes derivados de MFh podem ser alteradas de acordo com a aplicação a que se destinam, fazendo variar o rácio MFhd:anidrido metacrilico Estas propriedades podem ainda ser controladas através do tempo de irradiação e concentração de precursor fotoreativo.

[0065] Numa realização o grau de metacrilação pode ser verificado utilizando o seguinte método ou métodos: espetrometria de massa, análise com fluoraldeído ou método de Habeeb.

[0066] Numa realização, a composição aqui descrita é um hidrogel ou um biomaterial à base de hidrogel. Em algumas ocasiões, as propriedades físico-químicas desta composição podem ser alteradas utilizando os métodos descritos anteriormente. As propriedades físico-químicas controláveis incluem, por exemplo, robustez, rigidez, dureza, durabilidade, degradabilidade, transporte de massa e absorção de água.

[0067] Numa realização, diferentes rácios de MFhd para anidrido metacrilico foram testados, incluindo: 10:lxl0^-1(v/v), 10:lxl0~³ (v/v) and 10:lxl0~⁵ (v/v). Diferentes concentrações de precursor fotoreativo foram também testadas para cada um destes rácios, incluindo: 1%, 2.5% e 5%. Por último a composição foi polimerizada por irradiação com luz UC durante 60 segundos para que se formassem os hidrogéis.

[0068] Numa realização, o polímero é reticulado por ação da luz UV na presença de um fotoiniciador (2-hidroxi-4'-(2hidroxietoxi)-2-metíIpropíofenona) à temperatura ambiente (Figura 4).

[0069] Numa realização, a citocompatibilidade e capacidade dos hidrogéis aqui descritos suportarem a cultura de células foi acessada através da cultura in vitro de células estaminais humanas do tecido adiposo (ASCs) e células endoteliais humanas da veia do cordão umbilical (HUVECs).Numa realização, a viabilidade, proliferação e morfologia das células cultivadas no topo dos hidrogéis foram avaliadas. Para tal, o hidrogel foi pipetado para micropoços e polimerizado com luz UV durante 60 segundos. As células foram cultivadas no topo dos hidrogéis e incubadas a 37°C em meio de cultura por diferentes períodos de tempo, preferencialmente períodos de 24 horas, 3 dias e 7 dias. A viabilidade celular foi avaliada usando calceína e iodeto de propídeo (Figuras 4) . A proliferação e morfologia das células foi avaliada com DAPI/faloidina após fixação do hidrogel (Figuras 4) . Estes ensaios demonstraram que os hidrogéis aqui descritos são capazes de suportar a adesão e proliferação de células in vitro durante vários dias.

[0070] A presente invenção refere-se a um scaffold produzido a partir de MFhd que mantém grande parte da composição do tecido de origem, providenciando assim um microambiente apropriado à adesão e crescimento celulares. O que o difere de outros substratos derivados de MEC é a sua elevada estabilidade e o facto de ter propriedades mecânicas ajustáveis, que o tornam mais versátil para aplicação em diferentes áreas. Para além disso, a presente tecnologia pode ainda ser combinada com outros materiais ou fatores bioativos de forma a favorecer as suas propriedades bioquímicas e mecânicas, aumentando também a gama de aplicações possíveis, por exemplo, como uma matriz de entrega ou material transplantável.

[0071] Numa realização, que não deve ser vista como limitante, a presente invenção adquire preferencialmente a forma de um hidrogel que gelifica quando exposto a luz UV. O hidrogel descrito pode ser aplicado a diversos propósitos. Em algumas ocasiões, pode ser usado como uma plataforma para cultura de células. Neste caso, o hidrogel pode ser primeiramente adsorvido numa superfície apropriada (como por exemplo, um prato de cultura de células ou placa de micropoços), polimerizado e posteriormente semeado com as células de interesse ou, alternativamente, pode ser primeiramente combinado com as células, adsorvido na superfície e só posteriormente polimerizado com luz UV. Estas duas abordagens podem ser utilizadas em diferentes áreas para estudos in vitro (por exemplo, na indústria farmacêutica, em estudos biológicos, em engenharia de tecidos ou em biotecnologia) ou comercialmente (por exemplo, para expansão de células ou produção de fatores de crescimento). Em algumas ocasiões, a presente invenção pode ainda ser utilizada como um revestimento. Para tal, o hidrogel por ser aplicado sob a forma líquida e posteriormente polimerizado com luz UV. Esta técnica permite revestir, por exemplo, plataforma para cultura de células, scaffolds ou dispositivos médicos de forma a aumentar a sua biocompatibilidade e desempenho. Em algumas ocasiões, a presente invenção pode também ser usada como uma matriz de entrega. Para tal, o hidrogel pode ser carregado via ligações covalentes, não-covalentes ou por aprisionamento de células ou moléculas terapêuticas, que são posteriormente entregues em locais específicos como, por exemplo, tecidos danificados. Em particular, o hidrogel pode ser carregado com células estaminais, células especificas, péptidos, proteínas, vacinas, anticorpos, fatores de crescimento, fármacos ou ADN, entre outros.

