CN108543112B

CN108543112B - 具有促进细胞增殖活性的丝胶-琼脂糖复合凝胶的制备方法及其产品

Info

Publication number: CN108543112B
Application number: CN201810292819.8A
Authority: CN
Inventors: 夏庆友; 王元成; 王峰; 田弛; 赵萍
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2018-03-30
Filing date: 2018-03-30
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2038-03-30
Also published as: CN108543112A

Abstract

本发明涉及一种具有促进细胞增殖活性的丝胶‑琼脂糖复合凝胶的制备方法及其产品，利用转人FGF1基因与人FGF2基因蚕丝提取中丝胶蛋白的提取含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白，得含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液，然后经复性后得复性的含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液，再与琼脂糖溶液混合，注模，成型，得具有促进细胞增殖活性的丝胶‑琼脂糖复合凝胶，制得的复合凝胶稳定性好，能够较好的支持NIH3T3细胞的增殖与生长，且细胞毒性低，在组织工程学中具有广阔的应用前景。

Description

具有促进细胞增殖活性的丝胶-琼脂糖复合凝胶的制备方法及其产品

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及具有促进细胞增殖活性的丝胶-琼脂糖复合凝胶的制备方法，还涉及由该方法制得的产品。

背景技术

蚕丝主要由内层的丝素与外层的丝胶组成，含量分别为75％与25％。长期以来，缫丝工业产生的大量丝胶蛋白被视为“废弃物”而排放掉，产生了严重的环境安全隐患。随着研究的深入，研究人员发现丝胶蛋白具有抗氧化、保湿、促进细胞增殖与加速伤口愈合的功效，是潜在生物材料原料。丝胶蛋白在经过化学交联、物理共混、诱导等多种方法交联后能够制备出如丝胶药膏、丝胶-明胶膜、丝胶-羧甲基纤维素基、丝胶聚(乙烯醇)支架等丝胶复合生物材料，体现出巨大的应用价值和潜力。在此基础之上，研究人员也尝试过将功能性蛋白如生长因子等与丝胶蛋白混合后，制备具有功能性的丝胶复合生物材料。例如，Zhang等将神经生长因子(NGF)加入到丝胶-壳聚糖复合支架生物材料中用于缓解和治疗慢性神经嵌压症，并取得一定的疗效；Liu等将葡聚糖与丝胶混合制成药载用于治疗恶性黑色素瘤。然而，受限于传统蚕丝生物材料繁杂的制备流程，功能性单一，以及自身还存在的诸如细胞粘附力弱等缺陷，即使通过后期添加功能性物质可以得到改善，但是功能物质的来源和功效所带来的风险因素，以及生产成本的增加，限制了蚕丝生物材料的市场化，至今也少有获得临床批文以及定型产品。因此，系统探索蚕丝蛋白在仿生材料和生物医学材料等领域中的理论基础与关键技术迫在眉睫。

蚕丝纤维是一种蛋白纤维，主要由丝素和丝胶两类结构性蛋白构成，其中丝素蛋白约占丝纤维的75％，由丝素重链(fib-H chain)、丝素轻链(fib-L chain)和P25三个基因的编码产物按照6：6：1分子比例组成。丝胶蛋白约占丝纤维的25％，主要由丝胶I(Sericin1)，丝胶II(Sericin2)以及丝胶III(Sericin3)基因编码产物组成，其中丝胶I蛋白比重最大。随着家蚕基因组计划的实施，蚕丝合成分泌机制的解析，以及家蚕分子育种技术体系的建立，理论上可以对蚕丝蛋白编码基因进行遗传改良，从根本上改善蚕丝的缺陷，分子培育家蚕改良品系，提升蚕丝纤维的性能和用途，促进蚕丝在生物医疗等高端领域的应用。获得了具有力学性能增强的蚕丝纤维、彩色蚕丝以及特殊功能性蚕丝材料等。在前期的研究中，本课题组通过piggyBac转座酶将人酸性成纤维细胞生长因子(FGF1)和人碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)的基因整合至家蚕基因组，利用家蚕丝腺生物反应器表达系统控制FGF1和FGF2特异在家蚕丝腺分泌表达至蚕丝中，遗传改良制备了含重组人源FGF1和FGF2的功能性蚕丝，并具有促进细胞增殖的功能。

琼脂糖是一种由1,3连结的β-D-半乳糖和1,4连结的3,6-内醚-L-半乳糖交替连接起来的长链线性的多聚物，其在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶，并且，还可以通过调节琼脂糖的浓度制备不同力学强度的凝胶材料。因此，部分研究者尝试了将琼脂糖用于制备各种凝胶生物材料。例如Singh等人利用琼脂糖与丝素蛋白制备了一种丝素蛋白-琼脂糖复合凝胶，该凝胶材料能够有效地维持猪耳廓软骨细胞的细胞活力与增殖生长，提高细胞外基质的沉积；Bhat等人利用壳聚糖、琼脂糖与明胶制备了复合冷冻胶凝，该凝胶材料能够支持成纤维细胞、心脏细胞、C2C12细胞以及Cos 7细胞的增殖与生长，表明其能够帮助皮肤、软骨以及骨骼等损伤组织的恢复。

为深度开发利用人源FGF1/FGF2功能性蚕丝，有必要制备具有生物活性的FGF1/FGF2再生丝胶蛋白生物材料。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一从转FGF1/FGF2蚕丝中提取有活性FGF1/FGF2蛋白的技术方法，并与琼脂糖混合制备具有增强型促细胞增殖活性的丝胶-琼脂糖复合凝胶；本发明的目的之二在于提供由该方法制得的产品。

为实现上述表达目的，本发明提供如下技术方案：

具有促进细胞增殖活性的丝胶-琼脂糖复合凝胶的制备方法，包括如下步骤：利用转人FGF1基因与人FGF2基因蚕丝提取重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白，得含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液，然后经复性后得复性的含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液，再与琼脂糖溶液混合，注模，成型，得具有促进细胞增殖活性的丝胶-琼脂糖复合凝胶。

优选的，所述提取为将转人FGF1基因与人FGF2基因蚕丝经过液氮研磨成粉末，加水制成30～50mg/ml的浓度，利用含有8M尿素的抽提缓冲液在80℃条件下萃取2h，然后于4℃条件下，18,000rpm条件下离心10min，上清液即为含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液。

优选的，所述抽提缓冲液为pH 7.0、含50mM Tris-HCl和8M尿素的溶液。

优选的，所述复性为利用二硫苏糖醇/谷胱甘肽氧化还原系统复性。

优选的，所述复性为将含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白在透析液中、4℃透析上清液12h，然后利用对半稀释法用复性液对透析液进行置换，重复4次，每次12h，再用水透析去除复性液，最后将复性的含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液在4℃、4000rmp条件下离心10min，收集沉淀即可。

更优选的，所述琼脂糖溶液的质量分数为1％。

更优选的，所述复性的含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液与所述琼脂糖溶液混合后复性的含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液的质量分数为20～100％。

更优选的，所述复性的含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液与所述琼脂糖溶液混合后复性的含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液的质量分数为60～80％。

2、由所述的制备方法制得的具有促进细胞增殖活性的丝胶-琼脂糖复合凝胶。

本发明的有益效果在于：具有促进细胞增殖活性的丝胶-琼脂糖复合凝胶的制备方法，该方法简单，制得的复合凝胶稳定性好，吸水性能好，具有较好的力学性能，并且能够维持维持NIH3T3细胞增殖与生长的功能，在组织工程学中具有广阔的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为AH(FGF1+FGF2)凝胶的制备流程(A-G：分别为转人FGF1基因与FGF2基因茧壳、茧粉、丝胶蛋白的提取过程、提取液、复性过程、含有FGF1与FGF2蛋白的液体丝胶凝胶与琼脂糖；H：为AH(FGF1+FGF2)凝胶；I-J：分别为冷冻干燥后的AH(FGF1+FGF2)凝胶形态以及其重新吸水后的形态。

图2为AH(FGF1+FGF2)凝胶中不同的琼脂糖浓度影响NIH3T3细胞的贴附与生长。(A)NIH3T3细胞在浓度为1％的琼脂糖凝胶表面生长情况；(B)CCK-8试剂盒定量分析NIH3T3细胞接种到含有不同琼脂糖浓度的复合凝胶表面12h的生长情况。