[0072] Em algumas ocasiões, a presente invenção pode ser usada como um sistema injetável. Os sistemas injetáveis podem ser usados sozinhos ou combinados com células ou moléculas terapêuticas. Para tal, o hidrogel deve ser injetado no paciente no local da lesão ou defeito e polimerizado ín sítu. Em alternativa, o hidrogel pode ser injetado como uma biotínta ou componente de uma bio-tinta recorrendo a uma bioimpressora, ou instrumento semelhante, para produzir construções com estruturas controladas.

[0073] Em algumas ocasiões, a presente invenção pode também ser usada como uma estrutura implantável ou adesiva. Para tal, o hidrogel deve adquirir a configuração de, por exemplo, micropartícuias, cápsulas, fibras, membranas, discos, pensos, entre outros. Em qualquer uma destas configurações, o hidrogel pode ser combinado com outros materiais, células ou moléculas terapêuticas.

[0074] Em algumas ocasiões, a presente invenção pode ser incorporada em sistema de microfluídica, em placas de microarranjos ou plataformas de lab-on-a-chip.

[0075] O termo composto quando usado neste documento destina-se a indicar a presença de características, totalidade, etapas, componentes declarados, mas não impede a presença ou adição de uma ou mais características, totalidade, etapas, componentes ou grupos dos mesmos.

[0076] Será apreciado por aqueles com conhecimento geral na área que, salvo indicação em contrário, a sequência particular de passos descritos é apenas ilustrativa e pode ser variada sem se afastar da divulgação. Assim, salvo indicação em contrário, as etapas descritas estão desordenadas o que significam que, quando possível, as etapas podem ser executadas em qualquer ordem conveniente ou desejável.

[0077] A presente invenção não deve ser vista, de maneira alguma, restringida às realizações descritas sendo que uma pessoa com conhecimentos gerais na área poderá prever mais possibilidades para modificações das mesmas.

[0078] As realizações descritas anteriormente são combináveis.

[0079] As seguintes reivindicações estabelecem ainda realizações particulares da presente invenção.

Referências:

1. Huang, G., et al., Accelerated expansion of epidermal keratinocyte and improved dermal reconstruction achieved by engineered amniotic membrane. Cell Transplant, 2013. 22(10): p. 1831-44.

2. Hariya, T., et al. , Transparent, resilient human amniotic membrane laminates for corneai transplantation. Biomaterials, 2016. 101: p. 76-85.

3. AMAdowicz, J., et al., New Amniotic Membrane Based Biocomposite for Future Application in Reconstructive Urology. PLoS One, 2016. 11(1): p. e0146012.

4. Murphy, S.V., et al. , Solubilized Amnion Membrane Hyaluronic Acid Hydrogel Accelerates Full-Thickness Wound Healing. Stem Cells Transi Med, 2017. 6(11) : p. 20202032 .

5. Ryzhuk, V., et al. , Human amnion extracellular matrix derived bioactive hydrogel for cell delivery and tissue engineering. Materials Science and Engineering C, 2018. 85(December 2017): p. 191-202.

Claims

RE IVINDICAÇÕES

1. Hidrogel caracterizado por compreender:

um extrato proteico de membranas fetais humanas descelularizadas (MFhd);

uma fração polimerizável ou montável;

em que a fração polimerizável ou montável está ligada ao extrato proteico;

e pelo menos um fotoiniciador;