图3为AH(FGF1+FGF2)凝胶的SEM图(A：未混入琼脂糖的丝胶凝胶SEM图；B：未混入琼脂糖的丝胶凝胶SEM放大图；C：AH(FGF1+FGF2)凝胶SEM图；D：AH(FGF1+FGF2)凝胶SEM图放大图)。

图4为AH(FGF1+FGF2)凝胶吸水性与稳定性(A：为AH(FGF1+FGF2)凝胶冷冻干燥后的吸水性能；B：为AH(FGF1+FGF2)凝胶在37℃条件下，在PBS或含有10U/ml溶菌酶的PBS中的稳定性能。

图5为AH(FGF1+FGF2)凝胶持续释放FGF1与FGF2蛋白(A：37℃条件下，AH(FGF1+FGF2)凝胶浸泡在PBS中24h后，PBS中与凝胶中FGF1蛋白与FGF2蛋白的检测；B：AH(FGF1+FGF2)凝胶中FGF1蛋白与FGF2蛋白的释放特征)。

图6为AH(FGF1+FGF2)凝胶支持NIH3T3细胞正常生长(A：NIH3T3细胞在AH(FGF1+FGF2)凝胶与TCP表面接种3h、6h后的贴附情况；B：NIH3T3细胞在AH(FGF1+FGF2)凝胶与TCP表面生长情况；C：NIH3T3细胞在AH(FGF1+FGF2)凝胶与TCP表面生长状态)。

图7为AH(FGF1+FGF2)凝胶促进NIH3T3细胞增殖(A：Live-Dead染色试剂盒染色丝胶凝胶表面培养24h后的NIH3T3细胞；B：EdU染色试剂盒染色丝胶凝胶表面培养24h后的NIH3T3细胞；C：CCK-8试剂盒检测在丝胶凝胶表面培养1天、2天与3天后的NIH3T3细胞生长情况)。

图8为AH(FGF1+FGF2)凝胶无细胞毒性，Live-Dead染色试剂盒染色接种于TCP与AH(FGF1+FGF2)复合凝胶表面培养7天后的NIH3T3细胞。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明实施例使用的材料如下：

细胞系：NIH/Swiss小鼠胚胎细胞系(NIH3T3)，使用含有10％胎牛血清(Gibico)的DMEM培养基(Gibico)培养。

蚕丝材料：正常蚕丝D9L与转人FGF1基因与人FGF2基因蚕丝；转人FGF1基因蚕丝由前期研究中成功获得的转人FGF1基因家蚕品系制得(Wang,F.,et al.,Advanced silkmaterial spun by a transgenic silkworm promotes cell proliferation forbiomedical application.Acta Biomater,2014.10(12):p.4947-55.Wang,F.,et al.,Large-scale production of bioactive recombinant human acidic fibroblastgrowth factor in transgenic silkworm cocoons.Sci Rep,2015.5:p.16323.)。

人FGF2基因蚕丝按转人FGF1基因蚕丝相同方法制备，区别为将如SEQ ID NO.1所示的FGF2编码基因导入SEQ ID NO.2所示载体的BamHI和NotI位点，且FGF2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例1、转人FGF1基因与人FGF2基因蚕丝中丝胶蛋白的提取

将转人FGF1基因与人FGF2基因蚕丝茧壳经过液氮研磨成粉末，备用。以30～50mg/ml的浓度，利用含有8M尿素的抽提缓冲液(50mM Tris-HCl,8M urea,pH 7.0)在80℃条件下萃取2h，4℃条件下，18,000rpm条件下离心10min，上清液即为含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液。

实施例2、丝胶蛋白-琼脂糖复合凝胶(AH(FGF1+FGF2))的制备方法

首先，将实施例1中得到的含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液利用二硫苏糖醇/谷胱甘肽(DTT/GSSH)氧化还原系统复性上清液中的FGF1蛋白与FGF2蛋白。复性过程：在4℃条件下，利用透析袋(MWCO 1000Da,Spectrum Laboratory,Inc,USA)充分透析上清液12h，置换成为透析液(8M urea，1mM dithiothreitol(DTT)，50mM Tris-Cl(pH7.0)，and 250mM NaCl)；利用对半稀释的方法利用复性液(2.0mM reduced glutathione(GSH),0.2mM oxidized glutathione(GSSG),1mM DTT,50mM Tris–Cl(pH 7.0),and 250mMNaCl)对透析液进行置换，每次透析12h，重复4次；利用超纯水透析6次，去除复性液，每次12h。复性完成后，丝胶蛋白水溶液在4℃、4000rmp条件下离心10min，下层为含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白水凝胶，备用。

SDS-PAGE与Western Blotting检测FGF1蛋白与FGF2蛋白的浓度，具体采用增强型BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度(Beyotime)。取等质量的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，利用考马斯亮蓝染色与Western Blotting进行检测。电泳完成后，通过转膜仪将蛋白样品转到PVDF膜，经过5％脱脂奶粉封闭、5次PBST洗膜、敷一抗(anti-FGF1抗体、anti-FGF2抗体)、5次PBST洗膜、敷二抗(抗兔IgG抗体)等操作后，利用ECL Western BlottingDetection System(Amersham Biosciences)显现膜上的条带，曝光方式采用自动曝光。

称取1g琼脂糖(Biowest)固体粉末，与100ml超纯水加热溶于溶解，室温冷却至约40℃时，制得质量浓度为1％的琼脂糖溶液，按照含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白水凝胶与琼脂糖溶液的质量百分比为按质量比4:4混合，注入不同形态的磨具，4℃冷却30min后得到AH(FGF1+FGF2)凝胶材料，结果如图1所示。

为研究AH(FGF1+FGF2)凝胶中不同的琼脂糖浓度影响NIH3T3细胞的贴附与生长，以质量浓度为1％的琼脂糖溶液为基础，制备了丝胶蛋白溶液占0％，20％、40％、60％、80％与100％的丝胶蛋白-琼脂糖复合凝胶。将制得的丝胶蛋白-琼脂糖复合凝胶接种NIH3T3细胞，培养24小时后结果如图2所示。结果显示，不含有丝胶蛋白溶液的1％琼脂糖凝胶表面的NIH3T3细胞出现明显的集团现象(图2，A)；与AH-WT凝胶相比，含有FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液含量低于60％的丝胶蛋白-琼脂糖凝胶无法有效地支持NIH3T3细胞的增值与生长，含有FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液含量高于60％的丝胶蛋白-琼脂糖凝胶能够较好的支持NIH3T3细胞的增值与生长(图2，B)。

实施例3、丝胶蛋白-琼脂糖复合凝胶性能检测

a.电镜观察(SEM)

将长与宽分别为1cm的AH(FGF1+FGF2)凝胶冷冻干燥，取其内层进行喷金处理，利用扫描电镜(Supra 55sapphire,Zeiss)进行观察与拍照。所有实验在室温下进行，电压为3.0kV。每个实验的样品数为5个独立样品，每个样品拍3次，结果如图3所示。结果显示，AH(FGF1+FGF2)复合凝胶内部为多孔状疏松结构；与未混入琼脂糖的丝胶凝胶材料内空隙孔径(横径约为48μm，纵径约为137μm)相比，AH(FGF1+FGF2)复合凝胶内的空隙直径显著减小，约为23μm，表明AH(FGF1+FGF2)复合凝胶具有更好的力学性能。

b.稳定性分析

称取等量的AH(FGF1+FGF2)凝胶材料浸泡在PBS(pH7.4)或PBS(pH7.4)+lysozyme溶液中，置于37℃条件下，一定时间后，取出凝胶样品利用滤纸吸干多于的水分后称量。结果显示，在37℃条件下，AH(FGF1+FGF2)复合凝胶逐渐溶解，在100天内降解率仅约为25％；在含有10U/ml溶菌酶的PBS条件下，AH(FGF1+FGF2)复合凝胶在100天内的降解率也仅约为25％，表明AH(FGF1+FGF2)复合凝胶在长时间内保持稳定(图4，B)。

c.吸水性分析

利用真空冷冻干燥法干燥AH(FGF1+FGF2)材料。在37℃条件下，将干燥后的AH(FGF1+FGF2)材料浸入PBS(pH7.4)溶液，一定时间后，取出样品去除附着的水分后称量。结果显示，冻干后的AH(FGF1+FGF2)复合凝胶能够吸收自身重量约40倍的PBS溶液，表明其具有极强的吸水性能(图4，A)。