em que a fração polimerizável ou montável é metacrilato, acrilato ou combinações destes; e em que o rácio de extrato proteico:fração polimerizável ou montável varia entre 10:lxl0⁵ (v/v) e lOilxlO¹, particularmente entre 10:lxl0³ e 10:lxl0² (v/v) .
2. Hidrogel de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a MFhd é selecionada entre: membrana amniótica, membrana coriónica ou combinações das mesmas.
3. Hidrogel de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores que compreende pelo menos duas frações polimerizáveis ou montáveis diferentes.
4. Hidrogel de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a concentração do extrato proteico varia entre 1-15% (m/v), preferencialmente entre 1-5% (m/v); mais preferencialmente 1-2.5% (m/v).
5. Hidrogel de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores compreendendo ainda materiais inorgânicos selecionados entre: fosfato de cálcio, partículas magnéticas, nanopartícuias metálicas, partículas de biovidro, fibras ou combinações das mesmas.
6. Hidrogel de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores compreendendo ainda quitosano, alginato, laminarina, acido hialurónico, polietileno glicol, ou combinações das mesmas.
7. Microparticulas, pós, cápsulas, fibras, membranas, discos, microgéis com geometrias controláveis, esponjas, liofilizados, órgãos-em-chips, estruturas imprimiveis, pomadas, malhas, espumas, scaffolds ou matrizes de entrega caracterizados por compreender o hidrogel descrito em qualquer uma das reivindicações anteriores.
8. Dispositivos ou sistema, lab-on-chip, substratos para microscópio ou para sistemas de microarranjos, placas de micropoços ou sistemas de microfluidica caracterizado por compreender o hidrogel descrito em qualquer uma das reivindicações anteriores.
9. Substrato caracterizado por compreender o hidrogel descrito em qualquer uma das reivindicações anteriores.
10. Pratos/placas para cultura de células e tecidos caracterizados por compreender o hidrogel descrito em qualquer uma das reivindicações anteriores.
11. Matriz de entrega caracterizadas por compreender o hidrogel descrito em qualquer uma das reivindicações anteriores em que esta matriz é carregada com um agente biológico ativo ou agente terapêutico, incluindo células, células estaminais, proteínas, vacinas, biomoléculas, marcadores de diagnostico, sondas ou combinações destes.
12. Hidrogel descrito em qualquer uma das reivindicações anteriores para uso em medicina.
13. Hidrogel descrito em qualquer uma das reivindicações anteriores para uso em estudos farmacêuticos, processos biotecnológicos ou estudos ex vivo e ín vítro.
14. Hidrogel descrito em qualquer uma das reivindicações anteriores para uso em medicina regenerativa, engenharia de tecidos, como um dispositivo proangiogénico implantável, um biomaterial de substituição, para entrega de fármacos, cultura tridimensional de células ou modelos de doença, assim como para aplicações biomédicas ou biológicas.
15. Hidrogel descrito em qualquer uma das reivindicações anteriores para uso em cultura de células, encapsulamento de células vivas, entrega de fármacos, entrega de células, regeneração células, desenvolvimento de órgãos ou crescimento de tecidos.
16. Método para obter um hidrogel de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores compostas pelos seguintes passos:

lavar uma membrana fetal previamente isolada; descelularizar a membrana lavada;

solubilizar a membrana descelularizada, obtendo-se um extrato proteico;

congelar, liofilizar e/ou moer a membrana solubilizada; ligar ao extrato proteico pelo menos uma fração polimerizável ou montável de forma a obter um extrato mais reativo, em que a fração polimerizável ou montável é metacrilato;

conjugar com um fotoiniciador, em particular um fotoiniciador radical-livre, selecionado entre: (2hidroxi-4'-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona), acetofenona, benzil, benzofenona, 1-hidroxiciclohexil fenil cetona, entre outros.
17. Método de acordo com a reivindicação anterior compreendendo ainda um passo de armazenamento do extrato proteico funcionalizado a temperaturas entre 80°C e 4°C.
18. Método de acordo com as reivindicações anteriores compreendendo a modificação química do extrato proteico derivado da MFh com ligações biodegradáveis, mais particularmente, ligações ester, ligações amida, ligações de cicloadição azida-alceno, ligações tiol-acrilato, ligações uretano e/ou ligações tiol-metacrilato, e combinações das mesmas.
19. Método de acordo com as reivindicações anteriores compreendendo ainda um passo de esterilização terminal do extrato proteico derivado da MFh através de filtração ou reação química, preferencialmente com ácido peracético, oxido de etileno ou dióxido de carbono supercritico; irradiação, preferencialmente com luz ultra-violeta (UV) ou radiação gama.
20. Método de acordo com as reivindicações anteriores em que o passo de descelularização é realizado com recurso a detergentes, métodos enzimáticos, químicos ou físicos ou combinações destes, de forma a obter um extrato livre de células e com bio- e citocompatibilidade melhorada.
21. Método de acordo com as reivindicações anteriores em que o passo de solubilização é realizado por digestão enzimática, mais particularmente com recurso a pepsina e baixo pH que permite manter a bioatividade nativa da enzima.
22. Método de acordo com as reivindicações anteriores em que o passo de moagem consiste em reduzir o extrato proteico derivado da MFh a pó.
23. Método de acordo com as reivindicações anteriores em que o passo de reticulação é realizado via reticulação química, ligações não-covalentes, incluindo complexos guest-host ou coordenação de metais, ou reticulado enzimaticamente via transglutaminase, ou combinações destes.