d.AH(FGF1+FGF2)凝胶中FGF1蛋白、FGF2蛋白的释放

取总体积为1ml的丝胶蛋白与琼脂糖混合液置于24孔培养板，4℃冷藏30min后，将其置于冰上利用紫外光直接照射8h。然后，向每个培养孔中加入500μl的PBS(pH7.4)，置于37℃条件下，孵育一定时间后取出PBS提取液，冷藏备用。向每个培养孔中重新加入500μl新鲜的PBS，重复该过程。最后，利用SDS-PAGE与Western blotting检测释放到PBS中的FGF1蛋白与FGF2蛋白的含量，结果如图5所示。结果显示，在浸泡了AH(FGF1+FGF2)复合凝胶24h的PBS中成功检测到了FGF1蛋白与FGF2蛋白(图5，A)，表明AH(FGF1+FGF2)凝胶中的FGF1蛋白与FGF2蛋白中能够被成功释放出来；根据释放曲线可知，前5天内，AH(FGF1+FGF2)凝胶中的FGF1蛋白与FGF2蛋白的释放速率较高，之后，释放速率逐渐减小。最终，从0.5ml的AH(FGF1+FGF2)复合凝胶中能够释放出超过40ng的FGF1蛋白、超过12ng的FGF2蛋白(图5，B)。

e.细胞增殖实验

取总体积为100μl的丝胶蛋白与琼脂糖混合凝胶置于96孔培养板，在4℃条件下静置30min后，置于冰上紫外消毒8h。然后，分别利用PBS、0.5％血清的DMEM培养基浸泡2h，备用。NIH3T3细胞用含有0.5％胎牛血清的DMEM培养基接种于AH(FGF1+FGF2)凝胶表面，每孔500个细胞，100μl体系，连续培养数天。设置添加了FGF1标准品蛋白的细胞孔作为阳性对照组。该方法检测了AH(FGF1+FGF2)复合凝胶维持细胞正常生长的能力。根据AH(FGF1+FGF2)复合凝胶与TCP对NIH3T3细胞的贴附性能结果可知，在TCP与AH(FGF1+FGF2)复合凝胶表面接种NIH3T3细胞2h后，成功接种到AH(FGF1+FGF2)复合凝胶表面的NIH3T3细胞数量显著低于TCP表面的细胞数量，6h后，成功接种到AH(FGF1+FGF2)复合凝胶与TCP表面的NIH3T3细胞数量无明显差异，表明AH(FGF1+FGF2)复合凝胶具有良好的NIH3T3细胞贴附能力(图6，A)；将少量的NIH3T3细胞接种到TCP与AH(FGF1+FGF2)复合凝胶表面连续培养1天、3天后，发现，接种在AH(FGF1+FGF2)复合凝胶表面的NIH3T3细胞的生长状态、数量与接种在TCP中的NIH3T3细胞相似，并且，培养3天后的细胞数量显著多于培养1天后的细胞数量(图6，B-C)，表明AH(FGF1+FGF2)复合凝胶能够支持NIH3T3细胞的正常增殖与生长。

利用Click-iT EdU试剂盒(Invitrogen)对正在发生增殖的细胞进行染色。EdU染色结果表明，AH(FGF1+FGF2)复合凝胶表面呈现红色荧光信号的正在发生细胞增殖的NIH3T3细胞的数量显著多于AH-WT组(图7，B)；利用Live-Dead染色试剂盒(MolecularProbes^TM)分别对活细胞与死细胞进行染色。Live-Dead染色试剂盒染色结果表明，与AH-WT组相比，AH(FGF1+FGF2)复合凝胶表面呈现绿色荧光信号的活细胞数量较多(图7，A)；利用CCK-8试剂盒(Beyotime)对细胞的数量进行分析，结果显示，接种NIH3T3细胞1天、2天与3天后，AH(FGF1+FGF2)复合凝胶表面的细胞数量显著地多于1％琼脂糖组、AH-WT组(图7，C)。表明AH(FGF1+FGF2)复合凝胶具有促进NIH3T3细胞增殖的能力。

f.细胞毒性实验

取总体积为100μl的丝胶蛋白与琼脂糖混合凝胶置于96孔培养板，在4℃条件下静置30min后，置于冰上紫外消毒8h。然后，分别利用PBS、0.5％血清的DMEM培养基浸泡2h，备用。NIH3T3细胞用含有10％胎牛血清的DMEM培养基铺于96孔板，每孔500个细胞，100μl体系，连续培养数天。利用Live-Dead染色试剂盒(Molecular Probes^TM)分别对活细胞与死细胞进行染色。结果表明，培养7天后，AH(FGF1+FGF2)复合凝胶表面呈现绿色荧光信号的活细胞数量与TCP组相近，且仅有少量呈现红色荧光信号的死细胞(图8)。表明AH(FGF1+FGF2)复合凝胶能够维持NIH3T3细胞正常生长，无明显的细胞毒性。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 具有促进细胞增殖活性的丝胶-琼脂糖复合凝胶的制备方法及其产品

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 482

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggatccatgg cggcaggctc aatcacaacc ttaccggcat taccagagga cggaggcagc 60

ggcgcatttc ccccaggaca cttcaaagac cccaaacgtt tgtactgcaa gaacggtgga 120

ttctttctca ggatacaccc tgacggccgt gtcgatggtg taagggaaaa atcggaccca 180

catatcaagc tccaattaca ggcagaagag agaggagtgg tttcaattaa aggcgtgtgt 240

gctaacagat atctggccat gaaagaagac ggtcgcctgt tggctagcaa gtgcgttacc 300

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actggtcccg gtcaaaaggc gatactgttc ctccctatgt cagcgaagtc ttaagcggcc 480

gc 482

<210> 2

<211> 2036

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccatggcagc gtcgtgaaaa gaggcaatga caaatacaaa acgacgtatg agcagacccg 60

tcgccaagac gggtctacct ctaagatgat gtcatttgtt ttttaaaact aactcgcttt 120

acgagtagaa ttctacgtgt aaaacataat caagagatga tgtcatttgt ttttcaaaac 180

caaactcgct ttacgagtag aattctacgt gtaaaacaca atcaaaagat gatgtcattc 240

gtttttcaaa accgaattta agaaatgatg tcatttgttt ttcaaaacca aactcgcttt 300

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<210> 3

<211> 155

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu

20 25 30

Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg

35 40 45

Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu

50 55 60

Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn

65 70 75 80

Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys

85 90 95

Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr

100 105 110

Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys

115 120 125

Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys

130 135 140

Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser

145 150 155

Claims

1.具有促进细胞增殖活性的丝胶-琼脂糖复合凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：利用转人FGF1基因与人FGF2基因蚕丝提取重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白，得含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液，然后经复性后得复性的含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液，再与琼脂糖溶液混合，注模，成型，得具有促进细胞增殖活性的丝胶-琼脂糖复合凝胶；

所述提取为将转人FGF1基因与人FGF2基因蚕丝经过液氮研磨成粉末，加水制成30~50mg/mL 的浓度，利用含有8M尿素的抽提缓冲液在80℃条件下萃取2h，然后于4℃条件下，18,000 rpm条件下离心10min，上清液即为含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液；所述抽提缓冲液为pH 7.0、含50mM Tris-HCl和8M 尿素的溶液；

所述复性为将含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白在透析液中、4 ℃透析上清液12 h，然后利用对半稀释法用复性液对透析液进行置换，重复4次，每次12h，再用水透析去除复性液，最后将复性的含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液在4 ℃、4000rpm条件下离心10 min，收集沉淀即可；

所述琼脂糖溶液的质量分数为1%。

2.根据权利要求1所述具有促进细胞增殖活性的丝胶-琼脂糖复合凝胶的制备方法，其特征在于：所述复性的含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液与所述琼脂糖溶液混合后复性的含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液的质量分数为20~100%。

3.根据权利要求2所述具有促进细胞增殖活性的丝胶-琼脂糖复合凝胶的制备方法，其特征在于：所述复性的含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液与所述琼脂糖溶液混合后复性的含有重组FGF1蛋白与FGF2蛋白的丝胶蛋白溶液的质量分数为60~80%。

4.由权利要求1~3任一项所述的制备方法制得的具有促进细胞增殖活性的丝胶-琼脂糖复合凝胶。